KR100455032B1

KR100455032B1 - 다중-이중 중합효소연쇄반응에 의한 결핵균과 비결핵균의동시 검출 방법

Info

Publication number: KR100455032B1
Application number: KR10-2002-0014466A
Authority: KR
Inventors: 박영석; 김은하
Original assignee: 바이오코아 주식회사
Priority date: 2002-03-18
Filing date: 2002-03-18
Publication date: 2004-11-06
Also published as: KR20030075315A

Abstract

본 발명은 마이코박테리아에 관련된 3종의 유전자(mtp40, IS6110, hsp65)를 표적으로 하는 각각의 프라이머와, 이들 프라이머를 이용하여 하나의 튜브내에서 상기 3종의 유전자를 동시에 증폭시키는 다중-이중 중합효소연쇄반응법(multiplex- nested PCR법)에 의한 결핵균과 비결핵균의 동시검출 및 분석하는 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 인형 결핵균에서만 존재하는 mtp40 유전자와 인형 및 우형 결핵균에 주로 존재하는 것으로 알려진 IS6110 유전자 및 모든 항산성 마이코박테리아에 존재하는 hsp65 유전자 각각을 표적으로 하는 프라이머와, 검체에서 추출한 DNA를 주형으로 하는 상기 프라이머를 이용하여 하나의 튜브에서 동시에 3종의 유전자를 증폭시켜 생성된 산물의 패턴을 분석하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에 의하면, 검체내의 결핵균과 비결핵균에 대해 보다 신속하고 효율적인 임상 진단을 할 수 있는 유용한 지표를 제공할 수 있다.

Description

다중-이중 중합효소연쇄반응에 의한 결핵균과 비결핵균의 동시 검출 방법{METHOD FOR SIMULTANEOUS DETECTION OF TUBERCLE BACILLUS(TB) AND NONTURBERCULOUS MYCOBACTERIA(NTM) BY MULTIPLEX-NESTED POLYMERASE CHAIN REACTION}

본 발명은 마이코박테리아에 관련된 3종의 유전자(mtp40, IS6110, hsp65) 각각을 표적으로 하는 프라이머와, 이들 프라이머를 이용하여 하나의 튜브내에서 상기 3종의 유전자를 동시에 증폭시키는 다중-이중 중합효소연쇄반응법(multiplex-nested PCR법)에 의한 결핵균과 비결핵균의 동시검출 및 분석하는 방법에 관한 것이다.

더 구체적으로는 본 발명은 인형 결핵균에서만 존재하는 mtp40 유전자와 인형 및 우형 결핵균에 주로 존재하는 것으로 알려진 IS6110 유전자 및 모든 항산성 마이코박테리아에 존재하는 hsp65 유전자를 표적으로 하는 각각의 프라이머와, 검체에서 추출한 DNA를 주형으로 하는 상기 프라이머를 이용하여 하나의 튜브에서 동시에 3종의 유전자를 증폭시켜 생성된 산물의 패턴을 분석하는 방법에 관한 것이다.

마이코박테리아(Mycobacteria)속에는 사람과 동물에 감염되어 결핵, 나병 등의 질병을 일으키는 종들이 다수 포함되며, 지금까지 약 70여종 이상이 알려져 있다. 사람에게 결핵을 일으키는 균으로는 가장 중요한 원인균으로 알려져 있는 인형 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)과 드물게 나타나는 우형 결핵균 (Mycobacterium bovis)등이 있으며, 나병을 일으키는 나균(Mycobacterium leprae)도 마이코박테리아속에 포함된다(Shinnick TM 등, Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1994;13(11):884-901).

또한, 마이코박테리아속에는 정상적인 사람에게 결핵을 일으키지는 않지만 후천성면역결핍증환자(AIDS) 및 기타 면역결핍증 환자에게 유사결핵증을 일으키는 조결핵균군(M. avium-intracellulare또는M. avium complex), 및 기타 마이코박테리움 칸사시이(M. kansasii), 마이코박테리움 아프리카눔(M. africanum), 마이코박테리움 게나벤스(M. genavense) 등의 비결핵균(nontuberculous mycobacteria: NTM)도 포함된다(Barnes PF 등, N Engl J Med. 1991;324(23):1644-50).

상술한 균들의 감염에 의해 발생하는 결핵은 후진국 질병 중의 하나로 아직도 우리나라에서 흔한 질병이며, 한국국립보건원 통계조사에 의하면, 한국인 100명 중 1.03명이 결핵에 걸려있고(1995년), 10만명 중 7.1명은 폐결핵 때문에 사망 (1997년)하는 것으로 알려져 있다.

또한, 최근에는 비결핵균이 후천성 면역결핍증(AIDS) 및 기타 면역결핍증 환자나 면역력이 약화된 유아 등에 감염되어 결핵성균 감염증상과 유사한 임상증상을 나타내는 경우가 증가하고 있으며(Barnes PF 등, N Engl J Med. 1991;324(23):1644-50), 이들 중 최근의 결핵균 치료 약제들에 다중 내성을 갖는 것들이 많아 치료에 많은 어려움을 주고 있다(Kam KM 등, Clin Infect Dis. 2002;34(3):324-9).

따라서, 이들 각각에 대응하여 적합한 치료를 수행하기 위해서는, 결핵균과 비결핵균을 조기에 감별 진단하는 것이 필수적으로 요망되고 있다.

결핵을 진단하는 일반적인 방법으로는 환자의 임상증상, 튜버쿨린 검사, X-선 촬영, 결핵균 검사 등이 있다. 가장 간단한 방법인 튜버쿨린 검사는 간단하게 실시할 수 있으나, 중증결핵, 홍역, 면역억제로 인한 무감작(anergy)시에는 음성으로 반응한다.

또한, 일반 실험실에서는, Ziehl-Neelsen 염색에 의해 항산성을 조사하는 도말염색법이 보편적으로 사용되고 있으나, 이 방법에 의하면 그 결과는 간단하고 신속하게 얻을 수 있지만, 결핵균과 비결핵균을 구분할 수 없을 뿐만 아니라 민감도 또한 떨어진다.

민감도가 높은 배양 방법으로는 5-10%의 CO₂분압, 37℃에서 약 4-8주간 배양하여 관찰하는 방법이 있으나 기간이 매우 오래 걸려 치료하는데 적절치 못한 단점이 있다.

최근에는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction ; PCR) 및 이중 PCR (nested PCR) 방법을 이용하여 하루만에 신속하고 정확하게 임상 검체로부터 결핵균을 검출할 수가 있게 되었으며, 이 방법의 민감도와 특이도는 95% 이상인 것으로 보고되고 있어 유용하게 사용되고 있다(Wilson SM 등, J Clin Microbiol. 1993; 31(4):776-782 및 Noordhoek GT 등, J Clin Microbiol. 1994;32(2):277-84).

특히, 결핵균과 비결핵균을 감별하기 위해, 상기 PCR방법을 응용한, 몇 종의 프라이머를 하나의 튜브에 넣고 동시에 증폭시키는 다중-PCR법이 사용되고 있으며, 이 방법은 결핵균과 비결핵균의 동시 진단에 있어서, 민감도와 그 유용성이 매우 높은 것으로 알려져 있다(Cormican M et al, J Clin Pathol. 1995;48(3) :203-5; Yeboah-Manu D et al, J Clin Microbiol. 2001;39 (11):4166-8).

현재 상기의 다중 PCR 법을 이용한 결핵균과 비결핵균의 감별에종-특이적(species-specific) 또는 속-특이적(genus-specific)인 다수의 유전자가 그 표적 유전자로 이용되고 있으며, 그에 따른 그 표적 유전자의 선정에 있어서는, 종간에 존재하는 유전자의 보존도가 높고 유전자의 동질성이 높아 각 균종을 민감하게 감별할 수 있는 유전자를 선정함이 요구된다.

현재 결핵을 진단하는 PCR법에서 여러 종류의 유전자 부위를 사용하고 있는데 일반적으로 IS6110과 16S rRNA를 가장 보편적으로 사용하고 있으며(Noordhoek GT 등, J Clin Microbiol. 1996;34(10):2522-2525), hsp65와 mtp40 및 32-KDa 등도 사용하고 있다(Brunello F 등, J Clin Microbiol. 2001; 39(8):2799-2806 및 Herrera EA 등, J Clin Microbiol. 1996; 34(5):1108-1113). 그러나 이들 각각의 유전자에 대한 특성이 서로 다르므로 특정 유전자 부위만을 증폭하여 임상적으로 결핵을 진단하는데는 많은 어려움이 있다. 따라서 본 발명에서는 결핵을 일으키는 결핵균과 결핵으로 오인될 수 있는 유사 결핵증을 일으키는 마이코박테리아를 동시에 확인하고 분석이 가능하도록 하기 위하여 변별력이 뛰어나다고 판단되는 3종의 유전자를 선택하여 각각이 지니고 있는 장점을 살리고 단점을 보완할 수 있는 다중-이중 PCR법을 개발하였다. 즉 결핵균(M. tuberculosis)에만 특이적으로 존재하여 특이도는 높으나 단일 카피로 존재하므로 IS6110에 비해 민감도가 다소 낮은 mtp40 유전자와 결핵균군(M. tuberculosis, M. bovis)에 다량 카피로 존재하여 적은 수의 균에서도 높은 민감도를 나타내기는 하지만 약 5% 정도의 위음양성을 나타낼 수 있는 IS6110 유전자 및 마이코박테리아 속을 모두 증폭시켜 유사 결핵의 판단이 가능하도록 하는 hsp65 유전자를 동시에 하나의 튜브에서 증폭시켰다. 특히본 발명에서는 각기 특성이 다른 3종의 유전자를 하나의 튜브에서 증폭되도록 각각의 유전자를 분석하여 프라이머를 선택하였고, 다중-이중 PCR법의 실시예에 의해 결핵균과 비결핵균의 감별 진단 민감도를 크게 향상시켰다.

이에 본 발명자는 결핵균과 비결핵균을 동시에 검출 진단하는 쉽고 민감하고 간편한 방법를 개발하고자 예의 연구한 결과, 새로운 결핵균(M. tuberculosis) 특이 프라이머(표적 유전자: mtp40 유전자), 결핵균군(M. tuberculosis와M. bovis) 특이 프라이머(표적 유전자: IS6110 유전자) 및 모든 마이코박테리아 특이 프라이머(표적 유전자 : 65-kDa heat shock protein 유전자(hsp65))를 제작하고, 이를 이용하여, 검체내의 DNA를 주형으로 하나의 튜브에서 동시에 3종의 유전자를 증폭시키는 다중-이중 PCR을 수행함으로써, 우수한 민감도로 결핵균과 비결핵균을 동시에 진단할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 목적은 결핵균 및 비결핵균 특이적 유전자(mtp40, IS6110 및 hsp65) 부위를 뛰어난 민감도로 동시에 증폭시킬 수 있는 다중-이중 PCR 프라이머를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 프라이머를 이용한 다중-이중 중합효소 연쇄반응에 의해 결핵균과 비결핵균을 동시에 진단할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 다중-이중 중합효소연쇄반응법(다중-이중 PCR법)을 이용하여 mtp40 유전자, IS6110 유전자 및 hsp65 유전자를 하나의 튜브에서 동시에 증폭시킨 결과를 나타내는 전기영동사진이다.

도 2는 mtp40 유전자 부위만을 이중 PCR법에 의해 증폭한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.

도 3은 IS6110 유전자 부위만을 이중 PCR법에 의해 증폭한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.

도 4는 hsp65 유전자 부위만을 이중 PCR법에 의해 증폭한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.

본 발명은 임상검체로부터 추출한 DNA와 마이코박테리아에 특이적인 3개의 유전자 부위(mtp40, IS6110, hsp65)를 표적으로 하여 제작한 각각의 프라이머를 이용하여, 하나의 튜브에서 동시에 다중-이중 PCR을 실시하였다.

상기 mtp40 유전자는 결핵의 가장 중요한 원인균인 결핵균(M. tuberculosis)에만 특이적으로 존재하는 유전자(Del Portillo P 등, J Clin Microbiol. 1991; 29(10):2163-8)로서, Herrera EA와 Segovia M에 의해 mtp40의 민감도와 특이도가 각각 98.8%와 98.9%로 매우 우수함이 확인되었다(J Clin Microbiol. 1996; 34(5):1108-13).

또한, 상기 IS6110 유전자는 결핵균(M. tuberculosis) 및 마이코박테리아 보비스(M. bovis)에 존재하는 삽입 서열(insertion sequence)로서 결핵균군에 10~12카피가 존재하는 것으로 알려져 있어 일반적으로 결핵균 PCR 진단에서 주로 사용되고 있다(Thierry D 등, J Clin Microbiol. 1990; 28(12):2668-2673). 그러나 Doucet-Populaire 등은 비결핵균의 약 7% 정도가 IS6110 유전자를 지니고 있어 위양성의 위험을 지니고 있음을 보고하였다(Tuber Lung Dis 1996; 77(4):358-62).

상기 hsp65 유전자는 모든 마이코박테리아속의 세포벽에 존재하는 65kDa 크기의 열쇼크 단백질(heat shock protein)을 코딩하는 유전자(Rastogi N 등, J Clin Microbiol 1999; 37(6):2016-9)로 종에 따른 유전자 다형성을 이루고 있어 PCR-RFLP(Brunello F 등, J Clin Microbiol. 2001; 39(8):2799-806 및 Steingrube VA 등, J Clin Microbiol. 1995; 33(1):149-53)법이나 유전자 염기서열법(Ringuet H등, J Clin Microbiol. 1999; 37(3):852-7)을 이용하여 속을 분리하는데 사용하고 있으며 그 유용성이 매우 크다.

본 발명의 상기 3개 프라이머를 이용한 다중-이중 PCR을 행한 결과, 검체 중의 인형 결핵균(M. tuberculosis)의 감별진단 및 우형 결핵균(M. bovis)을 감별 진단하고, 결핵균군과 비결핵균을 감별 진단할 수 있음을 확인하였다.

<실시예>

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 구체적으로 설명한다.

이들 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 구체예로써, 당업계에서 통상의 지식을 가진자에 있어서, 본 발명이 이들 실시예에 제한되지 않는다는 것은 명백할 것이다.

실시예 1Multiplex-PCR용 프라이머 제작

본 발명에서 사용하는 mtp40 특이 프라이머는 미국립보건원 산하 NCBI에서 운영하는 유전자은행(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록되어 있는 GenBank S69737 염기서열을 Hitachi 소프트웨어사의 DNAsis 프로그램을 이용하여 분석한 다음 그 염기서열을 결정하고, 이를 다시 BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)로 분석하여 결핵균(M. tuberculosis)만을 증폭할 수 있는 프라이머 염기서열임을 확인하였다.

또한, 본 발명에서 사용하는 IS6110 특이 프라이머는 GenBank X17348 염기서열을 DNAsis 프로그램을 이용하여 분석한 다음 그 염기 서열을 결정하고 , 이를 다시 BLAST로 분석하여 결핵균군(M. tuberculosis및M. bovis)만을 증폭할 수 있는프라이머 염기서열임을 확인하였다.

본 발명에서 사용한 hsp65 특이 프라이머는 다양한 hsp65에서 공통적으로 사용할 수 있는 부위로 Shinnick TM(J Bacteriol. 1987; 169(3):1080-8)이 사용한 프라이머를 외측용으로 사용하였고 내측 프라이머는 GenBank M15467의 염기서열을 DNAsis로 분석하여 결정하였다.

제작한 프라이머의 염기서열과 이를 이용한 다중-이중 PCR에 의해 증폭되는 유전자 크기는 하기의 표1과 같다.

<표 1>

표적유전자	프라이머	염기서열 (5' ---> 3')	PCR증폭크기
mtp40	1차	Sense	gat agg gaa tgc tcg gca ac (서열번호1)	315 bp
		Antisense	gtc tgg gtt ttc gcg ttc c (서열번호2)
	2차	Sense	ggt tcc caa cac cac gtt c (서열번호3)	231 bp
		Antisense	ctg atg gtc tcc gac acg tt (서열번호4)
IS6110	1차	Sense	gag tcg atc tgc aca cag c (서열번호5)	238 bp
		Antisense	gtt tgg tca tca gcc gtt c (서열번호6)
	2차	Sense	gcc cca tcg acc tac tac g (서열번호7)	181 bp
		Antisense	gtt cga cgg tgc atc tgg c (서열번호8)
hsp65	1차	Sense	acc aac gat ggt gtg tcc at^*(서열번호9)	441 bp
		Antisense	ctt gtc gaa ccg cat acc ct^*(서열번호10)
	2차	Sense	atc ggc gcc gag ctg gtc aa (서열번호11)	341 bp
		Antisense	aag gtg ttg gac tcc tcg ac (서열번호12)
*; Shinnick TM (J Bacteriol. 1987; 169(3):1080-8)의논문에서 사용한 primer를 이용하였음.

실시예 2상기 프라이머의 합성

실시예 1에서 분석한 프라이머는 Molecular cloning 3판 (Sambrook과 Rusell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2001년)의 10.42에 기술된 올리고뉴클레오타이드 합성과 같은 방법을 이용하여 Applied biosystems 사의 DNA Synthesizer Model 392을 사용하여 합성하였다. 또한 합성된 프라이머는 OPC(Oligonucleotide Purification Cartridge) 컬럼을 사용하여 정제하고, 흡광도 측정기를 사용하여 정량한 다음, Speed Vac 시스템을 사용하여 건조시킨 후 적정량의 농도가 되도록 증류수에 녹여 PCR 프라이머로 사용하였다.

실시예 3임상검체로부터 균의 DNA 추출

결핵이 의심되는 환자의 객담 2-4ml과 동량의 4N NaOH를 15ml 튜브에 넣고 충분히 교반시킨 후 4,000rpm에서 20분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 침전물에 10 ml의 PBS buffer(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO_4,2 mM KH₂PO₄)를 넣어 잘 교반시킨 후, 4,000rpm에서 20분 동안 원심분리한다. 그 다음, 상층액을 제거하고 침전물을 1.5 ml 튜브로 옮긴 후 PBS buffer 1 ml을 넣고 교반시킨 후 13,000rpm에서 5분 동안 원심분리한다. 그 다음, 상층액을 제거하고 침전물에 5% Chelex 100 resin(Bio-Rad 사) 50-100 ul를 넣고 100℃에서 20분간 가열한 후, 13,000rpm에서 3분간 원심분리하여 분리된 DNA 상층액을 PCR의 주형 DNA로 사용한다.

실시예 4상기 프라이머를 이용한 다중-이중 PCR

1) 1차 PCR 반응

PCR 반응액은 10X buffer를 2ul, 2mM dNTP를 1ul, 10pmol mtp40 1차 프라이머를 1ul, 10pmol IS6110 1차 프라이머를 1ul, 10pmol hsp65 1차 프라이머를 1.5ul 및 증류수 8.5ul를 넣고 1units/ul Taq 중합효소를 0.5ul 가한 다음, 실시예 3에서 추출한 DNA를 4.5ul 첨가하여, 전체량을 20ul로 하였다.

PCR 반응은 PCR 기기(Perkin Elmer 9600, USA)를 사용하여, 95℃에서 5분간 변성(denaturation) 공정을 1 사이클, 94℃에서 1분간 변성, 68℃에서 1분간 결합(annealing), 72℃에서 1.5분간 연장(extention) 공정을 1 사이클로 하여, 30 사이클 실시한 뒤, 72℃에서 5분간 1사이클 반응시키는 조건으로 실시하였다.

2) 2차 PCR 반응

1차 PCR 반응과 마찬가지로, PCR 반응액은 10X buffer를 2ul, 2mM dNTP를 1ul, 10pmol mtp40 2차 프라이머를 2ul, 10pmol IS6110 2차 프라이머를 1ul, 10pmol hsp65 2차 프라이머를 1ul 및 증류수 11ul를 넣고, 1 units/ul Taq 중합효소를 0.5ul를 가한 다음, 여기에 상기 1차 PCR 반응물 1.5ul를 첨가하여 전체량을 20ul로 하였다.

PCR 반응은 PCR 기기(Perkin Elmer 9600, USA)를 사용하여, 95℃에서 5분간 변성(denaturation) 공정을 1 사이클, 94℃에서 1분간 변성, 65℃에서 1분간 결합(annealing), 72℃에서 1분간 연장(extention) 공정을 1 사이클로 하여, 25 사이클 실시한 뒤, 72℃에서 5분간 최종 연장반응을 1사이클 행하는 조건으로 실시하였다.

실시예 5다중-이중 PCR 결과의 확인

다중-이중 PCR이 끝난 산물 5ul에 젤 로딩 버퍼(0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 15% Ficoll 400) 1 ul를 넣고 1 ug/ml 에티듐 브로마이드(EtBr)가 함유된 2% 아가로스 젤에서 100-150 volt로 30-60분 동안 전기영동한 후 UV transilluminator가 부착된 화상분석기(Image analyzer; Vilber Lourmat, France)에서 PCR 밴드를 확인하였다. 이때 사용한 표준 마커는 PhiX174 Hae III Marker를 사용하였다.

도 1은 임상검체로부터 분리한 균의 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 프라이머를 이용한 다중-이중 PCR의 결과를 나타낸 전기영동 사진이다.

이들 중, 제1레인에서 제6레인은 결핵 증상을 나타내는 환자의 임상검체로부터 분리한 DNA를 주형으로 실험한 결과이며, 제7레인은 정상인 사람의 임상검체로부터 분리한 DNA를 주형으로 실험한 결과를 나타낸다. 이때, 양성 컨트롤(P레인)로는 American Type Culture Collection (ATCC)으로부터 구입한 결핵균 표준균주인 ATCC 27294를 사용하였으며, 음성 컨트롤(N레인)은 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis)의 표준균주인 ATCC 33530을 사용하였다.

제1레인의 경우, 341bp 크기(hsp65 유전자)의 단일밴드를, 제2레인은 231bp(mtp 40 유전자)와 341bp(hsp65 유전자)의 2 밴드를, 제3레인∼제6레인은 341bp(hsp65 유전자), 231bp(mtp40 유전자) 및 181bp(IS6110 유전자)의 3 밴드를 확인할 수 있었고, 마이코박테리아 음성인 제7레인은 밴드가 전혀 나타나지 않았다.

따라서, 제1레인의 경우, 모든 마이코박테리아에 존재하는 hsp65 밴드만 나타나고 결핵균 특이 유전자인 mtp40과 IS6110 밴드가 나타나지 않았으므로 비결핵균에 의한 감염임이 판명되었으며, 제3레인∼제6레인의 경우, 모든 유전자 부위(hsp65, mtp40, IS6110)가 나타났으므로 결핵균에 감염되었음이 판명되었다. 한편, mtp40과 hsp65 밴드만 나타나고, IS6110밴드는 나타나지 않은 제2레인의 경우은 IS6110 유전자에 위음성을 나타내는 결핵균으로 판단되었다.

비교예 1mtp 40 유전자 특이 프라이머를 이용한 PCR 및 결과의 확인

mtp40 특이 프라이머만을 사용한 것 외에는, 실시예4와 동일한 방법으로 PCR을 행한 결과, 도2와 같이, 제2∼제6레인의 샘플에서 밴드가 나타남을 확인하였다.

비교예 2IS6110 유전자 특이 프라이머를 이용한 PCR 및 결과의 확인

인형과 우형 결핵균에 존재하는 것으로 알려진 IS6110 특이 프라이머만을 이용한 것 외에는, 실시예4와 동일한 방법으로 PCR을 행한 결과, 도3과 같이, 제1레인과 제2레인에서는 밴드가 나타나지 않았으며, 제3레인∼제6레인에 밴드가 나타남을 확인하였다. 이 결과에서 제2레인의 경우는, 실시예5의 결과와 비교해 볼때, 실제로 결핵균에 감염되었으나 IS6110 유전자가 존재하지 않는 결핵균은 감별할 수 없음을 나타낸다.

비교예 3hsp65 유전자 특이 프라이머를 이용한 PCR 및 결과의 확인

모든 마이코박테리아에 존재하는 hsp65 유전자 특이 프라이머만을 사용한 것 외에는, 실시예4와 동일한 방법으로 PCR을 행한 결과, 도4와 같이, 제7레인(음성 컨트롤)을 제외한 제1레인∼제6레인 모두에서 밴드가 나타남을 확인하였다.

상기의 결과를 종합해 볼 때, 본 발명의 3종의 프라이머(mtp40, IS6110, hsp65 유전자 특이 프라이머)와 그것을 이용한 다중-이중 PCR 방법에 의하면, 종래의 일반적인 결핵 진단 방법보다, 단 시간내에 우수한 민감도와 특이성으로 검체내의 결핵균과 비결핵균을 효율적으로 검출할 수 있다.

<참고문헌>

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Claims

마이코박테리아 관련 3종의 유전자(mtp40, IS6110, hsp65) 각각을 표적으로 하는 3종의 특이 프라이머쌍을 동시에 사용하는 다중-이중 중합효소연쇄 반응(multiplex-nested PCR)에 의한 결핵균과 비결핵균의 동시검출방법으로서,

상기 프라이머쌍이 하기의 염기서열(서열번호 1∼12)로 구성됨을 특징으로 하는 다중-이중 중합효소연쇄 반응에 의한 결핵균과 비결핵균의 동시검출방법.

표적유전자 프라이머 염기서열 (5' ---> 3') 서열번호 mtp40 1차 Sense gat agg gaa tgc tcg gca ac 1 Antisense gtc tgg gtt ttc gcg ttc c 2 2차 Sense ggt tcc caa cac cac gtt c 3 Antisense ctg atg gtc tcc gac acg tt 4 IS6110 1차 Sense gag tcg atc tgc aca cag c 5 Antisense gtt tgg tca tca gcc gtt c 6 2차 Sense gcc cca tcg acc tac tac g 7 Antisense gtt cga cgg tgc atc tgg c 8 hsp65 1차 Sense acc aac gat ggt gtg tcc at^* 9 Antisense ctt gtc gaa ccg cat acc ct^* 10 2차 Sense atc ggc gcc gag ctg gtc aa 11 Antisense aag gtg ttg gac tcc tcg ac 12

삭제
제1항에 있어서,

환자의 검체에 감염된 미생물로부터 추출한 DNA와 상기 프라이머를 함께 첨가하여 상기 유전자의 일부 또는 전부를 동시에 증폭시키는 다중-이중 중합효소연쇄반응을 행하고, 생성된 산물을 확인 판독함을 특징으로 하는 다중-이중 중합효소연쇄 반응에 의한 결핵균과 비결핵균의 동시검출방법.