DE69308381T2

DE69308381T2 - Sonden für Mycobakterien

Info

Publication number: DE69308381T2
Application number: DE69308381T
Authority: DE
Inventors: Daryl D Shank; Patricia A Spears
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1992-05-26
Filing date: 1993-05-24
Publication date: 1997-06-12
Anticipated expiration: 2013-05-25
Also published as: KR960002876B1; EP0571911A2; MY114656A; ES2100390T3; CA2096497A1; KR930023470A; BR9302052A; AU3871193A; EP0571911A3; DE69308381D1; JPH0630796A; EP0571911B1; JP2709256B2; AU663180B2

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Oligonucleotid-Sonden und betrifft insbesondere Oligonucleotid-Sonden, die zur selektiven Hybridisierung mit Mycobakterien- DNA befähigt sind.

Hintergrund der Erfindung

Im Gesundheitswesen sieht man sich mit einem deutlichen Anstieg von Fällen mycobakterieller Infektionen konfrontiert. Viele dieser neuen Fälle hängen mit der AIDS-Epidemie zusammen. Die Ärzte sind darauf angewiesen, von klinischen Mikrobiologen bei der Diagnose einer mycobakteriellen Infektion unterstützt zu werden. Die Diagnose solcher Infektionen hängt jedoch weitgehend von einer säurefesten Färbung und der Züchtung des Organismus mit anschließenden biochemischen Assays ab. Diese sind zeitaufwendige Verfahren. Die WO90/10085 (Cogent Limited) beschreibt Sonden zur Feststellung von Mycobakterien und zur Diagnose von Tuberkulose. Die Sonden sind von einem repetitiven Element abgeleitet, das zu der IS3-Familie der Insertionssequenzen gehört. Sie hybridisieren mit und unterscheiden zwischen M. tuberculosis, M. bovis und BCG, hybridisieren jedoch nicht in signifikanter Weise mit Mycobakterien anderer Arten. Es besteht somit ein fortdauerendes Bedürfnis nach neuen und insbesondere schnellen Methoden zur Diagnose von mycobakteriellen Infektionen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine Oligonucleotid-Sonde zur Verfügung, die zur selektiven Hybridisierung mit Mycobakterien-Nucleinsäure befähigt ist. Die Oligonucleotid-Sonde ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Oligonucleotid- Sonde, die im wesentlichen aus der DNA-Sequenz besteht, die hierin als SEQ ID NO:1 (MK14) angegeben ist; (b) Oligonucleotid-Sonden, die mit MK14 hybridisieren, eine Länge von mindestens 10 Nucleotiden aufweisen und mindestens zu 60 % homolog zu MK14 Nucleinsäure sind; und (c) Oligonucleotid-Sonden, die zu irgendeiner der vorhergehenden komplementär und imstande sind, selektiv mit Mycobakterien-Nucleinsäure zu hybridisieren.
Eine erste Ausführungsform des obigen ist eine Oligonucleotid-Sonde, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Oligonukleotid-Sonde, die aus der DNA-Sequenz besteht, die hierin als SEQ ID NO:22 angegeben ist (M. kansasii Fragment BC), einer Oligonucleotid-Sonde, die aus der DNA-Sequenz besteht, die hierin als SEQ ID NO:23 angegeben ist (M. tuberculosis Fragment BC), und einer Oligonucleotid- Sonde, die aus der Sequenz besteht, die hierin als SEQ ID NO:24 angegeben ist (M. avium Fragment BC); (b) Oligonucleotid-Sonden, die mit den oben unter (a) genannten Sonden hybridisieren, haben eine Länge von mindestens 10 Nucleotiden und sind mindestens zu 60 % homolog zu MK14 Nucleinsäure; und (c) Oligonucleotid-Sonden, die zu irgendeiner der vorhergehenden komplementär und imstande sind, selektiv mit Mycobakterien-Nucleinsäure zu hybridisieren.
Eine zweite Ausführungsform des obigen ist eine Oligonucleotid-Sonde, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Oligonucleotid-Sonde, die aus der DNA-Sequenz besteht, die hierin als SEQ ID NO:14 (MK14-C) angegeben ist; (b) Oligonucleotid-Sonden, die mit MK14 hybridisieren, eine Länge von mindestens 10 Nucleotiden aufweisen und mindestens zu 60 % homolog zu MK14 Nucleinsäure sind; und (c) Oligonucleotid-Sonden, die zu irgendeiner der vorhergehenden komplementär und imstande sind, selektiv mit Mycobakterien-Nucleinsäure zu hybridisieren.
Eine dritte Ausführungsform des obigen ist eine Oligonucleotid-Sonde, die zur selektiven Hybridisierung mit der Nucleinsäure von Mycobakteria kansasii befähigt ist, wobei die Oligonucleotid-Sonde ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Oligonucleotid-Sonde, die aus der DNA-Sequenz besteht, die hierin als SEQ ID NO:15 (MK14-D) angegeben ist; (b) Oligonucleotid-Sonden, die mit MK14 hybridisieren und zur selektiven Hybridisierung mit Nucleinsäure von Mycobacteria kansasii befähigt sind; und (c) Oligonucleotid-Sonden, die zu irgendeiner der vorhergehenden komplementär und imstande sind, selektiv mit Mycobakterien-Nucleinsäure zu hybridisieren.
Ein Verfahren zur Feststellung von Mycobakterien-Nucleinsäure in einer Nucleinsäureprobe wird ebenfalls hierin geoffenbart. Das Verfahren umfaßt die Stufe des In-Kontakt-Bringens einer Oligonucleotid-Sonde mit einer Nucleinsäureprobe unter Bedingungen, die die Hybridisierung der genannten Oligonucleotid-Sonde mit Mycobakterien-Nucleinsäure erlaubt, wobei die genannte Oligonucleotid-Sonde eine oben angegebene Sonde ist, und anschließend die Stufe der Feststellung, ob die Oligonucleotid-Sonde mit der Nucleinsäureprobe hybridisiert oder nicht. wobei die Hybridisierung der Oligonucleotid-Sonde mit der Nucleinsäureprobe ein Hinweis dafür ist, daß die Nucleinsäureprobe Mycobakterien-Nucleinsäure enthält.
Ebenso hierin geoffenbart wird ein Kit zur Feststellung von Mycobakterien-Nucleinsäure in einer Nucleinsäureprobe. Der Kit umfaßt eine Hybridisierungslösung gemeinsam mit einer oben angegebenen Oligonucleotid-Sonde. Die Oligonucleotid-Sonde kann entweder lyophilisiert oder in der Hybridisierungslösung enthalten sein.
Ein Verfahren zur Amplifizierung einer ausgewählten Mycobakterien- Nucleinsäuresequenz in einer Nucleinsäureprobe wird ebenfalls hierin geoffenbart. Das Amplifizierungsverfahren umfaßt das In-Kontakt-bringen von mindestens einem Paar von Oligonucleotid-Sonden mit der Nucleinsäureprobe unter Bedingungen, die die Hybridisierung jeder der Oligonucleotid-Sonden mit der ausgewählten Mycobaktieren-Nucleinsäuresequenz gestatten, wobei das genannte Sondenpaar gemeinsam ein Amplifizierungspaar umfaßt und wobei jede der genannten Oligonucleotid-Sonden aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus (i) Oligonucleotid-Sonden, die Fragmente von SEQ ID NO:1 (MK14) enthalten, die die Fähigkeit von MK14 zur selektiven Hybridisierung mit Mycobakterien-Nucleinsäure beibehalten; und (ii) Oligonucleotid-Sonden, die komplementär zu irgendeiner der vorhergehenden sind, eine Länge von mindestens 10 Nucleotiden aufweisen und mindestens zu 60 % zu MK14-Nucleinsäure homolog sind; und anschließend Amplifizierung der selektierten Mycobakterien-Zielsequenz.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine Karte des Clons MK14. Das Insert des Plasmids MK14 wurde in 5 Subfragmente A-E unterteilt. Entlang der DNA sind die Oligonucleotide (Oligos) mit Kästchen bezeichnet und gemäß der Oligo-Liste (siehe unten Tabelle 1) gekennzeichnet. Jede Fragmentgröße und jeder GC-Gehalt ist wie angegeben.
Fig. 2 zeigt einen Southern Blot von Mycobakterien und Nicht-Mycobakterien, sondiert mit MK14-C, die mit ³²P gekennzeichnet war. Dieses Bandmuster zeigt starke Gattungsspezifität, wobei keine Kreuzreaktivität in irgenwelchen untersuchten Nicht-Mycobakterien festgestellt wurde.
Fig. 3 zeigt einen Southern Blot von Mycobakterien und Nicht-Mycobakterien, sondiert mit MK14-D, das mit ³²P gekennzeichnet war. Diese Sonde zeigt starke Spezifität für M. kansasii und zeigt keine Kreuzreaktivität mit irgendeinem anderen der untersuchten Organismen.
Fig. 4 zeigt ein Agarosegel einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR). PCR- Amplifizierungsreaktionen unter Verwendung von Oligos 14-3 (SEQ ID NO:2) und 14-10 (SEQ ID NO:9) als Primer wurden durch Sichtbarmachung auf einem 1 % Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegel analysiert. Der Pfeil deutet auf ein 242 bp Produkt, das in allen Bahnen gefunden wurde, wobei langsam wachsende Mycobakterien als Templat verwendet wurden. In einem positiven Vergleich wurde das Plasmid MK14 (pMK14) als ein Templat verwendet. Als negativer Vergleich wurde Wasser anstelle der Templat-DNA zugesetzt.
Fig. 5 zeigt einen Southern Blot des PCR-Gels von Fig. 4, sondiert mit MK14-C, das mit ³²P gekennzeichnet war. Der Pfeil deutet auf ein 242 bp Produkt, das in allen langsam wachsenden Mycobakterien und M. gordonae auftrat. Es fehlt in allen Nicht-Mycobakterien und fehlt in den Mycobakterien M. chelonae und M. fortuitum. Die positiven und negativen Vergleiche sind die gleichen wie jene in Fig. 4.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt in vorteilhafter Weise sowohl Sonden zur Verfügung, die an eine Vielzahl unterschiedlicher Mycobakterien-Arten binden, als auch Sonden, die an spezifische Mycobakterien-Arten binden. Die allgemeinen Sonden sind als eine anfängliche Untersuchung auf mycobakterielle Infektion verwendbar und liefern eine rasche Alternative für die derzeit als anfängliche Untersuchung verwendeten Züchtungsverfahren, die eine 6-wöchige Züchtung erfordern. Sobald ein positives Ergebnis bei der anfänglichen Untersuchung gefunden wurde, liefern die hierin angegebenen artenspezifischen Sonden ein rasches Mittel zur Diagnose der speziellen Infektion.
Die Nucleotidsequenzen sind hierin nur durch einen Einzelstrang in der 5re - bis 3'-Richtung von links nach rechts angegeben. Die hierin verwendeten 1-Buchstaben- Nucleotidsymbole haben in der Fachwelt ihre Standardbedeutung in sbereinstimmung mit den Empfehlungen der IUPAC-IUB Biochemischen Nomenklatur-Kommission.
Der Ausdruck "Mycobakterien", wie er hierin verwendet wird, hat seine in der Fachwelt übliche Bedeutung und bezieht sich auf säurefeste, nicht-motile stäbchenförmige Bakterien. Vgl. allgemein B. Davis et al., Microbiology, 724-742 (3.Ausg. 1980). Als Beispiel, jedoch ohne Begrenzung darauf, umfassen Mycobakterien Mycobacterium africanum, M. avium, M. bovis, M. bovis-BCG, M. chelonae, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. kansasii, M. microti, M. scrofulaceum und M. tuberculosis.
Der Ausdruck "Amplifizierungspaar", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Paar von Oligonucleotid-Sonden gemäß der vorliegenden Erfindung, die ausgewählt sind, um gemeinsam bei der Amplifizierung einer ausgewählten Mycobakterien-Nucleinsäuresequenz in einem Verfahren, wie etwa der Polymerase-Kettenreaktion, Ligase-Kettenreaktion oder Strangverschiebungs-Amplifizierung, verwendet zu werden, wie detaillierter weiter unten besprochen werden wird.
Nucleinsäure- (d.h. DNA oder RNA) -proben zur Umsetzung der vorliegenden Erfindung in die Praxis können aus einer beliebigen Quelle erhalten werden. In der Regel wird die Nucleinsäureprobe in der Form einer Probe eines biologischen Fluids oder eines biologischen Gewebes erhalten werden, von denen angenommen wird, daß sie Mycobakterien enthalten. Geeignete biologische Fluide sind u.a., ohne Beschränkung auf dieselben: Sputum, Bronchialspülungen, Magenspülungen (die geschlucktes Sputum enthalten), Blut, Milch und Lymphflüssigkeit. Geeignete Gewebsproben sind u.a., ohne Beschränkung auf dieselben: Haut- und Weichgewebeproben. Da Mycobakterien sowohl Menschen als auch Tierarten befallen, ist die vorliegende Erfindung auf Diagnoseverfahren sowohl in der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin anwendbar und die Proben können sowohl von Menschen als auch von Tierarten stammen. Zum Beispiel verursacht M. bovis Tuberkulose in Rindern und ist auf Menschen übertragbar und somit kann die vorliegende Erfindung zur Diagnose der Infektion beim Rind verwendet werden und kann zum Testen von Rindermilch auf die Anwesenheit von M. bovis eingesetzt werden, das auf Menschen übertragbar ist. Ein weiteres Beispiel ist M. avium und M. intracellulare, die Vögel befallen (z.B. Hühner und Tauben) ebenso wie Schweine und somit kann die vorliegende Erfindung zur Feststellung solcher Infektionen verwendet werden. Weiters sind Menschen auf eine Infektion durch eine Vielzahl von Mycobakterien empfindlich, die, ohne Beschränkung auf dieselben, umfassen: M. tuberculosis, M. kansasii, M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum und M. fortuitum, und die vorliegende Erfindung kann zur Feststellung solcher Infektionen eingesetzt werden.
Oligonucleotid-Sonden gemäß der vorliegenden Erfindung können eine beliebige Länge aufweisen, je nach dem speziellen eingesetzten Assay-Format. Im allgemeinen weisen die Oligonucleotid-Sonden eine Länge von mindestens 10 bis 15 Nukleotiden auf. Zum Beispiel haben Oligonucleotid-Sonden, die zur Feststellung von Mycobakterien verwendet werden, vorzugsweise eine Länge von 15 bis 20 Nucleotiden. Die Oligonucleotid-Sonden können die Elemente einer Strangverschiebungs-Amplifizierungssonde enthalten, wie detaillierter weiter unten besprochen wird. Nucleinsäuresequenzen, auf welche Amplifizierungspaare von Oligonucleotid-Sonden gerichtet sind, haben vorzugsweise eine Länge von 50 bis 150 Nucleotiden.
Im Hinblick auf Nucleinsäuresequenzen, die mit spezifischen hierin geoffenbarten Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, kann die Hybridisierung unter Bedingungen reduzierter Intensität, mittlerer Intensität oder selbst unter intensiven Bedingungen (z.B. Bedingungen, die durch eine Waschintensität von 0,5 x SSC und 0,1 % SDS bei einer Temperatur von 20 oder 30 Grad unterhalb der Schmelztemperatur der Sonde dargestellt werden, oder selbst Bedingungen, die durch eine Waschintensität von 0,1 x SSC und 0,1 % SDS bei einer Temperatur von 10 Grad unterhalb der Schmelztemperatur der DNA- Sequenz für MK14 DNA dargestellt werden) in einem Standard-Hybridisierungsassay durchgeführt werden. Vgl. J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2. Ausgabe 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory). Im allgemeinen werden die Nucleinsäuresequenzen, die mit der hierin geoffenbarten MK14-DNA hybridisieren, mindestens zu 60 % homolog, zu 65 % homolog, zu 70 % homolog und sogar zu 75 % homolog oder mehr mit der hierin geoffenbarten Sequenz der MK14-DNA sein.
Die erfindungsgemäßen Sonden können mit natürlich vorkommenden Zucker-Phosphat-Rückgraten ebenso wie mit modifizierten Rückgraten, inklusive Phosphorthionaten, Dithionaten, Alkylphosphonaten und α-Nucleotiden, eingesetzt werden. Modifizierte Zucker-Phosphat-Rückgrate sind allgemein erläutert in Miller und T'so, Ann. Reports Med.Chem., 23:295 (1988) und Moran et al., Nuc. Acids Res., 14:5019 (1987). Die erfindungsgemäßen Sonden können entweder aus Ribonucleinsäure (RNA) oder Deoxyribonucleinsäure (DNA) aufgebaut sein, wobei DNA bevorzugt ist.
Der Einsatz der Sonden bei Untersuchungsmethoden inkludiert Northern Blot (Feststellung von RNA), Southern Blot (Feststellung von DNA), Western Blot (Feststellung von Protein) und Dot Blot (DNA, RNA oder Protein). Andere Feststellungsmethoden inkludieren Kits, in denen Sonden in einer Tauchstiftanordnung und dergleichen enthalten sind.
Zur Feststellung von Hybrid-Molekülen, die bei Einsatz der erfindungsgemäßen Sonden gebildet wurden, wird in der Regel ein feststellbarer Marker an eine der Sonden angesetzt. Die Sonden können auf verschiedene Weise gekennzeichnet werden. Die Sonden können mit Radiolabel gekennzeichnet sein und durch Autoradiografie festgestellt werden. Solche Label für Autoradiografie sind u.a. ³H, ¹²&sup5;I, ³&sup5;S, ¹&sup4;C und ³²P. In der Regel hängt die Auswahl der radioaktiven Isotope von Forschungsvorteilen ab, wie u.a. der Leichtigkeit der Synthese, der Stabilität und der Halbwertszeit der Isotope. Andere feststellbare Marker inkludieren Liganden, Fluorophore, chemilumineszente Mittel, elektrochemische Via-Sensoren, zeitlich aufgelöste Fluoreszenz, Enzyme und Antikörper. Zum Beispiel kann ein Antikörper mit einem Liganden gekennzeichnet werden. Andere feststellbare Marker zur Verwendung mit erfindungsgemäßen Sonden inkludieren Biotin, Radionucleotide, Enzym-Inhibitoren, Co-Enzyme, Luciferine, paramagnetische Metalle, Spinmarkierung und monoklonale Antikörper. Die Auswahl des Labels bestimmt die Art und Weise, in welcher das Label an die Sonde gebunden wird.
Radioaktive Nucleotide können auf verschiedene Weise in die erfindungsgemäßen Sonden eingebaut werden. Solche Mittel sind u.a. Nick-Translation von doppelsträngigen Sonden, Kopieren von einzelsträngigen M13-Plasmiden, die spezielle Inserts aufweisen, mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I aus E. coli oder einer anderen solchen DNA-Polymerase in Gegenwart von radioaktivem dNTP, Transkription einer cDNA von RNA-Templaten unter Verwendung von reverser Transkriptase in Anwesenheit von radioaktivem dNTP, Transkription einer RNA von Vektoren, die starke Promotoren enthalten, wie etwa SP6 Promotoren oder T7 Promotoren, unter Verwendung von SP6 oder T7 RNA Polymerase in Anwesenheit von radioaktivem rNTP, Tailing der 3'-Enden der Sonden mit radioaktiven Nucleotiden unter Verwendung von terminaler Transferase und Phosphorylierung der 5'-Enden der Sonden unter Verwendung von Gamma ³²P ATP und Polynucleotid-Kinase.
Die Amplifizierung einer ausgewählten oder Ziel-Nucleinsäuresequenz kann auf jede geeignete Weise durchgeführt werden. Vgl. allgemein D. Kwoh, Am. Biotechol. Lab. 8, 14-25 (1990). Beispiele geeigneter Amplifizierungsverfahren inkludieren, sind jedoch nicht beschränkt auf Polymerase-Kettenreaktion, Ligase-Kettenreaktion, Strangverschiebungs-Amplifizierung, auf Transkription basierende Amplifizierung (vgl. D. Kwoh et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86, 1173-1177 (1989)), selbsterhaltende Sequenz-Replikation (vgl. J. Guatelli et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87, 1874-1878 (1990)) sowie das Qβ Replikase-System (vgl. P. Lizardi et al., BioTechnology 6, 1197- 1202 (1988)).
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird in Übereinstimmung mit den bekannten Verfahren vorgenommen. Vgl. z.B. US-Patente 4,683.195; 4,683.202; 4,800.159; und 4,965.188. Im allgemeinen wird bei der PCR zuerst eine Nucleinsäureprobe (z.B. in Anwesenheit einer hitzestabilen DNA-Polymerase) mit einem Oligonucleotid-Primer für jeden Strang der speziellen zu untersuchenden Sequenz unter Hybridisierungsbedingungen behandelt, sodaß ein Extensionsprodukt jedes Primers synthetisiert wird, das zu jedem Nucleinsäurestrang komplementär ist, wobei die Primer ausreichend komplementär zu jedem Strang der spezifischen Sequenz sind, um damit zu hybridisieren, sodaß das von jedem Primer synthetisierte Extensionsprodukt, wenn es von seinem Komplement getrennt wird, als ein Templat für die Synthese des Extensionsprodukts des anderen Primers dienen kann, worauf die Probe unter Denaturierungsbedingungen behandelt wird, um die Primer-Extensionsprodukte von ihren Templaten zu trennen, wenn die festzustellende(n) Sequenz(en) vorliegt (vorliegen). Diese Schritte werden in zyklischer Weise wiederholt, bis das gewünschte Ausmaß der Amplifizierung erreicht ist. Die Feststellung der amplifizierten Sequenz kann dadurch erfolgen, daß zu dem Reaktionsprodukt eine Oligonucleotid-Sonde zugesetzt wird, die zur Hybridisierung mit dem Reaktionsprodukt befähigt ist (z.B. eine Oligonucleotid-Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung), wobei die Sonde ein feststellbares Label trägt und dann das Label in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren festgestellt wird.
Ligase-Kettenreaktion (LCR) wird in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren durchgeführt. Vgl. z.B. R. Weiss, Science 254, 1292 (1991). Im allgemeinen wird die Reaktion mit zwei Paaren von Oligonucleotid-Sonden durchgeführt: ein Paar bindet an einen Strang der festzustellenden Sequenz; das andere Paar bindet an den anderen Strang der festzustellenden Sequenz. Jedes Paar überlappt gemeinsam vollständig den Strang, welchem es entspricht. Die Reaktion wird ausgeführt, indem zuerst die Stränge der festzustellenden Sequenz denaturiert werden (z.B. aufgetrennt werden), dann die Stränge mit den beiden Paaren von Oligonucleotid-Sonden in Gegenwart von hitzestabiler Ligase umgesetzt werden, sodaß jedes Paar der Oligonucleotid-Sonden zusammenligiert wird, worauf das Reaktionsprodukt aufgetrennt wird und dann das Verfahren in zyklischer Weise wiederholt wird, bis die Sequenz zu dem gewünschten Ausmaß amplifiziert wurde. Die Feststellung kann in ähnlicher Weise vorgenommen werden, wie oben im Hinblick auf PCR beschrieben wurde.
Die Strangverschiebungs-Amplifizierung (SDA) wird ebenfalls gemäß bekannten Verfahren durchgeführt. Vgl. G. Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396 (1992); G. Walker et al., Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696 (1992). SDA kann mit einem einzigen Amplifizierungs-Primer oder mit einem Paar von Amplifizierungs- Primern durchgeführt werden, wobei exponentielle Amplifizierung mit den letzteren erreicht wird. Im allgemeinen umfassen die SDA-Amplifizierungs-Primer in der 5'- bis 3'- Richtung eine flankierende Sequenz (die DNA-Sequenz derselben ist nicht kritisch), eine Restriktionsstelle für das in der Reaktion verwendete Restriktionsenzym und eine Oligonucleotidsequenz (z.B. eine Oligonucleotid-Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung), die mit der zu amplifizierenden und/oder festzustellenden Zielsequenz hybridisiert. Die Flankierungssequenz, die einfach zur Erleichterung der Bindung des Restriktionsenzyms an die Erkennungsstelle dient, hat vorzugsweise eine Länge von etwa 15 bis 20 Nucleotiden; die Restriktionsstelle ist in der SDA-Reaktion funktionell (d.h. Phosphorthioat-Bindungen, die in den Primer-Strang eingebaut sind, inhibieren anschließendes Nicking nicht -- eine Bedingung, der durch die Verwendung einer nicht-palindromischen Erkennungsstelle genüge getan wird); der Abschnitt der Oligonucleotid-Sonde hat vorzugsweise eine Länge von etwa 13 bis etwa 15 Nucleotiden. SDA wird mit einem einzigen Amplifizierungs-Primer wie folgt durchgeführt: ein Restriktionsfragment (vorzugsweise etwa 50 bis 100 Nucleotide lang und vorzugsweise mit niedrigem GC-Gehalt), das die festzustellende Sequenz enthält, wird dadurch hergestellt, daß eine DNA-Probe mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen verdaut wird, der SDA-Amplifizierungs-Primer zu einer Reaktionsmischung, die das Restriktionsfragment enthält, zugesetzt wird, sodaß ein Duplex zwischen dem Restriktionsfragment und dem Amplifizierungs-Primer mit einem 5'-Überhang an jedem Ende gebildet wird, ein Restriktionsenzym, das sich an die Restriktionsstelle an der Amplifizierungssonde bindet (z.B. HincII) wird zu der Reaktionsmischung zugesetzt, eine Exonuclease-defiziente DNA-Polymerase (z.B. eine Exonuclease-defiziente Form von E. coli DNA Polymerase I, vgl. V. Derbyshire, Science 240, 199-201 (1988)) wird zu der Reaktionsmischung zugesetzt und drei dNTPs und ein dNTP[αS] werden zu der Reaktionsmischung zugesetzt, wobei das dNTP[αS] so ausgewählt ist, daß eine Phosphorthioat-Bindung in den Primer-Strang an der Restriktionsstelle für das spezielle verwendete Restriktionsenzym eingebaut wird (z.B. dGTP, dCTP, dTTP und dATP[αS], wenn das Restriktionsenzym HincII ist). Die DNA-Polymerase erstreckt die 3'-Enden des Duplex mit den dNTPs zur Bildung eines Stromabwärts-Komplements des Zielstranges, das Restriktionsenzym nickt die Restriktionsstelle an dem Amplifizierungs-Primer und die DNA-Polymerase erstreckt das 3'-Ende des Amplifizierungs-Primers an dem Nick, um das vorher gebildete Stromabwärts-Komplement des Zielstranges zu verschieben. Das Verfahren ist inherent wiederholbar, da das Restriktionsenzym ständig neue komplementäre Stränge nickt, wenn diese von der Restriktionsstelle her gebildet werden, und die DNA-Polymerase bildet kontinuierlich neue komplementäre Stränge von der genickten Restriktionsstelle her. Die SDA kann mit einem Primer-Paar an einer doppelsträngigen Ziel-DNA-Sequenz durchgeführt werden, wobei der zweite Primer an das 5'-Ende des komplementären Strangs bindet, sodaß zwei Sätze von sich wiederholenden Reaktionen gleichzeitig stattfinden und das Verfahren exponentiell vor sich geht, da die Produkte eines Reaktionssatzes als ein Ziel für den Amplifizierungs-Primer im anderen Reaktionssatz dienen. Zusätzlich dazu kann die Stufe der ersten Verdauung der DNA- Probe zur Bildung eines Restriktionsfragments dadurch eliminiert werden, daß die Strangverschiebungswirkung der DNA-Polymerase ausgenützt und ein Paar von "Bumper"-Primern zugesetzt wird, das sich an einer Flankierungsposition 5' zu der Position, an welcher sich jeder Amplifizierungs-Primer bindet, binden. Jedes Extensionsprodukt des Bumper-Primers verschiebt das entsprechende Extensionsprodukt des Amplifizierungs-Primers und die beiden verschobenen, komplementären Extensionsprodukte des Amplifizierungs-Primers binden sich aneinander, um ein doppelsträngiges DNA- Fragment zu bilden, das dann als ein Substrat für die exponentielle SDA mit diesem Paar von SDA-Primern dienen kann.
Beim Einsatz von SDA werden die erfindungsgemäßen Oligonucleotid- Sonden vorzugsweise so ausgewählt, daß der Guanin- plus Cytosingehalt niedrig ist, vorzugsweise geringer als 70 % der gesamten Nucleotid-Zusammensetzung der Sonde. In ähnlicher Weise sollte die Zielsequenz einen niedrigen GC-Gehalt aufweisen, um die Bildung von sekundären Strukturen zu vermeiden.
Ein Kit zur Feststellung von Mycobakterien-Nucleinsäure in einer Nucleinsäureprobe enthält mindestens eine erfindungsgemäße Sonde und eine Hybridisierungslösung, um zu ermöglichen, daß Hybridisierung zwischen den Sonden und der Nucleinsäureprobe stattfindet, wobei die Sonde entweder in der Lösung suspendiert oder getrennt in lyophilisierter Form zur Verfügung gestellt wird. Ein Beispiel einer geeigneten Hybridisierungslösung ist eine Lösung bestehend aus 6x SSC (0,9M Natriumchlorid, 0,09M Natriumzitrat, pH 7,0), 0,1M EDTA, pH 8,0, 5x Denhardt's Lösung [0,1 % (Gew./Vol.) Ficoll Typ 400, 0,1 % (Gew./Vol.) Polyvinylpyrrolidon, 0,1 % (Gew./Vol.) Rinderserum- Albumin] und 100 µg/ml gescherte denaturierte Lachs-Sperma-DNA, im Handel erhältlich von Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD 20877 USA unter der Katalog-Nr. 5565UA. Vgl. auch T. Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Munual, 387-388 (1982) (Cold Spring Harbor Laboratory). Die Bestandteile des Kits werden zusammen in einen gemeinsamen Behälter verpackt (z.B. einen Behälter, der mit einem aufbrechbaren Siegel verschlossen ist), wobei der Kit in der Regel eine Gebrauchsanweisung enthält, um eine spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens durchzuführen. Zusätzliche wahlweise Bestandteile des Kits in Abhängigkeit von dem zu verwendenden Assay-Format inkludieren eine zweite Sonde gemäß der Erfindung, die zur Verwendung mit der ersten Sonde zur Durchführung der PCR gemäß obiger Erklärung geeignet ist (oder, im Fall eines Kits zur Durchführung von LCR, zwei Sondenpaare gemäß der vorliegenden Erfindung), eine oder mehrere Feststellungssonden und Mittel zur Durchführung eines Feststellungsschrittes (z.B eine erfindungsgemäße Sonde, gekennzeichnet mit einem feststellbaren Marker und gegebenenfalls ein Enzymsubstrat, wenn der feststellbare Marker ein Enzym ist).
Die vorliegende Erfindung wird detaillierter in den folgenden Beispielen erklärt, worin "Kb" für Kilobasen, "bp" für Basenpaare, "ng" für Nanogramm, "pMol" für Picomole, "µl" für Mikroliter, "mM" für Millimolar, "µM" für Mikromolar, "DTT" für Dithiothreitol, "Tm" für Schmelztemperatur steht und die Temperaturen, sofern nicht anders angegeben, in Grad Celsius angegeben sind. Diese Beispiele dienen nur zur Erläuterung und sollen keineswegs zur Einschränkung der Erfindung dienen.

BEISPIEL I

Herstellung der Stämme und von genomischer DNA

Die in den beschriebenen Beispielen hierin verwendeten Mycobakterien waren M. africanum LCDC501, M. avium ATCC25291, M. bovis CDC4, M. bovis- BCG CDC34, M. chelonae TMC1543, M. fortuitum TMC1529, M. gordonae TMC1318, M. intracellulare ATCC13950, M. kansasii TMC1201, M. microti LCDC201, M. scrofulaceum CDC78 und M. tuberculosis ATCC27294. Die verwendeten Nicht-Mycobakterien waren Bordetella pertussis ATCC8467, Candida albicans ATCC44808, Corynebacterium diphtheriae ATCC11913, Escherichia coli ATCC11775, Flavobacterium meningisepticum ATCC13253, Nocardia asteroides ATCC3308, Rhodococcus rhodochrous ATCC13808, Streptococcus pneumoniae ATCC6303, Adenovirus Sigma D3390 (Advirus), Eurkaryotische DNA McCoy-Zellen (eukDNA). Die langsam wachsenden Mycobakterien sind M. africanum, M. avium, M. bovis, M. bovis-BCG, M. intracellulare, M. kansasii, M. microti, M. scrofulaceum und M. tuberculosis. Die schnell wachsenden Mycobakterien sind M. chelonae, M. fortuitum und M. gordonae. Alle diese Mycobakterien-Stämme wurden in BACTEC- (Handelsmarke) Röhrchen gezüchtet und dann durch Hitze bei 70ºC während 4 Stunden abgetötet. Die genomische DNA wurde in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren isoliert. Vgl. S. Visuvanathan et al., Simple Enzymatic Method for Isolation of DNA from Diverse Bacteria (Einfaches enzymatisches Verfahren zur Isolierung von DNA aus verschiedenen Bakterien), J.Microbiol.Meth. 10, 59-64 (1989). Die Nicht-Mycobakterien- Stämme wurden in Luria-Brühe gezüchtet und die genomische DNA wurde durch die CTAB Mini-Prep-Methode isoliert. Vgl. z.B. F. Asubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987).

BEISPIEL 2

M. kansasii-Bibliothek

Die genomische DNA von M. kansasii wurde mit Sau3AI (GIBCO BRL) geschnitten. Die Fragmentgrößen lagen im Bereich von 1,4 Kb bis < 200 bp. Der Vektor, BlueScript SK+ (Handelsmarke) (Stratagene), wurde mit BamHI (GIBCO BRL) verdaut und dann unter Verwendung von alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (CIAP) (Boehringer Mannheim Biochemicals) phosphatasiert. 750 ng des Inserts wurden in 20 ng des Vektors in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 7 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT, 1 mM ATP und 1 Einheit/10 µl T4 DNA-Ligase (GIBCO BRL) ligiert. Die Ligation wurde über Nacht bei 15ºC inkubiert und dann in kompetente JM109-Zellen (Stratagene) transformiert. Es wurden 1000 unabhängige Isolate erhalten.

BEISPIEL 3

Identifizierung und Sequenzierung des Clons MK14

Aus den oben in Beispiel 2 erzeugten 1000 Clonen wurden 15 zum genomischen Blot-Screening ausgewählt, die aus verschiedenen mycobakteriellen und nicht- mycobakteriellen DNAs bestanden. Von den 15 Clonen zeigte sich, daß MK14 (SEQ ID NO:1) mit allen Mycobakterien hybridisierte und keine Kreuz-Hybridisierung zu irgendeinem untersuchten Nicht-Mycobakterium zeigte.
MK14 wurde unter Verwendung eines Sequenase Version 2.0 Kits (United States Biochemicals) mit [α-³&sup5;S]-Deoxyadenosin-triphosphat (NEN-DuPont) sequenziert. MK14 wurde auch unter Verwendung des DNA Sequencers von Applied Biosystems 373A sequenziert, wobei der Farbstoff-Primer-Kit nach den Angaben des Herstellers verwendet wurde.

BEISPIEL 4

Oligonucleotid-Synthese

Die Oligonudeotide (Oligos) wurden mit einem Synthesizer von Applied Biosystem 380B nach den Angaben des Herstellers synthetisiert. Die Oligos wurden bei 50ºC deblockiert und dann durch eine Oligonucleotid-Reinigungskartusche nach den Angaben des Herstellers gereinigt. Die Namen und Sequenzen der Oligonucleotide sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. TABELLE 1 Oligonucleotide
Man beachte, daß im Hinblick auf das Oligonucleotid 14-3 (SEQ ID NO:2) das T an jener Position fehlt, die der Position 98 in MK14 (SEQ ID NO:1) entspricht, da die Synthese dieser Sonde auf einer früheren Sequenzinformation beruhte. Obwohl diese Veränderung in die mit diesem Oligonucleotid (nach später folgender Beschreibung) synthetisierten MK14-Fragmente eingebaut war, wurde kein nachteiliger Effekt beobachtet.

BEISPIEL 5

Herstellung der MK14-Fragmente A bis E durch Polymerase-Kettenreaktion

Der Clon MK14 wurde in fünf kleinere Fragmente mit der Bezeichnung A bis E durch Polymerase-Kettenreaktion unterteilt, wobei das Plasmid MK14 als das Templat und die in Beispiel 4 oben beschriebenen Oligonucleotid-Primer in dem in Fig. 1 gezeigten Muster verwendet wurden.
Die Amplifizierungen durch Polymerase-Kettenreaktion erfolgten in Reaktionen von 25 bis 100 µl, bestehend aus 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,001 % (Gew./Vol.) Gelatine, 200 µM dATP, 200 µM dGTP, 200 µM dGTP, 200 µM dTTP, 1,0 µM jedes Primers, 100 ng/100 µl genomischer DNA als Templat oder 50 ng/100 µl Plasmid-DNA als Templat. Die Reaktionen wurden mit Mineralöl überschichtet und 5 Minuten auf 95ºC erhitzt. Es wurden 2,5 Einheiten/100 µl AmpliTaq (Handelsmarke) Polymerase (Perkin Elmer Cetus) zugesetzt und das zyklische Verfahren wurde begonnen. Die Proben wurden in der Regel 1 Minute und 30 Sekunden bei 94ºC, 2 Minuten bei 37-50ºC, 3 Minuten bei 72ºC über 25-30 Zyklen inkubiert. Darauf folgte eine Inkubierung während 7 Minuten bei 72ºC und eine Aufbewahrung bei 4ºC.
Das Fragment A (SEQ ID NO:12) bestand aus den Nucleotiden 5-95 von MK 14; das Fragment B (SEQ ID NO:13) bestand aus Nucleotiden 96-202 von MK14 (man beachte den Kommentar zum obigen Beispiel 4); das Fragment C (SEQ ID NO:14) bestand aus den Nucleotiden 203-337 von MK14; das Fragment D (SEQ ID NO:15) bestand aus den Nucleotiden 338-429 von MK14; und das Fragment E (SEQ ID NO:16) bestand aus den Nucleotiden 430-527 von MK 14.

BEISPIEL 6

Hybridisierungsmuster der MK14-Fragmente A-E nach der Bestimmung durch genomische Southern Blot-Analyse

Die in Beispiel 5 oben hergestellten MK14-Fragmente A-E wurden als Sonden für eine Southern Blot-Analyse von genomischer DNA bei einer Vielzahl von Mycobakterien und Nicht-Mycobakterien verwendet.
Alle Fragmente bildeten einzigartige Hybridisierungsmuster. Das Fragment C (MK14-C) (SEQ ID NO:14) zeigte starke Gattungsspezifität (Fig. 2), wogegen das Fragment D (MK14-D) (SEQ ID NO:15) starke M. kansasii-Spezifität zeigte (Fig. 3). Das Fragment A (MK14-A) (SEQ ID NO:12) hybridisierte mit allen untersuchten Arten von Mycobakterien, zeigte jedoch Kreuz-Reaktion mit einigen Nicht-Mycobakterien-Arten. Das Fragment B (MK14-B) (SEQ ID NO:13) hybridisierte stark mit M. kansasii, hybridisierte schwach mit TB Komplex-Organismen und M. gordenae und zeigte keine Kreuz-Reaktivität mit dem untersuchten Nicht-Mycobakterien-Arten. Das Fragment E (MK14-E) (SEQ ID NO:16) hybridisierte gut mit M. bovis, M. gordonae, M. intracellulare und M. kansasii, hybridisierte nicht mit den anderen untersuchten Mycobakterien-Arten und zeigte keine Kreuz-Reaktivität mit den untersuchten Nicht-Mycobakterien-Arten.
Für die Southern Blot-Analyse wurde genomische DNA mit PstI (GIBCO BRL) verdaut. Die Reaktionen wurden auf einem 0,8 % Agarosegel aufgetrennt und dann auf eine Nylon-Membran (GIBCO BRL Nylon-1 oder NEN-DuPont Gene Screen) übertragen. Vgl. J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2.Ausgabe 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory). Die Filter wurden dann mit UV vernetzt (Stratalinker) und hybridisiert (GIBCO BRL) (Sambrook et al.). Die Sonden wurden durch Random-Primer gekennzeichnet (Boehringer Mannheim Biochemicals), wobei [α- ³²P]-Deoxyadenosin-Triphosphat und [α-³²P]-Deoxycytidin-Triphosphat (NEN- DuPont)verwendet wurden. Die Blots wurden bei -25ºC bis -10ºC unterhalb der vorhergesagten Tm gewaschen (Sambrook et al.). Die Filter wurden 1-7 Tage auf einen XAR-5- Film einwirken gelassen.

BEISPIEL 7

Hybridisierungsmuster der MK14-Fragmente C1 und C2 nach der Bestimmung durch genomische Southern Blot-Analyse

Das Fragment MK14-C wurde durch PCR-Amplifizierung gemäß obiger Beschreibung mit den Oligonucleotiden MK14-13 (TAG TAT CGA CTG CGT) (SEQ ID NO:17) und MK14-14 (TCT TGC CCG TTG GGG) (SEQ ID NO:18) und mit den Oligonucleotiden MK14-15 (CCC CAA CGG GCA AGA) (SEQ ID NO:19) und MK14-10 (SEQ ID NO:9) in zwei kleinere Fragmente unterteilt, um das Fragment MK14-C1 (SEQ ID NO:20) bzw. das Fragment MK14-C2 (SEQ ID NO:21) zu bilden. MK14-C1 hybridisierte mit allen langsam wachsenden Mycobakterien, es erfolgte jedoch keine Hybridisierung mit M. fortuitum und M. gordonae. Das Fragment MK14-C2 hybridisierte mit allen untersuchten Mycobakterien und zeigte keine Kreuz-Hybridisierung mit den untersuchten nicht-mycobakteriellen DNAs.

BEISPIEL 8

PCR-Analyse des Fragmentes MK14-C

MK14-C wurde durch PCR-Analyse weiter analysiert. Eine Reaktionsmischung der PRC-Amplifizierung, bei der die Oligos 14-3 (SEQ ID NO:2) und 14-10 (SEQ ID NO:9) enthalten waren und bei der viele mycobakterielle und nicht-mycobakterielle DNAs als Template verwendet wurden, zeigte beste Gattungsspezifität (Fig. 4). Diese Oligos amplifizieren ein 242 bp-Produkt, das die Fragmente B und C enthält (Fig. 1) (SEQ ID NO:22). Es existierte ein Produkt der korrekten Größe in allen untersuchten langsam wachsenden Mycobakterien. Die schnell wachsenden Mycobakterien M. chelonae, M. fortuitum und M. gordonae zeigten keine 242 bp Bande auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel. Eine spezielle Sonde für eine interne Region des amplifizierten Produkts wird nur spezifische Produkte zeigen, die nicht auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel sichtbar gemacht werden können. Sie wird auch beweisen, daß das 242 bp Produkt, das in den langsam wachsenden Mycobakterien gefunden wird, tatsächlich das spezifische MK14-C-artige Produkt ist.
Eine Southern Blot-Analyse erfolgte an diesen PCR-Amplifizierungsreaktionen unter Verwendung von MK14-C als Sonde. Die PCR Southern Blots wurden in der gleichen Weise wie die oben beschriebenen genomischen Southern Blots vorgenommen, mit Ausnahme dessen, daß 5 µl der PCR-Reaktionsmischung auf einem 1,0 % Agarosegel getrennt wurden. Die Sonde hybridisierte mit allen langsam wachsenden Mycobakterien und M. gordonae. Sie hybridisierte nicht mit M. chelonae, M. fortuitum, E. coli, B. pertussis, N. asteroides, R. rhodochrous oder eukaryotischer DNA (Fig. 5).

BEISPIEL 9

Subclonierung der MK14-Fragmente B und C aus M. avium und M. tuberculosis

Die Auswahl der Oligonucleotide, die alle Mycobakterien amplifizieren, hängt davon ab, wie homolog die MK14-C DNA-Sequenz innerhalb der verschiedenen Arten ist. Daher wurde beschlossen, die analoge DNA von zwei zusätzlichen Arten M. avium und M. tuberculosis, zu sequenzieren. Ein Vergleich der neuen Sequenzen mit der Sequenz von M. kansasii könnte dann verwendet werden, um spezifische Oligonucleotide zu entwickeln.
Die PCR-Amplifizierungsreaktionen wurden unter Verwendung der Oligos 14-3 (SEQ ID NO:2) und 14-10 (SEQ ID NO:9) mit genomischer DNA von M. avium, M. tuberculosis und M. kansasii als Template durchgeführt. Das 242 bp Produkt wurde durch niedrig schmelzende Agarose (GIBCO BRL) isoliert. Dann erfolgte Kinasierung in 50 nM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM MgCl&sub2;, 5 % Glyzerin, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP und 10 Einheiten/20 µl Polynucleotid-Kinase (Stratagene) während 30 Minuten bei 37ºC. Der Vektor Bluescript SK+ (Handelsmarke) wurde mit HincII (GIBCO BRL) verdaut und dann mit CIAP (Boehringer Mannheim Biochemicals) phosphatasiert. Das Insert und der Vektor wurden in einem Verhältnis von 3 zu 1 über Nacht bei 15ºC ligiert. Die Subclone beider wurden nach obiger Beschreibung sequenziert.
Beim Vergleich von M. kansasii Frament BC (SEQ ID NO:22) mit M. tuberculosis Fragment BC (SEQ ID NO:23) oder M. avium Fragment BC (SEQ ID NO:24) zeigte sich, daß die Homologien 79 % bzw. 80 % betrugen. Selbst beim Vergleich von M. avium mit M. tuberculosis beträgt die Homologie 76 %. Wenn alle drei aneinandergereiht werden, beträgt die Homologie 69 %.

BEISPIEL 10

Screening der PCR-Amplifizierungsreaktionen durch Primer-Extension mit Oligos 14-23 und 14-15

Der gleiche Satz von PCR-Amplifizierungsreaktionen wurde durch Primer- Extension unter Verwendung von Oligo 14-23 (Fig. 4) auf Spezifität gescreent. Das Oligo 14-23 (CTA GTG AAT GGG A) (SEQ ID NO:25) wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Information über die Sequenzhomologie entwickelt. Die Ergebnisse zeigten die gleiche Spezifität wie die Southern Blots (nicht gezeigte Daten). Die unterschiedlichen Intensitäten der Banden können durch die Oligo-Sequenz erklärt werden. Die Oligo-Sequenz ist identisch in M. tuberculosis und M. kansasii, jedoch besteht eine Fehlpaarung in M. avium.
Zur Primer-Extension wurden zwei pMole von Oligonucleotid 14-23 in 1X REact 1 (BRL) mit 4,6 pMolen von [g-³²P]-Adenosintriphosphat (NEN-DuPont) und 1 Einheit/µl Polynucleotid-Kinase (Stratagene) kinasiert. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei 37ºC inkubiert und dann 10 Minuten auf 65ºC erhitzt. Die Reaktion wurde dann mit TE (10 mM Tris/8,0, 1 mM EDTA) auf das doppelte Volumen verdünnt. Für die Primer-Extensionsreaktion wurden 5 µl einer PCR-Reaktion auf 10 µl in 1X PCR-Puffer (Perkin Elmer Cetus), 0,125 mM dNTPs und 0,05 pMolen/10 µl gekennzeichnetem Primer verdünnt. Die Reaktionsmischung wurde 10 Minuten auf 95ºC erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Es wurden 1,5 Einheiten Klenow Großes Fragment (BRL) zugesetzt und die Proben wurden 10 Minuten bei 37ºC inkubiert. Eine Stop-Lösung (USB) wurde zugesetzt und die Proben wurden 5 Minuten auf 95ºC erhitzt, bevor sie auf einem 8 % Acrylamid-Denaturierungsgel aufgetrennt wurden. Die Gele wurden dann auf einen XAR-Film 2 bis 16 Stunden einwirken gelassen.
Eine andere Primer-Extensionsreaktion erfolgte an den gleichen PCR-amplifizierten Produkten unter Verwendung von Oligo 14-15 (SEQ ID NO:16). Dieses Oligo hat sehr geringe Homologie zwischen M. kansasii, M. tuberculosis und M. avium mit 6- 7 Fehlpaarungen in 13 bp. Die einzigen festgestellten Produkte waren jene von M. kansasii und dem Kontrollplasmid pMK14 (nicht gezeigte Daten). Es wurde auch eine schwache Bande bei M. gordonae festgestellt. Unter Verwendung zweier unterschiedlicher Oligos zur Feststellung der gleichen PCR-Amplifizierungsreaktion durch Primer- Extension ergaben sich dramatisch unterschiedliche Profile. Das Oligo 14-23 zeigte Gattungsspezifität, während das Oligo 14-15 Spezifität für M. kansasii zeigte. Dies zeigt, daß die hier bereitgestellten Sequenzen für Gattungsspezifität von M. kansasii, M. tuberculosis oder M. avium, je nach dem verwendeten Assay und den eingesetzten Bestimmungsmethoden, verwendet werden können. Sowohl bei Southern Blot als auch bei den Primer-Extensionsassays zeigten N. asteroides und M. fortuitum sehr schwache Hybridisierung nach längeren Einwirkungszeiten.
Die vorangehenden Beispiele erläuterun die vorliegende Erfindung und sind nicht zur Beschränkung derselben angegeben. Die Erfindung wird durch die angeschlossenen Ansprüche definiert.

SEQUENZ-LISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER: BECTON, DICKINSON AND COMPANY
(A) NAME: BECTON, DICKINSON AND COMPANY
(B) STRASSE: 1 Becton Drive
(C) STADT: Franklin Lakes
(D) STAAT: New Jersey
(E) LAND: USA
(F) ZIP: 07417-1880
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Mycobakterien-Sonden
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 25
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) MEDIUM TYP: Floppy disk
(B) COMPUTER: PC IBM compatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(v) VORLIEGENDE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: 93108325.7
(B) ANMELDUNGSDATUM: 24. Mai 1993
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:1:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 531 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
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(ii) MOLUKÜLART: cDNA
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(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:2:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
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(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
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(ii) MOLEKÜLART: cDNA
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ACCTGTGTGC CACCACACCA 20
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:3:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
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(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:3:
ATACGGTCAT CGGCTACCTG 20
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(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
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(ii) MOLEKÜLART: cDNA
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AACGAACTCG TTGACGGGAC 20
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(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
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(ii) MOLEKÜLART: cDNA
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ATTCCTGCGG GTTTTCTTCA 20
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(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
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(ii) MOLEKÜLART: cDNA
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GGCTCCGGCG AACGATTCCG 20
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(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
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CGACGCGTCG GGTTCGCCGC 20
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(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
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(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:8:
GAGCCCCCGC ACGCCGTAGT 20
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CGCCGCTCCA CCTTGTGCTG 20
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GGGCGCGCAT GGCTCAGGGG 20
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GGCGCTGACG ACCACGTGGT 20
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(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
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(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
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(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
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(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:16:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
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(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:17:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Basenpaare
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(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:17:
TAGTATCGAC TGCGT 15
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:18:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
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(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:18:
TCTTGCCCGT TGGGG 15
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:19:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
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(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:19:
CCCCAACGGG CAAGA 15
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:20:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE:73 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
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(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:21:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE:61 Basenpaare
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(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE:241 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
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(ii) MOLEKÜLART: cDNA
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(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:23:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE:230 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
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(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:23:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:24:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE:230 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:24:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:25:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE:13 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:25:
CTAGTGAATG GGA 13

Claims

1. Eine Oligonukleotid-Sonde, die zur selektiven Hybridisierung mit Mycobacterien-Nukleinsäure befähigt ist, wobei diese Oligonukleotid-Sonde aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

(a) einer Oligonukleotid-Sonde, die aus der hierin als SEQ ID NO:1 (MK14) angegebenen DNA Sequenz besteht:

(b) Oligonukleotid-Sonden, die mit MK14 hybridisieren, eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden aufweisen und mindestens zu 60 % homolog zu MK14 Nucleinsäure sind; und

(c) Oligonukleotid-Sonden, die komplementär zu irgendeiner der vorhergehenden und imstande sind, selektiv mit Mycobakterien-Nucleinsäure zu hybridisieren.

2. Eine Oligonukleotid-Sonde nach Anspruch 1, die aus den hierin als SEQ ID NO:1 (MK14) angegebenen Sequenzen besteht:

3. Eine Oligonukleotid-Sonde nach Anspruch 1, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Sonden besteht, die aus den hierin als folgende angegebenen Sequenzen bestehen:

SEQ ID NO:12 (MK14-A)

SEQ ID NO:13 (MK14-B):

SEQ ID NO:14 (MK14-C):

SEQ ID NO:15 (MK14-D):

SEQ ID NO:16 (MK14-E):

SEQ ID NO:20 (MKL4-C1):

SEQ ID NO:21 (MK14-C2):

4. Eine Oligonukleotid-Sonde nach Anspruch 1, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

(a) einer Oligonukleotid-Sonde, die aus der hierin als SEQ ID NO: 22 (M. Kansasii Fragment BC) angegebenen DNA-Sequenz besteht:

einer Oligonukleotid-Sonde, die aus der hierin als SEQ ID NO: 23 (M. tuberculosis Fragment BC) angegebenen DNA- Sequenz besteht:

einer Oligonukleotid-Sonde, die aus der hierin als SEQ ID NO: 24 (M. avium Fragment BC) angegebenen DNA-Sequenz besteht:

(b) Oligonukleotid-Sonden, die mit obigen Sonden von (a) hybridisieren, eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden aufweisen und mindestens zu 60 % homolog zu MK14 Nucleinsäure sind ; und

5. Ein Verfahren zur Feststellung von Mycobakterien- Nukleinsäure in einer Nukleinsäure-Probe, welches Verfahren umfaßt:

(a) In-Kontakt-Bringen einer Oligonukleotid-Sonde mit einer Nukleinsäure-Probe unter Bedingungen, die die Hybridisierung der genannten Oligonukleotid-Sonde mit Mycobakterien- Nukleinsäure erlaubt, wobei die genannte Oligonukleotid- Sonde ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus:

(i) einer Oligonukleotid-Sonde, die aus der hierin als SEQ ID NO: 1 (MK14) angegebenen DNA-Sequenz besteht:

(ii) Oligonukleotid-Sonden, die mit MK14 hybridisieren, eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden aufweisen und mindestens zu 60 % homolog zu MK14 Nukleinsäure sind ; und

(iii) Oligonukleotid-Sonden, die komplementär zu irgendeiner der vorhergehenden und imstande sind, selektiv mit Mycobakterien-Nukleinsäure zu hybridisieren; und dann

(b) Festellen, ob die genannte Oligonukleotid-Sonde mit der genannten Nukleinsäure-Probe hybridisiert oder nicht, wobei die Hybridisierung der Oligonukleotid-Sonde mit der Nukleinsäure-Probe darauf hindeutet, daß die Nukleinsäure-Probe Mycobakterien-Nukleinsäure enthält.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 5, das weiters einen Schritt der Strangverschiebungsamplifizierung umfaßt, welcher vor dem genannten Feststellungsschritt erfolgt.

7. Ein Verfahren zur Amplifizierung einer ausgewählten Mycobakterien-Nukleinsäuresequenz in einer Nukleinsäure- Probe, welches Verfahren umfaßt:

(a) In-Kontakt-Bringen mindestens eines Paares von Oligonukleotid-Sonden mit der Nukleinsäure-Probe unter Bedingungen, die die Hybridisierung jeder der genannten Oligonukleotid-Sonden mit der ausgewählten Mycobakterien-Nukleinsäuresequenz gestatten, wobei das genannte Sondenpaar gemeinsam ein Amplifizierungspaar umfaßt und wobei jede der genannten Oligonukleotid-Sonden aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

(i) Oligonukleotid-Sonden, die Fragmente von SEQ ID NO:1 (MK14) umfassen, welche die Fähigkeit von MK14 zur selektiven Hybridisierung mit Mycobakterien-Nukleinsäure behalten:

(ii) Oligonukleotid-Sonden, die komplementär zu irgendeiner der vorhergehenden sind, eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden aufweisen und mindestens zu 60 % homolog zu MK14 Nukleinsäure sind; und

(b) Amplifizierung der genannten ausgewählten Mycobakterien- Zielsequenz durch zyklische Umsetzung des genannten mindestens einen Paares von Oligonukleotid-Sonden mit der genannten Nukleinsäure-Probe zur Herstellung eines Amplifizierungsproduktes.

8. Ein Verfahren nach Anspruch 7, in welchem der genannte Amplifizierungsschritt durch Strangverschiebungsamplifizierung erfolgt.

9. Ein Kit zur Feststellung von Mycobakterien-Nukleinsäure in einer Nukleinsäure-Probe, der eine Hybridisierungslösung gemeinsam mit einer Oligonukleotid-Sonde umfaßt, welch letztere aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

(ii) Oligonukleotid-Sonden, die mit MK14 hybridisieren, eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden aufweisen und mindestens zu 60 % homolog zu MK14 Nukleinsäure sind; und

(iii) Oligonukleotid-Sonden, die komplementär zu irgendeiner der vorhergehenden und imstande sind, selektiv mit Mycobakterien-Nukleinsäure zu hybridisieren.

10. Ein Kit nach Anspruch 9, wobei die genannte Oligonukleotid-Sonde aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Oligonukleotid-Sonden besteht, die aus den hierin als folgende angegebenen Sequenzen bestehen:

SEQ ID NO:12 (MK14-A)

SEQ ID NO:13 (MK14-B)

SEQ ID NO:14 (MK14-C)

SEQ ID NO:15 (MK14-D)

SEQ ID NO:16 (MK14-E)

SEQ ID NO:20 (MK14-C1)

SEQ ID NO:21 (MK14-C2)