DE69426956T2 - Nachweis von Mycobakterien durch Nukleinsäure-Multiplexamplifizierung - Google Patents
Nachweis von Mycobakterien durch Nukleinsäure-MultiplexamplifizierungInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Amplifikation einer Nukleinsäure und Erfassung und bzw. oder Identifikation von Mikroorganismen unter Verwendung einer Nukleinsäure- Amplifikation.
- In vitro Nukleinsäure-Amplifikations Techniken haben leistungsstarke Werkzeuge für die Erkennung und Analyse von kleinen Mengen von Nukleinsäuren bereitgestellt. Die extreme Sensitivität von solchen Verfahren haben zu Versuchen geführt, diese für die Diagnose von infektiösen und genetischen Krankheiten, Isolation von Genen für die Analyse und Erkennung von spezifischen Nukleinsäuren in der forensischen Medizin zu entwickeln.
- Im allgemeinen waren Diagnose und Screening von spezifischen Nukleinsäuren unter Verwendung von Nukleinsäure-Amplifikations- Techniken zur Zeit durch die Notwendigkeit der Amplifikation einer einzelnen Target-Sequenz begrenzt. In Fällen wo irgendeine aus vielfach möglichen Nukleinsäure- Sequenzen vorhanden sein können (z. B. Diagnose von infektiösen Krankheiten), ist die Durchführung vielfacher separater Tests durch dieses Verfahren beschwerlich und zeitaufwendig. Die U. S. Patente N0. 4 683 195, 4 683 202 und 4 800 159 beschreiben die PCR. Obwohl diese Erfinder behaupten, daß multiple Sequenzen erfaßt werden können, wird gleichzeitig kein Verfahren zur Amplifikation multipler Target-Sequenzen geoffenbart. Wenn multiple Target-Sequenzen amplifiziert werden, so erfolgt dies durch sequentielles Amplifizieren einzelner Targets in separaten PCRs. Tatsächlich, wenn multiple Paare von Primern, die auf verschiedene Target-Sequenzen gerichtet sind, zu einem einzelnen PCR hinzugefügt werden, so erzeugt die Reaktion einen unakzeptabel hohen Pegel an nicht-spezifischer Amplifikation und Hintergrund. Eine Verbesserung bei der PCR, die, wie verlautet, eine simultane Amplifikation von multiplen Target- Sequenzen ermöglicht, wird in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 364 255 beschrieben und veröffentlicht. Dies wird einer Multiplex- DNA- Amplifikation zugeschrieben. Bei diesem Verfahren werden multiple Paare von Primern zu der Nukleinsäure hinzugefügt, die die Target- Sequenz enthält. Jedes Primerpaar hybridisiert zu einer verschiedenen ausgewählten Target- Sequenz, die nachfolgend in einer Temperatur- Zyklus Reaktion, ähnlich der PCR, amplifiziert wird. Eine Adaptierung der PCR zu einem Ichnogramm wird durch P. R. Mueller und B. Wold (1989, Sience 246, 780-786) vorgeschlagen. Zum Herstellen eines Ichnogramms wird eine übliche Oligonukleotid- Sequenz zu dem einzigen Ende eines jeden Fragmentes der Ichnogramm- Stufe ligiert. Die Fragmente werden gleichzeitig unter Verwendung eines Primers, der komplementär zu der gewöhnlichen Sequenz ist, und eines Primers amplifiziert, der komplementär zu der bekannten Sequenz an dem festen Ende ist.
- In den meisten Fällen wurden Nukleinsäure- Amplifikations- Techniken zur Herstellung qualitativer Ergebnisse in Diagnose Tests verwendet. Es gab jedoch großes Interesse zur Entwicklung von Verfahren zur Nukleinsäure- Amplifikation, welche nicht nur geeignet sind, die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Target- Sequenz zu erfassen, sondern auch die Quantität des Betrages der anfangs vorhandenen Target- Sequenz zu erfassen. Interne Kontroll- Sequenzen wurden in der PCR in einem Versuch zur Herstellung solcher quantitativer Ergebnisse verwendet. Die EP 0 623682 (entspricht der U. S. Anmeldung Nr. 08/068, 648), die den Stand der Technik im Sinne des Art. 54(3) EPÜ darstellt, offenbart interne Kontroll- Sequenzen, die in isothermalen Nukleinsäure- Amplifikations- Reaktionen für die Quantifizierung einer Target- Sequenz, wie auch zur Bestimmung der Amplifikationsaktivität der Probe, geeignet sind (z. B. Wirksamkeit - ob die Probe die Amplifikations- Reaktion verhindert oder nicht, wodurch ein falsches negatives Ergebnis erzeugt wird).
- Bestimmte PCRs, welche interne Kontrollen einsetzen, suchen interne Kontroll- Sequenzen aus, die durch den selben Primer wie die Target- Sequenz amplifiziert werden können. Siehe zum Beispiel WO 93/02215 und WO 92/11273. In der PCR können sich die amplifizierten Target- und Kontroll- Sequenzen durch verschiedene Längen der Fragmente unterscheiden, da es bekannt ist, daß die Rate der PCR durch die Länge des Targets relativ unbeeinflußt ist und die Amplifikations- Effektivität nicht signifikant beeinflußt wird. Die EP 0 525 882 beschreibt ein Verfahren zur Quantifizierung einer Target- Nukleinsäure- Sequenz in einer auf einer Nukleinsäure basierenden Amplifikations- Reaktion (NASBA) (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) durch eine kompetitive Amplifikation der Target- Nukleinsäure und einer Mutanten- Sequenz. Das Verfahren wird mit einem festen Betrag von Proben- und Verdünnungs- Serien der Mutanten- Sequenz durchgeführt. Die Analyse schließt die Bestimmung des Betrages der zugesetzten Mutanten Sequenz, die das Signal von der Target- Sequenz um 50% reduziert, z. B. der Punkt an dem die Mutanten-Sequenz und die Target- Sequenz in gleichen Mengen vorhanden sind, ein. Um eine genaue Quantifizierung zu erhalten, muß die in der EP 0 525 882 beschriebene Amplifikations- Reaktion soweit abgelaufen lassen werden, bis zumindest einer der Reagenten im wesentlichen aufgebraucht ist, z. B. in der post- exponentiellen Phase der Reaktion, wo Konkurrenz für limitierte Reagenten auftreten kann. Weiters sind die Kalkulationen nur genau, wenn zwei Reaktionen um Reagenten konkurrieren - die Target- Amplifikation und die Amplifikation der Mutanten Sequenz. Die Ergebnisse sind daher nicht zuverlässig wenn eine dritte Reaktion, wie eine Hintergrund- Amplifikation, auftritt. Da im wesentlichen alle Amplifikations- Reaktionen in einem gewissen Ausmaß eine Hintergrund- Amplifikation einschließen, ist das Quantifizierungs- Verfahren nach der EP 0 525 882 nur für hohe Pegel der Target- Sequenz genau. Bei geringen Target- Pegeln würde die ebenso ablaufende Hintergrund- Amplifikations- Reaktion die Genauigkeit der Kalkulation merklich beeinträchtigen. Da sich die auf verschiedenen Verdünnungen der Mutanten. Sequenz mit· dem Target bezieht, ist das Verfahren nach der EP 0 525 882 auch auf Abweichungen des Betrages der Mutanten Sequenz und der Target- Sequenz von Probe zu Probe empfindlich. Auch kleine Unterschiede im Betrag der Target- Sequenz oder geringe Ungenauigkeiten in der Verdünnung der Mutanten- Sequenz zwischen den Proben werden in der nachfolgenden Amplifikations- Reaktion exponentiell amplifiziert und schlagen sich in den Quantifizierungs-Berechnungen nieder.
- Im Gegensatz dazu erfordert das Verfahren nach der EP 0 623 682 keine Parallelreaktion zwischen Kontroll- und Target- Sequenz für Reagenten, noch ist es erforderlich, daß die Reaktion in die postexponentielle Phase geht. Sie ist sowohl in den exponentiellen, wie auch in den post- exponentiellen Phasen der Amplifikations- Reaktion genau. Das Vehältnis der Target-/Kontroll- Sequenz wird daher durch die Hintergrund- Amplifikations- Reaktion, die auftreten kann, nicht nachteilig beeinflußt und bleibt, unabhängig vom Ausmaß der Hintergrund- Reaktion, gleich. Das Ergebnis kann daher früher in der Amplifikations- Reaktion erhalten werden und die Variabilität ist durch die Verwendung einer einzigen Target- /Kontroll- Amplifikations- Reaktion statt einer Serie von Reaktionen vermindert.
- Wie bereits früher berichtet wurde, erfordern multiplexe Nukleinsäure- Amplifikations- Verfahren eine separate interne Kontroll- Sequenz, die passend zu jedem zu amplifizierenden Target ist, da jedes Target unter Verwendung eines unterschiedlichen Paares von Primern (z. B. eine Kontroll- Sequenz für jedes Primer- Paar) amplifiziert wird. Vor der gegenständlichen Erfindung war es nicht möglich eine einzige interne Kontroll- Sequenz zu verwenden, um multiple Targets in multiplexen Nukleinsäure- Amplifikations- Reaktionen anzuzeigen oder zu quantifizieren. Es ist daher ein Merkmal der Instant- Adapter- übertragenden multiplexen Amplifikations- Verfahren, daß das einzige Paar von Primern, das für multiplexe Amplifikation erforderlich ist, es das erste Mal ermöglicht, eine einzige interne Kontroll- Sequenz zum Anzeigen oder Quantifizieren der Amplifikation von multiplen Targets zu verwenden.
- Mycobakterien sind eine Art von Bakterien, die beständig gegen Säuren, nicht frei beweglich sind und gram- positive Stäbchen aufweisen. Die Art umfaßt mehrere Spezien, die Mycobacterium africanum, M. avium, M. bovis, M. bovis-BCG, M. chelonae, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. kansasil, M. microti, M. scrofulaceum, M. paratuberculosis und 14. tuberculosis umfassen, aber nicht auf diese beschränkt sind. Bestimmte von diesen Organismen sind kausative Agentien von Krankheiten. Das erste Mal seit 1953 steigen die Fälle von mycobakteriellen Infektionen in den Vereingten Staaten wieder an. Von besonderer Bedeutung in diesem Zusammenhang ist Tuberkulose, deren ursächlicher Agens M. tuberculosis ist. Viele von diesen neuen Fällen stehen in Zusammenhang mit der AIDS Epidemie, die eine Population mit geschwächtem Immunsystem bewirkt, die für Infektionen durch Mycobakterien empfindlich ist. Andere mycobakterielle Infektionen steigen ebenfalls als eine Folge des Anstiegs von vorhandenen Patienten mit geschwächtem Immunsystem an. Mycobacterium avium, Mycobacterium kansasii und andere nichttuberkulose Mycobakterein wurden als opportunistische Phatogene in HIV-infizierten und anderen Patienten mit geschwächtem Immunsystem gefunden.
- Gegenwärtig hängt die Diagnose von mycobakteriellen Infektionen von säurefestem Anfärben und Kultivieren der Organismen, gefolgt von biochemischen Tests ab. Diese Prozeduren sind zeitaufwendig und eine typische Diagnose unter Verwendung von konventionellen Kultivierungsverfahren kann bis zu sechs Wochen dauern. Automatisierte Kultivierungs- Systeme wie das BACTECTM System (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD) kann die Zeit für die Diagnose auf eine bis zwei Wochen reduzieren. Es besteht jedoch noch ein Bedarf zur Reduktion der für das Diagnostizieren von mycobakteriellen Infektionen erforderlichen Zeit auf weniger als eine Woche, vorzugsweise auf ungefähr einen Tag. Auf Oligonukleotid- Proben basierende Tests, wie Southern Hybridisationen oder Dot Blots sind geeignet um ein rasches Ergebnis (z. B. in einem Tag oder rascher) zu erhalten. Tests, die auf der Amplifikation von Nukleinsäuren basieren, können noch raschere Ergebnisse, oft innerhalb von Stunden liefern. Für die Diagnose von mycobakteriellen Infektionen würden solche Verfahren eine Oligonukleotid - Probe oder einen Primer erfordern, der spezifisch für die Art von Mycobakterien oder spezifisch für eine besondere mycobakterielle Spezie ist, wenn eine spezifische Identifikation eines Organismus gewünscht wird.
- Es wurde nun entdeckt, daß die in der EP 0 628 640 (entspricht der U.S. Ser. Nr. 08/073,197), welche den Stand der Technik gemäß der Bedeutung des Artikel 54(3) EPÜ darstellt, geoffenbarten Primer eine Adapter- übertragende multiplexe Amplifikation von dem IS6110 Insertions- Element des Mycobycterium tuberculosis (M.tb) und dem 16S Ribosom Gen des Mycobycterium tuberculosis exemplifizieren und auch für die simultane Erfassung und bzw. oder Identifizierung von Spezien des Mycobycterium tuberculosis Komplexes und anderer klinisch relevanter Mycobykterium -Spezien durch Nukleinsäure- Amplifikation zweckmäßig sind. Die erfindungsgemäßen Verfahren verwenden multiplexe Strang- Vertauschungs- Amplifikation (SDA) in einer einzigen Amplifikations- Reaktion, die für eine simultane Identifizierung von M. tuberculosis geeignet ist und ein Screening für im wesentlichen alle klinisch relevanten Spezien von Mycobakterien ermöglicht. SDA ist für die Amplifizierung von zwei DNA Sequenzen auf das 10&sup8;- fache während einer einzigen Inkubation bei einer konstanten Temperatur geeignet.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt die Amplifikations- Reaktion weiters eine interne Kontroll- Sequenz, wie in der EP 0 623 682 beschrieben, mit ein. Diese interne Kontroll- Sequenz wird mit zwei Target- Sequenzen in einem Multiplex- Amplifikations- Protokoll amplifiziert, wobei ein einziges Paar von Amplifikations- Primern für die simultane Amplifikation von IS6110, 16S und internen Kontroll- Targets eingesetzt wird (Triplex- Amplifikation). Bei dieser Ausführungsform stellt der Test in einer einzigen Amplifikations- Reaktion Mittel zum Quantifizieren des Targets oder zum Bestimmen der Proben- Amplifikations- Aktivität und zum Erfassen und bzw. oder Identifizieren von klinisch relevanten Mycobakterien, die möglicherweise vorhanden sind, bereit. Die simultane Amplifikation von Art- und Spezien- spezifischen Mycobakterien- Sequenzen mit einer einzigen Kontroll- Sequenz veranschaulicht die breitere Anwendbarkeit der geoffenbarten Verfahren für Adapterübertragende multiplexe Amplifikation von multiplen Targets und einer einzigen internen Kontroll- Sequenz unter Verwendung des selben Primer- Paares.
- Fig. 1 zeigt ein Diagramm, das das Verfahren nach der Erfindung zur Co- Amplifikation von zwei Target- Sequenz in Beispiel 1, Beispiel 2 und Beispiel 3 zeigt,
- Fig. 2 zeigt Sequenz- Ausrichtungen für die Mycobakterium Art- Target- Sequenz in den 16S Ribosom- Genen von verschiedenen Mycobaterien Spezien, einschließlich der Darstellung der den Primer bindenden Stellen.
- Die vorliegende Erfindung schlägt Verfahren für die simultane Amplifikation von multiplen Target- Sequenzen durch Sequenzspezifische Hybridisation von Primen, insbesondere durch SDA (multiplexe SDA) vor. Die Verfahren verwenden ein einziges Par von Amplifikations- Primern oder einen einzigen SDA Amplifikations- Primer zum co- amplifizieren der multiplen Target- Sequenzen. Dies wird durch die Anfügung einer definierten Adapter- Sequenz zu den Targets und Amplifizierung durch Primer- Extension erreicht. Die erfindungsgemäßen Verfahren werden im weiteren als "Adapterübertragendes Multiplexieren" bezeichnet. Dies steht im Kontrast zu "konventionellem Multiplxieren", bei dem multiple Paare von target- spezifischen Primern verwendet werden, um die multiplen Targets zu co- amplifizieren ohne die Hinzufügung von Adapter- Sequenzen.
- Die folgenden Bezeichnungen werden im weiteren wie folgt definiert:
- Ein Amplifikations- Primer ist ein Primer für die Amplifikation einer Target- Sequenz durch sequenz- spezifische Hybridisation. Für SDA, das 3' Ende des Amplifikations- Primes (die Target- Bindungs- Sequenz) hybridisiert an dem 3' Ende der Target- Sequenz und umfaßt eine Erkennungs- Stelle für ein Restriktions- Enzym nahe seines 5' Endes. Die Erkennungs- Stelle ist für ein Restriktions- Enzym, das einen Strang einer DNA Duplex einschnürt, wenn die Erkennungs- Stelle hemi- modifiziert ist, wie durch Walker, et al. (1992. PNAS 89, 392-396 und Nukleic Acids Res. 20, 1691-1696) und in der EP-A-0 497 272 angemeldet 9. Jänner 1992 beschrieben.
- Eine hemi- modifizierte Erkennungs- Stelle ist eine doppelsträngige Erkennungs- Stelle für ein Restriktions- Enzym, in welchem ein Strang zumindest ein derivatisiertes Nukleotid enthält, das ein Abtrennen dieses Stranges durch das Restriktions- Enzym verhindert. Die anderen Stränge der hemi- modifizierten Erkennungs- Stelle enthält keine derivatisiertes Nukleotid an der Segmentierungs- Stelle und wird durch das Restriktions- Enzym eingeschnürt. Die bevorzugten hemi- modifizierte Erkennungs- Stellen sind hemi- phosphorothioatisierte Erkennungs- Stellen für die Restriktions- Enzyme HincII, Hindil, Aval, NciI und Fnu4HI. Für die Mehrzahl der SDA Reaktionen ist der Amplifikations- Primer für exponentielle Amplifikation der Target- Sequenz verantwortlich.
- Ein Adapter- Primer ist ein Oligonukleotid, das eine Sequenz an seinem 3' Ende (die Target- Bindungs- Sequenz) für die Hybridisierung der Target- Sequenz aufweist. An dem 5' Ende des Adapter- Primers befindet sich eine Adapter- Sequenz. Die Adapter- Sequenz kann eine Sequenz sein, die im wesentlichen ident zum 3' Ende eines der Amplifikations- Primer ist oder sie kann durch irgehd eine Sequenz definert sein, für die die Amplifikations- Primer mit komplementären Target- Bindungs- Sequenzen präpariert werden können.
- Ein Bumper- Primer ist ein Primer der sich an eine Target- Sequenz strangaufwärts entweder an dem Adapter- oder dem Amplifikations- Primer bindet, so daß die Verlängerung des Bumper- Primers den strangabwärtigen Primer und dessen Verlängerungs- Produkt vertauscht. Die Verlängerung des Bumper- Primers ist ein Verfahren für den Austausch der Verlängerungs- Produkte von Adapter- und Amplifikations- Primern, doch ist auch ein Erhitzen geeignet.
- Idente Sequenzen werden zu der selben komplementären Nukleotid- Sequenz hybridisiert. Im wesentlichen idente Sequenzen sind ausreichend ähnlich in deren Nukleotid- Sequenz, sodaß sie ebenfalls zu der gleichen Nukleotid- Sequenz hybridisieren.
- Die Bezeichnungen Target oder Target- Sequenz sind für Nukleinäure- Sequenzen verwendet, die zu amplifizieren sind. Diese schließen die ursprüngliche zu amplifizierende Nukleinsäure- Sequenz und deren komplementären zweiten Strang (vor der Zugabe der Adapter- Sequenzen), jeden Strang einer Adapter- modifizierten Kopie der ursprünglichen Sequenz, wie hierin beschrieben, und jeden Strang einer Kopie der ursprünglichen Sequenz, die in einem Zwischenprodukt der Reaktionen, bei denen Adapter- Sequenzen an die ursprüngliche Sequenz angehängt werden, mit ein.
- Die Spezien- spezifische Amplifikation einer Target- Sequenz bezieht sich auf eine Amplifikation einer Target- Sequenz in den Spezien der Mycobakterien, die als Mitglieder des Mycobacterium tuberculosis Komplexes klassifiziert sind, und auf eine geringe oder keine Amplifikation im Nicht-M.tb. Komplex der Mycobakterien.
- Art- spezifische Amplifikation einer Target- Sequenz bezieht sich auf das Amplifizieren einer Target- Sequenz in, im wesentlichen allen klinisch relevanten, Spezien von Mycobakterien und auf geringe oder keine Amplifikation in ähnlichen Nicht- Mycobakterien- Spezien.
- In der Adapter- übertragenden Multiplexierung nach der Erfindung werden Adapter- Sequenzen an die Enden von Target- Sequenzen mittels eines Adapter- Primers und einer Serie von Verlängerungs- und Strang- Vertauschungs- Schritten angehängt. Die Fig. 1 zeigt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der zwei Target- Sequenzen co- amplifiziert werden, unter Verwendung eines einzelnen Paares von Amplifikation- Primern. Eine von den zwei Target- Sequenzen ist spezifisch für den M.tb Komplex (z. B. IS6110) und die andere Target- Sequenz ist spezifisch für alle Arten von Mycobakterien (M. g - z. B. das 16S Gen). Aus Gründen der Klarheit ist die Modifikation von lediglich einem Strang einer jeden Target- Sequenz dargestellt. Bei diesem Ausführungsbeispiel wird ein Ende eines jeden Target- Stranges durch Anhängen einer Sequenz an diesen modifiziert, die im wesentlichen ident zu einem Terminal- Segment des anderen Targets ist. Das andere Ende eines jeden Target- Stranges bleibt unmodifiziert und behält seine ursprüngliche Komplementarität zu einem Mitglied des Amplifikations- Primerpaares. Wie detailliert unten beschrieben wird, können die beiden resultierenden modifizierten Targets durch ein einzelnes Paar von Amplifikations- Primern amplifiziert werden, wobei ein Mitglied eines Paares komplementär zu einem der zwei ursprünglichen Target- Sequenzen ist und das andere Mitglied des Paares komplementär zu der anderen der zwei ursprünglichen Target- Sequenzen ist., Für das erste (spezifisch für den M.tb- Komplex) Target (M.tb- Target) wird ein M.tb- spezifischer Amplifikations- Primer (Stb) zu dem 3' Ende der Target- Sequenz hybridisiert und mit Polymerase verlängert. Die einschnürende Enzym- Erkennungs- Stelle des Amplifikations- Primers ist in der Fig. 1 als ein erhöhter Bereich des Primers dargestellt. Das sich ergebende Verlängersprodukt wird durch Verlängerung eines Bumper- Primers (Btb1), der zu dem Target sttangaufwärts von Stb hybridisiert, vertauscht. Das vertauschte Stb Verlängerungsprodukt (Stb-ext) wird zu einem Adapter- Primer (Atb) hybridisiert, der sich an Stb-ext an dem 3' Ende des Komplements der ursprünglichen Target- Sequenz bindet. Das 5' Ende des Atb umfaßt die Adapter- Sequenz (feste Stelle), die im wesentlichen ident zu 4er Target- Bindungs- Sequenz an dem 3' Ende des Sg ist, und einen Amplifikations- Primer, der spezifisch an das zweite, für Mycobakterien Artspezifische Target (M.g Target) bindet. Die Verlängerung des Atb und die Vertauschung des Atb Verlängerungsproduktes (Atb-ext) erzeugt eine einzelne Strang- Kopie der M.tb Target- Sequenz mit einer einschnürenden Enzym- Erkennungs- Stelle und die M.tb Target- Sequenz an dessen 3' Endes und die Sg Target- Bindungs- Sequenz an dessen 5' Ende.
- Das zweite Target (M.g Target) wird ähnlich behandelt, zuerst Binden und Verlängern eines M.g- spezifischen Amplifikation- Primers (Sg), danach Hybridisieren eines Adapter- Primes (Ag) zu einem Verlängerungsprodukt (Sg-ext). Sq hybridisiert zu dem M.g Target an einem 3' Terminal- Segment des Targets, das komplementär zu beiden Target- Bindungs- Sequenzen des Sg und der Adapter- Sequenz von Atb ist. Das 3' Ende des Adapter- Primers Ag hybridisiert an dem 3' Ende des Komplements des ursprünglichen Targets und das 5' Ende des Ag (offener Abschnitt) ist im wesentlichen ident zu der Target- Bindungs- Sequenz des Stb. Die Verlängerung und der Austausch des A9 Verlängerungs- Produktes (Agext) erzeugt eine Kopie der zweiten Target- Sequenz mit einer einschnürenden Enzym- Erkennungs- Stelle (erhöhter Abschnitt) und der M.g Target- Sequenz an deren 3' Ende und der Stb Target- Bindungs- Sequenz an deren 5' Ende. Die zwei Adaptermodifizierten Kopien der Target- Sequenzen sind amplifizierbar durch SDA unter Verwendung lediglich der Stb und Sg Amplifikation- Primer, die in der Reaktion bereits vorhanden sind. Zu Beginn hybridisieren SDA, Atb-ext und Ag-ext zu deren entsprechenden Amplifikations- Primern, die verlängert werden, um das Komplement des modifizierten Stranges (z. B. Verlängerung des Stb an dem M.tb modifizierten Strang und Verlängerung von Sg an dem M.g modifizierten Strang) zu erzeugen, einschließlich des Komplements der Adapter- Sequenz an dem 3' Ende. Nach dem Abschnüren und Austausch kann der Amplifikations- Primer des gegenüberliegenden Targets dann an das 3' Ende von diesem Verlängerungsprodukt anbinden (z. B. Sg an den M.tb- abgeleiteten Strang und Stb an den M.g- abgeleiteten Strang) und verlängert werden, um ein Fragment mit einer einschnürenden Enzym- Erkennungs- Stelle an jedem Ende zu erzeugen. Dieses Fragment wird durch konventionelle SDA amplifiziert, wie dies von Walker et. al supra beschrieben ist.
- Die doppelsträngigen Reaktionsprodukte, die nach der Vertauschung von Atb-ext und Ag-ext erzeugt werden, können auch an einer Reaktions- Schleife partizipieren, die zusätzliche Kopien von Atbext und A; -ext erzeugt. Das Einschnüren der Restriktions- Enzym- Erkennungs- Stelle auf dem Grundstrang, das Verlängern mit Polymerase und das Vertauschen des Grundstranges erzeugt Targets, die ähnlich mit Stb-ext und Sg-ext aber mit der Hälfte der das Restriktions- Enzym erkennenden Stelle am 5' Ende sind. Der Adapter- Primer kann an diese Fragmente binden und kann verlängert und vertauscht werden, um zusätzliche Kopien von Atb-ext und Ag-ext (auch mit der Hälfte einer Restriktions- Enzym- Erkennungs- Stelle an dem 5' Ende) zu erzeugen, die in den Zyklus der SDA Reaktion, wie oben beschrieben, eintreten.
- Fig. 1 zeigt die Erzeugung von modifizierten Targets von lediglich einem der zwei komplementären Strängen, die üblicherweise für jede Target- Sequenz vorhanden sind. Nach Verfahren, ähnlich den beschriebenen Verfahren, machen den Anfang mit dem zweiten Strang eines jeden Targets. Im Falle des zweiten Stranges ist die Reihenfolge von Bindung und Verlängerung des Primers jedoch umgekehrt. Der Adapter- Primer bindet zuerst direkt an den zweiten Strang des Targets an und wird an dieser Schablone verlängert. Nach der folgenden Vertauschung hybridisiert das resultierende Adapter- Verlängerungsprodukt zu dem Amplifikations- Primer, der in weiterer Folge verlängert und vertauscht wird, um ein Produkt zu liefern, das die ursprüngliche zweite- Strang- Target- Sequenz mit einer Erkennungsstelle für ein einschnürendes Restriktions- Enzym an seinem 5' Ende und eine Sequenz komplementär zu der Adapter- Sequenz an seinem 3' Ende aufweist. Diese modifizierte Fragment tritt in eine konventionelle SDA Amplifikation durch Bindung und Verlängerung des Amplifikations- Primers ein, der spezifisch für das Gegen- Target (z. B. Sg bindet an den M.tbabgeleiteten Strang und Stb bindet an den M.g- abgeleiteten Strang) ist, um ein Fragment für jeden zweiten Strang des Targets mit einer einschnürenden Enzym- Erkennungs- Stelle an jedem Ende zu erzeugen.
- Alle Schritte der Reaktion, die in das Anhängen der Adapter- Sequenzen und Amplifizieren des Targets involviert sind, können gleichzeitig in einer einzelnen Reaktions- Mischung auftreten. Dies bedeutet, daß wenn einmal die Adapter- Sequenzen an ein Target- Molekül angehängt sind, die Amplifikation des Target- Moleküls innerhalb der selben Reaktions- Mischung vor dem Anhängen der Adapter- Sequenzen an irgend ein anderes vorhandenes Molekül ohne Isolation des modifizierten Targets stattfinden kann. Die Reaktionsbedingungen für diese Verfahren nach der Erfindung sind im wesentlichen wie von Walker et. al., supra, für SDA beschrieben sind, jedoch mit einigen Modifikationen. Erstens enthält die anfängliche Reaktionsmischung sowohl die Amplifikations- Primer, wie auch die Adapter- Primer und auch die Target DNA. Zusätzlich sind die Amplifikations- Primer vorzugsweise in ungefähr 10- fachem Überschuß gegenüber den Adapter- Primern und in einem ungefähr 20-fachen Überschuß gegenüber den Bumper- Primern vorhanden. Die Konzentration der Bumper-Primer ist nicht kritisch, aber soll im allgemeinen geringer als die Konzentration sein, die in einer konventionellen SDA verwendet wird. Jedoch, ähnlich der konventionellen SDA, werden das einschnürende Restriktions- Enzym und exo Klenow Polymerase nach einer Hitze- Denaturierung der Target DNA und Anbinden des Primers zugesetzt. Nach der Denaturierung der Target DNA, dem Anbinden des Primers und der Zugabe von Polymerase laufen die Prozesse des Anhängens der Adapter- Sequenzen und der Amplifikation automatisch in einer einzigen Reaktions- Mixture ohne weitere Eingriffe des Praktikanten ab. Das heißt, nachdem die Adapter- Sequenzen angehängt sind, tritt eine modifizierte Target- Sequenz automatisch in den SDA Reaktions- Zyklus ein.
- Die vollständige Nukleotid- Sequenz des IS6110 Einfüge- Elementes wurde von Thierry et al. (1990, Nucleic Acids Res. 18, 188) beschrieben. Die Verfahren nach der Erfindung sehen Primer vor, die eine Target- Sequenz innerhalb des IS6110 Einfüge- Elementes amplifizieren, das in den Spezies des Mycobakterium Komplexes (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum und M. microti) vorhanden ist. Diese Primer sind komplementär zu Nukleotiden 972- 984 von IS6110 und tragen wenig oder nichts zur Amplifikation des Targets in anderen Mycobakterien Spezies als des M.tb Komplexes oder in Nicht- Mycobakterien Spezies bei. Diese Primer sind hierin als Spezien- spezifische Primer definiert.
- Die Orientierung der 16S Ribosom- Gene von verschiedenen Mycobakterien Spezien, wie in der Fig. 2 dargestellt, wurden für das Design des Art- spezifischen Primers für die Nukleinsäure- Amplifikation verwendet, der ein Target von im wesentlichen allen klinisch relevanten Spezien von Mycobakterien amplifiziert, nicht aber von Nicht- Mycobakterien- Spezien. Die ausgewählte M. tuberculosis Sequenz an der Nukleotid Position 507-603 ist ident mit den Sequenzen in M. bovis, M. bovis BCG, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. gastri, M. paratuberculosis, M. malmoense, M. szulgai, M. gordonae, M. leprae, M. ulcerans, M. asiaticum und M. scrofulaceum. Für einige Spezien in der Sequenz- Datenbank ist ein unbestimmtes Nukleotid an der Position 587 oder 588 aufgelistet, doch betrifft keine dieser Positionen die Bindung des Primers. M. terrae, M. chelonae, M. fortuitum und oder unsere Linie von M. marinum variieren von dieser allgemeinen Sequenz an drei Nukleotid Positionen. Die Sequenz unserer Linie von M. marinum war unerwartet, da die GENBANK Sequenz für diesen Organismus als ident zu M. bovis, nicht aber zu M. terrae, M. flavescens, M. xenopi und M. genavense beschrieben wurden und zeigt eine extensivere Sequenz- Varianz. Diese Target- Sequenz divergiert signifikant von der M. tb Sequenz in Organismen, die in anderer Weise im allgemeinen ähnlich den Mycobakterien sind. Ungeachtet der Sequenz- Variabilität unter Mycobakterien wurde jedoch gefunden, daß die Primer, die zum Amplifizieren. der Target- Sequenz gestaltet sind, wie in der Fig. 2 dargestellt, speziell ein Target amplifizieren, das in den klinisch relevanten Arten von Mycobakterien, nicht aber in anderen ähnlichen Nicht- Mycobakterien Spezien vorhanden sind. Diese Primer sind hierin als Art- spezifische Primer definiert.
- Die gleichzeitige Amplifikation der M. tb Spezien- spezifischen IS6110 Sequenz und der Art- spezifischen 16S Sequenz in einer Multiplex DNA Reaktion erlaubt eine rasche Erkennung und bzw. oder Identifikation von M. tb Organismen und anderer klinisch relevanter Mycobakterien Spezien in einer einzigen Reaktion. Die Erkennung des amplifizierten IS6110 und 16S Targets ist indikativ für die Anwesenheit von einem Organismus des M. tuberculosis Komplexes in der Probe. Die Erkennung von lediglich 16S Targets ist indikativ für die Anwesenheit von Mycobakterien des Nicht- M. tb Komplexes. Da Ergebnisse innerhalb eines Tages durch die Verwendung von Nukleinsäure- Amplifikations- Verfahren innerhalb eines Tages erhalten werden können, ist es nicht länger erforderlich sechs Wochen für die Ergebnisse der Kultur vor dem Erreichen einer Entscheidung zu warten, daß eine Probe negativ für klinisch relevante Mycobakterien ist.
- In einem ersten Ausführungsbeispiel werden IS6110 und 16S Target- Sequenzen co- amplifiziert, wobei dies durch Adapter- übertragende multiplexe SDA unter Verwendung von Art- spezifischen und Spezienspezifischen Primern gemäß der Erfindung erfolgt.
- In einer bevorzugten alternativen Ausführungsform schließt die Adapter- übertragende multiplexe SDA Reaktion weiters eine interne Kontroll- Sequenz mit ein, wie dies in der EP 0 623 682 beschrieben ist. Die bevorzugte interne Kontroll- Sequenz zur Verwendung mit Art-spezifischen und Spezien- spezifischen Primern des folgenden Beispiels ist (SEQ ID NO: 12). SEQ ID NO: 12 enthält eine Kern- Sequenz von SEQ ID NO: 1 gemäß EP 0 623 682 und eine Amplifikations- Primer Bindungs- Sequenz an jedem Ende, um eine Co- Amplifikation unter Verwendung eines einzelnen Paares von Primern zu ermöglichen, wie dies in der EP 0 628 640 beschrieben ist. Die Amplifikation- Primer Bindungs- Sequenzen der internen Kontroll- Sequenz sind komplementär zu den Target- Bindungs- Sequenzen der Amplifikations- Primern.
- Es ist für den Fachmann aus der obigen Offenbarung verständlich, daß entweder die IS6110 oder 16S Sequenzen allein in einer konventionellen SDA Reaktion amplifiziert werden können. Zum Beispiel kann für die M. tb Erkennung allein die 16S Sequenz gemäß Walker, et al. unter Verwendung von Sg und Stb mit Ag Adapter- Primer amplifiziert werden. Alternativ, wenn lediglich eine Artspezifische Erkennung gewünscht wird, kann die 16S Sequenz unter Verwendung von Sg und einem Ag amplifiziert werden, wobei Äg modifiziert ist, um als Amplifikations- Primer zu dienen, z. B. Ersetzen der M. tb Adapter- Sequenz mit einer ein HincII Restriktions Enzym erkennenden Stelle. Ähnlich kann die IS6110 Target- Sequenz allein amplifiziert werden unter Verwendung von Sg und Stb mit dem Atb Adapter- Primer, oder unter Verwendung von Stb und einem Atb Adapter- Primer, der durch Ersetzen der M. g Adapter- Sequenz mit einer HincII Restriktions- Enzym- Erkennungs- Stelle modifiziert ist, um als ein Amplifikations- Primer zu dienen.
- Die Amplifikationsprodukte des IS6110, 16S und der internen Kontroll Target- Sequenzen können durch Hybridisation zu Oligonukleotid Proben, die mit einem Erkennungszeichen markiert sind, erfaßt werden, wobei jede der drei Proben spezifisch zu einem der Targets hybridisiert wird. Wenn die Target- spezifischen und Kontroll- spezifischen Proben gleichzeitig zu Amplifikations- Produkten hybridisiert werden, so sollen die Erkennungszeichen separat identifizierbar sein, um die Unterscheidung der entsprechenden Mengen der Kontrolle und des Targets zu erleichtern. Andererseits können separate aliquote Teile der Amplifikations- Reaktion getrennt zu Target- spezifischen und Kontroll- spezifischen Proben, die mit dem selben Erkennungszeichen markiert sind, hybridisiert werden. Das Erkennungszeichen kann zu der Probe konjugiert werden, nachdem diese sythetisiert ist oder sie kann in die Probe während der Synthese eingefügt werden, zum Beispiel in Form eines vom Erkenungszeichen abgeleiteten Nukleotids. Solche Erkennungszeichen sind der Fachwelt bekannt und schließen direkt oder indirekt erfaßbare Erkennungszeichen mit ein. Direkt erfaßbare Erkennungszeichen erzeugen ein Signal ohne weitere chemische Reaktionen und schließen solche Erkennungszeichen wie Fluorochrome, Radioisotopen und Farben mit ein. Indirekt erfaßbare Erkennungszeichen erfordern eine weitere chemische Reaktion oder die Zugabe von Reagentien, um ein erfaßbares Signal zu liefern. Diese schließen zum Beispiel Enzyme, wie Meerrettich- Peroxidase und alkalische Phosphatase, Liganden, wie Biotin, das durch die Bindung zu einem zum Erkennungszeichen konjugierten Avidin erfaßt werden kann, und chemiluminiszente Moleküle mit ein. Die Proben können zu deren entsprechenden Amplifikations- Produkte in Lösungen, Gels, oder auf festen Trägern hybridisiert werden. Nach der Hybridisation werden die Signale von den zugehörigen Erkennungszeichen entwickelt, erfaßt und separat quantifiziert unter Verwendung geeigneter Verfahren für das gewählte Erkennungszeichen und Hybridisations- Protokoll. Der Betrag des erfaßten Signals für jedes Amplifikations- Produkt ist eine Reflexion der vorhandenen Menge.
- Ein bevorzugtes Verfahren zur Erfassung der Target- und Kontroll- Amplifikations- Produkte erfolgt durch Polymerase- Verlängerung eines Primers, der spezifisch zu der Target- oder Kontroll- Sequenz hybridisiert ist. Der Primer ist wie oben beschrieben gekennzeichnet, vorzugsweise mit einer Radioisotope, so daß das Erkennungszeichen des Primers in das verlängerte Reaktionsprodukt eingefügt ist. Dieses Verfahren ist in größerem Detail von Walker, et al. (1992) Nuc. Acids Res und PNAS, supra beschrieben. Ein zweites bevorzugtes Verfahren zur Erfassung von amplifizierten Target- und Kontroll- Sequenzen ist ein Chemiluminiszenz- Verfahren, bei dem amplifizierte Produkte unter Verwendung einer Biotin enthaltenden Fänger- Oligodeoxinukleotid- Probe und ein Enzym- konjugierte Detektor- Oligodeoxinukleotid- Probe, wie dies im Beispiel 3 erläutert ist. Nach der Hybridisierung dieser zwei Proben zu verschiedenen Stellen an die amplifizierte Target- Sequenz, wird der Komplex auf einer mit Streptavidin bestrichenen Mikrotiter- Platte gehalten und das Chemiluminiszenz- Signal entwickelt und in einem Luminometer abgelesen. Dieses Erfassungsverfahren kann in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden und ist genügend sensitiv um so wenige wie eine Pre-Amplifikations- Target- Sequenz zu erfassen.
- SDA Reaktionen, die Primers nach der Erfindung verwenden, können Thymin enthalten, wie von Walker, et al. supra, beschrieben, oder können vollständig oder teilweise durch 2'-Deoxiuridin 5'- Triphosphat für die TTP Reaktion als ein Mittel für die Reduzierung der Kreuz- Kontamination der folgenden SDA Reaktionen substituiert sein (wie in den folgenden Beispielen erläutert) und in der EP 0 624 643 (entspricht der U. S. Ser. Nr. 08/060,842) beschrieben. du ist in das Amplifikationsprodukt sowohl der Target -, wie auch der Kontroll- Sequenzen eingefügt und kann durch Behandlung mit Urazil DNA Glykosylase (UDG) exidiert werden. Diese abasischen Stellen machen das Amplifikationsprodukt in den folgenden SDAs unamplifizierbar. Die interne Kontroll- Sequenz kann auch, wie anfänglich synthetisiert, dU an Stelle von Thymin einfügen, um seine Amplifikation in den folgenden SDAs zu verhindern. Zum Beispiel ist SEQ ID NO: 12 in der angefügten Sequenz- Liste als Thymin enthaltend dargestellt, doch kann es auch aus der korrespondierenden Sequenz bestehen, in der Thymin vollständig oder teilweise durch dU ersetzt ist. UDG kann durch einen Urazil DNA Glykosylase Inhibitor (Ugi) vor der Durchführung der folgenden Amplifikation inaktiviert werden, um die Exzision von dU in den neu gebildeten Amplifikationsprodukten zu verhindern.
- Da bestimmte Primer und Proben, die hierin geoffenbart sind, und in den folgenden Beispielen erläutert werden, ident in der Sequenz zu Primern und Proben sind, die bereits in den Stamm- Anmeldungen sind, wird die folgende Korrespondenz- Liste von Sequenz ID Nr. aus Gründen der Klarheit angegeben:
- Die Primer und bzw. oder Proben für die Test- Verfahren nach der Erfindung können in Form eines Diagnose- Kits für gleichzeitige Art- spezifische und Spezien- spezifische Amplifikation der Mycobakterien DNA zusammengestellt sein. Die Kits können die Amplifikations-, Adapter- und Bumper- Primer für Art- spezifische und Spezien- spezifische Amplifikation der Mycobakterien DNA, wie auch die Reagentien, die zur Durchführung der SDA Reaktion (z. B. Deoxinukleosid Triphosphate, einschnürende Restriktions- Enzyme, Puffer, exo&supmin; Polymerase, u. s. w.) erforderlich sind, umfassen. Diese Kits können weiters gegebenenfalls die Proben oder Primer einschließen, die für die Erfassung und die Identifikation der Amplifikationsprodukte und bzw. oder einer internen Kontroll- Sequenz für die Co- Amplifikation mit den Mycobaterium Target- Sequenzen erforderlich sind.
- Ein Verfahren zur gleichzeitigen Amplifikation multipler Mycobakterien- Target- Sequenzen in einer Probe gemäß der vorliegenden Erfindung ist in den Ansprüchen 1, 2 und 8 beschrieben, worin die Verwendung einer Kombination von SEQ. ID. NO: 3, 4, 7 und 8 als Bumper- Primer ausgeschlossen ist.
- Dieses experimentelle Beispiel zeigt die Co- Amplifikation von Art- und Spezien- spezifischen Target Nukleinsäuren unter Verwendung des Amplifikations- Verfahrens, das in der Fig. 1 dargestellt ist. Das erste Target war das IS6110 Insertions- Element von M. tuberculosis (Target A). Das zweite Target war das 16S Ribosom Gen von M. tuberculosis (Target B). Eine Amplifikations- Reaktion wurde für jede der folgenden Spezien aufgebaut: M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294), M. bovis (CDC 81), M. bovis-BCG (CDC34), M. avium (ATCC 25291), M. intracellulare (ATCC 13950) M. kansasii (LCDC 711), M. gastri (LCDC 1301), M. fortuitum (LCDC 2801), M. paratuberculosis (LINDA), M. chelonae (TMC 1543), M. malmoense (CDC 93), M. szulgai (TMC 1328), M. flavescens (LCDC 2601), M. xenopi (LCDC 1901), M. terrae (TMC 1450), M. marinum (LCDC 801) und M. gordonae (TMC 1318). Die "kein Target" Probe enthält keine bakterielle Target DNA. Die "kein SDA" Probe stellt eine Kontroll- Reaktion dar, zu der keine- Amplifikations- Enzyme zugesetzt wurden.
- SDA wurde durchgeführt, wie allgemein von Walker, et al., Nuc. Acids Res. Supra, unter Substitution dUTP für TTP beschrieben, um die Entfernung von kontaminierenden Amplikons zu ermöglichen. Die finalen Konzentrationen von Komponenten war 45 mN KiP04, pH 7,5, 6 mN MgCl&sub2;, 0, 5mM dUTP, 0, 2 mM dGTP, 0, 2mM dCTP, 0, 2mM dATPaS, 0, lmg/ml azetyliertes BSA, 12%(v/v) Dimethylsulfooxid, 3% (v/v) Glycerol (geliefert durch die Ausgangs- Lösung von exo Klenow und HincII), 50 ng menschlicher plazentaler DNA, 2,5 Einheiten von exo Klenow (United States Biochemical, Cleveland, OH), 150 Einheiten HincII (New England Biolabs, Beverly, MA) und 1000 Genome (Moleküle) der zu testenden Mycobakterien Spezien. Jede Probe enthält zwei Sätze von vier Primern wie folgt: Satz #1) 500nM von SAQ ID NO: 1 (Stb in Fig. 1). 50nM von SEQ ID NO: 2 (Atb), 25nM einer jeden der SEQ ID NO: 3 (Btb1) und SEQ ID NO: 4 (Btb2); Satz #2) 500nM von SEQ ID NO: 5 (Sg in Fig. 1); 50nM von SEQ ID NO: 6 (Ag), 25nM einer jeden der SEQ ID NO: 7 (Bg1) und SEQ I D NO: 8 (Bg2).
- Die Primer von Satz #1 sind für die Spezien- spezifische Erfassung des IS6110 Elementes vorgesehen. Der IS6110 Amplifikations- Primer (Stb) ist komplementär zu den Nukelotiden 972-984 der IS6110 Sequenz. Die Bumper- Primer sind bei diesem Beispiel komplementär zu den Nukleotiden 954-966 beziehungsweise 1032-1044 der IS6110 Sequenz, jedoch können andere Bumper- Primer, die hybridisiert und verlängert werden können, um das Verlängerungsprodukt des Amplifikations- Primers des Satzes #1 zu vertauschen, basierend auf der Kenntnis der IS6110 Sequenz ausgewählt werden. Die Primer des Satzes #2 sind für die Art- spezifische Erkennung von klinisch relevanten Mikrobakterien vorgesehen.
- Jede 47uL Probe wurde assembliert um alle Reagenzien außer exo&supmin; Klenow und HincII unter Verwendung 10X konzentrierter Ausgangs- Lösungen eines jeden Reagenten zu enthalten. Das MgCl&sub2; wurde nach der Zugabe und dem Mischen aller anderer Reagenten (außer exo- Klenow und Hinoll) hinzugefügt, um eine Ausfällung zu verhindern, die auftritt wenn KiPO&sub4;, Dimethylsulfoxid und. MgCl&sub2; mit Konzentrationen gemischt werden, die merklich höher als 45mM, 12% (v/v) beziehungsweise 6mM sind. Die Proben werden dann für 2 min in einem kochenden Wasserbad erhitzt, um die Mycobakterien DNA zu denaturieren. Ein Ausfällen wurde unmittelbar nach dem entfernen aus dem kochenden Wasserbad beobachtet. Das Inkubieren für 2 min bei 40ºC und Mischen in einem Vortex- Mischer löste den Großteil der Hoch- Temperatur Ausfällung wieder auf. Exo Klenow (1uL von einer 2,5 Einheiten/uL Ausgangs- Lösung) und HincII(2uL von einer 75 Einheiten/uL Ausgangs- Lösung) wurden für ein gesamtes Volumen der Probe von 50uL zugesetzt und die Proben für 2 Stunden bei 40ºC inkubiert.
- Amplifikations- Produkte wurden durch Primer- Verlängerung erfaßt, wie von Walker, et al., Nuc. Acids Res., supra, beschrieben und substituierten auch dUTP. Ein 5uL aliquoter Rest einer jeden Probe wurde gemischt mit 5uL von 45m1v1 KiP04, pH 7, 5, GrnN MgCl&sub2;, 0, 5 mN dUTP, 0, 2 mM dGTP, 0, 2 mN dCTP, 0, 2mM daTPccS, 0, lmg/ml azetyliertes BSA und 2uL von einer 5'-32p Detektor- Proben Ausgangs- Lösung (50mM Tris-HCl, pH 8,10mM MgCl&sub2;, 1uM einer jeden der drei S'-32P Detektor- Proben). Die Detektor- Probe für das IS6110 Target war SEQ ID NO: 9 (Spezien- spezifisch für den M.tb Komplex). Die Detektor Proben für das 16S Target waren SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11. SEQ ID NO: 11 entspricht den S16 Sequenzen von M. fortuitum, M. chelonae, M. terrae, M. marinum und M. flavescenes ("fc" Detektor). SEQ ID NO: 10 entspricht dem verbleibenden Nicht- M.tb Komplex Spezien, die getestet wurden. Die 12uL Proben wurden dann für lmin in einem kochenden Wasserbad erhitzt. Nach einem Inkubieren für 2 min bei 37ºC wurden 2uL von lEinheit/uL von exo Klenow hinzugefügt und die Proben wurden für lSmin bei 37ºC inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 14uL von 50% Harnstoff in 0,5X TBE.
- Die Proben wurden für lmin bei 95ºC erhitzt und analysiert unter Verwendung von 8% denaturierendem Gel Elektrophorese und Autoradiografie (Maniatis, et al. 1982. Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Amplifiziertes IS6110 (M. tb Target). wird durch Verlängerung der SEQ ID NO: 9 Detektor Probe zu einem 41- und 63- mer erkannt. Amplifiziertes 16S (M. g Target) wird durch Verlängerung der SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 Detektor- Proben zu 30- und 51-mer erkannt.
- Positive IS6110 und 165 Signale wurden für M. tuberculosis, M. bovis, und M. bovis-BCG erhalten, von denen alle Mitglieder des M. tuberculosis Komplexes sind. Für M. tuberculosis waren die IS6110 Signale stärker als die 16S Signale, da dieser Organismus ungefähr 10 Kopien des Elementes IS6110 Elementes verglichen mit einer einzigen Kopie des 16S Ribosom Gens enthält. Ungefähr gleiche IS6110 und 16S Signale wurden mit M, bovis und M. bovis-BCG erhalten, da diese eine bis zwei Kopien des IS6110 Elementes und eine einzige Kopie des 16S Ribosom Gens enthalten. IS6110 Signale wurden für irgendwelche Mycobakterien Spezies nicht festgestellt, die getestet wurden und keine Mitglieder des M.tb Komplexes waren.
- 16S Signale wurden lediglich für M. avium, M. intracellulare, M. kansasil, M. gastri, M. paratuberculosis, M. malmoense, M. szulgai und M. gordonae, die 16S Target- Sequenzen haben, die ident zu denen von M. tuberculosis, M. gordonae sind, erhalten, die normalerweise nicht phatogen sind, aber eine übliche Kontaminierung in klinischen Laboratorien sind. Es ist daher möglich, daß die Kontaminierung einer negativen Probe mit M. gordonae ein falsches positives Ergebnis für die Mycobakterien- Art in diesem Test erzeugt, wie es auch bei auf Kulturen basierenden Tests vorkommt. Relative schwache 16S Signale wurden für M. fortuitum, M. chelonae, M. marinum und M. terrae erhalten. Es ist möglich, daß dieses Ergebnis mit einer T-G Fehlangleichung mit dem Adapter SEQ ID NO: 6 in Verbindung steht, die sich bei dieser Spezies bildet (siehe Fig. 2). Jedoch, das selbe Experiment, das unter Verwendung eines Art- spezifischen Adapter- Primers mit perfekter Angleichung durchgeführt wurde, lieferte auch ein relativ schwaches Signal, wobei sich die Möglichkeit erhöht, daß das 16S Gen für diese Spezie eine sekundäre Struktur enthält, die die Amplifikation dämpft. Das Signal, das für M. flavescenes erhalten wurde, war so stark - wie für M. fortuitum, abgesehen von einer zusätzlichen A-C Fehlanpassung an dem 3'-Ende des Adapters SEQ ID NO: 6. Kein 16S Signal wurde für M. xenopi, erhalten, möglicherweise aufgrund einer schlechten Anpassung mit den Detektor- Proben. Basierend auf diesen Resultaten, wurden positive 16S Signale auch für Mycobakterium Spezies zusätzlich zu den getesteten erwartet (z. B. M. scrofulaceum, M. leprae, M. ulcerans, M. hemophilum und M. asiaticum), da die 16S Sequenzen für diese Spezien auch mit dem von M.tb passen.
- Dieses experimentelle Beispiel zeigt das Fehlen von Kreuz-Reaktivitäten von dem CO-Amplifikations- Verfahren mit Nicht-Mycobakterien. Die Amplifikationen und Analysen wurden wie im Beispiel 1 durchgeführt, außer daß die Target DNA entweder von M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) oder den folgenden Nicht- Mycobakterien Spezien genommen wurde: Corynebacteria diphtheriae (ATCC 11913), Corynebacteria xerosis (ATCC 373), Corynebacteria pseudodiphtheriticum (ATCC 10700), Nocardia asteroides (ATCC 3308), Nocardia brasiliensis (ATCC 19296), Nocardia orientalis (ATCC 19795), Streptomyces somaliensis (ATCC 33201), Streptomyces griseus (ATCC 10137), Streptomyces albus (ATCC 3004), Streptomyces gedanensis (ATCC 4880), Actinomyces israelii (ATCC 10049), Eubacterium lentum (ATCC 43055), Rbodococcus equi (ATCC 6939), Rhodococcus rhodochrous (ATCC 13808), Propionibacterium acnes (ATCC 6919), Actinoplanes auranticolor (ATCC 15330), Streptosporangium virlalbum (ATCC 33328), und Streptoverticillium alboverticillatum (ATCC 29818). Verschiedene Spezien der selben Art wurden gepoolt zusammen in eine SDA Probe wie unter dem Art- Namen dargestellt eingebracht. Die Nicht- Mycobakterien- Probe enthielten 105 Genom Kopien für jede der angegebenen Spezien. Die "kein Target" Probe enthielt keine Bakterielle DNA.
- Alle Nicht-Mycobakterien Organismen (105 Genom), die getestet wurden, erzeugten Signale die schwächer waren als das Signal, das von lediglich 10 Genomen von M. tuberculosis erhalten wurde, auch wenn die Nicht-Mycobakterien Organismen im allgemeinen ähnlich wie Mycobakterien getestet wurden.
- Dieses experimentelle Beispiel zeigt die Ausführungsform der Erfindung, bei der eine interne Kontroll- Sequenz mit IS6110 und 16S Target- Sequenzen co-amplifiziert wird, wobei die IS6110/16S Amplifikations- Primerpaare (Triplex- Amplifikation) verwendet werden. Die Amplifikationen wurden wie im Beispiel 1 durchgeführt, wobei M. tb DNA verwendet wurde, die in verschiedenem Ausmaß verdünnt wurde, um die Sensibilität des Erkennungsverfahrens zu bewerten. Die Amplifikations- Produkte wurden in einem Fest- Phasen- Chemiluminiszenz- Test erfaßt, in dem amplifizierte Target- und Kontroll- Sequenzen auf Mikrowell- Platten zu einer immobilisierten Fänger- Probe hybridisiert wurden. Die Hybridisierung wurde durch Sandwich- Hybridisierung der gefangenen Target- oder Kontroll- Sequenz zu einer Detektor- Probe erfaßt, die mit alkalischer Phosphatase gekennzeichnet sind. Die gefangenen Proben wurden entweder an deren 5' oder 3' Enden mit Biotin gekennzeichnet und durch Bindung an Streptavidin auf der Mikrowell- Platte immobilisiert. Die Detektor- Proben wurden entweder an deren 5' oder 3' Enden mit alkalischer Phosphatase (AP) gekennzeichnet und durch eine enzymatische Reaktion mit LUMIPHOS 530 (Lumigen, Inc., Detroit, M1) erfaßt.
- Oligodeoxinukleotid Fänger- Proben mit 5' Biotinylation (SEQ ID NO: 13 für die IS6110 Target- Sequenz und SEQ ID NO: 15 für die interne Kontroll- Sequenz) wurden synthetisiert, wie im Beispiel 2 der EP 0 623 682 beschrieben. Oligodeoxinukleotid Detektor- Proben, die mit AP (SEQ ID NO: 14 für IS6110 und SEQ ID NO: 16 für die interne Kontrolle) gekennzeichnet sind, wurden ebenfalls synthetisiert und, wie in EP 0 623 682 beschrieben gekennzeichnet.
- Oligodeoxinukleotid- Fänger Proben mit 3' Biotinylation wurden wie folgt synthetisiert: SEQ ID NO: 17 (Fänger- Probe für die 16S Target- Sequenz) wurde unter Verwendung eines DNA Synthetisierers (Model 380B, Applied Biosystems, Foster City, CA) systhetisiert. 3'BIOTIN-ON CPG (kontrolliertes Porenglas, Clontech, Palo Alto CA) wurde verwendet, um ein Biotin- Teil an das 3' Ende des Oligodeoxinukleotids anzufügen. Zwei zusätzliche Biotins wurde dann an das 3' Ende unter Verwendung eines BIOTIN-ON Phosphoramidit Reagenten (ebenfalls von Clontech) zugegeben. Die Oligodeoxinukleotide wurden dann präpariert, wobei Standar Phosphoramidit Reagenten verwendet wurden, und von der feste Phase aufgespalten, um rohe 3'- Biotin enthaltende Oligodeoxinukleotide zu bilden. Die Reinigung wurde mit Phasenumkehr Hochdruck Flüssig- Chromatographie (HPLC) (Brownlee Lab Auapore RP 300 Säule - 220 · 4, 6 mm, C8 Säule 7 Partikel, 300 Ä Porengröße) mit einem UV Monitor mit 254 nm und einem Gradienten von 14 zu 44% Puffer B über eine Stunde und einer Durchflußrate von /ml/Minute durchgeführt (Puffer B: O,1M Triethylamin- Azetat pH 7 mit 50% Azetonitril; Puffer A: O,1M Triethylamin- Azetat, pH 7).
- Oligodeoxinukleotid Detektor Proben für die Kennzeichnung von 5' mit alkalischer Phosphatase wurden von 5'- Amino- Oligodeoxinukleotiden synthetisiert, die unter Verwendung eines DNA Synthetisierers (Model 380B, Applied Biosystems, Foster City, CA präpariert wurden. SEQ ID NO: 19 ist eine Detektor- Probe für die 16S Target- Sequenz in M. fortuitum, M. chelonae, M. terrae und M. flavescens ("fc" Detektor). SEQ ID NO: 18 ist eine Detektor- Probe für die 16S Target- Sequenz in den verbleibenden Nicht- M. tb Spezien der getesteten Mycobakterien. Der Reagent AMINOLINK II (Applied Biosystems, Foster City, CA) wurde verwendet um eine Amino- Gruppe an den 5'- Enden der Oligodeoxinukleotiden, wie dies oben beschrieben ist, für die nachfolgende Konjugation mit alkalischer Phosphatase zu plazieren. Die rohen Konjugate wurden in 20m14 Tris pH 7,5 dialysiert und unter Verwendung von CENTRIPREP 30 (Amicon, Danvers, MA) auf ungefähr 2 ml konzentriert. Die konzentrierten Konjugate wurden dann durch HPLC gereinigt, wobei eine DEAE-5PW Kolonne (7, Smm · 7, 5 cm) und ein Gradient von 0 bis 66% Puffer B (Puffer B: 20 mN Tris, 1M NaCl ph 7,5, Puffer A: 20mM Tris pH 7,5) und eine Durchflußrate von /ml/Minute verwendet wurden. Die Ektinktion wurde bei 254 nm beobachtet. Die Fraktionen wurden gesammelt, die Aktivität der Konjugate wurde bestimmt und die konjugierten Produkte wurden, wie oben beschrieben, gelagert.
- Biotin enthaltendes Rinder- Serum- Albumin (biotin*BSA) (Pierce, Rockford, 1L) wurde auf 5 ug/ml in 50mM Karbonat pH 9,6 (Sigma, St. Louis, M0, unter Verwendung von in einem Autoklaven behandelten Wasser präpariert) verdünnt und wurde in jede Vertiefung (1004/Vertiefung) eines Labsystems Strip- Wells (Labsystems, Research Triangle Park, NC) pipettiert und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden zweimal unter Verwendung eines FTA Hemagglutinations- Puffers pH 7,2 (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD) gewaschen (375u1/Waschvorgang) und unter Verwendung von im Autoklaven behandeltem Wasser präpariert. Streptavidin im Hemagglutinations- Puffer wurde zu den mit Biotin*BSA beschichteten Vertiefungen (100u1/Vertiefung) hinzugefügt. Die Platten wurden bedeckt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Ungebundenes Streptavidin wurde durch Inversion der Vertiefungen entfernt und ein Blockier- Puffer (300u1/Vertiefung - Hamagglutinations- Puffer pH 7,2, 0,05% w/v BSA) wurde hinzugefügt. Die Platten wurden abgedeckt und wie oben, über Nacht inkubiert, der Blockier- Puffer wurde durch Inversion der Vertiefungen entfernt. Die Platten wurden zweimal mit Hamagglutinations- Puffer (375u1/Vertiefung) und dann nochmals unter Verwendung eines Hamagglutinations- Puffers mit 2%w/v Trehalos (375u1/Vertiefung - Fluka, Ronkonkoma, NY) gewaschen. Die Platten wurden für eine Stunde bei 37ºC getrocknet, in Mylar- Beutel mit einem Trocknungsmittel eingeschweißt und vor dem Gebrauch über Nacht bei Raumtemperatur gelagert. Die Platten wurden danach bei 2 bis 8ºC gelagert.
- SDA wurde wie in Beispiel 1 aus Proben hergestellt, die 0, 5, 10, 20 40 und 80 Kopien vom M.tb Genom enthielten. Eine "durch Hitze abgetötete" Probe war ebenfalls mit eingeschlossen, um die Hintergrund- Luminiszenz, die durch die Detektor- Probe erzeugt. wird, bewerten zu können. Die durch Hitze abgetötete Probe wurde unmittelbar nach dem Beginn der SDA Reaktion erhitzt, um eine Amplifikation zu verhindern. Jede Reaktion umfaßte auch 1000 Kopien der internen Kontroll- Sequenz (SEQ ID NO: 12 in der Thymin durch dU ersetzt ist). Funfundvierzig ul von jeder komplettierten SDA Reaktion wurde in 180 ul von sterilem Wasser in einem sterilen mit Silikon behandelten Rohr verdünnt. Die verdünnten SDA Reaktionen wurden für 3 min auf 95ºC erhitzt um die DNA zu denaturieren. Die Röhren wurden für 5min bei Raumtemperatur gekühlt und danach wurden 50u1 von jeder der denaturierten, verdünnten SDA Reaktion zu jeder der drei Vertiefungen hinzugefügt. In einer Vertiefung wurden die SDA Reaktions- Produkte mit dem IS6110 Fänger- und Detektor- Proben- Satz hybridisiert, in der zweiten Vertiefung wurden die SDA Reaktions- Produkte mit dem 16S Fänger- und Detektor- Proben- Satz hybridisiert und in der dritten Vertiefung wurden die SDA Reaktions- Produkte mit dem internen Kontroll- Fänger- und Detektor- Proben- Satz hybridisiert. Unmittelbar nach der Zugabe der Proben in die Vertiefungen wurden 50u1/Vertiefung einer Hybridisations- Mischung (100 mN Natriumphosphat, 0,02% BSA, 1,8M NaCl, 02% NaN&sub3;, 0,1mM ZnCl&sub2;, 20 ug/ml gescherte Lachs Sperma DNA, pH 7,0, Fänger- und Detektor- Proben) hinzugefügt. Die Platten wurden abgedeckt und für 45 min bei 37ºC inkubiert. Drei sehr sorgfältige Waschungen (300u1/Vertiefung - 10mM Tris pH 7,5, 0,1%w/v BSA, 0,01%v/v NONIDET P-40, 250mw NaCl) wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Bei jeder Waschung wurde die Flüssigkeit für lmin in den Vertiefungen belassen, bevor diese wieder entfernt wurde. LUMIPHOS 530 AP Substrat (100u1/Vertiefung) wurde hinzugefügt und die Platten abgedeckt und für 30 min bei 37ºC inkubiert. Die Luminiszenz (Relative Light Units - RLU) wurde auf einem Mikrotiter Platten- Luminometer (Labsystems, Research Triangle Pak, NC) bei 37ºC unter Verwendung einer 2 Sekunden/Vertiefung Integrations- Zeit abgelesen.
- Die Ergebnisse, in RLU, sind in der folgenden Tabelle angegeben. "Über" gibt an, daß eine RLU Ablesung über der maximalen Anzeige des Instrumentes liegt.
- Die Probe erfaßte eine so geringe Anzahl wie fünf genomische Kopien von 16S rDNA und 5 genomische Kopien von IS6110 von M. tb gegenüber dem Hintergrund. Die Amplifikations- Aktivität, wie sich durch die hohen Pegel der Amplifikation der internen Kontroll- Sequenz ergibt, war bei jeder Probe hoch, z.B waren die Proben der Amplifikations- Reaktion nicht hinderlich.
- (1) Allgemeine Information:
- (i) Anmelder: Becton, Dickinson and Company
- (A) Name: Becton, Dickinson and Company
- (B) Straße: 1 Becton Drive
- (C) Stadt: Franklin Lakes
- (D) Staat: NJ
- (E) Land: US
- (F) Zip: 07417
- (ii) Titel der Erfindung: Erfassung von Mycobakterien durch multiplexe Nukleinsäure- Amplifikation
- (iii) Zahl der Sequenzen: 19
- (iv) Computer lesbare Form:
- (A) Medium Type: Floppy Disk
- (B) Computer: IBM PC kompatibel
- (C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
- (D) Software: Patentln Release '1.0, Version '1.25
- (v) Daten der vorliegenden Erfindung
- (A) Anmeldenummer:
- (B) Anmeldetag:
- (2) Information für SEQ ID NO: 1:
- (i) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 37 Basenpaare
- (B) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID N0.1:
- TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACGGCGTA CTCGACC
- (2) Information für SEQ ID NO: 2:
- (1) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 25 Basenpaare
- (B) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NO: 2:
- GTCGCGTTGT TCACTGAGAT CCCCT
- (2) Information für SEQ ID NO: 3:
- (i) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 13 Basenpaare
- (8) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NO: 3:
- TGGACCCGCC AAC
- (2) Information für SEQ ID NO: 4:
- (i) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 13 Basenpaare
- (B) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NO: 4:
- CGCTGAACCG GAT
- (2) Information für SEQ ID NO: 5:
- (i) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 36 Basenpaare
- (B) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NO: 5:
- TTCTATAGTC GGTTACTTGT TGACGTCGCG TTGTTC.
- (2) Information für SEQ ID NO: 6:
- (1) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 26 Basenpaare
- (B) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NO: 6:
- GGCGTACTCG ACCACGCTCA CAGTTA
- (2) Information für SEQ ID NOV!:
- (i) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 13 Basenpaare
- (B) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NO: 7:
- CGGAATTACT GGG
- (2) Information für SEQ ID NO: 8:
- (i) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 14 Basenpaare
- (B) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NO: 8:
- AGTCTGCCCG TATC
- (2) Information für SEQ ID NO: 9:
- (i) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 15 Basenpaare
- (B) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NO: 9:
- TCCGTATGGT GGATA
- (2) Information für SEQ ID NO: 10:
- (i) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 15 Basenpaare
- (B) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NO: 10:
- GCCGTGAGAT TTCAC
- (2) Information für SEQ ID NO: 11:
- (i) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 15 Basenpaare
- (B) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NO: 11:
- GCTGTGAGTT TTCAC
- (2) Information für SEQ ID NO: 12:
- (1) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 59 Basenpaare
- (B) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NO: 12:
- GACGGCGTAC TCGACCAGCG ACGATGTCTG AGGCAACTAG CAAAGCTGAA CAACGCGAC
- (2) Information für SEQ ID NO: 13:
- (i) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 15 Basenpaare
- (B) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NO: 13:
- CCTGAAAGAC GTTAT
- (2) Information für SEQ ID NO: 14:
- (1) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 16 Basenpaare
- (B) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NO: 14:
- CCACCATACG GATAGT
- (2) Information für SEQ ID NO: 15:
- (1) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 15 Basenpaare
- (B) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NO: 15:
- GCTTTGCTAG TTGCC
- (2) Information für SEQ ID NO: 16:
- (i) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 15 Basenpaare
- (B) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NO: 16:
- TCAGACATCG TCGCT
- (2) Information für SEQ ID NO: 17:
- (i) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 15 Basenpaare
- (B) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NO: 17:
- ACTGTGAGCG TGGTC
- (2) Information für SEQ ID NO: 18:
- (i) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 15 Basenpaare
- (B) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NO: 18:
- AAATCTCACG GCTTA
- (2) Information für SEQ ID NO: 19:
- (i) Sequenz- Charakteristika:
- (A) Länge: 15 Basenpaare
- (B) Type: Nukleinsäure
- (C) Strängigkeit: einfach
- (D) Topologie: linear
- (xi) Sequenz Beschreibung: SEQ ID NO: 19:
- AAAACTCACA GCTTA
Claims (9)
1. Verfahren zur gleichzeitigen Amplifikation mehrerer
Mykobakterien-Zielsequenzen in einer Probe, umfassend:
a) Hybridisierung eines ersten Primers bestehend aus SEQ ID
NO: 1 mit der Zielsequenz, Verlängerung des ersten Primers mit
Polymerase zur Bildung eines ersten Verlängerungsproduktes und
Abspaltung des ersten Verlängerungsproduktes;
b) Hybridisierung eines zweiten Primers bestehend aus SEQ ID
NO: 2 mit dem ersten Verlängerungsprodukt, Verlängerung des
zweiten Primers zur Bildung eines zweiten Verlängerungsproduktes
und Abspaltung des zweiten Verlängerungsproduktes;
c) Hybridisierung eines dritten Primers bestehend aus SEQ ID
NO: 5 mit der Zielsequenz, Verlängerung des dritten Primers mit
Polymerase zur Bildung eines dritten Verlängerungsproduktes und
Abspaltung des dritten Verlängerungsproduktes;
d) Hybridisierung eines vierten Primers bestehend aus SEQ ID
NO: 6 mit dem dritten Verlängerungsprodukt, Verlängerung des
vierten Primers mit Polymerase zur Bildung eines vierten
Verlängerungsproduktes und Abspaltung des vierten
Verlängerungsproduktes, und
e) die gleichzeitige Amplifikation des zweiten und vierten
Verlängerungsproduktes in einer Strang-Vertauschungs-
Amplifikationsreaktion unter Verwendung von SEQ ID NO: 1 und SEQ
ID NO. 5 als Amplifikationsprimer, unter Ausschluss eines
Verfahrens, bei dem in Schritt a) ein Bumper-Primer bestehend aus
SEQ ID NO. 3 zur Abspaltung des ersten Verlängerungsproduktes
verwendet wird, in Schritt b) ein Bumper-Primer bestehend aus SEQ
ID NO. 4 zur Abspaltung des zweiten Verlängerungsproduktes
verwendet wird, in Schritt c) ein Bumper-Primer bestehend aus SEQ
ID NO. 7 zur Abspaltung des dritten Verlängerungsproduktes
verwendet wird und in Schritt d) ein Bumper-Primer bestehend aus
SEQ ID NO. 8 zur Abspaltung des vierten Verlängerungsproduktes
verwendet wird.
2. Das Verfahren von Anspruch 1, das weiters die Stufen umfasst:
a) Hybridisierung des zweiten Primers mit einem zweiten Strang
der Zielsequenz, Verlängerung des zweiten Primers mit Polymerase
zur Bildung eines fünften Verlängerungsproduktes und Abspaltung
des fünften Verlängerungsproduktes;
b) Hybridisierung des ersten Primers mit dem fünften
Verlängerungsprodukt, Verlängerung des ersten Primers mit
Polymerase zur Bildung eines sechsten Verlängerungsproduktes und
Abspaltung des sechsten Verlängerungsproduktes;
c) Hybridisierung des vierten Primers mit einem zweiten Strang
der Zielsequenz, Verlängerung des vierten Primers mit Polymerase
zur Bildung eines siebenten Verlängerungsproduktes und Abspaltung
des siebenten Verlängerungsproduktes;
d) Hybridisierung des dritten Primers mit dem siebenten
Verlängerungsprodukt, Verlängerung des dritten Primers mit
Polymerase zur Bildung eines achten Verlängerungsproduktes und
Abspaltung des achten Verlängerungsproduktes, und
e) die gleichzeitige Amplifikation des sechsten und achten
Verlängerungsproduktes durch eine Strang-Vertauschungs-
Amplifikationsreaktion unter Verwendung von SEQ ID NO: 1 und SEQ
ID NO: 5 als Amplifikationsprimer.
3. Ein Verfahren zur gleichzeitigen Amplifikation mehrerer
Zielsequenzen und einer internen Kontrollsequenz in einer Probe
umfassend:
a) die Beigabe einer einzigen internen Kontrollsequenz zur
Probe, wobei die interne Kontrollsequenz eine erste
Amplifikationsprimer-Bindungsstelle, die komplementär zur Ziel-
Bindungssequenz eines ersten Amplifikationsprimers ist, und eine
zweite Amplifikationsprimer-Bindungsstelle, die komplementär zur
Ziel-Bindungssequenz eines zweiten Amplifikationsprimers ist,
umfasst;
b) die spezifische Hybridisierung des ersten
Amplifikationsprimers mit dem 3'-Ende einer ersten Zielsequenz,
Verlängerung des ersten Amplifikationsprimers mit Polymerase zur
Bildung eines ersten Verlängerungsproduktes, das komplementär zur
ersten Zielsequenz ist,, und Abspaltung des ersten
Verlängerungsproduktes;
c) die spezifische Hybridisierung eines ersten Adapterprimers
mit dem ersten Verlängerungsprodukt am 3'-Ende des zur ersten
Zielsequenz komplementären Stückes, wobei das 3'-Ende des ersten
Adapterprimers eine Ziel-Bindungssequenz umfasst, die zur
Hybridisierung mit dem ersten Verlängerungsprodukt und dem 5'-Ende
des ersten Adapterprimers, der im wesentlichen identisch mit der
Ziel-Bindungssequenz des zweiten Amplifikationsprimers ist,
geeignet ist, Verlängerung des ersten Adapterprimers mit
Polymerase zur Bildung eines zweiten Verlängerungsproduktes und
Abspaltung des zweiten Verlängerungsproduktes;
d) die spezifische Hybridisierung des zweiten
Amplifikationsprimers mit dem 3'-Ende einer zweiten Zielsequenz,
Verlängerung des zweiten Amplifikationsprimers mit Polymerase zur
Bildung eines dritten Verlängerungproduktes, das komplementär zur
zweiten Zielsequenz ist, und Abspaltung des dritten
Verlängerungproduktes;
e) spezifische Hybridisierung eines zweiten Adapterprimers mit
dem dritten Verlängerungsprodukt am 3'-Ende des zur zweiten
Zielsequenz komplementären Stückes, wobei das 3'-Ende des zweiten
Adapterprimers eine Ziel-Bindungssequenz- umfasst, die zur
Hybridisierung mit dem dritten Verlängerungsprodukt und dem 5'-
Ende des zweiten Adapterprimers, der im wesentlichen identisch mit
der Ziel-Bindungssequenz des ersten Amplifikationsprimers ist,
geeignet ist, Verlängerung des zweiten Adapterprimers mit
Polymerase zur Bildung eines vierten Verlängerungsproduktes und
Abspaltung des vierten Verlängerungsproduktes, und
f) gleichzeitige Amplifikation des zweiten und vierten
Velängerungsproduktes und der internen Kontrollsequenz unter
Verwendung des ersten und zweiten Amplifikationsprimers.
4. Das Verfahren nach Anspruch 3, welches weiters die Stufen
umfasst:
a) Hybridisierung des ersten Adapterprimers mit einem zweiten
Strang der ersten Zielsequenz, Verlängerung des ersten
Adapterprimers mit Polymerase zur Bildung eines fünften
Verlängerungsproduktes und Abspaltung des fünften
Verlängerungsproduktes;
b) Hybridisierung des ersten Amplifikationsprimers mit dem
fünften Verlängerungsprodukt, Verlängerung des ersten
Amplifikationsprimers mit Polymerase zur Bildung eines sechsten
Verlängerungsproduktes und Abspaltung des sechsten
Verlängerungsproduktes;
c) Hybridisierung des zweiten Adapterprimers mit einem zweiten
Strang der zweiten Zielsequenz, Verlängerung des zweiten
Adapterprimers mit Polymerase zur Bildung eines siebenten
Verlängerungsproduktes und Abspaltung des siebenten
Verlängerungsproduktes;
d) Hybridisierung des zweiten Amplifikationsprimers mit dem
siebenten Verlängerungsprodukt, Verlängerung des zweiten
Amplifikationsprimers mit Polymerase zur Bildung eines achten
Verlängerungsproduktes und Abspaltung des achten
Verlängerungsproduktes, und
e) die gleichzeitige Amplifikation des sechsten und achten
Verlängerungsproduktes durch eine Strang-Vertauschungs-
Amplifikationsreaktion unter Verwendung des ersten und zweiten ·
Amplifikationsprimers.
5. Das Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Zielsequenzen
Mykobakterien-Zielsequenzen sind, die internen Kontrollsequenzen
aus SEQ ID NO: 12, der erste Amplifikationsprimer aus SEQ ID NO:
1, der erste Adapterprimer aus SEQ ID NO: 2, der zweite
Amplifikationsprimer aus SEQ ID NO: 5, und der zweite
Adapterprimer aus SEQ ID NO: 6 besteht.
6. Ein Verfahren zur Art-spezifischen Amplifikation von
Mykobakterien-Zielsequenzen in einer Probe, umfassend: º
a) Hybridisierung eines ersten Primers bestehend aus SEQ ID
NO: 5 mit der Zielsequenz, Verlängerung des ersten Primers mit
Polymerase zur Bildung eines ersten Verlängerungsproduktes und
Abspaltung des ersten Verlängerungsproduktes;
b) Hybridisierung eines zweiten Primers bestehend aus SEQ ID
NO: 6 mit dem ersten Verlängerungsprodukt, Verlängerung des
zweiten Primers zur Bildung eines zweite- Verlängerungsproduktes
und Abspaltung des zweiten Verlängerungsproduktes, und
c) Amplifikation des zweiten Verlängerungsproduktes über eine
Strang-Vertauschungs-Amplifikationsreaktion unter Verwendung von
SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 5 als Amplifikationsprimer.
7. Das Verfahren nach Anspruch 6, welches weiters die Stufen
umfasst:
a) Hybridisierung des zweiten Primers mit einem zweiten Strang
der Zielsequenzen, Verlängerung des zweiten Primers mit Polymerase
zur Bildung eines dritten Verlängerungsproduktes und Abspaltung
des dritten Verlängerungsproduktes;
b) Hybridisierung des ersten Primers mit dem dritten
Verlängerungsprodukt, Verlängerung des ersten Primers mit
Polymerase zur Bildung eines vierten Verlängerungsproduktes und
Abspaltung des vierten Verlängerungsproduktes, und
c) Amplifikation des vierten Verlängerungsproduktes über eine
Strang-Vertauschungs-Amplifikationsreaktion unter Verwendung von
SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 5 als Amplifikationsprimer.
8. Ein Zubehörsatz zur Amplifikation von Mykobakterien-
Zielsequenzen gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
umfassend:
a) ein erstes Oligonukleotid bestehend aus SEQ ID NO: 1, ein
zweites Oligonukleotid bestehend aus SEQ ID NO: 2, ein drittes
Oligonukleotid bestehend aus SEQ ID NO: 5 und ein viertes
Oligonukleotid bestehend aus SEQ ID NO: 6, und
b) Reagenzien für die Hybridisierung des ersten, zweiten,
dritten und vierten Oligonukleotids mit den Mykobakterien-
Zielsequenzen, für die Verlängerung der Oligonukleotide und die
Abspaltung der Oligonukleotide von den Zielsequenzen in einer
Amplifikationsreaktion.
9. Ein Zubehörsatz zur Art-spezifischen Amplifikation von
Mykobakterien-Zielsequenzen gemäß dem Verfahren nach den
Ansprüchen 6 oder 7, umfassend:
a) ein erstes Oligonukleotid bestehend aus SEQ ID NO: 5, ein
zweites Oligonukleotid bestehend aus SEQ ID NO: 6, und ein drittes
Oligonukleotid bestehend aus SEQ ID NO: 1, und
b) Reagenzien für die Hybridisierung dieser Oligonukleotide
mit den Mykobakterien-Zielsequenzen, für die Verlängerung der
Oligonukleotide und für die Abspaltung der Oligonukleotide von den
Zielsequenzen in einer Amplifikationsreaktion.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/111,076 US5470723A (en) | 1993-05-05 | 1993-08-24 | Detection of mycobacteria by multiplex nucleic acid amplification |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE69426956D1 DE69426956D1 (de) | 2001-05-03 |
| DE69426956T2 true DE69426956T2 (de) | 2001-08-16 |
Family
ID=22336475
Family Applications (1)
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