WO2019031920A1 - 결핵 진단용 키트 및 이를 이용한 결핵의 진단방법 - Google Patents

결핵 진단용 키트 및 이를 이용한 결핵의 진단방법 Download PDF

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WO2019031920A1
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tuberculosis
nucleic acid
kit
gene
primer
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박영석
황병오
권나영
장시운
신예은
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주식회사 팍스젠바이오
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a kit for diagnosing tuberculosis and a method for detecting tuberculosis using the same, and more particularly, to a tuberculosis diagnostic kit comprising (a) (i) specifically amplifying Mycobacterium tuberculosis- specific genes and genes commonly present in mycobacteria (B) a kit for simultaneously diagnosing Mycobacterium tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria including a probe capable of confirming the amplified product, and a method for simultaneously diagnosing Mycobacterium tuberculosis and non-tuberculosis mycobacteria using the same will be.
  • Tuberculosis is not only found in the lungs but also in the lymphatic system, kidneys, vertebrae, peritoneum, intestines and skin. It is a disease caused by Mycobacterium tuberculosis. Symptoms vary with fever, fatigue, and weight loss. Even today, many medical technologies are developing, Mycobacterium tuberculosis infections are frequent. In Korea, the incidence of tuberculosis is the highest among OECD countries.
  • tuberculosis About two-thirds of the world's population, estimated to be infected with tuberculosis, is estimated to be infected with 9 million new tuberculosis patients each year, and 3 million TB people die from tuberculosis (TB).
  • TB tuberculosis
  • Tuberculosis which has been regarded as a disease of the backward country, has emerged as a global health problem in recent years, largely due to the possibility of TB infection in patients with acquired immunodeficiency syndrome (ADIS) and the frequent exchange of international society by globalization of the global community. .
  • ADIS acquired immunodeficiency syndrome
  • tuberculosis In order to prevent the spread of tuberculosis, various approaches such as early diagnosis, appropriate antibiotic administration, isolation of patients, and regular screening for the groups with a high possibility of exposure to tuberculosis are needed. In particular, early and rapid diagnosis of HIV infection prevent tuberculosis death The most common method for the diagnosis of tuberculosis is X-ray chest radiography and acid-fast bacilli smear test, but the accuracy is 50-75% Which is very low and has a problem of sensitivity and reliability. Atypical mycobacterial pulmonary disease is similar to tuberculosis symptoms such as coughing and sputum, but it is not transmitted to other people and treatment method is totally different.
  • tuberculosis In the USA and Europe, Of the patients with tuberculosis who were infected with non-tuberculous mycobacterium were diagnosed as tuberculosis because they were classified as rare. In addition, some patients suffer from economic and psychological injuries, such as drug-resistant tuberculosis, which is not treated as the first-line drug, and have received a second anti-tuberculosis drug for several years. Therefore, additional tests such as nucleic acid amplification test or culture test are necessary even if the primary sputum smear test is positive.
  • an AFB staining test or a culture test may be considered.
  • the AFB staining method can detect rapid results with a simple method, but it has a low sensitivity and it is impossible to distinguish between mycobacteria and non - tuberculous mycobacteria.
  • the culture can be detected with a very small amount of Mycobacterium tuberculosis and the specificity is high.
  • Immunodiagnostic methods such as ELISA and rapid method (Rapid method) are used in addition to simple and convenient method, but it is somewhat difficult to detect a very small amount of Mycobacterium tuberculosis.
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCR-electrophoresis or real-time PCR is considered.
  • PCR method is fast and sensitive to detect a small amount of Mycobacterium tuberculosis.
  • PCR-electrophoresis requires agarose gel preparation to confirm the amplified gene as in conventional PCR, and real-time PCR requires expensive equipment There is a disadvantage that economical efficiency is low.
  • the inventors of the present application can simultaneously diagnose tuberculosis rapidly and accurately by diagnosing the genes for Mycobacterium tuberculosis and mycobacteria, and can diagnose tuberculosis by distinguishing it from non-tuberculous acid bacteria by only a small amount of sample gene Kits, and a method for simultaneous diagnosis of tuberculosis and non-tuberculosis antibiotics using the kit.
  • the present invention has been completed based on this finding.
  • Mycobacterium tuberculosis include a specific gene and specific nucleic acid oligomers containing complementary binding site, and M. tuberculosis-specific genes and emergency beam of the base to be combined with Primer;
  • a primer comprising a complementary binding site that specifically binds to a gene commonly present in mycobacteria, and a nucleic acid oligomer containing a gene commonly present in mycobacteria and an uncharacterized base;
  • a membrane that is complementary to the nucleic acid oligomer and has a probe immobilized thereon, and a kit for simultaneous diagnosis of tuberculosis and non-tuberculous acidosis.
  • the present invention also relates to a method for producing a nucleic acid comprising the steps of: (i) introducing a nucleic acid extracted from a specimen into a cell, which comprises (i) a nucleic acid oligomer containing a complementary binding site specifically binding to Mycobacterium tuberculosis- Primer and (ii) a primer comprising a complementary binding site that specifically binds to a gene commonly present in mycobacteria, and a nucleic acid oligomer containing a gene commonly present in mycobacteria and a non-complementary base Amplifying; And a step of loading the amplification product into a fixed membrane that binds the probe complementarily binding the nucleic acid oligomer to the tubing and non-tuberculosis in vitro using the kit according to any one of claims 1 to 16.
  • the present invention relates to a method for simultaneously diagnosing an autoimmune disease.
  • the present invention further relates to a method for producing a nucleic acid comprising the steps of: (i) introducing a nucleic acid extracted from a sample into a sample containing (i) a nucleic acid oligomer containing a complementary binding site specifically binding to Mycobacterium tuberculosis- Primer and (ii) a primer comprising a complementary binding site that specifically binds to a gene commonly present in mycobacteria, and a nucleic acid oligomer containing a gene commonly present in mycobacteria and a non-complementary base Amplifying; And
  • the present invention relates to a method for providing information for simultaneous diagnosis of mycobacteria.
  • FIG. 1 is a diagram showing a process of selecting a target region for a genome of a tuberculosis causative organism and a primer design process.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a strip for identifying an amplification product in a kit according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a reaction in a membrane to which a probe complementary to a nucleic acid oligomer contained in a kit according to an embodiment of the present invention is immobilized.
  • Fig. 4 shows the change of coloring position depending on the presence or absence of a tuberculosis causative gene.
  • FIG. 5 shows test results according to the negative or positive criteria for tuberculosis and non-TB.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • Real-time PCR Real-time PCR
  • Real-time PCR can monitor nucleic acid amplification of pathogens in real time, but the kit is expensive and it is difficult to confirm the result of amplification of more than 5 multiple nucleic acids. Accordingly, it is required to develop a low-cost molecular diagnostic product while maintaining the convenience of the user. Therefore, the inventors of the present application have developed an in vitro diagnostic kit for qualitative analysis.
  • a primer comprising (i) a complementary binding site which binds to a Mycobacterium tuberculosis- specific gene, and (ii) a nucleic acid oligomer containing a non-complementary base and a M.
  • tuberculosis-specific gene (ii) a primer comprising a complementary binding site which binds to a gene commonly present in mycobacteria, and a nucleic acid oligomer containing a gene and a non-complementary base which are common to mycobacteria; And (b) a membrane in which a probe that binds complementarily to the nucleic acid oligomer is immobilized, and a kit for simultaneous diagnosis of tuberculosis and non-TB disease.
  • the kit according to the present invention comprises a complementary binding site and a primer comprising a nucleic acid oligomer, wherein the primer comprises a complementary binding site specifically binding to a M. tuberculosis-specific gene and a gene commonly present in mycobacteria , A nucleic acid oligomer containing the M. tuberculosis-specific gene and a gene commonly present in the mycobacteria and a non-complementary base.
  • the primer comprises a complementary binding site specifically binding to a M. tuberculosis-specific gene and a gene commonly present in mycobacteria
  • a nucleic acid oligomer containing the M. tuberculosis-specific gene and a gene commonly present in the mycobacteria and a non-complementary base According to the present invention, it is possible to simultaneously diagnose the infection of Mycobacterium tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria.
  • the Mycobacterium bacterium-specific gene may be one or more genes that are specifically present in Mycobacterium tuberculosis, and preferably two or more Mycobacterium tuberculosis-specific genes.
  • Conventional diagnostic products for M. tuberculosis use only one type of M. tuberculosis-specific gene.
  • the present invention can provide a diagnostic method that can accurately diagnose Mycobacterium tuberculosis even if any one of two or more genes is deficient in a diagnostic target by simultaneously using two or more kinds of genes used for diagnosis of Mycobacterium tuberculosis.
  • the M. tuberculosis-specific gene may be IS6110 (SEQ ID NO: 14) and / or mtp40 (SEQ ID NO: 15), and by using IS6110 and mtp40 simultaneously, have.
  • non-tuberculous acute acidosis is not a tubercle bacillus, but a mycobacteria other than mycobacterium tuberculosis, which is similar to the tuberculosis bacteria, may remain in the bronchi and may cause symptoms such as cough and sputum and various inflammation in the lung.
  • the gene commonly present in the mycobacteria may be one or more genes specifically present in mycobacteria including Mycobacterium tuberculosis, for example, rpoB (SEQ ID NO: 16).
  • the kit according to the present invention is used to simultaneously amplify the two genes IS6110 and mtp40 present in Mycobacterium tuberculosis and the rpoB gene commonly present in mycobacteria including Mycobacterium bacillus to simultaneously isolate Mycobacterium tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria .
  • tuberculosis can be diagnosed by amplification of one or more of mtp40 and mtp40 and the rpoB gene. If only rpoB gene is amplified, it can be identified as non-tuberculous persistent bacillus. According to the present invention, it is possible to accurately diagnose the presence or absence of tuberculosis even in a mycobacteria lacking one gene.
  • primer refers to a single-stranded oligonucleotide capable of acting as a starting point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions (ie, four different nucleoside triphosphates and polymerization enzymes) within a suitable temperature and buffer .
  • the primer according to the present invention may include a Mycobacterium tuberculosis-specific gene or a fragment of a gene commonly present in mycobacteria.
  • the fragment may refer to any part of the M. tuberculosis-specific gene and the gene commonly present in the mycobacteria, and the fragment may have any length, for example, IS6110 and / or mtp40 and the rpoB gene, May refer to a region having a length of 5 bp to 50 bp, particularly 10 bp to 30 bp, for any site in the sequence.
  • 'complementary binding' means that a primer hybridizes with a corresponding nucleic acid strand under the conditions of performing a polymerization reaction, and can form a duplex structure. Complementarity can also be formed if the complementarity between the paired nucleotide sequences results in a Watson-Crick pair or in the presence of some non-Watson-Crick base pair.
  • the primer may be a forward primer, for example, a complementary binding site that specifically binds to the M. tuberculosis-specific genes IS6110 and / or mtp40 and the rpoB gene, which is a gene commonly present in mycobacteria.
  • the forward primer is IS6110, and / or if the mtp40 and M. gene of the rpoB gene template that exists in common to bacterial this by binding to complementary strand IS6110 and / or the rpoB gene mtp40 and the gene present in common to mycobacterial
  • the complementary sequence can be specifically amplified.
  • the primer can be selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 6.
  • the primer includes a nucleic acid oligomer containing a Mycobacterium tuberculosis-specific gene and a non-tuberculous antibiotic gene or fragment thereof and a non-complementary base.
  • the nucleic acid oligomer may be selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 9 to 11, for example.
  • Such a nucleic acid oligomer binds to a probe complementarily synthesized in the membrane with a non-envelope base moiety and a fragment of a Mycobacterium tuberculosis-specific gene and a non-TB nucleic acid, or a fragment thereof, in order to react with a probe complementarily synthesized in the membrane And a non-nucleotide spacer between the bases.
  • the non-nucleotide spacer can be a C3, C6, C9 or C12 aliphatic spacer, and the number of C means the number of carbon atoms in the spacer structure.
  • Such a spacer may be an alkyl, alkenyl, or acinyl group.
  • a non-nucleotide spacer is provided between the M. tuberculosis-specific gene and the non-tuberculous antibiotic gene or a fragment thereof and a base for binding a non-complementary base moiety and a probe complementarily synthesized to the membrane,
  • the gene is amplified using Taq polymerase by positioning C3 spacer (profile spacer)
  • complementary amplification can be prevented by invading the base part for binding with the probe so as to obtain a partial single strand nucleic acid product And this portion was allowed to bind the probe to the membrane.
  • the primer may further comprise a primer comprising a marker.
  • the primer comprising the marker may be a reverse primer, and the reverse primer may be used to amplify a template by binding to the template strand when the reverse primer is a template containing the gene rpoB , which is a gene commonly present in IS6110 and / or mtp40 and mycobacteria,
  • the primers may be selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1-6.
  • the primers included in the primers include but are not limited to biotin, Cy5, Cy3, FITC, EDANS (5- (2'- aminoethyl) amino-1-naphthalene sulfate), tetramethylrhodamine But are not limited to, rhodamine isocyanate (TMRITC), x-rhodamine, DIG or an antibody or nanoparticles associated therewith.
  • the binding agent may be streptavidin, but is not limited thereto.
  • biotin is attached to the reverse primer to amplify and bind to Streptavidine in the membrane.
  • Particles conjugated to biotin for example, nanoparticles.
  • fluorescence it can be confirmed by fluorescence of various wavelengths, and it is possible to distinguish whether amplification of the target nucleic acid is performed from several to dozens depending on the type of probe attached to the membrane.
  • the kit according to the present invention comprises (b) a membrane to which a probe that binds complementarily to the nucleic acid oligomer is immobilized. Accordingly, when the product amplified by the primer is injected into the side of the membrane, the amplified product moves, and the probe immobilized on the membrane and the nucleic acid oligomer contained in the amplified product can perform a complementary hybridization reaction.
  • the primers according to the present invention can be carried out by multiplex PCR, which makes it possible to simultaneously diagnose Mycobacterium tuberculosis and various kinds of non-tuberculous mycobacteria. That is, if multiple PCR reactions are carried out using probes with several to several tens of different oligomer sequences and then reacted with oligomer probes to which complementary probes can be reacted, Several hundreds of amplified products can be identified with the lateral flow membrane.
  • the probe that binds complementarily to the nucleic acid oligomer may include, for example, one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 9 to 12.
  • the probe may further comprise a nucleic acid oligomer for immobilization on the membrane, and may further comprise an oligomer of 20-60 bp, particularly 20-40 bp, having a repeated base sequence.
  • the additional nucleic acid oligomer may comprise, for example, the sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the kit according to the invention may optionally further comprise an internal control primer.
  • these internal control primers are used to confirm whether a false negative, that is, a PCR reaction is properly performed, and genes normally expressed can be arbitrarily selected regardless of the presence of mycobacteria or mycobacteria in the sample.
  • the internal control primer may comprise a sequence of SEQ ID NO: 7 or 8, for example a beta globin gene (SEQ ID NO: 17).
  • the kit according to the present invention may optionally contain a reagent necessary for conducting a nucleic acid amplification PCR reaction such as a polymerase, a buffer, and deoxyribonucleotide-5-triphosphate.
  • a reagent necessary for conducting a nucleic acid amplification PCR reaction such as a polymerase, a buffer, and deoxyribonucleotide-5-triphosphate.
  • the kit according to the present invention may further comprise various polynucleotide molecules, various buffers and reagents.
  • the optimum amount of the reagent, buffer or reagent used for the specific reaction in the kit can be determined by those skilled in the art, and can be determined by a combination of the aforementioned Mycobacteria-specific gene and complementary binding specifically binding to a gene commonly present in mycobacteria (Reverse direction) comprising a primer (forward direction) and / or (ii) a marker comprising a nucleic acid oligomer containing a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the M. tuberculosis-specific gene and a gene commonly present in the M. tuberculosis- And the membranes on which the probes are immobilized, may be fabricated in separate packages or compartments, each containing a separate package or compartment.
  • the present invention provides a primer comprising (i) a primer comprising a complementary binding site that specifically binds to a Mycobacterium tuberculosis gene, and a nucleic acid oligomer containing an M. tuberculosis-specific gene and an unacceptable base, and (ii) Amplifying with a primer comprising a complementary binding site that specifically binds to a gene commonly present in a mycobacteria and a nucleic acid oligomer that contains a gene commonly present in mycobacteria and an uncharacterized base; And a method for simultaneously diagnosing tuberculosis and non-tuberculosis acute mycobacteria in vitro using the kit, comprising loading the amplification product with a probe, which binds complementarily to the nucleic acid oligomer, on a fixed membrane.
  • a primer comprising a complementary binding site that specifically binds to a Mycobacterium tuberculosis gene, and a nucleic acid oligomer containing an M. tuberculosis-specific gene and a non-complementary base; and (ii) amplifying with a primer comprising a complementary binding site specifically binding to a gene commonly present in mycobacteria, and a nucleic acid oligomer containing a non-TBase antibiotic gene and an unreacted base; And loading the amplified product with a probe that binds complementarily to the nucleic acid oligomer on a fixed membrane.
  • the present invention also relates to a method for providing information for simultaneous diagnosis of tuberculosis and non-TB disease.
  • the specimen may comprise a wide range of all biological fluids obtained from body fluids, cell lines, tissue cultures, etc., depending on the diagnosis of tuberculosis and non-TB disease, But are not limited to, sputum, cultured specimens, tissue specimens, or bronchial washing solutions.
  • the step of extracting the nucleic acid from the specimen may further include the step of extracting the nucleic acid, for example, by using various kits or extracting reagents which are commercially available.
  • the kit according to the present invention (hereinafter also referred to as PaxView TB / NTM MPCR-ULFA Kit) comprises two kits. One is a kit for amplifying nucleic acid (hereinafter referred to as PaxView TB / NTM MPCR Kit), and the other is a kit for confirming amplification products (hereinafter referred to as PaxView ULFA Kit).
  • the principle of color development is based on the reaction between biotin and streptavidin tagged on each primer, and can be used for confirmation of DNA reaction as well as antigen-antibody reaction which is widely used.
  • Streptavidin similar to avidin, can form a complex with biotin, resulting in visible readability by gold particles bound to biotin.
  • the tuberculosis diagnostic kit (TB / NTM diagnostic kit) according to the present invention is a new tuberculosis diagnostic platform, which amplifies a gene using a gene extracted from a sample as a rapid and accurate qualitative molecular diagnostic kit, If the particles appear in the form of bands, they can be diagnosed as having TB and / or non-tuberculous antibiotics.
  • the PCR tubes were removed from the PCR instrument and lightly spun down.
  • the ULFA device in the PaxView ULFA Kit was withdrawn as much as the reaction quantity, and the solution was taken out together. 5 ⁇ l of the PCR reaction solution was dropped onto the square injection port at the bottom of the device, and immediately 50 ⁇ l of the developing solution was slowly dropped. After 10 minutes, 50 ⁇ l of wash solution was slowly dropped. The results were read within 20 minutes after the start of the test.
  • samples 5 to 7 show multiple infections depending on the specimen.
  • sample 8 one or more PCR amplification bands of TB and NTM of Mycobacterium tuberculosis were confirmed, but internal control IC) of the PCR amplification band is invisible. In this case, the PCR band of the internal control may not be visible. Therefore, the PCR amplification is judged to be positive for TB or NTM microorganisms.
  • sample 10 the internal control is not amplified. If the PCR inhibitor is present in the sample, DNA extraction should be repeated.
  • the kit according to the present invention makes it possible to diagnose tuberculosis with only a small amount of sample genes and diagnose by simultaneously amplifying the genes common to the Mycobacterium tuberculosis-specific gene and the mycobacteria to thereby diagnose the tubercle bacillus and the non- Make the diagnosis possible.
  • expensive equipment such as real-time PCR is not required, and an agarose gel for electrophoresis to identify amplified genes as in conventional PCR Because the manufacturing process is not required, results can be confirmed in a shorter time than the PCR-electrophoresis method.

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Abstract

본 발명은 결핵 진단용 키트 및 이를 이용한 결핵 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로 (a) (i) 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 특이적 유전자 및 마이코박테리아 (mycobacteria)에 공통으로 존재하는 유전자를 동시에 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머, 및 (b) 상기 증폭된 산물을 확인할 수 있는 프로브를 포함하는 결핵균 및 비결핵 마이코박테리아를 동시에 진단하기 위한 키트 및 이를 이용하여 결핵균 및 비결핵 마이코박테리아를 동시에 진단하는 방법에 관한 것이다.

Description

결핵 진단용 키트 및 이를 이용한 결핵의 진단방법
본 발명은 결핵 진단용 키트 및 이를 이용한 결핵 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로 (a) (i) 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 특이적 유전자 및 마이코박테리아 (mycobacteria)에 공통으로 존재하는 유전자를 동시에 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머, 및 (b) 상기 증폭된 산물을 확인할 수 있는 프로브를 포함하는 결핵균 및 비결핵 마이코박테리아를 동시에 진단하기 위한 키트 및 이를 이용하여 결핵균 및 비결핵 마이코박테리아를 동시에 진단하는 방법에 관한 것이다.
결핵은 폐 뿐만 아니라 림프선, 신장, 척추, 복막, 장, 피부 등에서도 발견되고 있다. 결핵균에 의해 야기되는 질병이며 증상은 발열, 피로, 체중감소 등으로 다양하다. 각종 의학기술이 발전하고 있는 오늘날에도 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)에 의한 감염은 빈번하게 있으며, 특히 한국은 한해 결핵의 발병률이 OECD 국가 중 1위를 차지하고 있다.
전세계 인구의 1/3에 해당하는 약 20억 명 가량이 결핵균에 감염되어 있는 것으로 추정되고 매년 9백만 명이 새로운 결핵 환자로 판명되고 3백만 명이 결핵(TB)으로 사망하는 것으로 보고되고 있으며 우리나라의 경우 2006년 통계자료에 의하면 전국 242개 보건소 및 민간 병·의원에서 새로이 결핵으로 진단되어 치료를 받게 된 환자가 3만5천명으로 인구 10만 명 당 67.2명에 달하며 또한 통계청 사망원인 조사에 따르면 결핵으로 사망한 사람이 2006년의 경우 2,948명으로 결핵사망률이 인구 10만 명 당 6.7명에 달해 감염성 질환에 의한 전체 사망자 가운데 55.7%를 차지하여 경제협력개발기구(OECD) 30개 회원국 중 1위에 오르는 매우 심각한 질병이다. 후진국성 질병으로 치부되어 왔던 결핵이 최근 들어 전세계적인 보건문제로 가시 부상하게 된 큰 이유는 크게 후천성면역결핍증(ADIS) 환자에게서 결핵균이 기회감염을 일으키는 것과 지구촌의 국제화로 인한 국제사회의 빈번한 교류를 들 수 있다.
결핵의 확산을 막기 위해서는 조기 진단, 적절한 항생제의 투여, 환자의 격리, 결핵 노출 가능성이 많은 집단에 대한 정기적 스크리닝 등 다양한 접근이 필요하며 특히 HIV 감염환자의 조기, 신속한 진단은 결핵으로 인한 사망을 방지하는데 매우 중요하며 결핵 진단을 위한 가장 보편적 방법으로는 X선 흉부촬영검사와 객담도말(acid-fast bacilli smear) 검사를 들 수 있으나 결핵과 비결핵 항산균을 구별할 수 없어 정확도가 50~75%로 매우 낮아 민감도와 신뢰도에 문제가 있다. 비결핵 항산균(atypical mycobacteria)에 의한 폐질환은 기침과 가래 등 결핵과 유사한 증상과 검사 결과를 보이지만 타인에게 전염되지 않고 치료방법도 전혀 다른 질병으로 미국이나 유럽에서는 1차 객담도말검사에서 양성반응이 나오더라도 추가정밀검사를 통해 결핵을 최종적으로 판정하고 있으나 국내의 경우 비결핵 항산균이 드문 지역으로 분류돼 이에 대한 2차 검사를 소홀히 하여 비결핵 항산균에 감염된 환자들이 결핵으로 오인돼 결핵치료를 받아 전염성 때문에 제약을 받는 등 불이익을 받아 일부 환자는 1차 약물치료가 되지 않는 약제내성 결핵으로 오인돼 수 년 동안 2차 항결핵제를 투여받는 등 경제적, 정신적 피해를 받는 사례가 증가하고 있다. 따라서, 1차 객담도말검사에서 양성반응을 보이더라도 핵산증폭검사 혹은 배양검사등의 추가 검사가 필요하나 배양검사의 경우 결핵균 배양만 4~8주가 소요되어 신속한 진단과 이에 따른 적절한 조기 치료가 어려운 실정임을 고려할 때 결핵의 조기 검진을 위해서는 AFB(acid-fast bacillus) 도말검사와 핵산증폭검사를 병행한 진단이 가장 이상적이고 미국을 비롯한 선진국에서 이를 법제화하고 있는 추세이다.
이와 같이 결핵은 치료상의 부작용과 전염과 같은 문제점이 있기 때문에 감염균에 대한 조기진단은 질병의 치료에 있어 매우 중요한 요소다. 따라서, 결핵을 조기진단 하기 위해 다양한 진단기법이 활발하게 개발 및 적용되고 있다.
이러한 결핵 진단과 관련하여, 항산균 도말 염색검사법 또는 배양 검사가 고려될 수 있다. 항산균 도말 염색검사법은 간단한 방법으로 신속한 결과를 확인할 수 있으나 민감도가 낮고 결핵균과 비결핵성 항산균과의 감별이 불가능한 단점이 있다. 배양 검사는 미량의 결핵균으로도 검출이 가능하고 특이도도 높게 나타나지만 결과 도출까지 장시간이 요구된다. 이외에도 방법이 간단하고 편리한 ELISA나 신속법 (Rapid법)과 같은 면역진단법이 사용되고 있으나 미량의 결핵균을 검출하기에는 다소 무리가 있다.
최근 PCR법과 같은 중합효소연쇄반응법(PCR, Polymerase Chain Reaction)이 결핵균 진단에 이용되고 있으며, PCR-전기영동법 또는 리얼 타임 PCR (real-time PCR)이 고려된다. PCR법은 빠르고 민감도가 높아 미량의 결핵균도 검출해낼 수 있으나, PCR-전기영동법은 종래의 PCR에서와 같이 증폭된 유전자 확인을 위해 아가로스젤 제조가 필수적이며, 리얼 타임 PCR은 고가의 장비가 필요해 경제성이 떨어지는 단점이 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 결핵균과 마이코박테리아에 대한 유전자를 동시에 진단함으로써 신속 정확하게 정성적으로 결핵을 진단할 수 있고, 미량의 검체 유전자만으로 비결핵 항산균과 구별하여 결핵의 진단이 가능한 키트 및 이를 이용한 결핵과 비결핵 항산균증의 동시 진단방법을 제공할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다. 또한 결핵균을 진단하는데 사용하는 유전자를 2종류, 즉 IS6110과 mtp40을 동시에 사용함으로써 두 유전자중 하나의 유전자가 결핍되더라도 결핵균을 정확히 진단할 수 있는 진단방법을 제공할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술에 대한 정보는 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 앞서 언급한 종래기술의 문제점을 인식하고, 종래에 비해 정확하면서도 비결핵 항산균증과 구별하여 정확하고 간단하게 결핵을 진단할 수 있는 결핵과 비결핵 항산균증의 동시 진단용 키트 및 이를 이용한 결핵과 비결핵 항산균증을 동시에 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) (i) 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 특이적 유전자와 특이적으로 결합하는 상보적 결합 부위 및 결핵균 특이적 유전자와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함하는 프라이머; (ii) 마이코박테리아 (mycobacteria)에 공통으로 존재하는 유전자와 특이적으로 결합하는 상보적 결합 부위 및 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함하는 프라이머; 및 (b) 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브가 고정된 멤브레인을 포함하는 결핵 및 비결핵 항산균증의 동시 진단용 키트 에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 검체에서 추출된 핵산을 (i) 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 특이적 유전자와 특이적으로 결합하는 상보적 결합 부위 및 결핵균 특이적 유전자와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함하는 프라이머 및 (ii) 마이코박테리아 (mycobacteria)에 공통으로 존재하는 유전자와 특이적으로 결합하는 상보적 결합 부위 및 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함하는 프라이머로 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브가 고정된 멤브레인에 로딩하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 키트를 이용하여 생체 외에서 결핵 및 비결핵 항산균증을 동시에 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이, 검체에서 추출된 핵산을 (i) 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 특이적 유전자와 특이적으로 결합하는 상보적 결합 부위 및 결핵균 특이적 유전자와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함하는 프라이머 및 (ii) 마이코박테리아 (mycobacteria)에 공통으로 존재하는 유전자와 특이적으로 결합하는 상보적 결합 부위 및 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함하는 프라이머로 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브가 고정된 멤브레인에 로딩하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 키트를 이용하여 생체 외에서 결핵 및 비결핵 항산균증을 동시진단에 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
도 1는 결핵 원인균 별 유전체 표적부위 선정 및 프라이머 디자인 과정을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 키트 중 증폭 산물을 확인하기 위한 스트립에 대한 모식도이다.
도 3는 본 발명의 일실시예에 따른 키트에 포함된 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브가 고정된 멤브레인 내의 반응 모식도이다.
도 4은 결핵 원인균 유전자의 유무에 따른 발색 위치 변화를 도시한 것이다.
도 5은 결핵 및 비결핵 항상균의 음성 또는 양성 판정 기준에 따른 테스트 결과를 도시한 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
분자진단 제품 중 중합효소 연쇄 반응기법(Polymerase Chain Reaction, PCR) 이용하는 제품은 크게 두 가지로 분류할 수 있다. 하나는 종래 PCR로, 검체로부터 핵산을 추출하여 표적핵산을 증폭한 후 전기영동을 통해 그 결과를 확인한다. 이 방법을 사용하게 되면 저렴한 가격의 키트를 구입할 수 있지만 전기영동에 많은 노동력과 시간이 소요된다. 전기영동을 대신하여 사용하는 리얼-타임 PCR (Real-time PCR) 기법은 병원균의 핵산 증폭을 실시간으로 모니터링 할 수 있지만 키트의 가격이 고가이고, 5개 이상의 다중 핵산 증폭 결과를 확인하기 어렵다. 이에, 사용자의 편리성을 유지하면서, 저가의 분자진단 제품 개발이 요구됨에 따라, 본 출원의 발명자들은 정성분석을 위한 체외 진단용 키트를 개발하였다.
이러한 관점에서, 본 발명은 (a) (i) 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 특이적 유전자와 결합하는 상보적 결합 부위 및 결핵균 특이적 유전자와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함하는 프라이머; (ii) 마이코박테리아 (mycobacteria)에 공통으로 존재하는 유전자와 결합하는 상보적 결합 부위 및 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함하는 프라이머; 및 (b) 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브가 고정된 멤브레인을 포함하는 것으로 결핵 및 비결핵 항산균증의 동시 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 키트는 상보적 결합 부위 및 핵산 올리고머를 포함하는 프라이머를 포함하고, 상기 프라이머는 결핵균 특이적 유전자 및 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자와 특이적으로 결합하는 상보적 결합 부위를 포함하며, 상기 결핵균 특이적 유전자 및 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함한다. 본 발명에 따르면, 결핵균 및 비결핵 항산균에의 감염 여부를 동시에 진단할 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 결핵균 특이적 유전자는 결핵균에 특이적으로 존재하는 1종 이상 또는 2종 이상의 유전자일 수 있으며, 바람직하게 2종 이상의 결핵균 특이적 유전자를 포함할 수 있다. 종래의 결핵균 진단 제품들은 1종의 결핵균 특이적 유전자만을 사용한다. 그러나, 본 발명은 결핵균을 진단하는데 사용하는 유전자를 2종 이상 동시에 사용함으로써, 진단 대상에서 2종 이상의 유전자 중 어느 하나의 유전자가 결핍되더라도 결핵균을 정확히 진단할 수 있는 진단방법을 제공할 수 있다. 상기 결핵균 특이적 유전자는 예를 들어 IS6110 (서열번호 14) 및/또는 mtp40 (서열번호 15)일 수 있으며, IS6110과 mtp40을 동시에 사용함으로써 두 유전자 중 하나의 유전자가 결핍되더라도 결핵균을 정확히 진단할 수 있다.
본 명세서에서 비결핵 항산균증은 결핵균은 아니나, 그와 유사한 균인 결핵균 제외 마이코박테리아가 기관지 내에 머물면서 기침, 가래 등의 증상과 폐 내에 각종 염증을 일으키는 질환을 의미할 수 있다. 상기 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자는 결핵균을 포함하는 마이코박테리아속에 특이적으로 존재하는 하나 이상의 유전자일 수 있으며, 예를 들어 rpoB (서열번호 16) 일 수 있다.
구체적 실시예에서, 본 발명에 따른 키트를 사용하여 결핵균에 존재하는 2종의 유전자 IS6110 및 mtp40과 결핵균을 포함하는 마이코박테리아속에 공통으로 존재하는 rpoB 유전자를 동시에 증폭시켜 결핵균과 비결핵 항상균을 구분할 수 있다. 진단 결과, 결핵균 특이적 유전자 IS6110 및/또는 mtp40 중 1 종 이상과 rpoB 유전자가 증폭되면 결핵으로 진단할 수 있고, rpoB 유전자만 증폭되는 경우 비결핵 항상균증으로 판별될 수 있다. 본 발명에 따르면 하나의 유전자가 결핍된 결핵균에서도 정확하게 결핵 여부를 진단할 수 있게 된다.
본 명세서에서 ‘프라이머’는 적합한 온도 및 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명에 따른 프라이머는 결핵균 특이적 유전자 또는 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자의 단편을 포함할 수 있다. 상기 단편은 결핵균 특이적 유전자 및 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자의 임의의 부위를 의미할 수 있고, 상기 단편은 임의의 길이를 가질 수 있으며, 예를 들어 IS6110 및/또는 mtp40와 rpoB 유전자 또는 이들 중 임의의 부위에 대한 5 bp 내지 50 bp, 구체적으로 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가지는 부위를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 ‘상보적 결합’은 중합반응을 수행하는 조건에서 프라이머가 대응하는 핵산 가닥과 하이브리다이제이션되는 것을 의미하고, 이합체(duplex) 구조를 형성할 수 있다. 상보적 결합은 쌍을 이루는 뉴클레오티드 서열 간의 상보성이 왓슨-크릭 결합(Watson-Crick pair)을 이루거나, 일부 비 왓슨-크릭 결합(Non-Watson-Crick base pair)이 존재하여도 형성될 수 있다.
상기 프라이머는 정방향 프라이머로, 예를 들어 결핵균 특이적 유전자인 IS6110 및/또는 mtp40와 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자인 rpoB 유전자에 특이적으로 결합하는 상보적 결합 부위를 포함할 수 있다. 상기 정방향 프라이머는 IS6110 및/또는 mtp40와 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자인 rpoB 유전자를 주형으로 하는 경우 이와 상보적 가닥에 결합하여 IS6110 및/또는 mtp40와 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자인 rpoB 유전자와 상보적 서열을 특이적으로 증폭할 수 있으며, 예를 들어 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 6로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 프라이머는 결핵균 특이적 유전자 및 비결핵 항산균 유전자 또는 그 단편과 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함한다. PCR을 이용하여 표적 유전자인 IS6110 및/또는 mtp40와 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자인 rpoB 유전자를 증폭할 때에 IS6110 및/또는 mtp40와 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자인 rpoB 유전자와 비상보적인 염기를 포함하는 핵산 올리고머 즉, IS6110 및/또는 mtp40와 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자인 rpoB 유전자와 관련이 없는 유전자로 약 20-60 bp, 구체적으로 20-40 bp, 바람직하게 약 20-30 bp를 포함할 수 있다. 이러한 핵산 올리고머를 멤브레인에 상보적으로 합성되어 있는 프로브와 반응시킴으로써 결과물 즉, 핵산 증폭 여부를 쉽게 확인할 수가 있다. 상기 핵산 올리고머는 예를 들어, 서열번호 9 내지 11으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
이러한 핵산 올리고머는 멤브레인에 상보적으로 합성되어 있는 프로브와 반응시키기 위하여, 결핵균 특이적 유전자 및 비결핵 항산균 유전자 또는 그 단편과 비상보적인 염기부분과 멤브레인에 상보적으로 합성되어 있는 프로브와 결합하기 위한 염기 사이에 비-뉴클레오티드 스페이서 (non-nucleotide spacer)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 비-뉴클레오티드 스페이서는 C3, C6, C9 또는 C12 지방족 스페이서일 수 있으며, C의 숫자는 스페이서 구조 중 탄소 원자의 숫자를 의미한다. 이러한 스페이서는 알킬, 아케닐, 아키닐기일 수 있다.
하나의 실시예에서, 결핵균 특이적 유전자 및 비결핵 항산균 유전자 또는 그 단편과 비상보적인 염기부분과 멤브레인에 상보적으로 합성되어 있는 프로브와 결합하기 위한 염기 사이에 비-뉴클레오티드 스페이서, 예를 들어 C3 스페이서 (프로필 스페이서)를 위치시켜 Taq polymerase를 이용하여 유전자를 증폭하였을 때 상보적인 증폭이 프로브와 결합하기 위한 염기부분을 침범하여 증폭되지 않도록 함으로써, 부분적인 단일가닥의 핵산 결과물을 확보할 수 있도록 하였고, 이 부분이 멤브레인에 프로브와 결합할 수 있도록 하였다.
상기 프라이머는 표지자를 포함하는 프라이머를 추가로 포함할 수 있다. 상기 표지자를 포함하는 프라이머는 역방향 프라이머로, 상기 역방향 프라이머는 IS6110 및/또는 mtp40와 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자인 rpoB 유전자를 주형으로 하는 경우 주형 가닥에 결합하여 주형을 증폭할 수 있으며, 예를 들어 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 6로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 프라이머에 포함된 표지자는 비오틴, Cy5, Cy3, FITC, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민, DIG 또는 항체 또는 이와 결합된 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
여기에, 표지자의 발색을 유도하는 결합제와 반응시켜 발색 또는 형광 발현 여부를 확인하고 표적 핵산의 증폭을 검출할 수 있다. 이 때, 상기 결합제는 스트렙타비딘일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적 실시예에서, 역방향 프라이머에 비오틴 (Biotine)을 부착시켜 증폭함으로써 멤브레인에서 스트렙타비딘 (Streptavidine)과 결합하게 되고, 비오틴에 접합 (conjugation)된 입자 예를 들어 나노입자의 성향에 따라서 골드 파티클인 경우에는 발색으로 확인이 가능하고, 형광일 경우는 다양한 파장대의 형광으로 확인할 수 있어서, 멤브레인에 부착된 프로브의 종류에 따라서 수개에서 수십개까지 동시에 표적 핵산의 증폭 여부에 대한 구분이 가능하다.
본 발명에 따른 키트는 (b) 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브가 고정된 멤브레인을 포함한다. 이를 통해, 상기 프라이머에 의해 증폭된 산물을 멤브레인 측면에 주입하면 증폭된 산물이 이동하면서 멤브레인에 고정된 프로브와 증폭된 산물에 포함된 핵산 올리고머가 상보적 혼성화 반응할 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머는 다중 피씨알 (multiplex-PCR)에 의해 수행될 수 있으며, 이는 결핵균 및 여러 종류의 비결핵 항산균을 동시에 진단하는 것이 가능하도록 한다. 즉, 수 개에서 수 십 개의 추가된 각기 다른 올리고머 시퀀스를 지닌 프로브로 다중 피씨알을 수행한 후, 이와 상보적으로 반응이 가능한 프로브가 결합된 올리고머 프로브와 반응이 가능하도록 사용하게 되면, 하나의 측면 흐름 멤브레인으로 수개에서 수십개의 증폭된 결과물을 확인할 수가 있다.
따라서, 다양한 다중 피씨알에 공동으로 사용할 수가 있어 측면 흐름 멤브레인의 생산시에 대량 생산이 가능하다. 이는 하나의 측면흐름 멤프레인을 사용하여 다양한 아이템의 결과물을 확인하는 것으로, PCR의 증폭 산물의 종류에 상관없이 동일한 멤브레인을 사용하여 증폭산물을 확인할 수 있기 때문에, 제품생산의 원가절감과 품질관리를 용이하게 하여 제품의 생산성을 높일 수 있게 한다.
상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브는 예를 들어, 서열번호 9 내지 12으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
경우에 따라서, 상기 프로브는 멤브레인에 고정화하기 위해 핵산 올리고머를 추가로 포함할 수 있으며, 반복되는 염기 서열을 가지는 20-60bp, 구체적으로 20-40bp의 올리고머를 추가로 포함할 수 있다. 이 때 상기 추가 핵산 올리고머는 예를 들어, 서열번호 13의 서열을 포함할 수 있다.
경우에 따라서, 본 발명에 따른 키트는 선택적으로 내부 대조 (internal control) 프라이머를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 내부 대조 프라이머는 위음성 문제, 즉 PCR 반응이 제대로 수행되었는지 여부를 확인하기 위한 것으로서, 시료 내 결핵균 또는 마이코박테리아의 존부와 상관없이 정상적으로 발현되는 유전자를 임의로 선택할 수 있다. 본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 상기 내부 대조 프라이머는 베타글로빈 유전자 (서열번호 17)로 예를 들어 서열번호 7 또는 8의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 경우에 따라, 중합효소, 버퍼, 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 핵산 증폭 PCR 반응을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 다양한 버퍼 및 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기 키트에서 특정 반응을 위해 사용되는 시약, 버퍼 또는 반응물의 최적량은 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 앞서 언급된 결핵균 특이적 유전자 및 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자와 특이적으로 결합하는 상보적 결합 부위 및 상기 결핵균 특이적 유전자 및 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함하는 프라이머 (정방향) 및/또는 (ii) 표지자를 포함하는 표지된 프라이머 (역방향), 및 프로브가 고정화된 멤브레인들은 각각을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, (i) 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 유전자와 특이적으로 결합하는 상보적 결합 부위 및 결핵균 특이적 유전자와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함하는 프라이머 및 (ii) 마이코박테리아 (mycobacteria)에 공통으로 존재하는 유전자와 특이적으로 결합하는 상보적 결합 부위 및 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함하는 프라이머로 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브가 고정된 멤브레인에 로딩하는 단계를 포함하는 상기 키트를 이용하여 생체 외에서 결핵과 비결핵 항산균증을 동시에 진단하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 검체에서 추출된 핵산을 (i) 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 유전자와 특이적으로 결합하는 상보적 결합 부위 및 결핵균 특이적 유전자와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함하는 프라이머 및 (ii) 마이코박테리아 (mycobacteria)에 공통으로 존재하는 유전자와 특이적으로 결합하는 상보적 결합 부위 및 비결핵 항산균 유전자와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함하는 프라이머로 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브가 고정된 멤브레인에 로딩하는 단계를 포함하는 상기 키트를 이용하여 결핵과 비결핵 항산균증의 동시 진단에 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법을 수행함에 있어 사용되는 키트와 관련된 구성에 대한 설명은 방법에도 동일하게 적용될 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 검체는 결핵 및 비결핵 항산균증의 진단에 따라 의심 환자 또는 진단 대상 개개인 또는 개개인 유래의 체액, 세포주, 조직 배양 등에서 얻어지는 폭넓은 범위의 모든 생물학적 체액을 포함할 수 있고, 예를 들어 객담, 배양검체, 조직검체 또는 기관지 세척액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 검체로부터 핵산을 추출하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 핵산의 추출은 예를 들어 상업화 되어 공급되고 있는 다양한 키트 또는 추출 시약을 사용하여 수행될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
1. 키트의 제작
본 발명에 따른 키트 (이하, PaxView TB/NTM MPCR-ULFA Kit로도 명명)는 두 개의 키트를 포함한다. 하나는 핵산을 증폭하는 키트 (이하, PaxView TB/NTM MPCR Kit)이고, 다른 하나는 증폭산물을 확인하는 키트 (이하, PaxView ULFA Kit)이다. PaxView TB/NTM MPCR Kit의 구성품인 프라이머 혼합물에 포함된 프라이머는 3종의 질환 원인균에 대한 부위와 내부 대조에 대한 부위 외에 정방향 프라이머 (Forward primer=SN)에는 비상보적 핵산 올리고머인 유니버셜 부위 (universal region)가, 역방향 프라이머 (Reverse primer=ASN)에는 비오틴 서열이 태깅 (tagging)되어 있다 (도 1).
PCR 후 증폭산물을 PaxView ULFA Kit의 ULFA 디바이스(예를 들어, 스트립: 도 2) 에 로딩하면 골드-스트렙타비딘 접합체 (Gold-streptavidin conjugate=Gold-SV, 글라스 파이버 (Glass fiber) 소재의 패드 (pad)에 존재)와 결합 후 NC 멤브레인 위에 흡착되어 있는 프로브 (probe = 유니버셜 부위 (universal region)에 상보적인 올리고)와 결합하여 각 병원균의 표시 부위에서 발색한다 (도 3).
발색 원리는 각 프라이머에 태깅된 비오틴과 스트렙타비딘의 반응법에 의한 것으로 많이 사용되고 있는 항원-항체 반응 외에 DNA 반응 확인에도 활용할 수 있다. 아비딘과 유사한 스트렙타비딘은 비오틴과 복합체를 형성할 수 있어 비오틴에 접합된 골드 입자 (gold particle)에 의해 육안으로 판독 가능한 발색이 일어난다.
발색 후 ULFA 디바이스를 육안으로 판독한다. 키트의 사용방법에 기재된 결과 판정에 따라 음·양성을 판정하며 질환 원인균의 유무에 따라 발색선의 위치가 달라지므로 예상 밴드 패턴과 실제 밴드 패턴이 일치함을 확인할 수 있다 (도 4).
본 발명에 따른 결핵 진단 키트 (TB/NTM 진단 키트)는 새로운 결핵 진단의 플렛폼으로, 신속 정확한 정성적 분자 진단 키트로써 검체로부터 추출한 유전자를 주형으로 하여 유전자를 증폭하고, ULFA에 전개하여 나타나는 나노 골드 입자가 밴드의 형태로 나타나게 되면 결핵균 및/또는 비결핵 항성균에 감염 여부를 진단할 수 있다.
2. 결핵 진단
(1) 시약 제조: PCR Master Mixture의 제조 및 조건
표 1의 프라이머를 이용하여, 2X PCR premix 10μl 당 Primer mix 5μl를 혼합하고, 필요한 만큼 PCR Master Mixture를 제조하였다 (표 2).
Figure PCTKR2018009184-appb-T000001
Figure PCTKR2018009184-appb-T000002
Master Mixture 15μl를 각각의 PCR 튜브에 분주하고 추출한 검체 DNA 또는 양성 대조군 (Positive control-키트 내 포함) 또는 음성 대조군 (Negative control-TE 완충액 또는 증류수, 키트 내 미포함) 5μl를 파이펫팅하여 잘 섞었다. 스핀-다운 (Spin-down)하여 유전자 증폭 장치에 넣어 반응시켰다 (표 3).
Figure PCTKR2018009184-appb-T000003
(2) PCR 결과 확인
PCR 과정이 완료되면 PCR 튜브를 PCR 장비에서 꺼낸 후 가볍게 스핀다운 (spin down) 하였다. 반응 수량만큼 PaxView ULFA Kit 내 ULFA 디바이스를 꺼내고 전개액을 함께 꺼냈다. 디바이스 하단의 정사각형 투입구에 5μl의 PCR 반응액을 떨어뜨리고, 바로 전개액 50μl를 천천히 떨어뜨렸다. 10분 후 세척액 50μl를 천천히 떨어뜨렸다. 검사 시작 후 20분 안에 결과를 판독하였다.
(3) 결과 판정
ULFA 디바이스에서 PCR 증폭 산물과 결합하는 프로브의 시퀀스는 표 4와 같으며, 이와 결합하여 반응이 나타나는 밴드의 결과를 육안으로 확인하여 음?양성을 판정하였다 (표 5 및 표6의 예시 참조).
Figure PCTKR2018009184-appb-T000004
Figure PCTKR2018009184-appb-T000005
Figure PCTKR2018009184-appb-T000006
표 5 및 표 6에서 시료 5 내지 시료 7의 경우 검체에 따라 다중 감염이 존재하는 경우를 나타내고, 시료 8은 TB와 NTM의 결핵균 중 한 가지 이상의 PCR 증폭 밴드는 확인되지만, 내부 대조 (Internal control: IC)의 PCR 증폭 밴드가 보이지 않는 경우로 이는 DNA가 많아 PCR 증폭량이 많은 경우이다. 이러한 경우에는 내부 대조 (Internal control)의 PCR 밴드가 잘 보이지 않는 경우가 있으므로, PCR 증폭이 확인된 TB 또는 NTM의 미생물에 대한 양성으로 결과 판정한다. 시료 10의 경우에는 내부 대조 (Internal control)가 증폭되지 않았을 경우로, 시료에 PCR 저해제가 있는 경우에 해당하며, 이 때는 DNA 추출을 다시 해야 한다.
본 발명에 따른 키트는 미량의 검체 유전자만으로 결핵 진단이 가능하도록 하고, 결핵균 특이적 유전자 및 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자를 동시에 증폭하여 진단함으로써, 결핵균과 비결핵 항산균을 신속 정확한 정성적 분자진단이 가능하도록 한다. 또한, 유전자 증폭 후 측면 흐름 어세이를 통해 결과를 확인하기 때문에 리얼 타임 PCR에서와 같은 고가의 장비가 요구되지 않아 경제적이고, 종래 PCR에서와 같이 증폭된 유전자를 확인하기 위한 전기영동용 아가로스젤 제조 과정이 요구되지 않기 때문에 PCR-전기영동법 보다 빠른 시간 내에 결과 확인이 가능하다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (18)

  1. (a) (i) 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 특이적 유전자와 결합하는 상보적 결합 부위 및 결핵균 특이적 유전자와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함하는 프라이머;
    (ii) 마이코박테리아 (mycobacteria)에 공통으로 존재하는 유전자와 결합하는 상보적 결합 부위 및 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함하는 프라이머; 및
    (b) 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브가 고정된 멤브레인을 포함하는 결핵 및 비결핵 항산균증의 동시 진단용 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 키트는 2종 이상의 결핵균 특이적 유전자를 동시에 진단하는 것을 특징으로 하는 키트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 결핵균 특이적 유전자는 IS6110 및 mtp40인 것을 특징으로 하는 키트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자는 rpoB인 것을 특징으로 하는 키트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 핵산 올리고머는 20-60bp의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 키트.
  6. 제1항에 있어서, 상기 상보적 결합 부위와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머의 사이에 비-뉴클레오티드 스페이서를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  7. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 6로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  8. 제1항에 있어서, 표지자를 포함하는 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 제7항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 7 또는 8인 것을 특징으로 하는 키트.
  10. 제1항에 있어서, 상기 프라이머에 의해 증폭된 산물을 멤브레인 측면에 주입하면 증폭된 산물이 이동하면서 멤브레인에 고정된 프로브와 증폭된 산물에 포함된 핵산 올리고머가 상보적 혼성화 반응하는 것을 특징으로 하는 키트.
  11. 제1항에 있어서, 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브는 서열번호 9 내지 11로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  12. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 멤브레인에 고정화하기 위해 핵산 올리고머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 추가 핵산 올리고머는 서열번호 12 또는 13의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  14. 제8항에 있어서, 상기 표지자는 비오틴, Cy5, Cy3, FITC, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민, DIG 또는 항체 또는 이와 결합된 나노입자인 것을 특징으로 하는 키트.
  15. 제8항에 있어서, 상기 표지자와 결합제의 반응에 의해 발색이 유도되는 것을 특징으로 하는 키트.
  16. 제15항에 있어서, 상기 결합제는 스트렙타비딘인 것을 특징으로 하는 키트.
  17. 검체에서 추출된 핵산을 (i) 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 특이적 유전자와 결합하는 상보적 결합 부위 및 결핵균 특이적 유전자와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함하는 프라이머 및 (ii) 마이코박테리아 (mycobacteria)에 공통으로 존재하는 유전자와 특이적으로 결합하는 상보적 결합 부위 및 마이코박테리아에 공통으로 존재하는 유전자와 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머를 포함하는 프라이머로 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브가 고정된 멤브레인에 로딩하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 키트를 이용하여 생체 외에서 결핵 및 비결핵 항산균증을 동시에 진단하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 검체는 객담, 배양물, 조직 또는 기관지 세척액인 것을 특징으로 하는 방법.
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