JPH08143594A - クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチド、それをコードするｄｎａ、そのｄｎａを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体、及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 クラミジア・トラコマチスやクラミジア・シ
ッタシ等のクラミジア・ニューモニエ以外のクラミジア
属細菌に対する抗体に反応せず、クラミジア・ニューモ
ニエ特異的抗体とのみ反応し、これを検出するための抗
原ポリペプチドを提供し、クラミジア・ニューモニエ、
クラミジア・トラコマチス、クラミジア・シッタシ等の
クラミジア属細菌に共通に反応する抗体を検出するため
の抗原ポリペプチドを提供する。 【構成】 配列番号１のポリペプチドの中の連続した少
なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＣから
なる、クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチド、
この抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはそれ
に相補的なＤＮＡ、このＤＮＡを含む組換えベクター、
この組換えベクターを含む形質転換体及び前記抗原ポリ
ペプチドを抗原として用いることを特徴とする、抗クラ
ミジア・ニューモニエ抗体の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、クラミジア・ニューモ
ニエ感染症の診断に有用なクラミジア・ニューモニエの
抗原ポリペプチド、それをコードするＤＮＡ、そのＤＮ
Ａを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形
質転換体、及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造
方法に関する。本発明は医薬品工業、特にクラミジア・
ニューモニエ感染症の診断薬の製造において有効に利用
される。

【０００２】

【従来の技術】クラミジア属の細菌は、クラミジア・ト
ラコマチス、クラミジア・シッタシ、クラミジア・ニュ
ーモニエ等の種（Species）が知られている。クラミジ
ア・トラコマチスは、トラコーマ、性病性リンパ肉芽
腫、泌尿生殖器感染症、封入体結膜炎、新生児肺炎等を
引き起こす原因菌であり、クラミジア・シッタシは、オ
ウム病等の原因菌であり、またクラミジア・ニューモニ
エは、呼吸器感染症、異形肺炎等の原因菌である。

【０００３】クラミジア・ニューモニエの引き起こす呼
吸器感染症の症状は、マイコプラズマ・ニューモニエや
インフルエンザウイルスが原因で起こる感染症の症状と
類似しているので、しばしば誤診されやすい。そのた
め、クラミジア・ニューモニエの簡便な診断方法の開発
が望まれていた。

【０００４】感染症の診断は、通常、感染部位等におけ
る原因菌の存在の検出か、血清・その他の体液中におけ
る（原因菌に対する）抗体の存在の検出により確定的に
なされる。前者は抗原検査、後者は抗体検査と呼ばれ、
いずれも臨床で重要な意義があり、クラミジア・ニュー
モニエの抗体検査としては、クラミジア・ニューモニエ
の基本小体を用いて抗体の存在を検出する方法が知られ
ている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、クラミジア・
ニューモニエの基本小体は、クラミジア・ニューモニエ
以外のクラミジア属細菌、すなわち、クラミジア・トラ
コマチス又はクラミジア・シッタシにも共通に存在する
抗原を含むため、この基本小体を用いる方法ではクラミ
ジア・ニューモニエに対する抗体だけでなく、他の種の
クラミジアに対する抗体とも反応し、特異性に欠ける難
点があった。本発明は、クラミジア・トラコマチスやク
ラミジア・シッタシ等のクラミジア・ニューモニエ以外
のクラミジア属細菌に対する抗体に反応せず、クラミジ
ア・ニューモニエ特異的抗体とのみ反応し、これを検出
するための抗原ポリペプチドを提供することを目的とす
る。更には、本発明はクラミジア・ニューモニエ、クラ
ミジア・トラコマチス、クラミジア・シッタシ等のクラ
ミジア属細菌に共通に反応する抗体を検出するための抗
原ポリペプチドを提供することも目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、クラミジ
ア・ニューモニエ特異的抗原ポリペプチド又はクラミジ
ア属細菌特異的（すなわち、クラミジア・ニューモニ
エ、クラミジア・トラコマチス、クラミジア・シッタシ
等のクラミジア属細菌共通の抗原ポリペプチド）を純粋
に、かつアミノ酸配列が解明された形で取得するため、
先ず、クラミジア・ニューモニエを宿主細胞中に培養
し、そのクラミジア・ニューモニエからゲノムＤＮＡを
抽出し、制限酵素で部分分解し、これをλgt１１ＤＮＡ
に挿入してゲノムＤＮＡライブラリーを作成し、これを
大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染させ、クラミジア・ニュ
ーモニエ特異的モノクローナル抗体又はクラミジア属細
菌特異的モノクローナル抗体を用いてクラミジア・ニュ
ーモニエの抗原ポリペプチドを発現する感染大腸菌のコ
ロニーをスクリーニングし、陽性の感染大腸菌からλフ
ァージを抽出し、この操作を繰り返してλファージを精
製し、これを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染させて増幅
させた後そのＤＮＡの塩基配列を分析し、これをポリペ
プチドに翻訳して、抗原ポリペプチドのアミノ酸配列を
決定し、本発明を完成した。

【０００７】本発明は、下記（１）〜（１０）に関する
ものである。 （１）配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なく
とも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＣからな
る、クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチド。 （２）ポリペプチドＣが配列番号１のポリペプチドから
アミノ酸１〜２５０個が欠落しているポリペプチドであ
る、上記（１）記載の抗原ポリペプチド。 （３）ポリペプチドＣが、配列番号１のポリペプチドの
中のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置換されて
いるポリペプチドである、上記（１）記載の抗原ポリペ
プチド。 （４）ポリペプチドＣが、配列番号１のポリペプチドの
中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列にアミノ酸
若しくは２〜１０００個のアミノ酸配列が結合したポリ
ペプチドである、上記（１）記載の抗原ポリペプチド。 （５）ポリペプチドＣが配列番号１のアミノ酸配列から
なるポリペプチドである、上記（１）記載の抗原ポリペ
プチド。 （６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗原ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ若しくはそれに相補的なＤ
ＮＡ。 （７）塩基配列が配列番号２の塩基配列である、上記
（６）記載のＤＮＡ。 （８）上記（６）又は上記（７）記載のＤＮＡを含む組
換えベクター。 （９）上記（８）記載の組換えベクターを含む形質転換
体。 （１０）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗原ポ
リペプチドを抗原として用いることを特徴とする、抗ク
ラミジア・ニューモニエ抗体の製造方法。

【０００８】また、本発明は、下記（１１）〜（１７）
に関するものでもある。 （１１）(a) 配列番号３のポリペプチド； (b) 配列番号３のポリペプチド中のアミノ酸の１又は２
以上に欠落のあるポリペプチド； (c) 配列番号３のポリペプチド中のアミノ酸の１又は２
以上が他のアミノ酸で置換されたポリペプチド；及び (d) 上記(a)〜(c)のいずれかのポリペプチドに他のアミ
ノ酸もしくはペプチドが結合してなる融合ポリペプチ
ド、 からなる群から選ばれるクラミジア・ニューモニエの抗
原ポリペプチド。

【０００９】（１２）(a) 配列番号１のポリペプチド； (b) 配列番号１のポリペプチド中のアミノ酸の１又は２
以上に欠落のあるポリペプチド； (c) 配列番号１のポリペプチド中のアミノ酸の１又は２
以上が他のアミノ酸で置換されたポリペプチド；及び (d) 上記(a)〜(c)のいずれかのポリペプチドに他のアミ
ノ酸もしくはペプチドが結合してなる融合ポリペプチ
ド、 からなる群から選ばれるクラミジア・ニューモニエの抗
原ポリペプチド。

【００１０】（１３）上記（１１）のポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ、又はそれに相補的なＤＮＡ。 （１４）上記（１２）のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ、又はそれに相補的なＤＮＡ。 （１５）上記（１１）のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａが配列番号４である、上記（１３）のＤＮＡ。 （１６）上記（１２）のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａが配列番号２である、上記（１４）のＤＮＡ。 （１７）上記（１３）〜（１６）のいずれかのＤＮＡを
含む、組換えベクター。

【００１１】なお、本明細書において、塩基の数が１の
デオキシヌクレオチドはモノデオキシヌクレオチドとい
い、塩基の数が２以上のデオキシヌクレオチドは、特に
断らない限り、ＤＮＡと総称した。

【００１２】以下、本発明の詳細を、１．形質転換体の
作製、２．抗原ポリペプチドの製造方法、３．得られた
抗原ポリペプチド、４．抗原ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ、及び、５．抗原ポリペプチドを抗原として用い
る抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造方法、の順に
説明する。

【００１３】１．形質転換体の作製 １．１ クラミジア・ニューモニエの培養 培養したＨＬ細胞から細胞浮遊液を調製し、培養上清を
除去した後にクラミジア・ニューモニエの浮遊液を添加
してこれを培養し、遠心分離してクラミジア・ニューモ
ニエ感染ＨＬ細胞を取得する。クラミジア・ニューモニ
エとしては、例えばクラミジア・ニューモニエＹＫ４１
株(金本ら：ミクロバイオロジカル・イムノロジー、37
巻、495-498頁、1993年(Y.Kanamoto et al., Microbio
l. Immunol., Vol.37, p.495-498, 1993))が使用でき
る。 １．２ クラミジア・ニューモニエの基本小体の精製 クラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を破砕し、遠心
分離し、上清を回収する。ウログラフィン（シェーリン
グ社製）を用いた連続密度勾配液にこの上清を添加して
遠心分離し、クラミジア・ニューモニエの基本小体に相
当するバンドを回収する。

【００１４】１．３ クラミジア・ニューモニエのゲノ
ムＤＮＡの調製 クラミジア・ニューモニエの基本小体を、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）
（以下、ＴＥ緩衝液という）に懸濁し、１％ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液及び１mg/mlプロテイナ
ーゼＫ水溶液を加えて保温し、基本小体を溶解させる。
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）飽和フェノー
ルを加えて撹拌し、遠心分離し、水層を回収する。さら
にＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）処理をし、フェノール
／クロロホルム／イソアミルアルコール処理とエタノー
ル沈殿処理をし、クラミジア・ニューモニエのゲノムＤ
ＮＡを取得する。

【００１５】１．４ ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの
作製 ゲノムＤＮＡを制限酵素ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及びＡｌ
ｕＩで消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミル
アルコール処理とエタノール沈殿処理をし、部分消化Ｄ
ＮＡを取得する。この部分消化ＤＮＡにリンカー、アデ
ノシン−５′−三リン酸（adenosine 5′-triphosphat
e、以下、ＡＴＰと略す）及びＴ４リガーゼを添加し
て、部分消化ＤＮＡにリンカーを付加させる。これを、
０．１Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液を移動相とするクロマ・スピン６０
００（Chroma spin 6000）カラムにかけ、溶出液を分取
し、１ｋｂｐから７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回
収する。得られた分画にＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを加えて反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリ
ン酸化する。反応液をフェノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコール処理及びエタノール沈殿処理し、５′
端がリン酸化されたＤＮＡ断片を取得する。このＤＮＡ
断片に、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断しておいたλgt
１１ＤＮＡ、ＡＴＰ及びＴ４リガーゼを加えて反応さ
せ、市販のパッケージングキットを用い、得られた組換
えλgt１１ＤＮＡをパッケージングし、ゲノムＤＮＡ発
現ライブラリーを作製する。

【００１６】１．５ 抗原ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡのクローニング 大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の培養液に上記ゲノムＤＮＡ発
現ライブラリーを感染させ、寒天培地上で培養し、イソ
プロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）水溶
液に浸漬したニトロセルロースフィルターを利用して、
挿入ＤＮＡの発現により菌体内に産生されたタンパク質
をニトロセルロースフィルターに付着させる。このフィ
ルターを牛血清アルブミンを用いてブロッキング反応さ
せ、洗浄し、次いでフィルターをクラミジア・ニューモ
ニエ特異的モノクローナル抗体と反応させる。クラミジ
ア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体としては、
例えば、７０、ＡＹ６Ｅ２Ｅ８及びＳＣＰ５３を使用す
ることができる。７０及びＳＣＰ５３をは本発明者の一
人の松本等がクラミジア・ニューモニエＫＫｐｎ−１株
を抗原としてマウスを免疫し、その脾臓細胞をミエロー
マ細胞と融合させて得られたハイブリドーマ７０及びハ
イブリドーマＳＣＰ５３が分泌する抗体である。ＳＣＰ
５３を産生するハイブリドーマについてはジャーナル・
オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー、132巻、583-5
88頁(1994)（J. Clin. Microbiol.,Vol.132, p.583-58
8, 1994）に記載されている。また、ＡＹ６Ｅ２Ｅ８は
本発明者の一人の井筒等が、クラミジア・ニューモニエ
ＹＫ−４１株の基本小体を抗原として、マウスを免疫
し、その脾臓細胞をミエローマと細胞融合させて得られ
たハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８が分泌する抗体ＡＹ６
Ｅ２Ｅ８であり、ＡＹ６Ｅ２Ｅ８を産生するハイブリド
ーマは工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１３６８８として寄託されている。また、
反応後、フィルターを洗浄し、パーオキシダーゼ等の酵
素で標識された抗マウスＩｇＧ抗体を反応させる。反応
後、フィルターを洗浄し、発色基質液を添加して反応さ
せる。発色基質液としては、例えば、過酸化水素水溶液
及び４−クロロ−１−ナフトールのメタノール溶液を含
む液を利用することができる。反応後、フィルターを洗
浄し、風乾させる。

【００１７】フィルターの発色スポットに対応する寒天
培地上のプラークを同定し、プラークに含まれるλファ
ージを取得する。プラークが全て上記モノクローナル抗
体と反応するようになるまで前記操作を繰り返し、抗原
ポリペプチドをコードするＤＮＡをクローン化し、クラ
ミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体反応性
のクラミジア・ニューモニエ特異的抗原ポリペプチドを
発現するλファージを取得する。

【００１８】１．６ クラミジア・ニューモニエ抗原ポ
リペプチドをコードするＤＮＡの取得 取得したλファージを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染さ
せ、培養し、λファージを大量に生産する。市販のキッ
トを用いてλファージからＤＮＡを取得・精製する。こ
のＤＮＡにプライマー、タックポリメラーゼ（Taq Poly
merase）及びデオキシヌクレオチド類を添加し、加熱、
冷却、保温の工程を繰り返し、λgt１１に挿入されたＤ
ＮＡを増幅させる。プライマーとしては、例えば、λgt
１１・フォワード・プライマー（λgt１１ forward pri
mer）及びλgt１１・リバース・プライマー（λgt１１
reverse primer）（いずれも宝酒造株式会社製）があ
り、タックポリメラーゼとしては、例えば、アンプリタ
ック・ＤＮＡ・ポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮ
Ａ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）がある。このＤＮＡ増幅方
法の一般的手法はＰＣＲ法として知られており、詳細は
「サムブロック他編集、モレキュラー・クローニング
第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー）(1989年)」（J.Samblook et al., Molecular Cloni
ng 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press
（1989）、以下、本文献を文献″モレキュラー・クロー
ニング″という）に記載されている。

【００１９】増幅されたＤＮＡを取得し、塩基配列を決
定・解析する。ＤＮＡの取得には市販のキットを使用す
ることができ、例えばウイザード・ＰＣＲ・プレップキ
ット(Wizard PCR Prep kit)(プロメガ(Promega)社製品)
を使用することができる。また、塩基配列を決定はタッ
クポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータサイクル
シークエンス法で行うことができ、この方法を用いるに
は、パーキン・エルマー・ジャパン社から販売されてい
るキットを使用することができる。また、分析にあたっ
ては市販の機械、例えば３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ
（アプライドバイオシステムズ社）を利用することがで
きる。

【００２０】塩基配列の決定後、得られたＤＮＡ塩基配
列を遺伝子配列分析ソフトで解析し、編集、連結、アミ
ノ酸翻訳領域の推定を行なう。遺伝子配列分析ソフトと
しては、「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジニ
アリング社）を用いることができる。解析の結果、完全
長の遺伝子が取得できていない場合は、既に取得されて
いるＤＮＡの前後のＤＮＡをゲノムウォーキングによっ
て取得する。ゲノムウォーキングを行うには、宝酒造
(株)から販売されているキットを使用することができ
る。

【００２１】１．７ 抗原ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを含む組換えベクターの作製、及びそれを含む形質
転換体の作製 上記１．６で取得したλファージ自体も本発明のＤＮＡ
を含む組換えベクターであるが、上記１．６で取得した
クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードす
るＤＮＡを常法で既存のプラスミドベクターやファージ
ベクター等に挿入して、新たに組換えベクターを作製す
ることもできる。その際、必要に応じ、リンカーを使用
する。既存のプラスミドベクターとしては、例えばｐＢ
Ｒ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等を使用することが
でき、これらのプラスミドベクターは市販されている。
また、ファージベクターとしてはλgt１１ファージ、λ
gt１０ファージ等が利用できる。いずれも、用いた親ベ
クターに対応する組換えベクターが得られる。本発明の
ＤＮＡを含む組換えベクターとしては、後述するように
５３−３Ｓλファージ、７０−２Ｓλファージ等があ
る。

【００２２】得られた組換えベクターを宿主に入れ、形
質転換体を作製する。大腸菌由来のプラスミドやλファ
ージを使用する場合は宿主としては大腸菌を使用するこ
とができ、例えば大腸菌ＨＢ１０１株を使用することが
できる。この宿主をコンピテントセルとなるように処理
をする。大腸菌ＨＢ１０１株を処理して得たコンピテン
トセルは宝酒造から販売されている。上記連結の反応物
を宿主に入れ、形質転換体を作製する方法は文献″モレ
キュラー・クローニング″に記載されている。得られた
形質転換体を培養してコロニーを形成させ、各コロニー
からプラスミドＤＮＡを取得し、適切な制限酵素で切断
し、アガロースゲル電気泳動で分析し、所望の組換えプ
ラスミドをもつ形質転換体を選択する。

【００２３】２．抗原ポリペプチドの製造方法 本発明の抗原ポリペプチドを製造する場合は、形質転換
体の培養、形質転換体の破砕、ストレプトマイシン処
理、硫安沈殿、液体クロマトグラフィー、の各工程を行
う。形質転換体の培養は、その形質転換体が成長しうる
培地でこの抗原ポリペプチドが形質転換体内に十分蓄積
されるまで適温で培養器を振とうする。形質転換体とし
て、プラスミドベクターｐＢＲ３２２に本発明のＤＮＡ
を挿入した組換えベクターを入れた大腸菌ＨＢ１０１株
を使用する場合は、アンピシリンを含むＬＢ培地で３７
℃で一晩振とう培養し、その後、この培養液をアンピシ
リンを含むＴＢ培地等に接種してさらに３７℃で一晩振
とう培養する。ＴＢ培地の調製方法は、文献″モレキュ
ラー・クローニング″に記載されている。培養した形質
転換体を破砕するには、遠心分離で形質転換体を集め、
緩衝液に懸濁し、これに超音波を照射する。形質転換体
が大腸菌の場合は、上記懸濁液にリゾチームを加え、Ｓ
ＤＳを含む緩衝液を加えることよって菌体を溶菌させて
もよい。

【００２４】形質転換体の破砕後、遠心分離して細胞残
渣を除去し、上清を取得する。この上清にストレプトマ
イシン硫酸塩を添加し、しばらく撹拌し、遠心分離する
ことによって、核酸を沈殿物として除去し、上清を取得
する。この上清を液体クロマトグラフィーによって分画
し、各画分に含まれる蛋白質について、前述のクラミジ
ア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体を用い、ウ
ェスタン・ブロット法行い、抗原ポリペプチドを含む画
分を取得する。細胞膜等の残渣の除去、ストレプトマイ
シン硫酸塩を添加するＤＮＡの除去、硫酸アンモニウム
を添加する蛋白質の取得、及びウェスタン・ブロット法
の具体的方法は、文献″モレキュラー・クローニング″
に記載されている。

【００２５】３．得られた抗原ポリペプチド 本発明の抗原ポリペプチドは、配列番号１のポリペプチ
ドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含む
ポリペプチドＣからなるものである。配列番号１のポリ
ペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列
を含むポリペプチドＣは、望ましくは２０個以上、より
望ましくは１００個以上、さらに望ましくは２５０個以
上のアミノ酸からなるものがよい。ポリペプチドＣとし
ては、例えば配列番号１のポリペプチドを使用すること
ができるし、配列番号１のポリペプチドからアミノ酸１
〜２５０個が欠落しているポリペプチドや配列番号１の
ポリペプチドの中のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ
酸で置換されているポリペプチドを使用することもでき
る。また、ポリペプチドＣとして、配列番号１のポリペ
プチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列に
アミノ酸若しくは２〜１０００個のアミノ酸配列が結合
したポリペプチドも使用することもできる。

【００２６】配列番号１のポリペプチドからアミノ酸１
〜２５０個が欠落しているポリペプチドとしては、例え
ば、配列番号１のポリペプチドの１〜３２１番目のアミ
ノ酸配列からなるポリペプチドがある。配列番号１のポ
リペプチドの中のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸
で置換されているポリペプチドとしては、配列番号１の
ポリペプチドの中の任意の箇所のアミノ酸を類似の性質
をもつ他のアミノ酸に置換したポリペプチドがあり、例
えば、配列番号１のポリペプチドの５７１番目のアミノ
酸であるグリシンがアラニンに置換されたポリペプチド
がある。配列番号１のポリペプチドの中の連続した少な
くとも５個のアミノ酸配列に結合するアミノ酸若しくは
２〜１０００個のアミノ酸配列としては、例えば、ロイ
シン、ロイシン−メチオニン、ジヒドロ葉酸還元酵素
（ＤＨＦＲ）、β−ガラクトシダーゼ等がある。ポリペ
プチドＣの具体例としては、例えば配列番号１のポリペ
プチド、配列番号１のポリペプチドの１〜３２１番目の
アミノ酸配列からなるポリペプチドがある。

【００２７】本発明の配列番号１のポリペプチドは、配
列表に示すとおり、５７１個のアミノ酸残基から成る抗
原ポリペプチドである。本発明の配列番号３のポリペプ
チドは、配列表に示すとおり、２５９個のアミノ酸残基
から成る抗原ポリペプチドである。ポリペプチドＣの中
では、クラミジア・ニューモニエの７３ＫＤａの抗原ポ
リペプチドのアミノ酸配列そのものを含む配列番号１の
ポリペプチドが望ましい。

【００２８】４．抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡ 本発明において、配列番号１のポリペプチドをコードす
るＤＮＡとは、配列番号１のポリペプチドをトリプレッ
ト暗号表（それぞれのアミノ酸に対して、１〜６通りの
ヌクレオチド配列が割り当てられている。）に従ってア
ミノ酸をヌクレオチド配列に読み替えたときのＤＮＡ群
（この中には、配列番号２のＤＮＡも含まれる。）から
選ばれるＤＮＡのことである。同様に、本発明におい
て、配列番号３のポリペプチドをコードするＤＮＡと
は、配列番号３のポリペプチドをトリプレット暗号表
（それぞれのアミノ酸に対して、１〜６通りのヌクレオ
チド配列が割り当てられている。）に従ってアミノ酸を
ヌクレオチド配列に読み替えたときのＤＮＡ群（この中
には、配列番号４のＤＮＡも含まれる。）から選ばれる
ＤＮＡのことである。

【００２９】５．抗原ポリペプチドを抗原として用いる
抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造方法 抗クラミジア・ニューモニエ抗体を製造するには、本発
明の抗原ポリペプチドを抗原としてマウスを免疫し、そ
のひ臓細胞を骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマ
を作製し、その中からクラミジア・ニューモニエの抗原
ポリペプチドを認識するハイブリドーマを選択し、これ
を培養することによって得ることができる。骨髄腫細胞
株としては、例えばＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣ
Ｃ ＣＲＬ−１５８０）やＰ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−
１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１８）を使用することができ
る。抗原として本発明の抗原ポリペプチドを使用するこ
と以外は、マウスを免疫して抗体を得る公知の一般的手
法に従い、抗クラミジア・ニューモニエ抗体を製造す
る。

【００３０】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。

【００３１】以下の実施例において使用したモノクロー
ナル抗体は、表１に示されるように、モノクローナル抗
体のＳＣＰ５３及びＡＹ６Ｅ２Ｅ８は C.ニューモニエ
に特異的であり、モノクローナル抗体の７０はクラミジ
ア属細菌に特異的である。

【００３２】

【表１】 以下、クラミジア・ニューモニエの宿主細胞の培養か
ら、クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドの遺
伝子ＤＮＡ配列／アミノ酸配列の決定まで、順を追って
説明する。

【００３３】実施例１ クラミジア・ニューモニエの７
３Ｋ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製 （Ａ）宿主細胞（ＨＬ細胞）の培養 予め、プラスチック製培養フラスコ（７５cm²）の底面
いっぱいに増殖させたＨＬ細胞をリン酸緩衝化生理食塩
液（以下、ＰＢＳという）マグネシウム不含（−）液５
mlで洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）トリプシンを含むＰＢ
Ｓを５ml加えて細胞表面全体に行き渡らせ、その液を捨
てた後、３７℃で１０分間保温し、１０％（ｖ／ｖ）牛
胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地５mlを加え、ピペ
ッテイングによりＨＬ細胞を剥離して、細胞浮遊液を調
製した。

【００３４】７５cm²のプラスチック製培養フラスコで
培養するときは、培養フラスコに上記細胞浮遊液１ml及
び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培
地１５〜２０mlを加え、また、６ウェルプラスチック製
培養容器で培養するときは、上記細胞浮遊液８mlと１０
％牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培地２９２mlとの混
合液４mlずつを各ウェルに加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガ
ス雰囲気下で培養した。

【００３５】（Ｂ）クラミジア・ニューモニエ ＹＫ４
１の培養 ６ウェルプラスチック製培養容器（底面上）に増殖した
ＨＬ細胞の培養上清をピペットで取り除き、これに前述
のクラミジア・ニューモニエＹＫ４１株の浮遊液〔クラ
ミジア・ニューモニエＹＫ４１保存液を、１リットルあ
たり庶糖７５ｇ、リン酸一カリウム０．５２ｇ、リン酸
二カリウム１．２２ｇ及びグルタミン酸０．７２ｇを含
む水溶液（以下、ＳＰＧという）で１２ないし２４倍に
希釈し、超音波で１分間処理し、２，０００rpmで３分
間遠心分離した上清〕を１ウェルあたり２ml加えて、
２，０００rpmで１時間遠心吸着を行った。遠心吸着
後、クラミジア・ニューモニエ浮遊液を除き、１μg/ml
シクロヘキシミド及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含
むダルベッコＭＥＭ培地をウェルあたり４ml加え、５％
（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で３日間培養し
た。培養後、滅菌したシリコン片で細胞を剥離し、細胞
を回収した。これを８，０００rpmで３０分間遠心分離
して、沈殿をＳＰＧに再懸濁し、−７０℃で保存した
（以下、これをクラミジア・ニューモニエＹＫ４１保存
液という）。

【００３６】（Ｃ）クラミジア・ニューモニエＹＫ４１
の基本小体の精製 −７０℃に保存しておいたクラミジア・ニューモニエＹ
Ｋ４１感染凍結ＨＬ細胞浮遊液を融解し、テフロンホモ
ジナイザーでホモジナイズした。２，５００rpmで１０
分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿は再びＳＰＧに
懸濁し、同様の操作を行い、上清を回収した。同様の操
作を更に２回行い、得られた上清は集めて合わせた。

【００３７】別途、遠心管に５０％（ｗ／ｖ）庶糖を含
む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）、次い
で、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）３容量
と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）７容量と
の混合液を重層し、この上に先に回収した上清を注意深
く重層し、８，０００rpmで１時間遠心分離した。５０
％（ｗ／ｖ）庶糖を含む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液
（pH７．４）層及び沈殿を回収し、この回収液に同容量
のＳＰＧを加え、１０，０００rpmで３０分間遠心分離
した。上清を捨て、沈殿をＳＰＧに懸濁した。遠心分離
管に、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）と
０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）の３５％か
ら５０％（総量に対する前者の容量比）までの連続密度
勾配液を作製し、この上に懸濁液を重層し、８０００rp
mで１時間遠心分離した。クラミジア・ニューモニエ Ｙ
Ｋ４１の基本小体に相当するバンドを回収し、これをＳ
ＰＧで２倍に希釈し、１００００rpmで３０分間遠心分
離した。得られた沈殿をＳＰＧに懸濁し、タンパク質濃
度を測定（バイオラッド社のタンパク測定キットを用
い、牛血清アルブミンを標準とした）後、−７０℃で保
存した。

【００３８】（Ｄ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４
１株のゲノムＤＮＡの調製 上記精製クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本
小体の懸濁液３００μｌ（タンパク質濃度：１．３７mg
/ml）を４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。
沈殿に１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液pH８．０（以下、ＴＥ緩衝液という）５００μｌを
加えて懸濁した。同様の遠心分離を再度行い、沈殿を３
００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。１％ＳＤＳ水溶液３
０μｌ及び１mg/mlプロテイナーゼＫ水溶液３０μｌを
加え、５６℃で３０分間インキュベートし、基本小体を
溶解させた。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）
飽和フェノール３５０μｌを加え、ボルテックスミキサ
ーでよく混合後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心
分離し、水層を回収した（ＤＮＡの抽出）。この抽出操
作はもう一度繰り返した。１０mg/mlのＲＮａｓｅ溶液
を２μｌ加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＲＮ
Ａを分解した。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．
０）飽和フェノール、クロロホルム及びイソアミルアル
コールの２５：２４：１（容量比）の混合液（以下、Ｐ
ＣＩという）３００μｌを加え、ボルテックスミキサー
でよく混合し、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分
離し、水層を回収した。この操作を合計５回繰り返し
た。

【００３９】得られた液にその１／１０容の１０Ｍ酢酸
アンモニウム水溶液及び２容のエタノールを加え、５分
間放置し、ＤＮＡを析出させたのち、４℃、１２，００
０rpmで５分間遠心分離した。沈殿は７０％エタノール
水溶液６００μｌを加え、混合し、４℃、１２，０００
rpmで５分間遠心分離する洗浄を２回繰り返した。遠沈
管のふたを開けたまま１５分間放置して沈殿を乾燥さ
せ、これにＴＥ２００μｌを加えて溶かし、−２０℃に
保存した。

【００４０】（Ｅ）ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作
製 ゲノムＤＮＡ溶液１００μｌに、制限酵素用M-buffer１
０μｌ、制限酵素混合液（ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及び１
／５０希釈のＡｌｕＩ各０．４μｌとＴＥ２０μｌを混
合）１０μｌを加え、３７℃で２０分間反応させた。な
お、上記２０分の反応時間は、ＤＮＡが１ｋｂｐ〜７ｋ
ｂｐの大きさの部分消化ＤＮＡに分解される時間で、予
め少量のゲノムＤＮＡを用いて試験した。上記反応液に
ＰＣＩを１００μｌ加え、ボルテックスミキサーでよく
混ぜ、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水
層を回収した。これに３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液１０μ
ｌ及びエタノール２２０μｌを加え、−８０℃に１５分
間静置し、部分消化ＤＮＡを析出させた。４℃、１２，
０００rpmで５分間遠心分離し、上清液を捨てたのち、
沈殿に７０％エタノール水溶液５００μｌを加えて混
ぜ、再び、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。上
清液を捨て、沈殿を減圧下に乾燥した。

【００４１】得られた部分消化ＤＮＡを精製水２０μｌ
に溶かし、その１９μｌをとり、これに下記化１で示す
リンカー（２０pmole/μl）１４μｌ、１０ｍＭ ＡＴ
Ｐ４．５μｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭジチオ
スレイトール及び５００μg/ml牛血清アルブミン含有
０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、以下、１０倍
濃度ライゲーション用緩衝液という）４．５μｌ、精製
水２μｌ及びＴ４リガーゼ１μｌを加え、１６℃で４時
間反応させ、リンカーを付加させた。

【化１】

【００４２】リンカーを付加させた部分消化ＤＮＡを、
０．１Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液を移動相とするChroma spin 6000カラ
ムにかけた。溶出液２滴ずつを分取し、各分画の一部を
０．８％アガロースゲル電気泳動で分析して、１ｋｂｐ
から７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回収した。得ら
れた分画１４４μｌに、精製水１３μｌ、１０ｍＭ Ａ
ＴＰ ２０μｌ、０．１Ｍ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭジチオ
スレイトール、１ｍＭスペルミジン塩酸塩及び１ｍＭ
ＥＤＴＡ含有０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、
以下、１０倍濃度リン酸化反応用緩衝液という）２０μ
ｌ、及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ３μｌを加え、
３７℃で３０分間反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリン
酸化した。ＰＣＩ ２００μｌを加えてよく振り混ぜた
後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水層
を回収した。２０mg/mlグリコーゲン水溶液１μｌ、３
Ｍ酢酸ナトリウム水溶液２０μｌ及びエタノール４００
μｌを加えてヌクレオチドを析出させた。４℃、１２，
０００rpmで１０分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿に
７０％エタノール２００μｌを加え混ぜ、再び遠心分離
し、上清を捨て、沈殿を風乾し、精製水１μｌを加え溶
かした。

【００４３】この液０．６μｌに、予め制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断したλgt11 ＤＮＡ（１μg/μl、ストラタジ
ーン（Stratagene）社）１μｌ、１０倍濃度ライゲーシ
ョン用緩衝液０．５μl、１０ｍＭ ＡＴＰ０．５μｌ、
Ｔ４リガーゼ０．４μｌ及び精製水２μｌを加え、４℃
で一晩反応させた。次いで、ギガパック（Gigapack）II
Goldパッケージングキット（ストラタジーン社）を用
い、得られた組換えλgt１１ＤＮＡをパッケージングし
た。

【００４４】（Ｆ）抗原ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａのクローニング 大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の一白金耳を１０ｍＭ ＭｇＳ
Ｏ₄３ｍｌ、０．２％マルトース及び５０μg/mlアンピ
シリン含有のＬＢ（水１Ｌ中にＮａＣｌ ５ｇ、ポリペ
プトン１０ｇ及び酵母エキス５ｇを含む）培地に接種
し、３７℃で一晩振とう培養したのち、これを２，００
０rpmで１０分間遠心分離した。沈殿（大腸菌）に１０
ｍＭ ＭｇＳＯ₄水溶液９mlを加えて混ぜ、この大腸菌懸
濁液の０．３５mlを採り、これにλgt１１（ＤＮＡライ
ブラリー）懸濁液を０．１〜１０μｌ加え、３７℃で２
０分間インキューベートし、大腸菌にλgt１１を感染さ
せた。予め４７℃に保温した液状ＬＢ寒天培地２．５ml
に、上記λgt１１感染大腸菌を加え、これを直ちにＬＢ
寒天培地上に撒いた。上層寒天培地が固化した後、４２
℃で３〜４時間培養し、プラークが観察された時点で１
０ｍＭ ＩＰＴＧ水溶液に浸漬したニトロセルロースフ
ィルター（φ８２mm）を上層寒天培地に乗せ、３７℃で
１２時間培養した。黒インクをつけた注射針で非対称に
３ヵ所突き刺してフィルターに目印をつけた後、フィル
ターを寒天培地からとり出し、１５０ｍＭＮａＣｌ及び
０．１％ツィーン２０含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（pH７．５）（以下、ＴＴＢＳ緩衝液という）で３回洗
浄した。寒天培地は冷蔵庫中に保存した。

【００４５】フィルターを１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有２
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(pH７．５）（以下、ＴＢＳ
緩衝液という）の０．１％牛血清アルブミン含有液に浸
し、３７℃で１時間振とうし、ブロッキング反応を行っ
た。次いで、フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で２回洗浄し
たのち、５〜１０μg/mlのクラミジア属細菌に特異的な
モノクローナル抗体（７０）のＴＴＢＳ溶液に浸し、３
７℃、１時間振とうした。フィルターをＴＴＢＳ緩衝液
で３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識の（５０ng/m
l）抗マウスＩｇＧ抗体溶液（ＴＴＢＳ緩衝液）中、３
７℃で１時間振とうした。フィルターをＴＴＢＳ緩衝液
で３回、及びＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、発色基質
液（ＴＢＳ緩衝液１００mlに３０％過酸化水素水溶液６
０μｌと０．３％ ４−クロロ−１−ナフトールのメタ
ノール溶液２０mlを加えて調製）に浸漬し、室温で約３
０分間放置した。十分発色した時点でフィルターをとり
出し、精製水で洗浄し、風乾した。

【００４６】フィルターの発色スポットに対応する寒天
培地上のプラークを捜して同定し、この部分の寒天をパ
スツールピペットでつき刺し、プラークを回収した。回
収したプラークはクロロホルム１滴を加えた０．１Ｍ
ＮａＣｌ、８ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．０１％ゼラ
チン含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）（以
下、ＳＭ緩衝液という）中に採り、４℃で一晩放置しプ
ラーク中のλファージを抽出した。プラークが全て上記
モノクローナル抗体と反応するようになるまで、前記操
作を繰り返し、抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを
クローン化した。このようにして、クラミジア属細菌特
異的モノクローナル抗体反応性のクラミジア・ニューモ
ニエ抗原ポリペプチドを発現するλファージが得られ、
これを７０−２Ｓλファージと命名した。

【００４７】（Ｇ）７０−２Ｓλファージの培養とＤＮ
Ａ精製 前記（Ｆ）で述べた方法と同様にしてプラークを形成さ
せ、一つのプラークを回収し、１００μｌのＳＭ緩衝液
に入れ、４℃で一晩放置しλファージを抽出した。ＬＢ
培養液で一晩培養した大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株２５０μ
ｌに、λファージ液５〜１０μｌを加え、３７℃で２０
分間放置し、大腸菌にλファージを感染させた。予め３
７℃に温めておいた１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含むＬ
Ｂ培地５０ｍｌに接種し、λファージによる大腸菌の溶
菌が起こるまで３７℃で５〜７時間振とう培養した。２
５０μｌのクロロホルムを加え、３，０００rpmで１０
分間遠心分離し大腸菌細胞残渣を除き、λファージ懸濁
液を得た。λファージＤＮＡは、Wizard λ preps キッ
ト（プロメガ社）を用いて精製した。

【００４８】（Ｈ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡの増幅 ６００μｌ用のマイクロチューブに、精製水６１．５μ
ｌ、１０倍濃度 反応用緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、
１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチンを含むトリ
ス−塩酸緩衝液ｐＨ８．３）１０μｌ、２０ｍＭ ｄＮ
ＴＰ １μｌ、５３−３ＳλファージＤＮＡ溶液０．１
μｌ、２０ｎＭ λgt１１ forward primer（宝酒造株
式会社）１μｌ、２０ｎＭ λgt１１ reverse primer
（宝酒造株式会社）１μｌ、AmpliTaq DNA Polymerase
０．５μｌを入れ、ミネラルオイルを２〜３滴重層し
た。９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７３℃ ２分の
サイクルのインキュベーションを３０回繰返し、ＤＮＡ
を増幅した。反応後、１．２％低温融解アガロースゲル
電気泳動を行い、増幅されたＤＮＡを切り出して Wizar
d PCR Prep キット（プロメガ社）で精製した。

【００４９】（Ｉ）ＤＮＡ塩基配列分析 ＤＮＡ塩基配列分析は、ＰＣＲで増幅したＤＮＡを鋳型
として、Taq DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミ
ネータサイクルシークエンス法でシークエンス反応を行
い、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオ
システムズ社）で分析を行った。得られたＤＮＡ塩基配
列を遺伝子配列分析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフ
トウェアエンジニアリング社）を用いて、編集、連結、
アミノ酸翻訳領域の推定を行ない、配列番号５の配列を
得た。配列番号５の配列の解析結果から、７３ＫＤａ抗
原ポリペプチドについて、そのＮ末端からＣ末端に向け
て約９０％のアミノ酸配列が解明されたことが分かっ
た。配列番号５の塩基配列及びアミノ酸配列の相同性検
索をＧｅｎＢａｎｋデータベースで行なった結果、これ
はクラミジア・トラコマチスから単離された遺伝子塩基
配列（L.M.Sardinia et al:J. Bacteriol., Vol.171, 3
35-341(1989)）と高い相同性を示すものであった。

【００５０】実施例２ クラミジア・ニューモニエの抗
原ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするＤＮＡ
を含む組換えベクターの作製、及びそれを含む形質転換
体の作製 ７０−２ＳλファージＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切
断し、このＤＮＡ断片５０ngに、予め制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで切断してあるプラスミドｐＢＲ３２２のＤＮＡ１０
０ngを添加し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造）
を用いてこれらのＤＮＡを連結する。この反応物を大腸
菌ＨＢ１０１株コンピテントセル（宝酒造）に入れ、形
質転換体を作製する。このプラスミドは、約６．４ｋｂ
ｐのＤＮＡであり、７３Ｋ抗原ポリペプチドの一部をコ
ードするＤＮＡを含むものである。この７３Ｋ抗原ポリ
ペプチドの一部をコードするＤＮＡの塩基配列は配列番
号２のようになっており、この塩基配列から推定される
アミノ酸配列はを配列番号１のようになっている。プラ
スミドから７３Ｋ抗原ポリペプチドの一部をコードする
ＤＮＡを切りだし、発現ベクターに入れ、これを大腸菌
等の宿主に入れてＤＮＡを発現させると、コードされて
いるタンパク質が菌体内に蓄積される。このタンパク質
を電気泳動、ニトロセルロース膜への転写、モノクロー
ナル抗体での検出を同様に行うと上記ポリペプチドに相
当するバンドが観察され、クラミジア属の細菌に特異的
に反応するモノクローナル抗体と反応することができる
７３Ｋ抗原ポリペプチドを発現していることが示され
る。

【００５１】実施例３ クラミジア・ニューモニエの５
３Ｋ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製 モノクローナル抗体７０の代わりに、モノクローナル抗
体ＡＹ６Ｅ２Ｅ８又はＳＣＰ５３を使用し、実施例１と
同様の手順で操作した。クローン５３−３Ｓλファージ
が得られ、これから配列番号６の配列が得られた。配列
番号６の配列の解析結果から、クラミジア・ニューモニ
エに特異的な５３Ｋ抗原タンパク質については、そのＮ
末端からＣ末端に向けて約６０％のアミノ酸配列が解明
されたことが分かった。配列番号６の塩基配列及びアミ
ノ酸配列の相同性検索をＧｅｎＢａｎｋデータベースで
行なった結果、高い相同性を示す既知の配列はなかっ
た。

【００５２】実施例４ クラミジア・ニューモニエの抗
原ポリペプチドを抗原として用いる、抗クラミジア・ニ
ューモニエ抗体の製造 （Ａ）骨髄腫細胞株の培養及び継代 骨髄腫細胞株はＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１５８０）を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含
むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、継代する。細胞融合
に供する２週間前に、０．１３ｍＭの８−アザグアニ
ン、０．５μg/mlのＭＣ−２１０（マイコプラズマ除去
剤、大日本製薬(株)製）及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血
清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養し、その後
の１週間は通常の培地で培養する。

【００５３】（Ｂ）マウスの免疫 タンパク質の濃度が２７０μg/mlの上記抗原ポリペプチ
ドの懸濁液２００μｌを、１２０００rpmで１０分間遠
心分離し、沈殿に２００μｌのＰＢＳを加え、再懸濁す
る。これに２００μｌのフロイントコンプリートアジュ
バントを加え、エマルジョンとし、その１５０μｌをマ
ウスの背中の皮下に注射する（この日を０日目とす
る）。１４日目、３４日目及び４９日目に、タンパク質
の濃度が２７０μg/mlの上記抗原ポリペプチドの懸濁液
１００μｌをマウスの腹腔内に注射し、更に、６９日目
にタンパク質の濃度が８００μg/mlの上記抗原ポリペプ
チドの懸濁液５０μｌ、９２日目に同懸濁液１００μｌ
をマウスの腹腔内に注射し、９５日目に脾臓を取り出
し、細胞融合に供する。

【００５４】（Ｃ）細胞融合 上記脾臓から得られる脾細胞１０⁸個に対して骨髄腫細
胞１０⁷個を丸底ガラスチューブにとり、よく混合し、
１４００rpmで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞
を更によく混合する。予め３７℃に保温してある３０％
（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールを含むＲＰＭＩ１６
４０培地０．４mlを加え、３０秒間放置する。７００rp
mで６分間遠心分離した後、ＲＰＭＩ１６４０培地１０
ｍｌを加え、ポリエチレングリコールがよく混ざるよう
にガラスチューブをゆっくり回転させ、１４００rpmで
５分間遠心分離し、上清を完全に除去し、沈殿に５mlの
ＨＡＴ培地を加え、５分間放置する。更に１０〜２０ml
のＨＡＴ培地を加え、３０分間放置し、骨髄腫細胞濃度
が３．３×１０⁵/mlとなるようにＨＡＴ培地を加えて細
胞を懸濁させ、パスツールピペットを用い９６ウェルプ
ラスチック製培養容器のウェルに２滴ずつ分注する。５
％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で培養し、１日
後、７日後及び１４日後にウェルにＨＡＴ培地を１〜２
滴加える。

【００５５】（Ｄ）抗体生産細胞のスクリーニング 上記抗原ポリペプチドをタンパク質濃度が１〜１０μg/
mlとなるように０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ソーダ含有
０．０５Ｍ重炭酸ソーダ緩衝液（pH９．６）に懸濁し、
０．０２％アジ化ソーダ含有０．０５Ｍ重炭酸ソーダ緩
衝液（pH９．６）に対して透析し、その後、タンパク質
濃度が１〜１０μg/mlとなるように希釈した液を、塩化
ビニル製９６ウェルＥＩＡ用プレートのウェルに５０μ
ｌとり、４℃で一晩放置し、抗原を吸着させる。上澄み
を除去し、ウェルに０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０
を含むＰＢＳ１５０μｌを加え、３分間放置し、その後
除去・洗浄する。洗浄操作を更に１回行なった後、ウェ
ルに１％（ｖ／ｖ）牛血清アルブミンを含むＰＢＳ１０
０μｌを加え、４℃で一晩以上放置し、ブロッキングを
行なう。牛血清アルブミンを含むＰＢＳを除いた後、
０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様
に２回洗浄後、ウェルに融合細胞の培養上清を５０μｌ
加え、室温で２時間放置する。０．０２％（ｗ／ｖ）ツ
ィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回洗浄後、ウェルに
２５ng/mlのペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ抗体を５０μｌ加え、室温で２時間放置する。０．０
２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回
洗浄後、ウェルにＡＢＴＳ溶液（ＫＰＬ社製）を５０μ
ｌ加え、室温で１５分〜１時間放置して発色反応させ、
９６ウエルＥＩＡプレート用光度計で４０５nmの吸光度
を測定する。そして陽性のウエル中の細胞をそれぞれパ
スツールピペットで回収し、２４ウェルプラスチック製
培養容器に移し、ＨＡＴ培地１〜２mlを加え、同様に培
養する。

【００５６】（Ｅ）限界希釈法によるクローニング ２４ウェルプラスチック製培養容器で増殖させた２株の
融合細胞の細胞濃度を測定し、細胞数が２０個/mlとな
るようそれぞれをＨＴ培地で希釈する。別にＨＴ培地に
懸濁した４〜６週齢のマウス胸腺細胞を９６ウェルプラ
スチック製培養容器に１〜２×１０⁵個/ウェルとり、こ
れに上記の融合細胞（細胞濃度が２０個/ml）を５０μ
ｌ/ウェルずつ加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気
下、３６℃で培養し、その１日後、７日後及び１４日後
にＨＴ培地を１〜２滴／ウェル加える。細胞の増殖が見
られたウェルの培養上清を５０μｌ回収し、上記（Ｄ）
の「抗体生産細胞のスクリーニング」と同様の方法で抗
体の生産を確認する。ウェル中に単一の細胞コロニーし
か存在せず、基本小体と反応する抗体を生産するもの
で、かつ増殖が早い細胞をウェルから回収し、引き続き
２４ウェルプラスチック製培養容器で増殖させる。更
に、同様のクローニング操作を繰り返し、抗クラミジア
・ニューモニエ抗体を産生するハイブリドーマを取得す
る。これを培養し、その培養上清から抗クラミジア・ニ
ューモニエ抗体を製造する。

【００５７】

【発明の効果】請求項１記載の抗原ポリペプチドは、ク
ラミジア・ニューモニエの抗体検査等に好適である。請
求項２記載の抗原ポリペプチドは、請求項１記載の抗原
ポリペプチドの効果を奏し、さらにアミノ酸配列の長さ
が短いため、担体等に固定化できる抗原ペプチドの数を
多くすることができ、それにより、感度の高い診断薬の
製造に利用できる。請求項３記載の抗原ポリペプチド
は、請求項１記載の抗原ポリペプチドの効果を奏し、さ
らに、タンパク質分解酵素による分解を受けにくい構造
をつくることができるので、抗原として安定性に優れ
る。請求項４記載の抗原ポリペプチドは、請求項１記載
の抗原ポリペプチドの効果を奏し、さらに、ポリペプチ
ドＣが、アミノ酸若しくは２〜１０００個のアミノ酸配
列を利用して担体等に固定化できるので、固定化による
抗原性の低下又は喪失が生じにくい。請求項５記載の抗
原ポリペプチドは、請求項１記載の抗原ポリペプチドの
効果を奏し、さらに、クラミジア属細菌に特異的な抗原
ポリペプチドの抗原部分を有するので、抗体検査やクラ
ミジア属細菌感染の正確な診断に極めて適切であり、ま
た、クラミジア・ニューモニエに特異的な抗原ポリペプ
チドと合わせて利用することにより、感染している種の
容易な区別に利用できる。請求項６記載のＤＮＡは、ク
ラミジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニュ
ーモニエ感染の診断等に好適な抗原ポリペプチドの製造
に好適である。請求項７記載のＤＮＡは、請求項６記載
のＤＮＡの効果を奏し、さらに、このＤＮＡにコードさ
れている抗原ポリペプチドはクラミジア・ニューモニエ
属細菌に特異的な抗原ポリペプチドの抗原部分を有する
ので、抗体検査やクラミジア属細菌感染の正確な診断に
極めて適切な抗原ポリペプチドの製造に好適である。請
求項８記載の組換えベクターは、クラミジア・ニューモ
ニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエの感染症の
診断に好適な抗原ポリペプチドの製造に適していであ
る。請求項９記載の形質転換体は、クラミジア・ニュー
モニエの抗体検査等に好適な抗原ポリペプチドの製造に
適している。請求項１０記載の抗クラミジア・ニューモ
ニエ抗体の製造方法は、クラミジア・ニューモニエ感染
の診断薬製造に好適である。

【００５８】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：571 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Pro Lys Gln Ala Glu Tyr Thr Trp Gly Ser Lys Lys Ile Leu Asp 1 5 10 15 Asn Ile Glu Cys Leu Thr Glu Asp Val Ala Glu Phe Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Tyr Thr Ala His Arg Ile Thr Ser Ser Glu Glu Glu Ser Asp Asn Glu 35 40 45 Ile Gln Pro Gly Ala Ile Leu Lys Gly Thr Val Val Asp Ile Asn Lys 50 55 60 Asp Phe Val Val Val Asp Val Gly Leu Lys Ser Glu Gly Val Ile Pro 65 70 75 80 Met Ser Glu Phe Ile Asp Ser Ser Glu Gly Leu Val Leu Gly Ala Glu 85 90 95 Val Glu Val Tyr Leu Asp Gln Ala Glu Asp Glu Glu Gly Lys Val Val 100 105 110 Leu Ser Arg Glu Lys Ala Thr Arg Gln Arg Gln Trp Glu Tyr Ile Leu 115 120 125 Ala His Cys Glu Glu Gly Ser Ile Val Lys Gly Gln Ile Thr Arg Lys 130 135 140 Val Lys Gly Gly Leu Ile Val Asp Ile Gly Met Glu Ala Phe Leu Pro 145 150 155 160 Gly Ser Gln Ile Asp Asn Lys Lys Ile Lys Asn Leu Asp Asp Tyr Val 165 170 175 Gly Lys Val Cys Glu Phe Lys Ile Leu Lys Ile Asn Val Glu Arg Arg 180 185 190 Asn Ile Val Val Ser Arg Arg Glu Leu Leu Glu Ala Glu Arg Ile Ser 195 200 205 Lys Lys Ala Glu Leu Ile Glu Gln Ile Ser Ile Gly Glu Tyr Arg Lys 210 215 220 Gly Val Val Lys Asn Ile Thr Asp Phe Gly Val Phe Leu Asp Leu Asp 225 230 235 240 Gly Ile Asp Gly Leu Leu His Ile Thr Asp Met Thr Trp Lys Arg Ile 245 250 255 Arg His Pro Ser Glu Met Val Glu Leu Asn Gln Glu Leu Glu Val Ile 260 265 270 Ile Leu Ser Val Asp Lys Glu Lys Gly Arg Val Ala Leu Gly Leu Lys 275 280 285 Gln Lys Glu His Asn Pro Trp Glu Asp Ile Glu Lys Lys Tyr Pro Pro 290 295 300 Gly Lys Arg Val Leu Gly Lys Ile Val Lys Leu Leu Pro Tyr Gly Ala 305 310 315 320 Phe Ile Glu Ile Glu Glu Gly Ile Glu Gly Leu Ile His Ile Ser Glu 325 330 335 Met Ser Trp Val Lys Asn Ile Val Asp Pro Ser Glu Val Val Asn Lys 340 345 350 Gly Asp Glu Val Glu Ala Ile Val Leu Ser Ile Gln Lys Asp Glu Gly 355 360 365 Lys Ile Ser Leu Gly Leu Lys Gln Thr Glu Arg Asn Pro Trp Asp Asn 370 375 380 Ile Glu Glu Lys Tyr Pro Ile Gly Leu His Val Asn Ala Glu Ile Lys 380 385 390 395 Asn Leu Thr Asn Tyr Gly Ala Phe Val Glu Leu Glu Pro Gly Ile Glu 400 405 410 Gly Leu Ile His Ile Ser Asp Met Ser Trp Ile Lys Lys Val Ser His 415 420 425 Pro Ser Glu Leu Phe Lys Lys Gly Asn Ser Val Glu Ala Val Ile Leu 430 435 440 Ser Val Asp Lys Glu Ser Lys Lys Ile Thr Leu Gly Val Lys Gln Leu 445 450 455 Ser Ser Asn Pro Trp Asn Glu Ile Glu Ala Met Phe Pro Ala Gly Thr 460 465 470 475 Val Ile Ser Gly Val Val Thr Lys Ile Thr Ala Phe Gly Ala Phe Val 480 485 490 Glu Leu Gln Asn Gly Ile Glu Gly Leu Ile His Val Ser Glu Leu Ser 495 500 505 Asp Lys Pro Phe Ala Lys Ile Glu Asp Ile Ile Ser Ile Gly Glu Asn 510 515 520 Val Ser Ala Lys Val Ile Lys Leu Asp Pro Asp His Lys Lys Val Ser 525 530 535 Leu Ser Val Lys Glu Tyr Leu Ala Asp Asn Ala Tyr Asp Gln Asp Ser 540 545 550 560 Arg Thr Glu Leu Asp Phe Lys Asp Ser Gln Gly 565 570 571

【００５９】配列番号：２ 配列の長さ：１７１２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 ATGCCAAAAC AAGCTGAATA TACTTGGGGA TCTAAAAAAA TTCTGGACAA TATAGAATGC 60 CTCACAGAAG ACGTTGCCGA ATTTAAAGAT TTGCTTTATA CGGCACACAG AATTACTTCG 120 AGCGAAGAAG AATCTGATAA CGAAATACAG CCTGGCGCCA TCCTAAAAGG TACCGTAGTT 180 GATATTAATA AAGACTTTGT CGTAGTTGAT GTTGGTCTGA AGTCTGAGGG AGTGATCCCT 240 ATGTCAGAGT TCATAGACTC TTCAGAAGGT TTAGTGCTTG GAGCTGAAGT AGAAGTCTAT 300 CTCGACCAAG CCGAAGACGA AGAGGGCAAA GTTGTCCTTT CTAGAGAAAA AGCCACACGA 360 CAACGTCAAT GGGAATACAT CTTAGCTCAT TGTGAAGAAG GTTCTATTGT TAAAGGTCAA 420 ATTACACGTA AAGTCAAAGG CGGCCTTATT GTAGATATTG GAATGGAAGC CTTCCTACCT 480 GGATCACAAA TTGACAACAA GAAAATCAAA AATTTAGATG ATTATGTCGG AAAAGTTTGT 540 GAATTCAAAA TTTTAAAAAT TAACGTTGAA CGTCGCAATA TTGTTGTCTC AAGAAGAGAA 600 CTCTTAGAAG CTGAGAGAAT CTCTAAGAAA GCCGAACTTA TTGAACAAAT TTCTATCGGA 660 GAATACCGCA AAGGAGTTGT TAAAAACATT ACTGACTTTG GTGTATTCTT AGATCTCGAT 720 GGTATTGACG GTCTTCTCCA CATTACCGAT ATGACCTGGA AGCGCATACG ACATCCTTCC 780 GAAATGGTCG AATTGAATCA AGAGTTGGAA GTAATTATTT TAAGCGTAGA TAAAGAAAAA 840 GGACGAGTTG CTCTAGGTCT CAAACAAAAA GAGCATAATC CTTGGGAAGA TATTGAGAAG 900 AAATACCCTC CTGGAAAACG AGTTCTTGGT AAAATTGTGA AGCTTCTCCC CTACGGAGCT 960 TTCATTGAAA TTGAAGAGGG CATTGAAGGT CTAATTCACA TTTCTGAAAT GTCTTGGGTG 1020 AAAAATATTG TAGATCCTAG TGAAGTCGTA AATAAAGGCG ATGAAGTTGA AGCCATTGTT 1080 CTATCTATTC AGAAGGACGA AGGAAAAATT TCTCTAGGAT TAAAGCAAAC AGAACGTAAT 1140 CCTTGGGACA ATATCGAAGA AAAATATCCT ATAGGTCTCC ATGTCAATGC TGAAATCAAG 1200 AACTTAACCA ATTACGGTGC TTTCGTTGAA TTAGAACCAG GAATTGAGGG TCTGATTCAT 1260 ATTTCTGACA TGAGTTGGAT TAAAAAAGTC TCTCACCCTT CAGAACTATT CAAAAAAGGA 1320 AATTCTGTAG AGGCTGTTAT TTTATCAGTA GACAAAGAAA GTAAAAAAAT TACTTTAGGA 1380 GTTAAGCAAT TAAGTTCTAA TCCTTGGAAT GAAATTGAAG CTATGTTCCC TGCTGGCACA 1440 GTAATTTCAG GAGTTGTGAC TAAAATCACT GCATTTGGAG CCTTTGTTGA GCTACAAAAC 1500 GGGATTGAAG GATTGATTCA CGTTTCAGAA CTTTCTGACA AGCCCTTTGC AAAAATTGAA 1560 GATATTATCT CCATTGGAGA AAATGTTTCT GCAAAAGTAA TTAAGCTAGA TCCAGATCAT 1620 AAAAAAGTTT CTCTTTCTGT AAAAGAATAC TTAGCTGACA ATGCTTATGA TCAAGACTCT 1680 AGGACTGAAT TAGATTTCAA GGATTCTCAA GG 1712

【００６０】配列番号：3 配列の長さ：259 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met 1 5 10 15 Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys 20 25 30 Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys 35 40 45 Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys 50 55 60 Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly 65 70 75 80 Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp 85 90 95 Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr 100 105 110 Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu 115 120 125 Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu 130 135 140 Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser 145 150 155 160 Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg 165 170 175 Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr 180 185 190 Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln 195 200 205 Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile 210 215 220 Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu 225 230 235 240 Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val 245 250 255 Met Ile Ala 259

【００６１】配列番号：4 配列の長さ：777 配列の型：核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 ATGTCTATTT CATCTTCTTC AGGACCTGAC AATCAAAAAA ATATCATGTC TCAAGTTCTG 60 ACATCGACAC CCCAGGGCGT GCCCCAACAA GATAAGCTGT CTGGCAACGA AACGAAGCAA 120 ATACAGCAAA CACGTCAGGG TAAAAACACT GAGATGGAAA GCGATGCCAC TATTGCTGGT 180 GCTTCTGGAA AAGACAAAAC TTCCTCGACT ACAAAAACAG AAACAGCTCC ACAACAGGGA 240 GTTGCTGCTG GGAAAGAATC CTCAGAAAGT CAAAAGGCAG GTGCTGATAC TGGAGTATCA 300 GGAGCGGCTG CTACTACAGC ATCAAATACT GCAACAAAAA TTGCTATGCA GACCTCTATT 360 GAAGAGGCGA GCAAAAGTAT GGAGTCTACC TTAGAGTCAC TTCAAAGCCT CAGTGCCGCG 420 CAAATGAAAG AAGTCGAAGC GGTTGTTGTT GCTGCCCTCT CAGGGAAAAG TTCGGGTTCC 480 GCAAAATTGG AAACACCTGA GCTCCCCAAG CCCGGGGTGA CACCAAGATC AGAGGTTATC 540 GAAATCGGAC TCGCGCTTGC TAAAGCAATT CAGACATTGG GAGAAGCCAC AAAATCTGCC 600 TTATCTAACT ATGCAAGTAC ACAAGCACAA GCAGACCAAA CAAATAAACT AGGTCTAGAA 660 AAGCAAGCGA TAAAAATCGA TAAAGAACGA GAAGAATACC AAGAGATGAA GGCTGCCGAA 720 CAGAAGTCTA AAGATCTCGA AGGAACAATG GATACTGTCA ATACTGTGAT GATCGCG 777

【００６２】配列番号：5 配列の長さ：1954 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：C. ニューモニエ 株名：YK-41 直接の起源 クローン:70-2S 配列の特徴 特徴を表す記号：−３５ signal 存在位置：146..151 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：−１０ signal 存在位置：１６９．．１７４ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＲＢＳ 存在位置：１９９．．２０５ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：215..1927 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 TTGACACCAG ACCAACTGGT AATGGTAGCG ACCGGCGCTC AGCTGGAATT CGAACCCCTT 60 CGCCTTATAC ATCTCTAGAA CGGAAGTATA GGATTTTACG ATTAATTCGA TTATATAGAA 120 CTAATCGTCT CCTGCAAGGG AGGTCTTGCC TTTTTTAAGG TTTATATTTA CACTGTCTTT 180 TTTGACTTTG TAGTTTTTAG GAGAATAACA ATAA ATG CCA AAA CAA GCT GAA TAT 235 Met Pro Lys Gln Ala Glu Tyr 1 5 ACT TGG GGA TCT AAA AAA ATT CTG GAC AAT ATA GAA TGC CTC ACA GAA 283 Thr Trp Gly Ser Lys Lys Ile Leu Asp Asn Ile Glu Cys Leu Thr Glu 10 15 20 GAC GTT GCC GAA TTT AAA GAT TTG CTT TAT ACG GCA CAC AGA ATT ACT 331 Asp Val Ala Glu Phe Lys Asp Leu Leu Tyr Thr Ala His Arg Ile Thr 25 30 35 TCG AGC GAA GAA GAA TCT GAT AAC GAA ATA CAG CCT GGC GCC ATC CTA 379 Ser Ser Glu Glu Glu Ser Asp Asn Glu Ile Gln Pro Gly Ala Ile Leu 40 45 50 55 AAA GGT ACC GTA GTT GAT ATT AAT AAA GAC TTT GTC GTA GTT GAT GTT 427 Lys Gly Thr Val Val Asp Ile Asn Lys Asp Phe Val Val Val Asp Val 60 65 70 GGT CTG AAG TCT GAG GGA GTG ATC CCT ATG TCA GAG TTC ATA GAC TCT 475 Gly Leu Lys Ser Glu Gly Val Ile Pro Met Ser Glu Phe Ile Asp Ser 75 80 85 TCA GAA GGT TTA GTG CTT GGA GCT GAA GTA GAA GTC TAT CTC GAC CAA 523 Ser Glu Gly Leu Val Leu Gly Ala Glu Val Glu Val Tyr Leu Asp Gln 90 95 100 GCC GAA GAC GAA GAG GGC AAA GTT GTC CTT TCT AGA GAA AAA GCC ACA 571 Ala Glu Asp Glu Glu Gly Lys Val Val Leu Ser Arg Glu Lys Ala Thr 105 110 115 CGA CAA CGT CAA TGG GAA TAC ATC TTA GCT CAT TGT GAA GAA GGT TCT 619 Arg Gln Arg Gln Trp Glu Tyr Ile Leu Ala His Cys Glu Glu Gly Ser 120 125 130 135 ATT GTT AAA GGT CAA ATT ACA CGT AAA GTC AAA GGC GGC CTT ATT GTA 667 Ile Val Lys Gly Gln Ile Thr Arg Lys Val Lys Gly Gly Leu Ile Val 140 145 150 GAT Ile Gly Met Glu Ala Phe Leu Pro Gly Ser Gln Ile Asp Asn Lys 715 Asp ATT GGA ATG GAA GCC TTC CTA CCT GGA TCA CAA ATT GAC AAC AAG 155 160 165 Lys ATC AAA AAT TTA GAT GAT TAT GTC GGA AAA GTT TGT GAA TTC AAA 763 AAA Ile Lys Asn Leu Asp Asp Tyr Val Gly Lys Val Cys Glu Phe Lys 170 175 180 ATT TTA AAA ATT AAC GTT GAA CGT CGC AAT ATT GTT GTC TCA AGA AGA 811 Ile Leu Lys Ile Asn Val Glu Arg Arg Asn Ile Val Val Ser Arg Arg 185 190 195 GAA CTC TTA GAA GCT GAG AGA ATC TCT AAG AAA GCC GAA CTT ATT GAA 859 Glu Leu Leu Glu Ala Glu Arg Ile Ser Lys Lys Ala Glu Leu Ile Glu 200 205 210 215 CAA ATT TCT ATC GGA GAA TAC CGC AAA GGA GTT GTT AAA AAC ATT ACT 907 Gln Ile Ser Ile Gly Glu Tyr Arg Lys Gly Val Val Lys Asn Ile Thr 220 225 230 GAC TTT GGT GTA TTC TTA GAT CTC GAT GGT ATT GAC GGT CTT CTC CAC 955 Asp Phe Gly Val Phe Leu Asp Leu Asp Gly Ile Asp Gly Leu Leu His 235 240 245 ATT ACC GAT ATG ACC TGG AAG CGC ATA CGA CAT CCT TCC GAA ATG GTC 1003 Ile Thr Asp Met Thr Trp Lys Arg Ile Arg His Pro Ser Glu Met Val 250 255 260 GAA TTG AAT CAA GAG TTG GAA GTA ATT ATT TTA AGC GTA GAT AAA GAA 1051 Glu Leu Asn Gln Glu Leu Glu Val Ile Ile Leu Ser Val Asp Lys Glu 265 270 275 AAA GGA CGA GTT GCT CTA GGT CTC AAA CAA AAA GAG CAT AAT CCT TGG 1099 Lys Gly Arg Val Ala Leu Gly Leu Lys Gln Lys Glu His Asn Pro Trp 280 285 290 295 GAA GAT ATT GAG AAG AAA TAC CCT CCT GGA AAA CGA GTT CTT GGT AAA 1147 Glu Asp Ile Glu Lys Lys Tyr Pro Pro Gly Lys Arg Val Leu Gly Lys 300 305 310 ATT GTG AAG CTT CTC CCC TAC GGA GCT TTC ATT GAA ATT GAA GAG GGC 1195 Ile Val Lys Leu Leu Pro Tyr Gly Ala Phe Ile Glu Ile Glu Glu Gly 315 320 325 ATT GAA GGT CTA ATT CAC ATT TCT GAA ATG TCT TGG GTG AAA AAT ATT 1243 Ile Glu Gly Leu Ile His Ile Ser Glu Met Ser Trp Val Lys Asn Ile 330 335 340 GTA GAT CCT AGT GAA GTC GTA AAT AAA GGC GAT GAA GTT GAA GCC ATT 1291 Val Asp Pro Ser Glu Val Val Asn Lys Gly Asp Glu Val Glu Ala Ile 345 350 355 GTT CTA TCT ATT CAG AAG GAC GAA GGA AAA ATT TCT CTA GGA TTA AAG 1339 Val Leu Ser Ile Gln Lys Asp Glu Gly Lys Ile Ser Leu Gly Leu Lys 360 365 370 375 CAA ACA GAA CGT AAT CCT TGG GAC AAT ATC GAA GAA AAA TAT CCT ATA 1387 Gln Thr Glu Arg Asn Pro Trp Asp Asn Ile Glu Glu Lys Tyr Pro Ile ３８０ 385 390 GGT CTC CAT GTC AAT GCT GAA ATC AAG AAC TTA ACC AAT TAC GGT GCT 1435 Gly Leu His Val Asn Ala Glu Ile Lys Asn Leu Thr Asn Tyr Gly Ala 395 400 405 TTC GTT GAA TTA GAA CCA GGA ATT GAG GGT CTG ATT CAT ATT TCT GAC 1483 Phe Val Glu Leu Glu Pro Gly Ile Glu Gly Leu Ile His Ile Ser Asp 410 415 420 ATG AGT TGG ATT AAA AAA GTC TCT CAC CCT TCA GAA CTA TTC AAA AAA 1531 Met Ser Trp Ile Lys Lys Val Ser His Pro Ser Glu Leu Phe Lys Lys 425 430 435 GGA AAT TCT GTA GAG GCT GTT ATT TTA TCA GTA GAC AAA GAA AGT AAA 1579 Gly Asn Ser Val Glu Ala Val Ile Leu Ser Val Asp Lys Glu Ser Lys 440 445 450 455 AAA ATT ACT TTA GGA GTT AAG CAA TTA AGT TCT AAT CCT TGG AAT GAA 1627 Lys Ile Thr Leu Gly Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Pro Trp Asn Glu 460 465 470 ATT GAA GCT ATG TTC CCT GCT GGC ACA GTA ATT TCA GGA GTT GTG ACT 1675 Ile Glu Ala Met Phe Pro Ala Gly Thr Val Ile Ser Gly Val Val Thr 475 480 485 AAA ATC ACT GCA TTT GGA GCC TTT GTT GAG CTA CAA AAC GGG ATT GAA 1723 Lys Ile Thr Ala Phe Gly Ala Phe Val Glu Leu Gln Asn Gly Ile Glu 490 495 500 GGA TTG ATT CAC GTT TCA GAA CTT TCT GAC AAG CCC TTT GCA AAA ATT 1771 Gly Leu Ile His Val Ser Glu Leu Ser Asp Lys Pro Phe Ala Lys Ile 505 510 515 GAA GAT ATT ATC TCC ATT GGA GAA AAT GTT TCT GCA AAA GTA ATT AAG 1919 Glu Asp Ile Ile Ser Ile Gly Glu Asn Val Ser Ala Lys Val Ile Lys 520 525 530 535 CTA GAT CCA GAT CAT AAA AAA GTT TCT CTT TCT GTA AAA GAA TAC TTA 1867 Leu Asp Pro Asp His Lys Lys Val Ser Leu Ser Val Lys Glu Tyr Leu 540 545 550 GCT GAC AAT GCT TAT GAT CAA GAC TCT AGG ACT GAA TTA GAT TTC AAG 1915 Ala Asp Asn Ala Tyr Asp Gln Asp Ser Arg Thr Glu Leu Asp Phe Lys 555 560 565 GAT TCT CAA GGC GAA GGG GTT CGA ATT CCG CCG ATA CTG 1954 Asp Ser Gln Gly Glu Gly Val Arg Ile Pro Pro Ile Leu 570 575 580

【００６３】配列番号：6 配列の長さ：1048 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：C. ニューモニエ 株名：YK-41 直接の起源 クローン：53-3S 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：236..1012 特徴を決定した方法：P 配列 TCAGTATCGG CGGAATTCGA ACCCCTTCGC GGCTCTTTCT GGAACTCTAG AATCTTTACA 60 TCTCGAAGAG TTAACTCAAG GATTATTCCC TTCTGCCCAA GAAGATGCCA ACTTCGCAAA 120 GGAGTTATCT TCAGTAGTAC ACGGATTAAA AAACCTAACC ACTGTAGTTA ATAAACAAAT 180 GGTTAAAGGC GCTGAGTAAA GCCCTTTGCA GAATCAAACC CCTTAGGATA CAAAC ATG 238 Met 1 TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC ATG TCT 286 Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met Ser 5 10 15 CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT AAG CTG 334 Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys Leu 20 25 30 TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT AAA AAC 382 Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys Asn 35 40 45 ACT GAG ATG GAA AGC GAT GCC ACT ATT GCT GGT GCT TCT GGA AAA GAC 430 Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys Asp 50 55 60 65 AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG GGA GTT 478 Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly Val 70 75 80 GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT GAT ACT 526 Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp Thr 85 90 95 GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA ACA AAA 574 Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr Lys 100 105 110 ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG GAG TCT 622 Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu Ser 115 120 125 ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA GAA GTC 670 Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu Val 130 135 140 145 GAA GCG GTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT TCC GCA 718 Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser Ala 150 155 160 AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA AGA TCA 766 Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg Ser 165 170 175 GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG ACA TTG 814 Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr Leu 180 185 190 GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA CAA GCA 862 Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln Ala 195 200 205 CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG ATA AAA 910 Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile Lys 210 215 220 225 ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC GAA CAG 958 Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu Gln 230 235 240 AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT GTG ATG 1006 Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val Met 245 250 255 ATC GCG AAGGGGTTCG AATTCCAGCT GAGCGCCGGT CGCTAC 1048 Ile Ala ２５９

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【書類名】 受託番号変更届

【提出日】 平成７年７ 月２０日

【旧寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術研
究所

【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１３６８８

【新寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術研
究所

【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−５１５４

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (54)【発明の名称】 クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチド、それをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを含む組 換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体、及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体の 製造方法

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１のポリペプチドの中の連続し
   た少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＣ
   からなる、クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチ
   ド。
2. 【請求項２】 ポリペプチドＣが配列番号１のポリペプ
   チドからアミノ酸１〜２５０個が欠落しているポリペプ
   チドである、請求項１記載の抗原ポリペプチド。
3. 【請求項３】 ポリペプチドＣが、配列番号１のポリペ
   プチドの中のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置
   換されているポリペプチドである、請求項１記載の抗原
   ポリペプチド。
4. 【請求項４】 ポリペプチドＣが、配列番号１のポリペ
   プチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列に
   アミノ酸若しくは２〜１０００個のアミノ酸配列が結合
   したポリペプチドである、請求項１記載の抗原ポリペプ
   チド。
5. 【請求項５】 ポリペプチドＣが配列番号１のアミノ酸
   配列からなるポリペプチドである、請求項１記載の抗原
   ポリペプチド。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載の抗原ポ
   リペプチドをコードするＤＮＡ若しくはそれに相補的な
   ＤＮＡ。
7. 【請求項７】 塩基配列が配列番号２の塩基配列であ
   る、請求項６記載のＤＮＡ。
8. 【請求項８】 請求項６又は請求項７記載のＤＮＡを含
   む組換えベクター。
9. 【請求項９】 請求項８記載の組換えベクターを含む形
   質転換体。
10. 【請求項１０】 請求項１〜５のいずれかに記載の抗原
    ポリペプチドを抗原として用いることを特徴とする、抗
    クラミジア・ニューモニエ抗体の製造方法。