JP2814422B2 - 複数核酸増幅によるミコバクテリアの検出 - Google Patents
複数核酸増幅によるミコバクテリアの検出Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸の増幅および検
出、および／または核酸の増幅を用いた微生物の同定に
関する。
出、および／または核酸の増幅を用いた微生物の同定に
関する。
【０００２】
【従来技術】インビトロ核酸増幅技術は、少量の核酸の
検出および分析のための有力な手段を提供してきた。そ
のような方法の究極の感度は、感染性および遺伝的疾患
の診断、分析のための遺伝子の単離、および法律上の医
薬としての特定の核酸の検出のためのそれらの開発の企
画に通じてきた。
検出および分析のための有力な手段を提供してきた。そ
のような方法の究極の感度は、感染性および遺伝的疾患
の診断、分析のための遺伝子の単離、および法律上の医
薬としての特定の核酸の検出のためのそれらの開発の企
画に通じてきた。
【０００３】通常、核酸増幅技術を用いた特定の核酸の
診断およびスクリーニングは、単一の標的核酸を一度に
増幅する必要性により限定されてきた。あらゆる複数の
核酸配列が存在するかもしれない場合（例えば、感染性
疾患の診断）、複数の異なるアッセイをこの方法により
実施することは煩わしくかつ時間を浪費する。米国特許
第４，６８３，１９５号；４，６８３，２０２号および
４，８００，１５９号はＰＣＲを記載している。これら
の発明者は複数の配列が検出されると述べているが、複
数の標的配列を同時に増幅する方法は開示されていな
い。複数の標的配列を増幅する場合、別々のＰＣＲにお
いて単一の標的を連続的に増幅する。事実、異なる標的
配列に対する複数対のプライマーを一つのＰＣＲに添加
する場合、受容不可能なほど高いレベルの非特異的増幅
およびバックグラウンドを生じる。複数の標的配列を同
時に増幅させるために報告されたＰＣＲにおける改良
は、欧州特許出願第０ ３６４ ２５５号に記載されて
いる。この文献は複数のＤＮＡの増幅として引用され
る。この方法において、複数対のプライマーを標的配列
含有核酸に添加する。各プライマー対は別々の選択され
た標的配列にハイブリダイズし、続いて、ＰＣＲと同様
の温度循環反応により増幅される。フットプリンティン
グへのＰＣＲの適用は、Ｐ．Ｒ．Ｍｕｅｌｌｅｒおよび
Ｂ．Ｗｏｌｄ（１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６，７
８０−７８６）により教示される。フットプリンティン
グに関しては、共通のオリゴヌクレオチド配列を、フッ
トプリントラダーの各断片の唯一の末端に連結する。こ
の断片は、共通配列の相補的なプライマーおよび固定し
た末端の公知配列に相補的なプライマーを用いて同時に
増幅される。
診断およびスクリーニングは、単一の標的核酸を一度に
増幅する必要性により限定されてきた。あらゆる複数の
核酸配列が存在するかもしれない場合（例えば、感染性
疾患の診断）、複数の異なるアッセイをこの方法により
実施することは煩わしくかつ時間を浪費する。米国特許
第４，６８３，１９５号；４，６８３，２０２号および
４，８００，１５９号はＰＣＲを記載している。これら
の発明者は複数の配列が検出されると述べているが、複
数の標的配列を同時に増幅する方法は開示されていな
い。複数の標的配列を増幅する場合、別々のＰＣＲにお
いて単一の標的を連続的に増幅する。事実、異なる標的
配列に対する複数対のプライマーを一つのＰＣＲに添加
する場合、受容不可能なほど高いレベルの非特異的増幅
およびバックグラウンドを生じる。複数の標的配列を同
時に増幅させるために報告されたＰＣＲにおける改良
は、欧州特許出願第０ ３６４ ２５５号に記載されて
いる。この文献は複数のＤＮＡの増幅として引用され
る。この方法において、複数対のプライマーを標的配列
含有核酸に添加する。各プライマー対は別々の選択され
た標的配列にハイブリダイズし、続いて、ＰＣＲと同様
の温度循環反応により増幅される。フットプリンティン
グへのＰＣＲの適用は、Ｐ．Ｒ．Ｍｕｅｌｌｅｒおよび
Ｂ．Ｗｏｌｄ（１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６，７
８０−７８６）により教示される。フットプリンティン
グに関しては、共通のオリゴヌクレオチド配列を、フッ
トプリントラダーの各断片の唯一の末端に連結する。こ
の断片は、共通配列の相補的なプライマーおよび固定し
た末端の公知配列に相補的なプライマーを用いて同時に
増幅される。
【０００４】ほとんどの場合、核酸増幅技術を用いるこ
とにより、診断アッセイにおいて定量的結果を生じた。
しかしながら、標的配列の在否を検出することができる
ばかりでなく、最初に存在した標的配列の量を定量する
こともできる核酸増幅法の開発に大きな興味があった。
内部対照配列は、そのような定量結果を生じさせる企画
において、ＰＣＲにおいて用いられた。親出願の米国特
許出願番号第０８／０５８，６４８号は、標的配列を定
量し、並びにサンプルの増幅活性を測定する（即ち、サ
ンプルが増幅反応を阻害して誤った陰性の結果を生じる
か否かについて）ために恒温核酸増幅反応において有用
な内部対照配列を開示する。
とにより、診断アッセイにおいて定量的結果を生じた。
しかしながら、標的配列の在否を検出することができる
ばかりでなく、最初に存在した標的配列の量を定量する
こともできる核酸増幅法の開発に大きな興味があった。
内部対照配列は、そのような定量結果を生じさせる企画
において、ＰＣＲにおいて用いられた。親出願の米国特
許出願番号第０８／０５８，６４８号は、標的配列を定
量し、並びにサンプルの増幅活性を測定する（即ち、サ
ンプルが増幅反応を阻害して誤った陰性の結果を生じる
か否かについて）ために恒温核酸増幅反応において有用
な内部対照配列を開示する。
【０００５】内部対照を用いる特定のＰＣＲは、標的配
列と同じプライマーにより増幅されうる内部対照配列を
選択する。例えば、国際公開番号９３／０２２１５およ
び９２／１１２７３を参照されたい。このＰＣＲの速度
が標的の長さにより比較的影響されないことが知られて
おり、かつ、増幅効率に顕著に影響しないことから、こ
のＰＣＲにおいては、増幅された標的および対照配列
は、異なる断片の長さにより区別される。欧州特許出願
第０ ５２５ ８８２号は、標的核酸および変異配列の
競争的増幅による、核酸配列に基づいた増幅（ＮＡＳＢ
Ａ）における標的核酸の定量法を記載している。この方
法は、一定量のサンプルと希釈シリーズの変異配列を用
いて実施される。この分析は、標的配列からのシグナル
を５０％低下させる点、即ち、変異配列と標的配列が等
量存在する点において添加された変異配列の量を測定す
る。正確な定量を生じるためには、欧州特許出願第０
５２５ ８８２号において記載された増幅反応は、少な
くとも試薬の一つが完全に消費されるまで、即ち、限定
された試薬に関する競争が生じうる反応における後対数
期まで続けなければならない。さらに、２つの反応、即
ち標的の増幅と変異配列の増幅が２つの試薬に関して競
争する場合にのみ計算が正確である。したがって、その
結果は、第３の反応、例えばバックグラウンド増幅が起
こると、信用できない。必然的にすべての増幅反応がい
くらかのバックグラウンド増幅を含むように、欧州特許
出願第０ ５２５ ８８２号の定量法は、高いレベルの
標的配列に関してのみ正確である。低い標的レベルにお
いては、競争するバックグラウンド増幅反応が正確な計
算を顕著に妨害するはずである。さまざまな希釈の変異
配列を標的と共に増幅することをあてにするため、欧州
特許出願第０ ５２５ ８８２号の方法は、チューブか
らチューブへの変異配列および標的配列の量の変化にも
敏感である。標的配列量の僅かな違い、またはチューブ
間の変異配列の希釈における僅かな不正確さでさえも、
次の増幅反応において対数的に増幅され、そして定量計
算においてそれが反映される。
列と同じプライマーにより増幅されうる内部対照配列を
選択する。例えば、国際公開番号９３／０２２１５およ
び９２／１１２７３を参照されたい。このＰＣＲの速度
が標的の長さにより比較的影響されないことが知られて
おり、かつ、増幅効率に顕著に影響しないことから、こ
のＰＣＲにおいては、増幅された標的および対照配列
は、異なる断片の長さにより区別される。欧州特許出願
第０ ５２５ ８８２号は、標的核酸および変異配列の
競争的増幅による、核酸配列に基づいた増幅（ＮＡＳＢ
Ａ）における標的核酸の定量法を記載している。この方
法は、一定量のサンプルと希釈シリーズの変異配列を用
いて実施される。この分析は、標的配列からのシグナル
を５０％低下させる点、即ち、変異配列と標的配列が等
量存在する点において添加された変異配列の量を測定す
る。正確な定量を生じるためには、欧州特許出願第０
５２５ ８８２号において記載された増幅反応は、少な
くとも試薬の一つが完全に消費されるまで、即ち、限定
された試薬に関する競争が生じうる反応における後対数
期まで続けなければならない。さらに、２つの反応、即
ち標的の増幅と変異配列の増幅が２つの試薬に関して競
争する場合にのみ計算が正確である。したがって、その
結果は、第３の反応、例えばバックグラウンド増幅が起
こると、信用できない。必然的にすべての増幅反応がい
くらかのバックグラウンド増幅を含むように、欧州特許
出願第０ ５２５ ８８２号の定量法は、高いレベルの
標的配列に関してのみ正確である。低い標的レベルにお
いては、競争するバックグラウンド増幅反応が正確な計
算を顕著に妨害するはずである。さまざまな希釈の変異
配列を標的と共に増幅することをあてにするため、欧州
特許出願第０ ５２５ ８８２号の方法は、チューブか
らチューブへの変異配列および標的配列の量の変化にも
敏感である。標的配列量の僅かな違い、またはチューブ
間の変異配列の希釈における僅かな不正確さでさえも、
次の増幅反応において対数的に増幅され、そして定量計
算においてそれが反映される。
【０００６】対照的に、米国特許出願番号第０８／０５
８，６４８号の方法は、対照配列と標的配列との間で試
薬に関して競争を必要とせず、また反応が後対数期にま
で入ることを必要としない。後対数期および対数期の何
れにおいても、増幅反応は正確である。したがって、標
的配列／対照配列の比は、生じるかもしれないバックグ
ラウンド増幅反応により影響されず、バックグラウンド
反応の程度にかかわらず同じままである。したがって、
結果は増幅反応の初期に得られ、また、反応シリーズよ
りも単一の標的／対照共増幅（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ）の使用により可変性が低下する。
８，６４８号の方法は、対照配列と標的配列との間で試
薬に関して競争を必要とせず、また反応が後対数期にま
で入ることを必要としない。後対数期および対数期の何
れにおいても、増幅反応は正確である。したがって、標
的配列／対照配列の比は、生じるかもしれないバックグ
ラウンド増幅反応により影響されず、バックグラウンド
反応の程度にかかわらず同じままである。したがって、
結果は増幅反応の初期に得られ、また、反応シリーズよ
りも単一の標的／対照共増幅（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ）の使用により可変性が低下する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】以前に報告された複数
核酸増幅法は、増幅される各標的に適合した異なる内部
対照配列を必要とするが、それは、各標的が異なるプラ
イマー対を用いて増幅されるからである（即ち、各プラ
イマー対のための対照配列）。本発明以前には、複数の
核酸増幅反応において複数の標的を監視または定量する
ために単一の内部対照配列を用いることは不可能であっ
た。したがって、本発明のアダプター介在複数増幅法の
特徴は、複数増幅のために必要な単一プライマー対によ
り、初めて、単一内部対照配列を用いて複数標的の増幅
の監視または定量が可能になることである。
核酸増幅法は、増幅される各標的に適合した異なる内部
対照配列を必要とするが、それは、各標的が異なるプラ
イマー対を用いて増幅されるからである（即ち、各プラ
イマー対のための対照配列）。本発明以前には、複数の
核酸増幅反応において複数の標的を監視または定量する
ために単一の内部対照配列を用いることは不可能であっ
た。したがって、本発明のアダプター介在複数増幅法の
特徴は、複数増幅のために必要な単一プライマー対によ
り、初めて、単一内部対照配列を用いて複数標的の増幅
の監視または定量が可能になることである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】ミコバクテリアは、抗酸
性、非運動性、グラム陽性杆菌のバクテリア属である。
該属は以下のものを含むがこれらに限定されない：ミコ
バクテリウムアフリカナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、ミコバクテリウムアビウム
（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、ミコバクテリウムボビス（Ｍ．ｂ
ｏｖｉｓ）、ミコバクテリウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉ
ｓ）−ＢＣＧ、ミコバクテリウムケロネア（Ｍ．ｃｈｅ
ｌｏｎａｅ）、ミコバクテリウムホルツイツム（Ｍ．ｆ
ｏｒｔｕｉｔｕｍ）、ミコバクテリウムゴルドネア
（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、ミコバクテリウムイントラ
セルラエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ミコ
バクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、ミコ
バクテリウムミクロチ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、ミコバ
クテリウムスクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃ
ｅｕｍ）、ミコバクテリウムパラツベクロシス（Ｍ．ｐ
ａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ミコバクテリウム
ツベクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）。これ
らの生物の特定のものは、疾患の病原となる。１９５３
年以来初めて、ミコバクテリアの感染症例が米国で増加
しつつある。特に興味深いのは結核であり、その病因は
ミコバクテリウムツベクロシスである。これらの新しい
症例の多くはＡＩＤＳの流行に関連しており、免疫の日
和見集団を提供することにより特にミコバクテリアによ
る感染に特に敏感になる。他のミコバクテリアの感染も
免疫日和見患者の増加の結果として増加している。ミコ
バクテリウムアビウム、ミコバクテリウムカンサシおよ
び他の非結核性ミコバクテリアは、ＨＩＶ感染者および
他の免疫日和見患者において日和見病原体であることが
見いだされている。
性、非運動性、グラム陽性杆菌のバクテリア属である。
該属は以下のものを含むがこれらに限定されない：ミコ
バクテリウムアフリカナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、ミコバクテリウムアビウム
（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、ミコバクテリウムボビス（Ｍ．ｂ
ｏｖｉｓ）、ミコバクテリウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉ
ｓ）−ＢＣＧ、ミコバクテリウムケロネア（Ｍ．ｃｈｅ
ｌｏｎａｅ）、ミコバクテリウムホルツイツム（Ｍ．ｆ
ｏｒｔｕｉｔｕｍ）、ミコバクテリウムゴルドネア
（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、ミコバクテリウムイントラ
セルラエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ミコ
バクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、ミコ
バクテリウムミクロチ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、ミコバ
クテリウムスクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃ
ｅｕｍ）、ミコバクテリウムパラツベクロシス（Ｍ．ｐ
ａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ミコバクテリウム
ツベクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）。これ
らの生物の特定のものは、疾患の病原となる。１９５３
年以来初めて、ミコバクテリアの感染症例が米国で増加
しつつある。特に興味深いのは結核であり、その病因は
ミコバクテリウムツベクロシスである。これらの新しい
症例の多くはＡＩＤＳの流行に関連しており、免疫の日
和見集団を提供することにより特にミコバクテリアによ
る感染に特に敏感になる。他のミコバクテリアの感染も
免疫日和見患者の増加の結果として増加している。ミコ
バクテリウムアビウム、ミコバクテリウムカンサシおよ
び他の非結核性ミコバクテリアは、ＨＩＶ感染者および
他の免疫日和見患者において日和見病原体であることが
見いだされている。
【０００９】現在、ミコバクテリアの感染の診断は生物
の抗酸性染色および培養、続く生化学アッセイに依存し
ている。これらの方法は時間を浪費し、慣用的培養法を
用いた典型的診断法は６週間を要する。自動化培養シス
テム、例えば、ＢＡＣＴＥＣ（商標名）システム（Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）は、診断
時間を１から２時間に減少させることができる。しかし
ながら、ミコバクテリアの感染を診断するのに要する時
間を１週間未満、好ましくは約１日に減少させる要求が
なお存在する。オリゴヌクレオチドに基づくアッセイ、
例えばサザンハイブリダイゼーションまたはドットブロ
ットは、迅速な結果（即ち、１日未満）を提供すること
ができる。核酸の増幅に基づくアッセイはより迅速に、
しばしば数時間で結果を提供する。ミコバクテリアの感
染の診断に関して、そのような方法は、ミコバクテリア
属に特異的であるかまたは生物の特定が必要であれば特
定のミコバクテリア種に特異的なオリゴヌクレオチドプ
ローブまたはプライマーを必要とする。
の抗酸性染色および培養、続く生化学アッセイに依存し
ている。これらの方法は時間を浪費し、慣用的培養法を
用いた典型的診断法は６週間を要する。自動化培養シス
テム、例えば、ＢＡＣＴＥＣ（商標名）システム（Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）は、診断
時間を１から２時間に減少させることができる。しかし
ながら、ミコバクテリアの感染を診断するのに要する時
間を１週間未満、好ましくは約１日に減少させる要求が
なお存在する。オリゴヌクレオチドに基づくアッセイ、
例えばサザンハイブリダイゼーションまたはドットブロ
ットは、迅速な結果（即ち、１日未満）を提供すること
ができる。核酸の増幅に基づくアッセイはより迅速に、
しばしば数時間で結果を提供する。ミコバクテリアの感
染の診断に関して、そのような方法は、ミコバクテリア
属に特異的であるかまたは生物の特定が必要であれば特
定のミコバクテリア種に特異的なオリゴヌクレオチドプ
ローブまたはプライマーを必要とする。
【００１０】米国特許出願番号第０８／０７３，１９７
号において開示されたプライマーはミコバクテリウムツ
ベルクロシス（以下、Ｍ．ｔｂと略す場合がある）のＩ
Ｓ６１１０インサーションエレメントおよびミコバクテ
リウムツベルクロシスの１６Ｓリボソーマル遺伝子の、
アダプタ−介在複数増幅を例示するものであり、ミコバ
クテリウムツベルクロシスの種および臨床的に関連する
他のミコバクテリア種を核酸増幅により同時に検出およ
ひ／または同定するのにも有用であることが現在わかっ
ている。本発明の方法は、複数鎖置換増幅（ＳＤＡ）を
単一の増幅反応において用い、ミコバクテリウムツベル
クロシスを同時に同定することができ、かつ、実質的に
すべての臨床的に関連のあるミコバクテリア種のスクリ
ーニングを提供することができる。ＳＤＡは常温におい
て１回のインキュベーションにおいて２つの標的ＤＮＡ
配列を１０8倍に増幅することができる。
号において開示されたプライマーはミコバクテリウムツ
ベルクロシス（以下、Ｍ．ｔｂと略す場合がある）のＩ
Ｓ６１１０インサーションエレメントおよびミコバクテ
リウムツベルクロシスの１６Ｓリボソーマル遺伝子の、
アダプタ−介在複数増幅を例示するものであり、ミコバ
クテリウムツベルクロシスの種および臨床的に関連する
他のミコバクテリア種を核酸増幅により同時に検出およ
ひ／または同定するのにも有用であることが現在わかっ
ている。本発明の方法は、複数鎖置換増幅（ＳＤＡ）を
単一の増幅反応において用い、ミコバクテリウムツベル
クロシスを同時に同定することができ、かつ、実質的に
すべての臨床的に関連のあるミコバクテリア種のスクリ
ーニングを提供することができる。ＳＤＡは常温におい
て１回のインキュベーションにおいて２つの標的ＤＮＡ
配列を１０8倍に増幅することができる。
【００１１】特に好ましい態様において、増幅反応はさ
らに、米国特許出願番号第０８／０５８，６４８号に記
載された内部対照配列を含む。この内部対照配列は、Ｉ
Ｓ６１１０、１６Ｓおよび内部対照標的の同時増幅（３
者の増幅）のために１対の増幅プライマーを用いる複数
増幅プロトコルにおいて２つの標的配列と共に増幅され
る。この態様において、ひとつの増幅反応におけるアッ
セイは、標的を定量するかまたはサンプルの増幅活性を
測定し、そして存在するかもしれない臨床的に関連した
ミコバクテリアを検出／同定するための手段を提供す
る。属および種特異的ミコバクテリア配列と、ひとつの
内部対照配列の同時増幅は、同じプライマー対を用いて
複数の標的および内部対照配列のアダプター介在による
複数増幅のための、開示された方法の広い適用性を例示
する。
らに、米国特許出願番号第０８／０５８，６４８号に記
載された内部対照配列を含む。この内部対照配列は、Ｉ
Ｓ６１１０、１６Ｓおよび内部対照標的の同時増幅（３
者の増幅）のために１対の増幅プライマーを用いる複数
増幅プロトコルにおいて２つの標的配列と共に増幅され
る。この態様において、ひとつの増幅反応におけるアッ
セイは、標的を定量するかまたはサンプルの増幅活性を
測定し、そして存在するかもしれない臨床的に関連した
ミコバクテリアを検出／同定するための手段を提供す
る。属および種特異的ミコバクテリア配列と、ひとつの
内部対照配列の同時増幅は、同じプライマー対を用いて
複数の標的および内部対照配列のアダプター介在による
複数増幅のための、開示された方法の広い適用性を例示
する。
【００１２】本発明は、配列特異的なプライマーのハイ
ブリダイゼーション、特にＳＤＡ（複数化ＳＤＡ）によ
る複数標的配列の同時増幅法を提供する。この方法は、
１対の増幅プライマーまたは１対のＳＤＡ増幅プライマ
ーを用いて複数の標的配列を共増幅する。この方法は、
標的に対する規定されたアダプター配列を付加し、プラ
イマー伸長合成により増幅することにより実施される。
この方法は、複数の標的特異的プライマー対を用いてア
ダプター配列の付加なしに複数の標的を共増幅する「慣
用的複数化」とは対照的である。
ブリダイゼーション、特にＳＤＡ（複数化ＳＤＡ）によ
る複数標的配列の同時増幅法を提供する。この方法は、
１対の増幅プライマーまたは１対のＳＤＡ増幅プライマ
ーを用いて複数の標的配列を共増幅する。この方法は、
標的に対する規定されたアダプター配列を付加し、プラ
イマー伸長合成により増幅することにより実施される。
この方法は、複数の標的特異的プライマー対を用いてア
ダプター配列の付加なしに複数の標的を共増幅する「慣
用的複数化」とは対照的である。
【００１３】以下の単語は以下のとおりに規定される。
【００１４】増幅プライマーは、配列特異的ハイブリダ
イゼーションにより標的配列を増幅するためのプライマ
ーである。ＳＤＡに関して、増幅プライマーの３’末端
（標的結合配列）は標的配列の３’末端においてハイブ
リダイズし、その５’末端に制限酵素の認識部位を含
む。認識部位は、認識部位の一方の鎖がメチル化されて
いる場合（ヘミメチル化）に、ＤＮＡ二本鎖にニックを
入れる制限酵素に関するものであり、Ｗａｌｋｅｒ，ｅ
ｔ ａｌ．（１９９２，ＰＮＡＳ ８９，３９２−３９
６およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｉｄｓ Ｒｅｓ．２０，１
６９１−１６９６）および米国特許出願番号第０７／８
１９，３５８号（１９９２年１月９日出願）に記載され
ているとおりであり、これらの文献は引用により本明細
書の一部をなす。ヘミメチル化されている認識部位は、
制限酵素による鎖の切断を阻害する少なくともひとつの
修飾ヌクレオチドを一方の鎖が含む場合の、制限酵素の
二本鎖認識部位に関する。ヘミメチル化されている認識
部位の他方の鎖は、切断部位に修飾ヌクレオチドを含ま
ず、制限酵素によりニックを入れられない。好ましいヘ
ミメチル化認識部位は、制限酵素ＨｉｎｃＩＩ，Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ，ＡｖａＩ，ＮｃｉＩおよびＦｎｕ４ＨＩのヘ
ミホスホロチオエート化された認識部位である。ＳＤＡ
反応の大多数に関して、増幅プライマーは標的配列の対
数増幅に必要である。
イゼーションにより標的配列を増幅するためのプライマ
ーである。ＳＤＡに関して、増幅プライマーの３’末端
（標的結合配列）は標的配列の３’末端においてハイブ
リダイズし、その５’末端に制限酵素の認識部位を含
む。認識部位は、認識部位の一方の鎖がメチル化されて
いる場合（ヘミメチル化）に、ＤＮＡ二本鎖にニックを
入れる制限酵素に関するものであり、Ｗａｌｋｅｒ，ｅ
ｔ ａｌ．（１９９２，ＰＮＡＳ ８９，３９２−３９
６およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｉｄｓ Ｒｅｓ．２０，１
６９１−１６９６）および米国特許出願番号第０７／８
１９，３５８号（１９９２年１月９日出願）に記載され
ているとおりであり、これらの文献は引用により本明細
書の一部をなす。ヘミメチル化されている認識部位は、
制限酵素による鎖の切断を阻害する少なくともひとつの
修飾ヌクレオチドを一方の鎖が含む場合の、制限酵素の
二本鎖認識部位に関する。ヘミメチル化されている認識
部位の他方の鎖は、切断部位に修飾ヌクレオチドを含ま
ず、制限酵素によりニックを入れられない。好ましいヘ
ミメチル化認識部位は、制限酵素ＨｉｎｃＩＩ，Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ，ＡｖａＩ，ＮｃｉＩおよびＦｎｕ４ＨＩのヘ
ミホスホロチオエート化された認識部位である。ＳＤＡ
反応の大多数に関して、増幅プライマーは標的配列の対
数増幅に必要である。
【００１５】アダプタープライマーは、標的配列にハイ
ブリダイズするための配列をその３’末端に有する（標
的結合配列）オリゴヌクレオチドである。アダプタープ
ライマーの５’末端は、アダプター配列である。このア
ダプター配列は、増幅プライマーの一方の３’末端と実
質的に同一な配列であるか、または相補的な標的結合配
列を伴う増幅プライマーが調製されうるためのあらゆる
規定された配列である。
ブリダイズするための配列をその３’末端に有する（標
的結合配列）オリゴヌクレオチドである。アダプタープ
ライマーの５’末端は、アダプター配列である。このア
ダプター配列は、増幅プライマーの一方の３’末端と実
質的に同一な配列であるか、または相補的な標的結合配
列を伴う増幅プライマーが調製されうるためのあらゆる
規定された配列である。
【００１６】バンパープライマーは、アダプタープライ
マーまたは増幅プライマーの何れかの上流において標的
配列にアニールするプライマーであり、それによりバン
パープライマーの伸長合成が下流のプライマーおよび伸
長合成産物を置換する。バンパープライマーの伸長合成
は、アダプタープライマーおよび増幅プライマーの伸長
合成産物の置換のための一つの方法であるが、加熱も適
切である。
マーまたは増幅プライマーの何れかの上流において標的
配列にアニールするプライマーであり、それによりバン
パープライマーの伸長合成が下流のプライマーおよび伸
長合成産物を置換する。バンパープライマーの伸長合成
は、アダプタープライマーおよび増幅プライマーの伸長
合成産物の置換のための一つの方法であるが、加熱も適
切である。
【００１７】同一の配列とは、同じ相補的ヌクレオチド
配列にハイブリダイズすることをいう。実質的に同一の
配列とは、ヌクレオチド配列において十分に類似性を有
し、同じヌクレオチド配列にハイブリダイズすることを
いう。
配列にハイブリダイズすることをいう。実質的に同一の
配列とは、ヌクレオチド配列において十分に類似性を有
し、同じヌクレオチド配列にハイブリダイズすることを
いう。
【００１８】単語、標的または標的配列は、増幅される
核酸配列を意味する。これらは、増幅される起源の核酸
およびその相補的第２鎖（アダプター配列付加前）、上
記の起源配列のアダプター修飾コピーの何れか一方の
鎖、およびアダプター配列が起源配列に付加される場合
の反応の中間産物である起源配列のコピーの何れか一方
を包含する。
核酸配列を意味する。これらは、増幅される起源の核酸
およびその相補的第２鎖（アダプター配列付加前）、上
記の起源配列のアダプター修飾コピーの何れか一方の
鎖、およびアダプター配列が起源配列に付加される場合
の反応の中間産物である起源配列のコピーの何れか一方
を包含する。
【００１９】標的配列の種特異的増幅とは、ミコバクテ
リウムツベルクロシス（Ｍ．ｔｂ）群（ｃｏｍｐｌｅ
ｘ）のメンバーとして分類されるミコバクテリア種中の
標的配列の増幅であって、非Ｍ．ｔｂ群（ｃｏｍｐｌｅ
ｘ）のミコバクテリアをほとんどあるいは全く増幅しな
いことを意味する。
リウムツベルクロシス（Ｍ．ｔｂ）群（ｃｏｍｐｌｅ
ｘ）のメンバーとして分類されるミコバクテリア種中の
標的配列の増幅であって、非Ｍ．ｔｂ群（ｃｏｍｐｌｅ
ｘ）のミコバクテリアをほとんどあるいは全く増幅しな
いことを意味する。
【００２０】本発明のアダプター介在複数化において、
アダプター配列は、アダプタープライマー手段および一
連の伸長合成および鎖置換工程により標的配列の末端に
付加される。図１は、１対の増幅プライマーを用いて２
つの標的配列を共増幅する場合の本発明のひとつの態様
を示す。２つの標的配列のひとつは、Ｍ．ｔｂ群特異的
（例えば、ＩＳ６１１０）であり、他方の標的配列はミ
コバクテリア属のすべてに特異的である（例えば、１６
Ｓ遺伝子）。各標的配列の一方の鎖のみの修飾を明確に
例示する。この態様において、各標的鎖の一方の末端
は、他方の標的の末端セグメントと実質的に同一な配列
を付加することにより修飾する。各標的鎖の他方の末端
は修飾されないまま残り、増幅プライマー対の一方に対
するもともとの相補性を保持する。以下において詳細に
記載されるとおり、その結果得られる修飾標的の両方は
１対の増幅プライマーにより増幅され、該対の一方は２
つの起源標的配列の一方に相補的であり、該対の他方は
２つの起源標的配列の他方に相補的である。第１の
（Ｍ．ｔｂ群特異的）標的（Ｍ．ｔｂ標的）に関して
は、Ｍ．ｔｂ特異的増幅プライマー（Ｓtb）を標的配列
の３’末端にハイブリダイズさせてポリメラーゼにより
伸長合成する。増幅プライマーのニッキング酵素の認識
部位は図１に示すとおり、プライマーの盛り上がった部
分である。その結果得られる伸長合成産物は、Ｓtbの上
流において標的にハイブリダイズするバンパープライマ
ー（Ｂtb1）の伸長合成により置換される。置換された
Ｓtb伸長合成産物（Ｓtb−ｅｘｔ）を、起源標的配列に
相補的な３’末端においてＳtb−ｅｘｔに結合するアダ
プタープライマー（Ａtb）にハイブリダイズさせる。Ａ
tbの５’末端はアダプター配列からなるが（太線部
分）、該配列は第２のミコバクテリア属に特異的な標的
（Ｍ．ｇ標的）に特異的に結合する増幅プライマーＳg
の３’末端において標的結合配列と実質的に同一であ
る。Ａtbの伸長合成およびＡtb伸長合成産物（Ａtb−ｅ
ｘｔ）の置換は、ニッキング酵素認識部位およびその
３’末端のＭ．ｔｂ標的配列およびその５’末端のＳg
標的結合配列により、Ｍ．ｔｂ標的配列の一本鎖コピー
を生産する。
アダプター配列は、アダプタープライマー手段および一
連の伸長合成および鎖置換工程により標的配列の末端に
付加される。図１は、１対の増幅プライマーを用いて２
つの標的配列を共増幅する場合の本発明のひとつの態様
を示す。２つの標的配列のひとつは、Ｍ．ｔｂ群特異的
（例えば、ＩＳ６１１０）であり、他方の標的配列はミ
コバクテリア属のすべてに特異的である（例えば、１６
Ｓ遺伝子）。各標的配列の一方の鎖のみの修飾を明確に
例示する。この態様において、各標的鎖の一方の末端
は、他方の標的の末端セグメントと実質的に同一な配列
を付加することにより修飾する。各標的鎖の他方の末端
は修飾されないまま残り、増幅プライマー対の一方に対
するもともとの相補性を保持する。以下において詳細に
記載されるとおり、その結果得られる修飾標的の両方は
１対の増幅プライマーにより増幅され、該対の一方は２
つの起源標的配列の一方に相補的であり、該対の他方は
２つの起源標的配列の他方に相補的である。第１の
（Ｍ．ｔｂ群特異的）標的（Ｍ．ｔｂ標的）に関して
は、Ｍ．ｔｂ特異的増幅プライマー（Ｓtb）を標的配列
の３’末端にハイブリダイズさせてポリメラーゼにより
伸長合成する。増幅プライマーのニッキング酵素の認識
部位は図１に示すとおり、プライマーの盛り上がった部
分である。その結果得られる伸長合成産物は、Ｓtbの上
流において標的にハイブリダイズするバンパープライマ
ー（Ｂtb1）の伸長合成により置換される。置換された
Ｓtb伸長合成産物（Ｓtb−ｅｘｔ）を、起源標的配列に
相補的な３’末端においてＳtb−ｅｘｔに結合するアダ
プタープライマー（Ａtb）にハイブリダイズさせる。Ａ
tbの５’末端はアダプター配列からなるが（太線部
分）、該配列は第２のミコバクテリア属に特異的な標的
（Ｍ．ｇ標的）に特異的に結合する増幅プライマーＳg
の３’末端において標的結合配列と実質的に同一であ
る。Ａtbの伸長合成およびＡtb伸長合成産物（Ａtb−ｅ
ｘｔ）の置換は、ニッキング酵素認識部位およびその
３’末端のＭ．ｔｂ標的配列およびその５’末端のＳg
標的結合配列により、Ｍ．ｔｂ標的配列の一本鎖コピー
を生産する。
【００２１】第２標的（Ｍ．ｇ標的）は同様に処理さ
れ、即ち、最初に結合させ、ミコバクテリア属特異的増
幅プライマー（Ｓg）を伸長合成させ、そして伸長合成
産物（Ｓg−ｅｘｔ）にアダプター配列（Ａg）をハイブ
リダイズさせる。Ｓgは、Ｓgの標的結合配列およびＡtb
のアダプター配列の両者に相補的な標的の３’末端セグ
メントにおいてミコバクテリア属の標的にハイブリダイ
ズする。アダプタープライマーＡgの３’末端は起源標
的に相補的な３’末端においてハイブリダイズし、Ａg
の５’末端（白枠部分）はＳtbの標的結合配列に実質的
に同一である。Ａg伸長合成産物（Ａg−ｅｘｔ）の伸長
合成および置換は、ニッキング酵素認識部位（盛り上が
った部分）およびその３’末端のＭ．ｔｂ標的配列およ
びその５’末端のＳtb標的結合配列により、第２標的配
列のコピーを生産する。標的配列の２つのアダプター修
飾配列は、すでに反応物中に存在するＳtbおよびＳg増
幅プライマーのみを用いてＳＤＡにより増幅可能であ
る。ＳＤＡを開始するために、Ａtb−ｅｘｔおよびＡg
−ｅｘｔを各々の増幅プライマーにハイブリダイズさ
せ、それらプライマーは伸長合成により修飾鎖の相補鎖
を生産するが（即ち、Ｍ．ｔｂ修飾鎖上のＳtbの伸長合
成およびＭ．ｇ修飾鎖上のＳgの伸長合成）、該相補鎖
は３’末端においてアダプター配列に相補性を有する。
ニッキングおよび置換の後に、次に、他方の標的の増幅
プライマーはこの伸長合成産物の３’末端（即ち、Ｍ．
ｔｂ由来の鎖に対するＳgおよびＭ．ｇ由来の鎖に対す
るＳtb）に結合することができ、かつ、各末端において
ニッキング酵素認識部位により断片を生じる。この断片
はＷａｌｋｅｒ，ｅｔ ａｌ（前記）において記載され
た慣用的ＳＤＡにより増幅される。
れ、即ち、最初に結合させ、ミコバクテリア属特異的増
幅プライマー（Ｓg）を伸長合成させ、そして伸長合成
産物（Ｓg−ｅｘｔ）にアダプター配列（Ａg）をハイブ
リダイズさせる。Ｓgは、Ｓgの標的結合配列およびＡtb
のアダプター配列の両者に相補的な標的の３’末端セグ
メントにおいてミコバクテリア属の標的にハイブリダイ
ズする。アダプタープライマーＡgの３’末端は起源標
的に相補的な３’末端においてハイブリダイズし、Ａg
の５’末端（白枠部分）はＳtbの標的結合配列に実質的
に同一である。Ａg伸長合成産物（Ａg−ｅｘｔ）の伸長
合成および置換は、ニッキング酵素認識部位（盛り上が
った部分）およびその３’末端のＭ．ｔｂ標的配列およ
びその５’末端のＳtb標的結合配列により、第２標的配
列のコピーを生産する。標的配列の２つのアダプター修
飾配列は、すでに反応物中に存在するＳtbおよびＳg増
幅プライマーのみを用いてＳＤＡにより増幅可能であ
る。ＳＤＡを開始するために、Ａtb−ｅｘｔおよびＡg
−ｅｘｔを各々の増幅プライマーにハイブリダイズさ
せ、それらプライマーは伸長合成により修飾鎖の相補鎖
を生産するが（即ち、Ｍ．ｔｂ修飾鎖上のＳtbの伸長合
成およびＭ．ｇ修飾鎖上のＳgの伸長合成）、該相補鎖
は３’末端においてアダプター配列に相補性を有する。
ニッキングおよび置換の後に、次に、他方の標的の増幅
プライマーはこの伸長合成産物の３’末端（即ち、Ｍ．
ｔｂ由来の鎖に対するＳgおよびＭ．ｇ由来の鎖に対す
るＳtb）に結合することができ、かつ、各末端において
ニッキング酵素認識部位により断片を生じる。この断片
はＷａｌｋｅｒ，ｅｔ ａｌ（前記）において記載され
た慣用的ＳＤＡにより増幅される。
【００２２】Ａtb−ｅｘｔおよびＡg−ｅｘｔの置換後
に生産される二本鎖反応産物も、Ａt b−ｅｘｔおよびＡ
g−ｅｘｔのさらなるコピーを生じる繰り返し反応に関
与する。最後の鎖の制限酵素認識部位にニッキングを入
れ、ポリメラーゼにより伸長合成し、そして最後の鎖を
置換することにより、Ｓtb−ｅｘｔおよびＳg−ｅｘｔ
と同様であるがその５’末端に制限酵素認識部位の半分
を有する標的を生成する。アダプタープライマーはこれ
らの断片に結合することができ、伸長合成および置換に
よりＡtb−ｅｘｔおよびＡg−ｅｘｔ（５’末端に制限
酵素認識部位の半分を有する）のさらなるコピーを生成
し、これらのコピーは上記のとおりＳＤＡ反応サイクル
に入る。
に生産される二本鎖反応産物も、Ａt b−ｅｘｔおよびＡ
g−ｅｘｔのさらなるコピーを生じる繰り返し反応に関
与する。最後の鎖の制限酵素認識部位にニッキングを入
れ、ポリメラーゼにより伸長合成し、そして最後の鎖を
置換することにより、Ｓtb−ｅｘｔおよびＳg−ｅｘｔ
と同様であるがその５’末端に制限酵素認識部位の半分
を有する標的を生成する。アダプタープライマーはこれ
らの断片に結合することができ、伸長合成および置換に
よりＡtb−ｅｘｔおよびＡg−ｅｘｔ（５’末端に制限
酵素認識部位の半分を有する）のさらなるコピーを生成
し、これらのコピーは上記のとおりＳＤＡ反応サイクル
に入る。
【００２３】図１は、各標的配列に関して通常存在する
２つの相補鎖の一方のみからの修飾された標的の生成を
示す。第２鎖の場合、しかしながら、プライマーの結合
および伸長合成の程度は保持される。アダプタープライ
マーは最初に直接標的第２鎖に結合し、その鋳型上で伸
長合成する。続く置換の後、その結果得られるアダプタ
ー伸長合成産物は増幅プライマーにハイブリダイズし、
ひるがえって伸長合成および置換されることにより、
５’末端にニッキング制限酵素の認識部位を有し、３’
末端にアダプター配列に相補的な配列を有する起源第２
鎖標的配列を含む生成物を生成する。この修飾された断
片は、他方の標的に特異的な増幅プライマーの結合およ
び伸長合成により慣用的ＳＤＡ増幅に入り（即ち、Ｓg
はＭ．ｔｂ由来の鎖に結合し、Ｓtbはミコバクテリア属
由来の鎖に結合する）、各末端にニッキング酵素認識部
位を有する各標的の第２鎖の断片を生成する。
２つの相補鎖の一方のみからの修飾された標的の生成を
示す。第２鎖の場合、しかしながら、プライマーの結合
および伸長合成の程度は保持される。アダプタープライ
マーは最初に直接標的第２鎖に結合し、その鋳型上で伸
長合成する。続く置換の後、その結果得られるアダプタ
ー伸長合成産物は増幅プライマーにハイブリダイズし、
ひるがえって伸長合成および置換されることにより、
５’末端にニッキング制限酵素の認識部位を有し、３’
末端にアダプター配列に相補的な配列を有する起源第２
鎖標的配列を含む生成物を生成する。この修飾された断
片は、他方の標的に特異的な増幅プライマーの結合およ
び伸長合成により慣用的ＳＤＡ増幅に入り（即ち、Ｓg
はＭ．ｔｂ由来の鎖に結合し、Ｓtbはミコバクテリア属
由来の鎖に結合する）、各末端にニッキング酵素認識部
位を有する各標的の第２鎖の断片を生成する。
【００２４】アダプター配列を付加して標的を増幅する
ことに係わるすべての反応工程は、ひとつの反応混合物
中で同時に生じる。即ち、アダプター配列が標的分子に
付加されたならば、その標的分子の増幅は、存在するあ
らゆる他の標的分子にアダプター配列を付加する前と同
じ反応混合物中で、修飾標的の単離なしに生じうる。本
発明の方法の反応条件は幾つかの変更を加えた以外は、
本質的に、前記のＷａｌｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．により記
載されたとおりである。第１に、最初の反応混合物は、
増幅プライマーおよびアダプタープライマーの両者並び
に標的ＤＮＡを含む。さらに、増幅プライマーは、アダ
プタープライマーの約１０倍、そしてバンパープライマ
ーの約２０倍過剰に存在することが好ましい。バンパー
プライマーの濃度は重要ではないが、慣用的ＳＤＡにお
ける濃度よりも通常は低い。しかしながら、慣用的ＳＤ
Ａと同様に、標的ＤＮＡの熱変成およびプライマーのア
ニーリングの後に、ニッキング酵素およびｅｘｏ-クレ
ノーポリメラーゼを添加する。標的ＤＮＡを変成し、プ
ライマーをアニーリングしてポリメラーゼを添加した
後、アダプター配列の付加および増幅は、実施者のさら
なる干渉なしにひとつの反応混合物中で自動的に進行す
る。即ち、アダプター配列が付加された後は、修飾標的
配列は自動的にＳＤＡ反応サイクルに入る。
ことに係わるすべての反応工程は、ひとつの反応混合物
中で同時に生じる。即ち、アダプター配列が標的分子に
付加されたならば、その標的分子の増幅は、存在するあ
らゆる他の標的分子にアダプター配列を付加する前と同
じ反応混合物中で、修飾標的の単離なしに生じうる。本
発明の方法の反応条件は幾つかの変更を加えた以外は、
本質的に、前記のＷａｌｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．により記
載されたとおりである。第１に、最初の反応混合物は、
増幅プライマーおよびアダプタープライマーの両者並び
に標的ＤＮＡを含む。さらに、増幅プライマーは、アダ
プタープライマーの約１０倍、そしてバンパープライマ
ーの約２０倍過剰に存在することが好ましい。バンパー
プライマーの濃度は重要ではないが、慣用的ＳＤＡにお
ける濃度よりも通常は低い。しかしながら、慣用的ＳＤ
Ａと同様に、標的ＤＮＡの熱変成およびプライマーのア
ニーリングの後に、ニッキング酵素およびｅｘｏ-クレ
ノーポリメラーゼを添加する。標的ＤＮＡを変成し、プ
ライマーをアニーリングしてポリメラーゼを添加した
後、アダプター配列の付加および増幅は、実施者のさら
なる干渉なしにひとつの反応混合物中で自動的に進行す
る。即ち、アダプター配列が付加された後は、修飾標的
配列は自動的にＳＤＡ反応サイクルに入る。
【００２５】ＩＳ６１１０の全ヌクレオチド配列は、Ｔ
ｈｉｅｒｒｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９０，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，１８８）に記載されて
いる。本発明の方法は、ミコバクテリア群（ミコバクテ
リウムツベルクロシス、ミコバクテリウムボビス、ミコ
バクテリウムボビス−ＢＣＧ、ミコバクテリウムアフリ
カナムおよびミコバクテリウムミクロチ）の種に存在す
るＩＳ６１１０インサーションエレメント中の標的配列
を増幅するプライマーを提供する。このプライマーは、
ＩＳ６１１０のヌクレオチド番号９７２−９８４に相補
的であり、Ｍ．ｔｂ群以外のミコバクテリア種または非
ミコバクテリア種中の標的の増幅をほとんどまたは全く
行わない。これらのプライマーは、本明細書中で種特異
的プライマーと規定する。
ｈｉｅｒｒｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９０，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，１８８）に記載されて
いる。本発明の方法は、ミコバクテリア群（ミコバクテ
リウムツベルクロシス、ミコバクテリウムボビス、ミコ
バクテリウムボビス−ＢＣＧ、ミコバクテリウムアフリ
カナムおよびミコバクテリウムミクロチ）の種に存在す
るＩＳ６１１０インサーションエレメント中の標的配列
を増幅するプライマーを提供する。このプライマーは、
ＩＳ６１１０のヌクレオチド番号９７２−９８４に相補
的であり、Ｍ．ｔｂ群以外のミコバクテリア種または非
ミコバクテリア種中の標的の増幅をほとんどまたは全く
行わない。これらのプライマーは、本明細書中で種特異
的プライマーと規定する。
【００２６】図２に示すとおり、さまざまなミコバクテ
リア種の１６Ｓリボソーマル遺伝子の配列を利用するこ
とにより、実質的にすべての臨床的に関連のあるミコバ
クテリア種に存在して非ミコバクテリア種には存在しな
い標的を増幅する、核酸増幅のための属特異的プライマ
ーをデザインする。ヌクレオチド番号５０７−６０３の
選択されたミコバクテリウムツベルクロシスの配列は、
ミコバクテリウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、ミコバク
テリウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧ、ミコバク
テリウムイントラセルラエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕ
ｌａｒｅ）、ミコバクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓ
ａｓｉｉ）、ミコバクテリウムガストリ（Ｍ．ｇａｓｔ
ｒｉ）、ミコバクテリウムパラツベルクロシス（Ｍ．ｐ
ａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ミコバクテリウム
モルモエンス（Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）、ミコバクテ
リウムスズルガイ（Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ）、ミコバクテ
リウムゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、ミコバクテ
リウムレプレ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、ミコバクテリウム
ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）、ミコバクテリ
ウムアシアチカム（Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ）、ミコバ
クテリウムスクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃ
ｅｕｍ）中の配列と同一である。配列データベース中の
幾つかの種に関しては、まだ決定されていないヌクレオ
チドが５８７および５８８位に挙げられているが、これ
らの何れもがプライマー結合を含まない。ミコバクテリ
ウムテレ（Ｍ．ｔｅｒｒａｅ）、ミコバクテリウムケロ
ネア（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、ミコバクテリウムホル
ツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）および本願発明者
の所有するミコバクテリウムマリナム（Ｍ．ｍａｒｉｎ
ｕｍ）株は、３つのヌクレオチド位置においてこの共通
配列とは異なる。本願発明者の所有するミコバクテリウ
ムマリナム株は、予期しなかったものであり、これら生
物のＧＥＮＢＡＮＫ配列はミコバクテリウムボビスと同
一であり、ミコバクテリウムテレとは同一でないことが
報告された。ミコバクテリウムフラベシーンス（Ｍ．ｆ
ｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ミコバクテリウムゼノピ（Ｍ．
ｘｅｎｏｐｉ）およびミコバクテリウムゲナベンス
（Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ）はより広範囲な配列の相違
がある。この標的配列は、他の点においてはミコバクテ
リアと同様な生物において、ミコバクテリアから意味を
もって分化した。ミコバクテリア間における配列の違い
にもかかわらず、しかしながら、図２に示すような標的
配列を増幅するためにデザインされたプライマーは臨床
的に関連のあるミコバクテリア種に存在して他の同様な
非ミコバクテリア種には存在しない標的を特異的に増幅
することが見いだされた。これらのプライマーは、本明
細書において属特異的プライマーと規定する。
リア種の１６Ｓリボソーマル遺伝子の配列を利用するこ
とにより、実質的にすべての臨床的に関連のあるミコバ
クテリア種に存在して非ミコバクテリア種には存在しな
い標的を増幅する、核酸増幅のための属特異的プライマ
ーをデザインする。ヌクレオチド番号５０７−６０３の
選択されたミコバクテリウムツベルクロシスの配列は、
ミコバクテリウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、ミコバク
テリウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧ、ミコバク
テリウムイントラセルラエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕ
ｌａｒｅ）、ミコバクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓ
ａｓｉｉ）、ミコバクテリウムガストリ（Ｍ．ｇａｓｔ
ｒｉ）、ミコバクテリウムパラツベルクロシス（Ｍ．ｐ
ａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ミコバクテリウム
モルモエンス（Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）、ミコバクテ
リウムスズルガイ（Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ）、ミコバクテ
リウムゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、ミコバクテ
リウムレプレ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、ミコバクテリウム
ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）、ミコバクテリ
ウムアシアチカム（Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ）、ミコバ
クテリウムスクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃ
ｅｕｍ）中の配列と同一である。配列データベース中の
幾つかの種に関しては、まだ決定されていないヌクレオ
チドが５８７および５８８位に挙げられているが、これ
らの何れもがプライマー結合を含まない。ミコバクテリ
ウムテレ（Ｍ．ｔｅｒｒａｅ）、ミコバクテリウムケロ
ネア（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、ミコバクテリウムホル
ツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）および本願発明者
の所有するミコバクテリウムマリナム（Ｍ．ｍａｒｉｎ
ｕｍ）株は、３つのヌクレオチド位置においてこの共通
配列とは異なる。本願発明者の所有するミコバクテリウ
ムマリナム株は、予期しなかったものであり、これら生
物のＧＥＮＢＡＮＫ配列はミコバクテリウムボビスと同
一であり、ミコバクテリウムテレとは同一でないことが
報告された。ミコバクテリウムフラベシーンス（Ｍ．ｆ
ｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ミコバクテリウムゼノピ（Ｍ．
ｘｅｎｏｐｉ）およびミコバクテリウムゲナベンス
（Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ）はより広範囲な配列の相違
がある。この標的配列は、他の点においてはミコバクテ
リアと同様な生物において、ミコバクテリアから意味を
もって分化した。ミコバクテリア間における配列の違い
にもかかわらず、しかしながら、図２に示すような標的
配列を増幅するためにデザインされたプライマーは臨床
的に関連のあるミコバクテリア種に存在して他の同様な
非ミコバクテリア種には存在しない標的を特異的に増幅
することが見いだされた。これらのプライマーは、本明
細書において属特異的プライマーと規定する。
【００２７】Ｍ．ｔｂ種特異的ＩＳ６１１０配列および
属特異的１６Ｓ配列の複数化ＳＤＡ反応における同時増
幅は、Ｍ．ｔｂ生物および他の臨床的に関連のあるミコ
バクテリア種を１回の反応により迅速に検出および／ま
たは同定する。増幅されたＩＳ６１１０および１６Ｓ標
的の検出は、サンプル中のミコバクテリウムツベルクロ
シス群生物の存在を示唆する。１６Ｓ標的のみの検出
は、非Ｍ．ｔｂ群ミコバクテリアの存在を示唆する。核
酸増幅法を用いて１日で結果が得られるとおり、臨床的
に関連のあるミコバクテリアに関してサンプルが陰性で
あるという決定に到達するまで、６週間も培養結果を待
つ必要はもはやない。
属特異的１６Ｓ配列の複数化ＳＤＡ反応における同時増
幅は、Ｍ．ｔｂ生物および他の臨床的に関連のあるミコ
バクテリア種を１回の反応により迅速に検出および／ま
たは同定する。増幅されたＩＳ６１１０および１６Ｓ標
的の検出は、サンプル中のミコバクテリウムツベルクロ
シス群生物の存在を示唆する。１６Ｓ標的のみの検出
は、非Ｍ．ｔｂ群ミコバクテリアの存在を示唆する。核
酸増幅法を用いて１日で結果が得られるとおり、臨床的
に関連のあるミコバクテリアに関してサンプルが陰性で
あるという決定に到達するまで、６週間も培養結果を待
つ必要はもはやない。
【００２８】この態様において、ＩＳ６１１０および１
６Ｓ標的配列は、本発明の属特異的および種特異的プラ
イマーを用いて、アダプター介在複数化ＳＤＡにより共
増幅される。別の好ましい態様において、アダプター介
在複数化ＳＤＡ反応は、米国特許出願番号第０８／０５
８，６４８号に記載された内部対照配列を含む。属特異
的および種特異的プライマーを用いた以下の実施例にお
ける使用のための好ましい内部対照配列は、配列番号１
２である。配列番号１２は、米国特許出願番号第０８／
０５８，６４８号の配列番号１の中心（ｃｏｒｅ）配
列、および米国特許出願番号第０８／０７３，１９７号
において教示されたような１対のプライマーを用いて共
増幅を促進するための増幅プライマー結合配列を各末端
に含む。内部対照配列の増幅プライマー結合配列は、増
幅プライマーの標的結合配列に相補的である。
６Ｓ標的配列は、本発明の属特異的および種特異的プラ
イマーを用いて、アダプター介在複数化ＳＤＡにより共
増幅される。別の好ましい態様において、アダプター介
在複数化ＳＤＡ反応は、米国特許出願番号第０８／０５
８，６４８号に記載された内部対照配列を含む。属特異
的および種特異的プライマーを用いた以下の実施例にお
ける使用のための好ましい内部対照配列は、配列番号１
２である。配列番号１２は、米国特許出願番号第０８／
０５８，６４８号の配列番号１の中心（ｃｏｒｅ）配
列、および米国特許出願番号第０８／０７３，１９７号
において教示されたような１対のプライマーを用いて共
増幅を促進するための増幅プライマー結合配列を各末端
に含む。内部対照配列の増幅プライマー結合配列は、増
幅プライマーの標的結合配列に相補的である。
【００２９】当業者には、以下の記載から、ＩＳ６１１
０または１６Ｓの何れかが慣用的ＳＤＡ反応において単
独で増幅されることを認識するであろう。例えば、Ｍ．
ｔｂの検出に関して、１６Ｓ配列のみがＷａｌｋｅｒ，
ｅｔ ａｌ．の方法に従って、ＳgおよびＳtbをＡgアダ
プタープライマーと用いることにより増幅される。別法
として、属特異的検出のみが必要ならば、Ｓgおよび増
幅プライマーとして機能するように修飾されたＡgを用
いて、即ち、ＨｉｎｃＩＩ制限酵素認識部位によりＭ．
ｔｂアダプター配列を置換して、１６Ｓ配列を増幅す
る。同様に、ＩＳ６１１０標的配列のみは、Ｓgおよび
ＳtbをＡtbアダプタープライマーと用いるか、または、
ＳtbおよびＨｉｎｃＩＩ制限酵素認識部位によりＭ．ｔ
ｂアダプター配列を置換することにより増幅プライマー
として機能するように修飾されたＡgを用いて、増幅さ
れる。
０または１６Ｓの何れかが慣用的ＳＤＡ反応において単
独で増幅されることを認識するであろう。例えば、Ｍ．
ｔｂの検出に関して、１６Ｓ配列のみがＷａｌｋｅｒ，
ｅｔ ａｌ．の方法に従って、ＳgおよびＳtbをＡgアダ
プタープライマーと用いることにより増幅される。別法
として、属特異的検出のみが必要ならば、Ｓgおよび増
幅プライマーとして機能するように修飾されたＡgを用
いて、即ち、ＨｉｎｃＩＩ制限酵素認識部位によりＭ．
ｔｂアダプター配列を置換して、１６Ｓ配列を増幅す
る。同様に、ＩＳ６１１０標的配列のみは、Ｓgおよび
ＳtbをＡtbアダプタープライマーと用いるか、または、
ＳtbおよびＨｉｎｃＩＩ制限酵素認識部位によりＭ．ｔ
ｂアダプター配列を置換することにより増幅プライマー
として機能するように修飾されたＡgを用いて、増幅さ
れる。
【００３０】ＩＳ６１１０、１６Ｓおよび内部対照標的
配列の増幅産物は、検出可能な標識を付加されたオリゴ
ヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションによ
り検出されるが、その際、３つのプローブの各ひとつは
標的のひとつに特異的にハイブリダイズする。標的特異
的および対照特異的プローブを増幅産物に同時にハイブ
リダイズさせるならば、それぞれの量の対照および標的
の識別を促進するために、標識は別々に同定可能なもの
であるべきである。さもなくば、異なるアリコートの増
幅反応物を、同じ標識を付加した標的特異的および対照
特異的プローブに別々にハイブリダイズさせる。検出可
能な標識は、合成後または合成中にプローブ中に取り込
まれた後、プローブに結合させるが、例えば、標的誘導
ヌクレオチドの形態である。そのような標識は当該分野
において公知であり、直接または間接的に検出可能な標
識を含む。直接的に検出可能な標識はさらなる化学反応
なしにシグナルを生じるものであり、蛍光染料、ラジオ
アイソトープおよび染料のような標識を含む。間接的に
検出可能な標識はさらなる化学反応および検出可能なシ
グナルを生じさせる試薬の添加を必要とする。これら
は、例えば、ホースラディッシュパーオキシダーゼおよ
びアルカリホスファターゼのような酵素、標識結合アビ
ジンへの結合により検出されるビオチンのようなリガン
ド、および化学発光分子を含む。プローブは、溶液中、
ゲル上、または固形支持体上の各々の増幅産物にハイブ
リダイズする。ハイブリダイゼーションに続き、関連す
る標識からのシグナルが発せられ、検出され、そして選
択された標識およびハイブリダイゼーションプロトコル
に適した方法を用いて別々に定量される。各増幅産物に
関して検出されたシグナルの量は存在する量を反映す
る。
配列の増幅産物は、検出可能な標識を付加されたオリゴ
ヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションによ
り検出されるが、その際、３つのプローブの各ひとつは
標的のひとつに特異的にハイブリダイズする。標的特異
的および対照特異的プローブを増幅産物に同時にハイブ
リダイズさせるならば、それぞれの量の対照および標的
の識別を促進するために、標識は別々に同定可能なもの
であるべきである。さもなくば、異なるアリコートの増
幅反応物を、同じ標識を付加した標的特異的および対照
特異的プローブに別々にハイブリダイズさせる。検出可
能な標識は、合成後または合成中にプローブ中に取り込
まれた後、プローブに結合させるが、例えば、標的誘導
ヌクレオチドの形態である。そのような標識は当該分野
において公知であり、直接または間接的に検出可能な標
識を含む。直接的に検出可能な標識はさらなる化学反応
なしにシグナルを生じるものであり、蛍光染料、ラジオ
アイソトープおよび染料のような標識を含む。間接的に
検出可能な標識はさらなる化学反応および検出可能なシ
グナルを生じさせる試薬の添加を必要とする。これら
は、例えば、ホースラディッシュパーオキシダーゼおよ
びアルカリホスファターゼのような酵素、標識結合アビ
ジンへの結合により検出されるビオチンのようなリガン
ド、および化学発光分子を含む。プローブは、溶液中、
ゲル上、または固形支持体上の各々の増幅産物にハイブ
リダイズする。ハイブリダイゼーションに続き、関連す
る標識からのシグナルが発せられ、検出され、そして選
択された標識およびハイブリダイゼーションプロトコル
に適した方法を用いて別々に定量される。各増幅産物に
関して検出されたシグナルの量は存在する量を反映す
る。
【００３１】標的および対照増幅産物を検出するための
ひとつの好ましい態様は、標的または対照の配列に特異
的にハイブリダイズするプライマーのポリメラーゼ伸長
合成反応による。プライマーを上記のとおりに、好まし
くはラジオアイソトープにより標識し、プライマーの標
識を伸長合成産物に取り込む。この方法は、Ｗａｌｋｅ
ｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ，およびＰＮＡＳ（前記）に、より詳細に記載され
ている。増幅された標的および対照配列を検出するため
の第２の好ましい方法は、実施例３に示すとおりに、ビ
オチン化取得用オリゴデオキシヌクレオチドプローブお
よび酵素に結合された検出用オリゴデオキシヌクレオチ
ドプローブを用いて増幅産物を検出する化学発光法であ
る。これら２つのプローブを増幅された標的配列の異な
る部位にハイブリダイゼーションさせた後、複合体をス
トレプトアビジンでコートされたマイクロタイタープレ
ート上で取得し、化学発光シグナルを生じさせてルミノ
メーターで読む。この検出法は２時間以内で実施でき、
増幅前の標的配列がわずかひとつであっても十分に検出
できる感度を有する。
ひとつの好ましい態様は、標的または対照の配列に特異
的にハイブリダイズするプライマーのポリメラーゼ伸長
合成反応による。プライマーを上記のとおりに、好まし
くはラジオアイソトープにより標識し、プライマーの標
識を伸長合成産物に取り込む。この方法は、Ｗａｌｋｅ
ｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ，およびＰＮＡＳ（前記）に、より詳細に記載され
ている。増幅された標的および対照配列を検出するため
の第２の好ましい方法は、実施例３に示すとおりに、ビ
オチン化取得用オリゴデオキシヌクレオチドプローブお
よび酵素に結合された検出用オリゴデオキシヌクレオチ
ドプローブを用いて増幅産物を検出する化学発光法であ
る。これら２つのプローブを増幅された標的配列の異な
る部位にハイブリダイゼーションさせた後、複合体をス
トレプトアビジンでコートされたマイクロタイタープレ
ート上で取得し、化学発光シグナルを生じさせてルミノ
メーターで読む。この検出法は２時間以内で実施でき、
増幅前の標的配列がわずかひとつであっても十分に検出
できる感度を有する。
【００３２】本発明のプライマーを用いるＳＤＡ反応は
Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．（前記）に教示されたとお
り、チミンを取り込むか、または、米国特許出願番号第
０８／０６０，８４２号に教示されたとおり、次のＳＤ
Ａ反応の複合汚染を低下させるための手段として、反応
物中の一部または全部のＴＴＰに代えて２’−デオキシ
ウリジン５’−３リン酸を含む（実施例を参照）。ｄＵ
は標的および対照配列の両方の増幅産物に取り込まれ、
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を用いた処理
により切り出される。これらの歩行不能の（ａｂａｓｉ
ｃ）部位は、次のＳＤＡにおける増幅産物の増幅を不可
能にする。最初に合成された内部対照配列も、チミンの
位置に置き換わってｄＵを取り込むことにより、次のＳ
ＤＡにおける増幅を阻害する。例えば、配列番号１２は
チミンを含むが、チミンのすべてまたは一部がｄＵに置
き換わっている対応配列も含む。ＵＤＧは、次の増幅前
にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（Ｕｇｉ）によ
り不活性化され、新たに形成される増幅産物の切り出し
を阻害する。
Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．（前記）に教示されたとお
り、チミンを取り込むか、または、米国特許出願番号第
０８／０６０，８４２号に教示されたとおり、次のＳＤ
Ａ反応の複合汚染を低下させるための手段として、反応
物中の一部または全部のＴＴＰに代えて２’−デオキシ
ウリジン５’−３リン酸を含む（実施例を参照）。ｄＵ
は標的および対照配列の両方の増幅産物に取り込まれ、
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を用いた処理
により切り出される。これらの歩行不能の（ａｂａｓｉ
ｃ）部位は、次のＳＤＡにおける増幅産物の増幅を不可
能にする。最初に合成された内部対照配列も、チミンの
位置に置き換わってｄＵを取り込むことにより、次のＳ
ＤＡにおける増幅を阻害する。例えば、配列番号１２は
チミンを含むが、チミンのすべてまたは一部がｄＵに置
き換わっている対応配列も含む。ＵＤＧは、次の増幅前
にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（Ｕｇｉ）によ
り不活性化され、新たに形成される増幅産物の切り出し
を阻害する。
【００３３】本明細書に開示され、以下の実施例におい
て例示される特定のプライマーおよびプローブは、本出
願の親出願において以前に開示されたプライマーおよび
プローブと同一の配列であり、以下に対応する配列番号
を記載する。
て例示される特定のプライマーおよびプローブは、本出
願の親出願において以前に開示されたプライマーおよび
プローブと同一の配列であり、以下に対応する配列番号
を記載する。
【００３４】
【表１】 本出願の 親出願の配列番号 機能 配列番号 米国特許出願 米国特許出願 第08/073,197号 第08/058,648号 １ ２ なし IS6110の増幅プライマー ２ １０ なし IS6110アダプタープライマー ３ ５ なし IS6110バンパープライマー ４ ６ なし IS6110バンパープライマー ５ ３ なし 16S増幅プライマー ６ ９ なし 16Sアダプタープライマー ７ ７ なし 16Sバンパープライマー ８ ８ なし 16Sバンパープライマー ９ なし なし M.tb検出用（プライマー伸長） １０ なし なし 16S検出用（プライマー伸長） １１ なし なし 16S検出用（プライマー伸長） １２ なし なし 内部対照配列 １３ なし ６ IS6110取得用 １４ なし ７ IS6110検出用(ハイブリダイズ) １５ なし ４ 内部対照取得用 １６ なし ５ 内部対照検出用 （ハイブリダイズ） １７ なし なし 16S取得用 １８ なし なし 16S検出用 （ハイブリダイゼーション） １９ なし なし 16S検出用−ｆｃ （ハイブリダイゼーション） 本発明のアッセイ方法を実施するためのプライマーおよ
び／またはプローブは、ミコバクテリアＤＮＡの属特異
的および種特異的同時増幅のための診断キットを形成す
るようにパッケージされる。このキットは、ミコバクテ
リアＤＮＡの属特異的および種特異的増幅のための増幅
プライマー、アダプタープライマーおよびバンパープラ
イマー、並びにＳＤＡ反応を実施するために必要な試薬
（例えば、デオキシヌクレオシド３リン酸、ニッキング
制限酵素、緩衝液、ｅｘｏ-ポリメラーゼ等）を含む。
このキットは、ミコバクテリア標的配列を共増幅するた
めの増幅産物および／または内部対照配列の検出および
同定に必要なプローブまたはプライマーを任意に含んで
よい。
び／またはプローブは、ミコバクテリアＤＮＡの属特異
的および種特異的同時増幅のための診断キットを形成す
るようにパッケージされる。このキットは、ミコバクテ
リアＤＮＡの属特異的および種特異的増幅のための増幅
プライマー、アダプタープライマーおよびバンパープラ
イマー、並びにＳＤＡ反応を実施するために必要な試薬
（例えば、デオキシヌクレオシド３リン酸、ニッキング
制限酵素、緩衝液、ｅｘｏ-ポリメラーゼ等）を含む。
このキットは、ミコバクテリア標的配列を共増幅するた
めの増幅産物および／または内部対照配列の検出および
同定に必要なプローブまたはプライマーを任意に含んで
よい。
【００３５】
実施例１ この実施例は、図１に示された増幅法を用いた、属特異
的および種特異的共増幅（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ）を示す。第１標的は、ミコバクテリウムツベル
クロシスのＩＳ６１１０インサーションエレメント（標
的Ａ）であった。第２標的は、ミコバクテリウムツベル
クロシスの１６Ｓリボソーマル遺伝子（標的Ｂ）であっ
た。増幅反応は、以下の各々の種に関して実施された：
ミコバクテリウムツベルクロシスＨ３７Ｒｖ（ＡＴＣＣ
２７２９４）、ミコバクテリウムボビス（ＣＤＣ８
１）、ミコバクテリウムボビスＢＣＧ（ＣＤＣ３４）、
ミコバクテリウムアビウム（ＡＴＣＣ２５２９１）、ミ
コバクテリウムイントラセルラエ（ＡＴＣＣ１３９５
０）、ミコバクテリウムカンサシ（ＬＣＤＣ７１１）、
ミコバクテリウムガストリ（ＬＣＤＣ１３０１）、ミコ
バクテリウムホルツイツム（ＬＣＤＣ２８０１）、ミコ
バクテリウムパラツベクロシス（ＬＩＮＤＡ）、ミコバ
クテリウムケロネア（ＴＭＣ１５４３）、ミコバクテリ
ウムモルモエンス（ＣＤＣ９３）、ミコバクテリウムス
ズルガイ（ＴＭＣ１３２８）、ミコバクテリウムフラベ
シーンス（ＬＣＤＣ２６０１）、ミコバクテリウムゼノ
ピ（ＬＣＤＣ１９０１）、ミコバクテリウムテレ（ＴＭ
Ｃ１４５０）、ミコバクテリウムマリナム（ＬＣＤＣ８
０１）およびミコバクテリウムゴルドネ（ＴＭＣ１３１
８）。「標的不含」サンプルは、バクテリアの標的ＤＮ
Ａを含まなかった。「ＳＤＡを行わない」サンプルと
は、増幅酵素を添加しなかった対照反応を示す。
的および種特異的共増幅（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ）を示す。第１標的は、ミコバクテリウムツベル
クロシスのＩＳ６１１０インサーションエレメント（標
的Ａ）であった。第２標的は、ミコバクテリウムツベル
クロシスの１６Ｓリボソーマル遺伝子（標的Ｂ）であっ
た。増幅反応は、以下の各々の種に関して実施された：
ミコバクテリウムツベルクロシスＨ３７Ｒｖ（ＡＴＣＣ
２７２９４）、ミコバクテリウムボビス（ＣＤＣ８
１）、ミコバクテリウムボビスＢＣＧ（ＣＤＣ３４）、
ミコバクテリウムアビウム（ＡＴＣＣ２５２９１）、ミ
コバクテリウムイントラセルラエ（ＡＴＣＣ１３９５
０）、ミコバクテリウムカンサシ（ＬＣＤＣ７１１）、
ミコバクテリウムガストリ（ＬＣＤＣ１３０１）、ミコ
バクテリウムホルツイツム（ＬＣＤＣ２８０１）、ミコ
バクテリウムパラツベクロシス（ＬＩＮＤＡ）、ミコバ
クテリウムケロネア（ＴＭＣ１５４３）、ミコバクテリ
ウムモルモエンス（ＣＤＣ９３）、ミコバクテリウムス
ズルガイ（ＴＭＣ１３２８）、ミコバクテリウムフラベ
シーンス（ＬＣＤＣ２６０１）、ミコバクテリウムゼノ
ピ（ＬＣＤＣ１９０１）、ミコバクテリウムテレ（ＴＭ
Ｃ１４５０）、ミコバクテリウムマリナム（ＬＣＤＣ８
０１）およびミコバクテリウムゴルドネ（ＴＭＣ１３１
８）。「標的不含」サンプルは、バクテリアの標的ＤＮ
Ａを含まなかった。「ＳＤＡを行わない」サンプルと
は、増幅酵素を添加しなかった対照反応を示す。
【００３６】ＳＤＡは、前記Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．に記載されたとお
りにして、ＴＴＰに代えてｄＵＴＰを用いることにより
汚染アンプリコンを除外した。成分の最終濃度は、４５
ｍＭ ＫiＰＯ4、ｐＨ７．５、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、
０．５ｍＭ ｄＵＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２
ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰαＳ、０．１ｍ
ｇ／ｍｌ アセチル化ＢＳＡ、１２％（ｖ／ｖ）ジメチ
ルスルフォキシド、３％（ｖ／ｖ）グリセロール（ｅｘ
ｏ-クレノーおよびＨｉｎｃＩＩの保存溶液により供
給）、５０ｎｇ ヒト胎盤ＤＮＡ、２．５ユニットｅｘ
ｏ-クレノー（Ｕｎｉｔｅｄ ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、１５０ユ
ニット ＨｉｎｃＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）および１０００ゲ
ノム（分子）の試験されたミコバクテリア種であった。
各サンプルは、２セットの４プライマー：セット＃１）
５００ｎＭの配列番号１（図１のＳtb）、５０ｎＭの配
列番号２（Ａtb）、それぞれ２５ｎＭの配列番号３（Ｂ
tb1）および配列番号４（Ｂtb2）；セット＃２）５００
ｎＭの配列番号５（図１のＳg）、５０ｎＭの配列番号
６（Ａg）、それぞれ２５ｎＭの配列番号７（Ｂg1）お
よび配列番号８（Ｂg2）を含んだ。
ｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．に記載されたとお
りにして、ＴＴＰに代えてｄＵＴＰを用いることにより
汚染アンプリコンを除外した。成分の最終濃度は、４５
ｍＭ ＫiＰＯ4、ｐＨ７．５、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、
０．５ｍＭ ｄＵＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２
ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰαＳ、０．１ｍ
ｇ／ｍｌ アセチル化ＢＳＡ、１２％（ｖ／ｖ）ジメチ
ルスルフォキシド、３％（ｖ／ｖ）グリセロール（ｅｘ
ｏ-クレノーおよびＨｉｎｃＩＩの保存溶液により供
給）、５０ｎｇ ヒト胎盤ＤＮＡ、２．５ユニットｅｘ
ｏ-クレノー（Ｕｎｉｔｅｄ ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、１５０ユ
ニット ＨｉｎｃＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）および１０００ゲ
ノム（分子）の試験されたミコバクテリア種であった。
各サンプルは、２セットの４プライマー：セット＃１）
５００ｎＭの配列番号１（図１のＳtb）、５０ｎＭの配
列番号２（Ａtb）、それぞれ２５ｎＭの配列番号３（Ｂ
tb1）および配列番号４（Ｂtb2）；セット＃２）５００
ｎＭの配列番号５（図１のＳg）、５０ｎＭの配列番号
６（Ａg）、それぞれ２５ｎＭの配列番号７（Ｂg1）お
よび配列番号８（Ｂg2）を含んだ。
【００３７】セット＃１のプライマーは、ＩＳ６１１０
エレメントの種特異的検出用である。ＩＳ６１１０増幅
プライマー（Ｓtb）は、ＩＳ６１１０配列のヌクレオチ
ド番号９７２−９８４に相補的である。この実施例にお
けるバンパープライマーは、それぞれ、ＩＳ６１１０配
列のヌクレオチド番号９５４−９６６および１０３２−
１０４４に相補的であるが、しかし、ハイブリダイズお
よび伸長合成によりセット＃１の増幅プライマーの伸長
合成産物を置換することができる他のバンパープライマ
ーを、ＩＳ６１１０配列の知見に基づいて選択してよ
い。セット＃２のプライマーは、臨床的に関連のあるミ
コバクテリアの属特異的検出用である。
エレメントの種特異的検出用である。ＩＳ６１１０増幅
プライマー（Ｓtb）は、ＩＳ６１１０配列のヌクレオチ
ド番号９７２−９８４に相補的である。この実施例にお
けるバンパープライマーは、それぞれ、ＩＳ６１１０配
列のヌクレオチド番号９５４−９６６および１０３２−
１０４４に相補的であるが、しかし、ハイブリダイズお
よび伸長合成によりセット＃１の増幅プライマーの伸長
合成産物を置換することができる他のバンパープライマ
ーを、ＩＳ６１１０配列の知見に基づいて選択してよ
い。セット＃２のプライマーは、臨床的に関連のあるミ
コバクテリアの属特異的検出用である。
【００３８】各試薬の１０×保存溶液を用いて、ｅｘｏ
-クレノーおよびＨｉｎｃＩＩ以外のすべての試薬を含
むように、各４７μｌのサンプルを用意した。ＭｇＣｌ
2は、すべての他の試薬（ｅｘｏ-クレノーおよびＨｉｎ
ｃＩＩ以外）を添加および混合した後に加えることによ
り、ＫiＰＯ4、ジメチルスルフォキシドおよびＭｇＣｌ
2がそれぞれ４５ｍＭ、１２％（ｖ／ｖ）および６ｍＭ
以上で混合された場合に生ずる沈殿の生成を回避した。
次に、サンプルを沸騰温浴槽中で２分間加熱してミコバ
クテリアＤＮＡを変成させた。沸騰温浴槽から取り出し
た直後に、沈殿物が観察された。４０℃において２分間
インキュベート後、渦巻き撹拌することにより高温沈殿
物の大部分を溶解した。ｅｘｏ-クレノー（２．５ユニ
ット／μｌ保存溶液を１μｌ）およびＨｉｎｃＩＩ（７
５ユニット／μｌ保存溶液を２μｌ）を全サンプル体積
が５０μｌになるように添加し、そしてサンプルを４０
℃において２時間インキュベートした。
-クレノーおよびＨｉｎｃＩＩ以外のすべての試薬を含
むように、各４７μｌのサンプルを用意した。ＭｇＣｌ
2は、すべての他の試薬（ｅｘｏ-クレノーおよびＨｉｎ
ｃＩＩ以外）を添加および混合した後に加えることによ
り、ＫiＰＯ4、ジメチルスルフォキシドおよびＭｇＣｌ
2がそれぞれ４５ｍＭ、１２％（ｖ／ｖ）および６ｍＭ
以上で混合された場合に生ずる沈殿の生成を回避した。
次に、サンプルを沸騰温浴槽中で２分間加熱してミコバ
クテリアＤＮＡを変成させた。沸騰温浴槽から取り出し
た直後に、沈殿物が観察された。４０℃において２分間
インキュベート後、渦巻き撹拌することにより高温沈殿
物の大部分を溶解した。ｅｘｏ-クレノー（２．５ユニ
ット／μｌ保存溶液を１μｌ）およびＨｉｎｃＩＩ（７
５ユニット／μｌ保存溶液を２μｌ）を全サンプル体積
が５０μｌになるように添加し、そしてサンプルを４０
℃において２時間インキュベートした。
【００３９】増幅産物は、前記のＷａｌｋｅｒ，ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．に記載されたプ
ライマー伸長合成においてｄＵＴＰを用いることにより
検出した。各サンプルの５μｌアリコートは、５μｌの
４５ｍＭ ＫiＰＯ4、ｐＨ７．５、６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、０．５ｍＭ ｄＵＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰαＳ、
０．１ｍｇ／ｍｌ アセチル化ＢＳＡおよび２μｌの
５’−32Ｐ検出用プローブ保存溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、それぞれ
１μＭの３種の５’−32Ｐ検出用プローブ）と混合し
た。ＩＳ６１１０標的の検出用プローブは、配列番号９
（Ｍ．ｔｂ群に関して種特異的）であった。１６Ｓ標的
の検出用プローブは配列番号１０および配列番号１１で
あった。配列番号１１は、ミコバクテリウムホルツイツ
ム、ミコバクテリウムケロネア、ミコバクテリウムテ
レ、ミコバクテリウムマリナムおよびミコバクテリウム
フラベシーンス（ｆｃ検出用）の１６Ｓ配列に相当す
る。配列番号１０は、試験された残りの非Ｍ．ｔｂ群種
に相当する。次に、１２μｌサンプルを沸騰温浴槽中で
１分間加熱した。３７℃において２分間インキュベート
後、１ユニット／μｌのｅｘｏ-クレノーを２μｌ添加
して、サンプルを３７℃において１５分間インキュベー
トし、０．５×ＴＢＥ中の５０％尿素を１４μｌ添加し
た。
ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．に記載されたプ
ライマー伸長合成においてｄＵＴＰを用いることにより
検出した。各サンプルの５μｌアリコートは、５μｌの
４５ｍＭ ＫiＰＯ4、ｐＨ７．５、６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、０．５ｍＭ ｄＵＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰαＳ、
０．１ｍｇ／ｍｌ アセチル化ＢＳＡおよび２μｌの
５’−32Ｐ検出用プローブ保存溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、それぞれ
１μＭの３種の５’−32Ｐ検出用プローブ）と混合し
た。ＩＳ６１１０標的の検出用プローブは、配列番号９
（Ｍ．ｔｂ群に関して種特異的）であった。１６Ｓ標的
の検出用プローブは配列番号１０および配列番号１１で
あった。配列番号１１は、ミコバクテリウムホルツイツ
ム、ミコバクテリウムケロネア、ミコバクテリウムテ
レ、ミコバクテリウムマリナムおよびミコバクテリウム
フラベシーンス（ｆｃ検出用）の１６Ｓ配列に相当す
る。配列番号１０は、試験された残りの非Ｍ．ｔｂ群種
に相当する。次に、１２μｌサンプルを沸騰温浴槽中で
１分間加熱した。３７℃において２分間インキュベート
後、１ユニット／μｌのｅｘｏ-クレノーを２μｌ添加
して、サンプルを３７℃において１５分間インキュベー
トし、０．５×ＴＢＥ中の５０％尿素を１４μｌ添加し
た。
【００４０】サンプルは９５℃において１分間加熱し、
８％変成ゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーを
用いて分析した（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，１
９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。結果を図３
に示す。増幅されたＩＳ６１１０（Ｍ．ｔｂ標的）は、
配列番号９の検出用プローブの４１マーおよび６３マー
への伸長合成により示される。増幅された１６Ｓ（Ｍ．
ｔｂ標的）は、配列番号１０および配列番号１１の、そ
れぞれ３０マーおよび５１マーへの伸長合成により示さ
れる。
８％変成ゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーを
用いて分析した（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，１
９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。結果を図３
に示す。増幅されたＩＳ６１１０（Ｍ．ｔｂ標的）は、
配列番号９の検出用プローブの４１マーおよび６３マー
への伸長合成により示される。増幅された１６Ｓ（Ｍ．
ｔｂ標的）は、配列番号１０および配列番号１１の、そ
れぞれ３０マーおよび５１マーへの伸長合成により示さ
れる。
【００４１】図３に示すとおり、陽性のＩＳ６１１０お
よび１６Ｓのシグナルが、ミコバクテリウムツベルクロ
シス、ミコバクテリウムボビス、ミコバクテリウムボビ
ス−ＢＣＧに関して得られたが、これらすべてはミコバ
クテリウムツベルクロシス群のメンバーである。ミコバ
クテリウムツベルクロシスに関しては、ＩＳ６１１０の
シグナルが１６Ｓのシグナルより強かったが、それは、
この生物が１６Ｓリボソーマル遺伝子の１コピーに比較
して約１０コピーのＩＳ６１１０エレメントを含むこと
による。ＩＳ６１１０および１６Ｓの両方のシグナルが
ほぼ等しかったのは、ミコバクテリウムボビスおよびミ
コバクテリウムボビス−ＢＣＧであったが、それは、１
６Ｓリボソーマル遺伝子の１コピーに比較して１から２
コピーのＩＳ６１１０エレメントを含むことによる。Ｉ
Ｓ６１１０シグナルは、Ｍ．ｔｂ群ではないメンバー
の、試験されたあらゆるミコバクテリア種に関して観察
されなかった。
よび１６Ｓのシグナルが、ミコバクテリウムツベルクロ
シス、ミコバクテリウムボビス、ミコバクテリウムボビ
ス−ＢＣＧに関して得られたが、これらすべてはミコバ
クテリウムツベルクロシス群のメンバーである。ミコバ
クテリウムツベルクロシスに関しては、ＩＳ６１１０の
シグナルが１６Ｓのシグナルより強かったが、それは、
この生物が１６Ｓリボソーマル遺伝子の１コピーに比較
して約１０コピーのＩＳ６１１０エレメントを含むこと
による。ＩＳ６１１０および１６Ｓの両方のシグナルが
ほぼ等しかったのは、ミコバクテリウムボビスおよびミ
コバクテリウムボビス−ＢＣＧであったが、それは、１
６Ｓリボソーマル遺伝子の１コピーに比較して１から２
コピーのＩＳ６１１０エレメントを含むことによる。Ｉ
Ｓ６１１０シグナルは、Ｍ．ｔｂ群ではないメンバー
の、試験されたあらゆるミコバクテリア種に関して観察
されなかった。
【００４２】１６Ｓシグナルのみは、ミコバクテリウム
アビウム、ミコバクテリウムイントラセルラエ、ミコバ
クテリウムカンサシ、ミコバクテリウムガストリ、ミコ
バクテリウムパラツベルクロシス、ミコバクテリウムモ
ルモエンス、ミコバクテリウムスズルガイおよびミコバ
クテリウムゴルドネアに関して検出されたが、これらは
ミコバクテリウムツベルクロシスと同一の配列の１６Ｓ
標的を有する。ミコバクテリウムゴルドネアは通常病原
性ではないが、臨床実験室における共通の汚染物であ
る。したがって、ミコバクテリウムゴルドネア等の微量
サンプルの汚染は、培養を基にした試験のように、この
試験におけるミコバクテリア属に関する偽陽性の結果を
生じるはずである。比較的弱い１６Ｓシグナルは、ミコ
バクテリウムホルツイツム、ミコバクテリウムケロネ
ア、ミコバクテリウムマリナムおよびミコバクテリウム
テレに関して観察された。この結果は、配列番号６のア
ダプターがこれらの種において形成するＴ−Ｇミスマッ
チに関連しているものと考えることができる（図２参
照）。しかしながら、完全にマッチする属特異的アダプ
タープライマーを用いて実施された同じ実験でも比較的
に弱いシグナルを生じたことから、これらの種の１６Ｓ
遺伝子が増幅を停止させるような２次構造を含む可能性
が考えられる。ミコバクテリウムフラベシーンスから得
られたシグナルは、配列番号６のアダプターの３’末端
に付加的なＡ−Ｃミスマッチを有するにもかかわらず、
ミコバクテリウムホルツイツムのシグナルと同じくらい
強かった。ミコバクテリウムゼノピにおいては１６Ｓシ
グナルは得られなかったが、それは、検出用プローブと
の適合性が弱いことによるらしい。これらの結果に基づ
いて、陽性１６Ｓシグナルは、試験されたもの以外のミ
コバクテリウム種（例えば、ミコバクテリアスクロフラ
セウム、ミコバクテリウムレプレ、ミコバクテリウムウ
ルセランス、ミコバクテリウムヘモフィラムおよびミコ
バクテリウムアシアティカム）に関しても期待され、こ
れらの種の１６Ｓ配列もＭ．ｔｂの配列と適合するはず
である。
アビウム、ミコバクテリウムイントラセルラエ、ミコバ
クテリウムカンサシ、ミコバクテリウムガストリ、ミコ
バクテリウムパラツベルクロシス、ミコバクテリウムモ
ルモエンス、ミコバクテリウムスズルガイおよびミコバ
クテリウムゴルドネアに関して検出されたが、これらは
ミコバクテリウムツベルクロシスと同一の配列の１６Ｓ
標的を有する。ミコバクテリウムゴルドネアは通常病原
性ではないが、臨床実験室における共通の汚染物であ
る。したがって、ミコバクテリウムゴルドネア等の微量
サンプルの汚染は、培養を基にした試験のように、この
試験におけるミコバクテリア属に関する偽陽性の結果を
生じるはずである。比較的弱い１６Ｓシグナルは、ミコ
バクテリウムホルツイツム、ミコバクテリウムケロネ
ア、ミコバクテリウムマリナムおよびミコバクテリウム
テレに関して観察された。この結果は、配列番号６のア
ダプターがこれらの種において形成するＴ−Ｇミスマッ
チに関連しているものと考えることができる（図２参
照）。しかしながら、完全にマッチする属特異的アダプ
タープライマーを用いて実施された同じ実験でも比較的
に弱いシグナルを生じたことから、これらの種の１６Ｓ
遺伝子が増幅を停止させるような２次構造を含む可能性
が考えられる。ミコバクテリウムフラベシーンスから得
られたシグナルは、配列番号６のアダプターの３’末端
に付加的なＡ−Ｃミスマッチを有するにもかかわらず、
ミコバクテリウムホルツイツムのシグナルと同じくらい
強かった。ミコバクテリウムゼノピにおいては１６Ｓシ
グナルは得られなかったが、それは、検出用プローブと
の適合性が弱いことによるらしい。これらの結果に基づ
いて、陽性１６Ｓシグナルは、試験されたもの以外のミ
コバクテリウム種（例えば、ミコバクテリアスクロフラ
セウム、ミコバクテリウムレプレ、ミコバクテリウムウ
ルセランス、ミコバクテリウムヘモフィラムおよびミコ
バクテリウムアシアティカム）に関しても期待され、こ
れらの種の１６Ｓ配列もＭ．ｔｂの配列と適合するはず
である。
【００４３】実施例２ この実施例は、本発明の共増幅法が非ミコバクテリアに
関して交差反応性を欠くことを示す。増幅および分析は
実施例１のとおりに実施したが、標的ＤＮＡは、ミコバ
クテリウムツベルクロシスＨ３７Ｒｖ（ＡＴＣＣ２７２
９４）または以下の何れかの非ミコバクテリア種から単
離された：コリネバクテリアジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉａ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）（ＡＴＣ
Ｃ１１９１３）、コリネバクテリアゼロシス（Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉａ ｘｅｒｏｓｉｓ）（ＡＴＣＣ３
７３）、コリネバクテリアシュードジフテリティカム
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐ
ｈｔｈｅｒｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ１０７００）、ノカル
ディアアステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ）（ＡＴＣＣ３３０８）、ノカルディアブラ
ジリエンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎ
ｓｉｓ）（ＡＴＣＣ１９２９６）、ノカルディアオリエ
ンタリス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）
（ＡＴＣＣ１９７９５）、ストレプトマイセスソマリエ
ンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｏｍａｌｉｅｎ
ｓｉｓ）（ＡＴＣＣ３３２０１）、ストレプトマイセス
グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕ
ｓ）（ＡＴＣＣ１０１３７）、ストレプトマイセスアル
ブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ）（ＡＴ
ＣＣ３００４）、ストレプトマイセスゲダネンシス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｅｄａｎｅｎｓｉｓ）（ＡＴ
ＣＣ４８８０）、アクチノマイセスイスラエリ（Ａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）（ＡＴＣＣ１０
０４９）、ユーバクテリウムレンタム（Ｅｕｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｌｅｎｔｕｍ）（ＡＴＣＣ４３０５５）、ロ
ドコッカスエクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕ
ｉ）（ＡＴＣＣ６９３９）、ロドコッカスロドコラス
（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）
（ＡＴＣＣ１３８０８）、プロピオニバクテリウムアク
ネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅ
ｓ）（ＡＴＣＣ６９１９）、アクチノプレーンズオウラ
ンチカラー（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ａｕｒａｎｔ
ｉｃｏｌｏｒ）（ＡＴＣＣ１５３３０）、ストレプトス
ポランギウムビリアルブム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａ
ｎｇｉｕｍ ｖｉｒｉａｌｂｕｍ）（ＡＴＣＣ３３３２
８）、およびストレプトベルティシリウムアルボベルテ
ィシラタム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ
ａｌｂｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｍ）（ＡＴＣＣ２９
８１８）。同じ属の異なる種を、同じ属名として表示し
て一つのＳＤＡサンプルに一緒にプールした。各ＳＤＡ
反応に存在するミコバクテリアツベルクロシスゲノムの
数は、図４に示す。非ミコバクテリアサンプルは、各々
示された種において１０5ゲノムコピーを含んだ。ＩＳ
６１１０標的（ミコバクテリウムツベルクロシス群）お
よび１６Ｓ標的（ミコバクテリア属）に関する増幅産物
に対応する32Ｐバンドは、図４に示す。
関して交差反応性を欠くことを示す。増幅および分析は
実施例１のとおりに実施したが、標的ＤＮＡは、ミコバ
クテリウムツベルクロシスＨ３７Ｒｖ（ＡＴＣＣ２７２
９４）または以下の何れかの非ミコバクテリア種から単
離された：コリネバクテリアジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉａ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）（ＡＴＣ
Ｃ１１９１３）、コリネバクテリアゼロシス（Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉａ ｘｅｒｏｓｉｓ）（ＡＴＣＣ３
７３）、コリネバクテリアシュードジフテリティカム
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐ
ｈｔｈｅｒｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ１０７００）、ノカル
ディアアステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ）（ＡＴＣＣ３３０８）、ノカルディアブラ
ジリエンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎ
ｓｉｓ）（ＡＴＣＣ１９２９６）、ノカルディアオリエ
ンタリス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）
（ＡＴＣＣ１９７９５）、ストレプトマイセスソマリエ
ンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｏｍａｌｉｅｎ
ｓｉｓ）（ＡＴＣＣ３３２０１）、ストレプトマイセス
グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕ
ｓ）（ＡＴＣＣ１０１３７）、ストレプトマイセスアル
ブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ）（ＡＴ
ＣＣ３００４）、ストレプトマイセスゲダネンシス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｅｄａｎｅｎｓｉｓ）（ＡＴ
ＣＣ４８８０）、アクチノマイセスイスラエリ（Ａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）（ＡＴＣＣ１０
０４９）、ユーバクテリウムレンタム（Ｅｕｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｌｅｎｔｕｍ）（ＡＴＣＣ４３０５５）、ロ
ドコッカスエクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕ
ｉ）（ＡＴＣＣ６９３９）、ロドコッカスロドコラス
（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）
（ＡＴＣＣ１３８０８）、プロピオニバクテリウムアク
ネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅ
ｓ）（ＡＴＣＣ６９１９）、アクチノプレーンズオウラ
ンチカラー（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ａｕｒａｎｔ
ｉｃｏｌｏｒ）（ＡＴＣＣ１５３３０）、ストレプトス
ポランギウムビリアルブム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａ
ｎｇｉｕｍ ｖｉｒｉａｌｂｕｍ）（ＡＴＣＣ３３３２
８）、およびストレプトベルティシリウムアルボベルテ
ィシラタム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ
ａｌｂｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｍ）（ＡＴＣＣ２９
８１８）。同じ属の異なる種を、同じ属名として表示し
て一つのＳＤＡサンプルに一緒にプールした。各ＳＤＡ
反応に存在するミコバクテリアツベルクロシスゲノムの
数は、図４に示す。非ミコバクテリアサンプルは、各々
示された種において１０5ゲノムコピーを含んだ。ＩＳ
６１１０標的（ミコバクテリウムツベルクロシス群）お
よび１６Ｓ標的（ミコバクテリア属）に関する増幅産物
に対応する32Ｐバンドは、図４に示す。
【００４４】試験されたすべての非ミコバクテリア生物
（１０5ゲノム）は、ミコバクテリア生物と同じ条件で
試験されても、ミコバクテリウムツベルクロシスのたっ
た１０ゲノムに相当するよりも弱いシグナルしか生じな
かった。
（１０5ゲノム）は、ミコバクテリア生物と同じ条件で
試験されても、ミコバクテリウムツベルクロシスのたっ
た１０ゲノムに相当するよりも弱いシグナルしか生じな
かった。
【００４５】実施例３ この実施例は、内部対照配列がＩＳ６１１０／１６Ｓ増
幅プライマー対を用いて、ＩＳ６１１０および１６Ｓと
共に増幅される（３者増幅）態様を示す。増幅は、検出
法の感度を調べるためにさまざまな程度に希釈された
Ｍ．ｔｂのＤＮＡを用いて、実施例１のとおりに実施し
た。増幅産物は、固相化学発光アッセイにより検出され
たが、該アッセイにおいて、増幅された標的および対照
配列は固定化取得用プローブにハイブリダイズさせるこ
とによりマイクロウエルプレート上で取得された。ハイ
ブリダイゼーションは、取得された標的または対照配列
を、アルカリホスファターゼで標識された検出用プロー
ブにサンドイッチハイブリダイゼーションさせることに
より検出した。取得されたプローブは、５’または３’
末端の何れかにビオチンで標識し、マイクロウエルプレ
ート上のストレプトアビジンへの結合により固定化され
た。検出用プローブは、５’または３’末端の何れかに
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）で標識し、ＬＵＭＩＰ
ＨＯＳ５３０（ｌｕｍｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｔｒｏ
ｉｔ，ＭＩ）による酵素反応により検出した。
幅プライマー対を用いて、ＩＳ６１１０および１６Ｓと
共に増幅される（３者増幅）態様を示す。増幅は、検出
法の感度を調べるためにさまざまな程度に希釈された
Ｍ．ｔｂのＤＮＡを用いて、実施例１のとおりに実施し
た。増幅産物は、固相化学発光アッセイにより検出され
たが、該アッセイにおいて、増幅された標的および対照
配列は固定化取得用プローブにハイブリダイズさせるこ
とによりマイクロウエルプレート上で取得された。ハイ
ブリダイゼーションは、取得された標的または対照配列
を、アルカリホスファターゼで標識された検出用プロー
ブにサンドイッチハイブリダイゼーションさせることに
より検出した。取得されたプローブは、５’または３’
末端の何れかにビオチンで標識し、マイクロウエルプレ
ート上のストレプトアビジンへの結合により固定化され
た。検出用プローブは、５’または３’末端の何れかに
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）で標識し、ＬＵＭＩＰ
ＨＯＳ５３０（ｌｕｍｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｔｒｏ
ｉｔ，ＭＩ）による酵素反応により検出した。
【００４６】５’ビオチン化されたオリゴデオキシヌク
レオチド取得プローブ（ＩＳ６１１０標的配列に関する
配列番号１３および内部対照配列に関する配列番号１
５）は、米国特許出願番号０８／０５８，６４８号の実
施例２の記載のとおりに合成した。ＡＰで３’標識され
たオリゴデオキシヌクレオチド検出プローブ（ＩＳ６１
１０に関する配列番号１４および内部対照に関する配列
番号１６）も、米国特許出願番号０８／０５８，６４８
号の記載のとおりに合成および検出した。
レオチド取得プローブ（ＩＳ６１１０標的配列に関する
配列番号１３および内部対照配列に関する配列番号１
５）は、米国特許出願番号０８／０５８，６４８号の実
施例２の記載のとおりに合成した。ＡＰで３’標識され
たオリゴデオキシヌクレオチド検出プローブ（ＩＳ６１
１０に関する配列番号１４および内部対照に関する配列
番号１６）も、米国特許出願番号０８／０５８，６４８
号の記載のとおりに合成および検出した。
【００４７】３’ビオチン化取得用オリゴデオキシヌク
レオチドの調製 ３’ビオチン化されたオリゴデオキシヌクレオチド取得
用プローブは、以下のとおりに合成した。配列番号１７
（１６Ｓ標的配列に関する取得用プローブ）は、ＤＮＡ
合成機（モデル３８０Ｂ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて
合成した。３’ＢＩＯＴＩＮ−ＯＮ ＣＰＧ（孔制御ガ
ラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓ
ｓ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）
を用いて、オリゴデオキシヌクレオチドの３’末端にビ
オチンモイエティを結合した。２つの付加されたビオチ
ンは、次に、ＢＩＯＴＩＮ−ＯＮホスホルアミダイト試
薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて３’末端に付加され
た。次に、オリゴデオキシヌクレオチドを標準ホスホル
アミダイト試薬により調製し、固相から分離して粗３’
ビオチン化オリゴデオキシヌクレオチドを得た。精製
は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Ｂ
ｒｏｗｎｌｅｅ Ｌａｂ Ａｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ ３
００カラム、２２０×４．６ｍｍ、Ｃ８カラム７粒子、
３００Ａポアサイズ）を用いて、２５４ｎｍにおいてＵ
Ｖを監視し、１時間以上１４から４４％のバッファーＢ
のグラジエントにより（バッファーＢ：０．１Ｍ トリ
エチルアミン−アセテート、ｐＨ７および５０％アセト
ニトリル；バッファーＡ：０．１Ｍ トリエチルアミン
−アセテート、ｐＨ７）、１ｍｌ／分の流速で実施し
た。
レオチドの調製 ３’ビオチン化されたオリゴデオキシヌクレオチド取得
用プローブは、以下のとおりに合成した。配列番号１７
（１６Ｓ標的配列に関する取得用プローブ）は、ＤＮＡ
合成機（モデル３８０Ｂ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて
合成した。３’ＢＩＯＴＩＮ−ＯＮ ＣＰＧ（孔制御ガ
ラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓ
ｓ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）
を用いて、オリゴデオキシヌクレオチドの３’末端にビ
オチンモイエティを結合した。２つの付加されたビオチ
ンは、次に、ＢＩＯＴＩＮ−ＯＮホスホルアミダイト試
薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて３’末端に付加され
た。次に、オリゴデオキシヌクレオチドを標準ホスホル
アミダイト試薬により調製し、固相から分離して粗３’
ビオチン化オリゴデオキシヌクレオチドを得た。精製
は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Ｂ
ｒｏｗｎｌｅｅ Ｌａｂ Ａｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ ３
００カラム、２２０×４．６ｍｍ、Ｃ８カラム７粒子、
３００Ａポアサイズ）を用いて、２５４ｎｍにおいてＵ
Ｖを監視し、１時間以上１４から４４％のバッファーＢ
のグラジエントにより（バッファーＢ：０．１Ｍ トリ
エチルアミン−アセテート、ｐＨ７および５０％アセト
ニトリル；バッファーＡ：０．１Ｍ トリエチルアミン
−アセテート、ｐＨ７）、１ｍｌ／分の流速で実施し
た。
【００４８】５’アルカリホスファターゼ検出用オリゴ
デオキシヌクレオチドの調製 アルカリホスファターゼで５’標識されたオリゴデオキ
シヌクレオチド検出用プローブは、ＤＮＡ合成機（モデ
ル３８０Ｂ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，
Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて調製された
５’アミノ−オリゴデオキシヌクレオチドから合成し
た。配列番号１９は、ミコバクテリウムホルツイツム、
ミコバクテリウムケロネア、ミコバクテリウムテレおよ
びミコバクテリウムフラベシーンス中の１６Ｓ標的配列
に関する検出用プローブ（「ｆｃ」検出用）である。配
列番号１８は、試験されたミコバクテリアの残りの非
Ｍ．ｔｂ種中の１６Ｓ標的配列に関する検出用プローブ
である。試薬ＡＭＩＮＯＬＩＮＫＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃ
Ａ）を用いて、上記アルカリホスファターゼとの結合の
ためのアミン基をオリゴデオキシヌクレオチドの５’末
端に付加した。粗結合体は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）に対して透析し、ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ
３０（Ａｍｉｃｏｎ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を用いて
約２ｍｌに濃縮した。次に、濃縮された結合体をＨＰＬ
Ｃにより、ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（７．５ｍｍ×７．
５ｃｍ）および０から６６％のバッファーＢ（バッファ
ーＢ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．
５；バッファーＡ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５）の
グラジエントを用いて、１ｍｌ／分の流速で精製した。
吸光は２５４ｎｍにおいて監視した。画分を集め、結合
体の活性を測定し、そして結合体を上記のとおりに保存
した。
デオキシヌクレオチドの調製 アルカリホスファターゼで５’標識されたオリゴデオキ
シヌクレオチド検出用プローブは、ＤＮＡ合成機（モデ
ル３８０Ｂ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，
Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて調製された
５’アミノ−オリゴデオキシヌクレオチドから合成し
た。配列番号１９は、ミコバクテリウムホルツイツム、
ミコバクテリウムケロネア、ミコバクテリウムテレおよ
びミコバクテリウムフラベシーンス中の１６Ｓ標的配列
に関する検出用プローブ（「ｆｃ」検出用）である。配
列番号１８は、試験されたミコバクテリアの残りの非
Ｍ．ｔｂ種中の１６Ｓ標的配列に関する検出用プローブ
である。試薬ＡＭＩＮＯＬＩＮＫＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃ
Ａ）を用いて、上記アルカリホスファターゼとの結合の
ためのアミン基をオリゴデオキシヌクレオチドの５’末
端に付加した。粗結合体は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）に対して透析し、ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ
３０（Ａｍｉｃｏｎ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を用いて
約２ｍｌに濃縮した。次に、濃縮された結合体をＨＰＬ
Ｃにより、ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（７．５ｍｍ×７．
５ｃｍ）および０から６６％のバッファーＢ（バッファ
ーＢ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．
５；バッファーＡ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５）の
グラジエントを用いて、１ｍｌ／分の流速で精製した。
吸光は２５４ｎｍにおいて監視した。画分を集め、結合
体の活性を測定し、そして結合体を上記のとおりに保存
した。
【００４９】コートされたマイクロウエルプレートの調
製 ビオチン化ウシ血清アルブミン（ビオチン＊ＢＳＡ）
（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を５０ｍＭ
カーボネート（ｐＨ９．６）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ，ＭＯ、オートクレーブされた水を用いて調製）
中で５μｇ／ｍｌに希釈し、そしてピペットにより実験
室用ストリップウエル（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ）の各
ウエル（１００μｇ／ｍｌ）に移し、そして室温で一晩
インキュベートした。プレートを２回（３７５μｌ／洗
浄）、オートクレーブされた水を用いて調製されたＦＴ
Ａ血球凝集バッファー（ｐＨ７．２）（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ，Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で２回
洗浄した。血球凝集バッファー中のストレプトアビジン
をビオチン＊ＢＳＡでコートされたウエルに加えた（１
００μｌ／ウエル）。プレートをカバーし、室温で一晩
インキュベートした。未結合のストレプトアビジンはウ
エルを倒置することにより捨て、ブロッキングバッファ
ー（３００μｌ／ウエル−血球凝集バッファー、ｐＨ
７．２、０．０５％ ｗ／ｖ ＢＳＡ）を加えた。上記
のとおりにプレートをカバーして一晩インキュベート
し、ウエルを倒置してブロッキングバッファーを捨て
た。プレートを血球凝集バッファーにて２回（３７５μ
ｌ／ウエル）、次いで、２％ ｗ／ｖのトレハロースを
含む血球凝集バッファーにて洗浄した（３７５μｌ／ウ
エル−Ｆｌｕｋａ，Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，ＮＹ）。プ
レートを３７℃において１時間乾燥し、乾燥剤と共にマ
イラーパンチでシールし、そして使用前まで室温にて一
晩おいた。その後、プレートは２−８℃に保った。
製 ビオチン化ウシ血清アルブミン（ビオチン＊ＢＳＡ）
（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を５０ｍＭ
カーボネート（ｐＨ９．６）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ，ＭＯ、オートクレーブされた水を用いて調製）
中で５μｇ／ｍｌに希釈し、そしてピペットにより実験
室用ストリップウエル（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ）の各
ウエル（１００μｇ／ｍｌ）に移し、そして室温で一晩
インキュベートした。プレートを２回（３７５μｌ／洗
浄）、オートクレーブされた水を用いて調製されたＦＴ
Ａ血球凝集バッファー（ｐＨ７．２）（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ，Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で２回
洗浄した。血球凝集バッファー中のストレプトアビジン
をビオチン＊ＢＳＡでコートされたウエルに加えた（１
００μｌ／ウエル）。プレートをカバーし、室温で一晩
インキュベートした。未結合のストレプトアビジンはウ
エルを倒置することにより捨て、ブロッキングバッファ
ー（３００μｌ／ウエル−血球凝集バッファー、ｐＨ
７．２、０．０５％ ｗ／ｖ ＢＳＡ）を加えた。上記
のとおりにプレートをカバーして一晩インキュベート
し、ウエルを倒置してブロッキングバッファーを捨て
た。プレートを血球凝集バッファーにて２回（３７５μ
ｌ／ウエル）、次いで、２％ ｗ／ｖのトレハロースを
含む血球凝集バッファーにて洗浄した（３７５μｌ／ウ
エル−Ｆｌｕｋａ，Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，ＮＹ）。プ
レートを３７℃において１時間乾燥し、乾燥剤と共にマ
イラーパンチでシールし、そして使用前まで室温にて一
晩おいた。その後、プレートは２−８℃に保った。
【００５０】マイクロウエルアッセイ法 ０，５，１０，２０，４０および８０コピーのＭ．ｔｂ
ゲノムを含むサンプルにつき、実施例１のＳＤＡを実施
した。「熱失活」サンプルも含めて、検出用プローブに
より生じるバックグラウンド発光を調べた。熱失活サン
プルは、増幅を防ぐためにＳＤＡ開始直後に加熱した。
各反応物も１０００コピーの内部対照配列（チミンがｄ
Ｕに変わっている配列番号１２）を含んだ。４５μｌの
各完全ＳＤＡ反応物を滅菌シリコン化チューブ中で１８
０μｌの滅菌水中に希釈した。希釈されたＳＤＡ反応物
を９５℃において３分間加熱してＤＮＡを変成させた。
チューブを５分間室温において冷却し、次に各変成希釈
ＳＤＡ反応物５０μｌを各３つのウエルに加えた。ひと
つのウエルにおいて、ＳＤＡ反応産物はＩＳ６１１０取
得用および検出用プローブセットにハイブリダイズさ
せ、第２のウエルにおいては、ＳＤＡ反応産物は１６Ｓ
取得用および検出用プローブセットにハイブリダイズさ
せ、そして第３のウエルにおいては、ＳＤＡ反応産物を
内部対照取得用および検出用プローブセットにハイブリ
ダイズさせた。サンプルをウエルに加えた直後に、５０
μｌ／ウエルのハイブリダイゼーション混合物（１００
ｍＭ リン酸ナトリウム、０．０２％ ＢＳＡ、１．８
Ｍ ＮａＣｌ，０．２％ ＮａＮ3、０．１ｍＭ Ｚｎ
Ｃｌ2、２０μｇ／ｍｌの切り刻まれたサケ精子ＤＮ
Ａ、ｐＨ７．０、取得用および検出用プローブ）を加え
た。プレートをカバーし、３７℃において４５分間イン
キュベートした。３つのストリンジェンシーな洗浄（３
００μｌ／ウエル−１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５，
０．１％ ｗ／ｖ ＢＳＡ，０．０１％ ｗ／ｖ ＮＯ
ＮＩＤＥＴ Ｐ−４０，２５０ｍＭ ＮａＣｌ）を室温
にて実施した。各洗浄液は除去前１分間ウエルに残し
た。ＬＵＭＩＰＨＯＳ ５３０ ＡＰ基質（１００μｌ
／ウエル）を加え、次いで、プレートをカバーして３７
℃において３０分間インキュベートした。発光（相対光
ユニット−ＲＬＵ）をマイクロタイタープレートルミノ
メーター（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ）で３７℃におい
て、２秒／ウエルインテグレーション時間にて読んだ。
ゲノムを含むサンプルにつき、実施例１のＳＤＡを実施
した。「熱失活」サンプルも含めて、検出用プローブに
より生じるバックグラウンド発光を調べた。熱失活サン
プルは、増幅を防ぐためにＳＤＡ開始直後に加熱した。
各反応物も１０００コピーの内部対照配列（チミンがｄ
Ｕに変わっている配列番号１２）を含んだ。４５μｌの
各完全ＳＤＡ反応物を滅菌シリコン化チューブ中で１８
０μｌの滅菌水中に希釈した。希釈されたＳＤＡ反応物
を９５℃において３分間加熱してＤＮＡを変成させた。
チューブを５分間室温において冷却し、次に各変成希釈
ＳＤＡ反応物５０μｌを各３つのウエルに加えた。ひと
つのウエルにおいて、ＳＤＡ反応産物はＩＳ６１１０取
得用および検出用プローブセットにハイブリダイズさ
せ、第２のウエルにおいては、ＳＤＡ反応産物は１６Ｓ
取得用および検出用プローブセットにハイブリダイズさ
せ、そして第３のウエルにおいては、ＳＤＡ反応産物を
内部対照取得用および検出用プローブセットにハイブリ
ダイズさせた。サンプルをウエルに加えた直後に、５０
μｌ／ウエルのハイブリダイゼーション混合物（１００
ｍＭ リン酸ナトリウム、０．０２％ ＢＳＡ、１．８
Ｍ ＮａＣｌ，０．２％ ＮａＮ3、０．１ｍＭ Ｚｎ
Ｃｌ2、２０μｇ／ｍｌの切り刻まれたサケ精子ＤＮ
Ａ、ｐＨ７．０、取得用および検出用プローブ）を加え
た。プレートをカバーし、３７℃において４５分間イン
キュベートした。３つのストリンジェンシーな洗浄（３
００μｌ／ウエル−１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５，
０．１％ ｗ／ｖ ＢＳＡ，０．０１％ ｗ／ｖ ＮＯ
ＮＩＤＥＴ Ｐ−４０，２５０ｍＭ ＮａＣｌ）を室温
にて実施した。各洗浄液は除去前１分間ウエルに残し
た。ＬＵＭＩＰＨＯＳ ５３０ ＡＰ基質（１００μｌ
／ウエル）を加え、次いで、プレートをカバーして３７
℃において３０分間インキュベートした。発光（相対光
ユニット−ＲＬＵ）をマイクロタイタープレートルミノ
メーター（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ）で３７℃におい
て、２秒／ウエルインテグレーション時間にて読んだ。
【００５１】ＲＬＵの結果は以下の表に示す。「オーバ
ー」は、器具により読み取り可能な最大値を越える読み
を示す。
ー」は、器具により読み取り可能な最大値を越える読み
を示す。
【００５２】
【表２】 ゲノム 種特異性（ＩＳ６１１０） 種特異性（１６Ｓ） 内部対照 ０ １１ １２ ８５１５ ５ ３００ ６８ オーバー １０ ９４５ １６４ ７７４４ ２０ ３１５７ ６１５ オーバー ４０ ３６１８ ６９４ １４１１８ ８０ ６８９０ １３６７ オーバー 加熱による死滅 ５ １８ ３ このアッセイは、わずか５ゲノムコピー足らずの１６Ｓ
のｒＤＮＡおよび５ゲノムコピー足らずのＩＳ６１１０
を、Ｍ．ｔｂのバックグラウンドから検出した。増幅活
性は、高いレベルの内部対照配列の増幅により証明され
るとおり各サンプルにおいて高く、即ち、サンプルは増
幅反応に対して阻害作用をもたない。
のｒＤＮＡおよび５ゲノムコピー足らずのＩＳ６１１０
を、Ｍ．ｔｂのバックグラウンドから検出した。増幅活
性は、高いレベルの内部対照配列の増幅により証明され
るとおり各サンプルにおいて高く、即ち、サンプルは増
幅反応に対して阻害作用をもたない。
【００５３】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACGGCGTA CTCGACC 37 配列番号：２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GTCGCGTTGT TCACTGAGAT CCCCT 25 配列番号：３ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TGGACCCGCC AAC 13 配列番号：４ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CGCTGAACCG GAT 13 配列番号：５ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TTCTATAGTC GGTTACTTGT TGACGTCGCG TTGTTC 36 配列番号：６ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GGCGTACTCG ACCACGCTCA CAGTTA 26 配列番号：７ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状配列 CGGAATTACT GGG
13 配列番号：８ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AGTCTGCCCG TATC 14 配列番号：９ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TCCGTATGGT GGATA 15 配列番号：１０ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GCCGTGAGAT TTCAC 15 配列番号：１１ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GCTGTGAGTT TTCAC 15 配列番号：１２ 配列の長さ：５９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GACGGCGTAC TCGACCAGCG ACGATGTCTG AGGCAACTAG CAAAGCTGAA CAACGCGAC 59 配列番号：１３ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CCTGAAAGAC GTTAT 15 配列番号：１４ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CCACCATACG GATAGT 16 配列番号：１５ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GCTTTGCTAG TTGCC 15 配列番号：１６ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TCAGACATCG TCGCT 15 配列番号：１７ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ACTGTGAGCG TGGTC 15 配列番号：１８ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AAATCTCACG GCTTA 15 配列番号：１９ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AAAACTCACA GCTTA 15
13 配列番号：８ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AGTCTGCCCG TATC 14 配列番号：９ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TCCGTATGGT GGATA 15 配列番号：１０ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GCCGTGAGAT TTCAC 15 配列番号：１１ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GCTGTGAGTT TTCAC 15 配列番号：１２ 配列の長さ：５９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GACGGCGTAC TCGACCAGCG ACGATGTCTG AGGCAACTAG CAAAGCTGAA CAACGCGAC 59 配列番号：１３ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CCTGAAAGAC GTTAT 15 配列番号：１４ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CCACCATACG GATAGT 16 配列番号：１５ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GCTTTGCTAG TTGCC 15 配列番号：１６ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TCAGACATCG TCGCT 15 配列番号：１７ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ACTGTGAGCG TGGTC 15 配列番号：１８ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AAATCTCACG GCTTA 15 配列番号：１９ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AAAACTCACA GCTTA 15
【図１】図１は、実施例１、２および３における２つの
標的配列の共増幅に用いられる本発明の方法を示す。
標的配列の共増幅に用いられる本発明の方法を示す。
【図２】図２は、さまざまなミコバクテリア種の１６Ｓ
リボソーマル遺伝子中のミコバクテリア属標的配列の並
びをプライマー結合部位と共に示す。
リボソーマル遺伝子中のミコバクテリア属標的配列の並
びをプライマー結合部位と共に示す。
【図３】図３は、実施例１の実験結果であるオートラジ
オグラフィーを示すＸ線写真である。
オグラフィーを示すＸ線写真である。
【図４】図４は、実施例２の実験結果であるオートラジ
オグラフィーを示すＸ線写真である。
オグラフィーを示すＸ線写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:33） (73)特許権者 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲ ＡＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩ ＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲ ＩＣＡ (72)発明者 ジェームズ・ジー・ナデュー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27514，チャペル・ヒル，コーカー・レ イン 710 (72)発明者 パトリシア・アン・スピアーズ アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27615，ローリー，キャロリンジィア ン・コート 8605 (72)発明者 コリーン・エム・ニーチ アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27613，ローリー，パーノッド・ウェイ 6412 (72)発明者 ダリル・ディー・シャンク アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27712，ダーラム，ドンピル・ドライブ 1108 (72)発明者 ジェームズ・エル・シュラム アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27545，ナイトデール，ドゥエリング・ プレイス 102 (72)発明者 スチュワート・ラッセル・ジャルジェン セン アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27615，ライル，バリー・ラン・ドライ ブ 7504 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/00 - 1/70 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (10)
- 【請求項１】 （ａ）配列番号１からなる第１プライマ
ーを標的配列にハイブリダイズさせ、ポリメラーゼによ
り第１プライマーを伸長合成して第１伸長合成産物を生
成し、そして第１伸長合成産物を置換し； （ｂ）配列番号２からなる第２プライマーを第１伸長合
成産物にハイブリダイズさせ、第２プライマーを伸長合
成して第２伸長合成産物を生成し、そして第２伸長合成
産物を置換し； （ｃ）配列番号５からなる第３プライマーを標的配列に
ハイブリダイズさせ、ポリメラーゼにより第３プライマ
ーを伸長合成して第３伸長合成産物を生成し、そして第
３伸長合成産物を置換し； （ｄ）配列番号６からなる第４プライマーを第３伸長合
成産物にハイブリダイズさせ、第４プライマーを伸長合
成して第４伸長合成産物を生成し、そして第４伸長合成
産物を置換し；そして （ｅ）配列番号１および配列番号５のヌクレオチドを増
幅プライマーとして用いて、鎖置換増幅反応において第
２および第４伸長合成産物を同時に増幅する工程からな
る、サンプル中の複数のミコバクテリア標的配列の同時
増幅法。 - 【請求項２】 さらに、以下の工程： （ａ）第２プライマーを標的配列の第２鎖にハイブリダ
イズさせ、ポリメラーゼにより第２プライマーを伸長合
成して第５伸長合成産物を生成し、そして第５伸長合成
産物を置換し； （ｂ）第１プライマーを第５伸長合成産物にハイブリダ
イズさせ、ポリメラーゼにより第１プライマーを伸長合
成して第６伸長合成産物を生成し、そして第６伸長合成
産物を置換し； （ｃ）第４プライマーを標的配列の第２鎖にハイブリダ
イズさせ、ポリメラーゼにより第４プライマーを伸長合
成して第７伸長合成産物を生成し、そして第７伸長合成
産物を置換し； （ｄ）第３プライマーを第７伸長合成産物にハイブリダ
イズさせ、ポリメラーゼにより第３プライマーを伸長合
成して第８伸長合成産物を生成し、そして第８伸長合成
産物を置換し；そして （ｅ）配列番号１および配列番号５のヌクレオチドを増
幅プライマーとして用いて、鎖置換増幅反応において第
６および第８伸長合成産物を同時に増幅するを含む、請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】 （ａ）配列番号１２からなる内部対照配
列をサンプルに加え； （ｂ）配列番号１からなる第１プライマーを標的配列に
ハイブリダイズさせ、ポリメラーゼにより第１プライマ
ーを伸長合成して第１伸長合成産物を生成し、そして第
１伸長合成産物を置換し； （ｃ）配列番号２からなる第２プライマーを第１伸長合
成産物にハイブリダイズさせ、第２プライマーを伸長合
成して第２伸長合成産物を生成し、そして第２伸長合成
産物を置換し； （ｄ）配列番号５からなる第３プライマーを標的配列に
ハイブリダイズさせ、ポリメラーゼにより第３プライマ
ーを伸長合成して第３伸長合成産物を生成し、そして第
３伸長合成産物を置換し； （ｅ）配列番号６からなる第４プライマーを第３伸長合
成産物にハイブリダイズさせ、ポリメラーゼにより第４
プライマーを伸長合成して第４伸長合成産物を生成し、
そして第４伸長合成産物を置換し；そして （ｆ）配列番号１および配列番号５のヌクレオチドを増
幅プライマーとして用いて、鎖置換増幅反応において第
２および第４伸長合成産物並びに内部対照配列を同時に
増幅する 工程からなる、サンプル中の複数のミコバクテリア標的
配列および内部対照配列の同時増幅法。 - 【請求項４】 さらに、以下の工程： （ａ）第２プライマーを標的配列の第２鎖にハイブリダ
イズさせ、ポリメラーゼにより第２プライマーを伸長合
成して第５伸長合成産物を生成し、そして第５伸長合成
産物を置換し； （ｂ）第１プライマーを第５伸長合成産物にハイブリダ
イズさせ、ポリメラーゼにより第１プライマーを伸長合
成して第６伸長合成産物を生成し、そして第６伸長合成
産物を置換し； （ｃ）第４プライマーを標的配列の第２鎖にハイブリダ
イズさせ、ポリメラーゼにより第４プライマーを伸長合
成して第７伸長合成産物を生成し、そして第７伸長合成
産物を置換し； （ｄ）第３プライマーを第７伸長合成産物にハイブリダ
イズさせ、ポリメラーゼにより第３プライマーを伸長合
成して第８伸長合成産物を生成し、そして第８伸長合成
産物を置換し；そして （ｅ）配列番号１および配列番号５のヌクレオチドを増
幅プライマーとして用いて、鎖置換増幅反応において第
６および第８伸長合成産物を同時に増幅するを含む、請
求項３記載の方法。 - 【請求項５】 （ａ）配列番号５からなる第１プライマ
ーを標的配列にハイブリダイズさせ、ポリメラーゼによ
り第１プライマーを伸長合成して第１伸長合成産物を生
成し、そして第１伸長合成産物を置換し； （ｂ）配列番号６からなる第２プライマーを第１伸長合
成産物にハイブリダイズさせ、第２プライマーを伸長合
成して第２伸長合成産物を生成し、そして第２伸長合成
産物を置換し；そして （ｃ）配列番号１および配列番号５のヌクレオチドを増
幅プライマーとして用いて、鎖置換増幅反応において第
２伸長合成産物を増幅する工程からなる、サンプル中の
ミコバクテリア標的配列の属特異的増幅法。 - 【請求項６】 さらに、以下の工程： （ａ）第２プライマーを標的配列の第２鎖にハイブリダ
イズさせ、ポリメラーゼにより第２プライマーを伸長合
成して第３伸長合成産物を生成し、そして第３伸長合成
産物を置換し； （ｂ）第１プライマーを第３伸長合成産物にハイブリダ
イズさせ、ポリメラーゼにより第１プライマーを伸長合
成して第４伸長合成産物を生成し、そして第４伸長合成
産物を置換し； （ｃ）配列番号１および配列番号５のヌクレオチドを増
幅プライマーとして用いて、鎖置換増幅反応において第
４伸長合成産物を増幅するを含む、請求項５記載の方
法。 - 【請求項７】 （ａ）配列番号１からなる第１オリゴヌ
クレオチド、配列番号２からなる第２オリゴヌクレオチ
ド、配列番号５からなる第３オリゴヌクレオチドおよび
配列番号６からなる第４オリゴヌクレオチド；および （ｂ）増幅反応において第１、第２、第３および第４オ
リゴヌクレオチドをミコバクテリア標的配列にハイブリ
ダイズさせ、これらオリゴヌクレオチドを伸長合成し、
そして標的配列からこれらオリゴヌクレオチドを置換す
るための試薬からなる、ミコバクテリア標的配列を増幅
するためのキット。 - 【請求項８】 （ａ）配列番号５からなる第１オリゴヌ
クレオチドおよび配列番号６からなる第２オリゴヌクレ
オチド；および （ｂ）増幅反応において第１および第２オリゴヌクレオ
チドをミコバクテリア標的配列にハイブリダイズさせ、
これらオリゴヌクレオチドを伸長合成し、そして標的配
列からこれらオリゴヌクレオチドを置換するための試薬
からなる、ミコバクテリア標的配列を属特異的に増幅す
るためのキット。 - 【請求項９】 （ａ）第１増幅プライマーの標的結合配
列に相補的な第１増幅プライマー結合部位および第２増
幅プライマーの標的結合配列に相補的な第２増幅プライ
マー結合部位を有するひとつの内部対照配列をサンプル
に加え； （ｂ）第１標的配列に第１増幅プライマーを特異的にハ
イブリダイズさせ、ポリメラーゼにより第１増幅プライ
マーを伸長合成して第１伸長合成産物を生成し、そして
第１伸長合成産物を置換し； （ｃ）第１アダプタープライマーを第１伸長合成産物に
特異的にハイブリダイズさせ、第１アダプタープライマ
ーを伸長合成して第２伸長合成産物を生成し、そして第
２伸長合成産物を置換し； （ｄ）第２増幅プライマーを第２標的配列に特異的にハ
イブリダイズさせ、ポリメラーゼにより第２増幅プライ
マーを伸長合成して第３伸長合成産物を生成し、そして
第３伸長合成産物を置換し； （ｅ）第２アダプタープライマーを第３伸長合成産物に
特異的にハイブリダイズさせ、ポリメラーゼにより第２
増幅プライマーを伸長合成して第４伸長合成産物を生成
し、そして第４伸長合成産物を置換し；そして （ｆ）第１および第２増幅プライマーを用いて、鎖置換
増幅反応において第２および第４伸長合成産物および内
部対照配列を同時に増幅する工程からなる、サンプル中
の複数標的配列および内部対照配列の同時増幅法。 - 【請求項１０】 さらに、以下の工程： （ａ）第１アダプタープライマーを第１標的配列の第２
鎖にハイブリダイズさせ、ポリメラーゼにより第１アダ
プタープライマーを伸長合成して第５伸長合成産物を生
成し、そして第５伸長合成産物を置換し； （ｂ）第１増幅プライマーを第５伸長合成産物にハイブ
リダイズさせ、ポリメラーゼにより第１増幅プライマー
を伸長合成して第６伸長合成産物を生成し、そして第６
伸長合成産物を置換し； （ｃ）第２アダプタープライマーを第２標的配列の第２
鎖にハイブリダイズさせ、ポリメラーゼにより第２アダ
プタープライマーを伸長合成して第７伸長合成産物を生
成し、そして第７伸長合成産物を置換し； （ｄ）第２増幅プライマーを第７伸長合成産物にハイブ
リダイズさせ、ポリメラーゼにより第２増幅プライマー
を伸長合成して第８伸長合成産物を生成し、そして第８
伸長合成産物を置換し；そして （ｅ）第１および第２増幅プライマーを用いて、鎖置換
増幅反応において第６および第８伸長合成産物を同時に
増幅するを含む、請求項９記載の方法。
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