JPH08294400A

JPH08294400A - クラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出・測定用プローブ及びプライマー、該プローブ又はプライマーを用いるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出・測定方法、並びに該プローブ又はプライマーを含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出・測定用試薬

Info

Publication number: JPH08294400A
Application number: JP7106015A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Izutsu; 浩井筒; Akira Matsumoto; 明松本
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Showa Denko Materials Co Ltd
Priority date: 1995-04-28
Filing date: 1995-04-28
Publication date: 1996-11-12

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】クラミジア・ニューモニエ遺伝子を特異的に
検出・測定するためのプローブ及びプライマーを提供
し、さらに、これを用いたクラミジア・ニューモニエ遺
伝子の特異的検出・測定方法、並びに該プローブ又はプ
ライマーを含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝
子の検出・測定用試薬を提供する。【構成】（ａ）配列番号１のＤＮＡの中の連続した少
なくとも１０塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、（ｂ）上
記（ａ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、又は（ｃ）上記
（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡと９０％以上の相同性を
有するＤＮＡのいずれかを含有するＤＮＡからなる、ク
ラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出・測定用プロー
ブ、このプローブを用いる、クラミジア・ニューモニエ
遺伝子の検出・測定方法、このプローブを含有してなる
クラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出・測定用試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、クラミジア・ニューモ
ニエ遺伝子の検出・測定用プローブ及びプライマー、該
プローブ又はプライマーを用いるクラミジア・ニューモ
ニエ遺伝子の検出・測定方法、並びに該プローブ又はプ
ライマーを含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝
子の検出・測定用試薬に関する。本発明は医薬品工業、
特にクラミジア・ニューモニエ感染症の診断薬の製造に
おいて有効に利用される。

【０００２】

【従来の技術】クラミジア(Chlamydia)属に属する微生
物は、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomat
is)、クラミジア・シッタシ(Chlamydia psittaci)、ク
ラミジア・ペコラム(Chlamydia pecorum)、クラミジア
・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)等の種（Specie
s）が知られている。クラミジア・ニューモニエは肺
炎、上気道炎などの呼吸器感染症の原因菌として広く蔓
延していることが知られており、クラミジア・ニューモ
ニエ感染症の治療には適切な抗生物質を投与することが
必要である。しかし、クラミジア・ニューモニエが引き
起こす呼吸器感染症の症状は、マイコプラズマ・ニュー
モニエやインフルエンザウイルスが原因で起こる感染症
の症状と類似しているので、しばしば誤診されやすい。
そのため、治療に際してはクラミジア・ニューモニエに
感染しているか否かを調べる必要がある。

【０００３】特定の微生物に感染しているか否かを調べ
る方法としては遺伝子検査法がある。これは、核酸プロ
ーブ等を用いて検体中に検出対象の微生物の遺伝子が存
在するか否かを調べる方法である。クラミジア・ニュー
モニエの遺伝子検査法としては、特表昭６４−５０００
８３号公報、米国特許第５，２８１，５１８号公報、及
びＷＯ９４／０４５４９号公報に記載された方法が知ら
れている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、特表昭６４−
５０００８３号公報及び米国特許第５，２８１，５１８
号公報には、クラミジア・ニューモニエ染色体ＤＮＡそ
のもの又は染色体ＤＮＡを制限酵素等で分解して得られ
るＤＮＡ断片をプローブとして用いることが記載されて
いるだけであり、これらのＤＮＡの塩基配列は明らかで
はなく、それゆえ、プローブの特異性が定かではなく、
また反応条件の設定も困難である。一方、ＷＯ９４／０
４５４９号公報に記載された方法は、リボソームＲＮＡ
又はそれをコードするＤＮＡにハイブリダイズするプロ
ーブを用いるものであるが、リボソームＲＮＡはすべて
の生物において比較的相同性が高いため、このプローブ
の特異性も定かではない。

【０００５】本発明は、クラミジア・ニューモニエ遺伝
子を特異的に検出・測定するためのプローブ及びプライ
マーを提供し、さらに、これを用いたクラミジア・ニュ
ーモニエ遺伝子の特異的検出・測定方法、並びに該プロ
ーブ又はプライマーを含有してなるクラミジア・ニュー
モニエ遺伝子の検出・測定用試薬を提供することを目的
とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、クラミジ
ア・ニューモニエのゲノムＤＮＡから、クラミジア・ニ
ューモニエの抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを取
得し、その塩基配列を解読・解析することによって本発
明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明は、下記（１）〜（１
０）に関するものである。（１）（ａ）配列番号１のＤＮＡの中の連続した少なく
とも１０塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、（ｂ）上記
（ａ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、又は（ｃ）上記
（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡと９０％以上の相同性を
有するＤＮＡ、のいずれかを含有するＤＮＡからなる、
クラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出・測定用プロー
ブ。（２）塩基配列が配列番号２の塩基配列である、上記
（１）記載のプローブ。（３）塩基配列が配列番号３の塩基配列である、上記
（１）記載のプローブ。（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のプローブ
を用いる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出・測
定方法。（５）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のプローブ
を含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出
・測定用試薬。（６）（ａ）配列番号１のＤＮＡの中の連続した少なく
とも１０塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、（ｂ）上記
（ａ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、又は（ｃ）上記
（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡと９０％以上の相同性を
有するＤＮＡ、のいずれかを含有するＤＮＡからなる、
クラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出・測定用プライ
マー。（７）塩基配列が配列番号２の塩基配列である、上記
（６）記載のプライマー。（８）塩基配列が配列番号３の塩基配列である、上記
（６）記載のプライマー。（９）上記（６）〜（８）のいずれかに記載のプライマ
ーを用いる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出・
測定方法。（１０）上記（６）〜（８）のいずれかに記載のプライ
マーを含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の
検出・測定用試薬。

【０００８】本明細書において使用した略号の意味は以
下の通りである。ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン−５′−三リン酸（deox
yadenosine 5′-triphosphate）ｄＣＴＰ：デオキシシチジン−５′−三リン酸（deoxyc
ytidine 5′-triphosphate）ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン−５′−三リン酸（deox
yguanosine 5′-triphosphate）ｄＴＴＰ：デオキシチアミン−５′−三リン酸（deoxyt
hiamin 5′-triphosphate）

【０００９】以下、本発明の詳細を、１．クラミジア・
ニューモニエ遺伝子のクローニング、２．クラミジア・
ニューモニエ遺伝子の検出・測定用プローブ及びプライ
マー、３．クラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出・測
定方法、並びに、４．クラミジア・ニューモニエ遺伝子
の検出・測定用試薬、の順に説明する。

【００１０】１．クラミジア・ニューモニエ遺伝子のク
ローニング１．１クラミジア・ニューモニエの培養培養したＨＬ細胞から細胞浮遊液を調製し、培養上清を
除去した後にクラミジア・ニューモニエの浮遊液を添加
してこれを培養し、遠心分離してクラミジア・ニューモ
ニエ感染ＨＬ細胞を取得する。クラミジア・ニューモニ
エとしては、例えばクラミジア・ニューモニエＹＫ４１
株(金本ら：ミクロバイオロジカル・イムノロジー、37
巻、495-498頁、1993年(Y.Kanamoto et al., Microbio
l. Immunol., Vol.37, p.495-498, 1993))が使用でき
る。１．２クラミジア・ニューモニエの基本小体の精製クラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を破砕し、遠心
分離し、上清を回収する。ウログラフィン（シェーリン
グ社製）を用いた連続密度勾配液にこの上清を添加して
遠心分離し、クラミジア・ニューモニエの基本小体に相
当するバンドを回収する。

【００１１】１．３クラミジア・ニューモニエのゲノ
ムＤＮＡの調製クラミジア・ニューモニエの基本小体を、１ｍＭＥＤ
ＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）
（以下、ＴＥ緩衝液という）に懸濁し、１％ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液及び１mg/mlプロテイナ
ーゼＫ水溶液を加えて保温し、基本小体を溶解させる。
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）飽和フェノー
ルを加えて撹拌し、遠心分離し、水層を回収する。さら
にＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）処理をし、フェノール
／クロロホルム／イソアミルアルコール処理とエタノー
ル沈殿処理をし、クラミジア・ニューモニエのゲノムＤ
ＮＡを取得する。

【００１２】１．４ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの
作製ゲノムＤＮＡを制限酵素ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及びＡｌ
ｕＩで消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミル
アルコール処理とエタノール沈殿処理をし、部分消化Ｄ
ＮＡを取得する。この部分消化ＤＮＡにリンカー、アデ
ノシン−５′−三リン酸（adenosine 5′-triphosphat
e、以下、ＡＴＰと略す）及びＴ４リガーゼを添加し
て、部分消化ＤＮＡにリンカーを付加させる。これを、
０．１ＭＮａＣｌ及び１ｍＭＥＤＴＡ含有１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液を移動相とするクロマ・スピン６０
００（Chroma spin 6000）カラムにかけ、溶出液を分取
し、１ｋｂｐから７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回
収する。得られた分画にＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを加えて反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリ
ン酸化する。反応液をフェノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコール処理及びエタノール沈殿処理し、５′
端がリン酸化されたＤＮＡ断片を取得する。このＤＮＡ
断片に、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断しておいたλgt
１１ＤＮＡ、ＡＴＰ及びＴ４リガーゼを加えて反応さ
せ、市販のパッケージングキットを用い、得られた組換
えλgt１１ＤＮＡをパッケージングし、ゲノムＤＮＡ発
現ライブラリーを作製する。

【００１３】１．５抗原ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡのクローニングクローニングするクラミジア・ニューモニエの遺伝子と
して、クラミジア・ニューモニエの７３ＫＤａ抗原ポリ
ペプチドの遺伝子を利用する。大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株
の培養液に上記ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーを感染さ
せ、寒天培地上で培養し、イソプロピルチオ−β−Ｄ−
ガラクトシド（ＩＰＴＧ）水溶液に浸漬したニトロセル
ロースフィルターを利用して、挿入ＤＮＡの発現により
菌体内に産生されたタンパク質をニトロセルロースフィ
ルターに付着させる。このフィルターを牛血清アルブミ
ンを用いてブロッキング反応させ、洗浄し、次いでフィ
ルターを抗クラミジア・ニューモニエモノクローナル抗
体と反応させる。抗クラミジア・ニューモニエモノクロ
ーナル抗体としては、例えば、７０及びＡＹ６Ｅ２Ｅ８
を使用することができる。７０は本発明者の一人の松本
等がクラミジア・ニューモニエＫＫｐｎ−１株を抗原と
してマウスを免疫し、その脾臓細胞をミエローマ細胞と
融合させて得られたハイブリドーマ７０が分泌する抗体
である。また、ＡＹ６Ｅ２Ｅ８は本発明者の一人の井筒
等が、クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本小
体を抗原として、マウスを免疫し、その脾臓細胞をミエ
ローマと細胞融合させて得られたハイブリドーマＡＹ６
Ｅ２Ｅ８が分泌する抗体ＡＹ６Ｅ２Ｅ８であり、ＡＹ６
Ｅ２Ｅ８を産生するハイブリドーマは工業技術院生命工
学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１３６８８
として寄託されている。反応後、フィルターを洗浄し、
パーオキシダーゼ等の酵素で標識された抗マウスＩｇＧ
抗体を反応させる。反応後、フィルターを洗浄し、発色
基質液を添加して反応させる。発色基質液としては、例
えば、過酸化水素水溶液及び４−クロロ−１−ナフトー
ルのメタノール溶液を含む液を利用することができる。
反応後、フィルターを洗浄し、風乾させる。

【００１４】フィルターの発色スポットに対応する寒天
培地上のプラークを同定し、プラークに含まれるλファ
ージを取得する。プラークが全て上記モノクローナル抗
体と反応するようになるまで前記操作を繰り返し、抗原
ポリペプチドをコードするＤＮＡをクローン化し、抗ク
ラミジア・ニューモニエモノクローナル抗体反応性のク
ラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドを発現するλ
ファージを取得する。

【００１５】１．６クラミジア・ニューモニエ抗原ポ
リペプチドをコードするＤＮＡの取得取得したλファージを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染さ
せ、培養し、λファージを大量に生産する。市販のキッ
トを用いてλファージからＤＮＡを取得・精製する。こ
のＤＮＡにプライマー、タックポリメラーゼ（Taq Poly
merase）及びデオキシヌクレオチド類を添加し、加熱、
冷却、保温の工程を繰り返し、λgt11に挿入されたＤＮ
Ａを増幅させる。プライマーとしては、例えば、λgt１
１・フォワード・プライマー（λgt１１ forward prime
r）及びλgt１１・リバース・プライマー（λgt１１ re
verse primer）（いずれも宝酒造株式会社製）があり、
タックポリメラーゼとしては、例えば、アンプリタック
・ＤＮＡ・ポリメラーゼ（AmpliTaq DNA Polymerase）
がある。このＤＮＡ増幅方法の一般的手法はＰＣＲ法と
して知られており、詳細は「サムブロック他編集、モレ
キュラー・クローニング第２版（コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー）(1989年)」（J.Samblook
et al., Molecular Cloning 2nd ed., Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press （1989）、以下、本文献を文
献″モレキュラー・クローニング″という）に記載され
ている。

【００１６】増幅されたＤＮＡを取得し、塩基配列を決
定・解析する。ＤＮＡの取得には市販のキットを使用す
ることができ、例えばウイザード・ＰＣＲ・プレップキ
ット(Wizard PCR Prep kit)(プロメガ(Promega)社製品)
を使用することができる。また、塩基配列を決定はタッ
クポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータサイクル
シークエンス法で行うことができ、この方法を用いるに
は、パーキン・エルマー・ジャパン社から販売されてい
るキットを使用することができる。また、分析にあたっ
ては市販の機械、例えば３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ
（アプライドバイオシステムズ社）を利用することがで
きる。

【００１７】塩基配列の決定後、得られたＤＮＡ塩基配
列を遺伝子配列分析ソフトで解析し、編集、連結、アミ
ノ酸翻訳領域の推定を行なう。遺伝子配列分析ソフトと
しては、「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジニ
アリング社）を用いることができる。解析の結果、完全
長の遺伝子が取得できていない場合は、既に取得されて
いるＤＮＡの前後のＤＮＡをゲノムウォーキングによっ
て取得する。ゲノムウォーキングを行うには、宝酒造
(株)から販売されているキットを使用することができ
る。

【００１８】２．クラミジア・ニューモニエ遺伝子の検
出・測定用プローブ及びプライマークラミジア・ニューモニエの７３ＫＤａ抗原ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡは配列番号１の塩基配列を有す
る。本発明のプローブ及びプライマーは、（ａ）配列番
号１のＤＮＡの中の連続した少なくとも１０塩基の塩基
配列を有するＤＮＡ、（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡに相補
的なＤＮＡ、又は（ｃ）上記（ａ）若しくは（ｂ）のＤ
ＮＡと９０％以上の相同性を有するＤＮＡ、のいずれか
を含有するＤＮＡからなる。塩基配列の長さとしては、
１０〜５０塩基が好ましく、より好ましくは１５〜２０
塩基である。本発明のプローブ及びプライマーの具体例
としては、例えば、配列番号２の塩基配列からなるＤＮ
Ａや配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡがある。

【００１９】本発明のプローブ及びプライマーは市販の
ＤＮＡ合成装置を使用して容易に合成することができ
る。ＤＮＡ合成装置はアプライドバイオシステムズ（Ap
pliedBiosystems）社等で販売されている。また、予め
短いＤＮＡ断片を化学合成し、これをプライマーとして
後述のＰＣＲ法を行って長いＤＮＡ断片を作製すること
もできる。

【００２０】本発明のプローブ及びプライマーには、上
記ＤＮＡを標識物で標識されたものも含まれる。標識物
としては、例えば、ビオチン（Biotin）、アビジン（Av
idin）、ストレプトアビジン（Streptoavidin）、ディ
ゴキシゲニン（Digoxigenin）等の化学物質、アルカリ
フォスファターゼ（Alkaline phosphatase）、ルシフェ
ラーゼ（Luciferase）、ペルオキシダーゼ（Peroxidas
e）、β−ガラクトシダーゼ（β-galactosidase）等の
酵素、フルオレセイン（Fluorescine）等の蛍光物質が
ある。プローブにビオチンを付加させるには、例えば、
ターミナルトランスフェラーゼ（Terminal transferas
e）存在下で、プローブにビオチン化されたデオキシウ
リジン−５′−三リン酸（deoxyuridine 5′-triphosph
ate）を添加する。ターミナルトランスフェラーゼやビ
オチン化されたデオキシウリジン−５′−三リン酸はキ
ットとしてベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannhe
im)社から購入できる。ビオチン以外の標識物を付加す
る場合も市販のキットを使用することができ、このよう
なキットは宝酒造(株)や東洋紡(株)から購入できる。ま
た、文献″モレキュラー・クローニング″に記載されて
いる方法に従って標識物を付加させてもよい。

【００２１】また、標識物としては放射性同位元素を利
用することもでき、その場合は例えば、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（T4 polynucleotide kinase）存在下、
これに（γ−³²Ｐ）ｄＡＴＰを添加する。放射性同位元
素で標識する一般的手法は文献″モレキュラー・クロー
ニング″に記載されている。Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼは東洋紡(株)から、（γ−³²Ｐ）ｄＡＴＰは(株)ア
マシャムから購入できる。

【００２２】なお、構成成分がＤＮＡである本発明のプ
ローブやプライマーの代わりに、本発明のプローブやプ
ライマーの塩基配列に対応するＲＮＡ、即ち、塩基とし
てチミンがウラシルに置換され、糖としてデオキシリボ
ースがリボースに置換された核酸、も本発明のプローブ
やプライマーとして使用でき、これらの構成成分がＲＮ
Ａであるプローブやプライマーも本発明の検出・測定方
法や検出・測定用試薬に使用することがてきる。

【００２３】３．クラミジア・ニューモニエ遺伝子の検
出・測定方法本発明のプローブを用いてクラミジア・ニューモニエ遺
伝子を検出・測定するには、例えば、検体中のＤＮＡを
電気泳動して分子量で分離し、そのＤＮＡをニトロセル
ロースフィルターやナイロンメンブレン等に移して固定
し、標識化された本発明のプローブを添加し、標識を検
出・測定する。この方法はサザンブロット法と呼ばれて
おり、その一般的手法は文献”モレキュラー・クローニ
ング”に記載されている。

【００２４】本発明のプライマーを用いてクラミジア・
ニューモニエ遺伝子を検出・測定するには、例えばＰＣ
Ｒ法を行う。ＰＣＲ法については既に述べているが、本
発明のプライマーを用いてＰＣＲ法を行うクラミジア・
ニューモニエ遺伝子の検出・測定方法の具体的な工程
は、下記の通りである。（ア）ＤＮＡを含む検体に、本発明のプライマー、ＤＮ
Ａポリメラーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄ
ＴＴＰを含む緩衝液を添加し、加熱する。（イ）冷却し、保温し、加熱する。（ウ）（イ）の操作を繰返す。（エ）反応液に含まれるＤＮＡを検出・測定する。

【００２５】工程（ア）のＤＮＡを含む検体としては、
例えば、患者の咽頭部綿棒擦過材料等から核酸を抽出し
たものがある。工程（ア）のＤＮＡポリメラーゼとして
は例えばタック（Ｔａｑ）ポリメラーゼを使用すること
ができる。タックポリメラーゼは東洋紡(株)から購入で
きる。工程（ア）の加熱は例えば９０℃〜１００℃で１
〜１０分間静置する。工程（イ）の冷却は例えば４５℃
〜６５℃で１〜５分間静置し、保温は例えば７０℃〜８
０℃で３〜１０分間静置し、加熱は例えば９０℃〜１０
０℃で１〜５分間静置する。工程（ア）の加熱操作や工
程（イ）の冷却、保温及び加熱の操作は、ＤＮＡサーマ
ルサイクラー（DNA thermal cycler）(登録商標)（パー
キン−エルマーシータス（Perkin-elmer Cetus）製）
を使用して行うことができる。工程（ウ）の繰返し回数
は特に限定されないが、３０回程度繰り返す。工程
（エ）の反応液に含まれるＤＮＡを検出・測定するに
は、例えば、反応液を臭化エチジウム含有アガロースゲ
ルを用いて電気泳動して反応液に含まれているＤＮＡを
分子量で分離し、紫外線を照射する。使用した本発明の
プライマーが標識物で標識されている場合はその標識を
利用してＤＮＡを検出・測定する。なお、一度工程
（ア）〜工程（ウ）を行った後、添加する本発明のプラ
イマーを別の塩基配列のものにし、再度工程（ア）〜工
程（ウ）を行ってから工程（エ）に入ってもよい。

【００２６】４．クラミジア・ニューモニエ遺伝子の検
出・測定用試薬本発明のクラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出・測定
用試薬としては、例えば、本発明のプローブ又はプライ
マーを含む水溶液が凍結された状態でプラスチック製の
容器に納められているものがある。

【００２７】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。

【００２８】実施例１クラミジア・ニューモニエ７３
Ｋ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製（Ａ）宿主細胞（ＨＬ細胞）の培養予め、プラスチック製培養フラスコ（７５cm²）の底面
いっぱいに増殖させたＨＬ細胞をリン酸緩衝化生理食塩
液（以下、ＰＢＳという）マグネシウム不含（−）液５
mlで洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）トリプシンを含むＰＢ
Ｓを５ml加えて細胞表面全体に行き渡らせ、その液を捨
てた後、３７℃で１０分間保温し、１０％（ｖ／ｖ）牛
胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地５mlを加え、ピペ
ッテイングによりＨＬ細胞を剥離して、細胞浮遊液を調
製した。

【００２９】７５cm²のプラスチック製培養フラスコで
培養するときは、培養フラスコに上記細胞浮遊液１ml及
び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培
地１５〜２０mlを加え、また、６ウェルプラスチック製
培養容器で培養するときは、上記細胞浮遊液８mlと１０
％牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培地２９２mlとの混
合液４mlずつを各ウェルに加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガ
ス雰囲気下で培養した。

【００３０】（Ｂ）クラミジア・ニューモニエＹＫ４
１の培養６ウェルプラスチック製培養容器（底面上）に増殖した
ＨＬ細胞の培養上清をピペットで取り除き、これに前述
のクラミジア・ニューモニエＹＫ４１株の浮遊液〔クラ
ミジア・ニューモニエＹＫ４１保存液を、１リットルあ
たり庶糖７５ｇ、リン酸一カリウム０．５２ｇ、リン酸
二カリウム１．２２ｇ及びグルタミン酸０．７２ｇを含
む水溶液（以下、ＳＰＧという）で１２ないし２４倍に
希釈し、超音波で１分間処理し、２，０００rpmで３分
間遠心分離した上清〕を１ウェルあたり２ml加えて、
２，０００rpmで１時間遠心吸着を行った。遠心吸着
後、クラミジア・ニューモニエ浮遊液を除き、１μg/ml
シクロヘキシミド及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含
むダルベッコＭＥＭ培地をウェルあたり４ml加え、５％
（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で３日間培養し
た。培養後、滅菌したシリコン片で細胞を剥離し、細胞
を回収した。これを８，０００rpmで３０分間遠心分離
して、沈殿をＳＰＧに再懸濁し、−７０℃で保存した
（以下、これをクラミジア・ニューモニエＹＫ４１保存
液という）。

【００３１】（Ｃ）クラミジア・ニューモニエＹＫ４１
の基本小体の精製 −７０℃に保存しておいたクラミジア・ニューモニエＹ
Ｋ４１感染凍結ＨＬ細胞浮遊液を融解し、テフロンホモ
ジナイザーでホモジナイズした。２，５００rpmで１０
分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿は再びＳＰＧに
懸濁し、同様の操作を行い、上清を回収した。同様の操
作を更に２回行い、得られた上清は集めて合わせた。

【００３２】別途、遠心管に５０％（ｗ／ｖ）庶糖を含
む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）、次い
で、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）３容量
と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）７容量と
の混合液を重層し、この上に先に回収した上清を注意深
く重層し、８，０００rpmで１時間遠心分離した。５０
％（ｗ／ｖ）庶糖を含む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液
（pH７．４）層及び沈殿を回収し、この回収液に同容量
のＳＰＧを加え、１０，０００rpmで３０分間遠心分離
した。上清を捨て、沈殿をＳＰＧに懸濁した。遠心分離
管に、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）と
０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）の３５％か
ら５０％（総量に対する前者の容量比）までの連続密度
勾配液を作製し、この上に懸濁液を重層し、８０００rp
mで１時間遠心分離した。クラミジア・ニューモニエＹ
Ｋ４１の基本小体に相当するバンドを回収し、これをＳ
ＰＧで２倍に希釈し、１００００rpmで３０分間遠心分
離した。得られた沈殿をＳＰＧに懸濁し、タンパク質濃
度を測定（バイオラッド社のタンパク測定キットを用
い、牛血清アルブミンを標準とした）後、−７０℃で保
存した。

【００３３】（Ｄ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４
１株のゲノムＤＮＡの調製上記精製クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本
小体の懸濁液３００μｌ（タンパク質濃度：１．３７mg
/ml）を４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。
沈殿に１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液pH８．０（以下、ＴＥ緩衝液という）５００μｌを
加えて懸濁した。同様の遠心分離を再度行い、沈殿を３
００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。１％ＳＤＳ水溶液３
０μｌ及び１mg/mlプロテイナーゼＫ水溶液３０μｌを
加え、５６℃で３０分間インキュベートし、基本小体を
溶解させた。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）
飽和フェノール３５０μｌを加え、ボルテックスミキサ
ーでよく混合後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心
分離し、水層を回収した（ＤＮＡの抽出）。この抽出操
作はもう一度繰り返した。１０mg/mlのＲＮａｓｅ溶液
を２μｌ加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＲＮ
Ａを分解した。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．
０）飽和フェノール、クロロホルム及びイソアミルアル
コールの２５：２４：１（容量比）の混合液（以下、Ｐ
ＣＩという）３００μｌを加え、ボルテックスミキサー
でよく混合し、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分
離し、水層を回収した。この操作を合計５回繰り返し
た。

【００３４】得られた液にその１／１０容の１０Ｍ酢酸
アンモニウム水溶液及び２容のエタノールを加え、５分
間放置し、ＤＮＡを析出させたのち、４℃、１２，００
０rpmで５分間遠心分離した。沈殿は７０％エタノール
水溶液６００μｌを加え、混合し、４℃、１２，０００
rpmで５分間遠心分離する洗浄を２回繰り返した。遠沈
管のふたを開けたまま１５分間放置して沈殿を乾燥さ
せ、これにＴＥ２００μｌを加えて溶かし、−２０℃に
保存した。

【００３５】（Ｅ）ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作
製ゲノムＤＮＡ溶液１００μｌに、制限酵素用M-buffer１
０μｌ、制限酵素混合液（ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及び１
／５０希釈のＡｌｕＩ各０．４μｌとＴＥ２０μｌを混
合）１０μｌを加え、３７℃で２０分間反応させた。な
お、上記２０分の反応時間は、ＤＮＡが１ｋｂｐ〜７ｋ
ｂｐの大きさの部分消化ＤＮＡに分解される時間で、予
め少量のゲノムＤＮＡを用いて試験した。上記反応液に
ＰＣＩを１００μｌ加え、ボルテックスミキサーでよく
混ぜ、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水
層を回収した。これに３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液１０μ
ｌ及びエタノール２２０μｌを加え、−８０℃に１５分
間静置し、部分消化ＤＮＡを析出させた。４℃、１２，
０００rpmで５分間遠心分離し、上清液を捨てたのち、
沈殿に７０％エタノール水溶液５００μｌを加えて混
ぜ、再び、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。上
清液を捨て、沈殿を減圧下に乾燥した。

【００３６】得られた部分消化ＤＮＡを精製水２０μｌ
に溶かし、その１９μｌをとり、これに下記化１で示す
リンカー（２０pmole/μl）１４μｌ、１０ｍＭＡＴ
Ｐ４．５μｌ、５０ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭジチオ
スレイトール及び５００μg/ml牛血清アルブミン含有
０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、以下、１０倍
濃度ライゲーション用緩衝液という）４．５μｌ、精製
水２μｌ及びＴ４リガーゼ１μｌを加え、１６℃で４時
間反応させ、リンカーを付加させた。

【化１】

【００３７】リンカーを付加させた部分消化ＤＮＡを、
０．１ＭＮａＣｌ及び１ｍＭＥＤＴＡ含有１０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液を移動相とするChroma spin 6000カラ
ムにかけた。溶出液２滴ずつを分取し、各分画の一部を
０．８％アガロースゲル電気泳動で分析して、１ｋｂｐ
から７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回収した。得ら
れた分画１４４μｌに、精製水１３μｌ、１０ｍＭＡ
ＴＰ２０μｌ、０．１ＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭジチオ
スレイトール、１ｍＭスペルミジン塩酸塩及び１ｍＭ
ＥＤＴＡ含有０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、
以下、１０倍濃度リン酸化反応用緩衝液という。）２０
μｌ、及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ３μｌを加
え、３７℃で３０分間反応させ、ＤＮＡ断片の５′端を
リン酸化した。ＰＣＩ２００μｌを加えてよく振り混
ぜた後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、
水層を回収した。２０mg/mlグリコーゲン水溶液１μ
ｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液２０μｌ及びエタノール
４００μｌを加えてヌクレオチドを析出させた。４℃、
１２，０００rpmで１０分間遠心分離し、上清を捨て、
沈殿に７０％エタノール２００μｌを加え混ぜ、再び遠
心分離し、上清を捨て、沈殿を風乾し、精製水１μｌを
加え溶かした。

【００３８】この液０．６μｌに、予め制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断したλgt１１ＤＮＡ（１μg/μl、ストラタ
ジーン（Stratagene）社）１μｌ、１０倍濃度ライゲー
ション用緩衝液０．５μl、１０ｍＭＡＴＰ０．５μ
ｌ、Ｔ４リガーゼ０．４μｌ及び精製水２μｌを加え、
４℃で一晩反応させた。次いで、ギガパック（Gigapac
k）II Goldパッケージングキット（ストラタジーン社）
を用い、得られた組換えλgt11ＤＮＡをパッケージング
した。

【００３９】（Ｆ）抗原ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａのクローニング大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の一白金耳を１０ｍＭＭｇＳ
Ｏ₄３ml、０．２％マルトース及び５０μg/mlアンピシ
リン含有のＬＢ（水１Ｌ中にＮａＣｌ５ｇ、ポリペプ
トン１０ｇ及び酵母エキス５ｇを含む）培地に接種し、
３７℃で一晩振とう培養したのち、これを２，０００rp
mで１０分間遠心分離した。沈殿（大腸菌）に１０ｍＭ
ＭｇＳＯ₄水溶液９mlを加えて混ぜ、この大腸菌懸濁液
の０．３５mlを採り、これにλgt１１（ＤＮＡライブラ
リー）懸濁液を０．１〜１０μｌ加え、３７℃で２０分
間インキューベートし、大腸菌にλgt１１を感染させ
た。予め４７℃に保温した液状ＬＢ寒天培地２．５ml
に、上記λgt１１感染大腸菌を加え、これを直ちにＬＢ
寒天培地上に撒いた。上層寒天培地が固化した後、４２
℃で３〜４時間培養し、プラークが観察された時点で１
０ｍＭＩＰＴＧ水溶液に浸漬したニトロセルロースフ
ィルター（φ８２mm）を上層寒天培地に乗せ、３７℃で
１２時間培養した。黒インクをつけた注射針で非対称に
３ヵ所突き刺してフィルターに目印をつけた後、フィル
ターを寒天培地からとり出し、１５０ｍＭＮａＣｌ及び
０．１％ツィーン２０含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（pH７．５）（以下、ＴＴＢＳ緩衝液という）で３回洗
浄した。寒天培地は冷蔵庫中に保存した。

【００４０】フィルターを１５０ｍＭＮａＣｌ含有２
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(pH７．５）（以下、ＴＢＳ
緩衝液という）の０．１％牛血清アルブミン含有液に浸
し、３７℃で１時間振とうし、ブロッキング反応を行っ
た。次いで、フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で２回洗浄し
たのち、５〜１０μg/mlの抗クラミジア・ニューモニエ
モノクローナル抗体（７０又はＡＹ６Ｅ２Ｅ８）のＴＴ
ＢＳ溶液に浸し、３７℃、１時間振とうした。フィルタ
ーをＴＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、パーオキシダー
ゼ標識の（５０ng/ml）抗マウスＩｇＧ抗体溶液（ＴＴ
ＢＳ緩衝液）中、３７℃で１時間振とうした。フィルタ
ーをＴＴＢＳ緩衝液で３回、及びＴＢＳ緩衝液で３回洗
浄した後、発色基質液（ＴＢＳ緩衝液１００mlに３０％
過酸化水素水溶液６０μｌと０．３％４−クロロ−１
−ナフトールのメタノール溶液２０mlを加えて調製）に
浸漬し、室温で約３０分間放置した。十分発色した時点
でフィルターをとり出し、精製水で洗浄し、風乾した。

【００４１】フィルターの発色スポットに対応する寒天
培地上のプラークを捜して同定し、この部分の寒天をパ
スツールピペットでつき刺し、プラークを回収した。回
収したプラークはクロロホルム１滴を加えた０．１Ｍ
ＮａＣｌ、８ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．０１％ゼラ
チン含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）（以
下、ＳＭ緩衝液という）中に採り、４℃で一晩放置しプ
ラーク中のλファージを抽出した。プラークが全て上記
モノクローナル抗体と反応するようになるまで、前記操
作を繰り返し、抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを
クローン化した。このようにして、抗クラミジア・ニュ
ーモニエモノクローナル抗体反応性のクラミジア・ニュ
ーモニエ抗原ポリペプチドを発現するλファージが得ら
れ、これを７０−２Ｓλファージと命名した。

【００４２】（Ｇ）７０−２Ｓλファージの培養とＤＮ
Ａ精製前記（Ｆ）で述べた方法と同様にしてプラークを形成さ
せ、一つのプラークを回収し、１００μｌのＳＭ緩衝液
に入れ、４℃で一晩放置しλファージを抽出した。ＬＢ
培養液で一晩培養した大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株２５０μ
ｌに、λファージ液５〜１０μｌを加え、３７℃で２０
分間放置し、大腸菌にλファージを感染させた。予め３
７℃に温めておいた１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含むＬ
Ｂ培地５０ｍｌに接種し、λファージによる大腸菌の溶
菌が起こるまで３７℃で５〜７時間振とう培養した。２
５０μｌのクロロホルムを加え、３，０００rpmで１０
分間遠心分離し大腸菌細胞残渣を除き、λファージ懸濁
液を得た。λファージＤＮＡは、Wizard λ preps キッ
ト（プロメガ社）を用いて精製した。

【００４３】（Ｈ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡの増幅６００μｌ用のマイクロチューブに、精製水６１．５μ
ｌ、１０倍濃度反応用緩衝液（５００ｍＭＫＣｌ、
１５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチンを含むトリ
ス−塩酸緩衝液ｐＨ８．３）１０μｌ、２０ｍＭｄＮ
ＴＰ１μｌ、７０−２ＳλファージＤＮＡ溶液０．１
μｌ、２０ｎＭ λgt１１ forward primer（宝酒造株
式会社）１μｌ、２０ｎＭ λgt１１ reverse primer
（宝酒造株式会社）１μｌ、AmpliTaq DNA Polymerase
０．５μｌを入れ、ミネラルオイルを２〜３滴重層し
た。９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７３℃ ２分の
サイクルのインキュベーションを３０回繰返し、ＤＮＡ
を増幅した。反応後、１．２％低温融解アガロースゲル
電気泳動を行い、増幅されたＤＮＡを切り出して Wizar
d PCR Prep キット（プロメガ社）で精製した。

【００４４】（Ｉ）ＤＮＡ塩基配列分析ＤＮＡ塩基配列分析は、ＰＣＲで増幅したＤＮＡを鋳型
として、Taq DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミ
ネータサイクルシークエンス法でシークエンス反応を行
い、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオ
システムズ社）で分析を行った。得られたＤＮＡ塩基配
列を遺伝子配列分析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフ
トウェアエンジニアリング社）を用いて、編集、連結、
アミノ酸翻訳領域の推定を行ない、配列番号４の配列を
得た。配列番号４の配列の解析結果から、７３ＫＤａ抗
原ポリペプチドについて、そのＮ末端からＣ末端に向け
て約９０％のアミノ酸配列が解明されたことが分かっ
た。

【００４５】実施例２ＰＣＲ法によるクラミジア・ニ
ューモニエ遺伝子の検出配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡと配列番号３の塩
基配列からなるＤＮＡをアプライドバイオシステムズ社
製のＤＮＡ合成機で化学合成し、それぞれプライマー７
０２Ｆ２、プライマー７０２Ｒ２と名付けた。クラミジ
ア・ニューモニエＹＫ４１株、またはクラミジア・トラ
コマチスＬ２株、又はクラミジア・シッタシＢｕｇｄ．
１７−ＳＬ株を感染させた細胞を遠心分離で回収し、Ｋ
Ｃｌ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ₂ ２．５ｍＭ、ゼラチン
０．１mg/ml、ノニデットＰ４０(Nonidet P40) ０．４
５％トゥイーン２０(Tween 20)０．４５％、プロテイネ
ースＫ０．１mg/mlを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（pH８．３）０．１mlを加え、５６℃で１時間保温し
た後、９５℃で１０分間加熱してプロテイネースＫを失
活させ、各クラミジアの遺伝子を含む試料とした。

【００４６】各試料１μｌに、精製水７８．５μｌ、
２．５ｍＭｄＮＴＰ水溶液８μｌ、５００ｍＭＫＣ
ｌ及び１５ｍＭＭｇＣｌ₂を含む１００ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（pH８．３）１０μｌ、３０μＭの上記プラ
イマー７０２Ｆ２及びプライマー７０２Ｒ２の水溶液各
１μｌ、並びに５Ｕ／μｌタックポリメラーゼ０．
５μｌを添加し、ミネラルオイル５０μｌを重層した
後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃６０秒の加
熱、冷却、保温のサイクルを３０回繰り返した。反応終
了後、反応液２μｌを取得し、アガロースゲル電気泳動
を行い、ゲルを０．５μ/mlの臭化エチジウムに浸し、
紫外線照射下でＤＮＡのバンドを観察した。その結果、
クラミジア・ニューモニエＹＫ４１株から得た試料につ
いて、配列番号１の塩基配列のうち、プライマー７０２
Ｆ２の塩基配列とプライマー７０２Ｒ２の塩基配列に相
補的な塩基配列で挾まれた領域に相当する約１．６ｋｂ
ｐの大きさのＤＮＡのバンドが観察された。しかし、他
の株から得た試料についてはバンドが観察されなかっ
た。

【００４７】

【発明の効果】請求項１記載のプローブは、クラミジア
・ニューモニエ遺伝子の検出・測定やクラミジア・ニュ
ーモニエ感染の診断に好適である。請求項２記載のプロ
ーブは、請求項１記載のプローブの効果を奏し、さら
に、クラミジア・ニューモニエに特異的な塩基配列を有
するので、クラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断
に好適である。請求項３記載のプローブは、請求項１記
載のプローブの効果を奏し、さらに、クラミジア・ニュ
ーモニエに特異的な塩基配列を有するので、クラミジア
・ニューモニエ感染の正確な診断に好適である。請求項
４記載の検出・測定方法は、クラミジア・ニューモニエ
感染の診断に好適である。請求項５記載の検出・測定用
試薬は、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適で
あり、またその診断薬の製造に利用できる。請求項６記
載のプライマーは、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の
検出・測定やクラミジア・ニューモニエ感染の診断に好
適である。請求項７記載のプライマーは、請求項６記載
のプライマーの効果を奏し、さらに、クラミジア・ニュ
ーモニエに特異的な塩基配列を有するので、クラミジア
・ニューモニエ感染の正確な診断に好適である。請求項
８記載のプライマーは、請求項７記載のプライマーの効
果を奏し、さらに、クラミジア・ニューモニエに特異的
な塩基配列を有するので、クラミジア・ニューモニエ感
染の正確な診断に好適である。請求項９記載の検出・測
定方法は、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適
である。請求項１０記載の検出・測定用試薬は、クラミ
ジア・ニューモニエ感染の診断に好適であり、またその
診断薬の製造に利用できる。

【００４８】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：1712 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 ATGCCAAAAC AAGCTGAATA TACTTGGGGA TCTAAAAAAA TTCTGGACAA TATAGAATGC 60 CTCACAGAAG ACGTTGCCGA ATTTAAAGAT TTGCTTTATA CGGCACACAG AATTACTTCG 120 AGCGAAGAAG AATCTGATAA CGAAATACAG CCTGGCGCCA TCCTAAAAGG TACCGTAGTT 180 GATATTAATA AAGACTTTGT CGTAGTTGAT GTTGGTCTGA AGTCTGAGGG AGTGATCCCT 240 ATGTCAGAGT TCATAGACTC TTCAGAAGGT TTAGTGCTTG GAGCTGAAGT AGAAGTCTAT 300 CTCGACCAAG CCGAAGACGA AGAGGGCAAA GTTGTCCTTT CTAGAGAAAA AGCCACACGA 360 CAACGTCAAT GGGAATACAT CTTAGCTCAT TGTGAAGAAG GTTCTATTGT TAAAGGTCAA 420 ATTACACGTA AAGTCAAAGG CGGCCTTATT GTAGATATTG GAATGGAAGC CTTCCTACCT 480 GGATCACAAA TTGACAACAA GAAAATCAAA AATTTAGATG ATTATGTCGG AAAAGTTTGT 540 GAATTCAAAA TTTTAAAAAT TAACGTTGAA CGTCGCAATA TTGTTGTCTC AAGAAGAGAA 600 CTCTTAGAAG CTGAGAGAAT CTCTAAGAAA GCCGAACTTA TTGAACAAAT TTCTATCGGA 660 GAATACCGCA AAGGAGTTGT TAAAAACATT ACTGACTTTG GTGTATTCTT AGATCTCGAT 720 GGTATTGACG GTCTTCTCCA CATTACCGAT ATGACCTGGA AGCGCATACG ACATCCTTCC 780 GAAATGGTCG AATTGAATCA AGAGTTGGAA GTAATTATTT TAAGCGTAGA TAAAGAAAAA 840 GGACGAGTTG CTCTAGGTCT CAAACAAAAA GAGCATAATC CTTGGGAAGA TATTGAGAAG 900 AAATACCCTC CTGGAAAACG AGTTCTTGGT AAAATTGTGA AGCTTCTCCC CTACGGAGCT 960 TTCATTGAAA TTGAAGAGGG CATTGAAGGT CTAATTCACA TTTCTGAAAT GTCTTGGGTG 1020 AAAAATATTG TAGATCCTAG TGAAGTCGTA AATAAAGGCG ATGAAGTTGA AGCCATTGTT 1080 CTATCTATTC AGAAGGACGA AGGAAAAATT TCTCTAGGAT TAAAGCAAAC AGAACGTAAT 1140 CCTTGGGACA ATATCGAAGA AAAATATCCT ATAGGTCTCC ATGTCAATGC TGAAATCAAG 1200 AACTTAACCA ATTACGGTGC TTTCGTTGAA TTAGAACCAG GAATTGAGGG TCTGATTCAT 1260 ATTTCTGACA TGAGTTGGAT TAAAAAAGTC TCTCACCCTT CAGAACTATT CAAAAAAGGA 1320 AATTCTGTAG AGGCTGTTAT TTTATCAGTA GACAAAGAAA GTAAAAAAAT TACTTTAGGA 1380 GTTAAGCAAT TAAGTTCTAA TCCTTGGAAT GAAATTGAAG CTATGTTCCC TGCTGGCACA 1440 GTAATTTCAG GAGTTGTGAC TAAAATCACT GCATTTGGAG CCTTTGTTGA GCTACAAAAC 1500 GGGATTGAAG GATTGATTCA CGTTTCAGAA CTTTCTGACA AGCCCTTTGC AAAAATTGAA 1560 GATATTATCT CCATTGGAGA AAATGTTTCT GCAAAAGTAA TTAAGCTAGA TCCAGATCAT 1620 AAAAAAGTTT CTCTTTCTGT AAAAGAATAC TTAGCTGACA ATGCTTATGA TCAAGACTCT 1680 AGGACTGAAT TAGATTTCAA GGATTCTCAA GG 1712

【００４９】配列番号：2 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CTGAAACGTG AATCAATCCT 20

【００５０】配列番号：3 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TCTCCTGCAA GGGAGGTCTT 20

【００５１】配列番号：4 配列の長さ：1954 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：C. ニューモニエ株名：YK-41 直接の起源クローン:70-2S 配列の特徴特徴を表す記号：−３５ signal 存在位置：146..151 特徴を決定した方法：Ｓ配列の特徴特徴を表す記号：−１０ signal 存在位置：169..174 特徴を決定した方法：Ｓ配列の特徴特徴を表す記号：ＲＢＳ存在位置：199..205 特徴を決定した方法：Ｓ配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：215..1927 特徴を決定した方法：Ｓ配列 TTGACACCAG ACCAACTGGT AATGGTAGCG ACCGGCGCTC AGCTGGAATT CGAACCCCTT 60 CGCCTTATAC ATCTCTAGAA CGGAAGTATA GGATTTTACG ATTAATTCGA TTATATAGAA 120 CTAATCGTCT CCTGCAAGGG AGGTCTTGCC TTTTTTAAGG TTTATATTTA CACTGTCTTT 180 TTTGACTTTG TAGTTTTTAG GAGAATAACA ATAA ATG CCA AAA CAA GCT GAA TAT 235 Met Pro Lys Gln Ala Glu Tyr 1 5 ACT TGG GGA TCT AAA AAA ATT CTG GAC AAT ATA GAA TGC CTC ACA GAA 283 Thr Trp Gly Ser Lys Lys Ile Leu Asp Asn Ile Glu Cys Leu Thr Glu 10 15 20 GAC GTT GCC GAA TTT AAA GAT TTG CTT TAT ACG GCA CAC AGA ATT ACT 331 Asp Val Ala Glu Phe Lys Asp Leu Leu Tyr Thr Ala His Arg Ile Thr 25 30 35 TCG AGC GAA GAA GAA TCT GAT AAC GAA ATA CAG CCT GGC GCC ATC CTA 379 Ser Ser Glu Glu Glu Ser Asp Asn Glu Ile Gln Pro Gly Ala Ile Leu 40 45 50 55 AAA GGT ACC GTA GTT GAT ATT AAT AAA GAC TTT GTC GTA GTT GAT GTT 427 Lys Gly Thr Val Val Asp Ile Asn Lys Asp Phe Val Val Val Asp Val 60 65 70 GGT CTG AAG TCT GAG GGA GTG ATC CCT ATG TCA GAG TTC ATA GAC TCT 475 Gly Leu Lys Ser Glu Gly Val Ile Pro Met Ser Glu Phe Ile Asp Ser 75 80 85 TCA GAA GGT TTA GTG CTT GGA GCT GAA GTA GAA GTC TAT CTC GAC CAA 523 Ser Glu Gly Leu Val Leu Gly Ala Glu Val Glu Val Tyr Leu Asp Gln 90 95 100 GCC GAA GAC GAA GAG GGC AAA GTT GTC CTT TCT AGA GAA AAA GCC ACA 571 Ala Glu Asp Glu Glu Gly Lys Val Val Leu Ser Arg Glu Lys Ala Thr 105 110 115 CGA CAA CGT CAA TGG GAA TAC ATC TTA GCT CAT TGT GAA GAA GGT TCT 619 Arg Gln Arg Gln Trp Glu Tyr Ile Leu Ala His Cys Glu Glu Gly Ser 120 125 130 135 ATT GTT AAA GGT CAA ATT ACA CGT AAA GTC AAA GGC GGC CTT ATT GTA 667 Ile Val Lys Gly Gln Ile Thr Arg Lys Val Lys Gly Gly Leu Ile Val 140 145 150 GAT Ile Gly Met Glu Ala Phe Leu Pro Gly Ser Gln Ile Asp Asn Lys 715 Asp ATT GGA ATG GAA GCC TTC CTA CCT GGA TCA CAA ATT GAC AAC AAG 155 160 165 Lys ATC AAA AAT TTA GAT GAT TAT GTC GGA AAA GTT TGT GAA TTC AAA 763 AAA Ile Lys Asn Leu Asp Asp Tyr Val Gly Lys Val Cys Glu Phe Lys 170 175 180 ATT TTA AAA ATT AAC GTT GAA CGT CGC AAT ATT GTT GTC TCA AGA AGA 811 Ile Leu Lys Ile Asn Val Glu Arg Arg Asn Ile Val Val Ser Arg Arg 185 190 195 GAA CTC TTA GAA GCT GAG AGA ATC TCT AAG AAA GCC GAA CTT ATT GAA 859 Glu Leu Leu Glu Ala Glu Arg Ile Ser Lys Lys Ala Glu Leu Ile Glu 200 205 210 215 CAA ATT TCT ATC GGA GAA TAC CGC AAA GGA GTT GTT AAA AAC ATT ACT 907 Gln Ile Ser Ile Gly Glu Tyr Arg Lys Gly Val Val Lys Asn Ile Thr 220 225 230 GAC TTT GGT GTA TTC TTA GAT CTC GAT GGT ATT GAC GGT CTT CTC CAC 955 Asp Phe Gly Val Phe Leu Asp Leu Asp Gly Ile Asp Gly Leu Leu His 235 240 245 ATT ACC GAT ATG ACC TGG AAG CGC ATA CGA CAT CCT TCC GAA ATG GTC 1003 Ile Thr Asp Met Thr Trp Lys Arg Ile Arg His Pro Ser Glu Met Val 250 255 260 GAA TTG AAT CAA GAG TTG GAA GTA ATT ATT TTA AGC GTA GAT AAA GAA 1051 Glu Leu Asn Gln Glu Leu Glu Val Ile Ile Leu Ser Val Asp Lys Glu 265 270 275 AAA GGA CGA GTT GCT CTA GGT CTC AAA CAA AAA GAG CAT AAT CCT TGG 1099 Lys Gly Arg Val Ala Leu Gly Leu Lys Gln Lys Glu His Asn Pro Trp 280 285 290 295 GAA GAT ATT GAG AAG AAA TAC CCT CCT GGA AAA CGA GTT CTT GGT AAA 1147 Glu Asp Ile Glu Lys Lys Tyr Pro Pro Gly Lys Arg Val Leu Gly Lys 300 305 310 ATT GTG AAG CTT CTC CCC TAC GGA GCT TTC ATT GAA ATT GAA GAG GGC 1195 Ile Val Lys Leu Leu Pro Tyr Gly Ala Phe Ile Glu Ile Glu Glu Gly 315 320 325 ATT GAA GGT CTA ATT CAC ATT TCT GAA ATG TCT TGG GTG AAA AAT ATT 1243 Ile Glu Gly Leu Ile His Ile Ser Glu Met Ser Trp Val Lys Asn Ile 330 335 340 GTA GAT CCT AGT GAA GTC GTA AAT AAA GGC GAT GAA GTT GAA GCC ATT 1291 Val Asp Pro Ser Glu Val Val Asn Lys Gly Asp Glu Val Glu Ala Ile 345 350 355 GTT CTA TCT ATT CAG AAG GAC GAA GGA AAA ATT TCT CTA GGA TTA AAG 1339 Val Leu Ser Ile Gln Lys Asp Glu Gly Lys Ile Ser Leu Gly Leu Lys 360 365 370 375 CAA ACA GAA CGT AAT CCT TGG GAC AAT ATC GAA GAA AAA TAT CCT ATA 1387 Gln Thr Glu Arg Asn Pro Trp Asp Asn Ile Glu Glu Lys Tyr Pro Ile 380 385 390 GGT CTC CAT GTC AAT GCT GAA ATC AAG AAC TTA ACC AAT TAC GGT GCT 1435 Gly Leu His Val Asn Ala Glu Ile Lys Asn Leu Thr Asn Tyr Gly Ala 395 400 405 TTC GTT GAA TTA GAA CCA GGA ATT GAG GGT CTG ATT CAT ATT TCT GAC 1483 Phe Val Glu Leu Glu Pro Gly Ile Glu Gly Leu Ile His Ile Ser Asp 410 415 420 ATG AGT TGG ATT AAA AAA GTC TCT CAC CCT TCA GAA CTA TTC AAA AAA 1531 Met Ser Trp Ile Lys Lys Val Ser His Pro Ser Glu Leu Phe Lys Lys 425 430 435 GGA AAT TCT GTA GAG GCT GTT ATT TTA TCA GTA GAC AAA GAA AGT AAA 1579 Gly Asn Ser Val Glu Ala Val Ile Leu Ser Val Asp Lys Glu Ser Lys 440 445 450 455 AAA ATT ACT TTA GGA GTT AAG CAA TTA AGT TCT AAT CCT TGG AAT GAA 1627 Lys Ile Thr Leu Gly Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Pro Trp Asn Glu 460 465 470 ATT GAA GCT ATG TTC CCT GCT GGC ACA GTA ATT TCA GGA GTT GTG ACT 1675 Ile Glu Ala Met Phe Pro Ala Gly Thr Val Ile Ser Gly Val Val Thr 475 480 485 AAA ATC ACT GCA TTT GGA GCC TTT GTT GAG CTA CAA AAC GGG ATT GAA 1723 Lys Ile Thr Ala Phe Gly Ala Phe Val Glu Leu Gln Asn Gly Ile Glu 490 495 500 GGA TTG ATT CAC GTT TCA GAA CTT TCT GAC AAG CCC TTT GCA AAA ATT 1771 Gly Leu Ile His Val Ser Glu Leu Ser Asp Lys Pro Phe Ala Lys Ile 505 510 515 GAA GAT ATT ATC TCC ATT GGA GAA AAT GTT TCT GCA AAA GTA ATT AAG 1919 Glu Asp Ile Ile Ser Ile Gly Glu Asn Val Ser Ala Lys Val Ile Lys 520 525 530 535 CTA GAT CCA GAT CAT AAA AAA GTT TCT CTT TCT GTA AAA GAA TAC TTA 1867 Leu Asp Pro Asp His Lys Lys Val Ser Leu Ser Val Lys Glu Tyr Leu 540 545 550 GCT GAC AAT GCT TAT GAT CAA GAC TCT AGG ACT GAA TTA GAT TTC AAG 1915 Ala Asp Asn Ala Tyr Asp Gln Asp Ser Arg Thr Glu Leu Asp Phe Lys 555 560 565 GAT TCT CAA GGC GAA GGG GTT CGA ATT CCG CCG ATA CTG 1954 Asp Ser Gln Gly Glu Gly Val Arg Ile Pro Pro Ile Leu 570 575 ５８０

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【書類名】受託番号変更届

【提出日】平成７年７月２０日

【旧寄託機関の名称】工業技術院生命工学工業技術研
究所

【旧受託番号】ＦＥＲＭＰ−１３６８８

【新寄託機関の名称】工業技術院生命工学工業技術研
究所

【新受託番号】ＦＥＲＭＢＰ−５１５４

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｇ０１Ｎ 33/569 ＢＧ０１Ｎ 33/569 33/571 33/571 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (54)【発明の名称】クラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出・測定用プローブ及びプライマー、該プローブ又はプライマーを用いるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出・測定方法、並びに該プローブ又はプライマーを含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出・測定用試薬

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）配列番号１のＤＮＡの中の連続し
た少なくとも１０塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、又は
（ｃ）上記（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡと９０％以上
の相同性を有するＤＮＡ、のいずれかを含有するＤＮＡ
からなる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出・測
定用プローブ。
【請求項２】塩基配列が配列番号２の塩基配列であ
る、請求項１記載のプローブ。
【請求項３】塩基配列が配列番号３の塩基配列であ
る、請求項１記載のプローブ。
【請求項４】請求項１〜３のいずれかに記載のプロー
ブを用いる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出・
測定方法。
【請求項５】請求項１〜３のいずれかに記載のプロー
ブを含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の検
出・測定用試薬。
【請求項６】（ａ）配列番号１のＤＮＡの中の連続し
た少なくとも１０塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、又は
（ｃ）上記（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡと９０％以上
の相同性を有するＤＮＡ、のいずれかを含有するＤＮＡ
からなる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出・測
定用プライマー。
【請求項７】塩基配列が配列番号２の塩基配列であ
る、請求項６記載のプライマー。
【請求項８】塩基配列が配列番号３の塩基配列であ
る、請求項６記載のプライマー。
【請求項９】請求項６〜８のいずれかに記載のプライ
マーを用いる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出
・測定方法。
【請求項１０】請求項６〜８のいずれかに記載のプラ
イマーを含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子
の検出・測定用試薬。