JP2002320486A

JP2002320486A - レジオネラ・ニューモフィラの増幅および検出

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Publication number: JP2002320486A
Application number: JP2001227090A
Authority: JP
Inventors: Thomas L Brink Jr; トーマス・エル・ブリンク，ジュニア; Tobin Hellyer; トビン・ヘルヤー
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2000-07-27
Filing date: 2001-07-27
Publication date: 2002-11-05
Also published as: EP1176213A2; EP1176213A3; DE60122067D1; DE60122067T2; US6251609B1; EP1176213B1

Abstract

(57)【要約】【課題】呼吸器サンプルまたは他の患者標品、培養物
および環境サンプルから、レジオネラ・ニューモフィラ
(legionella pneumophila)の有無を判定する。【解決手段】ｍｉｐ遺伝子配列を特異的に増幅および
検出するための増幅プライマーおよび方法を開示する。
多様な増幅反応および検出反応において、プライマー標
的結合配列は、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ標的の増幅
および検出に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】発明の分野本発明は、呼吸器サンプルまたは他の患者標品、培養物
および環境サンプルから、レジオネラ・ニューモフィラ
(legionella pneumophila)の有無を判定する方法に関す
る。本方法は、好ましくは、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、好
熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）または蛍光リアルタイムｔ
ＳＤＡの技法の１つを使用して、ｍｉｐ遺伝子内の標的
配列を特異的に増幅するために、核酸プライマーを使用
することを含む。

【０００２】

【従来の技術】発明の背景Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａは、ヒトにおいて、在郷軍
人病およびポンティアック熱を引き起こす。Ｒｉｆｆａ
ｒｄ，ｅｔａｌ．，（１９９６．Ｅｐｉｄｅｍｉｏ
ｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．，１１７（３）：５０１−５０６）
が記述している通り、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａが病
気を引き起こす潜在能力は、この種におけるマクロファ
ージ感染増強因子（macrophage infectivity potentiat
or; ｍｉｐ）が存在することに起因すると考えられる。
Ｅｎｇｌｅｂｅｒｇ，ｅｔａｌ．（１９８９．Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５７（４）：１２６３−１２７
０）が論じた通り、ｍｉｐタンパク質は、原生動物およ
びヒトのマクロファージの最適細胞内感染に必要な、２
４ｋＤａの表面タンパク質である。ｍｉｐ遺伝子の配列
は、遺伝学的に安定で且つＬｅｇｉｏｎｅｌｌａの個々
の種、たとえば、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａに特有の
ようである。さらに、ｍｉｐ遺伝子は、Ｒａｔｃｌｉｆ
ｆ，ｅｔａｌ．（１９９８．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．，３６（６）：１５６０−１５６７）によ
り、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属の分類体系用モデルとして
首尾よく使用されてきた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】核酸増幅は、特定の標
的配列を速やかに検出できる強力な技術である。従っ
て、核酸増幅は、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａを速やか
に検出し、同定するための有望な技術である。ｍｉｐ遺
伝子内の配列を使用したＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａの
ＰＣＲ同定に関しては、Ｒａｍｉｒｅｚ，ｅｔａｌ．
（１９９６．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，２
４：７−１４）、Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．（１９９
３．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６８：７６９−７
７２）、Ｗｅｉｒ，ｅｔａｌ．（１９９８．Ａｍ．
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，１１０：２９５−３０
０）、Ｂｅｊ，ｅｔａｌ．（１９９１．Ａｐｐｌ．Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７（２）：５
９７−６００）、およびＫｏｉｄｅ、ｅｔａｌ．（１
９９５．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，２１：１
９９−２０１）により記載されている。

【課題を解決するための手段】

【０００４】本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｌ．ｐｎ
ｅｕｍｏｐｈｉｌａの核酸増幅および検出に適用でき
る。

【０００５】以下の専門用語を、本明細書では下記の通
りに定義する。増幅プライマーは、標的配列にハイブリ
ダイズした後、プライマーの伸長によって標的配列を増
幅するためのプライマーである。増幅プライイマーは、
一般に１０〜７５ヌクレオチドの長さであり、好ましく
は１５〜５０ヌクレオチドの長さである。ＳＤＡ用増幅
プライマーの全長は約２５〜５０ヌクレオチドである。
ＳＤＡ増幅プライマーの３’末端（標的結合性配列）
は、標的配列の３’末端にてハイブリダイズする。標的
結合性配列は約１０〜２５ヌクレオチドの長さであり、
増幅プライマーにハイブリダーゼーション特性を与え
る。ＳＤＡ増幅プライマーは、５’から標的結合性配列
までの、制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位をさ
らに含む。認識部位は、Ｇ．Ｗａｌｋｅｒｅｔａ
ｌ．（１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ８９：３９２−３９６および１９９２Ｎ
ｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：１６９１−１６９
６）に記載されている通り、認識部位を半修飾するとき
にＤＮＡ二重らせんのニックを入れる（鎖１本を切断す
る）、制限エンドヌクレアーゼのためである。５’から
制限エンドヌクレアーゼ認識部位までのヌクレオチド
（「尾部」）は、増幅プライマーの残りを切断し、ＳＤ
Ａ中に置換するときにポリメラーゼリプライミング（ｒ
ｅｐｒｉｍｉｎｇ）部位として機能する。尾部ヌクレオ
チドのリプライミング機能によって、ＳＤＡ反応が持続
し、１つの標的分子から多数のアンプリコンを合成する
ことができる。この尾部は、一般に約１０〜２５ヌクレ
オチドの長さである。その長さおよび配列は概して重要
ではなく、定型的に選択して修飾することができる。標
的結合性配列は、その標的特異性を決定するプライマー
のタンパク質であるため、標的の末端において固有の配
列を必要としない増幅方法の場合、増幅プライマーは概
して、標的結合性配列のみで本質的に構成される。たと
えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した本発
明による標的配列の増幅は、本明細書に記載の増幅プラ
イマーの標的結合性配列からなる増幅プライマーを使用
する。ＳＤＡのニック可能な(ｎｉｃｋａｂｌｅ）制限
エンドヌクレアーゼ認識部位および尾部以外の標的に付
加した固有配列を必要とする増幅方法（たとえば、自続
的配列複製（Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄｓｅｑｕ
ｅｎｃｅＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：３ＳＲ）、核酸配
列に基づく増幅（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ−ＢａｓｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｎ
ＡＳＢＡ）または転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）
用のＲＮＡポリメラーゼプロモーター）の場合、定型的
なオリゴヌクレオチド調製法を使用して、プライマーの
ハイブリダイゼーション特異性を変えることなく、必要
な固有配列を標的結合性配列に連結することが可能であ
る。

【０００６】バンパープライマーすなわち外部プライマ
ーは、等温増幅反応において、プライマー伸長生成物の
置換に使用されるプライマーである。バンパープライマ
ーは、バンパープライマーの伸長部が、下流の増幅プラ
イマーおよびその伸長生成物に取って替わるように、増
幅プライマーの上流の標的配列にアニールする。

【０００７】標的または標的配列という用語は、増幅さ
れるべき核酸配列を指す。これらの中には、増幅される
べき本来の核酸配列、増幅されるべき本来の核酸配列の
相補的な第２鎖、および増幅反応により生成される本来
の配列のコピーのいずれかの鎖が含まれる。増幅可能な
標的は、増幅プライマーがハイブリダイズする対象であ
る配列のコピーを含むため、これらのコピーは増幅可能
な標的の役割を果たす。

【０００８】増幅反応中に生成され標的配列のコピー
は、増幅生成物、アンプリマーまたはアンプリコンと呼
ばれる。

【０００９】伸長生成物という用語は、プライマーのハ
イブリダイゼーションおよび標的配列を鋳型として使用
したポリメラーゼによるプライマーの伸長によって生成
されるコピーを指す。

【００１０】種特異的という用語は、実質的な検出、増
幅または同じ属の他種または異なる属の種へのオリゴヌ
クレオチドハイブリダイゼーションをしない、検出、増
幅または生物の種または一群の関連種へのオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーションを指す。

【００１１】アッセイプローブという用語は、核酸の検
出または同定を促進するのに使用されるオリゴヌクレオ
チドである。以下に記載の検出器プローブ、検出器プラ
イマー、捕捉プローブ、シグナルプライマーおよびレポ
ータープローブは、アッセイプローブの例である。

【００１２】シグナルプライマーは、標的中の相補配列
にハイブリダイズする３’標的結合性配列を含み、標的
に相補的でない５’尾部配列（アダプター配列）を含
む。このアダプター配列は、その相補配列が、以下に記
載のレポータープローブの３’末端にハイブリダイズす
るように選択される、間接的に検出できるマーカーであ
る。シグナルプライマーは、増幅プライマーのハイブリ
ダイゼーション部位の少なくともある程度下流で、標的
配列にハイブリダイズする。このシグナルプライマー
は、増幅プライマーの伸長に似た様式で、ポリメラーゼ
により伸長される。増幅プライマーの伸長部は、標的増
幅依存にシグナルプライマーの伸長生成物に取って替わ
る。下流標的結合性配列およびフランキングＳＤＡ増幅
プライマーへのハイブリダイゼーション特異的３’結合
性配列を含む、５’アダプター配列、一本鎖生成物を生
成する。このフランキング増幅プライマーのハイブリダ
イゼーションおよび伸長、ならびに後続のニッキングお
よび伸長により、アダプター配列の補体を含む増幅生成
物が生じ、これを標的増幅の指標として検出することが
可能である。

【００１３】本発明によるレポータープローブは、検出
器オリゴヌクレオチドとして機能し、少なくとも１ドナ
ー／消光剤色素対（すなわち、ドナーフルオロフォア用
のドナー蛍光色素および消光剤）であることが好ましい
標識を含む。標識は、標的配列に直接ハイブリダイズし
ないレポートプローブ中の配列または構造（レポーター
部分）に連結される。レポータープローブ３’からレポ
ーター部分までの配列は、シグナルプライマーアダプタ
ー配列の補体にハイブリダイズするように選択される。
概して、レポータープローブの３’末端は、標的配列に
かなりの相補性を有する配列を含まない。上述のアダプ
ター配列の補体を含む増幅生成物が存在する場合、その
増幅生成物はレポータープローブの３’末端にハイブリ
ダイズすることができる。プライミングおよびアダプタ
ー補体配列の３’末端からの伸長により、レポーター部
分補体を形成することが可能である。この形成によって
レポーター部分は二本鎖になり、その結果、レポーター
プローブの標識を検出することができ、標的の存在また
は増幅を示すことができる。

【００１４】アンプリコンという用語は、一対の増幅プ
ライマーのいずれか一方または両者の伸長により生じる
増幅反応の生成物を指す。使用する両プライマーが標的
配列にハイブリダイズする場合、アンプリコンは、指数
関数的に増幅した核酸を含んでもよい。あるいは、使用
したプライマーの１つが標的配列にハイブリダイズしな
い場合、アンプリコンは、直線的増幅により生じてもよ
い。従って、この用語は、本明細書で使用され、指数関
数的に増幅された核酸の存在を意味するものではない。

【００１５】

【発明の実施の形態】発明の概要本発明は、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａにある標的配列
の増幅に使用することができるオリゴヌクレオチドプラ
イマーを提供する。さらに詳細には、この標的配列はｍ
ｉｐ遺伝子のセグメントを含む。増幅プライマーは、高
温にて高能率高特異性の増幅（たとえばｔＳＤＡやＰＣ
Ｒ）向けにデザインされてきたが、従来のＳＤＡ、３Ｓ
Ｒ、ＴＡＳまたはＮＡＳＢＡ等の低温増幅反応でも有用
である。標的特異的シグナルプライマーにハイブリダイ
ズするオリゴヌクレオチドレポータープローブは、増幅
生成物を間接的に検出するのに使用される。

【００１６】本発明のオリゴヌクレオチドは、培養後
に、培養された微生物の同一性を確認するための手段と
して使用することが可能である。あるいは、既知の増幅
方法を使用して、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ菌の核酸
を検出して同定するために、ヒトの臨床サンプル（呼吸
器サンプル）、または環境サンプル（たとえば、汚染し
た水）と一緒に使用することができる。いずれの場合に
も、本発明のオリゴヌクレオチドおよび分析方法を使用
すると、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａと他の微生物とを
速やかに識別するための手段が得られ、開業医は、慣習
的に信頼されている旧式の手順を使用せずに、この微生
物を速やかに同定することできる。感染に関与する特定
の病原体をこのように迅速に同定することにより、適切
な処置を決定するのに使用できる情報が短時間のうちに
得られる。

【００１７】配列の要約配列番号１は、ｍｉｐ遺伝子増幅用の上流プライマーと
して使用されるオリゴヌクレオチドの配列である。配列
番号２は、ｍｉｐ遺伝子増幅用の下流プライマーとして
使用されるオリゴヌクレオチドの配列である。配列番号
３は、ＳＤＡ増幅用の上流バンパーとして使用されるオ
リゴヌクレオチドの配列である。配列番号４〜５は、Ｓ
ＤＡ増幅用の下流バンパーとして使用されるオリゴヌク
レオチドの配列である。配列番号６は、ｍｉｐ遺伝子内
の配列を増幅して検出するためのシグナルプライマーの
配列である。配列番号７は、前述のシグナルプライマー
と共に使用したとき、ｍｉｐ遺伝子内の配列を検出する
ようにデザインされたレポータープローブ用の配列であ
る。

【００１８】本発明の様々な目的、利点および新規な特
質は、添付の図面と関連して読んだ時、以下の詳細な説
明から容易に理解されるであろう。

【００１９】発明の詳細な説明本発明は、核酸増幅反応において、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌ
ａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａに対して特異性を示すオリ
ゴヌクレオチド、増幅プライマーおよびシグナルプライ
マーに関する。本発明のオリゴヌクレオチドを使用し
て、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ菌
の核酸を検出して同定するための方法も提供する。好ま
しい方法は、ＳＤＡ、ｔＳＤＡまたは同種リアルタイム
蛍光ｔＳＤＡを使用することである。以上の方法は当業
者に周知である。米国特許第５，５４７，８６１号、米
国特許第５，６４８，２１１号、米国特許第５，８４
６，７２６号、米国特許第５，９２８，８６９号、米国
特許第５，９５８，７００号、米国特許第５，９３５，
７９１号、米国特許第６，０５４，２７９号、２０００
年６月８日提出の米国特許出願番号第０９／５９０，０
６１号、および２０００年６月２３日提出の米国特許出
願番号第０９／６０２，９９６号（これらの開示内容
は、参照することにより本明細書に組み込まれるものと
する）。

【００２０】本発明のプライマーは、ｍｉｐ特異的領域
を同定するために一列に並べられた、複数のソースから
のｍｉｐ遺伝子配列データの解析に基づいてデザインさ
れた。ｔＳＤＡで使用す得るために開発されたプライマ
ーを表１に示す。結果として生じるアンプリコンを増幅
して検出するためのシグナルプライーマーおよびレポー
タープローブも示す。この増幅プライマーにおける代表
的な制限エンドヌクレアーゼ認識部位（ＢｓｏＢＩ）を
ボールド体で示し、標的結合性配列をイタリック体で示
す。増幅プライマーの標的結合性配列によって、その標
的特異性が決定される。

【００２１】

【表１】

【００２２】ハイブリダイズするために核酸は完全な相
補性を必要としないため、本明細書に開示されているプ
ローブ配列およびプライマー配列は、ｍｉｐ特異的プロ
ーブおよびプライマーとしての有用性を失うことなく、
ある程度修飾することが可能である。当技術分野で周知
の通り、ストリンジェンシーを増強または低減するよう
にハイブリダイゼーション条件（すなわち、ハイブリダ
イゼーションｐＨ、温度または緩衝液の塩含量）を調節
するとにより、相補的な核酸配列および部分的に相補的
な核酸配列を得ることができる。開示した配列のこのよ
うに僅かな修飾およびＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ菌特
異性を維持するために必要なハイブリダイゼーション条
件の調節は、定型的な実験のみを必要としし、当分野で
普通の技術の範囲内である。

【００２３】本明細書に記載のプライマーを使用して生
成した増幅生成物は、たとえば、臭化エチジウムで染色
されたポリアクリルアミドゲル上またはアガロースゲル
上の、特徴的なサイズによって検出することができる。
あるいは、アッセイプローブ（検出可能な標識で標識し
たオリゴヌクレオチドである）を使用して、増幅された
標的配列を検出することができる。１つの実施形態にお
いて、少なくとも１つの標識アッセイプローブを、ハイ
ブリダイゼーション（検出器プローブ）、Ｗａｌｋｅ
ｒ，ｅｔａｌ．（１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２０：１６９１−１６９６）により記載されて
いるハイブリダイゼーションおよび伸長（検出器プライ
マー）またはＥＰ０６７８５８２号に記載されている
通り、ハイブリダイゼーション、伸長および二本鎖型へ
の転換（シグナルプライマー）により増幅された標的配
列の検出に使用することができる。

【００２４】増幅された標的の検出に好ましい実施形態
を、図１に図解する。この実施形態において、シグナル
プライマーの５’尾部配列は、標的にハイブリダイズし
ない配列（アダプター配列）を含む。このアダプター配
列は、異なる３’標的結合性配列を有する様々なシグナ
ルプライマーにおいてアダプター配列が同じであるよう
に選択することが可能な、間接的に検出できるマーカー
である（すなわち「普遍」５’尾部配列）。配列番号６
はシグナルプライマーとして、本発明の増幅プライマー
とともに、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ菌検出に特に有
用である。アッセイプローブは、本発明のシグナルプラ
イマーのアダプター配列補体にハイブリダイズする単一
レポータープローブ配列であることが好ましい。配列番
号７は、本発明のシグナルプライマーと一緒に使用した
とき、レポータープローブとして、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐ
ｈｉｌａの検出に特に有用である。あるいは、増幅プラ
イマー間にある、標的における配列にハイブリダイズす
るように、アッセイプローブを選択することができる。
さらなる実施形態では、増幅プライマーまたはその標的
結合性配列をアッセイプローブとして使用することが可
能である。

【００２５】アッセイプローブの検出可能な標識は、標
的核酸の存在の指標として、直接的または間接的のいず
れかで検出できる部分である。標識の直接検出の場合、
当技術分野で周知の通り、アッセイプローブを放射性同
位元素で標識してオートラジオグラフィーで検出しても
よく、蛍光部分で標識して蛍光で検出してもよい。ある
いは、検出できるようにするにはさらなる試薬を必要と
する標識で標識することにより、アッセイプローブを間
接的に検出することが可能である。間接的に検出できる
標識としては、たとえば、化学発光剤、目に見える反応
生成物を生成する酵素、および標識された結合パートナ
ーに結合させることにより検出できる（たとえば、抗体
または抗原／ハプテン）リガンド（たとえば、ハプテ
ン、抗体または抗原）などがある。リガンドは、その検
出を容易にするために、リガンド標識オリゴヌクレオチ
ド（捕捉プローブ）を固相に固定するのにも有用であ
る。特に有用な標識としては、ビオチン（標識されたア
ビジンまたはストレプトアビジンに結合させることによ
り検出できる）およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ
またはアルカリホスファターゼ等の酵素（酵素基質を加
えて有色の反応性生物を生じさせることによって検出で
きる）などがある。このような標識をオリゴヌクレオチ
ドに加える方法、またはこのような標識をオリゴヌクレ
オチドに含める方法は、当技術分野で周知であり、これ
らの方法のいずれも本発明で使用するのに適している。

【００２６】商業上便利なように、核酸を特異的に検出
して同定するための増幅プライマーを、キットの形でパ
ッケージすることが可能である。一般に、このようなキ
ットは少なくとも一対の増幅プライマーを含む。標的特
異的増幅プライマーと共に、核酸増幅反応を実施するた
めの試薬、たとえば、緩衝液、さらなるプライマー、ヌ
クレオチド三リン酸、酵素等々も含まれてもよい。キッ
トの成分は、任意に本発明の具体的な実施形態を実施す
るための説明書が入っている、普通の容器に一緒にパッ
ケージされる。他の任意の成分、たとえば、アッセイプ
ローブとして使用するのに適した標識で標識されたオリ
ゴヌクレオチド、および／または標識を検出するための
試薬または手段もキットに含まれてもよい。

【００２７】使用することができる具体的な検出方法の
例としては、米国特許第５，４７０，７２３号に記載
の、ビオチニル化捕捉プローブおよび酵素複合検出器プ
ローブを使用して、増幅生成物を検出する化学発光法な
どがある。これらの２つのアッセイプローブを、標的配
列のアッセイ領域の異なる部位（２つの増幅プライマー
の結合部位の間）にハイブリダイズさせた後、捕捉プロ
ーブを用いて、この複合体をストレプトアビジン被覆微
量滴定プレート上に捕捉し、化学発光シグナルを生じさ
せ、照度計で読み取る。増幅生成物を検出するための別
の代替法として、欧州特許ＥＰ０６７８５８２号
に記載のシグナルプライマーを、ＳＤＡ反応に含めても
よい。増幅生成物を検出するためのさらに別の代替法で
は、シグナルプライマーは、標的配列にハイブリダイズ
しない配列、すなわちアダプター配列を含んでもよい。
この実施形態では、図１に示す通り、標識が結合したレ
ポータープローブは、アダプター配列の補体にハイブリ
ダイズすることができる。シグナルプライマーの両実施
形態において、ＳＤＡ中に、二次増幅生成物を標的増幅
依存的に生じさせ、これを標的増幅の指標として検出す
ることが可能である。

【００２８】本発明の場合、必要な成分を呼吸器微生物
パネルに提供するために、このようなキットを作ること
が可能である。このような呼吸器パネルは、Ｌ．ｐｎｅ
ｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅおよびクラミジア微生物、ならびに呼吸器感染を引き
起こすことができる他の微生物を含んでもよい。従っ
て、このような呼吸器キットは、呼吸器パネルの各微生
物に特異的な核酸配列の増幅用プライマーを含むであろ
う。Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｉｓおよびＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅの増幅および検出に有用なプライマー、バンパー、
シグナルプライマーおよびレポータープローブは、それ
ぞれ、本明細書と同日付で提出された同時係属米国特許
出願番号第０９／６２６，８５５号（弁理士整理番号第
Ｐ−５１４３号）および本明細書と同日付で提出された
同時係属米国特許出願番号第０９／６２６，３５５号
（弁理士用整理番号第Ｐ−５１４５号）（特に、その開
示内容は参照することにより本明細書に組み込まれるも
のとする）に記載されている。このような呼吸器パネル
キットは、使用する場合、パネルの各微生物の有無を示
す結果を提供するために、各微生物に対して別々の増幅
反応であってもよく、または１つ以上の複合的な増幅反
応であってもよい。

【００２９】増幅プライマーの標的結合性配列は、オリ
ゴヌクレオチドに種ハイブリダイゼーション特異性を与
え、従って、増幅反応に種特異性を提供する。従って、
本発明の増幅プライマーの標的結合性配列は、ＰＣＲ、
従来のＳＤＡ（ｔＳＤＡと本質的に同じであるが、中温
性酵素を使用して、より低温で実施される反応体系）、
３ＳＲ、ＮＡＳＢＡおよびＴＡＳ等の、他の核酸増幅プ
ロトコールにおいても有用である。具体的には、標的配
列への、プライマーの周期的な、特異的ハイブリダイゼ
ーションを使用するプロトコール、標的配列を鋳型とし
て使用するプライマーの伸長、および伸長生成物の標的
配列からの分離または置換は、本発明の標的結合性配列
を使用することが可能である。専門の非標的結合性配列
を必要としない増幅方法（たとえば、ＰＣＲ）の場合、
増幅プライマーは、表１に記載の増幅プライマーの標的
結合性配列のみで構成されてもよい。

【００３０】オリゴヌクレオチドの種特異性を変えるこ
となく、選択された増幅反応を実施するのに必要な他の
配列を、本明細書に開示されている標的結合性配列に、
任意に付加することが可能である。例として、特異的増
幅プライマーは、ＳＤＡ反応中に切断される制限エンド
ヌクレアーゼＢｓｏＢＩに対する認識部位を含んでもよ
い。ＥＰ０６８４３１５号に開示の認識部位を含
むがその限りではない、他の切断可能な制限エンドヌク
レアーゼ認識部位を、ＢｓｏＢＩ認識部位の代わりに使
用できることは、当業者に明らかになるであろう。好ま
しくは、この認識部位は、好熱性制限エンドヌクレアー
ゼに対するものであり、従って、ｔＳＤＡの条件で増幅
反応を実施することが可能である。同様に、増幅プライ
マーの尾部配列（５’から制限エンドヌクレアーゼ認識
部位まで）は、一般に重要ではないが、ＳＤＡに使用さ
れる制限部位、およびそれ自身の標的結合性配列か他の
プライマーのいずれかにハイブリダイズする配列は避け
るべきである。従って幾つかのＳＤＡ用増幅プライマー
は、３’標的結合性配列、５’から標的結合性配列まで
の切断可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位、および
５’から制限ヌクレアーゼ認識部位の１０〜２５ヌクレ
オチドの長さの尾部配列からなる。切断可能な制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位および尾部配列は、ＳＤＡ反応
に必要な配列である。２０００年５月１８日提出の米国
特許出願番号第０９／５７３，２４２号に記載の通り、
ＳＤＡ用の幾つかの増幅プライマーは、制限酵素認識部
位の５’および３’の両者の、標的特異的配列で構成さ
れてもよい。このデザインを用いて、標的特異的ハイブ
リダイゼーションの効率を高めることができる。他の増
幅反応（たとえば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡおよびＴＡＳ）
の場合、増幅プライマーは、標的結合性配列および選択
された増幅反応に必要なさらなる配列（たとえば、上述
のＳＤＡに必要な配列、または３ＳＲではＲＮＡポリメ
ラーゼにより認識されるプロモーター）で構成されても
よい。本発明の標的結合性配列を、ＳＤＡ以外の増幅方
法に合わせて改変する場合、増幅プライマーを調製する
ためのルーチンの方法（たとえば化学合成）および選択
された増幅反応のプライマーに必要な周知の構造上の条
件を使用する。従って、本発明の標的結合性配列は、産
生、スクリーニングおよび最適化のためのルーチンの方
法のみを使用した様々な増幅反応における、Ｌ．ｐｎｅ
ｕｍｏｐｈｉｌａ微生物特異的標的増幅ならびに検出に
合わせて容易に改変される。

【００３１】バンパープライマーは下流の種特異的増幅
プライマーを置換するように作用するため、ＳＤＡで
は、バンパープライマーは種特異性に不可欠ではない。
バンパープライマーが、増幅プライマーから上流の標的
にハイブリダイズすることだけが必要であり、従って、
バンパープライマーを伸長させると、バンパープライマ
ーは増幅プライマーおよびその伸長生成物を置換させ
る。従って、バンパープライマーの特定の配列は概して
重要ではなく、バンパープライマーが伸長したときに増
幅プライマー伸長生成物を置換できるように、増幅プラ
イマーの結合部位に十分近い上流の標的配列から誘導し
てもよい。バンパープライマー配列における標的と不一
致がたまにあっても、または非標的配列との交差ハイブ
リダイゼーションが多少あっても、バンパープライマー
が相変わらず特異的標的配列にハイブリダイズすること
ができる限り、概して、増幅効率にマイナスの影響はな
い。

【００３２】本発明のプライマーを使用する増幅反応
は、Ｗａｌｋｅｒｅｔａｌ．（１９９２，Ｎｕｃ
ｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：１６９１−１６９６）
による教示通り、チミンを組み込んでもよく、あるい
は、ＥＰ０６２４６４３号に教示の通り、後続の
増幅反応の交差汚染を減少させるために、ＴＴＰの代わ
りに２’−デオキシウイリジン５’三リン酸を全部ま
たは部分的に反応で使用してもよい。ｄＵ（ウリジン）
を増幅生成物に組み込み、ウラシルＤＮＡグリコシラー
ゼ（ＵＤＧ）で処理することによって切除することがで
きる。これらの非塩基性(abasic)部位は、後続の増幅反
応において、増幅生成物を増幅不能にする。新たに形成
される増幅生成物におけるｄＵの切除を防止するため
に、ＵＤＧをウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビタ
ー（ＵＧＩ）で不活化してから、後続の増幅を実施する
ことが可能である。

【００３３】ＳＤＡは、プライマーの切除、半修飾され
た制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位のニッキン
グ、一本鎖伸長生成物の置換、伸長生成物（または本来
の標的配列）へのプライマーのアニーリングおよびその
後のプライマーの伸長が、反応混合物中で同時に起こる
等熱方法である。これは、反応のステップが、反応の温
度循環特性の結果として非連続相または周期で行われる
ＰＣＲと対照的である。ＳＤＡは、１）制限エンドヌク
レアーゼが、そのヘミホスホロチオエート型二本鎖認識
／切断部位の未修飾の鎖を切断できることと、２）ある
特定のポリメラーゼがニックにて複製を開始し且つ下流
の非鋳型鎖を置換できることとに基づく。プライマーを
アニーリングするために、高温（約９５℃）にて最初に
インキュベートして二本鎖標的配列を変性させた後、続
いて、新たに合成された鎖の増幅および置換を定温で行
う。標的配列の新しい各コピーの作製は、１）増幅プラ
イマーを本来の標的配列または予め重合して置換した一
本鎖伸長生成物に結合するステップと、２）α−チオ
デオキシヌクレオシド三リン酸を取り込む５’−３’エ
クソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによりプライマーを
伸長するステップと、３）半修飾された二本鎖制限部位
を切断するステップと、４）制限酵素をニック部位から
分離するステップと、５）５’−３’エクソヌクレアー
ゼ欠損ポリメラーゼによってニックの３’末端から伸長
し、下流の新たに合成された鎖を置換するステップと
の、５ステップからなる。ニックからの伸長は別の切断
可能な制限部位を再生させるため、ニッキング（ｎｉｃ
ｋｉｎｇ）、重合および置換は、定温で同時に且つ連続
的に起こる。一対の増幅プライマーを使用し、それぞれ
が二本鎖標的配列の２本の鎖のうちの１本にハイブリダ
イズする場合、増殖は指数関数的である。これは、セン
ス鎖およびアンチセンス鎖が、その後の循環の増幅にお
いて、反対側のプライマー用の鋳型の役割を果たすため
である。１つの増幅プライマーを使用するとき、ただ１
本の鎖がプライマー伸長用の鋳型の役割を果たすため、
増幅は直線的である。α−チオｄＮＴＰが組み込まれ
たとき、二本鎖認識／切断部位を切断する制限エンドヌ
クレアーゼの例は、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、Ａｖ
ａＩ、ＮｃｉＩおよびＦｎｕ４ＨＩである。これらの制
限エンドヌクレアーゼおよび必要なニッキング活性を示
す他の制限エンドヌクレアーゼは全て、従来のＳＤＡで
使用するのに適する。しかし、これらは比較的熱に不安
定であり、約４０℃以上で活性を失う。

【００３４】ＳＤＡによる増幅の標的は、より大きい核
酸を断片化することによって調製することが可能であ
る。しかし、ＳＤＡ反応におけるニッキングのために選
択された制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位を有す
る標的核酸は、Ｗａｌｋｅｒｅｔａｌ．（１９９２
Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：１６９１−１６
９６）および米国特許第５，２７０，１８４号（特に、
参照することにより本明細書に組み込まれるものとす
る）に記載されている通りに生成することが一般に好ま
しい。簡単に記載すると、標的配列が２本鎖であれば、
４つのプライマーが標的配列にハイブリダイズされる。
このプライマーのうち２つ（Ｓ₁およびＳ₂）は、ＳＤＡ
増幅プライマーであり、２つ（Ｂ₁およびＢ₂）は、外
部、すなわちバンパープライマーである。Ｓ₁およびＳ₂
は、標的配列側方の、二本鎖核酸の反対側の鎖に結合す
る。Ｂ₁およびＢ₂は、それぞれ、Ｓ₁およびＳ₂の標的配
列５’（すなわち、上流）に結合する。次いで、３つの
デオキシヌクレオシド三リン酸および少なくとも１つの
修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸（たとえば、
２’−デオキシアデノシン５’−Ｏ−（１−チオ三リ
ン酸）、「ｄＡＴＰαＳ」）の存在下で、エキソヌクレ
アーゼ欠損ポリメラーゼを使用して、４つのプライマー
全てを同時に伸長する。その結果、Ｓ₁およびＳ₂の伸長
生成物は、Ｂ₁およびＢ₂の伸長によって、本来の標的配
列鋳型から追い払われる。追い払われた、増幅プライマ
ーの一本鎖伸長生成物は、反対側の増幅およびバンパー
プライマーが結合する標的の役割を果たす（たとえば、
Ｓ₁の伸長生成物はＳ₂およびＢ₂に結合する）。伸長の
次の反復および置換は、結果として、各末端に半修飾さ
れた制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位を有する２
つの二本鎖核酸断片を生じる。これらは、ＳＤＡによる
増幅に適した基質である。ＳＤＡの場合と同様、標的生
成反応の個々のステップは同時に且つ連続的に起こり、
ＳＤＡでの制限酵素によるニッキングに必要な末端に認
識／切断配列を有する標的配列が生じる。ＳＤＡ反応の
全成分が既に標的生成反応に存在するため、自動的且つ
連続的に生成された標的配列はＳＤＡ反復に入り、増幅
される。

【００３５】別の増幅生成物による、１つのＳＤＡ反応
の交差汚染を防止するために、増幅反応を阻害せずに、
ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰをＳＤＡ増幅ＤＮＡに組み
込むことができる。次いで、ウラシルＤＮＡグリコシラ
ーゼ（ＵＤＧ）で処理することにより、ウラシル修飾核
酸を特異的に認識して不活化することが可能である。従
って、事前の反応でｄＵＴＰがＳＤＡ増幅ＤＮＡに組み
込まれるのであれば、二本鎖標的を増幅する前に、その
後のＳＤＡ反応をＵＤＧで処理することができ、先に増
幅された反応からのＤＮＡを含むｄＵを増幅不可能にす
る。その後の反応で増幅されるべき標的ｄＮＡはｄＵを
含まず、ＵＤＧ処理による影響を受けない。次いで、標
的の増幅前にＵＧＩで処理することにより、ＵＤＧを阻
害することができる。あるいは、ＵＤＧを熱不活化して
もよい。ｔＳＤＡの場合、反応の高温そのもの（≧５０
℃）を同時に使用して、ＵＤＧを不活化し、標的を増幅
することができる。

【００３６】ＳＤＡは、５’−３’エキソヌクレアーゼ
活性が欠如したポリメラーゼを必要とし、二本鎖核酸の
一本鎖ニックにて重合を開始し、ニックの下流の鎖を置
換させる一方で、未切断鎖を鋳型として使用して新たな
相補鎖を生成する。ポリメラーゼは、ヌクレオチドを遊
離の３’−ＯＨに付加することによって伸長しなければ
ならない。ＳＤＡ反応を最適化するためには、ポリメラ
ーゼが、増幅できる標的配列の長さを最大化するのに極
めて前進的であることも望ましい。極めて前進的なポリ
メラーゼは、伸長生成物を分離して終結する前に、かな
りの長さの新しい鎖を重合することができる。置換活性
は、さらなるコピーの合成に利用できる標的を作り、且
つ指数関数的増幅反応で、第２の増幅プライマーがハイ
ブリダイズすることが可能な対象である一本鎖伸長生成
物を生成するため、増幅反応に不可欠である。制限酵素
のニッキング活性は、反応を永続させ、標的増幅のその
後の循環が開始するのを可能にするニッキングであるた
め、これも非常に重要である。

【００３７】ｔＳＤＡは、適切な熱安定性ポリメラーゼ
および熱安定性制限エンドヌクレアーゼを取り替えて、
本質的に、Ｗａｌｋｅｒｅｔａｌ．（１９９２，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：
３９２−３９６および１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２０：１６９１−１６９６）に記載されてい
る従来のＳＤＡと同様に実施される。もちろん、反応温
度は、取り替えられた酵素に適した高温に調節し、Ｈｉ
ｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位は、選
択された熱安定性エンドヌクレアーゼに適切な制限エン
ドヌクレアーゼ認識／切断部位と取り替える。また、Ｗ
ａｌｋｅｒｅｔａｌ．と対照的に、酵素が変性温度
で十分に安定であれば、専門家は、最初の変性ステップ
の前に酵素を反応混合物に含める。ｔＳＤＡで使用する
のに好ましい制限エンドヌクレアーゼは、ＢｓｒＩ、Ｂ
ｓｔＮＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｌＩおよびＢｓｏＢＩ（Ｎ
ｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）、およびＢｓ
ｔＯＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）である。好ましい好熱性ポリ
メラーゼは、Ｂｃａ（Ｐａｎｖｅｒａ）およびＢｓｔ
（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）である。

【００３８】同種リアルタイム蛍光ｔＳＤＡは、ｔＳＤ
Ａの改良型である。これは、検出器オリゴヌクレオチド
を使用して、標的依存的様式で、低い蛍光消光をもたら
す。この検出器オリゴヌクレオチドは、標的の非存在下
で蛍光消光が起こるように連結されたドナー／アクセプ
ター色素対を含む。標的の存在下で、検出器オリゴヌク
レオチドにおける分子内塩基対形成二次構造のアンフォ
ールディングおよび直線化は、色素間の距離を増大し、
蛍光消光を減少させる。塩基対形成二次構造のアンフォ
ールディングは、一般に、二次構造が少なくとも部分的
に乱されるように、二次構造の配列と相補鎖との間の分
子間塩基対形成を含む。十分な長さの相補鎖の存在下
で、二次構造を十分に直線化することが可能である。好
ましい実施形態では、二次構造と相補鎖との間の分子間
塩基対形成によって、ＲＥＲＳが二本鎖になり、制限エ
ンドヌクレアーゼで切断できるように、制限エンドヌク
レアーゼ認識部位（ＲＥＲＳ）は、２つの色素の間に存
在する。制限エンドヌクレアーゼで切断することによ
り、ドナー色素とアクセプター色素を別個の核酸断片上
に分離し、さらに、消光低下の一助となる。いずれの実
施形態でも、付随する蛍光パラメーターの変化（たとえ
ば、ドナー蛍光強度の増強、アクセプター蛍光強度の低
下、またはウンフォールディング前後の蛍光の比率）
を、標的配列が存在する指標としてモニタリングする。
ドナー蛍光強度の変化は、一般にアクセプター蛍光強度
の変化より大きいため、ドナー蛍光強度の変化をモニタ
リングすることが好ましい。蛍光寿命等の他の蛍光パラ
メーターをモニタリングしてもよい。オリゴヌクレオチ
ドの切断は、ＤＮＡ二重らせんの両鎖のホスホジエステ
ル結合を破壊すること、または一本鎖ＤＮＡのホスホジ
エステル結合を破壊することを指す。これは、ＤＮＡ二
重らせんにおける二本の鎖のうちの１本のみのホスホジ
エステル結合を破壊することを指すニッキングと対照的
である。

【００３９】同種リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ用の検出器
オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズする
一本鎖５’セクションまたは３’セクション（標的結合
性配列）、ならびに標的結合性配列に隣接する分子内塩
基対形成二次構造の両者を含むオリゴヌクレオチドであ
ってもよい。図１に示す好ましい実施形態では、検出器
オリゴヌクレオチドは、表テロ配列にハイブリダイズし
ない一本鎖５’セクションまたは３’セクションを含む
レポータープローブである。むしろ、一本鎖５’セクシ
ョンまたは３’セクションは、シグナルプライマーアダ
プター配列の補体（アダプター−補体結合性配列）にハ
イブリダイズする。レポータープローブのさらなる特徴
は、このハイブリダイズセクションが分子内塩基対形成
二次構造に隣接することである。本発明の検出器オリゴ
ヌクレオチドは、二次構造が分子内塩基対形成したと
き、ドナー蛍光が消光され、二次構造のアンフォールデ
ィングおよび直線化の結果として蛍光消光が減少するよ
うに検出器オリゴヌクレオチドに連結されたドナー／ア
クセプター色素対をさらに含む。

【００４０】同種リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ用の本発明
の検出器オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長または
ハイブリダイゼーションのために選択された反応条件で
分子内塩基対形成二次高構造を形成する配列を含む。１
つの実施形態では、標的結合性配列の少なくとも一部が
一本鎖３’尾部または５’尾部を形成するように、この
二次構造を検出器オリゴヌクレオチドの標的結合性配列
の近くに配置してもよい。図１に示す好ましい実施形態
では、アダプター−補体結合性配列の少なくとも一部が
一本鎖３’尾部または５’尾部を形成するように、この
二次構造は、レポータープローブ検出器オリゴヌクレオ
チドのアダプター−補体結合性配列の近くに配置され
る。本明細書で使用する用語「標的結合性配列の近く」
または「アダプター−補体結合性配列の近く」は、標的
／アダプター−補体結合性配列の全部または一部が、標
的／アダプター−補体へのハイブリダイゼーションに使
用できる５’尾部または３’尾部において一本鎖のまま
であることを意味する。すなわち、二次構造は標的／ア
ダプター−補体結合性配列全体を含まない。標的／アダ
プター−補体結合性配列は、その一部が二次構造におけ
る分子内塩基対形成に関与している可能性があり、二次
構造における分子内塩基対形成に関与する第１の配列の
一部または全部を含んでもよいが、その相補配列内に達
しないことが好ましい。たとえば、二次構造がステム・
ループ構造（たとえば、「ヘアピン」）であり、且つ検
出器オリゴヌクレオチドの標的／アダプター−補体結合
性配列が一本鎖３’尾部として存在するのであれば、標
的／アダプター−補体結合性配列は、ステムの第１アー
ムの全部または一部、および任意に、ループの全部また
は一部を通って伸びてもよい。しかし、標的／アダプタ
ー−補体結合性配列は、ステム分子内塩基対形成に関与
する配列の第２アーム内に達しないことが好ましい。す
なわち、標的／アダプター−補体にハイブリダイズする
ことができる二次構造において分子内塩基対形成に関与
する両配列を有することを回避することが望ましい。検
出器オリゴヌクレオチド二次構造の分子内塩基対形成部
分における不一致によって、標的の存在下で蛍光の変化
の大きさが減少する可能性があるが、分析感度が問題で
なければ許容できる。一本鎖尾部の標的／アダプター−
補体結合性配列における不一致も許容できるが、分析感
度および／または特異性が同様に低下する可能性があ
る。しかし、二次構造および標的／アダプター−補体結
合性配列の両者における完全な塩基対形成により反応が
損なわれないことが本発明の特質である。ハイブリダイ
ゼーションに関与する配列における完全一致は、反応動
力学に対してマイナスの影響を与えずに、分析特異性を
向上させる。

【００４１】本発明の検出器オリゴヌクレオチドレポー
タープローブは、増幅反応に加えられると、図１に示す
とおり、ハイブリダイゼーションおよび伸長によって二
本鎖型に転換される。ポリメラーゼによる鎖置換も二次
構造をほどくかまたは直線化し、これを相補鎖の合成に
よって二本鎖型に転換する。ＲＥＲＳも、存在する場合
には、二本鎖になり、制限エンドヌクレアーゼにより切
断可能（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）になる。二次構造が、ポ
リメラーゼの鎖置換活性によってほどかれるかまたは直
線化されるため、ドナー色素とアクセプター色素との間
の距離が増加し、その結果、ドナー蛍光の消光が減少す
る。随伴する、ドナー色素またはアクセプター色素のい
ずれかの蛍光の変化は、標的配列の増幅の指標としてモ
ニタリングまたは検出することができる。一般に、ＲＥ
ＲＳが切断されると、それぞれ、２個の色素のうちの一
方を有する２個の別個の二本鎖二次増幅生成物断片が生
成することにより、蛍光の変化の大きさがさらに増大す
る。これらの断片は、反応溶液中で自由に拡散し、ドナ
ー／アクセプター対の色素間の距離がさらに増大する。
ドナー蛍光強度の上昇またはアクセプター蛍光強度の低
下は、標的増幅が起きているまたは起きた指標として、
検出および／またはモニタリングしてもよいが、ドナー
／アクセプター色素対の接近により影響を受ける他の蛍
光パラメーターをモニタリングしてもよい。ドナーまた
はアクセプターの蛍光強度の変化は、ドナーおよび／ま
たはアクセプター蛍光強度の比率の変化として検出する
こともできる。たとえば、蛍光強度の変化は、ａ）二次
構造の直線化またはアンフォールディング後のドナーフ
ルオロフォア蛍光と直線化またはアンフォールディング
前の検出器オリゴヌクレオチドにおけるフルオロフォア
蛍光との比率の上昇、またはｂ）二次構造の直線化また
はアンフォールディング後のアクセプター色素蛍光と直
線化またはアンフォールディング前の検出器オリゴヌク
レオチドにおけるアクセプター色素蛍光との比率の低下
として検出することが可能である。

【００４２】ＳＤＡのほかにも、本発明の検出器オリゴ
ヌクレオチドは、他のプライマー伸長増幅方法（たとえ
ば、ＰＣＲ、３ＳＲ、ＴＡＳまたはＮＡＳＢＡ）のアン
プリコンの検出向けに改変することが可能である。たと
えば、ＰＣＲでＰＣＲ増幅プライマーおよび５’→３’
エキソヌクレアーゼ活性が欠如した標準置換ＤＮＡポリ
メラーゼ（たとえば、ＰｒｏｍｅｇａのＳｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇＧｒａｄｅＴａｑまたはＮｅｗＥｎｇｌａｎ
ｄＢｉｏＬａｂｓのｅｘｏ^- Ｖｅｎｔまたはｅｘｏ^-
ＤｅｅｐＶｅｎｔ）を使用することにより、ＰＣＲ
向けに方法を改変してもよい。シグナルプライマーは、
ＰＣＲ増幅プライマーから下流の標的に少なくとも部分
的にハイブリダイズし、検出器オリゴヌクレオチドレポ
ータープローブへのハイブリダーゼーションおよび後続
の伸長後、置換され、二本鎖にされる。ＰＣＲでは、Ｒ
ＥＲＳの切断よりむしろニッキングを誘導しかねない、
修飾されたデオキシヌクレオチド三リン酸が一般に存在
しないため、ＲＥＲＳを、検出器オリゴヌクレオチド向
けに任意に選択することが可能である。熱循環はＰＣＲ
による増幅の特徴であるため、制限エンドヌクレアーゼ
は、プライマーアニーリングの最終周期および増幅のエ
ンドポイント検出のための伸長の後で、低温で加えるこ
とが好ましい。しかし、ＰＣＲ反応の高温相を通じて活
性のままである好熱性制限エンドヌクレアーゼも、リア
ルタイムアッセイを提供するための増幅中ずっと存在し
得る。ＳＤＡシステムの場合と同様、色素対の分離によ
り蛍光消光が減少し、強度等の蛍光パラメータの変化が
標的増幅の指標の役割を果たす。

【００４３】検出器オリゴヌクレオチドのアンフォール
ディングまたは直鎖状にすることによる蛍光の変化を、
反応の選択されたエンドポイントで検出することができ
る。しかし、直鎖状にされた二次構造はハイブリダイゼ
ーションまたはプライマー伸長と同時に生じるため、反
応が起こるにつれて、すなわち、「リアルタイム」で、
蛍光の変化もモニタリングすることが可能である。この
同種リアルタイムアッセイ形式を使用して、存在する標
的の初期量に関する半定量的情報または定量的情報を提
供することが可能である。たとえば、（標的増幅の一部
としての、または非増幅検出法における）アンフォール
ディング反応または直鎖状反応中に蛍光強度が変化する
速度は、初期の標的レベルの指標である。結果として、
標的配列の最初のコピーがもっと多く存在するとき、ド
ナー蛍光は選択された閾値にもっと急速に到達する（す
なわち、短時間で確実になる）。アクセプター蛍光強度
の低下は、同様に、より短時間で確実になり、選択され
た最小値に達するまでに要する時間として検出される。
さらに、反応の経過中に蛍光パラメーターが変化する速
度は、初期標的含量の低いサンプルより初期標的含量の
高いサンプルで急速である（すなわち、蛍光曲線の傾斜
が大きい）。これらおよび当技術分野で周知の（たとえ
ば、米国特許第５，９２８，９０７号、１９９８年１１
月２０日提出の米国特許出願番号第０９／１９６，１２
３号、２０００年５月１９日出願の米国特許出願番号第
０９／５７４，０３１号（特に、その全てを参照するこ
とにより本明細書に組み込むこととする））他の測定
を、標的が存在する指標として、または標的増幅の指標
として実施することが可能である。初期標的量は、実験
結果と既知の標的量に関する結果との比較によって決定
される。

【００４４】本発明の方法に従って選択された標的配列
の存在に関するアッセイは、溶液または固相で実施する
ことが可能である。検出器オリゴヌクレオチドがプライ
マーとして機能するリアルタイムまたはエンドポイント
同種アッセイは、一般に溶液で実施される。本発明の検
出器オリゴヌクレオチドを使用したハイブリダイゼーシ
ョンアッセイは溶液でも実施することが可能であるが
（たとえば、同種リアルタイムアッセイ）、標的のリア
ルタイム検出またはエンドポイント検出のための固相ア
ッセイに特に適している。固相アッセイでは、当技術分
野で周知の方法を使用した内部標識または末端標識によ
って、検出器オリゴヌクレオチドを固相（たとえば、ビ
ーズ、膜または反応容器）上に固定することが可能であ
る。たとえば、ビオチン標識検出器オリゴヌクレオチド
をアビジン修飾固相上に固定することが可能であり、そ
こで、適切なハイブリダイゼーション条件で標的に曝露
すると、蛍光の変化を生じる。この方式で標的を捕捉す
ることにより、サンプルからの標的の分離が容易にな
り、アッセイのシグナルまたは他の特徴の検出を妨害す
る恐れのあるサンプル中の物質を除去することができ
る。使用することができる固相系の一例は、当技術分野
で周知のもの等の、アレー形式である。

【００４５】

【実施例】以下の実施例は、本明細書に記載の本発明の
具体的な実施形態を、例を挙げて説明する。当業者に明
らかな通り、様々な変更および修飾は、可能であり且つ
記載の発明の範囲内と考えられる。

【００４６】実施例１分析感度表１に示す増幅オリゴヌクレオチドを、ｍｉｐ標的の増
幅および検出について試験した。一部のＬ．ｐｎｅｕｍ
ｏｐｈｉｌａｍｉｐ標的インサートを含むクローン化
プラスミドの反応当たり０、１０、２０、３０、５０、
および１００コピーで、増幅反応を実施した。増幅反応
は、以下の成分の最終濃度を含む緩衝液中で、５２℃に
て実施した：４５ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．
６）、１００ｍＭのビシン(Bicine)、３５ｍＭの水酸化
カリウム、６％グリセロール、６％ジメチルスルホキシ
ド（ＤＭＳＯ）、５ｍＭの酢酸マグネシウム、７００ｎ
ｇのヒト胎盤ＤＮＡ、１０μｇのアセチル化血清アルブ
ミン、１００ｎＭの上流プライマー（配列番号１）、５
００ｎＭの下流プライマー（配列番号２）、５０ｎＭの
バンパープライマー（配列番号３〜４）、２５０ｎＭの
シグナルプライマー（配列番号６）、５００ｎｍのレポ
ータープローブ（配列番号７）、０．１ｍＭのｄＡＴ
Ｐ、０．１ｍＭのｄＧＴＰ、０．１ｍＭのｄＴＴＰ、
０．５ｍＭの２’−デオキシシチジン５’−Ｏ−（１
−チオ三リン酸）ｓ−異性体、および約２０単位のＢ
ｓｏＢ１および１０単位のＢｓｔポリメラーゼ。

【００４７】簡単に記載すると、ＤＮＡを、プライマー
およびバンパーを含む緩衝液に加える前に、９５℃にて
標的５分間変性させ、室温に冷却した。潜在的な間違っ
たプライミングを最小限に抑えるために、室温で２０分
間、続いて７２℃で１０分間、インキュベーションを続
けた。次いで、増幅酵素が入っている微量滴定ウェルに
一定量のプライミングミックを移すことにより、５２℃
で増幅を開始した。増幅およびリアルタイム検出を、５
２℃の定温で１時間実施した。レポータープローブ（配
列番号７）の、シグナルプライマー（配列番号６）の補
体へのハイブリダイゼーション、続いて起こるシグナル
プライマー補体の伸長および結果として得られる二本鎖
生成物の切断と関連した蛍光強度の変化をモニタリング
することにより、特定の増幅生成物を検出した。検出限
界（９５％の確信率を予測する目標レベルであると算定
される）は、約４０コピーであった。

【００４８】実施例２プライマー特異性の評価配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配
列番号６および配列番号７、ならびに実施例１に上述し
た反応条件を使用して、プライマー特異性を評価した。
プライマー特異性は、反応当たり５００ゲノム等価物に
て試験したＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａの異なる１６菌
株を使用して評価した（表２）。試験した菌株は全て、
計算による特異性

【００４９】

【表２】

【００５０】実施例３交差反応性の評価実施例１に記載のプライマーおよび反応条件を使用して
交差反応性を評価した。５５の微生物に由来する細胞溶
解産物を、反応当たり１０⁶ゲノム等価物にて試験し
た。確実に、増幅が抑制されないようにサンプルにスパ
イクした、部分的Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａｍｉｐ
標的インサートを含む２５０コピーのクローン化プラス
ミドを用いて、平行反応を実施した。試験した５５の微
生物のいずれでも、交差反応の証拠は得られなかった。

【００５１】

【表３】

【００５２】

【表３（つづき）】

【００５３】本発明を多少具体的に説明してきたが、本
発明の範囲から逸脱せずに、当業者に明白な修飾を行う
ことが可能である。本発明の様々な特質を特許請求の範
囲で述べる。

【００５４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Becton, Dickinson and Company <120> Amplification and Detection of Legionella Pneumophila <130> 13-390 <140> JP2001-227090 <141> 2001-07-27 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Upstream primer for SDA for Legionella pneumophila. <400> 1 accgatcgaa tgactgttct cgggggtacc gtttttgac 39 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Downstream primer for SDA for Legionella pneumophila. <400> 2 cgattccgct ccagacttct cgggataact tgtgaaacct 40 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Upstream bumper for SDA for Legionella pneumophila. <400> 3 tggtcgtctg attga 15 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Downstream bumper for SDA for Legionella pneumophila. <400> 4 acataaattt cccaagttga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Downstream bumper for SDA for Legionella pneumophila. <400> 5 cataaatttc ccaagttgat 20 <210> 6 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Signal primer for SDA for Legionella pneumophila. <400> 6 acgttagcca ccatacggat acagtaccca aaaaactggt aag 43 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc#feature <222> (1) <223> This base is modified by attachment of dabcyl. <220> <221> misc#feature <222> (15) <223> This base is modified by attachment of rhodamine. <220> <223> Description of Artificial Sequence:Reporter probe sequence for SDA for Legionella pneumophila. <400> 7 tagtgcccga gcactacgtt agccaccata cggat 35

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法に従って、鎖置換増幅（ＳＤＡ）
反応で、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ核酸ｍｉｐ標的配
列の検出を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ＢＥＣＴＯＮＤＲＩＶＥ，ＦＲＡＮＫＬＩＮＬＡＫＥＳ，ＮＥＷＪＥＲＳＥＹ 07417−1880，ＵＮＩＴＥＤＳＴＡＴＥＳＯＦＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者トーマス・エル・ブリンク，ジュニアアメリカ合衆国ペンシルヴァニア州17402, ヨーク，チェスターブルック・ドライブ 759 (72)発明者トビン・ヘルヤーアメリカ合衆国メリーランド州21117，オーウィングズ・ミルズ，ローヤルティ・サークル 110 Ｆターム(参考） 2G045 BA20 BB50 DA12 DA13 DA14 4B024 AA13 AA20 CA01 CA09 CA11 CA20 HA09 HA11 HA14 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ06 QQ42 QQ52 QR08 QR14 QR32 QR35 QR39 QR42 QR56 QR62 QS24 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＬＥＧＬ４４（配列番号１）およびＬＥ
ＧＲ５２（配列番号２）の標的結合性配列からなる群か
ら選択される標的結合性配列と、任意選択的に、増幅反
応に必要な配列とからなるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】前記増幅反応に必要な配列が、制限エン
ドヌクレアーゼでニックを入れることが可能な制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位である請求項１に記載のオリゴ
ヌクレオチド。
【請求項３】ＬＥＧＬ４４（配列番号１）およびＬＥ
ＧＲ５２（配列番号２）からなる群から選択される請求
項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】ＬＢＵＭ４４（配列番号３）、ＲＴ２Ｂ
Ｍ５２（配列番号４）およびＲＢＵＭ５２（配列番号
５）からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
【請求項５】ＬＥＧＤ６２（配列番号６）および配列
番号６に相補的なオリゴヌクレオチド。
【請求項６】間接的に検出可能なマーカーを含む請求
項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】前記間接的に検出可能なマーカーが、ア
ダプター配列である請求項６に記載のオリゴヌクレオチ
ド。
【請求項８】ａ）ＬＥＧＬ４４（配列番号１）からな
る１個のプライマーと、ｂ）ＬＥＧＲ５２（配列番号２）からなる１個のプライ
マーと、ｃ）ＬＢＵＭ４４（配列番号３）、ＲＴ２ＢＭ５２（配
列番号４）およびＲＢＵＭ５２（配列番号５）からなる
群から選択される１個以上のバンパーと、ｄ）ＬＥＧＤ６２（配列番号６）および配列番号６に相
補的な核酸からなる群から選択される１個以上のシグナ
ルプライマーとを含むキット。
【請求項９】配列番号７のレポータープローブを含む
請求項８に記載のキット。
【請求項１０】ｅ）ボルデテラ・ペルタシス(Bordete
lla pertussis)に特異的な核酸配列の増幅に特異的な一
対のプライマーと、ｆ）マイコプラズマ・ニューモニエ(Mycoplasma pneumo
niae)に特異的な核酸配列の増幅に特異的な一対のプラ
イマーと、ｇ）クラミジア感染を示す核酸配列の増幅に特異的な一
対のプライマーとをさらに含む請求項８に記載のキッ
ト。
【請求項１１】ａ）核酸に、ｉ）ＬＥＧＬ４４（配列番号１）の標的結合性配列、及
び任意選択的に増幅反応に必要な配列からなる第１の増
幅プライマーと、ｉｉ）ＬＥＧＲ５２（配列番号２）の標的結合性配列、
及び任意選択的に増幅反応に必要な配列からなる第２の
増幅プライマーとをハイブリダイズさせるステップと、ｂ）ハイブリダイズした第１および第２の増幅プライマ
ーを標的核酸配列上で伸長し、それによって標的核酸配
列を増幅させるステップとを含む、レジオネラ・ニュー
モフィラ(Legionella pneumophila)微生物の標的核酸配
列を増幅する方法。
【請求項１２】シグナルプライマーにハイブリダイズ
することによって、増幅された標的核酸を間接的に検出
するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】前記シグナルプライマーがＬＥＧＤ６
２（配列番号６）からなる請求項１２に記載の方法。