TWI577803B - 多重抗藥性結核病篩檢方法及套組 - Google Patents
多重抗藥性結核病篩檢方法及套組 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI577803B TWI577803B TW104101279A TW104101279A TWI577803B TW I577803 B TWI577803 B TW I577803B TW 104101279 A TW104101279 A TW 104101279A TW 104101279 A TW104101279 A TW 104101279A TW I577803 B TWI577803 B TW I577803B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- primer
- tuberculosis
- seq
- nucleotide sequence
- gene
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本發明係關於一種多重抗藥性結核病篩檢方法及套組；特別係指可同時偵測多種結核菌抗藥基因單點核苷酸變異之方法及套組。
結核病(Tuberculosis,TB)係由結核分枝桿菌(結核菌，Mycobacterium tuberculosis)引起。結核菌為長1~10μm，寬0.2~0.7μm之細長桿菌，屬於好氣菌，無鞭毛、芽胞及莢膜，其細胞壁富含脂質而不易被強酸脫色，故又稱耐酸菌。結核菌生長最適溫度為37℃，最適酸鹼度為6.4~7.0，分裂速度慢，平均每20小時分裂一次，但對外界抵抗力強，在適宜環境中可生存2~3個月。
多重抗藥性結核病(Multi-drug Resistant Tuberculosis,MDR-TB)是指患者檢體經測試後發現至少同時對Isoniazid(INH及Rifampin(RIF)等2種第1線藥物具有抗藥性，一旦被感染，其治療成功率將大幅下降，對於結核病防治有極大影響。導致多重抗藥性結核病發生的原因主要多為人為因素，包含：未依標準處方及劑量開立藥物、未注意到病人服藥後順服度不佳導致續發性多重抗藥菌株的產生、未注意到病人已經罹患抗藥性結核病、過度依賴Streptomycin及Fluoroquinolone、病人不規則
服藥、遭原發性多重抗藥性菌株感染、生理性抗藥等。
結核菌產生抗藥性的致病機制係源自於其染色體上基因產生變異或突變，其中又以單核苷酸多型性變異(簡稱單點核苷酸變異、單點核酸變異；Single Nucleotide Polymorphism,SNP)為主。目前已知結核菌對Rifampin的抗藥性與核醣核酸聚合酶的β子單位(β-subunit of RNA polymerase)rpoB基因變異有關，其中約96%~100%抗藥性菌株於rpoB基因上81個鹼基對區域(81-base pair region)產生SNP變異，其主要SNP變異點位於rpoB D516V/516Y/H526Y/H526R/H526T/S531L/S531W。另一方面，結核菌對Isoniazid的抗藥性則與數個基因片段SNP變異有關，如ahpC、inhA及katG，其中約42%~58%的katG基因、21%~34%的inhA基因，以及ahpC基因中皆有SNP變異，其主要SNP變異點分別位於katG S315T/S315N、inhA promoter-8T>CA/15C>T/-16A>G、ahpC promoter-10C>T。此外，對Rifampin具抗藥性之菌株約有90%同時對Isoniazid具有抗藥性。
現行抗藥性結核病之篩檢方法大多利用藥敏測試，一般而言，藥敏測試若利用Lowenstein Jensen培養基或Middlebrook 7H10或7H11等固體培養基約需4~8週才有結果，而若利用自動化液體培養基系統(radiometric BACTEC 460TB system、nonradiometric ESP II system或BACTEC MGIT 960 SIRE)則需耗費1~2週時間，上述方法都須花費較長時間才可得到確診，導致難以有效防範與治療抗藥性結核病。
有鑑於現行抗藥性結核病菌篩檢方法往往需耗費極長時間，而抗藥性結核病菌患者於此篩檢空窗期可能錯失治療黃金期或進一步擴散感染範圍，因此如何於初期的結核病診斷中篩選出MDR-TB患者，對於
疾病防治是相當重要的一環。而除了習知藥敏測試，核苷酸定序方法雖可對檢體進行定序，但所費成本過高，對於臨床檢驗的負擔較重，因此並不適宜做為臨床上大量篩檢的方法。另一方面，綜觀現行檢測核苷酸變異的方法，尚未有可同時檢測多重抗藥性結核病多個基因變異的快速篩檢方法。
本案發明人鑑於上述習用抗藥性結核病篩檢方法所衍生的各項缺點，乃亟思加以改良創新，並經多年苦心孤詣潛心研究後，終於成功研發完成本件多重抗藥性結核病篩檢的方法。
本發明之目的即在於提供一種結核病篩檢方法及套組，以進行第一線多重抗藥性結核病篩檢(MDR-TB screening)。
本發明之次一目的係在於提供一種快速的多重抗藥性結核病篩檢方法及套組，其可同時偵測多種結核菌抗藥基因單點核苷酸變異。
本發明之另一目的係在於提供一種快速且準確之核苷酸變異篩檢方法，該方法除可應用於抗藥性結核病檢測，亦可應用於其他核苷酸變異之疾病檢測，以加速疾病之診斷。
為達上述發明目的，本發明係提供一種多重抗藥性結核病篩檢方法，其係同時針對受測檢體中結核菌抗藥基因組合進行單點核苷酸變異篩檢，該方法包含下列步驟：步驟1：提供一受測檢體；步驟2：準備引子以擴增該結核菌抗藥基因組合；步驟3：準備特異性引子以針對步驟2所擴增之結核菌抗藥基因組合產物進行單鹼基延伸(Single base extension,SBE)反應；以及步驟4：根據單鹼基延伸反應之結果，判斷該受測檢體是否
具有多重抗藥性結核病，其中該結核菌抗藥基因組合包含katG基因、mabA-inhA基因區域、oxyR-ahpC基因區域及rpoB基因。
其中該受測檢體係為痰液、膿、水疱液、鼻腔拭子、鼻咽拭子、咽喉拭子、直腸拭子、肛門拭子、子宮頸拭子、尿道拭子、菌株檢體、血液、腦脊髓液、關節囊液、腹膜液、心胞液、滑液、眼前房液，或其他可用於篩檢之體液或組織。
而為擴增上述基因，本發明利用聚合酶鏈反應(PCR)或多重聚合酶鏈反應(multiplex PCR)進行DNA增量，而又以多重聚合酶鏈反應(multiplex PCR)最佳。
用以進行擴增該結核菌抗藥基因組合的引子序列係為：mabA-inhA引子為SEQ ID NO：1-14所示之核苷酸序列；oxyR-ahpC引子為SEQ ID NO：23-31所示之核苷酸序列；katG引子為SEQ ID NO：36-49所示之核苷酸序列；以及rpoB引子為SEQ ID NO：52-63所示之核苷酸序列。上述所列各基因或基因區域之引子序列任一對正向、反向引子皆可分別用於各目標基因之擴增。
待前述基因完成擴增後，接著進行單鹼基延伸反應，而用以進行單鹼基延伸反應之特異性引子係為：mabA-inhA特異性引子為SEQ ID NO：15-22所示之核苷酸序列；oxyR-ahpC特異性引子為SEQ ID NO：32-35所示之核苷酸序列；katG特異性引子為SEQ ID NO：50-51所示之核苷酸序列；rpoB特異性引子為SEQ ID NO：64-79所示之核苷酸序列。上述所列各基因或基因區域之特異性引子序列任一對正向、反向引子皆可分別用於進行各目標基因之單鹼基延伸反應。
前述之篩檢方法可更進一步同時擴增結核菌特有基因IS6110、CFP10，以避免偽陽性反應。
而可用以擴增該結核菌特有基因之引子係為：IS6110引子為SEQ ID NO：80-85所示之核苷酸序列；CFP10引子為SEQ ID NO：86-87所示之核苷酸序列。
待反應完成後，用以分析該單鹼基延伸反應之方法係為核酸定序及序列分析。
本發明係進一步提供一種篩檢多重抗藥性結核病之套組，其係用於同時篩檢結核菌抗藥基因組合的單點核苷酸變異，該套組包含可擴增該結核菌抗藥基因組合之引子，以及可用以進行單鹼基延伸反應之特異性引子，其中該結核菌抗藥基因組合包含katG基因、mabA-inhA基因區域、oxyR-ahpC基因區域及rpoB基因。
而可擴增該結核菌抗藥基因組合之引子係為：mabA-inhA引子為SEQ ID NO：1-14所示之核苷酸序列；oxyR-ahpC引子為SEQ ID NO：23-31所示之核苷酸序列；katG引子為SEQ ID NO：36-49所示之核苷酸序列；rpoB引子為SEQ ID NO：52-63所示之核苷酸序列。上述所列之各基因或基因區域之引子序列任一對正向、反向引子皆可分別用於各目標基因之擴增。
其中用以進行單鹼基延伸反應之特異性引子係為：mabA-inhA特異性引子為SEQ ID NO：15-22所示之核苷酸序列；oxyR-ahpC特異性引子為SEQ ID NO：32-35所示之核苷酸序列；katG特異性引子為SEQ ID NO：50-51所示之核苷酸序列；rpoB特異性引子為SEQ ID NO：64-79所
示之核苷酸序列。上述所列之各基因或基因區域之特異性引子序列任一對正向、反向引子皆可分別用於進行各目標基因之單鹼基延伸反應。
前述套組可更進一步包含可擴增結核菌特有基因IS6110、CFP10之引子，而其可用以擴增該結核菌特有基因之引子係為：IS6110引子為SEQ ID NO：80-85所示之核苷酸序列；CFP10引子為SEQ ID NO：86-87所示之核苷酸序列。
為使本領域具習知技藝者更為明瞭本發明所提供之方法與套組，茲詳細說明前述專有名詞如下，該專有名詞之說明於本發明中均適用：
專有名詞「結核病」係指Tuberculosis，其為一種慢性傳染病，致病原為結核菌。結核病主要感染部位肺或淋巴系統，但亦可感染人體其他器官或組織，如淋巴結、腦膜、胸膜、腎臟、骨骼、皮膚、消化道、泌尿生殖道等。
專有名詞「結核菌」係指Mycobacterium tuberculosis，又稱結核桿菌或結核分枝桿菌。
專有名詞「多重抗藥性結核病」係指Multi-drug Resistant Tuberculosis，其係指患者痰液或其他檢體中培養出的結核菌藥敏試驗同時對Isoniazid及Rifampin具有抗藥性。
專有名詞「結核菌抗藥基因」係指結核菌基因或基因區域產生變異或突變而可促使結核菌產生抗藥性。
專有名詞「結核菌特有基因」係指結核菌特有之基因片段，可用以分辨檢體所含之菌體為結核菌或非結核菌。
專有名詞「單鹼基延伸反應」係指檢測樣品中DNA特定位
置核苷酸之方法。
專有名詞「mabA-inhA」係指結核菌中inhA與mabA基因及其之間的基因區間(intergenic region)共同組成的基因區域，其與結核菌Isoniazid抗藥性有關。
專有名詞「oxyR-ahpC」係指結核菌中oxyR與ahpC基因及其之間的基因區間(intergenic region)共同組成的基因區域，其與結核菌Isoniazid抗藥性有關。
圖1係為應用本發明之引子進行PCR反應之結果。a.為Single PCR之結果，代號標示如下：100bp marker(lane M)、katG gene(lane 1)、NTC-katG gene(lane 2)、mabA-inhA gene(lane 3)、NTC-mabA-inhA gene(lane 4)、rpoB gene(lane 5)、NTC-rpoB gene(lane 6)、oxyR-ahpC gene(lane 7)、NTC-oxyR-ahpC gene(lane 8)、IS6110 gene(lane 9)、NTC-IS6110 gene(lane 10)、CFP10 gene(lane 11)、NTC-CFP10 gene(lane 12)；b.為multiplex PCR之結果，代號標示如下：100bp marker(lane M)、H37Rv-20ng(lane 1)、H37Rv-40ng(lane 2)、H37Rv-60ng(lane 3)、NTC(lane 4)，H37Rv：標準參考菌株結核菌H37Rv，NTC：Non-template Control；c.為PCR產物大小示意圖。
圖2係為應用本發明之引子進行NTM菌株(非結核分枝桿菌，Nontuberculous Mycobacterium)進行multiplex PCR之結果。a.
為multiplex PCR之結果，代號標示如下：100bp marker(lane M)、M.kansasii(lane 1)、M.gordonae(lane 2)、MAC(M.avium complex)(lane 3)、M.nonchromos genicum(lane 4)、M.xenopi(lane 5)、M.scrofulacoae(lane 6)、M.szulgai(lane 7)、M.tenoe complex(lane 8)、M.fortuiturn(lane 9)、M.cholonae(lane 10)、Kurono 35812(lane 11)、Erdman 35801(lane 12)、M.bovis 35731(lane 13)、M.bovis 19015(lane 14)、H37Ra 25177(lane 15)、標準參考菌株結核菌H37Rv(lane 16)、NTC(lane 17)；b.為PCR產物大小示意圖。
圖3係為應用本發明之特異性引子進行多條引子SBE反應之最佳化分析結果，部分引子為antisense。a.為SBE訊號分析結果圖；b.為SBE訊號分析編碼說明。
圖4係為應用本發明針對臨床檢體進行multiplex PCR之結果。臨床檢體(lane1-14，其中lane12-13經菌種鑑定為非結核菌)、100bp marker(lane M)。
本發明係以下述實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例限制。
實施例1 結核菌基因體DNA(Genomic DNA)萃取
以TANBead® TB DNA Auto套組(TAN Co.,Ltd)進行結核菌標準參考菌株結核菌H37Rv基因體DNA(Genomic DNA)萃取。方法簡述如下：將所培養之菌懸浮液離心後，去除培養基，加入incubation buffer於96℃反應，接
著加入lysozyme於37℃反應24小時後，再加入Proteinase K搖勻後靜置1小時，加入lysis buffer、wash buffer、Beads及elution buffer至96孔盤相對槽位，置入磁珠吸附系統(MeDiPro SuperPure System-32)，結束後即可收集DNA，DNA之濃度及純度以A-drop鑑定。
實施例2 目標基因聚合酶鏈反應與定序
(一)Single/multiplex PCR
為避免偽陽性反應，本實驗以IS6110、CFP10為控制組。設計可擴增結核菌katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、rpoB、IS6110、CFP10之引子序列，mabA-inhA引子為SEQ ID NO：1-14所示之核苷酸序列；oxyR-ahpC引子為SEQ ID NO：23-31所示之核苷酸序列；katG引子為SEQ ID NO：36-49所示之核苷酸序列；rpoB引子為SEQ ID NO：52-63所示之核苷酸序列；IS6110引子為SEQ ID NO：80-85所示之核苷酸序列；CFP10引子為SEQ ID NO：86-87所示之核苷酸序列。於Single PCR方面，反應溶液包含0.5-100ng之結核菌標準參考菌株結核菌H37Rv Genomic DNA為模板、引子(用於增量katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、rpoB、IS6110、CFP10等相關基因)、四種去氧核糖核酸、聚合酶、緩衝溶液及2價鎂離子，反應時間、溫度如下：96℃、30秒；95℃、1分鐘，52℃、30秒，72℃、1分鐘，以此循環重覆35次；最後以72℃反應10分鐘。於multiplex PCR方面，將前述所有引子加入同一管PCR反應，以與前述相同之反應條件同步擴增6個基因片段。
將該PCR產物進行DNA電泳後，使用Gel/PCR DNA
Fragments Extraction Kit(RBC Bioscience Co.,Ltd)，依次加入5倍PCR產物體積DF buffer、WS buffer，2次13,000rpm離心後，將DF column管置於1.5ml微量離心管，加入60℃的滅菌純水，以13,000rpm離心取得PCR DNA，DNA之濃度及純度以A-drop鑑定。
(二)試驗結果
katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、rpoB、IS6110(internal control-1)及CFP10(internal control-2)之single PCR反應結果如圖1a所示，其皆可獲得單一正確大小的PCR產物，並經定序確認為正確標的。katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、rpoB、IS6110及CFP10基因片段之multiplex PCR之結果則如圖1b所示。而若針對非結核菌之菌株(Nontuberculous Mycobacterium,NTM)進行multiplex PCR，則無法獲得正確且特定大小的PCR產物(如圖2a)。
實施例3 目標基因單鹼基延伸反應(Single base extension,SBE)
基因變異可促使結核菌產生抗藥性，為確認結核菌是否產生抗藥性，本發明針對結核菌katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、rpoB之單點核苷酸變異設計不同點位及長度的特異性引子，其單點核苷酸變異分別為rpoB D516V/D516Y/H526Y/H526R/H526T/S531L/S531W、katG S315T/S315N、inhA promoter-8T>C/-8T>A/15C>T/-16A>G、ahpC promoter-10C>T，以進行單鹼基延伸反應。mabA-inhA特異性引子為SEQ ID NO：15-22所示之核苷酸序列；oxyR-ahpC特異性引子為SEQ ID NO：32-35所示之核苷酸序列；katG特異性引子為SEQ ID NO：50-51所示之核苷酸序列；rpoB特異性引子為SEQ ID
NO：64-79所示之核苷酸序列。以SNaPshot Multiplex套組(Applied Biosystem Inc.Co.,Ltd)於Gene Amp2700(Applied Biosystem Inc.Co.,Ltd)上進行單鹼基延伸反應，反應溶液包含10-60ng之PCR DNA、特異性引子(用於katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、rpoB等相關基因單鹼基延伸反應)、緩衝溶液及相關佐劑。反應完成後，使用SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase)純化單鹼基延伸反應產物，反應時間、溫度如下：37℃、1小時；75℃、15分鐘。接著再利用3730 DNA Analyzer讀取訊號，並利用GeneMapper軟體進行分析，反應分析結果如圖3所示。
實施例4 臨床檢體篩檢
(一)臨床檢體處理
臨床痰液檢體先經NALC-NaOH處理後，接種於MGIT培養基(Mycobacteria Growth Indicator Tube)，再置入自動偵測結核菌液態快速培養系統BACTEC MGIT 960於37±1℃培養至6週判別是否感染。收集篩檢結果為陽性之檢體，以TANBead® TB DNA Auto套組(TAN Co.,Ltd)進行Genomic DNA萃取。
(二)細菌藥物敏感性試驗(藥敏試驗，Antimicrobial Susceptibility Testing)
利用比例法(Proportion method)進行藥敏試驗。將培養陽性的檢體，挑取數個菌落調製成McFarland 1濃度之懸浮液，稀釋為100倍及10,000倍接種液，接種於含藥(Isoniazid、Rifampin)之7H11培養基，經2~3週判讀結果。結果比較含藥培養基和不含藥對照組所生長的菌落數，判定為抗藥性(Resistant,R)或感受性(Susceptible,S)。
(三)試驗分析結果
臨床檢體進行multiplex PCR之電泳結果如圖4所示。於本發明方法中，對Rifampin具有抗性菌株之篩出靈敏度(sensitivity)(具變異點位抗藥性菌株/具變異點位抗藥性菌株+無變異點位抗藥性菌株)為88.24%、專一性(specificity)(無變異點位抗藥性菌株/具變異點位無抗藥性菌株+無變異點位無抗藥性菌株)為100%；對INH具有抗性菌株篩出靈敏度(sensitivity)為71.11%、專一性(specificity)為88.24%(如表1)。
上述實施例中所提及之引子序列如表2所示，該引子序列均可作為本發明之試驗材料，而得到相同之試驗結果。
本發明所提供之多重抗藥性結核病篩檢方法及套組，與其他習用技術相互比較時，更具有下列之優點：
1.本發明所提供之多重抗藥性結核病篩檢方法及套組，與習知藥敏測試之靈敏度及專一性相當，但時間花費較短，至多僅須1個工作天，相較於藥敏測試須花費至少1~2周以上，本發明更可以有效防治多重抗藥性結核病。
2.本發明所提供之多重抗藥性結核病篩檢方法，可更進一步應用於其他抗藥性菌株之核苷酸變異，有利於抗藥性疾病之防治。
3.相較於一般定序方法一次僅能檢驗1個SNP變異，本發明所提供之多重抗藥性結核病篩檢方法及套組可同時偵測至少10個以上的SNP變異，且篩檢成本減少約60%，有利於作為抗藥性結核病之臨床檢測工具之一。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
綜上所述，本案不但在方法上確屬創新，且較習用技術增進上述多項功效，已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。
<110> 昕穎生醫技術股份有限公司
<120> 多重抗藥性結核病篩檢方法及套組
<160> 87
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 15
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA SBE primer
<400> 1
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA SBE primer
<400> 1
<210> 17
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA SBE primer
<400> 1
<210> 18
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA SBE primer
<400> 1
<210> 19
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA SBE primer
<400> 1
<210> 20
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA SBE primer
<400> 1
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA SBE primer
<400> 1
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mabA-inhA SBE primer
<400> 1
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oxyR-ahpC multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 24
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oxyR-ahpC multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oxyR-ahpC multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oxyR-ahpC multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oxyR-ahpC multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oxyR-ahpC multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oxyR-ahpC multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oxyR-ahpC multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 31
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oxyR-ahpC multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oxyR-ahpC SBE primer
<400> 1
<210> 33
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oxyR-ahpC SBE primer
<400> 1
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oxyR-ahpC SBE primer
<400> 1
<210> 35
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oxyR-ahpC SBE primer
<400> 1
<210> 36
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KatG multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KatG multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KatG multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KatG multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KatG multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KatG multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KatG multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KatG multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KatG multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KatG multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KatG multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KatG multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KatG multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KatG multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 50
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KatG SBE primer
<400> 1
<210> 51
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KatG SBE primer
<400> 1
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 53
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 57
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 61
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 64
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB SBE primer
<400> 1
<210> 65
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB SBE primer
<400> 1
<210> 66
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB SBE primer
<400> 1
<210> 67
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB SBE primer
<400> 1
<210> 68
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB SBE primer
<400> 1
<210> 69
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB SBE primer
<400> 1
<210> 70
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB SBE primer
<400> 1
<210> 71
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB SBE primer
<400> 1
<210> 72
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB SBE primer
<400> 1
<210> 73
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB SBE primer
<400> 1
<210> 74
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB SBE primer
<400> 1
<210> 75
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB SBE primer
<400> 1
<210> 76
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB SBE primer
<400> 1
<210> 77
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB SBE primer
<400> 1
<210> 78
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB SBE primer
<400> 1
<210> 79
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB SBE primer
<400> 1
<210> 80
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IS6110 multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 81
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IS6110 multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 82
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IS6110 multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IS6110 multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 84
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IS6110 multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 85
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IS6110 multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 86
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CFP10 multiplex PCR primer
<400> 1
<210> 87
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CFP10 multiplex PCR primer
<400> 1
Claims (14)
- 一種多重抗藥性結核病篩檢方法，其係同時針對受測檢體中結核菌抗藥基因組合進行單點核苷酸變異篩檢，該方法包含下列步驟：步驟1：提供一受測混合物檢體；步驟2：準備引子以擴增該結核菌抗藥基因組合；步驟3：準備特異性引子以針對步驟2所擴增之結核菌抗藥基因組合產物進行單鹼基延伸(Single base extension,SBE)反應；以及步驟4：根據單鹼基延伸反應之結果，判斷該受測混合物檢體是否具有多重抗藥性結核病，其中該結核菌抗藥基因組合包含katG基因、mabA-inhA基因區域、oxyR-ahpC基因區域及rpoB基因。
- 如申請專利範圍第1項所述之篩檢方法，其中該受測檢體係為痰液、膿、水疱液、鼻腔拭子、鼻咽拭子、咽喉拭子、直腸拭子、肛門拭子、子宮頸拭子、尿道拭子、菌株檢體、血液、腦脊髓液、關節囊液、腹膜液、心胞液、滑液、眼前房液。
- 如申請專利範圍第1項所述之篩檢方法，其中擴增該結核菌抗藥基因組合之方法包含：聚合酶鏈反應(PCR)、多重聚合酶鏈反應(multiplex PCR)。
- 如申請專利範圍第3項所述之篩檢方法，其中擴增該結核菌抗藥基因組合之方法以多重聚合酶鏈反應(multiplex PCR)最佳。
- 如申請專利範圍第1項所述之篩檢方法，其中擴增該結核菌抗藥基因組合之引子係選自：mabA-inhA引子為SEQ ID NO：1-14所示之核苷酸序列；oxyR-ahpC引子為SEQ ID NO：23-31所示之核苷酸序列；katG引子為SEQ ID NO：36-49所示之核苷酸序列；rpoB引子為SEQ ID NO：52-63所示之核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之篩檢方法，其中進行單鹼基延伸反應之特異性引子係選自：mabA-inhA特異性引子為SEQ ID NO：15-22所示之核苷酸序列；oxyR-ahpC特異性引子為SEQ ID NO：32-35所示之核苷酸序列；katG特異性引子為SEQ ID NO：50-51所示之核苷酸序列；rpoB特異性引子為SEQ ID NO：64-79所示之核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之篩檢方法，其可更進一步擴增結核菌特有基因IS6110、CFP10。
- 如申請專利範圍第7項所述之篩檢方法，其中擴增該結核菌特有基因之引子係選自：IS6110引子為SEQ ID NO：80-85所示之核苷酸序列；CFP10引子為SEQ ID NO：86-87所示之核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之篩檢方法，其中分析該單鹼基延伸反應之方法係為核酸定序及序列片段分析方法。
- 一種篩檢多重抗藥性結核病之套組，其係用於同時篩檢結核菌抗藥基因組合的單點核苷酸變異，該套組包含一受測混合物檢體、可擴增該結核菌抗藥基因組合之引子，以及可用以進行單鹼基延伸反應之特異性引子，其中該結核菌抗藥基因組合包含katG基因、mabA-inhA基因區域、oxyR-ahpC基因區域及rpoB基因。
- 如申請專利範圍第10項所述之套組，其可擴增該結核菌抗藥基因組合之引子係選自：mabA-inhA引子為SEQ ID NO：1-14所示之核苷酸序列；oxyR-ahpC引子為SEQ ID NO：23-31所示之核苷酸序列；katG引子為SEQ ID NO：36-49所示之核苷酸序列；rpoB引子為SEQ ID NO：52-63所示之核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第10項所述之套組，其可用以進行單鹼基延伸反應之特異性引子係選自：mabA-inhA特異性引子為SEQ ID NO：15-22所示之核苷酸序列；oxyR-ahpC特異性引子為SEQ ID NO：32-35所示之核苷酸序列；katG特異性引子為SEQ ID NO：50-51所示之核苷酸序列；rpoB特異性引子為SEQ ID NO：64-79所示之核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第10項所述之套組，其可更進一步包含可擴增結核菌特有基因IS6110、CFP10之引子。
- 如申請專利範圍第13項所述之套組，其可用以擴增該結核菌特有基因之引子係選自：IS6110引子為SEQ ID NO：80-85 所示之核苷酸序列；CFP10引子為SEQ ID NO：86-87所示之核苷酸序列。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW104101279A TWI577803B (zh) | 2015-01-15 | 2015-01-15 | 多重抗藥性結核病篩檢方法及套組 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW104101279A TWI577803B (zh) | 2015-01-15 | 2015-01-15 | 多重抗藥性結核病篩檢方法及套組 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201625798A TW201625798A (zh) | 2016-07-16 |
| TWI577803B true TWI577803B (zh) | 2017-04-11 |
Family
ID=56985046
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW104101279A TWI577803B (zh) | 2015-01-15 | 2015-01-15 | 多重抗藥性結核病篩檢方法及套組 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| TW (1) | TWI577803B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030075315A (ko) * | 2002-03-18 | 2003-09-26 | 바이오코아 주식회사 | 다중-이중 중합효소연쇄반응에 의한 결핵균과 비결핵균의동시 검출 방법 |
| EP1484413A1 (en) * | 2003-06-03 | 2004-12-08 | Leopold Prof. Dr. Flohé | Assay for identifying inhibitors of Mycobacterium anti-oxidant defense system |
| CN101845503A (zh) * | 2010-06-10 | 2010-09-29 | 无锡锐奇基因生物科技有限公司 | 检测耐药结核分支杆菌(mdr-tb)的方法和试剂盒 |
| JP2013531983A (ja) * | 2010-06-11 | 2013-08-15 | パソジェニカ，インコーポレイテッド | 多重生物検出のための核酸ならびにその使用および製造方法 |
| TW201400621A (zh) * | 2012-06-22 | 2014-01-01 | Taichung Veterans General Hospital Vacrs | 檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之探針、晶片、套組與方法 |
| CN103882114A (zh) * | 2014-01-09 | 2014-06-25 | 华晶基因技术有限公司 | 一种检测单核苷酸多态性或者点突变的方法 |
-
2015
- 2015-01-15 TW TW104101279A patent/TWI577803B/zh active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030075315A (ko) * | 2002-03-18 | 2003-09-26 | 바이오코아 주식회사 | 다중-이중 중합효소연쇄반응에 의한 결핵균과 비결핵균의동시 검출 방법 |
| EP1484413A1 (en) * | 2003-06-03 | 2004-12-08 | Leopold Prof. Dr. Flohé | Assay for identifying inhibitors of Mycobacterium anti-oxidant defense system |
| CN101845503A (zh) * | 2010-06-10 | 2010-09-29 | 无锡锐奇基因生物科技有限公司 | 检测耐药结核分支杆菌(mdr-tb)的方法和试剂盒 |
| JP2013531983A (ja) * | 2010-06-11 | 2013-08-15 | パソジェニカ，インコーポレイテッド | 多重生物検出のための核酸ならびにその使用および製造方法 |
| TW201400621A (zh) * | 2012-06-22 | 2014-01-01 | Taichung Veterans General Hospital Vacrs | 檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之探針、晶片、套組與方法 |
| CN103882114A (zh) * | 2014-01-09 | 2014-06-25 | 华晶基因技术有限公司 | 一种检测单核苷酸多态性或者点突变的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| C. Bouakaze et al., "Identification and Genotyping of Mycobacterium tuberculosis Complex Species by Use of a SNaPshot Minisequencing-Based Assay", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Vol. 48, No. 5, May 2010, p. 1758–1766. * |
| 樂軍等人，酶聯免疫斑點試驗快速診斷結核分枝桿菌感染的臨床應用價值，中華檢驗醫學雜誌，2006年11月，第29卷第11期，第1005-1008頁 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW201625798A (zh) | 2016-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110541022B (zh) | 基于CRISPR-Cas12a系统的结核分枝杆菌复合群检测试剂盒 | |
| JP2020168007A (ja) | 結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のためのポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブ | |
| Nasr Esfahani et al. | Rapid and accurate identification of Mycobacterium tuberculosis complex and common non-tuberculous mycobacteria by multiplex real-time PCR targeting different housekeeping genes | |
| RU2405836C2 (ru) | Способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа beijing | |
| Brossier et al. | Molecular detection methods of resistance to antituberculosis drugs in Mycobacterium tuberculosis | |
| JP7262427B2 (ja) | 病原体試料におけるマイナー変異体突然変異検出のための単一分子重複読み取り分析 | |
| RU2684314C2 (ru) | Способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа Beijing В0-кластер в формате реального времени | |
| TWI577803B (zh) | 多重抗藥性結核病篩檢方法及套組 | |
| KR101425149B1 (ko) | 원-튜브 네스티드 실시간 피시알을 이용한 개선된 결핵균 진단방법 | |
| Quan et al. | Development of one-tube multiplex polymerase chain reaction (PCR) for detecting Mycobacterium bovis | |
| JP7065976B2 (ja) | マルチコピー遺伝子を用いたツツガムシ病の診断方法 | |
| CN106834498A (zh) | 一种快速鉴定分枝杆菌的引物与方法 | |
| Nagdev et al. | Comparison of real-time PCR and conventional PCR assay using IS6110 region of Mycobacterium tuberculosis for efficient diagnosis of tuberculous meningitis and pulmonary tuberculosis | |
| CN105316350B (zh) | 结核分枝杆菌EmbB突变基因及其用途 | |
| RU2809735C1 (ru) | Способ определения бактерии вида Mycobacterium tuberculosis методом петлевой изотермической амплификации (LAMP) | |
| RU2819877C1 (ru) | Тест-система для экспресс-выявления и идентификации mycobacterium avium complex | |
| RU2409680C1 (ru) | Способ диагностики чувствительности штаммов mycobacterium tuberculosis к аминогликозидам | |
| Jabber Benellam et al. | Diagnosis of Mycobacterium tuberculosis using GeneXpert MTB/RIF and TB-LAMP techniques from pulmonary and extra-pulmonary TB patients in Iraq. Revis Bionatura 2022; 7 (2) 50 | |
| CN110938702B (zh) | 一种实时荧光pcr检测鸟分枝杆菌的方法及其应用 | |
| KR101106963B1 (ko) | Ｐ１ 유전자를 이용한 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 ｐｃｒ 프라이머와 프로브 및 이를 이용한 실시간 ｐｃｒ 방법 | |
| RU2689801C1 (ru) | Способ детекции штаммов Mycobacterium bovis BCG в формате реального времени | |
| CN108754003B (zh) | 基于颤杆菌预测艾滋病人haart治疗效果的引物 | |
| Forbes et al. | Molecular diagnosis of mycobacterial infections | |
| KR100985196B1 (ko) | 비결핵항산성균의 감별 방법 및 이를 위한 키트 | |
| WO2015083056A2 (en) | Genetic markers for diagnosis of tuberculosis caused by mycobacterium tuberculosis |