CN116837119A

CN116837119A - 检测分枝杆菌dna的引物及检测方法

Info

Publication number: CN116837119A
Application number: CN202210306869.3A
Authority: CN
Inventors: 吴婉欣; 程丹妮; 孟粉; 宗伟英; 沈斌; 唐佳
Original assignee: Huzhou Shenke Biotechnology Co ltd
Current assignee: Huzhou Shenke Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-03-25
Filing date: 2022-03-25
Publication date: 2023-10-03
Also published as: WO2023179794A1

Abstract

本发明提供了检测分枝杆菌基因组DNA的引物对、包含本发明引物对的检测试剂或试剂盒以及利用所述引物对检测分枝杆菌基因组DNA的方法，所述引物对特异性结合于SEQ ID NO:1所示序列。利用所述引物对的PCR检测方法操作简便快捷、灵敏度高、能区分多种常见细菌、真菌、支原体、工程细胞以及与分枝杆菌进化关系较近的细菌等干扰性DNA。

Description

检测分枝杆菌DNA的引物及检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域。具体地说，本发明涉及分枝杆菌(Mycobacterium)DNA的检测引物及检测方法。

背景技术

随着国际社会对分枝杆菌污染风险的日渐关注，近年来WHO和FDA新修订的疫苗规程指南都提出了对分枝杆菌检测的要求。WHO指南规定用于生产生物制品的生物原材料，如细胞基质，应该检测确认不含外源传染性病原体，如细菌、真菌、可培养和不可培养的支原体、螺旋体(如是昆虫细胞或暴露于植物源物料的细胞)和分枝杆菌。为确保检测方法的可行性，须预先对检测方法进行灵敏度验证，以确认在可检测浓度下，该法可准确检测细胞基质中是否有污染物存在。如果某种细胞容易被结核分枝杆菌或其他分枝杆菌感染，则其细胞库的质量控制应包括分枝杆菌检测，对于原代细胞，同样需要进行该项目检测。鉴于某些分枝杆菌主要在细胞内生长，有必要通过裂解宿主细胞来检测分枝杆菌。

目前已报告的分枝杆菌种类超过200种。从安全性考虑，针对生物制品相关的分枝杆菌检测范围必须覆盖尽可能多的分枝杆菌，而需要检测的包括病毒疫苗种子批、基因工程疫苗种子批以及重组蛋白、单抗制品细胞库等。

对于人用乙型脑炎减毒活疫苗，WHO要求：生产用动物种群、种子批毒种和病毒单一收获液都应进行分枝杆菌检测，检测方法可采用传统的培养法、豚鼠法，也可采用核酸扩增法(NAT)。NAT在使用之前必须经过有效验证并经国家监管当局批准。对于登革热减毒活疫苗，WHO要求：种子批毒种和单一病毒收获液都应检测分枝杆菌，所用的检测方法应得到国家管理部门确认。NAT可作为分枝杆菌培养法的改进方法，但使用前必须得到国家管理部门批准。对于鼻腔接种的人用流感减毒活疫苗，WHO建议：每单一收获液都须检测分枝杆菌，常用的方法是将病毒收获液离心浓缩后接种豚鼠或固体培养基。

FDA指南规定分枝杆菌检测可采用培养法，可选用罗杰培养基或其他适合的培养基进行培养，检测时应同时设置阳性对照。豚鼠法同样也可用于检测分枝杆菌。如果采用改进的方法如PCR法，则所用的方法应足够灵敏。

中国药典要求，用于生物制品生产的细胞系/株均须通过全面检定，须具有相应资料，并经国家药品监督管理部门批准。取至少10⁷个活细胞用培养上清制备细胞裂解物，按照中国药典无菌检查法进行分枝杆菌检查。取细胞裂解物接种于适宜的固体培养基(如罗氏培养基(LowensteinJensen medium)或Middlebrook 7H10培养基)，每个培养基接种1ml并做3个重复。并同时以草分枝杆菌做为阳性对照。将接种后的培养基置于37℃培养56天，阳性对照应有菌生长，接种供试品的培养基未见分枝杆菌生长，则判为合格。

用于外源病毒检测的豚鼠接种法也可检测分枝杆菌，因此豚鼠法也可用于分枝杆菌检测。豚鼠在注射前应观察4周，结核菌素试验为阴性者方可用于试验，观察期末应进行结核菌素试验，并剖检观察主要脏器是否有节结形成。结核菌素试验为阴性，主要脏器无结节，为则符合要求。分枝杆菌检测也可采用经过验证的分枝杆菌核酸检测法替代培养法。

随着技术的发展和生物制品新形态，如细胞治疗、基因治疗产品的广泛上市，对于分枝杆菌的快检方法，特别是在灵敏度、特异性和时效性上具有优势的NAT方法越来越受到行业的关注和使用。WHO、FDA指南和《中国药典》中均指出，通过合适的方法验证证明分枝杆菌NAT检测法适用，则可以用NAT法替代培养法或豚鼠法。

综上所述，本领域急需检测分枝杆菌DNA的方法，该方法应具备特异性、灵敏性、操作简便、标准统一等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种高灵敏度，高特异性地检测分枝杆菌DNA的引物对，以及包含所述引物对的检测试剂或PCR试剂盒。

本发明的另一目的是提供利用本发明提供的引物对或检测试剂检测分枝杆菌基因组DNA的方法或PCR方法。

在第一方面，本发明提供一种检测分枝杆菌基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于分枝杆菌基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第510-550位，优选第518-539位；其中的反向引物结合于分枝杆菌基因组DNA上SEQ IDNO:1所示序列的第740-780、780-830、790-830、970-1010或1160-1200位，优选第748-769、791-815、800-822、979-996或1175-1193位；并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度分别为240-700bp。

在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为18-25bp；优选20bp。

在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为61-63℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤1℃。

在具体的实施方式中，所述引物对中，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3-7中任一所示。

在具体的实施方式中，所述引物对中，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:6所示。

在具体的实施方式中，所述引物对还包含探针，其中所述探针结合于分枝杆菌基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第600-640位，优选第613-628位。

在具体的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:8所示。

在第二方面，本发明提供一种检测试剂，所述检测试剂包含第一方面所述的引物对。

在优选的实施方式中，所述检测试剂的检测灵敏度为10CFU的分枝杆菌。

在第三方面，本发明提供一种检测分枝杆菌基因组DNA的方法，所述方法包括：利用第一方面所述的引物对或第二方面所述的检测试剂，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。

在第四方面，本发明提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的第一方面所述的引物对。

在优选的实施方式中，所述引物对中，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3-7中任一所示。

在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有探针。

在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:8所示。

在优选的实施方式中，所述试剂盒中还包括用于实施PCR扩增所需的其它试剂以及任选的标准品对照。

在第五方面，本发明提供一种PCR方法，包括步骤：

在一PCR检测体系中，利用第一方面所述的引物对扩增目标产物。

在优选的实施方式中，所述PCR检测体系还包括探针。

在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:8所示。

在第六方面，本发明提供第一方面所述的引物对或第二方面所述的检测试剂的用途，用于检测待测对象中是否存在分枝杆菌DNA。

在优选的实施方式中，所述待测对象是疫苗，优选人用乙型脑炎减毒活疫苗。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了参考品的扩增曲线，其中利用的引物对是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6。

图2显示了干扰实验的结果，其中利用的引物对是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6。

具体实施方式

经过深入而广泛的研究，本发明人出乎意料地发现针对分枝杆菌基因组DNA的SEQID NO:1所示区段设计的引物，不仅能够高度灵敏地检测分枝杆菌基因组DNA，还能区分多种常见细菌、真菌、支原体、工程细胞以及与分枝杆菌进化关系较近的细菌等干扰性DNA。本发明方法操作简便快捷、特异性和灵敏性高。在此基础上完成了本发明。

本发明的引物对

本文所用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义。本发明的分枝杆菌基因组DNA特异性引物不是针对外源基因本身或病毒载体本身设计，而是针对分枝杆菌基因组DNA上SEQ ID NO:1所示区段设计的。换言之，本发明的引物可以特异性结合于分枝杆菌基因组DNA上SEQ ID NO:1所示区段。

鉴于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员应该理解，针对SEQ IDNO:1所示区段可以设计多种引物对。因此，本发明的引物对不限于实施例中具体得到的引物对。

在具体的实施方式中，本发明的正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第510-550位，优选第518-539位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第740-780、780-830、790-830、970-1010或1160-1200位，优选第748-769、791-815、800-822、979-996或1175-1193位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为240-700bp。

在具体的实施方式中，本发明的引物对中，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3-7中任一所示。

探针

本文所用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义，即，一小段单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列。

鉴于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员应该理解，在知晓引物对的前提下，本领域技术人员可以根据正向引物和反向引物结合位点之间的模板序列自主设计探针，并检测该探针与引物对的技术效果。在具体的实施方式中，本领域普通技术人员可根据需要具体设计探针，所述探针可以处于液相中，也可以固定于固相上；可以在扩增前结合，也可以在扩增后结合。因此，本发明的探针并不限于实施例中具体公开的探针。本发明的引物对也不限于与实施例中具体公开的探针配对使用。

在具体的实施方式中，本发明的探针如SEQ ID NO:8所示。

本发明的检测试剂

本发明还提供一种检测分枝杆菌基因组DNA的检测试剂，所述检测试剂包含本发明的引物对以及探针等实施PCR所需的其它成分，例如Taq酶、dNTP、Mg²⁺等等。

在具体的实施方式中，本发明的检测试剂包含SEQ ID NO:2所示正向引物、SEQ IDNO:3-7中任一所示反向引物、SEQ ID NO:8所示探针。在优选的实施方式中，本发明的检测试剂包含SEQ ID NO:2所示正向引物，SEQ ID NO:6所示反向引物。

在具体的实施方式中，本发明检测试剂的检测灵敏度达到10CFU的分枝杆菌。

在本发明的引物对或检测试剂的基础上，本发明进一步提供一种检测分枝杆菌基因组DNA的方法，所述方法包括：利用本发明的引物对或检测试剂，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。

在本发明的引物对的基础上，本发明还提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的上述本发明引物对。

在具体的实施方式中，本发明的PCR试剂盒还装有用于实施PCR的其它所需成分以及使用该试剂盒作PCR检测的使用说明书。在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有标准品对照。

在本发明的引物对的基础上，本发明提供利用本发明的引物对扩增目标产物的PCR方法。

本发明的优点包括:

1.本发明的引物对或检测试剂能够高度灵敏地检测分枝杆菌基因组DNA；

2.本发明的引物对或检测试剂能够高度灵敏地检测分枝杆菌基因组DNA；

3.本发明的引物对或检测试剂能够区分肺炎链球菌、冰城链霉菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等干扰性DNA；

4.本发明的检测方法操作简便快捷、特异性和灵敏性高。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例

实施例1.引物对和探针的设计

本发明人利用以下靶标序列设计的用于检测分枝杆菌基因组DNA的引物对和探针：>KF378762.1Mycobacterium phlei strain CM32 16S ribosomal RNA gene,partialsequence(SEQ ID NO:1)

TGGAGGCTACTCTTACCATGCAAGTCGACGGAAAGGCCCCTTCGGGGGTGCTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATACACCCTTCTGGTTGCATGGCTGGGAGGGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGTCCGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCCCTTTCAGTAGGGACGAAGCGTGAGTGACGGTACCTACAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTTGTTCGTGAAAACTCACAGCTTAACTGTGGGCGTGCGGGCGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATGCACAGGACGACGGCAGAGATGTCGTTTCCCTTGTGGCCTGTGTGCAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCATGTTGCCAGCACGTTATGGTGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATGCCGTGAGGTGGAGCGAATCCTTTCAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGAGGCAGCCGTCGAAGGAATACCCCC

共设计了以下引物对和探针：

Mb-16-603F：GTAGGTGGTTTGTCGCGTTGTT(SEQ ID NO:2)

Mb-16-834R：CACCTAGTACCCACCGTTTACG(SEQ ID NO:3)

Mb-16-897R：TACTTAATGCGTTAGCTACGGCACG(SEQ ID NO:4)

Mb-16-906R：GGCGGGGTACTTAATGCGTTAGC(SEQ ID NO:5)

Mb-16-1095R：GCCATGCACCACCTGCAC(SEQ ID NO:6)

Mb-16-1303R：CCCTTTGTACCGGCCATTG(SEQ ID NO:7)

Mb-16-700probe：FAM-ATTCCTGGTGTAGCGG-MGB(SEQ ID NO:8)。

实施例2.检测线性范围(基因组DNA)

通过引物探针的设计筛选，得到五组检测体系，分别扩增八种分枝杆菌基因组DNA，标曲浓度范围100000～10copies/反应，NTC为无样本阴性质控即DNA稀释液，验证检测体系的性能。

综合分析这五组体系对不同浓度模板的扩增结果，包括标曲Ct值范围、标曲R²及扩增效率、NTC Ct值范围，得出479bp体系(正向引物SEQ ID NO:2、反向引物SEQ ID NO:6、探针SEQ ID NO:8)性能最佳，采用该引物探针组合用于后续实验。

实施例3.检测线性范围(质粒DNA)

为了再次验证479bp体系(正向引物SEQ ID NO:2、反向引物SEQ ID NO:6、探针SEQID NO:8)的性能，构建含有靶标序列的质粒为标准品，用DNA稀释液梯度稀释成以下7个浓度梯度，NTC为无样本阴性质控即DNA稀释液。

结果表明草分枝杆菌质粒浓度范围在2×10⁷～2×10¹cp/反应时，标曲的Ct值范围(3复孔)、标曲R²及扩增效率基本满足要求(如图1所示)。

实施例4.检测限检测

为了验证479bp体系的性能，对检测限进行测试。将含有靶标序列的质粒用DNA稀释液梯度稀释成较低的三个浓度梯度进行测试。

结果表明20cp/反应、10cp/反应、5cp/反应24孔检出率分别为23/24、24/24、16/24，FAM Ct值范围分别为33.1～undet、33.3～36.6、33.5～undet，VIC Ct值范围分别为31.1～32.0、31.0～32.0、30.9～32.3。检测限基本能达到10cp/反应。

/>

实施例5.空白限检测

为了验证479bp体系的性能，对空白限进行测试。NTC为无样本阴性质控即DNA稀释液。

检测24孔NTC，其中有22孔undet，2孔有扩增，Ct值分别为38.16、44.47。阴性率＞95％，符合要求。

实施例6.专属性检测

为了验证479bp体系的性能，选取生产中常见的细菌、真菌、支原体、工程细胞以及与分枝杆菌进化关系较近的细菌基因组DNA，对专属性进行测试。模板量为30ng/反应。测试物种如下：

/>

结果表明，肺炎链球菌、冰城链霉菌、东方拟无枝酸菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、人型支原体有扩增，，Ct值＜35；其他物种Ct值≥35。见图2。从进化关系及错配碱基数分析，得到的结论是东方拟无枝酸菌可能会存在比较强的干扰，因为其属于拟无枝酸菌属，与分枝杆菌同属于分枝杆菌科，序列较为相似，错配碱基个数仅有4个。

实施例7.无细胞基质10CFU草分枝杆菌标准株样本提取检测

为了验证提取方法对简单基质样本的提取性能，对10CFU草分枝杆菌标准株样本进行测试。样本核酸提取步骤如下：

1.样本加入20μl蛋白酶K，振荡混匀后，55℃孵育60min。

2.加入200μl结合液，200μl异丙醇，50μl磁珠，振荡5min后静置于磁性分离架上。

3.待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头小心移去上清。

4.加入700μl洗涤液A，振荡10s后置于磁性分离架上。

5.待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第1次磁珠洗涤。

6.加入700μl洗涤液B，振荡40s后置于磁性分离架上。

7.待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第2次磁珠洗涤。

8.打开管盖在室温下干燥30s～3min，除去残留的乙醇。

9.沿离心管壁加入50μl洗脱液，振荡10s混匀。

10.70℃孵育7min，孵育过程中可再次振荡混匀2～3次。

11.孵育完成后静置于磁性分离架上，待磁珠分离后，用枪头小心转移溶液到干净的离心管中，所得即为样本纯化液，作为模板进行后续qPCR扩增。

结果表明，24管样本检出率为24/24。

实施例8.10⁷个Vero细胞基质100CFU草分枝杆菌标准株检测

为了验证提取方法对复杂基质样本的提取性能，对10⁷个Vero细胞基质100CFU草分枝杆菌标准株样本进行测试。样本核酸提取步骤如下：

1.样本加入MB细胞裂解液(体积比为10:1)，加入预处理液(体积比为20:1)，涡旋振荡混匀。

2.5min后，450×g离心10min沉淀细胞碎片，吸取上清转移入新的离心管。

3.样本加入20μl蛋白酶K，振荡混匀后，55℃孵育60min。

4.加入200μl结合液，200μl异丙醇，50μl磁珠，振荡5min后静置于磁性分离架上。

5.待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头小心移去上清。

6.加入700μl洗涤液A，振荡10s后置于磁性分离架上。

7.待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第1次磁珠洗涤。

8.加入700μl洗涤液B，振荡40s后置于磁性分离架上。

9.待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第2次磁珠洗涤。

10.打开管盖在室温下干燥30s～3min，除去残留的乙醇。

11.沿离心管壁加入50μl洗脱液，振荡10s混匀。

12.70℃孵育7min，孵育过程中可再次振荡混匀2～3次。

13.孵育完成后静置于磁性分离架上，待磁珠分离后，用枪头小心转移溶液到干净的离心管中，所得即为样本纯化液，作为模板进行后续qPCR扩增。

结果表明，24管样本检出率为24/24。

/>

实施例9.10⁷个293T细胞基质100CFU草分枝杆菌标准株检测

重复实施例8，但采用10⁷个293T细胞基质100CFU草分枝杆菌标准株样本进行测试。

实验结果为：

/>

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 湖州申科生物技术有限公司

<120> 检测分枝杆菌DNA的引物及检测方法

<130> P2021-3326

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1423

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 多核苷酸

<400> 1

tggaggctac tcttaccatg caagtcgacg gaaaggcccc ttcgggggtg ctcgagtggc 60

gaacgggtga gtaacacgtg ggtgatctgc cctgcactct gggataagcc tgggaaactg 120

ggtctaatac cggatacacc cttctggttg catggctggg aggggaaagc ttttgcggtg 180

tgggatgggc ccgcggccta tcagcttgtt ggtggggtga tggcctacca aggcgacgac 240

gggtagccgg cctgagaggg tgtccggcca cactgggact gagatacggc ccagactcct 300

acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa gcctgatgca gcgacgccgc 360

gtgggggatg acggccttcg ggttgtaaac ccctttcagt agggacgaag cgtgagtgac 420

ggtacctaca gaagaagcac cggccaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt 480

gcgagcgttg tccggaatta ctgggcgtaa agagctcgta ggtggtttgt cgcgttgttc 540

gtgaaaactc acagcttaac tgtgggcgtg cgggcgatac gggcagacta gagtactgca 600

ggggagactg gaattcctgg tgtagcggtg gaatgcgcag atatcaggag gaacaccggt 660

ggcgaaggcg ggtctctggg cagtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac 720

aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacggtggg tactaggtgt gggtttcctt 780

ccttgggatc cgtgccgtag ctaacgcatt aagtaccccg cctggggagt acggccgcaa 840

ggctaaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gcggagcatg tggattaatt 900

cgatgcaacg cgaagaacct tacctgggtt tgacatgcac aggacgacgg cagagatgtc 960

gtttcccttg tggcctgtgt gcaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1020

gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtctcat gttgccagca cgttatggtg 1080

gggactcgtg agagactgcc ggggtcaact cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat 1140

catgcccctt atgtccaggg cttcacacat gctacaatgg ccggtacaaa gggctgcgat 1200

gccgtgaggt ggagcgaatc ctttcaaagc cggtctcagt tcggatcggg gtctgcaact 1260

cgaccccgtg aagtcggagt cgctagtaat cgcagatcag caacgctgcg gtgaatacgt 1320

tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcacg tcatgaaagt cggtaacacc cgaagccggt 1380

ggcctaaccc cttgtgggag gcagccgtcg aaggaatacc ccc 1423

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

gtaggtggtt tgtcgcgttg tt 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

cacctagtac ccaccgttta cg 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

tacttaatgc gttagctacg gcacg 25

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

ggcggggtac ttaatgcgtt agc 23

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

gccatgcacc acctgcac 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

ccctttgtac cggccattg 19

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 8

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Claims

1.一种检测分枝杆菌基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于分枝杆菌基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第510-550位，优选第518-539位；其中的反向引物结合于分枝杆菌基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第740-780、780-830、790-830、970-1010或1160-1200位，优选第748-769、791-815、800-822、979-996或1175-1193位；并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度分别为240-700bp。

2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对中，所述正向引物如SEQ IDNO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3-7中任一所示。

3.如权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述引物对中，所述正向引物如SEQ IDNO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:6所示。

4.如权利要求1-3中任一项所述的引物对，其特征在于，所述引物对还包含探针，其中所述探针结合于分枝杆菌基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第600-640位，优选第613-628位。

5.如权利要求4所述的引物对，其特征在于，所述探针如SEQ ID NO:8所示。

6.一种检测试剂，所述检测试剂包含权利要求1-5中任一项所述的引物对。

7.一种检测分枝杆菌基因组DNA的方法，所述方法包括：利用权利要求1-5中任一项所述的引物对或权利要求6所述的检测试剂，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。

8.一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的权利要求1-5中任一项所述的引物对。

9.一种PCR方法，包括步骤：

在一PCR检测体系中，利用权利要求1-5中任一项所述的引物对扩增目标产物。

10.权利要求1-5中任一项所述的引物对或权利要求6所述的检测试剂的用途，用于检测待测对象中是否存在分枝杆菌DNA。