JPH1057098A - ミコバクテリウム・カンサシイの種特異的検出 - Google Patents
ミコバクテリウム・カンサシイの種特異的検出Info
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- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ミコバクテリウム・カンサシイを種特異的に
検出すること。 【解決手段】 本発明は、ミコバクテリウム・カンサシ
イ（Mycobacterium kansasii）の種特異的検出および同
定のための増幅プライマーおよび検定プローブとして有
用なオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌ
クレオチドは、ヤンら（1993）によって前に報告された
ｐ６１２３配列に由来し且つ非典型的および典型的Ｍ．
カンサシイ菌株両方の標的配列を増幅して、広範囲の
Ｍ．カンサシイ菌株についての感度のよい検出および同
定を可能にする。該オリゴヌクレオチドは、培養された
微生物を同定する手段として培養後に用いることができ
るし、またはそれらは、種々の増幅法を用いるミコバク
テリア核酸の検出および識別のための培養前にまたは培
養の代わりに用いることができる。
検出すること。 【解決手段】 本発明は、ミコバクテリウム・カンサシ
イ（Mycobacterium kansasii）の種特異的検出および同
定のための増幅プライマーおよび検定プローブとして有
用なオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌ
クレオチドは、ヤンら（1993）によって前に報告された
ｐ６１２３配列に由来し且つ非典型的および典型的Ｍ．
カンサシイ菌株両方の標的配列を増幅して、広範囲の
Ｍ．カンサシイ菌株についての感度のよい検出および同
定を可能にする。該オリゴヌクレオチドは、培養された
微生物を同定する手段として培養後に用いることができ
るし、またはそれらは、種々の増幅法を用いるミコバク
テリア核酸の検出および識別のための培養前にまたは培
養の代わりに用いることができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸増幅を用いる
微生物の検出および／または同定を含めた核酸増幅に関
する。
微生物の検出および／または同定を含めた核酸増幅に関
する。
【０００２】
【従来の技術】ミコバクテリアは、抗酸性、非自動性、
グラム陽性の桿菌である細菌の属である。この属は、限
定されるものではないが、ミコバクテリウム・アフリカ
ヌム（Mycobacterium africanum)、鳥型結核菌（M.aviu
m)、ウシ型結核菌（M.bovis)、ウシ型結核菌−ＢＣＧ、
Ｍ．ケロネエ（chelonae）、Ｍ．フォルツイツム（fort
uitum)、Ｍ．ゴルドネエ（gordonae）、Ｍ．イントラセ
ルレア（intracellulare)、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．ミク
ロティ（Microti)、Ｍ．スクロフラセウム（scrofulace
um）、パラ結核菌（M.paratuberculosis）およびヒト型
結核菌（M.tuberculosis）を含むいくつかの種を含む。
これらの微生物のいくつかは疾患の原因物質である。最
初の１９５３年以来、米国においてミコバクテリア感染
の症例は増加している。特に問題なのは結核であり、そ
の病因物質はヒト型結核菌である。これら新規の症例の
多くはエイズ流行に関係しており、それは、ミコバクテ
リアによる感染に対して特に感受性である免疫無防備集
団を与えている。他のミコバクテリア感染は、更に免疫
無防備患者の和の増加に起因して増えている。鳥型結核
菌、ミコバクテリウム・カンサシイおよび他の非結核ミ
コバクテリアは、ＨＩＶ感染および他の免疫無防備患者
において日和見性病原体として見出される。
グラム陽性の桿菌である細菌の属である。この属は、限
定されるものではないが、ミコバクテリウム・アフリカ
ヌム（Mycobacterium africanum)、鳥型結核菌（M.aviu
m)、ウシ型結核菌（M.bovis)、ウシ型結核菌−ＢＣＧ、
Ｍ．ケロネエ（chelonae）、Ｍ．フォルツイツム（fort
uitum)、Ｍ．ゴルドネエ（gordonae）、Ｍ．イントラセ
ルレア（intracellulare)、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．ミク
ロティ（Microti)、Ｍ．スクロフラセウム（scrofulace
um）、パラ結核菌（M.paratuberculosis）およびヒト型
結核菌（M.tuberculosis）を含むいくつかの種を含む。
これらの微生物のいくつかは疾患の原因物質である。最
初の１９５３年以来、米国においてミコバクテリア感染
の症例は増加している。特に問題なのは結核であり、そ
の病因物質はヒト型結核菌である。これら新規の症例の
多くはエイズ流行に関係しており、それは、ミコバクテ
リアによる感染に対して特に感受性である免疫無防備集
団を与えている。他のミコバクテリア感染は、更に免疫
無防備患者の和の増加に起因して増えている。鳥型結核
菌、ミコバクテリウム・カンサシイおよび他の非結核ミ
コバクテリアは、ＨＩＶ感染および他の免疫無防備患者
において日和見性病原体として見出される。
【０００３】ミコバクテリア感染の従来の診断は、抗酸
性染色および微生物の培養に続く生化学的検定にたよっ
ている。これらの方法は時間がかかり、そして従来の培
養法を用いる典型的な診断は６週間程度かかることがあ
る。BACTECTMシステム（ベクトン・ディキンソン・ミク
ロバイオロジー・システムズ（Becton Dickinson Micro
biology Systems)，スパークス，ＭＤ）のような自動培
養システムは、診断の時間を１週間〜２週間まで減らす
ことができる。しかしながら、ミコバクテリア感染を診
断するのに必要な時間を１週間未満に、好ましくは、ほ
ぼ１日に短縮することがなお要求されている。サザンハ
イブリダイゼーションまたはドットブロットなどの検定
に基づくオリゴヌクレオチドプローブは、迅速な結果を
もたらすことができる（すなわち、１日以内）。核酸の
増幅に基づく検定は、通常、より感度がよく且つより一
層迅速な結果をしばしば数時間以内に与えることができ
る。ミコバクテリア感染の診断のために、このような方
法は、微生物の特異的同定が望まれる場合に、ミコバク
テリウム属に特異的であるかまたはミコバクテリアの特
定の種に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブまた
はプライマーの開発を必要とする。
性染色および微生物の培養に続く生化学的検定にたよっ
ている。これらの方法は時間がかかり、そして従来の培
養法を用いる典型的な診断は６週間程度かかることがあ
る。BACTECTMシステム（ベクトン・ディキンソン・ミク
ロバイオロジー・システムズ（Becton Dickinson Micro
biology Systems)，スパークス，ＭＤ）のような自動培
養システムは、診断の時間を１週間〜２週間まで減らす
ことができる。しかしながら、ミコバクテリア感染を診
断するのに必要な時間を１週間未満に、好ましくは、ほ
ぼ１日に短縮することがなお要求されている。サザンハ
イブリダイゼーションまたはドットブロットなどの検定
に基づくオリゴヌクレオチドプローブは、迅速な結果を
もたらすことができる（すなわち、１日以内）。核酸の
増幅に基づく検定は、通常、より感度がよく且つより一
層迅速な結果をしばしば数時間以内に与えることができ
る。ミコバクテリア感染の診断のために、このような方
法は、微生物の特異的同定が望まれる場合に、ミコバク
テリウム属に特異的であるかまたはミコバクテリアの特
定の種に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブまた
はプライマーの開発を必要とする。
【０００４】ミコバクテリウム・カンサシイの従来の実
験室同定は、成長特性の生化学的検査および確認に基づ
いている。これらには、カタラーゼ生産、ウレアーゼ活
性、トゥイーン加水分解、硝酸塩還元、および光に対し
て暴露された場合に色素を生じる細菌の能力（光発色
性）が含まれる。いくつかの他のミコバクテリア種が同
様の生化学的プロフィールを示すので、光発色性は、概
して、ミコバクテリウム・カンサシイの最終的同定のた
めに信頼されている。しかしながら、光発色性の確認に
は、微生物の純粋培養を必要とし、そしてこの表現型は
変化しやすく、主観的であり、そして信頼性を決定しに
くいことがありうる。これらの理由のために、オリゴヌ
クレオチドプローブを用いる種特異的ハイブリダイゼー
ションまたは核酸増幅によってミコバクテリウム・カン
サシイを同定することが試みられてきた。Z.H.ワン（Hu
ang）ら（1991年，J.Clin.Microbiol.29,2125-2129）
は、ミコバクテリウム・カンサシイに対してある程度の
種特異性を有するゲノムライブラリーから得られたＤＮ
Ａプローブを報告した。このクローン（ｐＭＫ１−９）
は、Ｍ．ガストリ（gastri）を含めた他の種と若干のク
ロスハイブリダイゼーションを示したが、Ｍ．カンサシ
イの遺伝的に異なるサブグループを検出しなかった。ｐ
ＭＫ１−９のヌクレオチド配列は報告されなかったし、
それが由来したかもしれない遺伝子も確認されなかっ
た。B.C.ロス（Ross）ら（1992年，J.Clin.Microbiol.3
0,2930-2933）は、更に、ｐＭＫ１−９プローブ、６５
ｋＤａ抗原遺伝子プローブ、およびｒＲＮＡに対して特
異的にハイブリッド形成するプローブ（ACCU-PROBE，ジ
ェン・プローブ（Gen-Probe），サン・ディエゴ，Ｃ
Ａ）を用いる市販のＤＮＡプローブ試験を用いる、Ｍ．
カンサシイの遺伝的に異なる亜種の同定を報告した。
Ｔ．ロガル（Rogall）ら（1990年，J.Gen.Microbiol.13
6,1915-1920）は、ミクロバクテリア種の同定のための
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく配列決定法に
おいて１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を用いた。しかしながら、
これらのプライマーは、Ｍ．ガストリをＭ．カンサシイ
と区別するのに、これら二つの種からの１６Ｓ ｒＲＮ
Ａ配列が、それらの異なった表現型特性にもかかわらず
一致するために用いることができなかった。同様の実験
は、Ｂ．ベディングハオス（Boddinghaus）ら（1990
年，J.Clin.Microbiol.28,1751-1759）によって公表さ
れており、彼らは、ヒト型結核菌グループ、すなわち、
鳥型結核菌−パラ結核菌およびＭ．イントラセルレアに
特異的である１６Ｓ ｒＲＮＡ配列に由来するオリゴヌ
クレオチドを報告した。Ｍ．ヤン（Yang）ら（1993年，
J.Clin.Microbiol.31,2769-2772）は、ハイブリダイゼ
ーションプローブとして用いられた場合にＭ．カンサシ
イ種特異性を示す臨床的単離物からの配列の単離を報告
している。このプローブ（ｐ６１２３）は、ｐＭＫ１−
９陰性であるサブグループを含めた、試験されたＭ．カ
ンサシイ菌株全部にハイブリッド形成した。P.A.スピア
ス（Spears）（米国特許第5,500,341号）は、ヌクレオ
チド５１〜２２０のｐ６１２３の部分に由来するＭ．カ
ンサシイ特異的プライマーを記載している。
験室同定は、成長特性の生化学的検査および確認に基づ
いている。これらには、カタラーゼ生産、ウレアーゼ活
性、トゥイーン加水分解、硝酸塩還元、および光に対し
て暴露された場合に色素を生じる細菌の能力（光発色
性）が含まれる。いくつかの他のミコバクテリア種が同
様の生化学的プロフィールを示すので、光発色性は、概
して、ミコバクテリウム・カンサシイの最終的同定のた
めに信頼されている。しかしながら、光発色性の確認に
は、微生物の純粋培養を必要とし、そしてこの表現型は
変化しやすく、主観的であり、そして信頼性を決定しに
くいことがありうる。これらの理由のために、オリゴヌ
クレオチドプローブを用いる種特異的ハイブリダイゼー
ションまたは核酸増幅によってミコバクテリウム・カン
サシイを同定することが試みられてきた。Z.H.ワン（Hu
ang）ら（1991年，J.Clin.Microbiol.29,2125-2129）
は、ミコバクテリウム・カンサシイに対してある程度の
種特異性を有するゲノムライブラリーから得られたＤＮ
Ａプローブを報告した。このクローン（ｐＭＫ１−９）
は、Ｍ．ガストリ（gastri）を含めた他の種と若干のク
ロスハイブリダイゼーションを示したが、Ｍ．カンサシ
イの遺伝的に異なるサブグループを検出しなかった。ｐ
ＭＫ１−９のヌクレオチド配列は報告されなかったし、
それが由来したかもしれない遺伝子も確認されなかっ
た。B.C.ロス（Ross）ら（1992年，J.Clin.Microbiol.3
0,2930-2933）は、更に、ｐＭＫ１−９プローブ、６５
ｋＤａ抗原遺伝子プローブ、およびｒＲＮＡに対して特
異的にハイブリッド形成するプローブ（ACCU-PROBE，ジ
ェン・プローブ（Gen-Probe），サン・ディエゴ，Ｃ
Ａ）を用いる市販のＤＮＡプローブ試験を用いる、Ｍ．
カンサシイの遺伝的に異なる亜種の同定を報告した。
Ｔ．ロガル（Rogall）ら（1990年，J.Gen.Microbiol.13
6,1915-1920）は、ミクロバクテリア種の同定のための
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく配列決定法に
おいて１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を用いた。しかしながら、
これらのプライマーは、Ｍ．ガストリをＭ．カンサシイ
と区別するのに、これら二つの種からの１６Ｓ ｒＲＮ
Ａ配列が、それらの異なった表現型特性にもかかわらず
一致するために用いることができなかった。同様の実験
は、Ｂ．ベディングハオス（Boddinghaus）ら（1990
年，J.Clin.Microbiol.28,1751-1759）によって公表さ
れており、彼らは、ヒト型結核菌グループ、すなわち、
鳥型結核菌−パラ結核菌およびＭ．イントラセルレアに
特異的である１６Ｓ ｒＲＮＡ配列に由来するオリゴヌ
クレオチドを報告した。Ｍ．ヤン（Yang）ら（1993年，
J.Clin.Microbiol.31,2769-2772）は、ハイブリダイゼ
ーションプローブとして用いられた場合にＭ．カンサシ
イ種特異性を示す臨床的単離物からの配列の単離を報告
している。このプローブ（ｐ６１２３）は、ｐＭＫ１−
９陰性であるサブグループを含めた、試験されたＭ．カ
ンサシイ菌株全部にハイブリッド形成した。P.A.スピア
ス（Spears）（米国特許第5,500,341号）は、ヌクレオ
チド５１〜２２０のｐ６１２３の部分に由来するＭ．カ
ンサシイ特異的プライマーを記載している。
【０００５】以下の用語を、本明細書中において次の通
り定義する。
り定義する。
【０００６】増幅プライマーは、標的配列に対するハイ
ブリダイゼーション後のプライマーの伸長による標的配
列の増幅のためのプライマーである。増幅プライマー
は、典型的に、約１０〜７５ヌクレオチド長さ、好まし
くは、約１５〜５０ヌクレオチド長さである。ＳＤＡの
ための増幅プライマーの全長は、典型的に、約２５〜５
０ヌクレオチド長さである。ＳＤＡ増幅プライマー（標
的結合配列）の３′末端は、標的配列の３′末端にハイ
ブリッド形成する。標的結合配列は、約１０〜２５ヌク
レオチド長さであり且つ増幅プライマーにハイブリダイ
ゼーション特異性を与える。ＳＤＡ増幅プライマーは、
更に、その標的結合配列に対して５′に制限エンドヌク
レアーゼの認識部位を含む。その認識部位は、Ｇ．ウォ
ーカーら（1992年，PNAS,89:392-396 および 1992年，N
ucl.Acids Res.20:1691-1696）によって記載されたよう
に、認識部位が半修飾されている場合にＤＮＡ二重らせ
んの一方の鎖にニックを入れるであろう制限エンドヌク
レアーゼに対する。制限エンドヌクレアーゼ認識部位に
対して５′のヌクレオチド（「尾部」）は、増幅プライ
マーの残部がＳＤＡの際にニックを入れられ且つ置換さ
れる場合、ポリメラーゼリプライミング部位として機能
する。尾部ヌクレオチドのリプライミング機能は、ＳＤ
Ａ反応を維持し且つ一つの標的分子から多数のアンプリ
コンを合成させる。その尾部は、典型的に、約１０〜２
５ヌクレオチド長さである。その長さおよび配列は、概
して臨界的ではなく、そして常套手段によって選択され
且つ修飾されて、ハイブリダイゼーションに望ましいＴ
mを得ることができる。標的結合配列は、その標的特異
性を決定するプライマーの一部分であるので、標的の末
端に特殊な配列を必要としない増幅法では、増幅プライ
マーは、概して、本質的に標的結合配列だけから成る。
ニッキング可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位およ
びＳＤＡのプライマー尾部以外の、標的に対して付加さ
れる特殊な配列（例えば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡまたは転
写に基く増幅のためのＲＮＡポリメラーゼプロモータ
ー）を必要とする増幅法では、必要とされる特殊な配列
を、プライマーのハイブリダイゼーション特異性を変更
することなく、オリゴヌクレオチドの製造のための常套
法を用いて標的結合配列に対して結合させることができ
る。
ブリダイゼーション後のプライマーの伸長による標的配
列の増幅のためのプライマーである。増幅プライマー
は、典型的に、約１０〜７５ヌクレオチド長さ、好まし
くは、約１５〜５０ヌクレオチド長さである。ＳＤＡの
ための増幅プライマーの全長は、典型的に、約２５〜５
０ヌクレオチド長さである。ＳＤＡ増幅プライマー（標
的結合配列）の３′末端は、標的配列の３′末端にハイ
ブリッド形成する。標的結合配列は、約１０〜２５ヌク
レオチド長さであり且つ増幅プライマーにハイブリダイ
ゼーション特異性を与える。ＳＤＡ増幅プライマーは、
更に、その標的結合配列に対して５′に制限エンドヌク
レアーゼの認識部位を含む。その認識部位は、Ｇ．ウォ
ーカーら（1992年，PNAS,89:392-396 および 1992年，N
ucl.Acids Res.20:1691-1696）によって記載されたよう
に、認識部位が半修飾されている場合にＤＮＡ二重らせ
んの一方の鎖にニックを入れるであろう制限エンドヌク
レアーゼに対する。制限エンドヌクレアーゼ認識部位に
対して５′のヌクレオチド（「尾部」）は、増幅プライ
マーの残部がＳＤＡの際にニックを入れられ且つ置換さ
れる場合、ポリメラーゼリプライミング部位として機能
する。尾部ヌクレオチドのリプライミング機能は、ＳＤ
Ａ反応を維持し且つ一つの標的分子から多数のアンプリ
コンを合成させる。その尾部は、典型的に、約１０〜２
５ヌクレオチド長さである。その長さおよび配列は、概
して臨界的ではなく、そして常套手段によって選択され
且つ修飾されて、ハイブリダイゼーションに望ましいＴ
mを得ることができる。標的結合配列は、その標的特異
性を決定するプライマーの一部分であるので、標的の末
端に特殊な配列を必要としない増幅法では、増幅プライ
マーは、概して、本質的に標的結合配列だけから成る。
ニッキング可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位およ
びＳＤＡのプライマー尾部以外の、標的に対して付加さ
れる特殊な配列（例えば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡまたは転
写に基く増幅のためのＲＮＡポリメラーゼプロモータ
ー）を必要とする増幅法では、必要とされる特殊な配列
を、プライマーのハイブリダイゼーション特異性を変更
することなく、オリゴヌクレオチドの製造のための常套
法を用いて標的結合配列に対して結合させることができ
る。
【０００７】バンパープライマーすなわち外プライマー
は、等温増幅反応においてプライマー伸長生成物を置換
するのに用いられるプライマーである。バンパープライ
マーは、バンパープライマーの伸長が下流の増幅プライ
マーおよびその伸長生成物を置換するように、増幅プラ
イマーの上流の標的配列に対してアニーリングする。
は、等温増幅反応においてプライマー伸長生成物を置換
するのに用いられるプライマーである。バンパープライ
マーは、バンパープライマーの伸長が下流の増幅プライ
マーおよびその伸長生成物を置換するように、増幅プラ
イマーの上流の標的配列に対してアニーリングする。
【０００８】標的または標的配列という用語は、増幅さ
れる核酸配列を意味する。これらは、増幅される元の核
酸配列、増幅される元の核酸配列の相補的第二鎖、およ
び増幅反応によって生成される元の配列のコピーのどち
らかの鎖を含む。これらのコピーは、増幅プライマーが
ハイブリッド形成する配列のコピーをそれらが含んでい
るという事実により、増幅可能な標的配列として役立
つ。
れる核酸配列を意味する。これらは、増幅される元の核
酸配列、増幅される元の核酸配列の相補的第二鎖、およ
び増幅反応によって生成される元の配列のコピーのどち
らかの鎖を含む。これらのコピーは、増幅プライマーが
ハイブリッド形成する配列のコピーをそれらが含んでい
るという事実により、増幅可能な標的配列として役立
つ。
【０００９】増幅反応中に生じる標的配列のコピーは、
増幅生成物、アンプリマーまたはアンプリコンと称され
る。
増幅生成物、アンプリマーまたはアンプリコンと称され
る。
【００１０】伸長生成物という用語は、プライマーのハ
イブリダイゼーションおよび標的配列を鋳型として用い
るポリメラーゼによるプライマーの伸長によって生じた
標的配列のコピーを意味する。
イブリダイゼーションおよび標的配列を鋳型として用い
るポリメラーゼによるプライマーの伸長によって生じた
標的配列のコピーを意味する。
【００１１】種特異的という用語は、同属の他の種また
は異なる属の種における実質的な検出、増幅またはオリ
ゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを含まない、微
生物の種または関連種のグループにおける検出、増幅ま
たはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを意味
する。
は異なる属の種における実質的な検出、増幅またはオリ
ゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを含まない、微
生物の種または関連種のグループにおける検出、増幅ま
たはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを意味
する。
【００１２】検定プローブという用語は、核酸の検出ま
たは識別を容易にするのに用いられる任意のオリゴヌク
レオチドを意味する。例えば、本発明において、検定プ
ローブは、ミコバクテリウム・カンサシイ核酸の検出ま
たは識別のために用いられる。以下に記載の検出用プロ
ーブ、検出用プライマー、捕捉プローブおよびシグナル
プライマーは検定プローブの例である。
たは識別を容易にするのに用いられる任意のオリゴヌク
レオチドを意味する。例えば、本発明において、検定プ
ローブは、ミコバクテリウム・カンサシイ核酸の検出ま
たは識別のために用いられる。以下に記載の検出用プロ
ーブ、検出用プライマー、捕捉プローブおよびシグナル
プライマーは検定プローブの例である。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ミコバクテ
リウム・カンサシイの種特異的検出および同定のための
増幅プライマーおよび検定プローブとして有用なオリゴ
ヌクレオチドを提供する。種特異的とは、本発明のプラ
イマーが、ミコバクテリアの他の種またはＭ．ガスト
リ、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodoc
hrous）およびノカルジア・アステロイデス（Nocardia
asteroides）などの近縁の微生物の標的配列の検出可能
な増幅をほとんどまたは全く伴うことなく、Ｍ．カンサ
シイ核酸中の標的配列を増幅することを意味する。本発
明の増幅プライマーは、ヤンら（1993）によって前に報
告されたｐ６１２３配列に由来する。米国特許第5,500,
341号で記載された標的は、ＢｓｏＢＩが、選択された
ニッキング可能な制限エンドヌクレアーゼ部位である場
合にそれをｔＳＤＡに不適当にするＢｓｏＢＩ部位を含
むので、本発明のプライマーは、その'341号特許のもの
とは異なるｐ６１２３の部分に由来する。本発明のプラ
イマーは、非典型的および典型的Ｍ．カンサシイ菌株両
方の標的配列を増幅し、広範囲のＭ．カンサシイ菌株に
ついての感度のよい検出および同定を可能にする。
リウム・カンサシイの種特異的検出および同定のための
増幅プライマーおよび検定プローブとして有用なオリゴ
ヌクレオチドを提供する。種特異的とは、本発明のプラ
イマーが、ミコバクテリアの他の種またはＭ．ガスト
リ、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodoc
hrous）およびノカルジア・アステロイデス（Nocardia
asteroides）などの近縁の微生物の標的配列の検出可能
な増幅をほとんどまたは全く伴うことなく、Ｍ．カンサ
シイ核酸中の標的配列を増幅することを意味する。本発
明の増幅プライマーは、ヤンら（1993）によって前に報
告されたｐ６１２３配列に由来する。米国特許第5,500,
341号で記載された標的は、ＢｓｏＢＩが、選択された
ニッキング可能な制限エンドヌクレアーゼ部位である場
合にそれをｔＳＤＡに不適当にするＢｓｏＢＩ部位を含
むので、本発明のプライマーは、その'341号特許のもの
とは異なるｐ６１２３の部分に由来する。本発明のプラ
イマーは、非典型的および典型的Ｍ．カンサシイ菌株両
方の標的配列を増幅し、広範囲のＭ．カンサシイ菌株に
ついての感度のよい検出および同定を可能にする。
【００１４】本発明のオリゴヌクレオチドは、培養され
た微生物を同定する手段として培養後に用いることがで
きる。或いは、それらは、既知の増幅法を用いるミコバ
クテリア核酸の検出および識別のための培養前にまたは
培養の代わりに用いることができる。どちらの場合に
も、本発明のオリゴヌクレオチドおよび検定法は、Ｍ．
カンサシイとミコバクテリアの他の種との核酸を速やか
に区別する手段を提供し、実施者が、慣例的に頼られた
時間のかかる表現型および生化学的方法に頼ることなく
この微生物を速やかに同定することを可能にする。ミコ
バクテリア感染に関係した独特の病因物質のこのような
迅速な識別は、短時間の内に適切な療法を決定するのに
用いることができる情報を提供する。
た微生物を同定する手段として培養後に用いることがで
きる。或いは、それらは、既知の増幅法を用いるミコバ
クテリア核酸の検出および識別のための培養前にまたは
培養の代わりに用いることができる。どちらの場合に
も、本発明のオリゴヌクレオチドおよび検定法は、Ｍ．
カンサシイとミコバクテリアの他の種との核酸を速やか
に区別する手段を提供し、実施者が、慣例的に頼られた
時間のかかる表現型および生化学的方法に頼ることなく
この微生物を速やかに同定することを可能にする。ミコ
バクテリア感染に関係した独特の病因物質のこのような
迅速な識別は、短時間の内に適切な療法を決定するのに
用いることができる情報を提供する。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、核酸増幅反応
においてＭ．カンサシイ特異性を示すオリゴヌクレオチ
ド、増幅プライマーおよび検定プローブを提供する。更
に提供されるのは、本発明のオリゴヌクレオチドを用い
てＭ．カンサシイ核酸を検出し且つ識別する方法であ
る。試験されたＭ．カンサシイ単離物はいずれも（典型
的および非典型的菌株両方）、本発明のオリゴヌクレオ
チドを用いる増幅検定において陽性であった。
においてＭ．カンサシイ特異性を示すオリゴヌクレオチ
ド、増幅プライマーおよび検定プローブを提供する。更
に提供されるのは、本発明のオリゴヌクレオチドを用い
てＭ．カンサシイ核酸を検出し且つ識別する方法であ
る。試験されたＭ．カンサシイ単離物はいずれも（典型
的および非典型的菌株両方）、本発明のオリゴヌクレオ
チドを用いる増幅検定において陽性であった。
【００１６】プライマーＭＹ−４（TCGCAGAACGCGACAAAC
GGTG，配列番号：１）およびＭＹ−１（TGATGAAACGTGTT
TTGCCAGCG，配列番号：２）を、ヤンらによって公表さ
れたｐ６１２３配列に基づいて設計し、そしてＰＣＲ反
応で用いて、ｐ６１２３クローン中に含まれる５００塩
基対フラグメントの３３１塩基対セグメントを増幅させ
た。このセグメントは、Ｍ．カンサシイの１３種類の典
型的および非典型的単離物において増幅され且つ配列決
定された。得られた配列は、Ｍ．カンサシイの典型的お
よび非典型的菌株両方の標的を種特異的に増幅させるで
あろう増幅プライマーを設計することを試みて並べられ
た。４組の増幅プライマーの標的結合配列を、それらの
配列順序に基づいて選択した。４プライマーセットは、
３３１塩基対セグメント中でオーバーラップする標的配
列を規定した。ＳＤＡに必要な標的結合配列および追加
の配列を含むプライマーを合成し且つ試験した。意外に
も、一つのセットだけが、この部分のｐ６１２３標的の
有効な増幅を引き起こした。残りの３セットは、検出可
能な水準で標的を増幅することが全くないかまたは診断
用途で有用であるにはあまりに感度が悪かった。増幅反
応条件の最適化は、これら３種類のプライマーセットを
用いて増幅効率を向上させることはできなかった。有効
な増幅を与えたプライマーセットは、表１で示される、
３個の上流増幅プライマーおよび２個の下流増幅プライ
マーの標的結合配列から成った。表１において、標的結
合配列はイタリック体で示され、そして典型的な制限部
位（ＢｓｏＢＩ）は太字で示される。
GGTG，配列番号：１）およびＭＹ−１（TGATGAAACGTGTT
TTGCCAGCG，配列番号：２）を、ヤンらによって公表さ
れたｐ６１２３配列に基づいて設計し、そしてＰＣＲ反
応で用いて、ｐ６１２３クローン中に含まれる５００塩
基対フラグメントの３３１塩基対セグメントを増幅させ
た。このセグメントは、Ｍ．カンサシイの１３種類の典
型的および非典型的単離物において増幅され且つ配列決
定された。得られた配列は、Ｍ．カンサシイの典型的お
よび非典型的菌株両方の標的を種特異的に増幅させるで
あろう増幅プライマーを設計することを試みて並べられ
た。４組の増幅プライマーの標的結合配列を、それらの
配列順序に基づいて選択した。４プライマーセットは、
３３１塩基対セグメント中でオーバーラップする標的配
列を規定した。ＳＤＡに必要な標的結合配列および追加
の配列を含むプライマーを合成し且つ試験した。意外に
も、一つのセットだけが、この部分のｐ６１２３標的の
有効な増幅を引き起こした。残りの３セットは、検出可
能な水準で標的を増幅することが全くないかまたは診断
用途で有用であるにはあまりに感度が悪かった。増幅反
応条件の最適化は、これら３種類のプライマーセットを
用いて増幅効率を向上させることはできなかった。有効
な増幅を与えたプライマーセットは、表１で示される、
３個の上流増幅プライマーおよび２個の下流増幅プライ
マーの標的結合配列から成った。表１において、標的結
合配列はイタリック体で示され、そして典型的な制限部
位（ＢｓｏＢＩ）は太字で示される。
【００１７】
【表１】
【００１８】ＳＤＡにおける増幅効率および特異性を調
べるために、ＳＤＡに必要なバンパープライマーおよび
増幅生成物の検出に用いるための検定プローブもまた、
配列順序に基づいて設計された。これらには、バンパー
プライマーＢ１（5'AGTGGTCATGAGATG3'，配列番号：
８）、バンパープライマーＢ２（5'CGGACTTCTTTCGT3'，
配列番号：９）および３個の検出用プローブ（ＤＩＡ，
5'CTGCTGGACACCAC3'，配列番号：１０；Ｄ２Ａ，5'AGCC
GTTCCAGGAC3'，配列番号：１１；Ｄ３Ａ，5'GCCGGTGGTG
TCCA3'，配列番号：１２）が含まれた。
べるために、ＳＤＡに必要なバンパープライマーおよび
増幅生成物の検出に用いるための検定プローブもまた、
配列順序に基づいて設計された。これらには、バンパー
プライマーＢ１（5'AGTGGTCATGAGATG3'，配列番号：
８）、バンパープライマーＢ２（5'CGGACTTCTTTCGT3'，
配列番号：９）および３個の検出用プローブ（ＤＩＡ，
5'CTGCTGGACACCAC3'，配列番号：１０；Ｄ２Ａ，5'AGCC
GTTCCAGGAC3'，配列番号：１１；Ｄ３Ａ，5'GCCGGTGGTG
TCCA3'，配列番号：１２）が含まれた。
【００１９】核酸は、ハイブリッド形成するのに完全な
相補性を必要としないので、本明細書中で開示されたプ
ローブおよびプライマー配列を、Ｍ．カンサシイ特異的
プローブおよびプライマーとしての有用性を損なうこと
なくある程度修飾しうることは理解されるはずである。
当該技術分野において知られているように、相補的およ
び部分相補的核酸配列のハイブリダイゼーションは、緊
縮を増加させるまたは減少させるハイブリダイゼーショ
ン条件の調整（すなわち、ハイブリダイゼーション温度
または緩衝液の塩含量の調整）によって得ることができ
る。開示された配列のこのような僅かな修飾およびＭ．
カンサシイ特異性を維持するハイブリダイゼーション条
件の何等かの必要な調整は、常套の実験のみを必要とし
且つ当該技術の範囲内である。
相補性を必要としないので、本明細書中で開示されたプ
ローブおよびプライマー配列を、Ｍ．カンサシイ特異的
プローブおよびプライマーとしての有用性を損なうこと
なくある程度修飾しうることは理解されるはずである。
当該技術分野において知られているように、相補的およ
び部分相補的核酸配列のハイブリダイゼーションは、緊
縮を増加させるまたは減少させるハイブリダイゼーショ
ン条件の調整（すなわち、ハイブリダイゼーション温度
または緩衝液の塩含量の調整）によって得ることができ
る。開示された配列のこのような僅かな修飾およびＭ．
カンサシイ特異性を維持するハイブリダイゼーション条
件の何等かの必要な調整は、常套の実験のみを必要とし
且つ当該技術の範囲内である。
【００２０】本発明のプライマーを用いて生成された増
幅生成物は、特徴的な寸法によって、例えば、臭化エチ
ジウムで染色されたポリアクリルアミドまたはアガロー
スゲル上で検出することができる。或いは、増幅された
Ｍ．カンサシイ標的配列は、検出可能な標識で標識され
たオリゴヌクレオチドである検定プローブによって検出
することができる。一つの実施態様において、少なくと
も一つの標識付き検定プローブは、ハイブリダイゼーシ
ョンによって（検出用プローブ）、ウォーカーら，Nuc
l.Acids Res.,上記によって記載のハイブリダイゼーシ
ョンおよび伸長によって（検出用プライマー）、または
欧州特許第0678582号で記載のハイブリダイゼーショ
ン、伸長および二本鎖型への変換によって（シグナルプ
ライマー）、増幅された標的配列の検出に用いることが
できる。好ましくは、検定プローブは、増幅プライマー
間にある標的中の配列に対してハイブリッド形成するよ
うに選択され、すなわち、それは内部検定プローブであ
るべきである。或いは、増幅プライマーまたはその標的
結合配列は、検定プローブとして用いることができる。
幅生成物は、特徴的な寸法によって、例えば、臭化エチ
ジウムで染色されたポリアクリルアミドまたはアガロー
スゲル上で検出することができる。或いは、増幅された
Ｍ．カンサシイ標的配列は、検出可能な標識で標識され
たオリゴヌクレオチドである検定プローブによって検出
することができる。一つの実施態様において、少なくと
も一つの標識付き検定プローブは、ハイブリダイゼーシ
ョンによって（検出用プローブ）、ウォーカーら，Nuc
l.Acids Res.,上記によって記載のハイブリダイゼーシ
ョンおよび伸長によって（検出用プライマー）、または
欧州特許第0678582号で記載のハイブリダイゼーショ
ン、伸長および二本鎖型への変換によって（シグナルプ
ライマー）、増幅された標的配列の検出に用いることが
できる。好ましくは、検定プローブは、増幅プライマー
間にある標的中の配列に対してハイブリッド形成するよ
うに選択され、すなわち、それは内部検定プローブであ
るべきである。或いは、増幅プライマーまたはその標的
結合配列は、検定プローブとして用いることができる。
【００２１】検定プローブの検出可能な標識は、標的核
酸の存在を示すものとして直接的にかまたは間接的に検
出することができる残基である。標識の直接的検出に対
して、検定プローブは、放射性同位体で標識され且つオ
ートラジオグラフィーによって検出されうるしまたは蛍
光残基で標識され且つ当該技術分野において知られてい
るように蛍光によって検出されうる。或いは、検定プロ
ーブは、標識を検出可能にするのに更に別の試薬を必要
とする標識を付けることによって間接的に検出すること
ができる。間接的に検出可能な標識としては、例えば、
化学発光物質、目に見える反応生成物を生じる酵素、お
よび標識された特異的結合パートナー（例えば、抗体ま
たは抗原／ハプテン）に対して結合することによって検
出することができるリガンド（例えば、ハプテン、抗体
または抗原）がある。リガンドは、固相上にリガンドで
標識されたオリゴヌクレオチド（捕捉プローブ）を固定
してその検出を容易にするのにも有用である。特に有用
な標識としては、（標識されたアビジンまたはストレプ
トアビジンに対して結合することによって検出可能な）
ビオチンおよび（着色反応生成物を生じる酵素基質の添
加によって検出可能な）西洋ワサビペルオキシダーゼま
たはアルカリ性ホスファターゼなどの酵素がある。この
ような標識をオリゴヌクレオチドに対して加えるまたは
このような標識をオリゴヌクレオチド中に包含させる方
法は当該技術分野において周知であり、そしてこれらの
方法はいずれも、本発明において用いるのに適してい
る。
酸の存在を示すものとして直接的にかまたは間接的に検
出することができる残基である。標識の直接的検出に対
して、検定プローブは、放射性同位体で標識され且つオ
ートラジオグラフィーによって検出されうるしまたは蛍
光残基で標識され且つ当該技術分野において知られてい
るように蛍光によって検出されうる。或いは、検定プロ
ーブは、標識を検出可能にするのに更に別の試薬を必要
とする標識を付けることによって間接的に検出すること
ができる。間接的に検出可能な標識としては、例えば、
化学発光物質、目に見える反応生成物を生じる酵素、お
よび標識された特異的結合パートナー（例えば、抗体ま
たは抗原／ハプテン）に対して結合することによって検
出することができるリガンド（例えば、ハプテン、抗体
または抗原）がある。リガンドは、固相上にリガンドで
標識されたオリゴヌクレオチド（捕捉プローブ）を固定
してその検出を容易にするのにも有用である。特に有用
な標識としては、（標識されたアビジンまたはストレプ
トアビジンに対して結合することによって検出可能な）
ビオチンおよび（着色反応生成物を生じる酵素基質の添
加によって検出可能な）西洋ワサビペルオキシダーゼま
たはアルカリ性ホスファターゼなどの酵素がある。この
ような標識をオリゴヌクレオチドに対して加えるまたは
このような標識をオリゴヌクレオチド中に包含させる方
法は当該技術分野において周知であり、そしてこれらの
方法はいずれも、本発明において用いるのに適してい
る。
【００２２】用いることができる特異的検出法の例とし
ては、米国特許第5,470,723号で記載のようにビオチニ
ル化捕捉プローブおよび酵素に結合した検出用プローブ
を用いて増幅生成物を検出する化学発光法がある。標的
配列の検定範囲中の異なる部位（二つの増幅プライマー
の結合部位間）に対するこれら二つの検定プローブのハ
イブリダイゼーション後、複合体を、ストレプトアビジ
ンで被覆された微量滴定プレート上で捕捉プローブによ
って捕捉し、そして化学発光シグナルを生じさせ且つル
ミノメーターで読み取る。増幅生成物の検出のもう一つ
の別の方法として、欧州特許第0678582号で記載のシグ
ナルプライマーをＳＤＡ反応に包含させることができ
る。この実施態様において、標識された二次増幅生成物
は、ＳＤＡ中に標的増幅依存方式で生じ、そして結合し
た標識によって標的増幅を示すものとして検出されう
る。
ては、米国特許第5,470,723号で記載のようにビオチニ
ル化捕捉プローブおよび酵素に結合した検出用プローブ
を用いて増幅生成物を検出する化学発光法がある。標的
配列の検定範囲中の異なる部位（二つの増幅プライマー
の結合部位間）に対するこれら二つの検定プローブのハ
イブリダイゼーション後、複合体を、ストレプトアビジ
ンで被覆された微量滴定プレート上で捕捉プローブによ
って捕捉し、そして化学発光シグナルを生じさせ且つル
ミノメーターで読み取る。増幅生成物の検出のもう一つ
の別の方法として、欧州特許第0678582号で記載のシグ
ナルプライマーをＳＤＡ反応に包含させることができ
る。この実施態様において、標識された二次増幅生成物
は、ＳＤＡ中に標的増幅依存方式で生じ、そして結合し
た標識によって標的増幅を示すものとして検出されう
る。
【００２３】商業的便宜上、Ｍ．カンサシイ核酸の種特
異的検出および識別のための増幅プライマーは、キット
の形で包装することができる。典型的に、このようなキ
ットは、本発明による少なくとも１対の増幅プライマー
を含む。Ｍ．カンサシイ特異的増幅プライマーと一緒
に、核酸増幅反応を行うための試薬、例えば、緩衝剤、
追加のプライマー、ヌクレオチド三リン酸、酵素等も含
まれることができる。キットの成分は、共通の容器中に
一緒に包装され、場合により、本発明の方法の独特の実
施態様を行うための器具が含まれる。他の任意の成分、
例えば、検定プローブとして用いるのに適当な標識を付
けられたオリゴヌクレオチド、および／またはその標識
を検出するための試薬若しくは手段もキット中に含まれ
ることができる。
異的検出および識別のための増幅プライマーは、キット
の形で包装することができる。典型的に、このようなキ
ットは、本発明による少なくとも１対の増幅プライマー
を含む。Ｍ．カンサシイ特異的増幅プライマーと一緒
に、核酸増幅反応を行うための試薬、例えば、緩衝剤、
追加のプライマー、ヌクレオチド三リン酸、酵素等も含
まれることができる。キットの成分は、共通の容器中に
一緒に包装され、場合により、本発明の方法の独特の実
施態様を行うための器具が含まれる。他の任意の成分、
例えば、検定プローブとして用いるのに適当な標識を付
けられたオリゴヌクレオチド、および／またはその標識
を検出するための試薬若しくは手段もキット中に含まれ
ることができる。
【００２４】増幅プライマーの標的結合配列はオリゴヌ
クレオチドに種ハイブリダイゼーション特異性を与え、
したがって、増幅反応に対する種特異性を与える。選択
された増幅反応の性能に必要とされる他の配列は、場合
により、オリゴヌクレオチドの種特異性を変更すること
なく本明細書中で開示された標的結合配列に対して加え
ることができる。例として、本発明のＭ．カンサシイ特
異的増幅プライマーは、ＳＤＡ反応中にニックを入れら
れる制限エンドヌクレアーゼＢｓｏＢＩの認識部位を含
むことができる。限定されるものではないが欧州特許第
0684315号で開示された認識部位を含めた他のニッキン
グ可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を、ＢｓｏＢ
Ｉの認識部位の代わりに置換えることができることは当
業者に明らかであろう。好ましくは、その認識部位は好
熱性制限エンドヌクレアーゼに対するので、その増幅反
応は好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）の条件下で行うことがで
きる。同様に、増幅プライマーの尾部配列（制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位に対して５′）は、概して臨界的
ではないが、ＳＤＡに用いられる制限部位、およびそれ
ら自体の標的結合配列に対してかまたは他のプライマー
に対してハイブリッド形成するであろう配列は避けるべ
きである。したがって、本発明によるＳＤＡの増幅プラ
イマーは、表１で示された３′標的結合配列、その標的
結合配列に対して５′のニッキング可能な制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位、およびその制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位に対して５′の約１０〜２５ヌクレオチド長
さの尾部配列から成る。ニッキング可能な制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位および尾部配列は、ＳＤＡ反応に必
要な配列である。他の増幅反応に対して、本発明による
増幅プライマーは、開示された標的結合配列のみ（例え
ば、ＰＣＲに対して）、または選択された増幅反応に必
要な標的結合配列および追加の配列（例えば、上記のＳ
ＤＡに必要な配列または３ＳＲのＲＮＡポリメラーゼに
よって認識されるプロモーター）から成ることができ
る。
クレオチドに種ハイブリダイゼーション特異性を与え、
したがって、増幅反応に対する種特異性を与える。選択
された増幅反応の性能に必要とされる他の配列は、場合
により、オリゴヌクレオチドの種特異性を変更すること
なく本明細書中で開示された標的結合配列に対して加え
ることができる。例として、本発明のＭ．カンサシイ特
異的増幅プライマーは、ＳＤＡ反応中にニックを入れら
れる制限エンドヌクレアーゼＢｓｏＢＩの認識部位を含
むことができる。限定されるものではないが欧州特許第
0684315号で開示された認識部位を含めた他のニッキン
グ可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を、ＢｓｏＢ
Ｉの認識部位の代わりに置換えることができることは当
業者に明らかであろう。好ましくは、その認識部位は好
熱性制限エンドヌクレアーゼに対するので、その増幅反
応は好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）の条件下で行うことがで
きる。同様に、増幅プライマーの尾部配列（制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位に対して５′）は、概して臨界的
ではないが、ＳＤＡに用いられる制限部位、およびそれ
ら自体の標的結合配列に対してかまたは他のプライマー
に対してハイブリッド形成するであろう配列は避けるべ
きである。したがって、本発明によるＳＤＡの増幅プラ
イマーは、表１で示された３′標的結合配列、その標的
結合配列に対して５′のニッキング可能な制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位、およびその制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位に対して５′の約１０〜２５ヌクレオチド長
さの尾部配列から成る。ニッキング可能な制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位および尾部配列は、ＳＤＡ反応に必
要な配列である。他の増幅反応に対して、本発明による
増幅プライマーは、開示された標的結合配列のみ（例え
ば、ＰＣＲに対して）、または選択された増幅反応に必
要な標的結合配列および追加の配列（例えば、上記のＳ
ＤＡに必要な配列または３ＳＲのＲＮＡポリメラーゼに
よって認識されるプロモーター）から成ることができ
る。
【００２５】ＳＤＡにおいて、バンパープライマーは、
下流の種特異的増幅プライマーを置換するように機能す
るので、それらは種特異性に不可欠ではない。バンパー
プライマーは、それらが伸長された場合にそれらが増幅
プライマーおよびその伸長生成物を置換するように、増
幅プライマーから上流の標的に対してハイブリッド形成
することが必要とされるだけである。したがって、バン
パープライマーの具体的な配列は、概して臨界的ではな
く、バンパープライマーの伸長の際に増幅プライマー伸
長生成物を置換させるように充分に増幅プライマーの結
合部位の近くにある任意の上流標的配列に由来しうる。
バンパープライマー配列中の標的との時々の誤対合また
は非標的配列との若干のクロスハイブリダイゼーション
は、概して、そのバンパープライマーが特異的標的配列
に対してなおハイブリッド形成することができる状態に
ある限り、増幅効率に悪影響を与えることはない。しか
しながら、本明細書中に記載のバンパープライマーは、
Ｍ．カンサシイに種特異的であるので、所望ならば、増
幅プライマー中の標的結合配列として用いてもよい。
下流の種特異的増幅プライマーを置換するように機能す
るので、それらは種特異性に不可欠ではない。バンパー
プライマーは、それらが伸長された場合にそれらが増幅
プライマーおよびその伸長生成物を置換するように、増
幅プライマーから上流の標的に対してハイブリッド形成
することが必要とされるだけである。したがって、バン
パープライマーの具体的な配列は、概して臨界的ではな
く、バンパープライマーの伸長の際に増幅プライマー伸
長生成物を置換させるように充分に増幅プライマーの結
合部位の近くにある任意の上流標的配列に由来しうる。
バンパープライマー配列中の標的との時々の誤対合また
は非標的配列との若干のクロスハイブリダイゼーション
は、概して、そのバンパープライマーが特異的標的配列
に対してなおハイブリッド形成することができる状態に
ある限り、増幅効率に悪影響を与えることはない。しか
しながら、本明細書中に記載のバンパープライマーは、
Ｍ．カンサシイに種特異的であるので、所望ならば、増
幅プライマー中の標的結合配列として用いてもよい。
【００２６】本発明のプライマーを用いる増幅反応は、
ウォーカーら、上記によって教示されたようにチミンを
包含することができるし、またはそれらは、例えば、欧
州特許第0624643号で教示されたように、反応において
ＴＴＰの代わりに２′−デオキシウリジン５′−三リン
酸を全体的に若しくは部分的に置換えて、引き続きの増
幅反応の交差汚染を減少させることができる。ｄＵ（ウ
リジン）は、増幅生成物中に包含され、そしてウラシル
ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）による処理によって切
除されうる。これらの非塩基部位は、引き続きの増幅反
応において増幅生成物を増幅不能にする。ＵＤＧは、引
き続きの増幅を行う前にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ
阻害剤（Ｕｇｉ）によって失活されて、新たに生成され
た増幅生成物中のｄＵの切除を妨げることができる。
ウォーカーら、上記によって教示されたようにチミンを
包含することができるし、またはそれらは、例えば、欧
州特許第0624643号で教示されたように、反応において
ＴＴＰの代わりに２′−デオキシウリジン５′−三リン
酸を全体的に若しくは部分的に置換えて、引き続きの増
幅反応の交差汚染を減少させることができる。ｄＵ（ウ
リジン）は、増幅生成物中に包含され、そしてウラシル
ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）による処理によって切
除されうる。これらの非塩基部位は、引き続きの増幅反
応において増幅生成物を増幅不能にする。ＵＤＧは、引
き続きの増幅を行う前にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ
阻害剤（Ｕｇｉ）によって失活されて、新たに生成され
た増幅生成物中のｄＵの切除を妨げることができる。
【００２７】
実施例１ 表１で記載された増幅プライマーを、上流／下流対組合
わせ全部においてｔＳＤＡで評価して、Ｍ．カンサシイ
中の標的を増幅するそれらの能力を確認した。表２で示
される４種類の異なる増幅反応条件を試験して、反応を
最適化した。
わせ全部においてｔＳＤＡで評価して、Ｍ．カンサシイ
中の標的を増幅するそれらの能力を確認した。表２で示
される４種類の異なる増幅反応条件を試験して、反応を
最適化した。
【００２８】
【表２】
【００２９】好熱性ＳＤＡを、本質的には欧州特許出願
第0684315号で記載のように行い、そして増幅生成物
を、ウォーカーら，Nucl.Acids Res.，上記によって記
載のように、32Ｐ標識プライマーのハイブリダイゼーシ
ョンおよび伸長によって検出した。それぞれの増幅反応
は、１０6Ｍ．カンサシイゲノム（ＴＭＣ １２０
１）、ヒトＤＮＡ ５５０ｎｇ、６．５ｍＭ酢酸マグネ
シウム、５．１５％グリセロール、ＢｓｏＢＩ １６０
単位、Ｂｓｔポリメラーゼ１２．５単位、０．５μＭ増
幅プライマーおよび０．０５μＭバンパープライマーを
含んだ。配列番号：１１は、ハイブリダイゼーションお
よび伸長のために選択された検定プローブであった。増
幅を、指示された温度で３０分間進行させた。
第0684315号で記載のように行い、そして増幅生成物
を、ウォーカーら，Nucl.Acids Res.，上記によって記
載のように、32Ｐ標識プライマーのハイブリダイゼーシ
ョンおよび伸長によって検出した。それぞれの増幅反応
は、１０6Ｍ．カンサシイゲノム（ＴＭＣ １２０
１）、ヒトＤＮＡ ５５０ｎｇ、６．５ｍＭ酢酸マグネ
シウム、５．１５％グリセロール、ＢｓｏＢＩ １６０
単位、Ｂｓｔポリメラーゼ１２．５単位、０．５μＭ増
幅プライマーおよび０．０５μＭバンパープライマーを
含んだ。配列番号：１１は、ハイブリダイゼーションお
よび伸長のために選択された検定プローブであった。増
幅を、指示された温度で３０分間進行させた。
【００３０】このセットでの上流および下流増幅プライ
マーの組合わせはいずれも、全ての反応条件下で標的を
検出可能に増幅した。最適増幅効率は、１０％ＤＭＳ
Ｏ、３５ｍＭ ＫＰＯ4中において５０℃で得られた。
マーの組合わせはいずれも、全ての反応条件下で標的を
検出可能に増幅した。最適増幅効率は、１０％ＤＭＳ
Ｏ、３５ｍＭ ＫＰＯ4中において５０℃で得られた。
【００３１】実施例２ 配列番号：５／配列番号：６増幅プライマー対の特異性
および交差反応性を、Ｍ．カンサシイの典型的および非
典型的菌株、ミコバクテリアの他の種、および非ミコバ
クテリア種を用いる増幅反応で評価した。増幅反応は、
実施例１で得られた最適な反応条件（３５ｍＭ ＫＰＯ
4、１０％ＤＭＳＯ、５０℃）を用いて行われた。交差
反応性実験では、ミコバクテリアの５種類の非Ｍ．カン
サシイ種（Ｍ．ガストリ ＡＴＣＣ１３０１、Ｍ．ゴル
ドネエ ＡＴＣＣ１３１８、Ｍ．マリナルムヌム（mari
narum）ＡＴＣＣ８０１、Ｍ．テレエ（terrae）ＡＴＣ
Ｃ３０１０およびヒト型結核菌 ＡＴＣＣ Ｈ３７Ｒ
ｖ）それぞれ１０7ゲノムを、一つの増幅反応で用いる
ために混合した。同様に、５種類の非ミコバクテリア種
（イスラエル放線菌（Actinomyces israelii）ＡＴＣＣ
１００４９、ジフテリア菌（Corynebacterium diphther
iae）ＡＴＣＣ１１９１３、ノカルジア・アステロイデ
ス ＡＴＣＣ３３０８、ロドコッカス・ロドクロウス
ＡＴＣＣ１３８０８およびストレプトミセス・ソマリエ
ンス（Streptomyces somaliens）ＡＴＣＣ１３２０１）
それぞれ１０7ゲノムコピーを増幅のために混合した。
交差反応性反応における増幅阻害を検出するために、ゲ
ノム混合物をＭ．カンサシイ標的（ＴＭＣ １２０１）
の２Ｘ１０4ゲノムコピーと一緒に加え、そして正対照
として平行して増幅させた。配列番号：１０は、全試料
中の増幅を検出する検出用プライマーとして用いられ且
つ配列番号：１１は、試料の内７種類で増幅を検出する
検出用プライマーとして用いられた。
および交差反応性を、Ｍ．カンサシイの典型的および非
典型的菌株、ミコバクテリアの他の種、および非ミコバ
クテリア種を用いる増幅反応で評価した。増幅反応は、
実施例１で得られた最適な反応条件（３５ｍＭ ＫＰＯ
4、１０％ＤＭＳＯ、５０℃）を用いて行われた。交差
反応性実験では、ミコバクテリアの５種類の非Ｍ．カン
サシイ種（Ｍ．ガストリ ＡＴＣＣ１３０１、Ｍ．ゴル
ドネエ ＡＴＣＣ１３１８、Ｍ．マリナルムヌム（mari
narum）ＡＴＣＣ８０１、Ｍ．テレエ（terrae）ＡＴＣ
Ｃ３０１０およびヒト型結核菌 ＡＴＣＣ Ｈ３７Ｒ
ｖ）それぞれ１０7ゲノムを、一つの増幅反応で用いる
ために混合した。同様に、５種類の非ミコバクテリア種
（イスラエル放線菌（Actinomyces israelii）ＡＴＣＣ
１００４９、ジフテリア菌（Corynebacterium diphther
iae）ＡＴＣＣ１１９１３、ノカルジア・アステロイデ
ス ＡＴＣＣ３３０８、ロドコッカス・ロドクロウス
ＡＴＣＣ１３８０８およびストレプトミセス・ソマリエ
ンス（Streptomyces somaliens）ＡＴＣＣ１３２０１）
それぞれ１０7ゲノムコピーを増幅のために混合した。
交差反応性反応における増幅阻害を検出するために、ゲ
ノム混合物をＭ．カンサシイ標的（ＴＭＣ １２０１）
の２Ｘ１０4ゲノムコピーと一緒に加え、そして正対照
として平行して増幅させた。配列番号：１０は、全試料
中の増幅を検出する検出用プライマーとして用いられ且
つ配列番号：１１は、試料の内７種類で増幅を検出する
検出用プライマーとして用いられた。
【００３２】標的増幅は、典型的菌株（ＡＴＣＣ１２４
７８、ＴＭＣ１２０１、ＬＣＤＣ７１１、ＬＣＤＣ７１
４、ＬＣＤＣ７１５）および非典型的菌株（Ｔ−１６８
９、Ｔ−１４９２、Ｔ−８５９４、Ｔ−１０８９２）両
方を含めた、試験されたＭ．カンサシイ菌株の全てにお
いて首尾よく検出された。ｐ６１２３標的の増幅は、最
終的に非典型的とも典型的とも同定されなかった菌株
（ＬＣＤＣ７０７）においても検出された。低い標的濃
度では、二つの検出用プライマーの間に感度の差が時々
見られ、配列番号：１１は、いくつかの検定において向
上した感度を与えた。配列番号：１０を検出用プライマ
ーとして用いると、プールされた非Ｍ．カンサシイミコ
バクテリア標的においては、ＴＭＣ１２０１標的も存在
した場合を除いて、増幅は検出されなかった。配列番
号：１１検出用プライマーは、真正増幅反応と区別され
ることができた非Ｍ．カンサシイミコバクテリア標的に
おいて非典型的寸法のバンドを生じた。同様に、配列番
号：１０検出用プライマーは、プールされた非ミコバク
テリア標的において、ＴＭＣ１２０１標的が存在した場
合を除いて増幅を検出しなかったが、配列番号：１１
は、僅かな非特異的バンドを生じた。したがって、セン
ス検定プローブ（配列番号：１１および配列番号：１
２）およびアンチセンス検定プローブ（配列番号：１
０）は両方とも本発明において有用であるが、アンチセ
ンス検定プローブはより正しい結果をもたらすと結論付
けられた。これらの実験は、本発明の増幅プライマーが
Ｍ．カンサシイに種特異的であり且つ非典型的および典
型的菌株両方を増幅することができることを確証する。
７８、ＴＭＣ１２０１、ＬＣＤＣ７１１、ＬＣＤＣ７１
４、ＬＣＤＣ７１５）および非典型的菌株（Ｔ−１６８
９、Ｔ−１４９２、Ｔ−８５９４、Ｔ−１０８９２）両
方を含めた、試験されたＭ．カンサシイ菌株の全てにお
いて首尾よく検出された。ｐ６１２３標的の増幅は、最
終的に非典型的とも典型的とも同定されなかった菌株
（ＬＣＤＣ７０７）においても検出された。低い標的濃
度では、二つの検出用プライマーの間に感度の差が時々
見られ、配列番号：１１は、いくつかの検定において向
上した感度を与えた。配列番号：１０を検出用プライマ
ーとして用いると、プールされた非Ｍ．カンサシイミコ
バクテリア標的においては、ＴＭＣ１２０１標的も存在
した場合を除いて、増幅は検出されなかった。配列番
号：１１検出用プライマーは、真正増幅反応と区別され
ることができた非Ｍ．カンサシイミコバクテリア標的に
おいて非典型的寸法のバンドを生じた。同様に、配列番
号：１０検出用プライマーは、プールされた非ミコバク
テリア標的において、ＴＭＣ１２０１標的が存在した場
合を除いて増幅を検出しなかったが、配列番号：１１
は、僅かな非特異的バンドを生じた。したがって、セン
ス検定プローブ（配列番号：１１および配列番号：１
２）およびアンチセンス検定プローブ（配列番号：１
０）は両方とも本発明において有用であるが、アンチセ
ンス検定プローブはより正しい結果をもたらすと結論付
けられた。これらの実験は、本発明の増幅プライマーが
Ｍ．カンサシイに種特異的であり且つ非典型的および典
型的菌株両方を増幅することができることを確証する。
【００３３】実施例３ Ｍ．カンサシイの典型的菌株におけるｐ６１２３標的検
出の感度を、増幅反応中に存在する初期ゲノムコピー数
を滴定することによって測定した。ゲノムＤＮＡは、菌
株ＴＭＣ１２０１から単離され且つヒト胎盤ＤＮＡ ５
０ｎｇ中で希釈された。ＳＤＡ反応（５０μｌ）は、１
０6個、１０5個、１０4個、１０3個、１０2個、１０個
のＴＭＣ１２０１ゲノムを出発標的数として用いて行わ
れた。増幅は、本質的には前の実施例で記載のように
（３５ｍＭ ＫＰＯ4、アセチル化ウシ血清アルブミン
１００μｇ／ｍｌ、１．４ｍＭ チオ−ｄＣＴＰ、０．
５ｍＭ ｄＵＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ
ｄＡＴＰ、１０％ＤＭＳＯ、６．５ｍＭ酢酸マグネシ
ウム、０．５μＭ増幅プライマー、０．０５μＭバンパ
ープライマー、ヒト胎盤ＤＮＡ ５５０ｎｇ、Ｂｓｔ
ＤＮＡポリメラー１２．５単位、ＢｓｏＢＩ １６０単
位、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ１単位、ウラシル−
Ｎ−グリコシラーゼ阻害剤２単位、５０℃３０分間）、
３種類の上流プライマーそれぞれを配列番号：６と対合
させ且つ配列番号：８および配列番号：９をバンパープ
ライマーとして用いて行われた。増幅生成物は、前のよ
うに32Ｐ標識検出用プライマー（配列番号：１０かまた
は配列番号：１１）のハイブリダイゼーションおよび伸
長によって検出された。試験された最低の初期標的コピ
ー数（１０ゲノム）は、センスかまたはアンチセンス検
出用プローブを用いて容易に検出され、検定の感度は１
０ゲノムまたはそれ未満であることが示された。典型的
な菌株において、検定プローブ（センスまたはアンチセ
ンス）の選択が検定の感度に影響を与えるとは考えられ
ない。
出の感度を、増幅反応中に存在する初期ゲノムコピー数
を滴定することによって測定した。ゲノムＤＮＡは、菌
株ＴＭＣ１２０１から単離され且つヒト胎盤ＤＮＡ ５
０ｎｇ中で希釈された。ＳＤＡ反応（５０μｌ）は、１
０6個、１０5個、１０4個、１０3個、１０2個、１０個
のＴＭＣ１２０１ゲノムを出発標的数として用いて行わ
れた。増幅は、本質的には前の実施例で記載のように
（３５ｍＭ ＫＰＯ4、アセチル化ウシ血清アルブミン
１００μｇ／ｍｌ、１．４ｍＭ チオ−ｄＣＴＰ、０．
５ｍＭ ｄＵＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ
ｄＡＴＰ、１０％ＤＭＳＯ、６．５ｍＭ酢酸マグネシ
ウム、０．５μＭ増幅プライマー、０．０５μＭバンパ
ープライマー、ヒト胎盤ＤＮＡ ５５０ｎｇ、Ｂｓｔ
ＤＮＡポリメラー１２．５単位、ＢｓｏＢＩ １６０単
位、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ１単位、ウラシル−
Ｎ−グリコシラーゼ阻害剤２単位、５０℃３０分間）、
３種類の上流プライマーそれぞれを配列番号：６と対合
させ且つ配列番号：８および配列番号：９をバンパープ
ライマーとして用いて行われた。増幅生成物は、前のよ
うに32Ｐ標識検出用プライマー（配列番号：１０かまた
は配列番号：１１）のハイブリダイゼーションおよび伸
長によって検出された。試験された最低の初期標的コピ
ー数（１０ゲノム）は、センスかまたはアンチセンス検
出用プローブを用いて容易に検出され、検定の感度は１
０ゲノムまたはそれ未満であることが示された。典型的
な菌株において、検定プローブ（センスまたはアンチセ
ンス）の選択が検定の感度に影響を与えるとは考えられ
ない。
【００３４】Ｍ．カンサシイの非典型的菌株におけるｐ
６１２３標的検出の感度を、Ｔ−１０８９２ゲノムＤＮ
Ａを非典型的標的として用いて同様に測定した。センス
検出用プライマー配列番号：１２を用いて増幅後に検出
可能な最小初期標的コピー数は約１０4ゲノムであっ
た。同様の結果は、配列番号：１０（センス）の補体を
検出用プライマーとして用いて得られた。
６１２３標的検出の感度を、Ｔ−１０８９２ゲノムＤＮ
Ａを非典型的標的として用いて同様に測定した。センス
検出用プライマー配列番号：１２を用いて増幅後に検出
可能な最小初期標的コピー数は約１０4ゲノムであっ
た。同様の結果は、配列番号：１０（センス）の補体を
検出用プライマーとして用いて得られた。
【００３５】配列番号：１０〜１２およびそれらの補体
はいずれも、本発明において検定プローブとして有用で
ある。しかしながら、概して、センス検定プローブは、
僅かであるが検出可能な水準のバックグラウンドを生
じ、そしてアンチセンス検定プローブより大きい検定感
度を与えたことが注目された。配列番号：１２は例外で
あり、正しい検定結果（バックグラウンドがほとんどな
い）およびより高い感度をもたらした。減少したバック
グラウンドは、概して、アンチセンス検定プローブを用
いる検定で見られたが、典型的に、感度もある程度減少
した。センスおよびアンチセンス検定プローブ間の感度
の違いは、二つの相補的標的鎖の非対称増幅の結果であ
ると考えられる。
はいずれも、本発明において検定プローブとして有用で
ある。しかしながら、概して、センス検定プローブは、
僅かであるが検出可能な水準のバックグラウンドを生
じ、そしてアンチセンス検定プローブより大きい検定感
度を与えたことが注目された。配列番号：１２は例外で
あり、正しい検定結果（バックグラウンドがほとんどな
い）およびより高い感度をもたらした。減少したバック
グラウンドは、概して、アンチセンス検定プローブを用
いる検定で見られたが、典型的に、感度もある程度減少
した。センスおよびアンチセンス検定プローブ間の感度
の違いは、二つの相補的標的鎖の非対称増幅の結果であ
ると考えられる。
【００３６】
【００３７】(2) 配列情報 配列番号:1: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 22 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:1: TCGCAGAACG CGACAAACGG TG 22
【００３８】(2) 配列情報 配列番号:2: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 23 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:2: TGATGAAACG TGTTTTGCCA GCG 23
【００３９】(2) 配列情報 配列番号:3: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 38 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:3: CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGACGACG ATTGGGCA 38
【００４０】(2) 配列情報 配列番号:4: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 38 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:4: CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGCACGAC GATTGGGC 38
【００４１】(2) 配列情報 配列番号:5: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 38 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:5: CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGACGACG ATCGGGCA 38
【００４２】(2) 配列情報 配列番号:6: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 37 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:6: ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGGCCGAC GAGCTGT 37
【００４３】(2) 配列情報 配列番号:7: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 38 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:7: ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGGCCGAC GAGCTGTG 38
【００４４】(2) 配列情報 配列番号:8: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 15 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:8: AGTGGTCATG AGATG 15
【００４５】(2) 配列情報 配列番号:9: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 14 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:9: CGGACTTCTT TCGT 14
【００４６】(2) 配列情報 配列番号:10: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 14 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:10: CTGCTGGACA CCAC 14
【００４７】(2) 配列情報 配列番号:11: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 14 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:14: AGCCGTTCCA GGAC 14
【００４８】(2) 配列情報 配列番号:12: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 14 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: 配列番号:12: GCCGGTGGTG TCCA 14
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:32） (72)発明者 キース・シー・ウィリアムズ アメリカ合衆国メリーランド州21236，ボ ルチモア，ヒーザーミル・ロード 8625
Claims (10)
- 【請求項１】 配列番号：３、配列番号：４、配列番
号：５、配列番号：６および配列番号：７の標的結合配
列から成る群より選択される標的結合配列並びに、場合
により増幅反応に必要な配列から成るオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項２】 配列番号：８、配列番号：９、配列番
号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２およびそれ
らの補体から成る群より選択されるオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項３】 ミコバクテリウム・カンサシイ（Mycoba
cterium kansasii）の標的核酸を増幅する方法であっ
て、 （ａ）該標的核酸に対して（ｉ）配列番号：３、配列番
号：４および配列番号：５の標的結合配列から成る群よ
り選択される標的結合配列並びに、場合により増幅反応
に必要な配列から成る第一増幅プライマー、および（i
i）配列番号：６および配列番号：７の標的結合配列か
ら成る群より選択される標的結合配列並びに、場合によ
り増幅反応に必要な配列から成る第二増幅プライマーを
ハイブリッド形成させ；そして （ｂ）ハイブリッド形成した第一および第二増幅プライ
マーを伸長することによって標的核酸配列を増幅するこ
とを含む上記方法。 - 【請求項４】 増幅反応に必要な配列が、増幅の際に制
限エンドヌクレアーゼによってニックを入れられる制限
エンドヌクレアーゼの認識部位を含む請求項３に記載の
方法。 - 【請求項５】 標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応によっ
て増幅させる請求項３に記載の方法。 - 【請求項６】 標的核酸を鎖置換増幅によって増幅させ
る請求項３に記載の方法。 - 【請求項７】 ミコバクテリウム・カンサシイの標的核
酸を増幅する方法であって、 （ａ）該標的核酸に対して（ｉ）配列番号：３、配列番
号：４または配列番号：５から成る第一増幅プライマ
ー、および（ii）配列番号：６または配列番号：７から
成る第二増幅プライマーをハイブリッド形成させ；そし
て （ｂ）該標的核酸を鎖置換増幅反応で増幅することを含
む上記方法。 - 【請求項８】 第一増幅プライマーが配列番号：５から
成り且つ第二増幅プライマーが配列番号：６から成る請
求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 ミコバクテリウム・カンサシイの標的核
酸の増幅用キットであって、 （ａ）配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５
の標的結合配列から成る群より選択される標的結合配列
並びに、場合により増幅反応に必要な配列から成る第一
増幅プライマー； （ｂ）配列番号：６および配列番号：７の標的結合配列
から成る群より選択される標的結合配列並びに、場合に
より増幅反応に必要な配列から成る第二増幅プライマ
ー、および （ｃ）標的配列の増幅用の試薬を含む上記キット。 - 【請求項１０】 検定プローブを更に含む請求項９に記
載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US663769 | 1984-10-23 | ||
| US08/663,769 US5614390A (en) | 1996-06-14 | 1996-06-14 | Species-specific detection of Mycobacterium kansasii |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1057098A true JPH1057098A (ja) | 1998-03-03 |
| JP3070529B2 JP3070529B2 (ja) | 2000-07-31 |
Family
ID=24663198
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9158665A Expired - Fee Related JP3070529B2 (ja) | 1996-06-14 | 1997-06-16 | ミコバクテリウム・カンサシイの種特異的検出 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5614390A (ja) |
| EP (1) | EP0818541A1 (ja) |
| JP (1) | JP3070529B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7342048B2 (en) | 2005-04-28 | 2008-03-11 | Nipro Corporation | Bioabsorbable pharmaceutical formulation |
| WO2018135560A1 (ja) * | 2017-01-19 | 2018-07-26 | 株式会社カネカ | マイコバクテリウム・カンサシイを検出するためのプライマーセット、プローブ、キット及び方法 |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997044488A2 (en) | 1996-05-22 | 1997-11-27 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for the detection of mycobacterium kansasii |
| US6124120A (en) * | 1997-10-08 | 2000-09-26 | Yale University | Multiple displacement amplification |
| WO1999025874A1 (en) * | 1997-11-18 | 1999-05-27 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Polymerase chain reaction test for detecting feline leukemia virus |
| US5932451A (en) * | 1997-11-19 | 1999-08-03 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Method for unbiased mRNA amplification |
| US6316229B1 (en) | 1998-07-20 | 2001-11-13 | Yale University | Single molecule analysis target-mediated ligation of bipartite primers |
| AU770993B2 (en) * | 1998-09-15 | 2004-03-11 | Yale University | Molecular cloning using rolling circle amplification |
| US6255082B1 (en) * | 1998-09-15 | 2001-07-03 | Yale University | Artificial long terminal repeat vectors |
| US6066461A (en) * | 1999-04-12 | 2000-05-23 | Becton Dickinson And Company | Amplification and detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli |
| US20060166227A1 (en) * | 2000-06-20 | 2006-07-27 | Stephen Kingsmore | Protein expression profiling |
| US6323009B1 (en) * | 2000-06-28 | 2001-11-27 | Molecular Staging, Inc. | Multiply-primed amplification of nucleic acid sequences |
| US6573051B2 (en) * | 2001-03-09 | 2003-06-03 | Molecular Staging, Inc. | Open circle probes with intramolecular stem structures |
| US7297485B2 (en) * | 2001-10-15 | 2007-11-20 | Qiagen Gmbh | Method for nucleic acid amplification that results in low amplification bias |
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