KR102617096B1 - 결핵균 검출 및 약제 내성 여부 확인을 위한 유전자 증폭용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

결핵균 검출 및 약제 내성 여부 확인을 위한 유전자 증폭용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 결핵균 검출 및 약제 내성 여부 확인을 위한 유전자 증폭용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, hsp65, embA, thyA 및 esxB(Rv3874) 유전자를 각각 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유전자 증폭용 조성물은 결핵균 검출 및 비결핵 항산균의 혼재 여부 확인 및 결핵균의 주요 약물 내성에 관한 정보를 동시에 확인할 수 있어, 검체로부터 약제 내성검사를 위한 분리배양에 걸리는 시간을 단축시키고, 다수의 검체를 대상으로 한 다제내성 및 광범위내성 결핵균의 효율적인 약제감수성검사가 가능하며, 이는 결핵환자의 치료에 있어 올바르고 빠른 항결핵제 선택을 할 수 있도록 하여 조기 치료와 감염 확산을 방지할 수 있어 유용하다.

Description

결핵균 검출 및 약제 내성 여부 확인을 위한 유전자 증폭용 조성물 및 이의 용도 {Composition for detecting MTB complex and resistance by Amplifying genes and Uses thereof}
본 발명은 결핵균 검출 및 약제 내성 여부 확인을 위한 유전자 증폭용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, hsp65, embA, thyA 및 esxB(Rv3874) 유전자를 각각 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
결핵은 결핵환자가 기침을 할 때 나오는 비말핵에서 검출되는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 의해 감염되는 소모성 만성 질환으로, WHO의 보고서에 의하면 현재 결핵균에 감염되어 있는 사람은 전세계 인구의 3분의 1에 해당하는 약 20억 명에 이르며, 이들 감염자 중에서 매년 1000만 명의 새로운 결핵 (Tuberculosis, TB) 환자와 160만명의 사망자가 발생하는 것으로 알려져 있다(www.who.int/gtb /publications/globrep).
결핵의 진단방법으로는 투베르쿨린 반응, 흉부 X-선 촬영, ROREKA 도말 검사 또는 면역학적 검사에 의하여 진단한다. 현재 결핵을 진단하는 중합효소 연쇄반응(PCR) 방법에서는 여러 종류의 유전자 부위를 사용하고 있는데 일반적으로 IS6110, rpoB gene, hsp65 유전자 등이 이용되고 있다.
결핵 관리 프로그램으로 결핵의 유병율과 신환자 발생은 조금씩 감소하고 있으나 내성결핵의 비율은 증가하는 추세이다. 난치성 결핵균의 내성 여부를 신속하게 판별하여 적절한 치료를 시행하는 것이 치료 실패를 막고 내성결핵균의 확산을 막는데 중요하다.
항결핵제에 감수성인 결핵의 치료는 1차 항결핵제인 리팜핀(rifampin, RIF), 아이소니아지드(isoniazid, INH), 에탐부톨(ethambutol, EMB), 피라지나마이드(pyrazinamide, PZA)의 복합제재가 사용되며, 이중 리팜핀, 아이소니아지드 두가지 약제 이상에 내성을 갖는 경우, 다제내성결핵(Multidrug resistant-tuberculosis, MDR-TB)으로 정의하고 있다. MDR-TB인 경우 2차 항결핵제로 퀴놀론계(fluoroquinolones, FQ)약제와 2차 주사제(Secondline injectable drugs(SLID); Amikacin, kanamycin, 본 발명에 따른 유전자 증폭용 조성물은 결핵균 검출 및 비결핵 항산균의 혼재 여부 확인 및 결핵균의 주요 약물 내성에 관한 정보를 동시에 확인할 수 있어, 검체로부터 약제 내성검사를 위한 분리배양에 걸리는 시간을 단축시키고, 다수의 검체를 대상으로 한 다제내성 및 광범위내성 결핵균의 효율적인 약제감수성검사가 가능하며, 이는 결핵환자의 치료에 있어 올바르고 빠른 항결핵제 선택을 할 수 있도록 하여 조기 치료와 감염 확산을 방지할 수 있어 유용하다.
2017년 WHO 보고에 따르면 새로운 결핵 환자의 5.8%인 600,000명에서 다제내성결핵이 확인되었다. 또한 다제내성결핵 환자의 9.7%가 광범위내성 결핵으로 보고되었다(WHO. Global TB report 2017).
리팜핀은 RNA 중합효소의 베타 소단위체에 결합하여 전사를 방해하는 역할을 한다. 리팜핀의 결합부위에 해당하는 유전자에 내성이 발생하면 내성을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 리팜핀에 내성을 갖는 결핵균의 95% 이상이 리팜핀 내성 결정 부위라고 알려진 rpoB 유전자의 81 염기쌍 부위에 돌연변이가 일어나 있다(Ramaswamy S, et al., Tuber Lung Dis. Vol.79. pp.3-29, 2015.).
리팜핀과 함께 일차치료약제로 사용되는 아이소니아자이드에 대한 결핵균의 내성은 더 복잡하고 다양한 유전자들의 돌연변이로 인해 발생한다. 가장 돌연변이가 빈번하게 일어나는 대표적인 유전자는 katG와 inhA 이다(Laurenzo D, et al., Acta Trop. Vol. 119, pp. 5-10, 2011]. 전세계적으로 아이소니아지드 내성 결핵균의 64%에서 katG 유전자 315 부위에 돌연변이가 발생하였으며, 19%에서 inhA 유전자 -15 부위에 돌연변이가 발생하였다(Seifert M, et al., PLoS ONE. Vol. 10(3), e0119628. 2015).
embB 유전자의 306 코돈에 돌연변이는 에탐부톨 약제내성균과 더불어 감수성인 균에서도 306 코돈 돌연변이가 확인되기도 하나, 에탐부톨 내성균에서의 돌연변이 비율이 감수성일 때보다 2배이상 높으며 최근에는 다제내성결핵균에서 embB 306 코돈 돌연변이의 비율이 점차 높아지는 것으로 보고되고 있다[Li-li Zhao, et al., Antimicrob Agents Chemother, Vol. 59(9), pp. 5455-5462. 2015].
결핵치료의 2차 약제로는 대표적으로 퀴놀론계 항생제가 사용된다. 퀴놀론계 항생제의 표적 부위는 결핵균의 DNA gyrase 로, DNA gyrase 를 구성하는 소단위체 A, B를 암호화하고 있는 유전자인 gyrA, gyrB 의 퀴놀론 내성 결정 부위에 돌연변이가 발생하게 되면 퀴놀론계 항생제에 대한 내성을 갖게 된다(Maruri F, et al., Antimicrob Agents Chemother. Vol. 56(4), pp.1990-6, 2012).
퀴놀론계 항생제 내성을 보이는 결핵균의 50-90%는 gyrA 유전자에 돌연변이가 발생하였다고 보고되었으며(Xu P, et al, PLoS Med. Vol. 10(2), e1001387, 2013), gyrA의 퀴놀론 내성 결정부위(QRDR; Quinolone resistance-determining region)에 돌연변이 발생 시, 퀴놀론 약제에 대한 내성을 나타내는 것으로 보고되었다. 이중 가장 돌연변이 발생빈도가 높은 부위는 아미노산 94번으로 알려져 있으며, 그 외 88, 89, 90, 91에서의 돌연변이가 보고되어 있다(Yin X, Yu Z. J Infect Vol. 61, pp. 150-154, 2010).
gyrB 유전자에 돌연변이 또한 퀴놀론계 항생제에 내성을 보이는 결핵균에서 발견되고 있으며, 주로 코돈 500과 538부위에 돌연변이가 발생한다(Maruri F, et al., J Antimicrob Chemother. Vol. 67(4), pp. 819-31, 2012).
2차 주사제(SLID; AMK, KM, CAP) 내성 결핵균은 rrs 유전자 내 1401, 1402, 1484번 염기에 돌연변이 발생과 연관되어 있는 것으로 보고되었으며, 최근에는 eis promoter 의 돌연변이가 KM 내성발생과 연관하는 것으로 보고되었다(Georghiou, M. et a., American Society for Microbiology, Vol. 60, pp. 3994-4004, 2016).
가장 많이 보고 되는 rrs A1401G 변이는 SLID 내성 결핵균 중 30-90%를 차지하고 있고 알려져 있으며, 아미카신, 카나마이신, 카프레오마이신 내성과 관련되어 있음이 보고되었다(Angkanang Sowajassatakul, et al., BMC Microbiol. Vol. 14, pp. 165, 2014).
스트렙토마이신(Streptomycin, SM)은 결핵치료의 2차 주사제에 포함되지는 않으나, 아미노글라이코사이드계 항생제로 amikacin, kanamycin에 내성이 있고 SM에 감수성인 경우, 대체 치료제로 사용되고 있다. rpsL 유전자의 43, 88 codon에 돌연변이 발생 시와 rrs 유전자의 530 loop 부위의 돌연변이 발생 시 SM 내성이 보고되었다. 그러나 같은 aminoglycoside 계열인 amikacin, kanamycin 내성과는 교차반응이 없는 것으로 알려져 있다(Li-li Zhao et al., Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, Vol. 83(2), pp. 150-153, 2015).
현재 표준방법으로 사용되고 있는 결핵균 약제 감수성 검사는 배양을 기반으로 한 방법이다. 배양 방법 중 고체 배지를 기반으로 하는 약제 감수성 검사는 최소 4주에서 최대 8주까지의 시간이 걸리는 단점이 있어, 최근에는 검사시간을 감축하기 위해 액체배지를 이용한 약제 감수성 검사법이 시도되고 있다. 하지만 액체배지 약제 감수성 검사법은 시행하는데 있어 검사실 별로 제약이 있으며, 2차 약제에 대한 검사결과의 신뢰도가 낮다는 한계가 있다(Kang YA. J Korean Med Assoc. Vol. 57(1), pp. 27-33, 2014)
내성결핵균에 의한 치료지연은 내성결핵균의 지역 감염확산으로 이어지므로, 초기 결핵진단 시 결핵균의 내성 여부를 판단하는 것은 매우 중요하며, 이에 최근에는 분자생물학적 검사방법에 기반한 약제감수성 검사의 개발되고 사용이 증가하고 있고, WHO에서는 분자생물학적 기반의 신속 내성진단법을 이용한 빠른 검사와 이에 따른 치료 시작을 권장하고 있다(WHO, Guidelines for treatment of drug-susceptible tuberculosis and patient care. 2017). 반면, 현재 알려져 있는 항결핵약제별 내성유발 유전자의 종류 및 돌연변이의 수가 다양해 기존의 PCR, Line probe assay, real-time PCR 등의 방법으로는 한번에 검사를 진행하기가 용이하지 않다.
대한민국 특허 제10-2030005호에서는 결핵균의 진단과 약제 내성을 동시에 진단하기 위해 QuantaMatirx assay platform을 이용한 프라이머 및 프로브 세트를 기재하고 있으나, 상기 방법은 형광 프로브 기반의 방법으로 정해진 수의 약제 내성과 결핵균의 진단만 가능하다는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 결핵균 진단과 약제 내성 여부 확인을 동시에 고속 대용량으로 진행할 수 있는 조성물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, hsp65, embA, thyA 및 esxB(Rv3874) 유전자를 각각 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 하나의 튜브에서 증폭한 다음, 분석할 경우, 샘플의 결핵균 감염여부와 약제 내성 여부를 빠른 속도와 함께 높은 민감도와 정확도로 결정할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 민감도와 정확도가 향상된 ahpC, rpoB, embB, pncA, rrs, gidB, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, fgd1, hsp65, embA, thyA 및 esxB(Rv3874) 유전자를 각각 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 결핵균 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, embA, 및 thyA 유전자를 각각 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 결핵균 약물 내성 확인용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, hsp65, embA, thyA 및 esxB(Rv3874) 유전자를 각각 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 결핵균 검출 및 약물 내성 확인용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 결핵균 검출용 조성물을 이용한 결핵균 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 결핵균 약물 내성 확인용 조성물을 이용한 결핵균 약물 내성 확인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 결핵균 검출 및 약물 내성 확인용 조성물을 이용한 결핵균 검출 및 약물 내성 확인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 결핵균 검출용 조성물을 포함하는 결핵균 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 결핵균 약물 내성 확인용 조성물을 포함하는 결핵균 약물 내성 확인용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 결핵균 검출 및 약물 내성 확인용 조성물을 포함하는 결핵균 검출 및 약물 내성 확인용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은
ahpC, rpoB, embB, pncA, rrs, gidB, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, fgd1, hsp65, embA, thyA 및 esxB(Rv3874) 유전자를 각각 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 결핵균 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, embA, 및 thyA 유전자를 각각 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 결핵균 약물 내성 확인용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, hsp65, embA, thyA 및 esxB(Rv3874) 유전자를 각각 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 결핵균 검출 및 약물 내성 확인용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 생체시료에서 핵산을 추출한 다음, 상기 결핵균 검출용 조성물을 이용하여 서열정보를 수득하는 단계; (b) 수득한 유전자들의 서열정보 중, hsp65 유전자의 서열정보를 Genebank 에 등록된 결핵균의 참조 서열과 비교하여 상동성이 100%일 경우, M. Tuberculosis로 동정하는 단계; 및 (c) 수득한 유전자들의 서열정보 중, ahpC, rpoB, embB, pncA, rrs, gidB, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, fgd1, embA 및 thyA 유전자의 변이를 확인한 다음, 하기 표 11의 기준에 따라 결핵균의 계열(lineage)을 동정하는 단계; 를 포함하는 결핵균 검출 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 생체시료에서 핵산을 추출한 다음, 상기 결핵균 약물 내성 확인용 조성물을 이용하여 서열정보를 수득하는 단계; 및 (b) 수득한 inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, embA, 및 thyA 유전자의 서열정보에서, 변이를 확인한 다음, 표 10의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 변이가 존재할 경우, 각 유전자에 대응하는 약물에 내성이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 결핵균의 약물 내성 확인 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 생체시료에서 핵산을 추출한 다음, 상기 결핵균 검출 및 약물 내성 확인용 조성물을 이용하여 서열정보를 수득하는 단계; (b) 수득한 유전자들의 서열정보 중, hsp65 유전자의 서열정보를 Genebank 에 등록된 결핵균의 참조 서열과 비교하여 상동성이 100%일 경우, M. Tuberculosis로 동정하는 단계; (c) 수득한 유전자들의 서열정보 중, ahpC, rpoB, embB, pncA, rrs, gidB, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, fgd1, embA 및 thyA 유전자의 변이를 확인한 다음, 하기 표 11의 기준에 따라 결핵균의 계열(lineage)을 동정하는 단계; 및
(d) 수득한 유전자들의 서열정보 중, inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, embA, 및 thyA 유전자의 서열정보에서, 변이를 확인한 다음, 하기 표 10의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 변이가 존재할 경우, 각 유전자에 대응하는 약물에 내성이 있는 것으로 결정하는 단계;
를 포함하는 결핵균의 약물 내성 확인 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 유전자 증폭용 조성물은 결핵균 검출 및 비결핵 항산균의 혼재 여부 확인 및 결핵균의 주요 약물 내성에 관한 정보를 동시에 확인할 수 있어, 검체로부터 약제 내성검사를 위한 분리배양에 걸리는 시간을 단축시키고, 다수의 검체를 대상으로 한 다제내성 및 광범위내성 결핵균의 효율적인 약제감수성검사가 가능하며, 이는 결핵환자의 치료에 있어 올바르고 빠른 항결핵제 선택을 할 수 있도록 하여 조기 치료와 감염 확산을 방지할 수 있어 유용하다.
도 1은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 유전자 증폭 및 분석과정을 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물의 NGS 서열 데이터의 퀄리티를 확인한 결과로서 (A)는 타겟별 커버리지와 평균 깊이, (B)는 타겟별 커버리지를 나타낸 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서의 용어 “NGS”는 Next Generation Sequencing을 의미하는 것으로, 차세대 시퀀싱, 차세대 염기서열 분석을 의미하기도 한다. 이는 전장유전체(Whole genome)를 조각 내고, 상기 조각을 화학적인 반응(hybridization)에 기초하여 대용량으로 시퀀싱을 수행하거나, multiplex PCR로 표적 유전자 영역들을 증폭 시켜 대용량으로 시퀀싱을 수행하는 기술을 의미하고, Agilent, Illumina, Roche 및 Life Technologies사의 기술을 포함하고, 넓은 의미로는 제3세대 기술인 Pacificbio사의 기술, Nanopore Technology 등의 기술 및 제 4세대 기술을 포함하는 것으로 정의한다.
본래 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing, NGS)으로 지칭되는 기술은 자동화로는 제2세대 기술에 해당된다. NGS는 이전의 첫 자동화 기기와 구분하고, 이후에 탄생한 Next NGS 기기(차차세대, 혹은 제3세대 NGS라고도 지칭됨)와 따로 구분하기 위하여 불리는 이름이다. 그러나, 효율적인 염기서열 분석 기술의 개발경쟁이 가속화되고 새로운 기술의 도입 및 플랫폼의 사용 목적에 기초한 염기서열 분석 기술이 지속적으로 개발됨에 따라, 각 세대의 염기서열 분석기술은 그 구분이 모호해지고, NGS는 자동화된 생어 염기서열 분석기술 이후의 염기서열 분석기술을 모두 아우르는 광의의 의미로 사용되고 있다.
NGS에 도입된 기술은 크게 클론 증폭(clonal amplification), 대량병렬법(massively parallel), 바로 읽을 수 있는 새로운 염기서열결정법(비 Sanger법)(base/color calling) 등 3가지로 나눌 수 있다. 클론 증폭은 라이브러리(library) 구축과정을 제거하여 클로닝 과정이 제거되는 효과를 가지며, 대량병렬법은 동시에 수십만 개의 클론을 취급하므로 효율이 향상된다. 바로 읽을 수 있는 새로운 염기서열결정법은 모세관 전기영동 과정이 제거된 효과를 나타낸다.
클론 증폭(clonal amplification)에 의해 주형 clone을 얻는 과정이 단순화되었다. Sanger법으로 시퀀싱을 하려면 약 500염기쌍의 길이를 가진 주형 DNA가 필요하다. BAC library를 구축한 후 subcloning을 통해서 짧은 단편을 cloning한 다음 bacteria에서 증폭해야 한다. 새로운 방법은 번거로운 library 구축과 cloning 과정을 모두 없애고 DNA를 바로 적절히 짧은 단편으로 자른 다음 프라이머를 이용하여 PCR로 바로 증폭하여 주형 clone을 얻을 수 있게 한다. 클론 증폭에는 비드 기반(bead-based), 솔리드-스테이트(solid-satate), DNA 나노볼 생성(DNA nanoball generation)과 같은 전략들이 사용된다.
비드 기반의 클론 증폭의 경우, 에멀젼 PCR을 이용한다. 에멀전 PCR은 게놈 DNA를 단편화(fragmentation)하여 얻은 집합체인 DNA 라이브러리(DNA library)를 기름 속에서 작은 수용액 방울로 공간적으로 분리(separation)한 다음 한쪽 PCR primer가 표면에 수식된 미세비드와 함께 유탁액(emulsion)안에서 증폭한다. 이렇게 만들어진 한 개의 비드에 하나의 단일 DNA 단편에서 유래한 100만개 이상의 클론 DNA 조각이 고정되어 있게 하는 방법이다. 솔리드 스테이트 방법에는 대표적으로 브릿지-증폭방법(Bridge-amplification)이 있다. 브릿지-증폭방법은 단편화한 DNA의 양 말단에 어댑터 올리고뉴크레오타이드(adaptor oligonucleotide)를 연결시킨 후, 이를 glass flow cell의 표면에 흘려주면 표면에 고정된 어댑터와 상보적인 primer에 무작위로 결합된다. 이 상태에서 PCR을 행하면 주변에 존재하는 free primer에 고정된 DNA의 자유 말단이 결합되어 브릿지 형태를 이루고 증폭이 진행된다. 이렇게 증폭이 진행을 하면 상기 비드와 동일한 역할을 하는 클러스터(cluster)가 형성된다.
NGS는 대량병렬(massively parallel) 방식을 도입하여 상기 클론들을 판상으로 배치하여 염기서열 분석을 진행한다. 주형 clone은 숫자가 매우 많아서 이를 따로 준비하면 시간이 많이 소요된다. 주형에서 염기서열신호를 읽어내는 과정도 효율을 떨어뜨리는 심각한 제한요인이 된다. 수십만 개의 다른 clone을 대량병렬 방식으로 처리하면 시간을 획기적으로 단축할 수 있다.
번거로운 전기영동 과정을 없애기 위해서 주형에 반응을 일으킨 다음, 반응에서 나오는 시그널로 각 주형의 서열정보를 바로 읽는 Sanger법을 탈피한 새로운 방법이 개발되었다. Sanger법을 대체하는 염기서열 결정법은 크게 DNA 결찰(ligation)을 통한 서열 분석 방법(Sequencing By Ligation, SBL)과 중합을 통한 서열 분석 방법(Sequencing By Synthesis, SBS)으로 나뉜다.
SBL방식은 DNA단편의 반복적인 결찰(ligation)을 이용하는 것으로 주형 DNA에 n개의 염기를 갖는 앵커가 상보적으로 결합되며, 형광라벨로 표지 되는 2개의 무작위적으로 인코딩된 염기(encoded base)와 그 뒤에 따라오는 퇴화염기 또는 범용염기(degenerate or universial bases)를 갖는 프로브가 상기한 비드 나 클러스터가 침전된 DNA 라이브러리 슬라이드에 추가된다. 앵커의 바로 뒤에 따라오는 주형 DNA 단편과 상보적인 2개의 엔코딩된 서열을 가지는 프로브가 앵커에 라이게이션되고, 슬라이드의 형광라벨 이미징을 통해 2개의 인코딩된 염기서열을 분석한다. 2개의 서열이 분석되면 퇴화염기서열과 형광입자는 제거 된 후 프로브를 추가하는 상기 과정을 반복한다. 상기한 n의 앵커 외에 n+2, n+4의 염기를 갖는 앵커를 이용 및 반복적으로 분석하여 전체 주형 DNA단편의 서열을 분석하는 방법이다.
SBS는 다시 사이클릭 리버서블 터미네이션 방식(Cyclic Reversible Termination, CRT)과 단일 뉴클레오타이드 추가 방식(Single Nucleotide Addition, SNA)으로 구분된다.
CRT방식은 자동화된 Sanger 방식과 유사한 과정을 이용하는데, 솔리드 스테이트 방법을 이용해 증폭된 DNA 클러스터를 갖는 슬라이드에 프라이머, DNA 중합효소, 변형 뉴클레오타이드 혼합물을 추가한다. 상기 변형 뉴클레오타이드는 추가적인 중합과정이 일어날 수 없도록 3`-O-아지도메틸(3`-O-azidomethyl)로 차단되며 각 베이스 특유적인 그리고 추후 제거가능한 형광라벨로 표지 된다. 중합 후 중합되지 않은 베이스는 씻어내고 총 내부 반사형 형광체(total internal reflection fluorescence, TIRF) 현미경을 이용하여 이미징을 통해 염기를 식별한다. 염기가 식별되면, 형광라벨은 분해되고 3′-OH는 환원제 Tris 2-Carboxyethyl)phosphine (TCEP)으로 재생된다. 이러한 과정을 반복하여 전기영동 없이 주형 DNA의 서열을 분석하는 방식이다.
SNA방식은 DNA 중합효소가 단일 뉴클레오타이드를 붙일 때 생성되는 이온등을 빛으로 전환하여 염기서열을 분석하는 방식이다. SNA방식은 Roche사의 454기기가 이용하는 파이로시퀀싱 방법으로 대표되는데, 이는 뉴클레오타이드가 결합할 때 방출되는 이인산(pyrophosphate)를 빛으로 읽어내는 방식이다. 4가지의 dNTP(A, G, T, C)를 순차적으로 넣어서 반응시키고 씻어내기를 반복하면 중합반응이 될 때마다 빛을 발산하므로 이를 통해 염기서열을 알아내는 방식이다.
SBL을 이용한 대표적인 분석기기로는 구 Life Technologies사의 SOLiD 시리즈가 있으며, SBS를 이용한 대표적 분석기기로는 Illumina사의 Hiseq 시리즈(CRT 방식), Roche사의 454 시리즈(SNA 방식)가 있다.
본 발명에서는 결핵균과 비결핵 항산균을 구분함과 동시에 약제 내성 여부를 높은 민감도와 정확도로 판별하기 위해, 정확하고 충분한 양의 증폭산물을 수득할 수 있는 조성물을 설계하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, hsp65, embA, thyA 및 esxB(Rv3874) 유전자를 하나의 튜브에서 모두 증폭한 다음, NGS 방법으로 분석한 결과, 높은 민감도와 정확도로 각 유전자의 SNP 또는 결실(deletion)을 확인할 수 있어, 결핵균과 비결핵 항산균의 구분 및 동정과 결핵균의 약물 내성을 검출할 수 있다는 것을 확인 하였다(표 7 및 표 8).
따라서, 본 발명은 일 관점에서 ahpC, rpoB, embB, pncA, rrs, gidB, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, fgd1, hsp65, embA, thyA 및 esxB(Rv3874) 유전자를 각각 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 결핵균 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, embA, 및 thyA 유전자를 각각 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 결핵균 약물 내성 확인용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, hsp65, embA, thyA 및 esxB(Rv3874) 유전자를 각각 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 결핵균 검출 및 약물 내성 확인용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭은 유전자를 증폭할 수 있는 모든 방법이면 제한 없이 이용가능하며, 바람직하게는 NGS를 이용한 증폭인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 ahpC, rpoB, embB, pncA, rrs, gidB, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, fgd1, hsp65, embA, thyA 및 esxB(Rv3874) 유전자를 각각 증폭할 수 있는 프라이머 세트는 하기 조합으로 표시되는 프라이머를 각각 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
(i) 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성된 ahpC 유전자 증폭용 프라이머 쌍;
(ii) 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 구성된 rpoB 유전자 증폭용 프라이머 쌍;
(iii) 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 구성된 embB 유전자 증폭용 제1 프라이머 쌍;
(iv) 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성된 embB 유전자 증폭용 제2 프라이머 쌍;
(v) 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 구성된 pncA 유전자 증폭용 프라이머 쌍;
(vi) 서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성된 rrs 유전자 증폭용 프라이머 쌍;
(vii) 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 구성된 gidB 유전자 증폭용 프라이머 쌍;
(viii) 서열번호 27의 정방향 프라이머 및 서열번호 28의 역방향 프라이머로 구성된 tlyA 유전자 증폭용 프라이머 쌍;
(ix) 서열번호 29의 정방향 프라이머 및 서열번호 30의 역방향 프라이머로 구성된 gyrA 유전자 증폭용 프라이머 쌍;
(x) 서열번호 31의 정방향 프라이머 및 서열번호 32의 역방향 프라이머로 구성된 gyrB 유전자 증폭용 프라이머 쌍;
(xi) 서열번호 33의 정방향 프라이머 및 서열번호 34의 역방향 프라이머로 구성된 ethA 유전자 증폭용 프라이머 쌍;
(xii) 서열번호 49의 정방향 프라이머 및 서열번호 50의 역방향 프라이머로 구성된 fgd1 유전자 증폭용 프라이머 쌍;
(xiii) 서열번호 57의 정방향 프라이머 및 서열번호 58의 역방향 프라이머로 구성된 hsp65 유전자 증폭용 프라이머 쌍;
(xiv) 서열번호 57의 정방향 프라이머 및 서열번호 58의 역방향 프라이머로 구성된 hsp65 유전자 증폭용 프라이머 쌍;
(xv) 서열번호 59의 정방향 프라이머 및 서열번호 60의 역방향 프라이머로 구성된 embA 유전자 증폭용 제1 프라이머 쌍;
(xvi) 서열번호 61의 정방향 프라이머 및 서열번호 62의 역방향 프라이머로 구성된 embA 유전자 증폭용 제2 프라이머 쌍;
(xvii) 서열번호 63의 정방향 프라이머 및 서열번호 64의 역방향 프라이머로 구성된 thyA 유전자 증폭용 프라이머 쌍; 및
(xviii) 서열번호 65의 정방향 프라이머 및 서열번호 66의 역방향 프라이머로 구성된 esxB(Rv3874) 유전자 증폭용 프라이머 쌍.
본 발명에 있어서, 상기 inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, embA, 및 thyA 유전자를 각각 증폭할 수 있는 프라이머 세트는 하기 표 9의 조합으로 표시되는 프라이머를 각각 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
서열번호 이름 서열 내성 약물/검출 용도
1 inhA_F ggcttccgaggatgcgagcta Isoniazid, Ethionamide
2 inhA_R gccccgggtaacgttctcca
3 KatG_F cgcttgtcgctaccacggaa Isoniazid
4 KatG_R gctgtcccgtcgtgggtcatat
5 fabG1_F acatacctgctgcgcaattcgt Isoniazid, Ethionamide
6 fabG1_R gtgttgtgtcagtggcccatacc
7 ahpC_F cgcaacgtcgactggctcata Isoniazid
8 ahpC_R cagcttgatgtctttggcgtactc
9 rpoB_F acgatgtcaaggcacccgtc Rifampicin
10 rpoB_R tcagacgagggcacgtactcc
11 embB_1_F gccgtggtgatattcggcttcc Ethambutol
12 embB_1_R gtaacgcaggttctcggtatacca
13 embB_2_F ctgtggtgctcgaatacgcca Ethambutol
14 embB_2_R cctggtgcataccgagcagc
15 pncA_F atccagatcgcgatggaacgt Pyrazinamide
16 pncA_R caccggacggatttgtcgct
17 rpsL_F ccgggccaattcgcatgtcc Streptomycin
18 rpsL_R agcttgctcaagcgcaccata
19 rrs_F tggtcttgactccattgccgga Amikacin, Kanamycin, Capreomycin, Streptomycin
20 rrs_R gccggcagcgtatccattga
21 gidB_F gtggtgtcatttcccgctggaa Streptomycin
22 gidB_R gagtcgttgtgctccgcgac
23 eis_1_F gctcaccgcgatcgagagtgta Amikacin, Kanamycin
24 eis_1_R cgggtggatcgcaccgatct
25 eis_2_F ccgtcaaccgcagatccatgt Amikacin, Kanamycin
26 eis_2_R accgggtttgccagcttgtc
27 tlyA_F ctggccgaactcgaaggcat Capreomycin
28 tlyA_R cgaccagcagaacactgcgat
29 gyrA_F cccgcaacgccaaggatgtt Fluoroquinolones
30 gyrA_R ccctgggatccgacgatcagt
31 gyrB_F cacccacgaagagggcttcc Fluoroquinolones
32 gyrB_R gtttgcaatcgaacgcagggtt
33 ethA_F tcaaagcgctgggcaccaat Ethionamide, Prothionamide
34 ethA_R cgtcgaccgagatatcggcca
35 rrl_F aaaccagtgaggagcgactgttta Linezolid
36 rrl_R ctttcagcggttatcctgaccga
37 rplC_F caacgtggtaacccgcatcc Linezolid
38 rplC_R ccttctgccggtagggctt
39 ddn_F gtgactgcaacatgaagcgacc Delamanid
40 ddn_R gcttcacgttcggcgaagtt
41 fbiA_F tgtcgagcgtgactcgtaacca Delamanid
42 fbiA_R ccgatgctgaccaccggattaga
43 fbiB_F acggcgaccacgctgagatt Delamanid
44 fbiB_R gactggcaggtccagctcgt
45 fbiC_1_F gggacaattgccactattgcacgt Delamanid
46 fbiC_1_R cggatcgattcccagtcaccgaa
47 fbiC_2_F cgatcccgagctaccggtcac Delamanid
48 fbiC_2_R cagtacatcggccttgtcgagtc
49 fgd1_F ccatgcccgcgagtctagga Delamanid
50 fgd1_R aggcacccttgagccggtaa
51 rv0678_F gcctctgccgcatgaagttcac Bedaquiline, Clofazimine
52 rv0678_R ggctggacaacacggtcaccta
53 atpE_F atgcgatctggaaagcatttgacc Bedaquiline
54 atpE_R gggaatgaggaagttgctggactc
55 pepQ_F ggaactcggtgattgtccacagc Bedaquiline
56 pepQ_R cacattcccagcgtcgagacaa
59 embA_1_F acctaggaacggtgactcgca Ethambutol
60 embA_1_R ccagagcaacaaggtcgcgat
61 embA_2_F gggctggtcaactccgatgc Ethambutol
62 embA_2_R ggcacagtgatcacgccctc
63 thyA_F ggctgtccgagccgacttcat p-aminosalicylic acid
64 thyA_R ggcgattccaatatcggttggct
본 발명에 있어서, 상기 inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, hsp65, embA, thyA 및 esxB(Rv3874) 유전자를 각각 증폭할 수 있는 프라이머 세트는 표 1의 조합으로 표시되는 프라이머를 각각 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약물은 결핵균을 사멸할 수 있는 용도의 약물이면 제한없이 사용가능하며, 바람직하게는 항생제일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 델라마니드, 리네졸리드, 리팜핀, 베다퀼린, 아이소니아지드, 에티오나이드, 에탐부톨, 퀴놀론, 클로파지민, 파라아미노살리실산(p-aminosalicylic acid), 피라진아마이드, 프로티온아미드, 플루오로퀴놀론, 항결핵 아미카신, 카나마이신, 카프레오마이신 및 스트렙토마이신으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항생제인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 '올리고뉴클레오타이드'는 일반적으로 약 10개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드 고분자를 의미한다. 그러나, 뉴클레오타이드의 길이는 100개 이상이거나 10개 이하일 수 있다.
본 발명의 '뉴클레오타이드'는 포스페이트 그룹, 5-탄당 및 질소 염기로 구성된 핵산의 기본 단위이다. RNA에서 5-탄당은 리보스이다. DNA에서 5-탄당은 2-데옥시리보스이다. 5-뉴클레오타이드의 경우, 당은 5-탄당-2에서 하이드록실그룹(-OH)을 함유한다. 이 용어는 또한 리보스의 2 위치에 메톡시 그룹과 같이 상기 기본 단위의 유사체를 포함한다.
본 발명의 프라이머는 통상의 클로닝 방법(Maniatis, T., et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1982)을 이용하여 목적하는 서열을 클로닝하거나 시판되는 DNA 합성기를 이용하여 화학적으로 합성하여 다량으로 얻을 수 있다.
본 발명의 프라이머는 바람직하게 단리 또는 정제된다. "단리 또는 정제된"이라는 것은 천연 또는 합성된 상태로부터 목적 성분 이외의 성분을 제거하는 조작이 적용됨을 의미한다. (w/w)%에서 단리 또는 정제된 프라이머의 순도(총 핵산에 포함된 표적 프라이머의 백분율)는 일반적으로 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상(예컨대, 100 %)이다. 프라이머의 순도는 용매 및 고체 또는 액체의 상태에 따라 적절히 변화될 수 있다. 순도의 단위는 (w/v)% 또는 (v/v)%일 수 있고, 목적하는 순도는 상기 언급된 (w/w)%에서 순도의 정의를 고려하여 적절하게 계산될 수 있다.
이들 프라이머는 건조 상태 또는 알코올 침전 상태에서 고체로 제공될 수 있거나, 또는 물 또는 적합한 완충액(예컨대, TE 완충액 등)에 용해시켜 제공될 수도 있다.
본 발명의 '앰플리콘'은 프라이머에 의해 증폭되는 증폭 산물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 각 유전자를 증폭할 수 있고, GC 비율이 20 내지 60% 범위를 유지하며, 종열반복 배열이 없는 유전자 서열과 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 용어 '증폭'은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), WO 89/06700 및 EP 329,822의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR, WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; MA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR, 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR, 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA, 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR, D-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends, RACE), DL-PCR(PC), 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 표 1의 조합으로 표시되는 프라이머를 각각 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, PCR의 주형(template)이 되는 DNA는 시험 샘플로부터 제조될 수 있다. 시험 샘플은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 혈액, 소변, 객담 등과 같은 체액 샘플, 구강 점막 등과 같은 세포, 및 모발 등과 같은 체모를 포함한다.
DNA는 프로테아제 K/페놀 추출법, 페놀/클로로포름 추출법, 알칼리 용해법, 비등법 등과 같은 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 시판되는 DNA/RNA 추출 키트를 사용하여 미량 샘플로부터 빠르고도 간편하게 순도 높은 DNA를 제조할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트를 사용하는 유전자 증폭을 위한 PCR의 반응 조건은 예를 들어 하기 조건일 수 있다:
열 변성 단계 (예컨대, 92°C 내지 98°C)
어닐링 단계 (예컨대, 55°C 내지 72°C)
신장 단계 (예컨대, 65°C 내지 80°C)
상기 언급된 PCR에서, 어닐링 단계 및 신장 단계는 하나의 단계 (셔틀 방법(shuttle method))로 수행될 수 있거나, 또는 어닐링 온도를 더 높게 설정하고 각 사이클에서 온도를 점차적으로 낮추는 것을 포함하는 방법이 채택될 수 있다(터치다운 방법(touchdown method)). 대안적으로, 이들은 조합될 수 있다. 셔틀 방법이 수행될 때, 어닐링 단계 및 신장 단계의 온도는 전형적으로 65 내지 72 ℃이다.
상기 언급된 PCR에서, 어닐링 단계 및 신장 단계는 하나의 단계 (셔틀 방법(shuttle method))로 수행될 수 있거나, 또는 어닐링 온도를 더 높게 설정하고 각 사이클에서 온도를 점차적으로 낮추는 것을 포함하는 방법이 채택될 수 있다(터치다운 방법(touchdown method)). 대안적으로, 이들은 조합될 수 있다. 셔틀 방법이 수행될 때, 어닐링 단계 및 신장 단계의 온도는 전형적으로 65 내지 72 ℃이다.
NGS를 사용한 서열 분석의 방법은 NGS의 종류에 따라 다르며, 예를 들어 각 회사의 매뉴얼 (예컨대, NexteraR XT DNA Library Prep Reference Guide)에 따라 수행될 수 있다. 수득된 샘플을 서열 분석하기 위해 페어드-엔드 분석(Paired-end analysis)이 바람직하게 사용된다. 다음에, Illumina, Inc.의 MiSeq 을 사용한 서열 분석 절차의 요약이 기재된다. 다른 장치(Life Technologies에 의해 제조된 Ion Proton, Roche Diagnostics K.K.의 GS FLX+ 등)를 사용하는 경우에도, 장치에 적합한 방법에 의해 염기 서열을 유사하게 결정할 수 있다.
1. 각 샘플의 증폭 생성물은 키트 (예컨대, Nextera XT DNA Sample Preparation Kit (Illumina, Inc.))를 사용하여 태그멘테이션(Tagmentation)한다.
2. 키트(예컨대, Nextera XT v2 Index Kit Set A, B, C, D (Illumina, Inc.))를 사용하여, 샘플마다 다른 인덱스 서열을 수득된 단편 서열의 양측에 첨가하고 PCR을 수행한다.
3. 증폭 생성물을 정제한다.
4. 각 샘플로부터의 증폭 생성물을 사용하여, 라이브러리 크기(library size)를 확인한다.
5. 샘플 사이의 농도를 조정한다.
6. 샘플의 증폭 생성물을 풀링(pooling)하고, 풀링된 증폭 생성물에 대해 정량적 PCR을 수행한다.
7. 풀링된 증폭 생성물을 MiSeq를 사용하여 서열 분석한다.
이러한 방식으로, 유전자의 변이 유무는 NGS에 의해 수득된 증폭 생성물의 염기 서열 정보를 기반으로 한 데이터베이스(이후 리드)를 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는 상기 프라이머 세트를 이용하여 결핵균을 빠르게 동정하고 비결핵 항산균의 종류를 결정할 뿐만 아니라, 결핵균으로 결정되었을 경우, 약물 내성 및 내성 약물 종류를 빠르게 확인할 수 있는 방법을 개발하였다.
즉, 상기 프라이머 세트를 이용한 Amplicon 기반 NGS에서 수득한 리드를 이용하여 consensus sequence를 생성한 다음, blastn을 실행하여 수득한 서열의 데이터 종을 확인하였다. 이 때, GeneBank에 등록된 비결핵 항산균 및 결핵균의 hsp65의 유전자를 reference로 사용하여 175개의 비결핵 항산균 및 결핵균(M. tuberculosis)을 동정하였다.
그 다음, hsp65로 분류가 어려운 5종의 MTBC 5종(M. bovis, M. microti, M. pinipedii, M. canettii, M. caprae) 에 대해서 하기 표 12의 SNP를 활용하여 MTBC의 종을 결정하였으며, 이 때, esxB(Rv3874) 유전자가 결실되었을 경우에는 M. bovis BCG로 결정하였다.
결핵균으로 결정된 샘플에 대해서는 하기 표 12개 기재된 13개의 유전자의 37개 SNP로 계열(lineage)을 분류하여 최종 결핵균의 계열을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서,
(a) 생체시료에서 핵산을 추출한 다음, 상기 결핵균 검출용 조성물을 이용하여 서열정보를 수득하는 단계;
(b) 수득한 유전자들의 서열정보 중, hsp65 유전자의 서열정보를 Genebank 에 등록된 결핵균의 참조 서열과 비교하여 상동성이 100%일 경우, M. Tuberculosis로 동정하는 단계; 및
(c) 수득한 유전자들의 서열정보 중, ahpC, rpoB, embB, pncA, rrs, gidB, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, fgd1, embA 및 thyA 유전자의 변이를 확인한 다음, 하기 표 11의 기준에 따라 결핵균의 계열(lineage)을 동정하는 단계;
를 포함하는 결핵균 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 생체시료는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), (혈장(plasma) 및 혈청(serum)을 포함하는) 혈액, 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract), 모발, 구강세포, 태반세포, 뇌척수액(cerebrospinal fluid) 및 이의 혼합물을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 침 또는 객담일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 (a) 단계의 서열정보는 NGS에 의해 수득된 증폭 생성물의 염기 서열 정보를 기반으로 한 데이터베이스(이후 리드)를 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명에서, 상기 (b) 단계의 hstp65 유전자의 서열비교는 blast search를 통해 수행할 수 있으며, 이는 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 에서 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 공지된 데이터베이스는 GeneBank 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 hsp65 유전자의 blast 분석을 통해 비결핵 항산균의 종류를 확인할 수 있다.
본 발명에서, 상기 비결핵 항산균이 동정되면, 호흡기 관련 질환 여부를 확인할 수 있다.
본 발명에서, 비결핵 항산균에 의해 발생하는 호흡기 관련 질환은 폐질환인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 (b) 단계에서 hsp65의 서열정보를 통해 동정할 수 있는 균주는 비결핵 항산균 174종과 결핵균(M. Tuberculosis)에 한정된다. hsp65 유전자의 서열정보 만으로는 기타 MTBC(Mycobacterium tuberculosis complex) 5종을 동정할 수 없으며, 상기 MTBC는 표 12의 SNP 정보와 esxB 유전자의 결실 유무를 통해 동정할 수 있다.
보다 구체적으로는,
pcnA 유전자가 존재한 염색체의 2289073 번째 염기 사이토신(C)이 구아닌(G)으로 치환된 변이가 존재할 경우에는 M. Bovis로 동정하고,
rrs 유전자가 존재한 염색체의 1473079 번째 염기 구아닌(G)이 알라닌(A)으로 치환된 변이가 존재할 경우에는 M. Microti로 동정하며,
rrs 유전자가 존재한 염색체의 1473094 번째 염기 티민(T)이 사이토신(C)으로 치환된 변이가 존재할 경우에는 M. Pinnipedii로 동정하고,
rrs 유전자가 존재한 염색체의 1471851 번째 염기 티민(T)이 구아닌(G)으로 치환된 변이가 존재할 경우에는 M. Canettii로 동정하며,
embB 유전자가 존재한 염색체의 4247646 번째 염기 알라닌(A)이 사이토신(C)으로 치환된 변이가 존재할 경우에는 M. Caprae로 동정하고,
esxB(Rv3874) 유전자의 서열정보가 결실되었을 경우에는 M. Bovis BCG로 동정할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
(a) 생체시료에서 핵산을 추출한 다음, 상기 결핵균 약물 내성 확인용 조성물을 이용하여 서열정보를 수득하는 단계; 및
(b) 수득한 inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, embA, 및 thyA 유전자의 서열정보에서, 변이를 확인한 다음, 하기 표 10의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 변이가 존재할 경우, 각 유전자에 대응하는 약물에 내성이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 결핵균의 약물 내성 확인 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
a) 생체시료에서 핵산을 추출한 다음, 상기 결핵균 검출 및 약물 내성 확인용 조성물을 이용하여 서열정보를 수득하는 단계;
(b) 수득한 유전자들의 서열정보 중, hsp65 유전자의 서열정보를 Genebank 에 등록된 결핵균의 참조 서열과 비교하여 상동성이 100%일 경우, M. Tuberculosis로 동정하는 단계;
(c) 수득한 유전자들의 서열정보 중, ahpC, rpoB, embB, pncA, rrs, gidB, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, fgd1, embA 및 thyA 유전자의 변이를 확인한 다음, 표 11의 기준에 따라 결핵균의 계열(lineage)을 동정하는 단계;
(d) 수득한 유전자들의 서열정보 중, inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, embA, 및 thyA 유전자의 서열정보에서, 변이를 확인한 다음, 표 10의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 변이가 존재할 경우, 각 유전자에 대응하는 약물에 내성이 있는 것으로 결정하는 단계;
를 포함하는 결핵균 검출 및 약물 내성 확인 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 결핵균 검출용 조성물을 포함하는 결핵균 검출용 키트(kit)에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 결핵균 약물 내성 확인용 조성물을 포함하는 결핵균 약물 내성 확인용 키트(kit)에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 결핵균 검출 및 약물 내성 확인용 조성물을 포함하는 결핵균 검출 및 약물 내성 확인용 키트(kit)에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 상기 언급된 본 발명의 프라이머 세트 이외에 PCR에 필요한 다른 시약을 포함할 수 있다. 상기 언급된 시약이 본 발명의 프라이머 세트와 공존하여 보존한 후 반응에 악영향을 미치지 않는 경우, 프라이머 세트와 혼합되어 키트에 포함될 수 있다. 대안적으로, 상기 언급된 시약 및 본 발명의 프라이머 세트는 혼합되지 않고 별도로 제공될 수 있다. 상기 언급된 시약의 예는 DNA 추출 시약, DNA 폴리머라아제 효소, dNTP, 반응 완충액, PCR에서 양성 대조군이 되는 표적 서열을 포함하는 DNA 분자, 설명서 등을 포함한다. 상기 언급된 DNA 폴리머라아제 효소는 시판되는 제품일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 생체시료 분석을 위한 프라이머 제작
inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, hsp65, embA, thyA 및 esxB(Rv3874) 유전자의 변이 및 결실 여부를 효과적으로 분석하기 위하여, 상기 표 1과 같은 구성의 서열번호 1 내지 66의 프라이머를 제작하였다.
서열번호 이름 서열 내성 약제/검출 용도
1 inhA_F ggcttccgaggatgcgagcta Isoniazid, Ethionamide
2 inhA_R gccccgggtaacgttctcca
3 KatG_F cgcttgtcgctaccacggaa Isoniazid
4 KatG_R gctgtcccgtcgtgggtcatat
5 fabG1_F acatacctgctgcgcaattcgt Isoniazid, Ethionamide
6 fabG1_R gtgttgtgtcagtggcccatacc
7 ahpC_F cgcaacgtcgactggctcata Isoniazid
8 ahpC_R cagcttgatgtctttggcgtactc
9 rpoB_F acgatgtcaaggcacccgtc Rifampicin
10 rpoB_R tcagacgagggcacgtactcc
11 embB_1_F gccgtggtgatattcggcttcc Ethambutol
12 embB_1_R gtaacgcaggttctcggtatacca
13 embB_2_F ctgtggtgctcgaatacgcca Ethambutol
14 embB_2_R cctggtgcataccgagcagc
15 pncA_F atccagatcgcgatggaacgt Pyrazinamide
16 pncA_R caccggacggatttgtcgct
17 rpsL_F ccgggccaattcgcatgtcc Streptomycin
18 rpsL_R agcttgctcaagcgcaccata
19 rrs_F tggtcttgactccattgccgga Amikacin, Kanamycin, Capreomycin, Streptomycin
20 rrs_R gccggcagcgtatccattga
21 gidB_F gtggtgtcatttcccgctggaa Streptomycin
22 gidB_R gagtcgttgtgctccgcgac
23 eis_1_F gctcaccgcgatcgagagtgta Amikacin, Kanamycin
24 eis_1_R cgggtggatcgcaccgatct
25 eis_2_F ccgtcaaccgcagatccatgt Amikacin, Kanamycin
26 eis_2_R accgggtttgccagcttgtc
27 tlyA_F ctggccgaactcgaaggcat Capreomycin
28 tlyA_R cgaccagcagaacactgcgat
29 gyrA_F cccgcaacgccaaggatgtt Fluoroquinolones
30 gyrA_R ccctgggatccgacgatcagt
31 gyrB_F cacccacgaagagggcttcc Fluoroquinolones
32 gyrB_R gtttgcaatcgaacgcagggtt
33 ethA_F tcaaagcgctgggcaccaat Ethionamide, Prothionamide
34 ethA_R cgtcgaccgagatatcggcca
35 rrl_F aaaccagtgaggagcgactgttta Linezolid
36 rrl_R ctttcagcggttatcctgaccga
37 rplC_F caacgtggtaacccgcatcc Linezolid
38 rplC_R ccttctgccggtagggctt
39 ddn_F gtgactgcaacatgaagcgacc Delamanid
40 ddn_R gcttcacgttcggcgaagtt
41 fbiA_F tgtcgagcgtgactcgtaacca Delamanid
42 fbiA_R ccgatgctgaccaccggattaga
43 fbiB_F acggcgaccacgctgagatt Delamanid
44 fbiB_R gactggcaggtccagctcgt
45 fbiC_1_F gggacaattgccactattgcacgt Delamanid
46 fbiC_1_R cggatcgattcccagtcaccgaa
47 fbiC_2_F cgatcccgagctaccggtcac Delamanid
48 fbiC_2_R cagtacatcggccttgtcgagtc
49 fgd1_F ccatgcccgcgagtctagga Delamanid
50 fgd1_R aggcacccttgagccggtaa
51 rv0678_F gcctctgccgcatgaagttcac Bedaquiline, Clofazimine
52 rv0678_R ggctggacaacacggtcaccta
53 atpE_F atgcgatctggaaagcatttgacc Bedaquiline
54 atpE_R gggaatgaggaagttgctggactc
55 pepQ_F ggaactcggtgattgtccacagc Bedaquiline
56 pepQ_R cacattcccagcgtcgagacaa
57 hsp65_F cgatccggaggaatcacttcgca MTBC/NTM identification
58 hsp65_R cgatgatcagcagcggcttacc
59 embA_1_F acctaggaacggtgactcgca Ethambutol
60 embA_1_R ccagagcaacaaggtcgcgat
61 embA_2_F gggctggtcaactccgatgc Ethambutol
62 embA_2_R ggcacagtgatcacgccctc
63 thyA_F ggctgtccgagccgacttcat p-aminosalicylic acid
64 thyA_R ggcgattccaatatcggttggct
65 esxB(Rv3874)_F ggccggaagacttgccaaca M.bovis BCG identification
66 esxB(Rv3874)_R ggcctcgatacccgcgaaat
실시예 2. 제작한 프라이머를 이용한 NGS 수행 및 데이터 품질 확인
대한결핵협회결핵연구원에서 보관 중인 임상분리 결핵균으로부터 분리된 genomic DNA에서, inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, hsp65, embA, thyA 및 esxB(Rv3874) 유전자에 대하여, 실시예 1에서 제작한 프라이머를 이용하여 multiplex PCR(ExPCR HS Plus 5x Master Mix polymerase, 엘피스바이오텍, 한국)을 통해 앰플리콘을 생성한 다음, Twist Library Preparation EF Kit 2.0(Twist Bioscience, USA)를 이용하여 라이브러리를 제작하였다.
제작한 라이브러리를 iSeq/MiSeq 장비를 이용하여 시퀀싱을 수행하여 리드를 생산하고, 생산된 리드의 커버리지 및 평균 깊이(depth)를 확인한 결과, 도 2의 (A) 및 (B)에 기재된 바와 같이, 각 유전자별 증폭영역에 대해 최소 100X 이상으로 커버되었으며, 샘플별 평균 1000x 이상의 깊이를 가져 서열 분석 및 변이 분석에 충분한 품질을 가지고 있는 것을 확인하였다.
실시예 3. 제작한 프라이머의 최소검출한계(Limit of Detection) 성능 확인
3-1. 약제 내성
약제 내성 검출을 위한 최소 DNA 농도를 확인하기 위하여, 약제 감수성검사(drug susceptibility test, DST) 및 Whole exome sequencing을 통해 약제 내성 및 내성변이가 확인된 배양균주로부터 추출한 DNA를 계대희석 하여 변이 탐지가 가능한 최소검출한계를 설정하였으며, 실시예 2의 방법으로 DNA 농도를 달리하여 NGS를 수행한 결과, 표 2에 기재된 바와 같이 input DNA 1 ng까지 NGS data 생산 및 변이 검출이 가능한 것을 확인하였다.
변이 검출과 약물 내성을 확인하기 위한 데이터베이스는 PhyResSE DB(https://bioinf.fz-borstel.de/mchips/phyresse/)를 이용하였다.
DNA Input 양에 따른 약제 내성 관련 변이 검출 결과
Sample DNA conc. CHROM POS REF ALT Gene HGVS.c HGVS.p Compound
MDR
(n=3)		 10 ng NC_000962.3 761140 A G rpoB c.1334A>G p.His445Arg Rifampicin
NC_000962.3 2155168 C G katG c.944G>C p.Ser315Thr Isoniazid
NC_000962.3 3987084 G A ddn c.241G>A p.Gly81Ser Delamanid
5 ng NC_000962.3 761140 A G rpoB c.1334A>G p.His445Arg Rifampicin
NC_000962.3 2155168 C G katG c.944G>C p.Ser315Thr Isoniazid
NC_000962.3 3987084 G A ddn c.241G>A p.Gly81Ser Delamanid
2.5 ng NC_000962.3 761140 A G rpoB c.1334A>G p.His445Arg Rifampicin
NC_000962.3 2155168 C G katG c.944G>C p.Ser315Thr Isoniazid
NC_000962.3 3987084 G A ddn c.241G>A p.Gly81Ser Delamanid
1.25 ng NC_000962.3 761140 A G rpoB c.1334A>G p.His445Arg Rifampicin
NC_000962.3 2155168 C G katG c.944G>C p.Ser315Thr Isoniazid
NC_000962.3 3987084 G A ddn c.241G>A p.Gly81Ser Delamanid
XDR
(n=3)		 10 ng NC_000962.3 7582 A G gyrA c.281A>G p.Asp94Gly Fluoroquinolone
NC_000962.3 761109 G T rpoB c.1303G>T p.Asp435Tyr Rifampicin
NC_000962.3 781687 A G rpsL c.128A>G p.Lys43Arg Streptomycin
NC_000962.3 1473246 A G rrs c.1401A>G p.Ser467Ser Amikacin
NC_000962.3 1473246 A G rrs c.1401A>G p.Ser467Ser Capreomycin
NC_000962.3 1473246 A G rrs c.1401A>G p.Ser467Ser Kanamycin
NC_000962.3 1673425 C T fabG1 c.5C>T - Isoniazid
NC_000962.3 2288766 A C pncA c.476T>G p.Leu159Arg Pyrazinamide
NC_000962.3 4247429 A G embB c.916A>G p.Met306Val Ethambutol
5 ng NC_000962.3 7582 A G gyrA c.281A>G p.Asp94Gly Fluoroquinolone
NC_000962.3 761109 G T rpoB c.1303G>T p.Asp435Tyr Rifampicin
NC_000962.3 781687 A G rpsL c.128A>G p.Lys43Arg Streptomycin
NC_000962.3 1473246 A G rrs c.1401A>G p.Ser467Ser Amikacin
NC_000962.3 1473246 A G rrs c.1401A>G p.Ser467Ser Capreomycin
NC_000962.3 1473246 A G rrs c.1401A>G p.Ser467Ser Kanamycin
NC_000962.3 1673425 C T fabG1 c.5C>T - Isoniazid
NC_000962.3 2288766 A C pncA c.476T>G p.Leu159Arg Pyrazinamide
NC_000962.3 4247429 A G embB c.916A>G p.Met306Val Ethambutol
2.5 ng NC_000962.3 7582 A G gyrA c.281A>G p.Asp94Gly Fluoroquinolone
NC_000962.3 761109 G T rpoB c.1303G>T p.Asp435Tyr Rifampicin
NC_000962.3 781687 A G rpsL c.128A>G p.Lys43Arg Streptomycin
NC_000962.3 1473246 A G rrs c.1401A>G p.Ser467Ser Amikacin
NC_000962.3 1473246 A G rrs c.1401A>G p.Ser467Ser Capreomycin
NC_000962.3 1473246 A G rrs c.1401A>G p.Ser467Ser Kanamycin
NC_000962.3 1673425 C T fabG1 c.5C>T - Isoniazid
NC_000962.3 2288766 A C pncA c.476T>G p.Leu159Arg Pyrazinamide
NC_000962.3 4247429 A G embB c.916A>G p.Met306Val Ethambutol
1 ng NC_000962.3 7582 A G gyrA c.281A>G p.Asp94Gly Fluoroquinolone
NC_000962.3 761109 G T rpoB c.1303G>T p.Asp435Tyr Rifampicin
NC_000962.3 781687 A G rpsL c.128A>G p.Lys43Arg Streptomycin
NC_000962.3 1473246 A G rrs c.1401A>G p.Ser467Ser Amikacin
NC_000962.3 1473246 A G rrs c.1401A>G p.Ser467Ser Capreomycin
NC_000962.3 1473246 A G rrs c.1401A>G p.Ser467Ser Kanamycin
NC_000962.3 1673425 C T fabG1 c.5C>T - Isoniazid
NC_000962.3 2288766 A C pncA c.476T>G p.Leu159Arg Pyrazinamide
NC_000962.3 4247429 A G embB c.916A>G p.Met306Val Ethambutol
MDR: multi-drug-resistant tuberculosis(다제내성 결핵)XDR: extensively drug resistant-tuberculosis(광범위내성 결핵)
3-2. 비결핵 항산균 동정
비결핵 항산균 동정을 위한 최소 DNA 농도를 확인하기 위하여, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)을 포함한 13종의 mycobaceria균주로부터 추출한 DNA를 시험 검체로 실시예 2의 방법으로 DNA 농도를 달리하여 NGS를 수행한 결과, 하기 표 3에 기재된 바와 같이 최소검출한계 농도인 1ng을 사용하여도 100%로 동정할 수 있다는 것을 확인하였다.
DNA Input 양에 따른 Mycobacteria identification 결과
# 검체 정보 (종) 분석 결과 (종) 일치 여부
1 Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis O
2 Mycobacterium intracellulare Mycobacterium intracellulare O
3 Mycobacterium avium Mycobacterium avium O
4 Mycobacterium abscessus Mycobacterium abscessus O
5 Mycobacterium chelonae subsp. Chelonae Mycobacterium chelonae subsp. Chelonae O
6 Mycobacterium fortuitum Mycobacterium fortuitum O
7 Mycobacterium kansasii Mycobacterium kansasii O
8 Mycobacterium szulgai Mycobacterium szulgai O
9 Mycobacterium malmoense Mycobacterium malmoense O
10 Mycobacterium scrofulaceum Mycobacterium scrofulaceum O
11 Mycobacterium marinum Mycobacterium marinum O
12 Mycobacterium terrae Mycobacterium terrae O
13 Mycobacterium gordonae Mycobacterium gordonae O
종 (Species) 일치율 : 100%
실시예 4. 제작한 프라이머의 교차반응 평가(cross-reactivity)
실시예 1에서 제작한 프라이머를 이용하여 분석을 진행할 때, 오염이 발생할 경우, 상기 프라이머의 특이도를 확인하기 위하여, PCR 및 DNA라이브러리 제작과정에서 오염 및 교차반응을 일으킬 수 있는 물질을 첨가하여 특이도를 확인하는 시험을 수행하였다.
표 4에 기재된 호흡기 관련 바이러스, 상재균 등[국가병원체자원은행 (National Culture Collection for Pathogens, NCCP), ATCC(American Type Culture Collection)] 13 종의 교차물질을 주입하여 실시예 2의 방법으로 NGS를 각 3회 반복 시험하여 교차 반응성을 확인한 결과, 표 5에 기재된 바와 같이 13종의 교차물질은 모두 Mycobacteria로 동정되지 않았으며, Mycobacteria 이외의 감염성 병원균은 본 발명의 프라이머를 이용한 검사 결과에 영향이 없다는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 프라이머 서열이 Mycobacteria에 매우 특이적으로 반응하는 것을 의미한다.
교차물질 평가에 사용된 균주
번호 Organism Sample type Sample Status Reference
1 Legionella pneumophila genomic DNA DNA NCCP : 72002
2 Haemophilus influenzae genomic DNA DNA NCCP : 72019
3 Bordetella pertussis genomic DNA DNA NCCP : 72026
4 Pseudomonas aeruginosa genomic DNA DNA NCCP : 72006
5 Acinetobacter baumannii genomic DNA DNA NCCP : 72005
6 Haemophilus haemolyticus genomic DNA DNA NCCP : 72021
7 Haemophilus parainfluenzae genomic DNA DNA NCCP : 72023
8 Serratia marcescens genomic DNA DNA NCCP : 72048
9 Staphylococcus aureus genomic DNA DNA NCCP : 72031
10 Stenotrophomonas maltophilia genomic DNA DNA NCCP : 72062
11 Streptococcus mitis genomic DNA DNA NCCP : 72066
12 Streptococcus pyogenes genomic DNA DNA NCCP : 72067
13 Yersinia enterocolitica genomic DNA DNA NCCP : 72081
교차물질 평가 결과
번호 Organism 분석 결과 [종(species)]
1 2 3
1 Legionella pneumophila ND ND ND
2 Haemophilus influenzae ND ND ND
3 Bordetella pertussis ND ND ND
4 Pseudomonas aeruginosa ND ND ND
5 Acinetobacter baumannii ND ND ND
6 Haemophilus haemolyticus ND ND ND
7 Haemophilus parainfluenzae ND ND ND
8 Serratia marcescens ND ND ND
9 Staphylococcus aureus ND ND ND
10 Stenotrophomonas maltophilia ND ND ND
11 Streptococcus mitis ND ND ND
12 Streptococcus pyogenes ND ND ND
13 Yersinia enterocolitica ND ND ND
*ND: Not Detected
실시예 4. 제작한 프라이머의 정확도(specificity) 확인
표 7에 기재된 약제 감수성검사(drug susceptibility test, DST) 및 Whole exome sequencing을 통해 약제 내성 및 내성변이가 확인된 배양균주로부터 추출된 결핵균 DNA와 순수 분리 배양된 mycobacteria 균주로부터 추출한 DNA를 이용하여 실시예 2의 방법으로 NGS를 수행하여 수득한 데이터를 분석하여 동정 및 약제 내성 관련 변이 검출의 정확도를 확인하였다.
그 결과, 하기 표 7 및 8에 기재된 바와 같이 세균 동정 및 약제 내성 관련 변이를 100% 정확도로 검출할 수 있다는 것을 확인하였다. 표 8은 약제 내성 관련 변이 검출 결과이다.
정확도 평가에 사용된 균주 및 정답
# 정확도 확인 균주 Type
1 M.tuberculosis (H37Rv) All-Sa
2 M.tuberculosis (1485) All-S
3 M.tuberculosis (1511) All-S
4 M.tuberculosis (6526) MDRb
5 M.tuberculosis (11207 MDR
6 M.tuberculosis (11325 MDR
7 M.tuberculosis (11774 MDR
8 M.tuberculosis (12123) MDR
9 M.tuberculosis (16132) MDR
10 M.tuberculosis (981) XDRc
11 M.tuberculosis (5947) XDR
12 M.tuberculosis (6351) XDR
13 M.tuberculosis (12353) XDR
14 M.tuberculosis (12666) XDR
15 M.tuberculosis (1311) XDR
16 M.tuberculosis (5965) XDR
17 M.tuberculosis (5973) XDR
18 M.tuberculosis (10739) XDR
19 M.tuberculosis (12771) XDR
20 M.tuberculosis (13073) XDR
21 M.tuberculosis (189) XDR
22 M.tuberculosis (190) XDR
23 M.tuberculosis (216) XDR
24 M.tuberculosis (231) XDR
25 M.tuberculosis (244) XDR
26 Mycobacterium marinum NTMd
27 Mycobacterium fortuitum NTM
28 Mycobacterium kansasii NTM
29 Mycobacterium intracellulare NTM
30 Mycobacterium peregrinum NTM
31 Mycobacterium gordonae NTM
32 Mycobacterium flavescens NTM
33 Mycobacterium vaccae NTM
34 Mycobacterium gastri NTM
35 Mycobacterium terrae NTM
36 Mycobacterium xenopi NTM
37 Mycobacterium smegmatis NTM
38 Mycobacterium abscessus NTM
39 Mycobacterium scrofulaceum NTM
40 Mycobacterium simiae NTM
41 Mycobacterium malmoense NTM
42 Mycobacterium avium NTM
43 Mycobacterium chelonae subsp. Chelonae NTM
44 Mycobacterium senegalense NTM
45 Mycobacterium szulgai NTM
46 Mycobacterium celatum NTM
47 Mycobacterium genavense NTM
48 Mycobacterium lentiflavum NTM
a. All-S: 민감성 균주
b. MDR: multi-drug-resistant tuberculosis(다제내성 결핵)
c. XDR: extensively drug resistant-tuberculosis(광범위내성 결핵)
Mycobacteria identification 결과
검체 정보 분석 결과
검체 종 (Species) 시험 1 시험 2 일치도 (%)
M.tuberculosis (H37Rv) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (1485) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (1511) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (6526) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (11207) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (11325) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (11774) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (12123) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (16132) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (981) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (5947) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (6351) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (12353) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (12666) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (1311) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (5965) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (5973) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (10739) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (12771) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (13073) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (189) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (190) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (216) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (231) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
M.tuberculosis (244) M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis 100%
Mycobacterium marinum Mycobacterium marinum Mycobacterium marinum Mycobacterium marinum 100%
Mycobacterium fortuitum Mycobacterium fortuitum Mycobacterium fortuitum Mycobacterium fortuitum 100%
Mycobacterium kansasii Mycobacterium kansasii Mycobacterium kansasii Mycobacterium kansasii 100%
Mycobacterium intracellulare Mycobacterium intracellulare Mycobacterium intracellulare Mycobacterium intracellulare 100%
Mycobacterium peregrinum Mycobacterium peregrinum Mycobacterium peregrinum Mycobacterium peregrinum 100%
Mycobacterium gordonae Mycobacterium gordonae Mycobacterium gordonae Mycobacterium gordonae 100%
Mycobacterium flavescens Mycobacterium flavescens Mycobacterium flavescens Mycobacterium flavescens 100%
Mycobacterium vaccae Mycobacterium vaccae Mycobacterium vaccae Mycobacterium vaccae 100%
Mycobacterium gastri Mycobacterium gastri Mycobacterium gastri Mycobacterium gastri 100%
Mycobacterium terrae Mycobacterium terrae Mycobacterium terrae Mycobacterium terrae 100%
Mycobacterium xenopi Mycobacterium xenopi Mycobacterium xenopi Mycobacterium xenopi 100%
Mycobacterium smegmatis Mycobacterium smegmatis Mycobacterium smegmatis Mycobacterium smegmatis 100%
Mycobacterium abscessus Mycobacterium abscessus Mycobacterium abscessus Mycobacterium abscessus 100%
Mycobacterium scrofulaceum Mycobacterium scrofulaceum Mycobacterium scrofulaceum Mycobacterium scrofulaceum 100%
Mycobacterium simiae Mycobacterium simiae Mycobacterium simiae Mycobacterium simiae 100%
Mycobacterium malmoense Mycobacterium malmoense Mycobacterium malmoense Mycobacterium malmoense 100%
Mycobacterium avium Mycobacterium avium Mycobacterium avium Mycobacterium avium 100%
Mycobacterium chelonae subsp. Chelonae Mycobacterium chelonae subsp. Chelonae Mycobacterium chelonae subsp. Chelonae Mycobacterium chelonae subsp. Chelonae 100%
Mycobacterium senegalense Mycobacterium senegalense Mycobacterium senegalense Mycobacterium senegalense 100%
Mycobacterium szulgai Mycobacterium szulgai Mycobacterium szulgai Mycobacterium szulgai 100%
Mycobacterium celatum Mycobacterium celatum Mycobacterium celatum Mycobacterium celatum 100%
Mycobacterium genavense Mycobacterium genaense Mycobacterium genavense Mycobacterium genavense 100%
Mycobacterium lentiflavum Mycobacterium lentiflavum Mycobacterium lentiflavum Mycobacterium lentiflavum 100%
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 구체적인 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, hsp65, embA, thyA 및 esxB(Rv3874) 유전자를 각각 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하고,
    하기 표 11의 단일염기변이를 확인하여 결핵균을 동정하며,
    하기 표 10의 단일염기변이를 확인하여 약물 내성을 확인하는 것을 특징으로 하는결핵균 검출 및 약물 내성 확인용 조성물.

  6. 제5항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 하기 표 1의 조합으로 표시되는 프라이머를 각각 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.



  7. 삭제
  8. 삭제
  9. (a) 생체시료에서 핵산을 추출한 다음, 제5항의 조성물을 이용하여 서열정보를 수득하는 단계;
    (b) 수득한 유전자들의 서열정보 중, hsp65 유전자의 서열정보를 Genebank 에 등록된 결핵균의 참조 서열과 비교하여 상동성이 100%일 경우, M. Tuberculosis로 동정하는 단계;
    (c) 수득한 유전자들의 서열정보 중, ahpC, rpoB, embB, pncA, rrs, gidB, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, fgd1, embA 및 thyA 유전자의 단일염기 변이를 확인한 다음, 하기 표 11의 기준에 따라 결핵균의 계열(lineage)을 동정하는 단계;

    (d) 수득한 유전자들의 서열정보 중, inhA, KatG, fabG1, ahpC, rpoB, embB, pncA, rpsL, rrs, gidB, eis, tlyA, gyrA, gyrB, ethA, rrl, rplC, ddn, fbiA, fbiB, fbiC, fgd1, rv0678, atpE, pepQ, embA, 및 thyA 유전자의 서열정보에서, 단일염기 변이를 확인한 다음, 하기 표 10의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 단일염기 변이가 존재할 경우, 각 유전자에 대응하는 약물에 내성이 있는 것으로 결정하는 단계;

    를 포함하는 결핵균 검출 및 약물 내성 확인 방법
  10. 제5항에 있어서, 상기 약물은 항생제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항생제는 델라마니드, 리네졸리드, 리팜핀, 베다퀼린, 아이소니아지드, 에티오나이드, 에탐부톨, 퀴놀론, 클로파지민, 파라아미노살리실산(p-aminosalicylic acid), 피라진아마이드, 프로티온아미드, 플루오로퀴놀론, 항결핵 아미카신, 카나마이신, 카프레오마이신 및 스트렙토마이신으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항생제인 것을 특징으로 하는 조성물
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제5항의 조성물을 포함하는 결핵균 검출 및 약물 내성 확인용 키트(kit).
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