DE68921287T2 - Nukleotidesequenzen, die ein Protein mit Ureareaktivität kodieren. - Google Patents

Nukleotidesequenzen, die ein Protein mit Ureareaktivität kodieren.

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Description

  • Die Erfindung betrifft Nucleotidsequenzen, die für eine Urease kodieren, wie sie in der Natur von Campylobacter pylori exprimiert wird, und ihre biologischen Anwendungen, insbesondere für den Nachweis von C.pylori beim Menschen und in der Umwelt.
  • C.pylori ist eine gramnegative Bakterie, die heute ausschließlich an der Oberfläche der Schleimhaut des antralen Teils des Magens beim Menschen gefunden wird, und insbesondere um die Läsionen und Kraters von Geschwüren des Magens und des Zwölffingerdarms herum. 25% der Bevölkerung trägt C.pylori: 8% leiden an einer ulzerierenden Krankheit, 9% leiden an einer nicht-ulzerierenden Dyspepsie und 8% sind asymptomatische Träger.
  • Die bis heute isolierten und beschriebenden C.pylori weisen die folgenden drei Eigenschaften auf:
  • Die Bakterien produzieren eine Urease, die eine starke Aktivität aufweist.
  • Sie hängen sehr fest an den Epithelzellen der Magenschleimhaut; diese Eigenschaft zeigt sich in vitro durch eine sehr starke Adhäsion an Hela-Zellen.
  • C.pylori bilden und setzen ein Enzym frei, das eine proteolytische Aktivität aufweist, welche zu einem Abbau der Schleimhaut und somit zu einer Schwächung der natürlichen, die Magenschleimhaut schützenden Barriere führt.
  • Der Nachweise von C.pylori in situ beim Menschen und in der Umwelt und die Untersuchung seiner pathogenen Wirkung - sie wird als verantwortlich für die aktive Gastritis beim Menschen angesehen - stoßt stets auf Schwierigkeiten bei der Kultivierung dieses Organismus.
  • Sein Wachstum ist sehr langsam (6 bis 7 Tage auf Blutagar-Medium) und muß unter mikroaerophilen Bedingungen ausgeführt werden, da Luftsauerstoff toxisch ist.
  • Die Erforschung von Mitteln zum Nachweis dieses Bakteriums hat die Erfinder veranlaßt, die Gene zu identifizieren, die bei C.pylori für die Bildung von Urease verantwortlich sind.
  • Die Bestimmung der Nucleotidsequenz eines intragenen Fragments gestattet den Zugriff. auf ein Mittel, das als Sonde zum Nachweis für die spezifische Identifizierung von C.pylori verwendbar ist.
  • Die Erfindung ist somit auf neue Nucleotidsequenzen gerichtet, die für Proteine mit Ureaseaktivität, wie sie von C.pylori exprimiert werden, kodieren.
  • Sie betrifft weiterhin die Bereitstellung von Fragmenten dieser Sequenz, die als Erkennungssonden für C.pylori eingesetzt werden können.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin die Bereitstellung eines Proteins init Ureaseaktivität, wie es von C.pylori exprimiert wird, mit größerer Reinheit, sowie Fragmente dieses Proteins.
  • Die Nucleotidsequenz der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dar sie mindestens einen Teil einer Sequenz umfaßt, der für ein Protein mit Ureaseaktivität, wie es von C.pylori exprimiert wird, kodiert.
  • Die Erfindung betrifft insbesondere eine Nucleotidsequenz, die mit Genen hybridisieren kann, die für ein Protein mit Ureaseaktivität, wie es von C.pylori exprimiert wird, kodieren, und zwar unter den folgenden Bedingungen: 68ºC, 6 x SSC (1 x SSC besteht aus 0,15M NaCl und 0,015M Natriumcitrat, pH 7), im Denhardt-Milieu (1% Ficoll, 1% Polyvinylpyrrolidon, 1% Rinder-Serumalbumin).
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist die Nucleotidsequenz dadurch gekennzeichnet, daß sie die Information trägt, welche für die Bildung eines Proteins mit Ureaseaktivität oder seiner Fragmente erforderlich ist, die einen immunologischen Komplex mit Antikörpern bilden können, die jeweils gegen das Protein mit Ureaseaktivität, wie es von C.pylori exprimiert wird, oder gegen Fragmente desselben gerichtet sind.
  • Die Sequenz der Erfindung ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens einen Teil eines Fragments mit etwa 8 kb umfaßt, das dem Restriktionsfragment EcoRI (ClaI, BamHI)-PstI (HindIII) entspricht.
  • Die Karte der enzyinatischen Restriktion dieses Fragments ist in Fig. 2 gezeigt.
  • Eine besonders bevorzugte Sequenz umfaßt mindestens einen Teil eines Fragments mit etwa 4,2 kb (15%), das von äußeren Nucleotiden begrenzt ist, die jeweils in einer Entfernung von etwa 0,55 kb stromauf des in Fig. 2 gezeigten Ortes H2 und etwa 0,7 kb stromab des in Fig. 2 gezeigten Ortes B1 angeordnet sind.
  • Die dieses Fragment bildenden Sequenzen zeigen die erforderlichen Information für die Expression eines Proteins mit Ureaseaktivität, wie es in der Natur von C.pylori exprimiert wird.
  • Die Expression dieser Sequenzen kann durch sämtliche andere Mikroorganismen erfolgen, die zu ihrem Vorteil die Information, die von diesen Sequenzen getragen wird, ausnutzen können, insbesondere bei einem Stamm Campylobacter, dem in der Natur Gene fehlen, die für die Bildung eines Proteins mit Ureaseaktivität (oder auch ein Stamm von campylobacter-Urease&supmin;) kodieren.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine rekomibante Sequenz, die eine der oben definierten Sequenzen umfaßt, ggf. mit einem Promotor, der die Transkription der Sequenz kontrollieren kann, und eine DNA-Sequenz, die für Signale der Termination der Transkription kodieren.
  • Die Nucleotidsequenzen der Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Sonde hybridisieren können, die ausgehend von der folgenden Sequenz gebildet ist:
  • - der folgenden Kette (I) der Nucleotide
  • - der folgenden Kette (II) der Nucleotide
  • - oder der folgenden Kette (IIbis) von Nucleotiden:
  • - oder von Ketten komplementärer Nucleotide bzw. jeweils von den obengenannten Ketten (I) (II) und (IIbis).
  • Nucleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, daß sie die oben definierten Nucleotidketten enthalten oder aus mindestens einem Teil dieser Ketten gebildet sind.
  • Selbstverständlich können die Basen der hier angesprochenen Nucleotidsequenzen in einer unterschiedlichen Reihenfolge von der in den Genen angetroffenen sein, oder das diese Basen ggf. substituiert sein können, da eine Sonde, die ausgehend von diesen Sequenzen erstellt worden ist, eine charakteristische und unzweideutige Reaktion ergibt, und zwar hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Erkennung der Anwesenheit von Genen, die für das Protein mit Ureaseaktivität von C.pylori kodieren.
  • Jede der Nucleotidsequenz, die mit denjenigen der obengenannten Nucleotidketten hybridisierbar sind, wie diese durch inverse enzymatische Transkription der entsprechenden RNA oder auch durch chemische Synthese erhalten werden, liegen ebenfalls im Umfang der Erfindung.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin eine Nucleotidsequenz, die gemäß dem universalen genetischen Code mindestens einem Teil der folgenden Sequenz (III) von Aminosäuren enspricht:
  • Die Erfindung betrifft weiterhin eine Nucleotidsequenz, die gemäß dem universalen genetischen Code mindestens einem Teil der folgenden Sequenz an Aminosäuren (IV) (kodiert durch die Nucleotidsequenz (IIbis)) entspricht:
  • Die Erfindung betrifft weiterhin rekombinante Expressions- und Klonierungsvektoren, die eine geeignete Wirtszelle transformieren können und mindestens einen Teil einer Nucleotidsequenz wie oben definiert unter der Kontrolle von seine Expression erlaubenden Regulationselementen aufweisen.
  • Bevorzugte rekombinante Vektoren enthalten mindestens einen Teil der obigen Sequenz mit 4,2 kb.
  • Transformierte Stämme von Mikroorganismen gehören ebenfalls in den Rahmen der Erfindung. Diese Stämme weisen eine der oben definierten Nucleotidsequenzen oder auch einen wie oben definierten rekombinanten Vektor auf.
  • Der am 16. August 1988 unter der Nr. I-795 bei der Collection Nationale de Culture des Microorganismes (C.N.C.M.) des Institut Pasteur in Paris (Frankreich) hinterlegte Stamm E.coli S17-1 weist das Plasmid pILL590 mit etwa 16,3 kb auf, das das Restriktionsfragment mit etwa 8 kb EcoRI (ClaI, BamHI)-PstI (HindIII), das oben beschrieben wurde, enthält.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Protein, das ein Ureaseaktivität des Typs aufweist, wie es in der Natur von C.pylori exprimiert wird, sowie peptidische Fragmente dieses Proteins.
  • Das Protein der Erfindung und seine Fragmente entsprechen gemaß dem universalen-genetischen Code den oben definierten Nucleotidsequenzen, insbesondere mindestens einem Teil der Sequenz mit etwa 4,2 kb.
  • Das Protein der Erfindung ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Protein handelt, wie es durch Transformation von Wirtszellen mittels eines wie oben definierten rekombinanten Vektors erhalten wird, indem man die transformierten Wirtszellen in einem geeigneten Medium kultiviert und das Protein aus diesen Zellen oder direkt aus dem Kulturmilieu gewinnt. Die Bildung der Urease oder von Fragmenten derselben in diesem Verfahren stellt ebenfalls einen Teil der Erfindung dar.
  • Das Protein der Erfindung und seine Fragmente, die auch durch chemische Synthese erhalten werden können, weisen vorzugsweise einen erhöhten Reinheitsgrad auf und werden verwendet, um gemäß den klassischen Methoden polyklonale Antikörper zu bilden.
  • So beschaffene polyklonale Antikörper gehören ebenso wie monoklonale Antikörper, die spezifisch das obige Protein und seine Fragmente erkennen können, ebenfalls zu der Erfindung.
  • Die oben definierten Nucleotidsequenzen werden mittels klassischer Methoden der Gentechnik erhalten, und zwar durch Klonierung und Identifizierung der Gene, die für die Synthese eines Proteins mit Ureasewirkung bei C.pylori verantwortlich sind.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin biologische Anwendungen der Nucleotidsequenzen, der entsprechenden Proteine und der monoklonalen oder polyklonalen Antikörper.
  • Diese Anwendungen umfassen die Herstellung aus intragenen Fragmenten von Sonden für den Nachweis von C.pylori. Diese Herstellung umfaßt insbesondere die Denaturierung von doppelsträngigen Sequenzen, um eine einzelsträngige Sequenz zu erhalten, welche als Sonde verwendbar ist.
  • Die mit derartigen Fragmenten durchgeführten Versuche zum Nachweis der eventuellen Anwesenheit von komplementären Sequenzen bei verschiedenen Campylobacter und bei Mikroorganismen, die zu unterschiedlichen Arten gehören, haben die grobe Spezifität dieser Fragmente bewiesen.
  • Die Erfindung betrifft somit Erkennungsonden, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie mindestens einen Teil der oben definierten Nucleotidsequenzen enthalten.
  • Jede Sonde unterscheidet sich von der obigen auf dem Niveau ihrer Nucleotidsequenz nur durch Substitutionen oder Alterationen von Nucleotiden, die keine Veränderung ihrer Eigenschaften der Hybridisierung mit dem Genom von C.pylori im Rahmen der Erfindung bewirken.
  • Das als Sonde verwendete DNA-Fragment trägt eine Anzahl von Nucleotiden, die ausreicht, um die erforderliche Spezifität und die Bildung eines stabilen Hybrids zu ergeben.
  • Es ist möglich, Fragmente zu verwenden, die mehrere kb erreichen; Ergebnisse mit hoher Spezifität werden jedoch ebenso mit kürzeren Fragmenten mit etwa 25 bis 40 Nucleotiden erhalten.
  • Geeignete Sonden für diesen Nachweistyp sind vorzugsweise mit einem radioaktiven Element oder einer anderen Gruppe markiert, die ihre Erkennung im hybridisierten Zustand mit einer die zu untersuchende DNA enthaltenden Zusammensetzung gestattet.
  • Gemäß den klassischen Methoden werden diese Sonden mit einer biologischen Probe, die Bakterien enthält, oder direkt mit diesen Bakterien oder ihren Nucleinsäuren zusammengebracht, und zwar unter Bedingungen, die die eventuelle Hybridisierung der Nucleotidsequenz der Sonde mit einer komplementären Sequenz, die ggf. in dem untersuchten Produkt enthalten ist, gestattet.
  • Man kann z. B. die Hybridisierungsmethode auf Blots durchführen. Diese Methode umfaßt nach der Denaturierung der vorher erhaltenen DNA aus aus antralen Biopsien stammenden Bakterien das Absetzen einer Teilmenge dieser DNA auf Nitrocellulosemembranen, die Hybridisierung jeder Membran mit der Sonde unter den üblichen Bedingungen und den Nachweis auf klassischem Wege des gebildeten Hybrids.
  • Man kann auch eine Hybridisierungsmethode der Replikation gemäß der Southern-Technik verwenden. Diese Methode umfaßt die elektrophoretische Auftrennung an Agarosegelen von DNA-Fragmenten, erzeugt nach der Behandlung der DNA durch Restriktionsenzyme, den Transfer nach der alkalischen Denaturierung auf geeignete Membranen und ihre Hybridisierung mit der Sonde unter den üblichen Bedingungen. Es ist nicht immer erforderlich, eine vorherige Expression der DNA vorzunehmen. Es reicht aus, wenn die DNA für die Sonde zugänglich gemacht wird.
  • Der Nachweis für die spezifische Identifizierung von C.pylori kann ebenfalls mittels DNA-Vermehrungsmethoden (PCR) erfolgen. Diese Methode ist insbesondere in den US-Patenten 4 683 202 und 4 683 195 im Namen der Cetus Corporation beschrieben.
  • Für die Durchführung dieser Methoden verwendet man zwei Primer mit 10 bis 40 Nucleotiden, vorzugsweise etwa 20 Nucleotiden, wobei diese Primer in einer der oben definierten Nucleotidsequenzen enthalten sind oder sich mit einem Teil einer der oben definierten Nucleotidsequenzen oder ihren komplementären Sequenzen hybridisieren können. Vorzugsweise sind diese Primer etwa 200 bis 250 Nucleotide entfernt, wenn sie mit den Strängen der zu vermehrenden DNA hybridisiert (oder verbunden) werden. Eine der Sequenzen kann sich an eine Nucleotidsequenz eines Stranges des zu vermehrenden DNA-Fragmentes binden, wobei diese Sequenz auf dem Niveau eines äußeren Endes dieses Fragmentes angeordnet ist (z. B. das 5'-Ende); die andere Sequenz kann sich an eine Nucleotidsequenz des zweiten Stranges des zu vermehrenden DNA-Fragmentes binden, wobei diese letztere Sequenz auf dem Niveau des äußeren Endes dieses Fragmentes angeordnet ist, das der vorgenannten entgegengesetzt ist (dieses letztere Ende ist in dem vorgeschlagenen Beispiel als 3'-Ende zu bezeichnen).
  • Bevorzugte Primer sind in der Nucleotidsequenz des Restriktionsfragmentes H2-H3 der Fig. 2 enthalten und sind etwa 200 bis 250 Nucleotide entfernt. Es handelt sich insbesondere um Fragmente an dem jeweiligen Ende dieser Restriktionssequenz HindIII-HindIII.
  • Ein Verfahren zum Nachweis in vitro der eventuellen Anwesenheit von C.pylori in einer biologischen Probe umfaßt die folgenden Schritte:
  • - ggf. vorherige Amplifikation der Menge der Nucleotidsequenzen, die in der Probe vorhanden sein können, durch Zusammenbringen dieser Probe mit Primer, wie sie oben beschrieben wurden, wobei diese Primer sich jeweils einerseits an das 5'-Ende eines Stranges der genannten Nucleotidsequenz und andererseits an das 3'-Ende des anderen Stranges der genannten Nucleotidsequenz binden können, wobei sich an dieses Zusammenbringen eine Stufe der Genamplifikation in Gegenwart einer DNA-Polymerase und von vier Nucleosid-Triphosphaten dATP, dCTP, dGTP, dTTP anschließt und die Operationen der Hybridisierung der Primer und der Genamplifikation mehrfach wiederholt werden,
  • - Zusammenbringen der zu untersuchenden biologischen Probe mit einer Nucleotidsonde gemäß der Erfindung, und zwar unter Bedingungen, die die Bildung eines zwischen der Sonde und der Nucleotidsequenz ausgebildeten Hybridisierungskomplexes gestatten,
  • - die Bestimmung des Hybridisierungskomplexes.
  • Die Erfindung stellt somit ein Mittel zur Verfügung, mit dem rasch C.pylori in situ und in der Umwelt bestimmt werden kann, und zwar mit grober Spezifität, ohne daß man mit Kulturen arbeiten muß.
  • Solche Mittel zum Nachweis sind besonders nützlich bei der Untersuchung des natürlichen Reservoirs dieser Bakterien, den Übertragungswegen, der Zirkulation und der Kontamination. Weiterhin kann bei der Diagnose in vitro an Biopsien der Einsatz dieser Sonden einen erheblichen Zeitgewinn ermöglichen, und zwar im Vergleich zu den gegenwärtig üblichen Methoden, die zudem eine Technologie erfordern, die nur von spezialisierten Institutionen ausgeführt werden kann, nämlich bakteriologische Methoden oder solche, in denen die Elektronenmikroskopie verwendet wird.
  • Es werden reproduzierbare Ergebnisse erhalten, wenn man als intragene Sonde das oben definierte Fragment mit etwa 8 kb verwendet.
  • Unter Berücksichtigung ihrer Spezifität im Bezug auf C.pylori stellen diese Sonden ebenfalls ein besonders interessantes Werkzeug dar.
  • Zur Untersuchung der pathogenen Potenz von C.pylori, um eine Infektion zu verhindern, ist es auch möglich, die von C.pylori gespielte Rolle bei der Entwicklung von ulzerierenden Erkrankungen zu untersuchen und die genetischen Determinanten zu identifizieren, die bei der pathogenen Potenz dieser Organismen in Hinblick auf die Bildung in vitro von isogenen Mutanten von C.pylori eine Rolle zu spielen scheinen, d. h. genetisch modifizierte Bakterien in jeder der Determinanten, die eine Rolle bei der Pathogenese der Infektion zu spielen scheinen, bzw. Mutanten, die an Tiermodellen getestet werden könnten.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin den Nachweis des Polymorphismus von Genen, die für die Urease bei C.pylori kodieren, mit Hilfe der oben definierten Nucleotidsonden und geeigneten Restriktionsenzymen. Die Bedingungen, unter denen dieser Nachweis durchgeführt wird, sind eingehend in der Veröffentlichung von J.F. Gusella in J. of Clin. - Investigations (1986), 77, 1723-1726, beschrieben worden.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin immunologische Anwendungen des kodierten Proteins, insbesondere für die Entwicklung eines spezifischen Antiserums und auch polyklonaler und monoklonaler Antikörper. Die polyklonalen Antikörper werden gemäß den klassischen Methoden durch Injektion des Proteins in Tiere, Gewinnung der Antisera sowie anschließend der Antikörper ausgehend von den Antisera, z. B. durch Affinitatschromatographie.
  • Die monoklonalen Antikörper werden in üblicher Weise hergestellt, indem Myelomzellen mit Rattenzellen von Tieren, die vorher mit Hilfe von Proteinen gemäß der Erfindung immunisiert wurden, fusioniert werden.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Nachweis in vitro der eventuellen Anwesenheit von C.pylori in einer dieses möglicherweise enthaltenden Probe. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt:
  • - Zusammenbringen der Probe mit einem Antikörper gemäß der Erfindung unter Bedingungen, die die Bildung eines immunologischen Komplexes, ausgebildet zwischen dem gesamten Protein mit Ureaseaktivität oder einem Teil desselben, gebildet von C.pylori, und diesem Antikörper gestatten, und
  • - Bestimmung des immunologischen Komplexes.
  • Für die Durchführung der Verfahren zum Nachweis in vitro, die oben auf der Basis der Verwendung von Nucleotidsonden erwähnt wurden, kann man vorzugsweise auf Necessaires oder Kits zurückgreifen, die folgendes umfassen:
  • - ggf. mindestens ein Paar von Primern gemäß der Erfindung,
  • - eine vorbestimmte Menge einer Nucleotidsonde gemäß der Erfindung,
  • - vorzugsweise ein für die Ausbildung einer Hybridisierungsreaktion zwischen der zu bestimmenden Sequenz und der Sonde jeweils geeignetes Medium,
  • - vorzugsweise Reaktanten, die den Nachweis der gebildeten Hybridisierungskomplexe zwischen der Nucleotidsequenz und der Sonde in Folge der Hybridisierungsreaktion gestatten.
  • Zur Durchführung der obengenannten Nachweisverfahren in vitro auf der Basis der Verwendung von Antikörpern kann man vorzugsweise auf Necessaires oder Kits zurückgreifen, die folgendes umfassen:
  • - eine vorbestimmte Menge eines Antikörpers gemäß der Erfindung,
  • - vorzugsweise ein Medium, das zur Ausbildung einer immunologischen Reaktion zwischen mindestens einem Teil des Proteins mit Ureaseaktivität, gebildet von einem C.pylori-Stamm, und dem Antikörper geeignet ist,
  • - vorzugsweise Reaktanten, die die Erkennung der zwischen mindestens einem Teil des Proteins mit Ureaseaktivität und dem Antikörper aufgrund der immunologischen Reaktion gestatten.
  • Eine eingehende Untersuchung des obengenannten Fragments mit 4,2 kb ermöglichte die Lokalisation der Strukturgene, die für die wichtigen polypeptidischen Untereinheiten der Urease von C.pylori kodieren.
  • Diese Untersuchung wurde durchgeführt, indem Mutanten in rekombinanten Plasmiden, eingeführt in E.coli und C.jejuni, konstruiert wurden, die nicht in der Lage sind, Urease zu synthetisieren (Baskerville-A, Newell D. (1988), Gut.29, 465-472). Das System der Transkription/Traduktion in vitro von E.coli und ein System zur Expression in Minizellen wurde schließlich verwendet, um innerhalb des 4,2 kb-Fragmentes von C.pylori die Gesamtheit der für die Untereinheiten der Urease kodierenden Gene zu identifizieren und zu lokalisieren: zwei Hauptproteine von 26 kDa und 61 kDa wurden identifiziert. Parallel dazu wurde nach verschiedenen Deletionen innerhalb des 4,2 kb-Fragmentes ein Transfersystem durch Konjugation eines Stammes von E.coli mit C.jejuni (von einem in der eingehenden folgenden Beschreibung erläuterten Typ) verwendet, um die für die Expression der Ureaseaktivität notwendigen Regionen zu identifizieren und die Deletion einer Region mit dem Verschwinden eines Polypeptids und dem Verlust der Ureaseaktivität zu korrelieren. Es wurde so bestimmt, daß die Gene, die für die Expression der Ureaseaktivität erforderlichen zwei Polypeptide kodieren, sich in der zentralen Region von 3,35 kb befinden, und zwar stromab des Ortes H3 gemäß Fig. 2 und auf B1. Die Transkription der für die Polypeptide mit 61 kDa oder mit 26 kDa kodierenden Gene erfolgt in der Richtung EcoRI- PstI. Das Fragment von 3,35 kb ist notwendig, jedoch nicht ausreichend für die Expression der Ureaseaktivität bei C.jejuni. Eine benachbarte Region von 0,85 kb, angeordnet stromauf und anscheinend nicht mit der Expression von Polypeptiden bei E.coli assoziiert, ist für die Expression der Ureaseaktivität bei C.jejuni erforderlich.
  • Die Analyse der Mutanten der Deletion durch in vitro-Transkription/Traduktion ermöglichte die Beobachtung, daß die zwei Polypeptide mit 26 und 61 kDa durch zwei Fragmente von benachbarter DNA kodiert werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die gesamte, folgende Nucleotidsequenz (V) oder einen Teil derselben.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin die gesamte entsprechende Nucleotidsequenz gemäß dem universalen genetischen Code bis zu mindestens einem Teil der folgenden Aminosäuresequenz (VI) mit 26 kDa (kodiert durch Nucleotidsequenz (V)): 239 Aminosäuren Molekulargewicht: 26.522 Dalton
  • Die Erfindung betrifft weiterhin die ganze folgende Nucleotidsequenz (VII) oder einen Teil derselben:
  • Die Erfindung betrifft weiterhin die gesamte nucleotidische Sequenz, die gemäß dem universalen genetischen Code mindestens einem Teil der folgenden Aminosäuresequenz (VIII) von 61 kDa (kodiert durch die Nucleotidsequenz (VI)) entspricht: 569 Aminosäuren Molekulargewicht: 61.729 Dalton
  • Der Vergleich der Aminosäuresequenz (VIII) mit derjenigen der Urease aus Bohnen (Jack Bean), insbesondere beschrieben in Eur. J. Biochem. 175, 151-165 (1988), zeigt in unerwarteter Weise ein hohes Ausmaß an Homologien der Aminosäuren. Die Bewahrung dieser Struktur hat es den Erfindern gestattet, das aktive Zentrum der Urease-Untereinheit von 61 kDa zu ermitteln, das vollständig oder teilweise in der polypeptidischen Sequenz enthalten ist, welche von den Aminosäuren begrenzt wird, die an den Positionen 206 und 338 der oben beschriebenen Sequenz VIII angeordnet sind.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin die gesamte nucleotidische Sequenz IX oder einen Teil derselben, die nacheinander von der Sequenz V und der Sequenz VII gebildet ist.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin die gesamte Nucleotidsequenz, die gemäß dem universalen genetischen Code mindestens einem Teil der Sequenz von Aminosäuren (X) von 87 kDa, welche nacheinander von der Sequenz VI und VIII gebildet ist, entspricht.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin Sonden zum Nachweis der möglichen Anwesenheit von C.pylori in einer biologischen Probe, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie mindestens einen Teil einer der oben definierten Nucleotidsequenz enthalten.
  • Selbstverständlich können die Basen der interessierenden Nucleotidsequenzen in einer unterschiedlichen Reihenfolge von derjenigen auftreten, die in den Genen gefunden wird, und/oder diese Basen können ggf. substituiert sein, wenn eine ausgehend von diesen Sequenzen konstruierte Sonde eine charakteristische und unzweideutige Reaktion ergibt, und zwar hinsichtlich der Fähigkeit zum Erkennen der Anwesenheit von Genen, die für das Protein mit Ureaseaktivität von C.pylori kodieren.
  • Jede Nucleotidsequenz, die mit den obengenannten Nucleotidketten, wie sie bei der inversen enzymatischen Transkription der entsprechenden RNA oder auch durch chemische Synthese erhalten wird, hybridisierbar ist, gehört ebenfalls in den Umfang der vorliegenden Erfindung.
  • Jede Sonde, die sich von der vorhergehenden nur auf dem Niveau ihrer Nucleotidsequenz durch Substitutionen oder Alterationen unterscheidet, welche keine Veränderungen seiner Eigenschaften zur Hybridisierung mit dem Genom von C.pylori führt, fällt in den Umfang der Erfindung.
  • Die obengenannten Sonden können bei in-vitro-Diagnoseverfahren zur eventuellen Feststellung der Anwesenheit von C.pylori in einer biologischen Probe, wie oben beschrieben, verwendet werden.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin nucleotidische Primer mit etwa 10 bis etwa 40 Nucleotiden, wobei die Primer in einer obigen Nucleotidsequenzen V oder VII enthalten sind (oder in einer der von diesen Sequenzen V und VII abgeleiteten Sequenzen) und mit einem Teil der obengenannten Nucleotidsequenzen oder mit ihren komplementären Sequenzen (insbesondere unter den oben definierten Hybridisierungsbedingungen) hybridisieren können.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung dieser Primer in den oben definierten in-vitro-Diagnoseverfahren zur vorherigen Vermehrung der Menge der Nucleotide von C.pylori, die in der biologischen Probe vorhanden sein können, gemäß dem oben beschriebenen Verfahren.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin rekombinante Expressions- und Klonierungsvektoren, die eine geeignete Wirtszelle transformieren können und die gesamte Nucleotidsequenz oder einen Teil derselben, identisch mit oder abgeleitet von den obigen Nucleotidsequenzen V, VII und IX, aufweisen.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen, die den gesamten, obigen Sequenzen VI, VIII und X oder einem Teil derselben entsprechen, wobei das Verfahren die Transformation von geeigneten Wirtszellen (insbesondere die oben beschriebenen) umfaßt, mit Hilfe der obengenannten Vektoren, sowie die Gewinnung der so hergestellten Proteine, ggf. gefolgt von einer Reinigungssstufe für diese Proteine.
  • Das Verfahren zur Herstellung der obigen Proteine umfaßt ggf. eine Vorstufe zur Vermehrung des für das Protein kodierenden Gens, dessen Herstellung untersucht wird, wobei diese Stufe mit Hilfe von Paaren von Primern gemäß der Erfindung ausgeführt wird, gemäß dem oben beschriebenen Verfahren.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin Polypeptide (oder Proteine), die von den oben beschriebenen Nucleotidsequenzen kodiert werden. Insbesondere betrifft die Erfindung die Aminosäuresequenz X mit 87 kDa, die Sequenz VI mit 26 kDa und die Sequenz VIII mit 61 kDa, die oben beschrieben worden sind, sowie Fragmente derselben.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin polyklonale und monoklonale Antikörper, die gegen die gesamten, oben beschriebenen Polypeptide oder Teile derselben gerichtet sind und die mit diesen einen immunologischen Komplex ausbilden können.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, die mit Hilfe einer Peptidsequenz von mindestens 10 bis 15 Aminosäuren der Sequenz VI oder der Sequenz VIII erhalten worden sind.
  • Bevorzugte monoklonale Antikörper der Erfindung sind gegen die gesamte Sequenz, begrenzt durch die Aminosäuren, die in den Positionen 206 und 338 der Sequenz VIII angeordnet sind, oder Teile derselben gerichtet, insbesondere diejenigen, die mit Hilfe einer Peptidsequenz von mindestens etwa 10 bis 15 Aminosäuren aus der Sequenz, die durch die in den Positionen 206 und 338 der Sequenz VIII angeordneten Aminosäuren begrenzt ist, erhalten wurden.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der obengenannten Antikörper für die Durchführung von in-vitro- Diagnoseverfahren sowie in-vitro-Diagnosekits für Infektionen eines Individuums mit C.pylori, wie dies oben beschrieben worden ist.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin immunogene Zusammensetzungen, die das ganze, oben beschriebene Polypeptid oder Teile desselben enthalten, und insbesondere die gesamte Polypeptidsequenz oder Teile derselben, die von den in den Positionen 206 und 338 der Sequenz VIII angeordneten Aminosäuren begrenzt ist, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
  • Solche immunogenen Zusammensetzungen können als Impfstoffzusammensetzungen für die Verhinderung der Infektion eines Individuums durch C.pylori verwendet werden.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen wie oben beschriebenen Antikörper (oder mehrere) enthalten, und insbesondere Antikörper, die einen immunologischen Komplex mit der ganzen Peptidsequenz oder einem Teil derselben ausbilden können, die von den an den Positionen 206 und 338 der Sequenz VIII angeordneten Aminosäuren begrenzt ist, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
  • Solche pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können für die Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, welche mit der Infektion eines Individuums durch C.pylori verbunden sind, insbesondere Gastritis sowie gastrische und duodenale Geschwüre.
  • Weitere Vorteile und charakteristische Eigenschaften der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung, die die Klonierung der verantwortlichen Gene für die Produktion des Proteins mit Ureaseaktivität bei C.pylori, die Sequenzierung der mit der Expression des Proteins mit Ureaseaktivität assoziierten Region und die Spezifität der Nucleotidsonden für den Nachweis von C.pylori betrifft.
  • In dieser Beschreibung wird auf die Fig. 1 und 2 Bezug genommen, die zeigen:
  • - Fig. 1 die Restriktionskarte eines PstI-EcoRI-Fragmentes des rekombinaten Cosmids IID2, das die für die Expression der Urease bei C.jejuni erforderliche Information trägt, und
  • - Fig. 2 die Restriktionskarte eines Fragmentes mit etwa 8 kb von pILL590.
  • 1) Herstellung einer Genbank in einem cosmidischen Pendelvektor; Klonierung der mit der Bildung von Urease bei C.pylori befaßten Genen.
  • Die Chromosomen-DNA des Stammes C.pylori (85P) wird hergestellt, um DNA-Fragmente hohen Molekulargewichts zu erzeugen; etwa 300ug dieser Chromosomen-DNA wird einem partiellen, kontrollierten Verdau durch die Restriktionsendonuclease Sau3A unterworfen und auf einen Zuckergradienten gebracht, um selektiv die Verdaufragmente zu isolieren, die zwischen 35 und 45 Kilobasen vorhanden sind. 1,5 ug dieser Fragmente werden in vitro mit den Pendelvektor-Cosmid pILL575, linearisiert durch die Endonuclease BamHI und dephosphoryliert, ligiert. pILL575 wurde aus dem Pendelcosmid pILL550 konstruiert, das von Labigne-Roussel et al. in J. Bacteriol. 169:5320-5323, 1987, beschrieben wurde, und in dem der Ort "cos" des Phagen lambda insertiert wurde (Fragment Bgl II mit 1,7 kb von pERG153, insertiert am Ort Pvu II von pILL550); es ist somit durch Konjugation mobilisierbar, kodiert für eine Kanamycin-Resistenz, die sich gleichzeitig bei E.coli und bei Campylobacter (Kmr) exprimiert und sich gleichzeitig bei E.coli und bei C.jejuni wegen der Anwesenheit der zwei Replikationsursprünge repliziert, die eine funktionell ausschließlich bei E.coli und die andere ausschließlich bei Campylobacter. Die Produkte dieser Ligation werden in vitro in lambda-Teilchen eingebracht und anschließend durch Transfektion in einen E.coli-Stamm eingeführt, welcher ein Plasmid IncP enthält, das in trans die Funktionen des Transfers der rekombinanten Cosmide komplementieren kann. Die Kolonien der infektierten und kanamycin-resistenten E.coli werden sofort einzeln bei -80ºC konserviert; eine cosmidische Genbank, die repräsentativ für das ganze Genom von Campylobacter pylori ist, wird bei E.coli hergestellt, indem man etwa 500 unabhängige K1one konserviert.
  • Jedes der rekombinanten Cosmide wird danach durch Konjugation von E.coli mit einem Empfängerstamm von Campylobacter jejuni C31, natürlich Urease&supmin;, transferiert.
  • Für jedes dieser Transkonjugate, die gegenüber Kanamycin resistent sind, wird verifiziert, daß es eine Synthese einer Urease durch Campylobacter jejuni gibt.
  • Unter 106 Analyseobjekten wurde eines isoliert, das eine genetische Information trägt, die Campylobacter jejuni C31 die Fähigkeit verleiht, eine Urease zu produzieren. Das rekombinante Cosmid (IID2) hat eine Größe von 54 Kilobasen. Die relative Anordnung der Spaltungsorte durch die Restriktionsendonucleasen PstI, BamHI, SmaI und EcoRI auf dieser Sequenz wird in Fig. 1 wiedergegeben.
  • 2) Identifizierung des oder der Gene, die für die Produktion für Urease bei Campylobacter pylori erforderlich sind.
  • Die Subklonierung der Ureasegene erfolgt, indem man ausgehend von der Cosmid-DNA IID2, hergestellt bei E.coli, einen partiellen Verdau durch die Endonuclease Sau3A durchführt, um Fragmente eines partiellen Verdaus zu erzeugen, die von 8 bis 15 Kilobasen gehen. Man sucht das kleinste Hybridplasmid, kloniert bei E.coli, das die Fähigkeit zur Produktion einer Urease nach seinem Transer durch Konjugation auf einem Campylobacter-Empfänger verleiht.
  • Vier Plasmide unter 37 getesteten tragen die erforderliche Information für die Expression der Urease bei Campylobacter Ieiuni: pILL586, pILL587, pILL589 und pILL590 (vgl. Fig. 2).
  • Durch Vergleich der Restriktionskarten dieser vier Hybride kann man die Anwesenheit einer Nucleotidsequenz von 4,2 Kilobasen feststellen, die den vier Hybriden gemeinsam ist; dies legt nahe, daß es sich dabei um die Region handelt, die für die Expression der Urease erforderlich ist. Eine gewisse Anzahl von Deletionen wurden vorgenommen, die diese Rückschlüsse bestätigen (vgl. Fig. 2).
  • Das Fragment EcoRI-PstI von pILL590 wurde als Sonde bei den Hybridisierungen mit der Gesamt-DNA von C.pylori 85P verwendet, um sicher zu gehen, daß die unterschiedlichen Restriktionsfragmente, die mit BamHI und HindIII aus pILL590 hergestellt wurden, im 85P vorhanden waren. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die Sequenz von 8 kb, die in pILL590 vorhanden ist, im Verlauf der unterschiedlichen Klonierungsschritte keinen Umlagerungen unterworfen wurde.
  • 3) Nucleotidsequenz der mit der Expression von der Urease assoziierten Region.
  • Die Sequenz des Fragmentes HindIII, die zwischen den Orten H2 und H3 enthalten ist, entspricht der Sequenz der 294 Nucleotide der Kette (I).
  • Die folgende Sequenz von 610 Nucleotiden der Kette (II) liegt innerhalb des Fragmentes, das von den Orten H4 und B1 definiert wird (Fig. 2).
  • 4) Spezifität der Nucleotidsonden für den Nachweis von Campylobacter pylori.
  • Das Fragment EcoRI-PstI von 8 kb, das aus pILL590 stammt, wurde als radioaktive Sonde für Hybridisierungsexperimente verwendet.
  • 32 Campylobacter pylori wurden in der Hybridisierung auf Kolonien untersucht und ergaben ein positives Signal; unter 35 Campylobacter jejuni ergaben die untersuchten fetus und coli kein positives Signal unter den stringenten, klassischen Bedingungen der Hybridisierung (50% Formamid, 37º, 3XSSC).
  • Unter den gleichen Bedingungen ergab die Sonde C.pylori mit 8 Kilobasen kein positives Signal mit der Liste der folgenden Mikroorganismen, die in der Natur sämtlich Ureaseproduzenten sind:
  • Klebsiella oxytoca (3 Stämme), Klebsiella pneumoniae (3 Stämme), Proteus mirabilis (3 Stämme), Proteus morganii (3 Stämme), Proteus rettgeri (3 Stämme), Proteus vulgaris (2 Stämme), Providencia stuartii (3 Stämme), Pseudomonas picketti (3 Stämme), Yersinia enterocolitica (3 Stämme), 5 Stämme von Acinetobacter Urease&spplus;, 2 Stämme von Echerichia coli Urease&spplus; und 3 Stämme von Citrobacter freundii Urease&spplus;.
  • Das Fehlen von falsch-positiven Ergebnissen mit dem 8 kb-Fragment garantiert die Spezifität der hier vorgeschlagenen Nucleotidsonden.
  • Ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern umfaßt folgendes:
  • - die Immunisierung eines Tieres mit Hilfe eines wie oben definiertes Polypeptids und
  • - die Gewinnung der gebildeten Antikörper nach den klassischen Methoden.
  • Ein geeignetes Verfahren zur Herstellung von Nucleinsäuren (enthaltend maximal 200 Nucleotide - oder pb, da es sich um bicatenare Nucleinsäuren handelt) gemäß der Erfindung auf chemischem Wege umfaßt die folgenden Schritte:
  • - die DNA-Synthese unter Verwendung der automatisierten Methode der β-Cyanethylphosphoramidite, beschrieben in Bioorganic Chemistry 4; 274-325, 1986,
  • - die Klonierung der so erhaltenen DNA in einem geeigneten Plasmidvektor, und die Gewinnung der DNA durch Hybridisierung mit einer geeigneten Sonde.
  • Ein Herstellungsverfahren auf chemischem Wege für Nucleinsäuren mit einer Länge von mehr als 200 Nucleotiden - oder pb (da es sich um bicatenare Nucleinsäuren handelt) umfaßt die folgenden Schritte:
  • - die Zusammenführung von chemisch synthetisierten Oligonucleotiden, die an ihren äußeren Enden unterschiedliche Restriktionsorte aufweisen, deren Sequenzen mit der Kette in den Aminosäuren des natürlichen Polypeptids verträglich sind, gemäß dem Prinzip, das in Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80; 7461-7465, 1983, beschrieben wurde,
  • - die Klonierung der so erhaltenen DNA in einem geeigneten Plasmidvektor und die Gewinnung der gesuchten Nucleinsäure durch Hybridisierung mit einer geeigneten Sonde.

Claims (26)

1. Nucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie in ihrer Struktur eine für ein Protein mit Ureaseaktivität, wie von C. pylori exprimiert, kodierende Sequenz enthält oder mit der genannten Kodierungssequenz hybridisieren kann, welche in einem Fragment Eco R1 (CLAI, BamH1) - PstI (Hindlll) von etwa 8 kb enthalten ist, dessen enzymatische Restriktionskarte in Figur 2 wiedergegeben ist.
2. Nucleotidsequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einem Teil eines Fragments von etwa 4,2 kb (± 5%), begrenzt von äußeren Nucleotiden enthalten ist, die jeweils in einer Entfernung von etwa 0,55 kb stromauf des Ortes H2 und von etwa 0,7 kb stromab des Ortes B1, wie in Figur 2 wiedergegeben, angeordnet sind.
3. Rekombinante Nucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 enthält, gegebenenfalls assoziiert mit einem Promotor, der die Transkription der Sequenz kontrollieren kann, und mit einer DNA-Sequenz, die für Terminationssignale der Transkription kodiert.
4. Nucleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Nucleotidsonde hybridisieren kann, welche ausgehend von einer Sequenz mit
- der folgenden Kette (I) von Nucleotiden
oder der folgenden Kette (IIbis) von Nucleotiden
oder der folgenden Kette (V) von Nucleotiden
oder der folgenden Kette (VII) von Nucleotiden
oder von Ketten komplementärer Nucleotide bzw. jeweils von den obengenannten Ketten (I), (II), (V) und (VII) gebildet ist.
5. Nucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nucleotidkette gemäß Anspruch 4 enthält oder daß sie aus mindestens einem Teil dieser Kette besteht, soweit sie zur eindeutigen Erkennung der Anwesenheit einer Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 befähigt ist.
6. Nucleotidsequenz entsprechend gemäß dem universalen genetischen Code der folgenden Sequenz (III) von Aminosäuren:
7. Nucleotidsequenz entsprechend gemäß dem universalen genetischen Code der folgenden Sequenz (IV) von Aminosäuren:
8. Nucleotidsequenz entsprechend gemäß dem universalen genetischen Code der folgenden Sequenz (VI) von Aminosäuren:
9. Nucleotidsequenz entsprechend gemäß dem universalen genetischen Code der folgenden Sequenz (VIII) von Aminosäuren:
10. Nucleotidsequenz gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Information trägt, welche für die Produktion eines Proteins mit Ureaseaktivität oder Fragmenten desselben, die einen immunologischen Komplex mit Antikörpern jeweils gegen das Protein mit Ureaseaktivität, wie es von C.pylori exprimiert wird, oder gegen Fragmente desselben bilden können, erforderlich ist.
11. Rekombinanter Vektor, insbesondere rekombinantes Plasmid oder Cosmid, der eine geeignete Wirtszelle transformieren kann und der eine Nucleotidsequenz gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 10 enthält, gegebenenfalls unter der Kontrolle von Regulationselementen, die die Expression dieses Fragments in der Wirtszelle gestatten.
12. Plasmid pILL590, getragen vom Stamm E.coli S17-1, hinterlegt am 16. August 1988 unter der Nummer I-795 bei der C.N.C.M.
13. Mikroorganismenstamm, transformiert mit Hilfe mindestens eines Vektors gemäß den Ansprüchen 11 oder 12 oder mit einer Nucleotidsequenz gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 10.
14. Protein mit Ureaseaktivität vom Typ des bei C.pylori exprimierten und seine peptidischen Fragmente, entsprechend gemäß dem universalen genetischen Code den Nucleotidsequenzen gemäS einem jeden der Ansprüche 1 bis 10.
15. Protein mit Ureaseaktivität vom Typ des bei C.pylori exprimierten, erhalten durch Transformation von Wirtszellen mittels eines kombinanten Vektors gemäß den Ansprüchen 11 oder 12, Kultivierung der transformierten Wirtszellen in einem geeigneten Medium und Gewinnung der Urease aus diesen Zellen oder direkt aus dem Kulturmedium.
16. Polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen das ganze oder einen Teil des Proteins oder seine Fragmente gemäß den Ansprüchen 14 oder 15 gerichtet ist.
17. Polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen die ganze oder einen Teil der von den in den Positionen 206 und 338 der Sequenz VII gemäß Anspruch 9 angeordneten Aminosäuren bestimmten Sequenz gerichtet ist.
18. Erkennungssonde, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nucleotidsequenz gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 10 umfaßt.
19. Verfahren zum Nachweis in vitro der Anwesenheit von C.pylori in einer dieses möglicherweise enthaltenden Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt:
- gegebenenfalls vorherige Vermehrung einer Sequenz gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 12, die sich möglicherweise in Probe befindet, mit Hilfe von Primern, die einerseits an das 5'-Ende und andererseits an das 3'-Ende des anderen Stranges der Nucleotidsequenz binden können;
- Zusammenbringen der obengenannten biologischen Probe mit einer Nucleotidsonde gemäß Anspruch 18 unter Bedingungen, die die Bildung eines zwischen der genannten Sonde und der genannten Nucleotidsequenz ausgebildeten Hybridisierungskomplexes gestatten;
- Erkennung des genannten Hybridisierungskomplexes.
20. Verfahren zum Nachweis in vitro der Anwesenheit von C.pylori in einer dieses möglicherweise enthaltenden biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es folgendes umfaßt:
- Zusammenbringen der Probe mit einem Antikörper gemäß dem Anspruch 16 oder 17 unter Bedingungen, die die Bildung des immunologischen Komplexes, ausgebildet zwischen dem Protein mit Ureaseaktivität, gebildet von C.pylori, und diesem Antikörper, gestatten
- Erkennung des immunologischen Komplexes.
21. Necessaire oder Kit für die Durchführung eines Verfahrens zur Erkennung in vitro der möglichen Anwesenheit von C.pylori in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es folgendes umfaßt:
- eine vorbestimmte Menge einer Nucleotidsonde gemäß Anspruch 18,
- vorzugsweise ein geeignetes Medium für die Ausbildung einer Hybridisierungsreaktion zwischen der zu erkennenden Sequenz und der obengenannten Sonde,
- vorzugsweise Reaktanten, die die Erkennung der zwischen der Nucleotidsequenz und der Sonde ausgebildeten Hybridisierungskomplexe im Verlauf der Hybridisierungsreaktion gestatten.
22. Necessaire oder Kit für die Durchführung eines Verfahrens zur Erkennung in vitro der möglichen Anwesenheit von C.pylori in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es folgendes umfaßt:
- eine vorbestimmte Menge eines Antikörpers gemäß den Ansprüchen 16 oder 17,
- vorzugsweise ein Medium, das zur Ausbildung einer immunologischen Reaktion zwischen mindestens einem Teil eines Proteins mit Ureaseaktivität, gebildet durch einen Stamm von C.pylori, und dem Antikörper geeignet ist,
- vorzugsweise Reaktanten, die die Erkennung der zwischen mindestens einem Teil des Ureaseproteins und dem Antikörper im Verlauf der immunologischen Reaktion gebildeten immunologischen Komplexe gestatten.
23. Verwendung als Primer in DNA-Vermehrungstechniken vom PCR-Typ oder anderen von zwei Nucleotidsequenzen mit mindestens etwa 20 Nucleotiden, enthalten in einer der Sequenzen gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 10 und angeordnet im Abstand von etwa 200 bis 250 Nucleotiden, wobei die eine der Sequenzen an das 5'-Ende einer Kette der zu vermehrenden Sequenz und die andere Sequenz an das 3'-Ende der anderen Kette binden kann.
24. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie Antikörper gemäß dem Anspruch 16 oder 17 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
25. Immunogene Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Ganze oder einen Teil eines Proteins gemäß Anspruch 14 oder gemäß Anspruch 15 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
26. Zusammensetzung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß sie die ganze oder einen Teil der von den an den Positionen 206 und 338 angeordneten Aminosäuren der Sequenz VII gemäß Anspruch 9 begrenzten Sequenz umfaßt.
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