JP2628767B2 - ウレアーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列 - Google Patents

ウレアーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はCampylobacter pyloriで天然に発現されるよ
うなウレアーゼをコードするヌクレオチド配列、及び特
に人体又は環境中におけるC.pyloriの検出のための、該
ヌクレオチド配列の生物学的適用に係る。
C.pyloriは今日、人体の胃の腔部分の粘膜の表面、よ
り特定的には胃及び十二指腸潰瘍の病変部及びクレータ
ーの周囲のみに見いだされるグラム陰性菌である。人口
の25％はC.pyloriの保菌者であり、そのうち８％は潰瘍
患者、９％は非潰瘍性の消化不良患者、８％は無症候保
菌者である。
今日単離及び報告されている全C.pyloriは次の３つの
特性を有する。
該細菌は高い活性を有するウレアーゼを産生する。
該細菌は胃の粘膜の上皮細胞に非常に強く密着し、こ
の特性はin vitroでヒーラー細胞に非常に強く密着する
ことを意味する。
C.pyloriは、粘液を分解し、従って胃粘膜を保護する
自然障壁を弱めるタンパク分解活性を有する酵素を産生
及び放出する。
しかしながら、人体及び環境中でC.pyloriをin situ
で検出し、その病原能（該細菌は人体で活性な胃炎に関
与すると考えられる）を検査するには、この細菌の培養
が困難であるという問題がある。
該細菌は増殖速度が非常に遅く（血液寒天培地で６〜
７日）、微好気性条件で増殖しなければならず、空気中
の酸素は有毒である。
本発明者らはこの細菌の検出手段を研究した結果、C.
pyloriでウレアーゼの産生に関与する遺伝子を同定する
に至った。
遺伝子内フラグメントのヌクレオチド配列を決定する
ことにより、C.pyloriの特異的同定のための検出用プロ
ーブとして使用可能なツールを取得するに至った。
従って、本発明の目的は、C.pyloriで発現されるよう
なウレアーゼ活性を有するタンパク質をコードすること
が可能な新規ヌクレオチド配列を提供することである。
本発明の別の目的は、C.pyloriの検出用プローブとし
て使用可能なこの配列のフラグメントを提供することで
ある。
本発明の更に別の目的は、C.pyloriで発現されるよう
なウレアーゼ活性を有する高純度のタンパク質、及びこ
のタンパク質のフラグメントを提供することである。
本発明のヌクレオチド配列は、C.pyloriで発現される
ようなウレアーゼ活性を有するタンパク質をコードする
配列の少なくとも一部を含むことを特徴とする。
本発明のより特定的な目的は、Denhardt媒質（１％Fi
coll、１％ポリビニルピロリドン、１％ウシ血清アルブ
ミン）中、68℃、６×SSC（１×SSCは0.15MのNaClと0.0
15Mのクエン酸ナトリウムpH7とから構成される）の条件
下で、C.pyloriで発現されるようなウレアーゼで活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子とハイブリダイズ
することが可能なヌクレオチド配列を提供することであ
る。
本発明の別の態様によるとヌクレオチド配列は、夫々
C.pyloriで発現されるようなウレアーゼ活性を有するタ
ンパク質又は該タンパク質のフラグメントに対する抗体
との間で免疫複合体を形成することが可能な、ウレアー
ゼ活性を有するタンパク質又はそのフラグメントの産生
に必要な情報を担持することを特徴とする。
本発明の配列は更に、EcoR I（Cla I、BamH I）−Pst
I（Hind III）制限フラグメントに対応する約8kbのフ
ラグメントの少なくとも一部を含むことを特徴とする。
このフラグメントの酵素制限地図を第２図に示す。
特に好適な配列は、第２図のH2部位から約0.55kb上
流、及び第２図のB2部位から約0.7kb下流に夫々配置さ
れた末端ヌクレオチドにより画定される約4.2kb（±５
％）のフラグメントの少なくとも一部を含む。
尚、第２図中のB1,B2,B3は制限酵素BamH Iによる切断
部位を示すものである。
このフラグメントにより構成される配列は、C.pylori
で天然に発現されるようなウレアーゼ活性を有するタン
パク質の発現に必要な情報を担持する。
これらの配列の発現は、これらの配列に担持される情
報を利用することが可能な他の全微生物、特にウレアー
ゼ活性を有するタンパク質の産生をコードする遺伝子を
元々欠失するCampylobacter株（又はウレアーゼ− campy
lobacter株）で生じ得る。
更に別の態様によると、本発明は上記配列の１つの、
場合により該配列の転写を調節することが可能なプロモ
ーター及び転写終結信号をコードするDNA配列とを組み
合わせて含む組換体配列に係る。
本発明のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド連鎖
（Ｉ）： 又はヌクレオチド連鎖（II）： 又はヌクレオチド連鎖（II bis）： 又は上記連鎖（Ｉ）、（II）及び（II bis）に夫々相
補的なヌクレオチド連鎖を有する配列から形成されたプ
ローブとハイブリダイズすることが可能であることを特
徴とする。
本発明のヌクレオチド配列は、上記ヌクレオチド連鎖
を含むか又は該連鎖の少なくとも一部により構成される
ことを特徴とする。
当然のことながら、このような配列から作成されるプ
ローブがC.pyloriのウレアーゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子の存在を認識する能力に関して特徴
的且つ明確な応答を与える限り、該当ヌクレオチド配列
の塩基は遺伝子中に見いだされる順序と異なる順序でも
よく、及び／又はこれらの塩基は場合により置換されて
もよい。
対応するRNAの酵素的逆転写又は化学的合成により得
られるような上記ヌクレオチド連鎖の配列とハイブリダ
イズ可能な全ヌクレオチド配列も本発明の範囲に含まれ
る。
本発明は更に、汎用遺伝暗号に従い、次のアミノ酸配
列（III）： の少なくとも一部に対応するヌクレオチド配列にも係
る。
本発明は更に、汎用遺伝暗号に従い、（ヌクレオチド
配列（II bis）によりコードされる）次のアミノ酸配列
（IV）： の少なくとも一部に対応するヌクレオチド配列にも係
る。
本発明は更に、適当な宿主を形質転換することが可能
な発現及びクローニング用組換体ベクターにも係り、該
ベクターは上記のようなヌクレオチド配列を発現させる
ことが可能な調節成分の制御下で該ヌクレオチド配列の
少なくとも一部を含む。
好適な組換体ベクターは、上記の約4.2kbの配列の少
なくとも一部を含む。
微生物の形質転換株も本発明の範囲に含まれる。これ
らの株は上記ヌクレオチド配列の１つ又は上記組換体ベ
クターを含む。
1988年８月16日付けで寄託番号Ｉ−795でパリ（フラ
ンス）、パスツール研究所のCollection Nationale de
Culture de Microorganismes（C.N.C.M.）に寄託された
大腸菌株S17−１は、上記の約8kbの制限フラグメントEc
oR I（Cla I、BamH I）−Pst I（Hind III）を含む約1
6.3kbのプラスミドpILL590を担持する。
本発明は更に、C.pyloriで天然に発現される型のウレ
アーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質のペ
プチドフラグメントにも係る。
本発明のタンパク質及びそのフラグメントは、汎用遺
伝暗号に従い上記ヌクレオチド配列、特に約4.2kbの配
列の少なくとも一部に対応する。
本発明のタンパク質は更に、宿主細胞を上記のような
組換体ベクターにより形質転換し、形質転換した宿主細
胞を適当な培地で培養し、これらの細胞から又は直接培
養培地からタンパク質を回収することにより得られるよ
うなタンパク質であることを特徴とする。この方法によ
るウレアーゼ又はそのフラグメントの製造も本発明の一
部を構成する。
本発明のタンパク質及び、同様に化学的合成により得
られるそのフラグメントは、有利には高純度を有してお
り、常法に従ってポリクローナル抗体を形成するために
使用される。
上記タンパク質及びそのフラグメントを特異的に認識
することが可能なこのようなポリクローナル抗体及びモ
ノクローナル抗体も本発明の目的を構成する。
上記ヌクレオチド配列は遺伝子工学の常法に従い、C.
pyloriでウレアーゼ活性を有するタンパク質の合成に関
与する遺伝子のクローニング及び同定により得られる。
本発明はヌクレオチド配列、対応するタンパク質及び
モノクローナル又はポリクローナル抗体の生物学的適用
にも係る。
これらの適用は、遺伝子内フラグメントからのC.pylo
riの検出用プローブの作成も含む。この作成は特に、プ
ローブとして使用可能な１重鎖配列を得るために２重鎖
配列を変性させる段階を含む。
種々のCampylobacter及び異なる属に含まれる微生物
に場合により存在する相補配列を検出するためにこのよ
うなフラグメントを用いて試験を行った処、これらのフ
ラグメントの高い特異性が明らかになった。
従って、本発明は上記ヌクレオチド配列の少なくとも
一部を含むことを特徴とする検出用プローブにも係る。
C.pyloriのゲノムにハイブリダイズする特性を改変し
ないようなヌクレオチドを置換又は変更によってのみヌ
クレオチド配列レベルで前記プローブから区別される全
プローブは本発明の範囲に含まれる。
プローブとして使用されるDNAフラグメントは、必要
な特異性及び安定なハイブリッドの形成を得るために十
分な数のヌクレオチドを含む。
何kbにも達するフラグメントを使用することが可能で
あるが、より短い約25〜40ヌクレオチドのフラグメント
を用いて高特異性の結果が得られる。
この型の検出に適当なプローブは、有利には放射性元
素又は被験DNAを含む試料とハイブリダイズした状態で
認識することが可能な他の任意の基により標識される。
常法に従い、プローブのヌクレオチド配列と被験物質
中に場合により含まれる相補的配列とのハイブリダイゼ
ーションが可能な条件下で、これらのプローブを細菌を
含む生物学的試料、又は直接これらの細菌もしくはその
核酸と接触させる。
例えばブロットハイブリダイゼーション法を使用する
ことができる。この方法は、腔生検に由来する細菌から
予め採取したDNAを変性後、このDNAのアリコート量をニ
トロセルロースメンブラン上に置く段階と、通常条件下
で各メンブランをプローブにハイブリダイズさせる段階
と、形成されたハイブリッドを常法で検出する段階とを
含む。
サザン法に従ってレプリカハイブリダイゼーション法
を使用することもできる。この方法は、DNAを制限酵素
により処理した後に形成されるDNAフラグメントをアガ
ロースゲル中で電気泳動により分画する段階と、アルカ
リ変性後に適当なメンブランに移す段階と、通常条件下
でメンブランをプローブにハイブリダイズさせる段階と
を含む。必ずしもDNAを予め発現させる必要はない。DNA
をプローブに接触できるようにすれば十分である。
C.pyloriの特異的同定のための検出は同様に、DNA増
幅法（PCR）により実施することもできる。これらの方
法は特にCetus Corporation名義の米国特許第4683202及
び4683195号に記載されている。
これらの方法を実施するためには10〜40ヌクレオチ
ド、有利には約20ヌクレオチドから成る２つのプライマ
ーを使用し、これらのプライマーは上記ヌクレオチド配
列の１つに含まれるか又は上記ヌクレオチド配列もしく
はその相補的配列の１つの一部とハイブリダイズするこ
とが可能である。有利には、これらのプライマーは増幅
すべきDNAの鎖にハイブリダイズ（又は結合）すると
き、相互に約200〜250ヌクレオチドの間隔で配置され
る。一方の配列は増幅すべきDNAフラグメントの一方の
鎖のヌクレオチド配列に結合することが可能であり、こ
の配列はこのフラグメントの一方の末端（例えば５′末
端）のレベルに配置され、他方の配列は増幅すべきDNA
フラグメントの第２の鎖のヌクレオチド配列に結合する
ことが可能であり、この配列は上記末端と反対側のこの
フラグメントの末端（提案例ではこの末端を同様に３′
末端と呼称する）のレベルに配置される。
好適なプライマーは第２図のH2〜H3制限フラグメント
のヌクレオチド配列に含まれ、相互に約200〜250ヌクレ
オチドの間隔で配置される。
特に、該プライマーはこの制限配列Hind III−Hind I
IIの各末端に夫々位置するフラグメントである。
生物学的試料中に場合により存在するC.pyloriのin v
itro検出方法は、該試料中に含まれ得るヌクレオチド配
列の一方の鎖の５′末端と該ヌクレオチド配列の他方の
鎖の３′末端とに夫々結合することが可能な上記のよう
なプライマーに該試料を接触させ、その後、DNAポリメ
ラーゼ及び４種のヌクレオシド三リン酸dATP、dCTP、dG
TP、dTTPの存在下で遺伝子増幅し、これらのプライマー
ハイブリダイゼーション及び遺伝子増幅操作を複数回繰
り返すことにより、該ヌクレオチド配列の量を場合によ
り予め増幅する段階と、本発明のヌクレオチドプローブ
と該ヌクレオチド配列との間で形成されるハイブリダイ
ゼーション複合体を産生し得る条件下で、該当生物学的
試料を該ヌクレオチドプローブと接触させる段階と、ハ
イブリダイゼーション複合体を検出する段階とを含む。
従って、本発明は培養を実施する必要なく迅速にin s
itu及び環境中で高特異性でC.pyloriを検出することが
可能なツールを提供する。
このような検出用ツールは、これらの細菌の天然源、
感染方法、伝播方法及び汚染方法を調査するために特に
有用である。また、生検で実施されるin vitro診断にお
いてこれらのプローブを使用すると、専門機関でなけれ
ば実施できないような技術を必要とする現状の方法、即
ち細菌学的方法又は電子顕微鏡を使用する方法に比較し
て大幅な時間の利得が得られる。
上記約8kbのフラグメントを遺伝子内プローブとして
使用することにより、再現可能な結果が得られた。
これらのプローブはC.pyloriに対する特異性を有する
ので、同様に非常に有利なツールを構成する。
従って、感染を予防するようにC.pyloriの病原能を調
査するために、潰瘍疾病の発生においてC.pyloriが果た
す役割を調査することが可能であり、また、動物モデル
で試験され得るC.pyloriの等遺伝子突然変異体（即ち感
染の病理発生に役割を果たすと思われる決定基の各々を
遺伝的に改変した細菌）をin vitroで形成できるよう
に、この細菌の病原能に関与していると思われる遺伝的
決定基を同定することが可能である。
本発明は更に、上記ヌクレオチドプローブ及び適当な
制限酵素による、C.pyloriでウレアーゼをコードする遺
伝子の多形性の検出にも係る。この検出を実施する条件
は、J.of Clin.−investigations（1986）,77,1723−17
26に所収のGusella J.F.の論文中により詳細に記載され
ている。
本発明は、特に特異的抗血清並びにポリクローナル及
びモノクローナル抗体の製造のための、コード化タンパ
ク質の免疫学的適用にも係る。ポリクローナル抗体は常
法に従い、動物にタンパク質を注入し、抗血清を回収し
た後、例えばアフィニティクロマトグラフィーにより抗
血清から抗体を回収することにより形成される。
モノクローナル抗体は、ミエローマ細胞を本発明のタ
ンパク質により予め免疫した動物の脾細胞と融合するこ
とにより常法通りに製造される。
本発明は更に、C.pyloriを含有し得る生物学的試料中
に場合により存在するC.pyloriのin vitro検出方法にも
係る。該方法は、C.pyloriにより産生されるウレアーゼ
活性を有するタンパク質の全部又は一部と本発明の抗体
との間に形成される免疫複合体を産生し得る条件下で、
試料を該抗体と接触させる段階と、免疫複合体を検出す
る段階とを含む。
ヌクレオチドプローブの使用に基づく上記in vitro検
出方法を実施するためには、場合により少なくとも１対
の本発明のプライマーと、所定量の本発明のヌクレオチ
ドプローブと、有利な要素として検出すべき配列とプロ
ーブとの間のハイブリダイゼーション反応の形成に夫々
適当な媒質と、有利な要素としてハイブリダイゼーショ
ン反応時にヌクレオチド配列とプローブとの間に形成さ
れるハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にする
試薬とを含む装置又はキットを利用すると有利である。
抗体の使用に基づく上記in vitro検出方法を実施する
ためには、所定量の本発明の抗体と、有利な要素とし
て、C.pylori株により産生されるウレアーゼ活性を有す
るタンパク質の少なくとも一部を抗体との間の免疫反応
の形成に適当な媒質と、有利な要素として、免疫反応時
にウレアーゼ活性を有するタンパク質の少なくとも一部
と抗体との間に形成される免疫複合体の検出を可能にす
る試薬とを含む装置又はキットを利用すると有利であ
る。
上記4.2kbのフラグメントを精査した結果、C.pylori
のウレアーゼの主要なポリペプチドサブユニットをコー
ドする構造の遺伝子を位置決定することができた。
この調査は、ウレアーゼを合成することができない大
腸菌及びC.Jejuniに導入した組換体プラスミドで突然変
異体を構築することにより実施した（Baskerville−A,N
ewell D.（1988）,Gut.29,465−472）。大腸菌のin vit
ro転写−翻訳系及びミニ細胞発現系を使用してウレアー
ゼのサブユニットをコードする遺伝子全体をC.pyloriの
4.2kbフラグメント中で同定及び位置決定した。26kDa及
び61kDaの２つの主要なタンパク質が同定された。同時
に、4.2kbのフラグメントに種々の欠失を形成後、大腸
菌からC.jejuni株への接合による伝達系（伝達系の型に
ついては以下の詳細な説明を参照されたい）を使用し
て、ウレアーゼ活性の発現に不可欠な領域を同定し、領
域の欠失をポリペプチドの消失及びウレアーゼ活性に相
関させた。この結果、ウレアーゼ活性の発現に必要な２
つのポリペプチドをコードする遺伝子は、第２図のH3部
位の下流でB2にまたがる3.35kbの中心領域に位置するこ
とが判明した。61kDa又は26kDaのポリペプチドをコード
する遺伝子の転写はEcoR I−Pst I方向に行われる。3.3
5kbフラグメントはC.jejuniにおけるウレアーゼ活性の
発現に必要であるが十分ではない。大腸菌におけるポリ
ペプチドの発現に無関係であると思われる上流の0.85kb
の隣接領域が、C.jejuniにおけるウレアーゼ活性の発現
に不可欠な領域である。
in vitro転写−翻訳による欠失突然変異体を分析した
処、26及び61kDaの２つのポリペプチドは隣接する２つ
のDNAフラグメントによりコードされることが判明し
た。
本発明はヌクレオチド配列（Ｖ）： の全部又は一部に係る。
本発明はより特定的には、汎用遺伝暗号に従い（ヌク
レオチド配列（Ｖ）によりコードされる）次の26kDaの
アミノ酸配列（VI）： （239アミノ酸、分子量26522ダルトン）の少なくとも
一部に対応する全ヌクレオチド配列に係る。
本発明は更に、ヌクレオチド配列（VII）： の全部又は一部に係る。
本発明はより特定的には汎用遺伝暗号に従い（ヌクレ
オチド配列（VII）によりコードされる）次の61kDaのア
ミノ酸配列（VIII）： （569アミノ酸、分子量61729ダルトン）の少なくとも
一部に対応する全ヌクレオチド配列に係る。
アミノ酸配列VIIIを特にEur.J.Biochem 175,151−165
（1588）に記載されているインゲンマメ（タチナタマ
メ）ウレアーゼのアミノ酸配列と比較した処、意外にも
高いレベルのアミノ酸相同性が判明した。このように構
造が維持されることから、本発明者らは上記配列VIIIの
206及び338位に位置するアミノ酸により画定されるポリ
ペプチド配列中に完全に又は部分的に含まれる61kDaの
ウレアーゼサブユニットの活性部位を推定することがで
きた。
本発明は更に、配列Ｖ及び配列VIIから連続的に構成
されるヌクレオチド配列IXの全部又は一部にも係る。
本発明は更に、汎用遺伝暗号に従い、配列VI及び配列
VIIIから連続的に構成される87kDaのアミノ酸配列
（Ｘ）の少なくとも一部に対応する全ヌクレオチド配列
にも係る。
本発明は更に、生物学的試料中に場合により存在する
C.pyloriの検出用プローブに係り、該プローブは上記ヌ
クレオチド配列の少なくとも一部を含むことを特徴とす
る。
自明のことながら、このような配列から作成されるプ
ローブがC.pyloriのウレアーゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子の存在を認識する能力に関して特徴
的且つ明確な応答を与える限り、該当ヌクレオチド配列
の塩基は遺伝子に見いだされる順序と異なる順序であっ
てもよく及び／又はこれらの塩基は場合により、置換さ
れてもよい。
対応するRNAの酵素的逆転写又は化学的合成により得
られるように上記ヌクレオチド連鎖の配列とハイブリダ
イズすることが可能な全ヌクレオチド配列も本発明の範
囲に含まれる。
C.pyloriのゲノムにハイブリダイズする形質を変えな
いようなヌクレオチド置換又は変更によってのみヌクレ
オチド配列のレベルにおいて上記プローブから区別され
る全プローブも本発明の範囲に含まれる。
該プローブは上記生物学的試料中に場合により存在す
るC.pyloriのin vitro診断法で使用可能である。
本発明は更に、約10〜約40ヌクレオチドのヌクレオチ
ドプライマーにも係り、これらのプライマーは上記ヌク
レオチド配列Ｖ又はVIIの１つ（又はこれらの配列Ｖ及
びVIIから誘導される配列の１つ）に含まれるか、又は
（特に上記ハイブリダイゼーション条件下で）上記ヌク
レオチド配列の一部もしくはその相補的配列にハイブリ
ダイズすることが可能である。
本発明は更に、上記方法に従い生物学的試料中に含ま
れ得るC.pyloriのヌクレオチドの量を予備増幅するため
の、上記in vitro診断法におけるこれらのプライマーの
使用に係る。
本発明は更に、上記ヌクレオチド配列Ｖ、VII及びIX
又はこれらの配列から誘導されるヌクレオチド配列の全
部又は一部を含む適当な宿主細胞を形質転換することが
可能な発現用及びクローニング用組換体ベクターにも係
る。
本発明は更に、上記配列VI、VIII及びＸの全部又は一
部に対応するタンパク質の製造方法にも係り、該方法は
適当な宿主細胞（特に上記宿主細胞）を上記ベクターに
より形質転換させる段階と、こうして生成されたタンパ
ク質を回収する段階と、場合によりこれらのタンパク質
を精製する段階とを含むことを特徴とする。
上記タンパク質の製造方法は場合により、生成すべき
タンパク質をコードする遺伝子を予備増幅する段階を含
み、該段階は上記方法に従い本発明のプライマー対を用
いて実施される。
本発明は更に、上記ヌクレオチド配列によりコードさ
れるポリペプチド（又はタンパク質）にも係る。特に本
発明は、上記87kDaのアミノ酸配列Ｘ、26kDaの配列VI及
び61kDaの配列VIII並びにそれらのフラグメントにも係
る。
本発明は更に、上記ポリペプチドの全部又は一部から
得られ且つ該ポリペプチドとの間で免疫複合体を形成す
ることが可能なポリクローナル及びモノクローナル抗体
に係る。
本発明は特に、配列VI又は配列VIIIの少なくとも約10
〜15個のアミノ酸のペプチド配列を用いて得られる抗
体、特にモノクローナル抗体に係る。
本発明の好適なモノクローナル抗体は、配列VIIIの20
6及び338位に位置するアミノ酸により画定される配列の
全部又は一部に特異的であり、より特定的には配列VIII
の206及び338位に位置するアミノ酸により画定される配
列に由来する少なくとも約10〜15個のアミノ酸のペプチ
ド配列により得られる抗体である。
本発明は更に、in vitro診断法を実施するため、及び
上記のようなC.pyloriによる固体の感染のin vitro診断
用キットにおける上記抗体の使用に係る。
本発明は更に、上記ポリペプチドの全部又は一部、よ
り特定的には配列VIIIの206及び338位に位置するアミノ
酸により画定されるポリペプチド配列の全部又は一部を
医薬上許容可能なビヒクルと組み合わせて含む免疫学的
組成物にも係る。
このような免疫学的組成物はC.pyloriによる固体の感
染の予防用ワクチン組成物として使用可能である。
本発明は更に、上記のような抗体、より特定的には配
列VIIIの206及び338位に位置するアミノ酸により画定さ
れるペプチド配列の全部又は一部との間で免疫複合体を
形成することが可能な１又は複数の抗体を、医薬上許容
可能なビヒクルと組み合わせて含む医薬組成物にも係
る。
本発明のこのような医薬組成物は、C.pyloriによる固
体の感染に結び付けられる病理、特に胃炎並びに胃及び
十二指腸潰瘍の治療に使用可能である。
本発明の他の利点及び特徴については、C.pyloriでウ
レアーゼ活性を有するタンパク質の産生に関与する遺伝
子のクローニング、ウレアーゼ活性を有するタンパク質
の発現に関連する領域の配列決定、及びC.pyloriの検出
のためのヌクレオチドプローブの特異性に関する以下の
記載に報告する。
この記載は第１図及び第２図を参照するものであり、
第１図はC.jejuniでウレアーゼを発現するのに必要な情
報を担持する組換体コスミドIID2のPst I−EcoR Iフラ
グメントの制限地図、第２図はpILL590の約8kbのフラグ
メントの制限地図である。
１） コスミドシャトルベクターにおけるゲノムバンク
の作成。C.pyloriでウレアーゼの産生に関与する遺伝子
のクローニング。
高分子量のDNAフラグメントを形成するようにC.pylor
i株（85P）の染色体DNAを調製し、この染色体DNA約300
μｇを制限エンドヌクレアーゼSau3Aで制御下に部分的
消化し、ショ糖勾配に重層し、35〜45kbの消化フラグメ
ントを選択的に単離した。エンドヌクレアーゼBamH Iに
より直鎖化し且つ脱ホスホリル化したコスミドシャトル
ベクターpILL575に、これらのフラグメント1.5μｇをin
vitroで連結した。pILL575は、Labigne−Roussel他に
よりJ.Bacteriol.169:5320−5323,1987に記載されてい
るシャトルコスミドpILL550から構築し、pILL550にλフ
ァージのcos部位を挿入（pILL550のPvu II部位にpERG15
3の1.7kbのBgl IIフラグメントを挿入）したものであ
り、従って接合により自己増殖可能であり、大腸菌及び
Campylobacterで同時に発現されるカナマイシン耐性（K
mr）をコードし、大腸菌のみで機能的な複製起点とCamp
ylobacterのみで機能的な複製起点との２つの複製起点
の存在により大腸菌及びC.jejuniで同時に複製する。こ
の連結産物をλ粒子にin vitroパッケージングし、その
後、組換体コスミドの伝達基をトランス配置で相補うこ
とが可能なプラスミドIncPを棲息させる大腸菌株に該連
結産物をトランスフェクションにより導入した。感染さ
せたカナマイシン耐性の大腸菌コロニーをすぐに個々に
−80℃に維持し、約500個の独立したクローンを維持す
ることにより、Campylobacter pyloriのゲノムの全体を
表すコスミドゲノムバンクを大腸菌で作成した。
次に組換体コスミドの各々を、当然ウレアーゼ−であ
るCampylobacter jejuni C31の受容株に大腸菌の接合に
より伝達した。
これらのカナマイシン耐性トランス接合体の各々につ
いて、Campylobacter jejuniによりウレアーゼが合成さ
れたか否かを検査した。
分析した106個のコスミドから、Campylobacter jejun
i C31にウレアーゼを産生する能力を与える遺伝子情報
を担持する１つのコスミドを単離した。組換体コスミド
（IID2）は54kbの寸法を有する。この配列上の制限エン
ドヌクレアーゼPst I、BamH I、Sma I及びEcoR Iによる
切断部位の相対位置を第１図に示す。
２） Campylobacter pyloriでウレアーゼを産生するた
めに必要な遺伝子の同定。
８〜15kbの部分的消化フラグメントを形成するよう
に、大腸菌で作成したコスミドDNA IID2からエンドヌク
レアーゼSau3Aで部分的消化を行うことにより、ウレア
ーゼ遺伝子のサブクローニングを実施した。大腸菌でク
ローニングしたハイブリッドプラスミドで、接合による
受容Campylobacterへの伝達後にウレアーゼを産生する
能力を与える最小のハイブリッドプラスミドを調査し
た。
試験した37個のプラスミドのうち４個のプラスミド即
ちpILL586、pILL587、pILL589（第２図）は、Campyloba
cter jejuniでウレアーゼを発現するのに必要な情報を
担持していた。
これらの４つのハイブリッドの制限地図を比較する
と、４つのハイブリッドに共通する4.2kbのヌクレオチ
ド配列の存在が認められ、従って、この配列がウレアー
ゼの発現に必要な領域であると予想される。これらの結
論を立証するために、所定数の欠失を形成した（第２
図）。
pILL590からBamH I及びHind IIIにより形成した種々
の制限フラグメントが85Pに存在することを立証するた
めに、pILL590のEcoR I−Pst IフラグメントをC.pylori
85Pの完全DNAとのハイブリダイゼーションにおけるプロ
ーブとして使用した。得られた結果によると、pILL590
中に存在する8kbの配列は種々のクローニング段階の間
に再配置を受けていなかった。
３） ウレアーゼの発現に関連する領域のヌクレオチド
配列。
H2及びH3部位の間に含まれるHind IIIフラグメントの
配列は、連鎖（Ｉ）の294ヌクレオチドの配列に対応す
る。
次の連鎖（II）の610ヌクレオチドの配列は、H4及びB
2部位（第２図）により規定されるフラグメントの内側
に位置する。
４） Campylobacter pyloriの検出用ヌクレオチドプロ
ーブの特異性。
pILL590に由来する8kbのEcoR I−Pst Iフラグメント
を、ハイブリダイゼーション実験の放射性プローブとし
て使用した。
32株のCampylobacter pyloriをコロニーハイブリダイ
ゼーションで試験した処、陽性の微候を得た。試験した
35株のCampylobacter jejuni、fetus及びcoliのうち
で、慣用緊縮ハイブリダイゼーション条件下（50％ホル
ムアミド、37℃、３×SSC）で陽性の微候を与えるもの
は皆無であった。
いずれも天然にウレアーゼを産生する微生物であるKl
ebsiella oxytoca（３株）、Klebsiella pneumoniae
（３株）、Proteus mirabilis（３株）、Proteus morga
nii（３株）、Proteus vulgaris（２株）、Providencia
stuartii（３株）、Pseudomonas picketti（３株）、Y
ersinia enterocolitica（３株）、ウレアーゼ＋ Acinet
obacter（５株）、ウレアーゼ＋ Escherichia coli（２
株）及びウレアーゼ＋ Citrobacter freundii（３株）を
上記と同一の条件下で8kbのC.pyloriプローブで試験し
たが、陽性の微候は認められなかった。
8kbフラグメントで擬似陽性は認められず、従って、
本発明のヌクレオチドプローブの特異性を保証すること
ができる。
抗体製造方法は、動物を上記ポリペプチドにより免疫
感作する段階と、形成された抗体を常法に従って回収す
る段階とを含む。
化学的経路による本発明の核酸（２重鎖核酸の場合、
最大200ヌクレチオド即ちpbを含む）の適当な製造方法
は、Bioorganic Chemistry4;274−325,1986に記載され
ているβ−シアノエチルホスホラミジト（cyanethyl ph
osphoramidite）の自動化方法を使用することによりDNA
を合成する段階と、こうして得られたDNAを適当なプラ
スミドベクターでクローニングし、適当なプローブとハ
イブリダイズさせることによりDNAを回収する段階とを
含む。
200ヌクレチオド即ちpb（２重鎖核酸の場合）を越え
る長さの核酸を化学的経路により製造する方法の１例
は、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 80;7461−7465,1983に記載
されている原理に従って天然ポリペプチドのアミノ酸連
鎖と適合可能な配列を有する異なる制限部位を末端に有
する化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを結合する
段階と、こうして得られたDNAを適当なプラスミドベク
ターでクローニングし、適当なプローブとハイブリダイ
ズさせることにより所望の核酸を回収する段階とを含
む。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (27)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】C.pyloriにより発現されるようなウレアー
    ゼ活性を有するタンパク質をコードし且つ第２図の制限
    酵素地図中に示される8kbのEcoR I（Cla I（BamH I）−
    Pst I（Hind III）フラグメントに含まれる配列の少な
    くとも一部を含むか、又は前記コーディング配列と緊縮
    条件下でハイブリダイズすることが可能であることを特
    徴とするヌクレオチド配列。
  2. 【請求項２】第２図に示すH2部位から約0.55kb上流及び
    B2部位から約0.7kb下流に夫々配置された末端ヌクレオ
    チドにより規定される約4.2kb（±５％）のフラグメン
    トの一部を含むことを特徴とする請求項１に記載のヌク
    レオチド配列。
  3. 【請求項３】場合により当該配列の転写を調節すること
    が可能なプロモーター及び転写終結信号をコードするDN
    A配列と組み合わせて請求項１又は２に記載の配列を含
    むことを特徴とする組換えヌクレオチド配列。
  4. 【請求項４】第２図の制限酵素地図におけるH2及びH3部
    位の間に位置する、下記ヌクレオチド連鎖（Ｉ）： 同制限酵素地図におけるH4及びB2部位の間に位置する、
    下記ヌクレオチド連鎖（II bis）： 同制限酵素地図におけるH3部位の下流でB2部位にまたが
    る3.35kbの中に位置する、下記ヌクレオチド連鎖
    （Ｖ）： 同制限酵素地図におけるH3部位の下流でB2部位にまたが
    る3.35kbの中に位置する、下記ヌクレオチド連鎖（VI
    I）： 又は上記連鎖（Ｉ）（II）（Ｖ）及び（VII）の夫々に
    相補的なヌクレオチド連鎖を有する配列から形成される
    ヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることが可能
    であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項
    に記載のヌクレオチド配列。
  5. 【請求項５】請求項４に記載のヌクレオチド連鎖を含む
    か又は請求項１から３のいずれか一項に記載の配列の存
    在を明確に確認し得るという条件下で前記連鎖の少なく
    とも一部により構成されることを特徴とするヌクレオチ
    ド配列。
  6. 【請求項６】汎用遺伝子コードに従い、下記アミノ酸配
    列（III）： に対応するヌクレオチド配列。
  7. 【請求項７】汎用遺伝子コードに従い、下記アミノ酸配
    列（IV）： に対応するヌクレオチド配列。
  8. 【請求項８】汎用遺伝子コードに従い、下記アミノ酸配
    列（VI）： に対応するヌクレオチド配列。
  9. 【請求項９】汎用遺伝子コードに従い、下記アミノ酸配
    列（VIII）： に対応するヌクレオチド配列。
  10. 【請求項１０】ウレアーゼ活性を有するタンパク質又は
    そのフラグメントであって、夫々C.pyloriにより発現さ
    れるようなウレアーゼ活性を有するタンパク質もしくは
    該タンパク質のフラグメントに対する抗体との免疫複合
    体を形成することが可能なフラグメントを生成するため
    に必要な情報を有することを特徴とする請求項１から９
    のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
  11. 【請求項１１】適当な宿主細胞を形質転換させることが
    可能であり、請求項１から10のいずれか一項に記載のヌ
    クレオチド配列を含む組換え核酸。
  12. 【請求項１２】適当な宿主細胞を形質転換させることが
    可能であり、場合により宿主細胞中でこのフラグメント
    を発現させることが可能な調節エレメントの制御下で、
    請求項１から11のいずれか一項に記載のヌクレオチド配
    列を含む組換えベクター、特に組換えプラスミド又はコ
    スミド。
  13. 【請求項１３】1988年８月16日付けでC.N.C.M.に寄託番
    号１−795で寄託された大腸菌株S17−１により担持され
    るプラスミドpILL5 90。
  14. 【請求項１４】請求項12もしくは13に記載の少なくとも
    １種のベクター又は請求項１から11のいずれか一項に記
    載のヌクレオチド配列により形質転換された微生物株。
  15. 【請求項１５】汎用遺伝子コードに従い、請求項１から
    11のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列に対応す
    る、C.pyloriで発現される型のウレアーゼ活性を有する
    タンパク質及びそのペプチドフラグメント。
  16. 【請求項１６】請求項12又は13に記載の組換えベクター
    により宿主細胞を形質転換し、形質転換した宿主細胞を
    適当な培地中で培養し、これらの細胞から又は直接培地
    からウレアーゼを回収することにより得られる、C.pylo
    riで発現される型のウレアーゼ活性を有するタンパク
    質。
  17. 【請求項１７】請求項15又は16に記載のタンパク質の全
    部もしくは一部又はそのフラグメントに対するポリクロ
    ーナル又はモノクローナル抗体。
  18. 【請求項１８】請求項９に記載の配列VIIIの206〜338位
    に位置するアミノ酸により決定される配列の全部又は一
    部に対するポリクローナル又はモノクローナル抗体。
  19. 【請求項１９】請求項１から11のいずれか一項に記載の
    ヌクレオチド配列を含むことを特徴とする検出用プロー
    ブ。
  20. 【請求項２０】C.pyloriを含有する疑いのあるサンプル
    中に場合により存在するC.pyloriのin vitroスクリーニ
    ング方法であって、 −請求項１から11のいずれか一項に記載の配列がサンプ
    ル中に含まれる場合には、前記ヌクレオチド配列の一方
    の鎖の５′末端と前記ヌクレオチド配列の他方の鎖の
    ３′末端とに夫々結合することが可能なプライマーを用
    いてこの配列を予め増幅する段階と、 −請求項19に記載のヌクレオチドプローブと前記ヌクレ
    オチド配列との間で形成されるハイブリダイゼーション
    複合体を生成し得る条件下で前記生物サンプルを前記プ
    ローブと接触させる段階と、 −前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する段階と
    を含むことを特徴とする方法。
  21. 【請求項２１】C.pyloriを含有する疑いのあるサンプル
    中に場合により存在するC.pyloriのin vitroスクリーニ
    ング方法であって、 −C.pyloriにより産生されるウレアーゼ活性を有するタ
    ンパク質と請求項17又は18に記載の抗体との間で形成さ
    れる免疫複合体を生成し得る条件下でサンプルを前記抗
    体と接触させる段階と、 −前記免疫複合体を検出する段階とを含むことを特徴と
    する方法。
  22. 【請求項２２】サンプル中に場合により存在するC.pylo
    riのスクリーニング方法を実施するためのキットであっ
    て、 −所定量の請求項19に記載のヌクレオチドプローブと、 −有利には、検出すべき配列と前記プローブとの間のハ
    イブリダイゼーション反応の形成に適した媒質と、 −有利には、ハイブリダイゼーション反応時にヌクレオ
    チド配列とプローブとの間で形成されるハイブリダイゼ
    ーション複合体を検出することが可能な試薬とを含むこ
    とを特徴とするキット。
  23. 【請求項２３】サンプル中に場合により存在するC.pylo
    riのスクリーニング方法を実施するためのキットであっ
    て、 −所定量の請求項17又は18に記載の抗体と、 −有利には、C.pylori株により産生されるウレアーゼ活
    性を有するタンパク質の少なくとも一部と抗体との間の
    免疫反応の形成に適した媒質と、 −有利には、免疫反応時にウレアーゼタンパク質の少な
    くとも一部と抗体との間で形成される免疫複合体を検出
    することが可能な試薬とを含むことを特徴とするキッ
    ト。
  24. 【請求項２４】請求項１から11のいずれか一項に記載の
    配列の１種に含まれ、相互に約200〜250ヌクレオチドの
    間隔で配置され、一方の配列が増幅すべき配列の一方の
    鎖の５′末端に結合することが可能であり、他方の配列
    が他方の鎖の３′末端に結合することが可能である少な
    くとも約20ヌクレオチドからなる２つのヌクレオチド配
    列を含む、PCR型又は他の型のDNA増幅法において使用す
    る為のヌクレオチド配列。
  25. 【請求項２５】請求項24に記載のヌクレオチド配列を用
    いてDNA増幅法によって得られるヌクレオチド配列。
  26. 【請求項２６】ペプチド配列が、 ａ） 87kDaのアミノ酸配列Ｘ、 ｂ） 26kDaの配列VI、 ｃ） 61kDa配列VIII、 ｄ） ａ）、ｂ）又はｃ）に記載の３種の配列のいずれ
    か１種のフラグメントから選択されることを特徴とする
    選択される15又は16に記載のタンパク質又はペプチド。
  27. 【請求項２７】請求項15、16又は26に記載のC.pyloriに
    より発現されるウレアーゼ活性を有するタンパク質又は
    該タンパク質のフラグメントに対する抗体間の免疫複合
    体の製造方法であって、請求項１から９のいずれか一項
    に記載のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク
    質又はペプチドフラグメントを前記抗体に接触させるこ
    とを特徴とする方法。
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