JP2540023B2 - マイコバクテリアの検出および同定 - Google Patents
マイコバクテリアの検出および同定Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はマイコバクテリウムパラ
チュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ）の７０ｋＤ熱ショックタンパク質をコードする遺
伝子に由来するマイコバクテリア属および種に特異的な
オリゴヌクレオチドプローブを提供する。
チュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ）の７０ｋＤ熱ショックタンパク質をコードする遺
伝子に由来するマイコバクテリア属および種に特異的な
オリゴヌクレオチドプローブを提供する。
【０００２】
【従来の技術】マイコバクテリアは抗酸性、非運動性の
グラム陽性のかん菌であるバクテリアの属である。この
属は、マイコバクテリウムアフリカーヌム（Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マイコバク
テリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリ
ウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウムボ
ビス−ＢＣＧ（Ｍ．ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ）、マイコバク
テリウムチェロネ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバ
クテリウムフォーチュータム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕ
ｍ）、マイコバクテリウムゴードネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎ
ａｅ）、マイコバクテリウムイントラセルラレ（Ｍ．ｉ
ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウムカ
ンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム
ミクロチ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、マイコバクテリウム
スクロフラセム（ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、マイコ
バクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウムチュバキ
ュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含むがこ
れらに限定されない、いくつかの種からなる。これらの
微生物のあるものは病気の病原体となり得る。米国では
マイコバクテリアによる感染は１９５３年に始まりそれ
以来増加している。結核の病原体であるマイコバクテリ
ウムチュバキュロス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）
は特に関心を集めている。これらの新しい症例は、特に
マイコバクテリアの感染を受けやすい免疫不全の集団を
つくりだすＡＩＤＳ伝染病と関係している。免疫不全患
者の増加により、その他のマイコバクテリアの感染例も
増加している。マイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖ
ｉｕｍ）、マイコバクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓ
ａｓｉｉ）およびその他の非ーチュバキュロシスマイコ
バクテリアはＨＩＶ感染患者あるいはその他の免疫不全
患者において日和見感染の病原体として見いだされてい
る。
グラム陽性のかん菌であるバクテリアの属である。この
属は、マイコバクテリウムアフリカーヌム（Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マイコバク
テリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリ
ウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウムボ
ビス−ＢＣＧ（Ｍ．ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ）、マイコバク
テリウムチェロネ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバ
クテリウムフォーチュータム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕ
ｍ）、マイコバクテリウムゴードネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎ
ａｅ）、マイコバクテリウムイントラセルラレ（Ｍ．ｉ
ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウムカ
ンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム
ミクロチ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、マイコバクテリウム
スクロフラセム（ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、マイコ
バクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウムチュバキ
ュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含むがこ
れらに限定されない、いくつかの種からなる。これらの
微生物のあるものは病気の病原体となり得る。米国では
マイコバクテリアによる感染は１９５３年に始まりそれ
以来増加している。結核の病原体であるマイコバクテリ
ウムチュバキュロス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）
は特に関心を集めている。これらの新しい症例は、特に
マイコバクテリアの感染を受けやすい免疫不全の集団を
つくりだすＡＩＤＳ伝染病と関係している。免疫不全患
者の増加により、その他のマイコバクテリアの感染例も
増加している。マイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖ
ｉｕｍ）、マイコバクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓ
ａｓｉｉ）およびその他の非ーチュバキュロシスマイコ
バクテリアはＨＩＶ感染患者あるいはその他の免疫不全
患者において日和見感染の病原体として見いだされてい
る。
【０００３】現在マイコバクテリア感染の診断は、抗酸
性染色性、微生物の培養とそれに続く生化学的解析に依
存している。これらの操作は時間がかかり、通常の培養
法による典型的な診断は６週間を要し得る。ＢＡＣＴＥ
Ｃ（商標名）（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｐａｒｋ
ｓ，ＭＤ）などの自動培養システムは、診断にかかる時
間を１から２週間に縮めることができる。しかしながら
マイコバクテリア感染の診断にかかる時間は、１週間よ
りも短く、好ましくは約１日にする必要がある。サザン
ハイブリダイゼーションやドットブロットなどのオリゴ
ヌクレオチドプローブによる解析では迅速に結果を得る
ことが可能であるが（すなわち１日以下）、このような
方法では特定の微生物を同定するために、マイコバクテ
リア属に、あるいは特定のマイコバクテリアの種に特異
的なオリゴブクレオチドプローブが必要とされる。必要
とされる特異性を持つプローブは、７０Ｋ熱ショックタ
ンパク質をコードする遺伝子に対するものは、これまで
入手可能でなかった。
性染色性、微生物の培養とそれに続く生化学的解析に依
存している。これらの操作は時間がかかり、通常の培養
法による典型的な診断は６週間を要し得る。ＢＡＣＴＥ
Ｃ（商標名）（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｐａｒｋ
ｓ，ＭＤ）などの自動培養システムは、診断にかかる時
間を１から２週間に縮めることができる。しかしながら
マイコバクテリア感染の診断にかかる時間は、１週間よ
りも短く、好ましくは約１日にする必要がある。サザン
ハイブリダイゼーションやドットブロットなどのオリゴ
ヌクレオチドプローブによる解析では迅速に結果を得る
ことが可能であるが（すなわち１日以下）、このような
方法では特定の微生物を同定するために、マイコバクテ
リア属に、あるいは特定のマイコバクテリアの種に特異
的なオリゴブクレオチドプローブが必要とされる。必要
とされる特異性を持つプローブは、７０Ｋ熱ショックタ
ンパク質をコードする遺伝子に対するものは、これまで
入手可能でなかった。
【０００４】熱ショックタンパク質は生物が温度の上昇
にさらされたときに発現が増加する一群のタンパク質で
ある。熱ショックタンパク質遺伝子は高度に保存されて
いる（Ｒ．Ｊ．Ｇａｒｃｉａ，ｅｔ ａｌ．（１９８
９）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ
５７：２０４−２１２；Ｒ．Ｓ．Ｇｕｐｔａ，ｅｔ ａ
ｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７
４：４５９４−４６０５）。このように全ての生物の細
胞に高度に保存されている熱ショックタンパク質のある
ものは７０ｋＤの大きさを持ち、ｈｓｐ７０と呼ばれて
いる。７０ｋＤの熱ショックタンパク質はマイコバクテ
リウムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ）（Ｒ．Ｂ．Ｌａｔｈｉｇｒａ，ｅｔ ａｌ．（１９
８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１
６３６）、マイコバクテリウムレプレ（Ｍ．ｌｅｐｒａ
ｅ）（Ｋ．Ｒ．ＭｃＫｅｎｚｉｅ，ｅｔ ａｌ．（１９
９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３１２−３１９）
とマイコバクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａ
ｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｋ．Ｓｔｅｖｅｎｓ
ｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４５５２）において同定されて
いる。ステベンソン（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ）らはマイコ
バクテリウムレプレ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）の７０ｋＤ熱
ショックタンパク質のアミノ酸１３１−２６４番目およ
びマイコバクテリウムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅ
ｒｃｕｌｏｓｉｓ）の７０ｋＤ熱ショックタンパク質の
アミノ酸３−１３４番目と９０％の相同性を持つマイコ
バクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の７０ｋＤ熱ショックタンパク
質のアミノ酸１３３（アミノ酸４０７−５４０番目）の
ストレッチを報告している。
にさらされたときに発現が増加する一群のタンパク質で
ある。熱ショックタンパク質遺伝子は高度に保存されて
いる（Ｒ．Ｊ．Ｇａｒｃｉａ，ｅｔ ａｌ．（１９８
９）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ
５７：２０４−２１２；Ｒ．Ｓ．Ｇｕｐｔａ，ｅｔ ａ
ｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７
４：４５９４−４６０５）。このように全ての生物の細
胞に高度に保存されている熱ショックタンパク質のある
ものは７０ｋＤの大きさを持ち、ｈｓｐ７０と呼ばれて
いる。７０ｋＤの熱ショックタンパク質はマイコバクテ
リウムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ）（Ｒ．Ｂ．Ｌａｔｈｉｇｒａ，ｅｔ ａｌ．（１９
８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１
６３６）、マイコバクテリウムレプレ（Ｍ．ｌｅｐｒａ
ｅ）（Ｋ．Ｒ．ＭｃＫｅｎｚｉｅ，ｅｔ ａｌ．（１９
９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３１２−３１９）
とマイコバクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａ
ｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｋ．Ｓｔｅｖｅｎｓ
ｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４５５２）において同定されて
いる。ステベンソン（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ）らはマイコ
バクテリウムレプレ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）の７０ｋＤ熱
ショックタンパク質のアミノ酸１３１−２６４番目およ
びマイコバクテリウムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅ
ｒｃｕｌｏｓｉｓ）の７０ｋＤ熱ショックタンパク質の
アミノ酸３−１３４番目と９０％の相同性を持つマイコ
バクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の７０ｋＤ熱ショックタンパク
質のアミノ酸１３３（アミノ酸４０７−５４０番目）の
ストレッチを報告している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の一つの態様は
マイコバクテリア属に特異的であり、ロドコッカスロド
クロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏ
ｕｓ）およびノカルディアアステロイデス（Ｎ．ａｓｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ）などの近縁の微生物と全く交差反応を
しないオリゴヌクレオチドプローブを提供する。２つ目
の態様ではマイコバクテリア、ロドコッカスロドクロス
（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）
あるいはノカルディアアステロイデス（Ｎ．ａｓｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ）の選択された種に特異的なオリゴヌクレオ
チドプローブを提供する。これらのプローブは培養後の
確認の為に使用し得る。あるいはこれらのプローブは検
出及び同定の方法における培養の工程の前に、バクテリ
アのＤＮＡを増幅して使用し得る。どちらの場合も本発
明のプローブおよび診断法はマイコバクテリア陽性およ
び陰性試料を迅速に識別する方法を提供し、実験者の、
マイコバクテリア陽性および陰性試料の迅速な同定を可
能とし、そのため陰性試料を培養する時間のかかる仕事
を避ける事ができる。種特異的なプローブはマイコバク
テリア感染における特定の病原体を迅速に同定する事を
可能とし、適当な治療法を短時間に決定するのに用いら
れ得る情報を提供する。
マイコバクテリア属に特異的であり、ロドコッカスロド
クロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏ
ｕｓ）およびノカルディアアステロイデス（Ｎ．ａｓｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ）などの近縁の微生物と全く交差反応を
しないオリゴヌクレオチドプローブを提供する。２つ目
の態様ではマイコバクテリア、ロドコッカスロドクロス
（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）
あるいはノカルディアアステロイデス（Ｎ．ａｓｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ）の選択された種に特異的なオリゴヌクレオ
チドプローブを提供する。これらのプローブは培養後の
確認の為に使用し得る。あるいはこれらのプローブは検
出及び同定の方法における培養の工程の前に、バクテリ
アのＤＮＡを増幅して使用し得る。どちらの場合も本発
明のプローブおよび診断法はマイコバクテリア陽性およ
び陰性試料を迅速に識別する方法を提供し、実験者の、
マイコバクテリア陽性および陰性試料の迅速な同定を可
能とし、そのため陰性試料を培養する時間のかかる仕事
を避ける事ができる。種特異的なプローブはマイコバク
テリア感染における特定の病原体を迅速に同定する事を
可能とし、適当な治療法を短時間に決定するのに用いら
れ得る情報を提供する。
【０００６】
【課題を解決するために手段】本発明はマイコバクテリ
ウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓ）の７０ｋＤ熱ショックタンパク質をコー
ドする遺伝子に由来するマイコバクテリア属および種に
特異的なオリゴヌクレオチドプローブを提供する。ｈｓ
ｐ７０遺伝子の３４９塩基の部分を１１種のマイコバク
テリアにおいて特定のプライマーを用いたポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）によって同定した。増幅した産物を
クローン化して配列を決定し、比較した。ロドコッカス
ロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈ
ｒｏｕｓ）およびノカルディアアステロイデス（Ｎ．ａ
ｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）と交差反応しないプローブを得る
ために、ロドコッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）およびノカルディアア
ステロイデス（Ｎ．ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）の同様な配
列の情報を得て比較した。マイコバクテリウムパラチュ
バキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ）のｈｓｐ７０遺伝子の上流の配列に相当する２０４
塩基の配列をマイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉ
ｕｍ）、マイコバクテリウムゴードネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏ
ｎａｅ）、マイコバクテリウムパラチュバキュロシス
（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）において同
定し、これも属−特異的プローブをデザインするのに用
いた。
ウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓ）の７０ｋＤ熱ショックタンパク質をコー
ドする遺伝子に由来するマイコバクテリア属および種に
特異的なオリゴヌクレオチドプローブを提供する。ｈｓ
ｐ７０遺伝子の３４９塩基の部分を１１種のマイコバク
テリアにおいて特定のプライマーを用いたポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）によって同定した。増幅した産物を
クローン化して配列を決定し、比較した。ロドコッカス
ロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈ
ｒｏｕｓ）およびノカルディアアステロイデス（Ｎ．ａ
ｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）と交差反応しないプローブを得る
ために、ロドコッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）およびノカルディアア
ステロイデス（Ｎ．ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）の同様な配
列の情報を得て比較した。マイコバクテリウムパラチュ
バキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ）のｈｓｐ７０遺伝子の上流の配列に相当する２０４
塩基の配列をマイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉ
ｕｍ）、マイコバクテリウムゴードネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏ
ｎａｅ）、マイコバクテリウムパラチュバキュロシス
（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）において同
定し、これも属−特異的プローブをデザインするのに用
いた。
【０００７】本発明のオリゴヌクレオチドプローブはマ
イコバクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のｈｓｐ７０遺伝子の３４
９塩基および２０４塩基の断片に由来するものであり、
核酸のハイブリダイゼーションによる迅速なマイコバク
テリアの検出に有用である。これらのプローブは直接マ
イコバクテリアＤＮＡとハイブリダイズして検出をする
か、あるいは核酸の増幅反応のプライマーとして用いて
マイコバクテリアに特異的な増幅産物を得て、これを検
出し得る。これらのプローブは、適用される解析方法に
応じて適当などの様な長さでもあり得る。一般的にはこ
れらは少なくとも、１０−１５ヌクレオチドの長さを持
つ。これらはマイコバクテリアの検出では１５−２０ヌ
クレオチドの長さを持つのが好ましい。マイコバクテリ
アに特異的なＤＮＡの増幅における核酸増幅反応のプラ
イマーとして用いるには、これらは５０−１５０ヌクレ
オチドの長さを持つのが好ましい。これらのプローブは
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、あるいはリボ核酸（ＲＮ
Ａ）のどちらでもあり得、また自然界に存在する糖−燐
酸バックボーン、あるいは当業者には明らかなように、
チオ燐酸、ジチオ燐酸、アルキル燐酸やα−ヌクレオチ
ドを含む修飾されたバックボーンを持ち得る。これらの
プローブはオリゴヌクレオチドの化学合成、クローン化
と宿主細胞における増幅、あるいはその他の当業者に明
らかな方法によって得る事ができる。
イコバクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のｈｓｐ７０遺伝子の３４
９塩基および２０４塩基の断片に由来するものであり、
核酸のハイブリダイゼーションによる迅速なマイコバク
テリアの検出に有用である。これらのプローブは直接マ
イコバクテリアＤＮＡとハイブリダイズして検出をする
か、あるいは核酸の増幅反応のプライマーとして用いて
マイコバクテリアに特異的な増幅産物を得て、これを検
出し得る。これらのプローブは、適用される解析方法に
応じて適当などの様な長さでもあり得る。一般的にはこ
れらは少なくとも、１０−１５ヌクレオチドの長さを持
つ。これらはマイコバクテリアの検出では１５−２０ヌ
クレオチドの長さを持つのが好ましい。マイコバクテリ
アに特異的なＤＮＡの増幅における核酸増幅反応のプラ
イマーとして用いるには、これらは５０−１５０ヌクレ
オチドの長さを持つのが好ましい。これらのプローブは
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、あるいはリボ核酸（ＲＮ
Ａ）のどちらでもあり得、また自然界に存在する糖−燐
酸バックボーン、あるいは当業者には明らかなように、
チオ燐酸、ジチオ燐酸、アルキル燐酸やα−ヌクレオチ
ドを含む修飾されたバックボーンを持ち得る。これらの
プローブはオリゴヌクレオチドの化学合成、クローン化
と宿主細胞における増幅、あるいはその他の当業者に明
らかな方法によって得る事ができる。
【０００８】本発明によるプローブは、マイコバクテリ
アを含むと疑われる、核酸を含む試料とハイブリダイズ
される。試料は分離された核酸からなるものあるいは臨
床的試料であり得る。臨床的試料は典型的に、生体液あ
るいは組織の形状のものであり、例えば唾液、気管支の
洗浄液、胃の洗浄液、血液、乳、リンパ、皮膚あるいは
軟組織である。マイコバクテリアはヒトおよびヒト以外
の動物に感染するため、本発明はヒトおよび獣医学的診
断の両方に適用でき、試料はどちらの材料からも得る事
ができる。例えばマイコバクテリウムパラチュバキュロ
シス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は畜牛
のジョーンズ病（Ｊｏｈｎｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）の
病原体であり、そしてヒトのクローン病の病原体だと推
測されている。マイコバクテリウムボビス（Ｍ．ｂｏｖ
ｉｓ）は畜牛の結核を引き起こし、ヒトにも伝染しう
る。従って本発明のプローブおよび方法は畜牛の感染の
診断および牛乳における、ヒトに感染しうるマイコバク
テリウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）の含有検査に使用し
うる。同様にマイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉ
ｕｍ）およびマイコバクテリウムイントラセルラレ
（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）は各々鳥、およ
びブタに感染し、本発明の即席のプローブおよび方法は
このような感染を検出する事ができる。さらに、ヒトは
マイコバクテリウムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓ），マイコバクテリウムカンサシイ
（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウムアビウ
ム（Ｍ．ａｖｉｕｍ），マイコバクテリウムイントラセ
ルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ），マイコ
バクテリウムスクロフラスム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃ
ｅｕｍ）およびマイコバクテリウムフォーチュタム
（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）を含む多様なマイコバクテ
リアの感染を受け易く、適当な治療法の決定の助けとし
て、本発明の即席のプローブおよび方法を用いて特定の
種を同定し得る。
アを含むと疑われる、核酸を含む試料とハイブリダイズ
される。試料は分離された核酸からなるものあるいは臨
床的試料であり得る。臨床的試料は典型的に、生体液あ
るいは組織の形状のものであり、例えば唾液、気管支の
洗浄液、胃の洗浄液、血液、乳、リンパ、皮膚あるいは
軟組織である。マイコバクテリアはヒトおよびヒト以外
の動物に感染するため、本発明はヒトおよび獣医学的診
断の両方に適用でき、試料はどちらの材料からも得る事
ができる。例えばマイコバクテリウムパラチュバキュロ
シス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は畜牛
のジョーンズ病（Ｊｏｈｎｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）の
病原体であり、そしてヒトのクローン病の病原体だと推
測されている。マイコバクテリウムボビス（Ｍ．ｂｏｖ
ｉｓ）は畜牛の結核を引き起こし、ヒトにも伝染しう
る。従って本発明のプローブおよび方法は畜牛の感染の
診断および牛乳における、ヒトに感染しうるマイコバク
テリウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）の含有検査に使用し
うる。同様にマイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉ
ｕｍ）およびマイコバクテリウムイントラセルラレ
（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）は各々鳥、およ
びブタに感染し、本発明の即席のプローブおよび方法は
このような感染を検出する事ができる。さらに、ヒトは
マイコバクテリウムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓ），マイコバクテリウムカンサシイ
（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウムアビウ
ム（Ｍ．ａｖｉｕｍ），マイコバクテリウムイントラセ
ルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ），マイコ
バクテリウムスクロフラスム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃ
ｅｕｍ）およびマイコバクテリウムフォーチュタム
（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）を含む多様なマイコバクテ
リアの感染を受け易く、適当な治療法の決定の助けとし
て、本発明の即席のプローブおよび方法を用いて特定の
種を同定し得る。
【０００９】オリゴヌクレオチドプローブはマイコバク
テリアの核酸とのハイブリダイゼーションによってマイ
コバクテリアを検出および／あるいは同定するのに使用
される。一つの態様では、本プローブはマイコバクテリ
アの核酸の直接的な検出の為のハイブリダイゼーション
法に用いられる。これらの方法はＤＮＡの検出のための
サザンブロット、ＲＮＡの検出のためのノーザンブロッ
トおよびＤＮＡあるいはＲＮＡの検出の為のドットブロ
ットを含む。これらの方法は当業者にはよく知られてお
り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載され
ている。２つ目の態様では、試料に含まれるマイコバク
テリアの存在が、標的となる配列の属−あるいは種−特
異的な増幅によって検出および／あるいは同定される。
この態様では本発明のプローブは、通常の核酸の増幅方
法におけるプライマーとして用いられる。標的の核酸に
対するプライマーのハイブリダイゼーションに依存す
る、どの様な増幅方法も用いることができ、これらは例
えばＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号；４，６
８３，２０２号；４，８００，１５９号；４，９６５，
１８８号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｒ．Ｗｅｉ
ｓｓ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１２９
２）、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍ
ｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）
（Ｇ．Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＮＡ
Ｓ ８９：３９２−３９６；Ｇ．Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ
ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．２０：１６９１−１６９６）核酸依存性配列増幅
（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂａｓｅｄ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）
（米国特許第５，１３０，２３８号、Ｃａｎｇｅｎ
ｅ）、転写増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂａｓ
ｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｄ．Ｋｗｏｈ，ｅ
ｔ ａｌ．（１９８９）ＰＮＡＳ ８６：１１７３−１
１７７），自己継続配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉ
ｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）
（Ｊ．Ｇｕａｔｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐ
ＮＡＳ ８７：１８７４−１８７８）あるいはＱβレプ
リカーゼシステム（Ｐ．Ｌｉｚａｒｄｉ，ｅｔ ａｌ．
（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９
７−１２０２）である。ＳＤＡを適用する場合、オリゴ
ヌクレオチドプローブは好ましくはＧＣ含量が低いも
の、好ましくはプローブの全ヌクレオチドの７０％より
低いものが選択される。同様に、ＳＤＡの場合標的の配
列も、２次構造を最少限にするために低いＧＣ含量を持
つことが好ましい。
テリアの核酸とのハイブリダイゼーションによってマイ
コバクテリアを検出および／あるいは同定するのに使用
される。一つの態様では、本プローブはマイコバクテリ
アの核酸の直接的な検出の為のハイブリダイゼーション
法に用いられる。これらの方法はＤＮＡの検出のための
サザンブロット、ＲＮＡの検出のためのノーザンブロッ
トおよびＤＮＡあるいはＲＮＡの検出の為のドットブロ
ットを含む。これらの方法は当業者にはよく知られてお
り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載され
ている。２つ目の態様では、試料に含まれるマイコバク
テリアの存在が、標的となる配列の属−あるいは種−特
異的な増幅によって検出および／あるいは同定される。
この態様では本発明のプローブは、通常の核酸の増幅方
法におけるプライマーとして用いられる。標的の核酸に
対するプライマーのハイブリダイゼーションに依存す
る、どの様な増幅方法も用いることができ、これらは例
えばＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号；４，６
８３，２０２号；４，８００，１５９号；４，９６５，
１８８号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｒ．Ｗｅｉ
ｓｓ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１２９
２）、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍ
ｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）
（Ｇ．Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＮＡ
Ｓ ８９：３９２−３９６；Ｇ．Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ
ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．２０：１６９１−１６９６）核酸依存性配列増幅
（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂａｓｅｄ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）
（米国特許第５，１３０，２３８号、Ｃａｎｇｅｎ
ｅ）、転写増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂａｓ
ｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｄ．Ｋｗｏｈ，ｅ
ｔ ａｌ．（１９８９）ＰＮＡＳ ８６：１１７３−１
１７７），自己継続配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉ
ｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）
（Ｊ．Ｇｕａｔｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐ
ＮＡＳ ８７：１８７４−１８７８）あるいはＱβレプ
リカーゼシステム（Ｐ．Ｌｉｚａｒｄｉ，ｅｔ ａｌ．
（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９
７−１２０２）である。ＳＤＡを適用する場合、オリゴ
ヌクレオチドプローブは好ましくはＧＣ含量が低いも
の、好ましくはプローブの全ヌクレオチドの７０％より
低いものが選択される。同様に、ＳＤＡの場合標的の配
列も、２次構造を最少限にするために低いＧＣ含量を持
つことが好ましい。
【００１０】核酸はハイブリダイズするために完全な相
補性を持つ必要はないため、ここに開示するプローブの
配列は、マイコバクテリア属−および種−特異的プロー
ブとしての有用性を失うことなく、ある範囲で変える事
が可能であることが理解されるべきである。当該分野で
明らかなように、相補的及び部分的に相補的な核酸のハ
イブリダイゼーションは、ストリンジェンシーを増加あ
るいは減少させてハイブリダイゼーションの条件を調整
する事で可能である（すなわちハイブリダイゼーション
温度あるいはバッファーの塩濃度の調整）。一般的に、
開示された配列に最低６５％相同性を持つ配列は、特異
性を顕著に失う事なくマイコバクテリアの属−および／
あるいは種−特異的プローブとしてハイブリダイゼーシ
ョンに用いる事ができる。
補性を持つ必要はないため、ここに開示するプローブの
配列は、マイコバクテリア属−および種−特異的プロー
ブとしての有用性を失うことなく、ある範囲で変える事
が可能であることが理解されるべきである。当該分野で
明らかなように、相補的及び部分的に相補的な核酸のハ
イブリダイゼーションは、ストリンジェンシーを増加あ
るいは減少させてハイブリダイゼーションの条件を調整
する事で可能である（すなわちハイブリダイゼーション
温度あるいはバッファーの塩濃度の調整）。一般的に、
開示された配列に最低６５％相同性を持つ配列は、特異
性を顕著に失う事なくマイコバクテリアの属−および／
あるいは種−特異的プローブとしてハイブリダイゼーシ
ョンに用いる事ができる。
【００１１】本発明のプライマーによって増幅した核酸
産物は、例えばエチジウムブロマイド染色されたポリア
クリルアミドあるいはアガロースゲル上での特徴的な大
きさによって検出し得る。あるいは、試料中のマイコバ
クテリアの核酸や特異的に増幅したマイコバクテリアＤ
ＮＡは本発明のプローブとハイブリダイゼーションさせ
る事で検出し得る。ハイブリダイゼーションによる検出
では、オリゴヌクレオチドプローブは典型的に検出可能
な標識物によって目印がつけられる。検出可能な標識
は、プローブと標的の核酸とのハイブリダイゼーション
を示すものとして直接的あるいは間接的に検出できる部
分である。標識の直接的な検出では、プローブを放射同
位元素で目印をつけオートラジオグラフィで検出あるい
は蛍光物質で目印をつけて当該分野で明らかな方法で検
出しうる。あるいは、プローブは検出可能とするために
さらに試薬の添加が必要な標識によって目印をつける事
で間接的に検出しうる。間接的な標識は例えば化学発光
試薬、観察可能な反応産物を生成する酵素および標識さ
れた結合物質との特異的な結合によって検出可能なリガ
ンド（ハプテン、抗体あるいは抗原）を含む。特に有用
な標識はビオチン（標識されたアビジンあるいはストレ
プトアビジンとの結合により検出可能）と西洋ワサビペ
ルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素
（色のついた反応産物を生成する酵素基質を加える事に
より検出可能）を含む。オリゴヌクレオチドにこの様な
標識を加えるあるいは取り込ませる方法は当業者にはよ
く知られており、これらのどの方法も本発明の方法に適
している。増幅反応では、標識したプローブは増幅産物
に取り込まれるため、プライマーとして用いる事が可能
であり、あるいは増幅産物とハイブリダイズする事が予
想され、プライマーとは異なる最低１つの標識プローブ
が用いられえる。
産物は、例えばエチジウムブロマイド染色されたポリア
クリルアミドあるいはアガロースゲル上での特徴的な大
きさによって検出し得る。あるいは、試料中のマイコバ
クテリアの核酸や特異的に増幅したマイコバクテリアＤ
ＮＡは本発明のプローブとハイブリダイゼーションさせ
る事で検出し得る。ハイブリダイゼーションによる検出
では、オリゴヌクレオチドプローブは典型的に検出可能
な標識物によって目印がつけられる。検出可能な標識
は、プローブと標的の核酸とのハイブリダイゼーション
を示すものとして直接的あるいは間接的に検出できる部
分である。標識の直接的な検出では、プローブを放射同
位元素で目印をつけオートラジオグラフィで検出あるい
は蛍光物質で目印をつけて当該分野で明らかな方法で検
出しうる。あるいは、プローブは検出可能とするために
さらに試薬の添加が必要な標識によって目印をつける事
で間接的に検出しうる。間接的な標識は例えば化学発光
試薬、観察可能な反応産物を生成する酵素および標識さ
れた結合物質との特異的な結合によって検出可能なリガ
ンド（ハプテン、抗体あるいは抗原）を含む。特に有用
な標識はビオチン（標識されたアビジンあるいはストレ
プトアビジンとの結合により検出可能）と西洋ワサビペ
ルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素
（色のついた反応産物を生成する酵素基質を加える事に
より検出可能）を含む。オリゴヌクレオチドにこの様な
標識を加えるあるいは取り込ませる方法は当業者にはよ
く知られており、これらのどの方法も本発明の方法に適
している。増幅反応では、標識したプローブは増幅産物
に取り込まれるため、プライマーとして用いる事が可能
であり、あるいは増幅産物とハイブリダイズする事が予
想され、プライマーとは異なる最低１つの標識プローブ
が用いられえる。
【００１２】マイコバクテリアの属−あるいは種−特異
的検出のためのプローブは、便利さのために検出方法に
必要な他の試薬や構成物を含むキットとしてパッケージ
され得る。例として、この様なキットは最低１つの本発
明によるプローブ、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ塩化ナトリウ
ム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）など
のハイブリダイゼーション溶液、０．１Ｍ ＥＤＴＡ
ｐＨ８．０，５× Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液（０．１
％ｗ／ｖＦＩＣＯＬＬ ＴＹＰＥ４００，０．１％ｗ／
ｖポリビニルピロリドン，０．１％ｗ／ｖウシ血清アル
ブミン）および１００μｇ／ｍｌせん断変性サケ精子Ｄ
ＮＡ（ｓｈｅａｒｅｄ ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｓａｌｍ
ｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ）を含む。このハイブリダイ
ゼーションバッファーはベセスダリサーチラボラトリー
ズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）が
市販している。前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌも参照せ
よ。このキットの構成物は通常の容器に一緒にパッケー
ジされ、典型的には本発明の特定の態様を行うための指
示書を含む。このキットは、さらにオプションとして例
えば１番目のプローブとあわせて標的核酸を増幅するの
に適した２番目のプローブ（あるいはＬＣＲのための２
組のプローブ）、１つあるいはそれ以上の標識された検
出用プローブおよび標識の検出のための試薬あるいは道
具などを含み得る。
的検出のためのプローブは、便利さのために検出方法に
必要な他の試薬や構成物を含むキットとしてパッケージ
され得る。例として、この様なキットは最低１つの本発
明によるプローブ、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ塩化ナトリウ
ム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）など
のハイブリダイゼーション溶液、０．１Ｍ ＥＤＴＡ
ｐＨ８．０，５× Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液（０．１
％ｗ／ｖＦＩＣＯＬＬ ＴＹＰＥ４００，０．１％ｗ／
ｖポリビニルピロリドン，０．１％ｗ／ｖウシ血清アル
ブミン）および１００μｇ／ｍｌせん断変性サケ精子Ｄ
ＮＡ（ｓｈｅａｒｅｄ ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｓａｌｍ
ｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ）を含む。このハイブリダイ
ゼーションバッファーはベセスダリサーチラボラトリー
ズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）が
市販している。前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌも参照せ
よ。このキットの構成物は通常の容器に一緒にパッケー
ジされ、典型的には本発明の特定の態様を行うための指
示書を含む。このキットは、さらにオプションとして例
えば１番目のプローブとあわせて標的核酸を増幅するの
に適した２番目のプローブ（あるいはＬＣＲのための２
組のプローブ）、１つあるいはそれ以上の標識された検
出用プローブおよび標識の検出のための試薬あるいは道
具などを含み得る。
【００１３】以下の実施例は本発明の特定の態様を表す
為のものである。これらは付記された請求項によって定
義される本発明を、どの様な意味においても限定するも
のではない。
為のものである。これらは付記された請求項によって定
義される本発明を、どの様な意味においても限定するも
のではない。
【００１４】
【実施例】菌株およびＤＮＡの調製 使用したマイコバクテリアの株は以下の通りである：マ
イコバクテリウムアフリカーヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎ
ｕｍ）ＬＣＤＣ５０１、マイコバクテリウムアビウム
（Ｍ．ａｖｉｕｍ）ＡＴＣＣ２５２９１、マイコバクテ
リウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＣＤＣ４、マイコバク
テリウムボビス−ＢＣＧ（Ｍ．ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ）Ｃ
ＤＣ３４、マイコバクテリウムチェロネ（Ｍ．ｃｈｅｌ
ｏｎａｅ）ＴＭＣ１５４３、マイコバクテリウムフォー
チュタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）ＴＭＣ１５２９、
マイコバクテリウムゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）
ＴＭＣ１３１８、マイコバクテリウムイントラセルラレ
（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）ＡＴＣＣ１３９
５０、マイコバクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓ
ｉｉ）ＴＭＣ１２０１、マイコバクテリウムミクロチ
（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）ＬＣＤＣ２０３、マイコバクテ
リウムスクロフラスム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕ
ｍ）ＣＤＣ７８、マイコバクテリウムチュバキュロシス
（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＡＴＣＣ２７２９
４。使用した非−マイコバクテリア微生物は以下の通り
である：ボルデテラパーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ＡＴＣＣ８４６７、カンジダア
ルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）ＡＴ
ＣＣ４４８０８、コリネバクテリウムジフテリア（Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ
ｅ）ＡＴＣＣ１１９１３、大腸菌ＡＴＣＣ１１７７５、
フラボバクテリウムメニンジセプチカム（Ｆｌａｖｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｊｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）
ＡＴＣＣ１３２５３、ノカルジアアステロイデス（Ｎｏ
ｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ３３０
８、ロドコッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ１３８０８、スト
レプトコッカスニューモニアエＡＴＣＣ６３０３、アシ
ネトバクタールボフィ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ｌｗｏｆｆｉ）ＡＴＣＣ１９００１、エンテロバクター
エアロゲンス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇ
ｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ１３０４８、エンテロバクタークロ
アカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）
ＡＴＣＣ１３０４７、ヘモフィリスインフルエンザＢ型
ＡＴＣＣ３３５３３、クレブシラニューモニアＡＴＣＣ
１３８８３、リステリアモノシトゲンス（Ｌｉｓｔｅｒ
ｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ７６４
４、モラクセラオスロエンシス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｏ
ｓｌｏｅｎｓｉｓ）ＡＴＣＣ９２８１、モルガネラモル
ガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）Ａ
ＴＣＣ２５８３０、ナイセリアラクタミカ（Ｎｅｉｓｓ
ｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）ＡＴＣＣ２３９７０、
ナイセリアメニンジチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅ
ｎｉｎｊｉｔｉｄｉｓ）ＡＴＣＣ１３０７７、エルスコ
ビアツルバタ（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ ｔｕｒｂａｔａ）
ＡＴＣＣ３３２２５、プロテウスブルガリスＡＴＣＣ１
３３１５、シュードモナスエアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＡＴＣＣ２７８５
３、セラチアマルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒ
ｃｅｓｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ８１００、シゲラジセンテリ
エ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）ＡＴ
ＣＣ１３３１３、黄色ブドウ状球菌ＡＴＣＣ２５９２
３、スタフィロコッカスエピダーミジス（Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＡＴＣＣ
Ｅ１５５、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ１９６
１５、アデノウイルス シグマＤ３３９０、ＭｃＣｏｙ
ｃｅｌｌｓの真核生物ＤＮＡ。マイコバクテリアの菌
株はＢＡＣＴＥＣの容器中でＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ
７Ｈ９倍地で培養し、７０゜Ｃで４時間加熱殺菌した。
ゲノムＤＮＡはＳ．Ｖｉｓｕｖａｎａｔｈａｎらによっ
て記載された方法で単離した（（１９８９）Ｊ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｍｔｄｓ．１０：５９−６４）。非−マ
イコバクテリア株はルリア培地あるいはその他の適当な
培地、例えば連鎖球菌はＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ培地
で、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）およびヘモフィ
ルスはチョコレートＩＩ寒天プレートで、ロドコッカス
を放線菌培地で培養した。ゲノムＤＮＡはＦ．Ｍ．Ａｕ
ｓｕｂｅｌらのＣＴＡＢミニプレップ法により単離した
（（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅ
ｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａ
ｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ
Ｙ）。
イコバクテリウムアフリカーヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎ
ｕｍ）ＬＣＤＣ５０１、マイコバクテリウムアビウム
（Ｍ．ａｖｉｕｍ）ＡＴＣＣ２５２９１、マイコバクテ
リウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＣＤＣ４、マイコバク
テリウムボビス−ＢＣＧ（Ｍ．ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ）Ｃ
ＤＣ３４、マイコバクテリウムチェロネ（Ｍ．ｃｈｅｌ
ｏｎａｅ）ＴＭＣ１５４３、マイコバクテリウムフォー
チュタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）ＴＭＣ１５２９、
マイコバクテリウムゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）
ＴＭＣ１３１８、マイコバクテリウムイントラセルラレ
（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）ＡＴＣＣ１３９
５０、マイコバクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓ
ｉｉ）ＴＭＣ１２０１、マイコバクテリウムミクロチ
（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）ＬＣＤＣ２０３、マイコバクテ
リウムスクロフラスム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕ
ｍ）ＣＤＣ７８、マイコバクテリウムチュバキュロシス
（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＡＴＣＣ２７２９
４。使用した非−マイコバクテリア微生物は以下の通り
である：ボルデテラパーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ＡＴＣＣ８４６７、カンジダア
ルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）ＡＴ
ＣＣ４４８０８、コリネバクテリウムジフテリア（Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ
ｅ）ＡＴＣＣ１１９１３、大腸菌ＡＴＣＣ１１７７５、
フラボバクテリウムメニンジセプチカム（Ｆｌａｖｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｊｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）
ＡＴＣＣ１３２５３、ノカルジアアステロイデス（Ｎｏ
ｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ３３０
８、ロドコッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ１３８０８、スト
レプトコッカスニューモニアエＡＴＣＣ６３０３、アシ
ネトバクタールボフィ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ｌｗｏｆｆｉ）ＡＴＣＣ１９００１、エンテロバクター
エアロゲンス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇ
ｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ１３０４８、エンテロバクタークロ
アカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）
ＡＴＣＣ１３０４７、ヘモフィリスインフルエンザＢ型
ＡＴＣＣ３３５３３、クレブシラニューモニアＡＴＣＣ
１３８８３、リステリアモノシトゲンス（Ｌｉｓｔｅｒ
ｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ７６４
４、モラクセラオスロエンシス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｏ
ｓｌｏｅｎｓｉｓ）ＡＴＣＣ９２８１、モルガネラモル
ガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）Ａ
ＴＣＣ２５８３０、ナイセリアラクタミカ（Ｎｅｉｓｓ
ｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）ＡＴＣＣ２３９７０、
ナイセリアメニンジチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅ
ｎｉｎｊｉｔｉｄｉｓ）ＡＴＣＣ１３０７７、エルスコ
ビアツルバタ（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ ｔｕｒｂａｔａ）
ＡＴＣＣ３３２２５、プロテウスブルガリスＡＴＣＣ１
３３１５、シュードモナスエアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＡＴＣＣ２７８５
３、セラチアマルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒ
ｃｅｓｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ８１００、シゲラジセンテリ
エ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）ＡＴ
ＣＣ１３３１３、黄色ブドウ状球菌ＡＴＣＣ２５９２
３、スタフィロコッカスエピダーミジス（Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＡＴＣＣ
Ｅ１５５、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ１９６
１５、アデノウイルス シグマＤ３３９０、ＭｃＣｏｙ
ｃｅｌｌｓの真核生物ＤＮＡ。マイコバクテリアの菌
株はＢＡＣＴＥＣの容器中でＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ
７Ｈ９倍地で培養し、７０゜Ｃで４時間加熱殺菌した。
ゲノムＤＮＡはＳ．Ｖｉｓｕｖａｎａｔｈａｎらによっ
て記載された方法で単離した（（１９８９）Ｊ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｍｔｄｓ．１０：５９−６４）。非−マ
イコバクテリア株はルリア培地あるいはその他の適当な
培地、例えば連鎖球菌はＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ培地
で、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）およびヘモフィ
ルスはチョコレートＩＩ寒天プレートで、ロドコッカス
を放線菌培地で培養した。ゲノムＤＮＡはＦ．Ｍ．Ａｕ
ｓｕｂｅｌらのＣＴＡＢミニプレップ法により単離した
（（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅ
ｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａ
ｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ
Ｙ）。
【００１５】核酸の増幅およびクローニング スティーブンス（Ｓｔｅｖｅｎｓ）らはマイコバクテリ
ウムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ）、マイコバクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．
ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびマイコバク
テリウムレプレ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）の間で相同なマイ
コバクテリウムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ）の７０ｋＤ熱ショックタンパク質中のアミ
ノ酸１３３残基を報告している。このアミノ酸ストレッ
チは遺伝子配列のヌクレオチド１４１５−１８１４番目
にコードされている。ＧＥＮＢＡＮＫ６９をこのヌクレ
オチド１４１５−１８１４に関して検索したところ、相
当するマイコバクテリウムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のヌクレオチド配列と８７％の
相同性を示した。その他の多様な原核生物、真核生物の
７０ｋＤ熱ショックタンパク質との有意な相同性も見い
だされた。しかしながら比較のためのマイコバクテリウ
ムレプレ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）の配列はＧＥＮＢＡＮＫ
６９では得られなかった。マイコバクテイウムパラチュ
バキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ）とマイコバクテリウムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に関して得られた配置を用い
て、ＰＣＲ増幅における使用のために２つのプライマー
を選択した。プライマーＰＡＳ７７（５’−ＣＣＧＴＣ
ＧＧＴＧＣＡＧＡＴＣＣＡＧＧＴ−３’；配列番号１
４）はマイコバクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．
ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のヌクレオチド配
列１４１５−１４３４番目のセンス鎖に由来する。プラ
イマーＰＡＳ７８（５’−ＧＡＡＣＴＴＣＴＣＣＧＴＣ
ＴＧＧＴＡＧＡ−３’；配列番号１５）はマイコバクテ
リウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓ）のヌクレオチド配列１７６３−１７４
４番目のアンチセンス鎖に由来する。これらのプライマ
ーはいくつかのマイコバクテリアおよび非−マイコバク
テリアのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅反応に用いた。
ＰＣＲプライマーはアプライドバイオシステムズ３８０
Ｂシンセサイザーで業者の推奨する方法に従って合成
し、５０゜Ｃで脱保護化してオリゴヌクレオチド精製カ
ートリッジ（アプライドシステムズ）を用いて精製し
た。
ウムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ）、マイコバクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．
ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびマイコバク
テリウムレプレ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）の間で相同なマイ
コバクテリウムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ）の７０ｋＤ熱ショックタンパク質中のアミ
ノ酸１３３残基を報告している。このアミノ酸ストレッ
チは遺伝子配列のヌクレオチド１４１５−１８１４番目
にコードされている。ＧＥＮＢＡＮＫ６９をこのヌクレ
オチド１４１５−１８１４に関して検索したところ、相
当するマイコバクテリウムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のヌクレオチド配列と８７％の
相同性を示した。その他の多様な原核生物、真核生物の
７０ｋＤ熱ショックタンパク質との有意な相同性も見い
だされた。しかしながら比較のためのマイコバクテリウ
ムレプレ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）の配列はＧＥＮＢＡＮＫ
６９では得られなかった。マイコバクテイウムパラチュ
バキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ）とマイコバクテリウムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に関して得られた配置を用い
て、ＰＣＲ増幅における使用のために２つのプライマー
を選択した。プライマーＰＡＳ７７（５’−ＣＣＧＴＣ
ＧＧＴＧＣＡＧＡＴＣＣＡＧＧＴ−３’；配列番号１
４）はマイコバクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．
ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のヌクレオチド配
列１４１５−１４３４番目のセンス鎖に由来する。プラ
イマーＰＡＳ７８（５’−ＧＡＡＣＴＴＣＴＣＣＧＴＣ
ＴＧＧＴＡＧＡ−３’；配列番号１５）はマイコバクテ
リウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓ）のヌクレオチド配列１７６３−１７４
４番目のアンチセンス鎖に由来する。これらのプライマ
ーはいくつかのマイコバクテリアおよび非−マイコバク
テリアのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅反応に用いた。
ＰＣＲプライマーはアプライドバイオシステムズ３８０
Ｂシンセサイザーで業者の推奨する方法に従って合成
し、５０゜Ｃで脱保護化してオリゴヌクレオチド精製カ
ートリッジ（アプライドシステムズ）を用いて精製し
た。
【００１６】ＰＣＲは２５−１００μｌの容積で１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３，５０ｍＭ ＫＣ
ｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，０．００１％（ｗ／ｖ）
ゼラチン、２００μＭ ｄＡＴＰ，２００μＭ ｄＣＴ
Ｐ，２００μＭ ｄＧＴＰ，２００μＭ ｄＴＴＰ，各
々１．０μＭのプライマー、鋳型として１００ｎｇ／１
００μｌのゲノムＤＮＡ、あるいは５０ｎｇ／１００μ
ｌのプラスミドＤＮＡを含む反応溶液で行った。反応物
にミネラルオイルを重層して９５゜Ｃで５分加熱した。
２．５ユニット／１００μｌのＡＭＰＬＩＴＡＱポリメ
ラーゼ（パーキンエルマーシータス，Ｎｏｒｗａｌｋ，
ＣＴ）を加え、サイクルを開始した。試料は典型的に９
４゜Ｃで１分３０秒、３７−５０゜Ｃで２分、７２゜Ｃ
で３分、２５−３０サイクルインキュベートされた。こ
れに続いて７２゜Ｃで７分インキュベートして４゜Ｃで
保存した。
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３，５０ｍＭ ＫＣ
ｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，０．００１％（ｗ／ｖ）
ゼラチン、２００μＭ ｄＡＴＰ，２００μＭ ｄＣＴ
Ｐ，２００μＭ ｄＧＴＰ，２００μＭ ｄＴＴＰ，各
々１．０μＭのプライマー、鋳型として１００ｎｇ／１
００μｌのゲノムＤＮＡ、あるいは５０ｎｇ／１００μ
ｌのプラスミドＤＮＡを含む反応溶液で行った。反応物
にミネラルオイルを重層して９５゜Ｃで５分加熱した。
２．５ユニット／１００μｌのＡＭＰＬＩＴＡＱポリメ
ラーゼ（パーキンエルマーシータス，Ｎｏｒｗａｌｋ，
ＣＴ）を加え、サイクルを開始した。試料は典型的に９
４゜Ｃで１分３０秒、３７−５０゜Ｃで２分、７２゜Ｃ
で３分、２５−３０サイクルインキュベートされた。こ
れに続いて７２゜Ｃで７分インキュベートして４゜Ｃで
保存した。
【００１７】マイコバクテリウムアフリカーヌム（Ｍ．
ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウムアビウム
（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウムボビス（Ｍ．
ｂｏｖｉｓ），マイコバクテリウムボビス−ＢＣＧ
（Ｍ．ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ）、マイコバクテリウムチェ
ロネ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバクテリウムフ
ォーチュタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバク
テリウムゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、マイコバ
クテリウムイントラセルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌ
ｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａ
ｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウムスクロフラスム
（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、マイコバクテリウ
ムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）
を含む、テストしたマイコバクテリアの全てにおいて、
３４９ｂｐのＰＣＲ産物が見いだされた。プライマーは
大腸菌、ノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ
ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）およびロドコッカスロドクロ
ス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕ
ｓ）と交差反応性を示さなかった。ＳＤＡの場合、核酸
の増幅のためにはこの配列をもとに、より短い中部のオ
リゴヌクレオチドが必要とされるため、この３４９ｂｐ
の産物の中に高度に保存された領域があるかを決定し
た。マイコバクテリウムアフリカーヌム（Ｍ．ａｆｒｉ
ｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖ
ｉｕｍ）、マイコバクテリウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉ
ｓ）、マイコバクテリウムボビス−ＢＣＧ（Ｍ．ｂｏｖ
ｉｓ−ＢＣＧ）、マイコバクテリウムチェロネ（Ｍ．ｃ
ｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバクテリウムフォーチュタム
（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウムゴル
ドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、マイコバクテリウムイ
ントラセルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｅ）、マイコバクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓ
ｉｉ）、マイコバクテリウムスクロフラスム（Ｍ．ｓｃ
ｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）およびマイコバクテリウムチュ
バキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む
１１の異なるマイコバクテリアに由来する３４９ｂｐの
増幅産物をサブクローン化し配列を決定した。配列決定
はアプライドバイオシステムズ３７３ＡＤＮＡシーケン
サーでＴａｑ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットを用いて業者の推奨する通り
に行った。マイコバクテリアパラチュバキュロシス
（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のヌクレオ
チド１４１５−１７６３番目に相当する増幅産物の配列
は本明細書で配列番号１から１３として開示する。これ
らの配列は、核酸の増幅およびハイブリダイゼーション
による属および種特異的なマイコバクテリアの検出のた
めのプローブをデザインするために比較された。
ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウムアビウム
（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウムボビス（Ｍ．
ｂｏｖｉｓ），マイコバクテリウムボビス−ＢＣＧ
（Ｍ．ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ）、マイコバクテリウムチェ
ロネ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバクテリウムフ
ォーチュタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバク
テリウムゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、マイコバ
クテリウムイントラセルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌ
ｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａ
ｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウムスクロフラスム
（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、マイコバクテリウ
ムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）
を含む、テストしたマイコバクテリアの全てにおいて、
３４９ｂｐのＰＣＲ産物が見いだされた。プライマーは
大腸菌、ノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ
ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）およびロドコッカスロドクロ
ス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕ
ｓ）と交差反応性を示さなかった。ＳＤＡの場合、核酸
の増幅のためにはこの配列をもとに、より短い中部のオ
リゴヌクレオチドが必要とされるため、この３４９ｂｐ
の産物の中に高度に保存された領域があるかを決定し
た。マイコバクテリウムアフリカーヌム（Ｍ．ａｆｒｉ
ｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖ
ｉｕｍ）、マイコバクテリウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉ
ｓ）、マイコバクテリウムボビス−ＢＣＧ（Ｍ．ｂｏｖ
ｉｓ−ＢＣＧ）、マイコバクテリウムチェロネ（Ｍ．ｃ
ｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバクテリウムフォーチュタム
（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウムゴル
ドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、マイコバクテリウムイ
ントラセルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｅ）、マイコバクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓ
ｉｉ）、マイコバクテリウムスクロフラスム（Ｍ．ｓｃ
ｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）およびマイコバクテリウムチュ
バキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む
１１の異なるマイコバクテリアに由来する３４９ｂｐの
増幅産物をサブクローン化し配列を決定した。配列決定
はアプライドバイオシステムズ３７３ＡＤＮＡシーケン
サーでＴａｑ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットを用いて業者の推奨する通り
に行った。マイコバクテリアパラチュバキュロシス
（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のヌクレオ
チド１４１５−１７６３番目に相当する増幅産物の配列
は本明細書で配列番号１から１３として開示する。これ
らの配列は、核酸の増幅およびハイブリダイゼーション
による属および種特異的なマイコバクテリアの検出のた
めのプローブをデザインするために比較された。
【００１８】ロドコッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）の７０Ｋ抗原に類
似した配列 ロドコッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒ
ｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）で類似した配列が存在するかを
決定するために、λ−ｚａｐＩＩライブラリを構築し
た。ロドコッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）のゲノムＤＮＡをＳａｕ３
ＡＩで部分消化し、０．５から８ｋｂの断片を集めた。
これらの断片の末端をｄＧＴＰとｄＡＴＰで部分的に埋
めた。λ−ｚａｐＩＩベクターはＸｈｏＩで消化してｄ
ＣＴＰとｄＴＴＰで部分的に埋めて調製した。次にロド
コッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏ
ｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＤＮＡとλ−ｚａｐＩＩベクターを
連結してライブラリを形成させた（ＣｌｏｎｅＴｅｃ
ｈ）。独立クローンの数は１．３×１０6であった。こ
のライブラリーを次に増幅して、７０ｋ抗原をコードす
る遺伝子と類似するするものをスクリーニングした。ラ
イブラリーはマイコバクテリウムチュバキュロシス
（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウ
ムアビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウムチ
ェロネ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバクテリウム
ゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）の３４９ｂｐのＰＣ
Ｒ産物を用いてスクリーニングを行った。３４９ｂｐ領
域の上流及び下流と重複する配列を持つ２つのクローン
が得られた。このロドコッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）の配列（配列
番号１２）をマイコバクテリアの配列と比較してロドコ
ッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄ
ｏｃｈｒｏｕｓ）と交差反応しないマイコバクテリアの
核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅の為のプロー
ブをデザインした。
ｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）の７０Ｋ抗原に類
似した配列 ロドコッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒ
ｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）で類似した配列が存在するかを
決定するために、λ−ｚａｐＩＩライブラリを構築し
た。ロドコッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）のゲノムＤＮＡをＳａｕ３
ＡＩで部分消化し、０．５から８ｋｂの断片を集めた。
これらの断片の末端をｄＧＴＰとｄＡＴＰで部分的に埋
めた。λ−ｚａｐＩＩベクターはＸｈｏＩで消化してｄ
ＣＴＰとｄＴＴＰで部分的に埋めて調製した。次にロド
コッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏ
ｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＤＮＡとλ−ｚａｐＩＩベクターを
連結してライブラリを形成させた（ＣｌｏｎｅＴｅｃ
ｈ）。独立クローンの数は１．３×１０6であった。こ
のライブラリーを次に増幅して、７０ｋ抗原をコードす
る遺伝子と類似するするものをスクリーニングした。ラ
イブラリーはマイコバクテリウムチュバキュロシス
（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウ
ムアビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウムチ
ェロネ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバクテリウム
ゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）の３４９ｂｐのＰＣ
Ｒ産物を用いてスクリーニングを行った。３４９ｂｐ領
域の上流及び下流と重複する配列を持つ２つのクローン
が得られた。このロドコッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）の配列（配列
番号１２）をマイコバクテリアの配列と比較してロドコ
ッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄ
ｏｃｈｒｏｕｓ）と交差反応しないマイコバクテリアの
核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅の為のプロー
ブをデザインした。
【００１９】ノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃａｒｄ
ｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）７０Ｋと類似する配列 ノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ）に類似した配列が存在するかを検討す
るために、基本的にマイコバクテリアで述べた通り、増
幅およびスクリーニングを行った。７０Ｋ ｈｓｐの３
４９ｂｐ領域の中間部の小さい領域がノカルジアアステ
ロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）
で同定され、これをサブクローン化して配列を決定し
た。この配列情報を用いて配列番号２６のオリゴヌクレ
オチドをデザインした。このオリゴヌクレオチドはマイ
コバクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔ
ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のアンチセンス鎖配列のヌク
レオチド１６０４−１５８５番目に相当し、５’末端の
近傍にＥｃｏＲＩ部位がつけ加えられている。配列番号
２６の３’末端はマイコバクテリアの標的配列と相補的
であり、配列表には「プライマー結合部位（ｐｒｉｍｅ
ｒ ｂｉｎｄ）」と表されている。配列番号２６のマイ
コバクテリア−相補的領域（すなわち「プライマー結合
部位」）は、単独でもＳＤＡ以外の適用にプローブとし
て用いられ得る事が理解されるべきである。下記に述べ
られるように、その他の本発明のプローブは同様な構
造、すなわち３’末端にマイコバクテリア−相補的配列
を持ち、そのすぐ５’側にＨｉｎｃＩＩ部位を持ち、ま
た５’末端にはＳＤＡを促進するために付加した配列を
持つ。これらのプローブの各々に関して、マイコバクテ
リアの核酸に相補的な領域が配列表に「プライマー結合
部位」として表されている。これらの全てのプローブ
は、ＳＤＡ以外の同定および検出の適用において、相補
的なプライマー結合部位単独で（適当な標識をつけて、
あるいはつけないで）、マイコバクテリア核酸との属−
特異的ハイブリダイゼーション（例えばＰＣＲプライマ
ーや標識したハイブリダイゼーションプローブ）に用い
る事が可能である事が理解されるべきである。
ｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）７０Ｋと類似する配列 ノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ）に類似した配列が存在するかを検討す
るために、基本的にマイコバクテリアで述べた通り、増
幅およびスクリーニングを行った。７０Ｋ ｈｓｐの３
４９ｂｐ領域の中間部の小さい領域がノカルジアアステ
ロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）
で同定され、これをサブクローン化して配列を決定し
た。この配列情報を用いて配列番号２６のオリゴヌクレ
オチドをデザインした。このオリゴヌクレオチドはマイ
コバクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔ
ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のアンチセンス鎖配列のヌク
レオチド１６０４−１５８５番目に相当し、５’末端の
近傍にＥｃｏＲＩ部位がつけ加えられている。配列番号
２６の３’末端はマイコバクテリアの標的配列と相補的
であり、配列表には「プライマー結合部位（ｐｒｉｍｅ
ｒ ｂｉｎｄ）」と表されている。配列番号２６のマイ
コバクテリア−相補的領域（すなわち「プライマー結合
部位」）は、単独でもＳＤＡ以外の適用にプローブとし
て用いられ得る事が理解されるべきである。下記に述べ
られるように、その他の本発明のプローブは同様な構
造、すなわち３’末端にマイコバクテリア−相補的配列
を持ち、そのすぐ５’側にＨｉｎｃＩＩ部位を持ち、ま
た５’末端にはＳＤＡを促進するために付加した配列を
持つ。これらのプローブの各々に関して、マイコバクテ
リアの核酸に相補的な領域が配列表に「プライマー結合
部位」として表されている。これらの全てのプローブ
は、ＳＤＡ以外の同定および検出の適用において、相補
的なプライマー結合部位単独で（適当な標識をつけて、
あるいはつけないで）、マイコバクテリア核酸との属−
特異的ハイブリダイゼーション（例えばＰＣＲプライマ
ーや標識したハイブリダイゼーションプローブ）に用い
る事が可能である事が理解されるべきである。
【００２０】配列番号２６の上流領域（５’）のオリゴ
ヌクレオチドをデザインするために、マイコバクテリウ
ムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕ
ｏｌｏｓｉｓ）とマイコバクテリウムレプレ（Ｍ．ｌｅ
ｐｒａｅ）の７０Ｋタンパク質の相同性を解析した。い
くつかの保存された領域をもとに、縮重オリゴヌクレオ
チドをデザインした。配列番号２５は４つのコドンで３
番目が縮重しており、１つのコドンで２、３番目が縮重
している。配列番号２５の３’末端はマイコバクテリウ
ムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ）のセンス鎖配列のヌクレオチド１２１１−
１２３０番目に相当し、５’末端の近傍にＥｃｏＲＩ部
位がつけ加えられている。配列番号２６はマイコバクテ
リウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓ）のヌクレオチド１５８５−１６０４番
目に相当する。これら２つのプライマーを用いて長さ３
９３ｂｐのＰＣＲ産物がノカルジアアステロイデス（Ｎ
ｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）から増幅され
た。この産物をｐＵＣ１８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＥ
ｃｏＲＩ部位にサブクローン化した。これらのクローン
をアプライドバイオシステムズ３７３Ａ ＤＮＡシーケ
ンサーでＴａｑ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットを用いて業者の推奨する方
法で配列を決定した。３４９ｂｐの下流領域（３’）を
得るために、配列番号２７および２８のオリゴヌクレオ
チドをＰＣＲ増幅反応に用いた。配列番号２７は配列番
号２８と相補的なオリゴヌクレオチドであるが５’末端
にＥｃｏＲＩ部位を持たない。配列番号２８は、マイコ
バクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）とロドコッカスロドクロス（Ｒ
ｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＤＮＡ
配列の並びを用いてデザインされ、マイコバクテリウム
パラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌ
ｏｓｉｓ）のヌクレオチド１９１０−１９２７番目のア
ンチセンス鎖配列に相当する。したがってこの増幅産物
は３９３ｂｐ増幅産物の配列と５’末端においてわずか
に重複しており、その下流領域をあわせて３４２ｂｐの
長さを持つ。この３４２ｂｐ断片をｐＵＣ１８のＳｍａ
Ｉ部位にサブクローン化した。このクローンの配列を上
記のように決定した。ノカルジアアステロイデス（Ｎｏ
ｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）の３９３ｂｐ及
び３４２ｂｐの増幅産物を重複させて、マイコバクテリ
ウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓ）の３４９ｂｐ断片に相当する配列の部分
が得られるように解析した（配列番号１３）。配列番号
１３をマイコバクテリアの配列と比較して非交差反応性
の配列を選択した。
ヌクレオチドをデザインするために、マイコバクテリウ
ムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕ
ｏｌｏｓｉｓ）とマイコバクテリウムレプレ（Ｍ．ｌｅ
ｐｒａｅ）の７０Ｋタンパク質の相同性を解析した。い
くつかの保存された領域をもとに、縮重オリゴヌクレオ
チドをデザインした。配列番号２５は４つのコドンで３
番目が縮重しており、１つのコドンで２、３番目が縮重
している。配列番号２５の３’末端はマイコバクテリウ
ムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ）のセンス鎖配列のヌクレオチド１２１１−
１２３０番目に相当し、５’末端の近傍にＥｃｏＲＩ部
位がつけ加えられている。配列番号２６はマイコバクテ
リウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓ）のヌクレオチド１５８５−１６０４番
目に相当する。これら２つのプライマーを用いて長さ３
９３ｂｐのＰＣＲ産物がノカルジアアステロイデス（Ｎ
ｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）から増幅され
た。この産物をｐＵＣ１８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＥ
ｃｏＲＩ部位にサブクローン化した。これらのクローン
をアプライドバイオシステムズ３７３Ａ ＤＮＡシーケ
ンサーでＴａｑ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットを用いて業者の推奨する方
法で配列を決定した。３４９ｂｐの下流領域（３’）を
得るために、配列番号２７および２８のオリゴヌクレオ
チドをＰＣＲ増幅反応に用いた。配列番号２７は配列番
号２８と相補的なオリゴヌクレオチドであるが５’末端
にＥｃｏＲＩ部位を持たない。配列番号２８は、マイコ
バクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）とロドコッカスロドクロス（Ｒ
ｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＤＮＡ
配列の並びを用いてデザインされ、マイコバクテリウム
パラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌ
ｏｓｉｓ）のヌクレオチド１９１０−１９２７番目のア
ンチセンス鎖配列に相当する。したがってこの増幅産物
は３９３ｂｐ増幅産物の配列と５’末端においてわずか
に重複しており、その下流領域をあわせて３４２ｂｐの
長さを持つ。この３４２ｂｐ断片をｐＵＣ１８のＳｍａ
Ｉ部位にサブクローン化した。このクローンの配列を上
記のように決定した。ノカルジアアステロイデス（Ｎｏ
ｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）の３９３ｂｐ及
び３４２ｂｐの増幅産物を重複させて、マイコバクテリ
ウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓ）の３４９ｂｐ断片に相当する配列の部分
が得られるように解析した（配列番号１３）。配列番号
１３をマイコバクテリアの配列と比較して非交差反応性
の配列を選択した。
【００２１】４種のマイコバクテリア種由来の付加的な
上流配列 ノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ）の類似配列を得るのに用いたのと同じ
縮重ＰＣＲプライマー（配列番号２５および配列番号２
６）を、マイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉｕ
ｍ），マイコバクテリウムゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎ
ａｅ）マイコバクテリウムカンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａ
ｓｉｉ），マイコバクテリウムチュバキュロシス（Ｍ．
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の２０４ｂｐ産物を増幅す
るのに用いた。この産物をｐＵＣ１８（ファルマシア）
のＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化した。このクローン
の配列をアプライドバイオシステムズ３７３Ａ ＤＮＡ
シーケンサーでＴａｑ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃ
ｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットを用いて業者の推奨
する方法で配列を決定した。これらの配列、すなわち上
記で得たノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ
ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）（３９３ｂｐセグメント）と
ロドコッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒ
ｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、および公表されているマイコ
バクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の配列を互いに並べて、核酸の
増幅とハイブリダイゼーションによるマイコバクテリア
の属−特異的検出のためのプローブをデザインした。こ
れらの種の配列はマイコバクテリウムパラチュバキュロ
シス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のヌク
レオチド１２１１−１４１４番目に相当し、ただしロド
コッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏ
ｄｏｃｈｒｏｕｓ）の配列は例外で、ヌクレオチド１２
６５−１４１４番目に相当する。これらは配列番号２
９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列
番号３３、および配列番号３４に挙げられている。
上流配列 ノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ）の類似配列を得るのに用いたのと同じ
縮重ＰＣＲプライマー（配列番号２５および配列番号２
６）を、マイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉｕ
ｍ），マイコバクテリウムゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎ
ａｅ）マイコバクテリウムカンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａ
ｓｉｉ），マイコバクテリウムチュバキュロシス（Ｍ．
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の２０４ｂｐ産物を増幅す
るのに用いた。この産物をｐＵＣ１８（ファルマシア）
のＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化した。このクローン
の配列をアプライドバイオシステムズ３７３Ａ ＤＮＡ
シーケンサーでＴａｑ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃ
ｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットを用いて業者の推奨
する方法で配列を決定した。これらの配列、すなわち上
記で得たノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ
ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）（３９３ｂｐセグメント）と
ロドコッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒ
ｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、および公表されているマイコ
バクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の配列を互いに並べて、核酸の
増幅とハイブリダイゼーションによるマイコバクテリア
の属−特異的検出のためのプローブをデザインした。こ
れらの種の配列はマイコバクテリウムパラチュバキュロ
シス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のヌク
レオチド１２１１−１４１４番目に相当し、ただしロド
コッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏ
ｄｏｃｈｒｏｕｓ）の配列は例外で、ヌクレオチド１２
６５−１４１４番目に相当する。これらは配列番号２
９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列
番号３３、および配列番号３４に挙げられている。
【００２２】７０Ｋ抗原をコードする遺伝子のＳＤＡ オリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ３８
０Ｂシンセサイザーでシアノエチルホスホアミダイトを
用いて業者の推奨するとおりに合成した。このオリゴヌ
クレオチドは５０゜Ｃで脱保護化し、以前に述べたよう
にゲルから精製した（Ａｕｓｕｂｅｌら）。
０Ｂシンセサイザーでシアノエチルホスホアミダイトを
用いて業者の推奨するとおりに合成した。このオリゴヌ
クレオチドは５０゜Ｃで脱保護化し、以前に述べたよう
にゲルから精製した（Ａｕｓｕｂｅｌら）。
【００２３】鎖置換増幅反応は基本的にウォーカー（Ｗ
ａｌｋｅｒ）らＮｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９９
２），前出、によって述べられたように、容積１０−５
０ｍｌで６ｍＭＭｇＣｌ2，各々１ｍＭのｄＧＴＰ，ｄ
ＣＴＰ，ＴＴＰおよびα−チオｄＡＴＰ，１００μｇ／
ｍｌアセチル化ウシ血清アルブミン、５０ｍＭ ＫＰＯ
4 ｐＨ７．６，３％（ｖ／ｖ）Ｎ−メチルピロリドン
（ＮＭＰ），０．５μＭプライマーＳ1およびＳ2、０．
０５μＭプライマーＢ１およびＢ２、３ユニット／μｌ
ＨｉｎｃＩＩ，０．１ユニット／μｌエキソ-Ｋｌｅｎ
ｏｗＤＮＡポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）（Ｄｅｒｙｓｈｉｒｅ，ｅ
ｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０
０−２０１）および様々な量の標的ＤＮＡを含む反応溶
液中で行った。いくつかの場合では、ＳＤＡ反応はｄＵ
−置換体産物が生成されるように行った。これらの反応
ではＭｇＣｌ2の濃度は７ｍＭとし、１０％グリセロー
ルをＮＭＰの代わりに加え、ヌクレオチドはｄＵＴＰ
（０．５ｍＭ），ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよびα−チオｄ
ＡＴＰ（０．２ｍＭ）に置き換えた。ＨｉｎｃＩＩ，エ
キソ-ＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼ を加える前に反
応液を９５゜Ｃで２分加熱して標的ＤＮＡを変性し、続
いて３７−４０゜Ｃで２分プライマーをアニールさせ
た。酵素を加えてから、反応液を３７−４０゜Ｃで２時
間インキュベートして増幅を行った。増幅を６５゜Ｃで
１０分加熱して停止させた。生成産物を上記の通りに32
Ｐ標識したプローブを用いたプライマー伸長法で、変性
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて解析した（ウ
ォーカーら）。
ａｌｋｅｒ）らＮｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９９
２），前出、によって述べられたように、容積１０−５
０ｍｌで６ｍＭＭｇＣｌ2，各々１ｍＭのｄＧＴＰ，ｄ
ＣＴＰ，ＴＴＰおよびα−チオｄＡＴＰ，１００μｇ／
ｍｌアセチル化ウシ血清アルブミン、５０ｍＭ ＫＰＯ
4 ｐＨ７．６，３％（ｖ／ｖ）Ｎ−メチルピロリドン
（ＮＭＰ），０．５μＭプライマーＳ1およびＳ2、０．
０５μＭプライマーＢ１およびＢ２、３ユニット／μｌ
ＨｉｎｃＩＩ，０．１ユニット／μｌエキソ-Ｋｌｅｎ
ｏｗＤＮＡポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）（Ｄｅｒｙｓｈｉｒｅ，ｅ
ｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０
０−２０１）および様々な量の標的ＤＮＡを含む反応溶
液中で行った。いくつかの場合では、ＳＤＡ反応はｄＵ
−置換体産物が生成されるように行った。これらの反応
ではＭｇＣｌ2の濃度は７ｍＭとし、１０％グリセロー
ルをＮＭＰの代わりに加え、ヌクレオチドはｄＵＴＰ
（０．５ｍＭ），ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよびα−チオｄ
ＡＴＰ（０．２ｍＭ）に置き換えた。ＨｉｎｃＩＩ，エ
キソ-ＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼ を加える前に反
応液を９５゜Ｃで２分加熱して標的ＤＮＡを変性し、続
いて３７−４０゜Ｃで２分プライマーをアニールさせ
た。酵素を加えてから、反応液を３７−４０゜Ｃで２時
間インキュベートして増幅を行った。増幅を６５゜Ｃで
１０分加熱して停止させた。生成産物を上記の通りに32
Ｐ標識したプローブを用いたプライマー伸長法で、変性
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて解析した（ウ
ォーカーら）。
【００２４】上記の手順でデザインした、７０Ｋ遺伝子
の２つの領域に対するプローブは、ノカルジアアステロ
イデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）と
ロドコッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒ
ｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）に交差反応性を示さず属−特異
性を保っていた。これらのプローブはＳＤＡ反応におい
てテストすることにより属−特異性が確かめられた。１
番目の領域は、ウォーカーら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．，前出、によって定義されている様に、
配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号
２３と配列番号２４、配列番号２１配列番号２２、配列
番号２０のプライマーのセットを各々Ｓ１およびＳ２プ
ライマー（増幅）として、また配列番号２３と配列番号
２４のプライマーのセットを各々Ｂ１およびＢ２プライ
マー（バンパー）として用いて増幅した。配列番号２
０、配列番号２１と配列番号２２は３’末端がプライマ
ー結合部位と相補的であり、そのプライマー結合結合部
位と相補的な部位のすぐ５’側にＨｉｎｃＩＩ部位を持
つ。この１番目の領域は配列番号２０において３塩基お
よび配列番号２１と配列番号２２において１塩基のミス
マッチを各々ノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃａｒｄ
ｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）およびロドコッカスロド
クロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏ
ｕｓ）の間に持つ。増幅において、この領域は１０，０
００分子でマイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉｕ
ｍ）に対する感度を持ち、ノカルジアアステロイデス
（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）とロドコ
ッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄ
ｏｃｈｒｏｕｓ）に交差反応性を示さなかった。これら
の属−特異的プローブは、上記に述べたとおりハイブリ
ダイゼーションによるマイコバクテリアの核酸の検出に
も用いられ得る。
の２つの領域に対するプローブは、ノカルジアアステロ
イデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）と
ロドコッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒ
ｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）に交差反応性を示さず属−特異
性を保っていた。これらのプローブはＳＤＡ反応におい
てテストすることにより属−特異性が確かめられた。１
番目の領域は、ウォーカーら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．，前出、によって定義されている様に、
配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号
２３と配列番号２４、配列番号２１配列番号２２、配列
番号２０のプライマーのセットを各々Ｓ１およびＳ２プ
ライマー（増幅）として、また配列番号２３と配列番号
２４のプライマーのセットを各々Ｂ１およびＢ２プライ
マー（バンパー）として用いて増幅した。配列番号２
０、配列番号２１と配列番号２２は３’末端がプライマ
ー結合部位と相補的であり、そのプライマー結合結合部
位と相補的な部位のすぐ５’側にＨｉｎｃＩＩ部位を持
つ。この１番目の領域は配列番号２０において３塩基お
よび配列番号２１と配列番号２２において１塩基のミス
マッチを各々ノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃａｒｄ
ｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）およびロドコッカスロド
クロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏ
ｕｓ）の間に持つ。増幅において、この領域は１０，０
００分子でマイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉｕ
ｍ）に対する感度を持ち、ノカルジアアステロイデス
（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）とロドコ
ッカスロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄ
ｏｃｈｒｏｕｓ）に交差反応性を示さなかった。これら
の属−特異的プローブは、上記に述べたとおりハイブリ
ダイゼーションによるマイコバクテリアの核酸の検出に
も用いられ得る。
【００２５】配列番号１７、配列番号１８をＳ１、Ｓ２
プライマーとして、配列番号１６および配列番号１９を
Ｂ１，Ｂ２プライマーとして用いて、７０Ｋ ｈｓｐの
異なる領域を増幅した。配列番号１７と配列番号１８は
配列表に示したように３’末端がマイコバクテリアと相
補的であり、プライマー結合部位のすぐ上流にＨｉｎｃ
ＩＩ部位を持つ。５’末端にはＳＤＡによる増幅を促進
するための付加的な配列を持つ。これらのプローブのセ
ットによって位置づけられる領域は、マイコバクテリウ
ムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ）、マイコバクテリウムフォーチュタム（Ｍ．ｆｏｒ
ｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウムチェロネ（Ｍ．ｃ
ｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバクテリウムゴルドネ（Ｍ．
ｇｏｒｄｏｎａｅ）、マイコバクテリウムアビウム
（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウムイントラセル
ラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバ
クテリウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリ
ウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテ
リウムアフリカーヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マ
イコバクテリウムスクロフラスム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌ
ａｃｅｕｍ）を含む、テストした全てのマイコバクテリ
アの種を増幅した。ノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃ
ａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドコッカスロ
ドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒ
ｏｕｓ）、ボルデテラパーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌ
ａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）カンジダアルビカンス（Ｃａ
ｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、コリネバクテリウム
ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐ
ｈｔｈｅｒｉａｅ）、大腸菌、フラボバクテリウムメニ
ンジセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅ
ｎｉｎｊｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、ストレプトコッカスニ
ューモニエ、アシネトバクタールボフィ（Ａｃｉｎｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒ ｌｗｏｆｆｉ）、エンテロバクターエ
アロゲンス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅ
ｎｅｓ）、エンテロバクタークロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏ
ｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、ヘモフィリスインフ
ルエンザＢ型、クレブシラニューモニア、リステリアモ
ノシトゲンス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇ
ｅｎｅｓ）、モラクセラオスロエンシス（Ｍｏｒａｘｅ
ｌｌａ ｏｓｌｏｅｎｓｉｓ）、モルガネラモルガニイ
（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）、ナイセ
リアラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉ
ｃａ）、ナイセリアメニンジチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉ
ａ ｍｅｎｉｎｊｉｔｉｄｉｓ）、エルスコビアツルバ
タ（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ ｔｕｒｖａｔａ）、プロテウ
スブルガリス、シュードモナスエアルギノサ（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、セラチアマ
ルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎ
ｓ）、シゲラジセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓ
ｅｎｔｅｒｉａｅ）、黄色ブドウ状球菌、スタフィロコ
ッカスエピダーミジス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ストレプトコッカスピオ
ゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅ
ｓ）を含むテストした非−マイコバクテリア種において
増幅は見られなかった。このシステムのおおよその感度
はマイコバクテリアのゲノムＤＮＡ１，０００から１
０，０００分子である。これらのプローブもマイコバク
テリアの核酸のハイブリダイゼーション反応による検出
に用いられ得る。
プライマーとして、配列番号１６および配列番号１９を
Ｂ１，Ｂ２プライマーとして用いて、７０Ｋ ｈｓｐの
異なる領域を増幅した。配列番号１７と配列番号１８は
配列表に示したように３’末端がマイコバクテリアと相
補的であり、プライマー結合部位のすぐ上流にＨｉｎｃ
ＩＩ部位を持つ。５’末端にはＳＤＡによる増幅を促進
するための付加的な配列を持つ。これらのプローブのセ
ットによって位置づけられる領域は、マイコバクテリウ
ムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ）、マイコバクテリウムフォーチュタム（Ｍ．ｆｏｒ
ｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウムチェロネ（Ｍ．ｃ
ｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバクテリウムゴルドネ（Ｍ．
ｇｏｒｄｏｎａｅ）、マイコバクテリウムアビウム
（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウムイントラセル
ラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバ
クテリウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリ
ウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテ
リウムアフリカーヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マ
イコバクテリウムスクロフラスム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌ
ａｃｅｕｍ）を含む、テストした全てのマイコバクテリ
アの種を増幅した。ノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃ
ａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドコッカスロ
ドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒ
ｏｕｓ）、ボルデテラパーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌ
ａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）カンジダアルビカンス（Ｃａ
ｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、コリネバクテリウム
ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐ
ｈｔｈｅｒｉａｅ）、大腸菌、フラボバクテリウムメニ
ンジセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅ
ｎｉｎｊｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、ストレプトコッカスニ
ューモニエ、アシネトバクタールボフィ（Ａｃｉｎｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒ ｌｗｏｆｆｉ）、エンテロバクターエ
アロゲンス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅ
ｎｅｓ）、エンテロバクタークロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏ
ｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、ヘモフィリスインフ
ルエンザＢ型、クレブシラニューモニア、リステリアモ
ノシトゲンス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇ
ｅｎｅｓ）、モラクセラオスロエンシス（Ｍｏｒａｘｅ
ｌｌａ ｏｓｌｏｅｎｓｉｓ）、モルガネラモルガニイ
（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）、ナイセ
リアラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉ
ｃａ）、ナイセリアメニンジチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉ
ａ ｍｅｎｉｎｊｉｔｉｄｉｓ）、エルスコビアツルバ
タ（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ ｔｕｒｖａｔａ）、プロテウ
スブルガリス、シュードモナスエアルギノサ（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、セラチアマ
ルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎ
ｓ）、シゲラジセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓ
ｅｎｔｅｒｉａｅ）、黄色ブドウ状球菌、スタフィロコ
ッカスエピダーミジス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ストレプトコッカスピオ
ゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅ
ｓ）を含むテストした非−マイコバクテリア種において
増幅は見られなかった。このシステムのおおよその感度
はマイコバクテリアのゲノムＤＮＡ１，０００から１
０，０００分子である。これらのプローブもマイコバク
テリアの核酸のハイブリダイゼーション反応による検出
に用いられ得る。
【００２６】マイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉ
ｕｍ）、マイコバクテリウムゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏ
ｎａｅ）、マイコバクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓ
ａｓｉｉ）マイコバクテリウムチュバキュロシス（Ｍ．
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウムパラ
チュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ）、のヌクレオチド１２１１−１４１４番目に由来
する配列の相同性比較に基づいて、保存された領域をＳ
ＤＡ増幅の領域として選択した。また、上記で得られた
ノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ）およびロドコッカスロドクロス（Ｒｈ
ｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）の配列
を並べて、ミスマッチを利用して交差反応が起こらない
ようにプライマーをデザインした。Ｓ１プライマー（配
列番号３５）は、ノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃａ
ｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）およびロドコッカス
ロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈ
ｒｏｕｓ）において中間部のミスマッチに加えて３’最
末端にミスマッチを持つ。Ｓ２プライマー（配列番号３
６）は、ノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ
ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）およびロドコッカスロドクロ
ス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕ
ｓ）において３’末端に３塩基のミスマッチを持つ。配
列番号３５および配列番号３６は、３’末端にプライマ
ー結合部位と相補的な部位、ＨｉｎｃＩＩ部位、５’末
端に、その他のいくつかのプローブにおいてすでに述べ
た付加的な配列を持つ。両プライマーは５種のマイコバ
クテリアと配列が同一である。Ｂ１およびＢ２プライマ
ーとして用いたのは配列番号３７と配列番号１９であ
る。ＳＤＡ増幅反応は上気にすでに述べたように行っ
た。この増幅システムのおおよその感度はマイコバクテ
リウムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ）ＤＮＡ２，０００分子であった。
ｕｍ）、マイコバクテリウムゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏ
ｎａｅ）、マイコバクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓ
ａｓｉｉ）マイコバクテリウムチュバキュロシス（Ｍ．
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウムパラ
チュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ）、のヌクレオチド１２１１−１４１４番目に由来
する配列の相同性比較に基づいて、保存された領域をＳ
ＤＡ増幅の領域として選択した。また、上記で得られた
ノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ）およびロドコッカスロドクロス（Ｒｈ
ｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）の配列
を並べて、ミスマッチを利用して交差反応が起こらない
ようにプライマーをデザインした。Ｓ１プライマー（配
列番号３５）は、ノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃａ
ｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）およびロドコッカス
ロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈ
ｒｏｕｓ）において中間部のミスマッチに加えて３’最
末端にミスマッチを持つ。Ｓ２プライマー（配列番号３
６）は、ノカルジアアステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ
ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）およびロドコッカスロドクロ
ス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕ
ｓ）において３’末端に３塩基のミスマッチを持つ。配
列番号３５および配列番号３６は、３’末端にプライマ
ー結合部位と相補的な部位、ＨｉｎｃＩＩ部位、５’末
端に、その他のいくつかのプローブにおいてすでに述べ
た付加的な配列を持つ。両プライマーは５種のマイコバ
クテリアと配列が同一である。Ｂ１およびＢ２プライマ
ーとして用いたのは配列番号３７と配列番号１９であ
る。ＳＤＡ増幅反応は上気にすでに述べたように行っ
た。この増幅システムのおおよその感度はマイコバクテ
リウムチュバキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ）ＤＮＡ２，０００分子であった。
【００２７】
配列番号：１ 配列の長さ：３４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：マイコバクテリウム アビウム（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ） 配列
ｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ） 配列
【化１】 配列番号：２ 配列の長さ：３４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：マイコバクテリウム イントラセルラレ（Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｅ） 配列
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｅ） 配列
【化２】 配列番号：３ 配列の長さ：３４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：マイコバクテリウム スクロフラセム（Ｍｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ） 配列
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ） 配列
【化３】 配列番号：４ 配列の長さ：３４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：マイコバクテリウム チュバキュロシス（Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列
【化４】 配列番号：５ 配列の長さ：３４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：マイコバクテリウム ゴードネ（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ） 配列
ｃｔｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ） 配列
【化５】 配列番号：６ 配列の長さ：３４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：マイコバクテリウム フォーチュータム（Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ） 配列
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ） 配列
【化６】 配列番号：７ 配列の長さ：３４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：マイコバクテリウム ボビス−ＢＣＧ（Ｍｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ） 配列
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ） 配列
【化７】 配列番号：８ 配列の長さ：３４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：マイコバクテリウム ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ） 配列
ｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ） 配列
【化８】 配列番号：９ 配列の長さ：３４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：マイコバクテリウム チェロネ（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｅｌｏｎａｅ） 配列
ｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｅｌｏｎａｅ） 配列
【化９】 配列番号：１０ 配列の長さ：３４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：マイコバクテリウム カンサシ（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ） 配列
ｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ） 配列
【化１０】 配列番号：１１ 配列の長さ：３４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム アフリカーヌム（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ） 配列
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ） 配列
【化１１】 配列番号：１２ 配列の長さ：３４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ロドコッカス ロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ） 配列
ｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ） 配列
【化１２】 配列番号：１３ 配列の長さ：３４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ノカルディア アスセテロイデス（Ｎｏｃａｒ
ｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ） 配列
ｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ） 配列
【化１３】 配列番号：１４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CCGTCGGTGC AGATCCAGGT 20 配列番号：１５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GAACTTCTCC GTCTGGTAGA 20 配列番号：１６ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CTTCGAGCTG ACCG 14 配列番号：１７ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄ 存在位置：２５．．３６ 配列 TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACGCAGAT CGAGGT 36 配列番号：１８ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄ 存在位置：２５．．３９ 配列 TTGAAGTAAC CGACTATTGT TGACGGTGCC CTTGTCCTT 39 配列番号：１９ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TCCTTGGACA GGC 13 配列番号：２０ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄ 存在位置：２５．．３８ 配列 TTGAATAGTC GGTTAGATGT TGACACGTCA CGGGGAAG 38 配列番号：２１ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄ 存在位置：２５．．３３ 配列 TTGATCTAAC CGACTATTGT TGACCCGAGC CCT 33 配列番号：２２ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄ 存在位置：２５．．３３ 配列 TTGATCTAAC CGACTATTGT TGACCGGAGC CTT 33 配列番号：２３ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TCGGCGTCCT TGAT 14 配列番号：２４ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CAGATCGAGG TCAC 14 配列番号：２５ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GTGGAATTCA ACCCSGAYGA RGYYGTNGC 29 配列番号：２６ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GTGGAATTCT CTCCTTRCCG GTGCCCTTG 29 配列番号：２７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CAAGGGCACC GGCAAGGAGA 20 配列番号：２８ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CCGAGGGCCT GCGACTC 17 配列番号：２９ 配列の長さ：２０４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：マイコバクテリウム アビウム（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ） 配列
ｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ） 配列
【化１４】 配列番号：３０ 配列の長さ：２０３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：マイコバクテリウム ゴードネ（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ） 配列
ｃｔｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ） 配列
【化１５】 配列番号：３１ 配列の長さ：２０４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：マイコバクテリウム カンサシ（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ） 配列
ｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ） 配列
【化１６】 配列番号：３２ 配列の長さ：２０４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：マイコバクテリウム チュバキュロシス（Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列
【化１７】 配列番号：３３ 配列の長さ：２０４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ノカルディア アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄ
ｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ） 配列
ｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ） 配列
【化１８】 配列番号：３４ 配列の長さ：１５０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ロドコッカス ロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ 配列
ｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ 配列
【化１９】 配列番号：３５ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TTGAATAGTC GGTTAGAAGT TGACAAGGGC GAGGTG 36 配列番号：３６ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TTGAAGTAAC CGACTATTGT TGACTCGATA CCCAGGCT 38 配列番号：３７ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CTGCAGGCCG GTGT 14
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マイケル・シー・リトル アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27610，ローリー，ウィンウェイ・ドラ イブ 1729 (72)発明者 ダリル・ディー・シャンク アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27712，ダーラム，ドンフィル・ドライ ブ 1108 (56)参考文献 国際公開88／5823（ＷＯ，Ａ)
Claims (10)
- 【請求項１】 マイコバクテリアの核酸の属−特異的な
増幅または検出に用いられる、配列番号１６、配列番号
１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配
列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２
４、配列番号３５、配列番号３６または配列番号３７か
らなるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 マイコバクテリアの核酸の属−特異的な
増幅または検出に用いられる、配列番号１、配列番号
２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号
６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１
０、配列番号１１、配列番号２９、配列番号３０、配列
番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４
またはこれらの相補的配列からなるオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項３】 配列番号１２、配列番号１３またはこれ
らの相補的配列からなるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 マイコバクテリアの核酸の属−特異的な
増幅または検出に用いられる、配列番号１４または配列
番号１５からなるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項５】 ａ）マイコバクテリアの核酸に、配列番
号２０からなる第１増幅プライマーおよび配列番号２１
または配列番号２２からなる第２増幅プライマーをハイ
ブリダイズさせ、そして ｂ）ハイブリダイズしたプライマーにより規定されるマ
イコバクテリア核酸の属−特異的セグメントを増幅する
ことにより属−特異的増幅産物を生成する工程からな
る、マイコバクテリア核酸の属−特異的増幅法。 - 【請求項６】 ａ）マイコバクテリアの核酸に、配列番
号１７からなる第１増幅プライマーおよび配列番号１８
からなる第２増幅プライマーをハイブリダイズさせ、そ
して ｂ）ハイブリダイズしたプライマーにより規定されるマ
イコバクテリア核酸の属−特異的セグメントを増幅する
ことにより属−特異的増幅産物を生成する工程からな
る、マイコバクテリア核酸の属−特異的増幅法。 - 【請求項７】 ａ）マイコバクテリアの核酸に、配列番
号３５からなる第１増幅プライマーおよび配列番号３６
からなる第２増幅プライマーをハイブリダイズさせ、そ
して ｂ）ハイブリダイズしたプライマーにより規定されるマ
イコバクテリア核酸の属−特異的セグメントを増幅する
ことにより属−特異的増幅産物を生成する工程からな
る、マイコバクテリア核酸の属−特異的増幅法。 - 【請求項８】 さらに属−特異的増幅産物を検出する工
程を含む、請求項５ないし７のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項９】 マイコバクテリアの核酸を鎖置換増幅
（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって増幅する、請求項５ない
し７のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】 ａ）配列番号１６、配列番号１７、配
列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２
１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列
番号３５、配列番号３６および配列番号３７からなる群
から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを
マイコバクテリアの核酸にハイブリダイズさせ、そして ｂ）ハイブリダイズしたプローブを検出する工程からな
るマイコバクテリアの核酸の属−特異的検出法。
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|---|---|---|---|
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