JP3578233B2 - 抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及びその試薬、並びにクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬 - Google Patents
抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及びその試薬、並びにクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及びその試薬、並びにクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬に関する。本発明は医薬品工業、特にクラミジア・ニューモニエ感染症の診断薬の製造において有効に利用される。
【０００２】
【従来の技術】
クラミジア属の細菌は、クラミジア・トラコマチス、クラミジア・シッタシ、クラミジア・ニューモニエ等の種（Ｓｐｅｃｉｅｓ）が知られている。クラミジア・トラコマチスは、トラコーマ、性病性リンパ肉芽腫、泌尿生殖器感染症、封入体結膜炎、新生児肺炎等を引き起こす原因菌であり、クラミジア・シッタシは、オウム病等の原因菌であり、またクラミジア・ニューモニエは、呼吸器感染症、異形肺炎等の原因菌である。
【０００３】
クラミジア・ニューモニエの引き起こす呼吸器感染症の症状は、マイコプラズマ・ニューモニエやインフルエンザウイルスが原因で起こる感染症の症状と類似しているので、しばしば誤診されやすい。そのため、クラミジア・ニューモニエの簡便な診断方法の開発が望まれていた。
【０００４】
感染症の診断は、通常、感染部位等における原因菌の存在の検出か、血清・その他の体液中における（原因菌に対する）抗体の存在の検出により確定的になされる。前者は抗原検査、後者は抗体検査と呼ばれ、いずれも臨床で重要な意義があり、クラミジア・ニューモニエの抗体検査としては、クラミジア・ニューモニエの基本小体を用いて抗体の存在を検出する方法が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、クラミジア・ニューモニエの基本小体は、クラミジア・ニューモニエ以外のクラミジア属細菌、すなわち、クラミジア・トラコマチス又はクラミジア・シッタシにも共通に存在する抗原を含むため、この基本小体を用いる方法ではクラミジア・ニューモニエに対する抗体だけでなく、他の種のクラミジアに対する抗体とも反応し、特異性に欠ける難点があった。本発明は、クラミジア・トラコマチスやクラミジア・シッタシ等のクラミジア・ニューモニエ以外のクラミジア属細菌に対する抗体に反応せず、クラミジア・ニューモニエ特異的抗体とのみ反応し、これを検出するための抗原ポリペプチドを提供し、また、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマチス、クラミジア・シッタシ等のクラミジア属細菌に共通に反応する抗体を検出するための抗原ポリペプチドを提供するものである。これにより、抗クラミジア属細菌抗体もしくは抗クラミジア・ニューモニエ抗体の簡便な検出・測定方法とその試薬、並びにクラミジア属細菌感染もしくはクラミジア・ニューモニエ感染を簡便に診断する診断薬を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、クラミジア・ニューモニエ特異的抗原ポリペプチド又はクラミジア属細菌特異的（すなわち、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマチス、クラミジア・シッタシ等のクラミジア属細菌共通の抗原ポリペプチド）を純粋に、かつアミノ酸配列が解明された形で取得するため、先ず、クラミジア・ニューモニエを宿主細胞中に培養し、そのクラミジア・ニューモニエからゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素で部分分解し、これをλｇｔ１１ＤＮＡに挿入してゲノムＤＮＡライブラリーを作成し、これを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染させ、クラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体又はクラミジア属細菌特異的モノクローナル抗体を用いてクラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドを発現する感染大腸菌のコロニーをスクリーニングし、陽性の感染大腸菌からλファージを抽出し、この操作を繰り返してλファージを精製し、これを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染させて増幅させた後そのＤＮＡの塩基配列を分析し、これをポリペプチドに翻訳して、抗原ポリペプチドのアミノ酸配列を決定し、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は下記（１）〜（６）に関するものである。
（１）配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＣを抗原として用いることを特徴とする、抗クラミジア属細菌抗体もしくは抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法。
（２）配列番号１のポリペプチドを抗原として用いることを特徴とする、抗クラミジア属細菌抗体もしくは抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法。
（３）配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＣを抗原として含有してなる、抗クラミジア属細菌抗体もしくは抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定用試薬。
（４）配列番号１のポリペプチドを抗原として含有してなる、抗クラミジア属細菌抗体もしくは抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定用試薬。
（５）配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＣを有効成分とする、クラミジア属細菌感染もしくはクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
（６）配列番号１のポリペプチドを有効成分とする、クラミジア属細菌感染もしくはクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
【０００８】
以下、本発明の詳細を、１．形質転換体の作製、２．抗原ポリペプチドの製造方法、３．得られた抗原ポリペプチド、４．抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡ、、５．抗原ポリペプチドを抗原として用いる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及び試薬、並びに抗原ポリペプチドを有効成分とするクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬、の順に説明する。
【０００９】
１．形質転換体の作製
１．１ クラミジア・ニューモニエの培養
培養したＨＬ細胞から細胞浮遊液を調製し、培養上清を除去した後にクラミジア・ニューモニエの浮遊液を添加してこれを培養し、遠心分離してクラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を取得する。クラミジア・ニューモニエとしては、例えばクラミジア・ニューモニエＹＫ４１株（金本ら：ミクロバイオロジカル・イムノロジー、３７巻、４９５−４９８頁、１９９３年（Ｙ．Ｋａｎａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， Ｖｏｌ．３７， ｐ．４９５−４９８， １９９３））が使用できる。
１．２ クラミジア・ニューモニエの基本小体の精製
クラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を破砕し、遠心分離し、上清を回収する。ウログラフィン（シェーリング社製）を用いた連続密度勾配液にこの上清を添加して遠心分離し、クラミジア・ニューモニエの基本小体に相当するバンドを回収する。
【００１０】
１．３ クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡの調製
クラミジア・ニューモニエの基本小体を、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、ＴＥ緩衝液という）に懸濁し、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液及び１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ水溶液を加えて保温し、基本小体を溶解させる。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）飽和フェノールを加えて撹拌し、遠心分離し、水層を回収する。さらにＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）処理をし、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理とエタノール沈殿処理をし、クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡを取得する。
【００１１】
１．４ ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作製
ゲノムＤＮＡを制限酵素ＡｃｃＩ、ＨａｅＩＩＩ及びＡｌｕＩで消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理とエタノール沈殿処理をし、部分消化ＤＮＡを取得する。この部分消化ＤＮＡにリンカー、アデノシン−５′−三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５′−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、以下、ＡＴＰと略す）及びＴ４リガーゼを添加して、部分消化ＤＮＡにリンカーを付加させる。
これを、０．１Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液を移動相とするクロマ・スピン６０００（Ｃｈｒｏｍａ ｓｐｉｎ ６０００）カラムにかけ、溶出液を分取し、１ｋｂｐから７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回収する。得られた分画にＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを加えて反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリン酸化する。反応液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理及びエタノール沈殿処理し、５′端がリン酸化されたＤＮＡ断片を取得する。
このＤＮＡ断片に、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断しておいたλｇｔ１１ＤＮＡ、ＡＴＰ及びＴ４リガーゼを加えて反応させ、市販のパッケージングキットを用い、得られた組換えλｇｔ１１ＤＮＡをパッケージングし、ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーを作製する。
【００１２】
１．５ 抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング
大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の培養液に上記ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーを感染させ、寒天培地上で培養し、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）水溶液に浸漬したニトロセルロースフィルターを利用して、挿入ＤＮＡの発現により菌体内に産生されたタンパク質をニトロセルロースフィルターに付着させる。このフィルターを牛血清アルブミンを用いてブロッキング反応させ、洗浄し、次いでフィルターを抗クラミジア・ニューモニエモノクローナル抗体と反応させる。抗クラミジア・ニューモニエモノクローナル抗体としては、例えば、７０、ＡＹ６Ｅ２Ｅ８及びＳＣＰ５３を使用することができる。７０及びＳＣＰ５３をは本発明者の一人の松本等がクラミジア・ニューモニエＫＫｐｎ−１株を抗原としてマウスを免疫し、その脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させて得られたハイブリドーマ７０及びハイブリドーマＳＣＰ５３が分泌する抗体である。ＳＣＰ５３を産生するハイブリドーマについてはジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー、１３２巻、５８３−５８８頁（１９９４）（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１３２， ｐ．５８３−５８８， １９９４）に記載されている。また、ＡＹ６Ｅ２Ｅ８は本発明者の一人の井筒等が、クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本小体を抗原として、マウスを免疫し、その脾臓細胞をミエローマと細胞融合させて得られたハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８が分泌する抗体ＡＹ６Ｅ２Ｅ８であり、ＡＹ６Ｅ２Ｅ８を産生するハイブリドーマは工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１３６８８として寄託されている。反応後、フィルターを洗浄し、パーオキシダーゼ等の酵素で標識された抗マウスＩｇＧ抗体を反応させる。反応後、フィルターを洗浄し、発色基質液を添加して反応させる。発色基質液としては、例えば、過酸化水素水溶液及び４−クロロ−１−ナフトールのメタノール溶液を含む液を利用することができる。反応後、フィルターを洗浄し、風乾させる。
【００１３】
フィルターの発色スポットに対応する寒天培地上のプラークを同定し、プラークに含まれるλファージを取得する。プラークが全て上記モノクローナル抗体と反応するようになるまで前記操作を繰り返し、抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡをクローン化し、抗クラミジア・ニューモニエモノクローナル抗体反応性のクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドを発現するλファージを取得する。
【００１４】
１．６ クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの取得
取得したλファージを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染させ、培養し、λファージを大量に生産する。市販のキットを用いてλファージからＤＮＡを取得・精製する。このＤＮＡにプライマー、タックポリメラーゼ（Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）及びデオキシヌクレオチド類を添加し、加熱、冷却、保温の工程を繰り返し、λｇｔ１１に挿入されたＤＮＡを増幅させる。プライマーとしては、例えば、λｇｔ１１・フォワード・プライマー（λｇｔ１１ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）及びλｇｔ１１・リバース・プライマー（λｇｔ１１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（いずれも宝酒造株式会社製）があり 、タックポリメラーゼとしては、例えば、アンプリタック・ＤＮＡ・ポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）がある。このＤＮＡ増幅方法の一般的手法はＰＣＲ法として知られており、詳細は「サムブロック他編集、モレキュラー・クローニング 第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）（１９８９年）」（Ｊ．Ｓａｍｂｌｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）、以下、本文献を文献″モレキュラー・クローニング″という）に記載されている。
【００１５】
増幅されたＤＮＡを取得し、塩基配列を決定・解析する。ＤＮＡの取得には市販のキットを使用することができ、例えばウイザード・ＰＣＲ・プレップキット（Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製品）を使用することができる。また、塩基配列を決定はタックポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータサイクルシークエンス法で行うことができ、この方法を用いるには、パーキン・エルマー・ジャパン社から販売されているキットを使用することができる。また、分析にあたっては市販の機械、例えば３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオシステムズ社）を利用することができる。
【００１６】
塩基配列の決定後、得られたＤＮＡ塩基配列を遺伝子配列分析ソフトで解析し、編集、連結、アミノ酸翻訳領域の推定を行なう。遺伝子配列分析ソフトとしては、「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジニアリング社）を用いることができる。
解析の結果、完全長の遺伝子が取得できていない場合は、既に取得されているＤＮＡの前後のＤＮＡをゲノムウォーキングによって取得する。ゲノムウォーキングを行うには、宝酒造（株）から販売されているキットを使用することができる。
【００１７】
１．７ 抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターの作製、及びそれを含む形質転換体の作製
上記１．６で取得したλファージ自体も上記抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターであるが、上記１．６で取得したクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを常法で既存のプラスミドベクターやファージベクター等に挿入して、新たに組換えベクターを作製することもできる。その際、必要に応じ、リンカーを使用する。既存のプラスミドベクターとしては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等を使用することができ、これらは市販されている。また、ファージベクターとしてはλｇｔ１１ファージ、λｇｔ１０ファージ等が利用できる。いずれも、用いた親ベクターに対応する組換えベクターが得られる。
上記抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターとしては、後述するように、５３−３Ｓλファージ、７０−２Ｓλファージ等がある。
【００１８】
得られた組換えベクターを宿主に入れ、形質転換体を作製する。大腸菌由来のプラスミドやλファージを使用する場合は宿主としては大腸菌を使用することができ、例えば大腸菌ＨＢ１０１株を使用することができる。この宿主をコンピテントセルとなるように処理をする。大腸菌ＨＢ１０１株を処理して得たコンピテントセルは宝酒造から販売されている。上記連結の反応物を宿主に入れ、形質転換体を作製する方法は文献″モレキュラー・クローニング″に記載されている。得られた形質転換体を培養してコロニーを形成させ、各コロニーからプラスミドＤＮＡを取得し、適切な制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動で分析し、所望の組換えプラスミドをもつ形質転換体を選択する。
【００１９】
２．抗原ポリペプチドの製造方法
本発明の抗原ポリペプチドを製造する場合は、形質転換体の培養、形質転換体の破砕、ストレプトマイシン処理、硫安沈殿、液体クロマトグラフィー、の各工程を行う。
形質転換体の培養は、その形質転換体が成長しうる培地でこの抗原ポリペプチドが形質転換体内に十分蓄積されるまで適温で培養器を振とうする。形質転換体として、プラスミドベクターｐＢＲ３２２に本発明のＤＮＡを挿入した組換えベクターを入れた大腸菌ＨＢ１０１株を使用する場合は、アンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃で一晩振とう培養し、その後、この培養液をアンピシリンを含むＴＢ培地等に接種してさらに３７℃で一晩振とう培養する。ＴＢ培地の調製方法は、文献″モレキュラー・クローニング″に記載されている。
培養した形質転換体を破砕するには、遠心分離で形質転換体を集め、緩衝液に懸濁し、これに超音波を照射する。形質転換体が大腸菌の場合は、上記懸濁液にリゾチームを加え、ＳＤＳを含む緩衝液を加えることよって菌体を溶菌させてもよい。
【００２０】
形質転換体の破砕後、遠心分離して細胞残渣を除去し、上清を取得する。この上清にストレプトマイシン硫酸塩を添加し、しばらく撹拌し、遠心分離することによって、核酸を沈殿物として除去し、上清を取得する。
この上清を液体クロマトグラフィーによって分画し、各画分に含まれる蛋白質について、前述のクラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体を用い、ウェスタン・ブロット法行い、抗原ポリペプチドを含む画分を取得する。細胞膜等の残渣の除去、ストレプトマイシン硫酸塩を添加するＤＮＡの除去、硫酸アンモニウムを添加する蛋白質の取得、及びウェスタン・ブロット法の具体的方法は、文献″モレキュラー・クローニング″に記載されている。
【００２１】
３．得られた抗原ポリペプチド
本発明に係る抗原ポリペプチドは、配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＣからなるものである。
配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＣは、望ましくは２０個以上、より望ましくは１００個以上、さらに望ましくは２５０個以上のアミノ酸からなるものがよい。
ポリペプチドＣとしては、例えば配列番号１のポリペプチドを使用することができるし、配列番号１のポリペプチドからアミノ酸１〜２５０個が欠落しているポリペプチドや配列番号１のポリペプチドの中のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置換されているポリペプチドを使用することもできる。
また、ポリペプチドＣとして、配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列にアミノ酸若しくは２〜１０００個のアミノ酸配列が結合したポリペプチドも使用することもできる。
【００２２】
配列番号１のポリペプチドからアミノ酸１〜２５０個が欠落しているポリペプチドとしては、例えば、配列番号１のポリペプチドの１〜３２１番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドがある。
配列番号１のポリペプチドの中のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置換されているポリペプチドとしては、配列番号１のポリペプチドの中の任意の箇所のアミノ酸を類似の性質をもつ他のアミノ酸に置換したポリペプチドがあり、例えば、配列番号１のポリペプチドの５７１番目のアミノ酸であるグリシンがアラニンに置換されたポリペプチドがある。
配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列に結合するアミノ酸若しくは２〜１０００個のアミノ酸配列としては、例えば、ロイシン、ロイシン−メチオニン、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、β−ガラクトシダーゼ等がある。
ポリペプチドＣの具体例としては、例えば配列番号１のポリペプチド、配列番号１のポリペプチドの１〜３２１番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドがある。
【００２３】
本発明に係る配列番号１のポリペプチドは、配列表に示すとおり、５７１個のアミノ酸残基から成る抗原ポリペプチドである。
本発明に係る配列番号３のポリペプチドは、配列表に示すとおり、２５９個のアミノ酸残基から成る抗原ポリペプチドである。
ポリペプチドＣの中では、クラミジア・ニューモニエの７３ＫＤａの抗原ポリペプチドのアミノ酸配列そのものを含む配列番号１のポリペプチドが望ましい。
【００２４】
４．抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡ
本発明において、配列番号１のポリペプチドをコードするＤＮＡとは、配列番号１のポリペプチドをトリプレット暗号表（それぞれのアミノ酸に対して、１〜６通りのヌクレオチド配列が割り当てられている）に従ってアミノ酸をヌクレオチド配列に読み替えたときのＤＮＡ群（この中には、配列番号２のＤＮＡも含まれる。）から選ばれるＤＮＡのことである。
同様に、本発明において、配列番号３のポリペプチドをコードするＤＮＡとは、配列番号３のポリペプチドをトリプレット暗号表（それぞれのアミノ酸に対して、１〜６通りのヌクレオチド配列が割り当てられている）に従ってアミノ酸をヌクレオチド配列に読み替えたときのＤＮＡ群（この中には、配列番号４のＤＮＡも含まれる）から選ばれるＤＮＡのことである。
【００２５】
５．抗原ポリペプチドを抗原として用いる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及び試薬、並びに抗原ポリペプチドを有効成分とするクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬
抗クラミジア・ニューモニエ抗体を検出・測定するには、例えば、上記抗原ポリペプチドを担体に固定化し、検体を添加し、洗浄し、標識化された二次抗体を添加し、洗浄し、この標識を直接的又は間接的に検出・測定する。
担体としては、例えば、ラテックスの粒子やセルロースの糸、その他プラスチック製のアッセイプレートや粒子等を利用することができる。
上記抗原ポリペプチドを担体に固定化するには、例えば共有結合や物理吸着を利用する。
検体としては、例えばヒトの血清等を使用する。なお、検体中の他の抗体等が担体に非特異的に結合するのを防止するため、検体の添加前に牛血清アルブミン等で担体の表面をブロッキングしておくことが望ましい。
洗浄は界面活性剤を含むリン酸緩衝液等を利用して行う。
【００２６】
標識化された二次抗体としては、例えば標識化された抗ヒトモノクローナル抗体がある。標識としては種々のものが利用でき、例えばアルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、ペルオキシダーゼ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）等の酵素、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎｅ）等の蛍光物質を利用することができる。また、抗体と標識物の間にビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）、アビジン（Ａｖｉｄｉｎ）、ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ）、ディゴキシゲニン（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）等の化学物質を介在させてもよい。
標識を直接的又は間接的に検出・測定するには、例えば、その標識が酵素である場合は基質を添加し、酵素の触媒作用により発生する光や発色を検出・測定するか吸光度の変化を測定する。また、標識が蛍光物質である場合は反応系に紫外線を照射し、発生する蛍光を検出・測定する。必要に応じ、増感剤を使用する。
【００２７】
上記抗原ポリペプチドを抗原として用いる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定用試薬としては、例えば上記抗原ポリペプチドを担体に固定化したものやさらに上記標識化された二次抗体や基質等が必要量同封されたものがある。上記抗原ポリペプチドを有効成分とするクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬としては、例えば上記試薬をそのまま利用することができる。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
【００２９】
以下の実施例において使用したモノクローナル抗体は、表１に示されるように、モノクローナル抗体のＳＣＰ５３及びＡＹ６Ｅ２Ｅ８は Ｃ．ニューモニエに特異的であり、モノクローナル抗体の７０はクラミジア属細菌に特異的である。
【００３０】
【表１】
以下、クラミジア・ニューモニエの宿主細胞の培養から、クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドの遺伝子ＤＮＡ配列／アミノ酸配列の決定まで、順を追って説明する。
【００３１】
実施例１ クラミジア・ニューモニエの７３Ｋ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製
（Ａ）宿主細胞（ＨＬ細胞）の培養
予め、プラスチック製培養フラスコ（７５ｃｍ２）の底面いっぱいに増殖させたＨＬ細胞をリン酸緩衝化生理食塩液（以下、ＰＢＳという）マグネシウム不含 （−）液５ｍｌで洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）トリプシンを含むＰＢＳを５ｍｌ加えて細胞表面全体に行き渡らせ、その液を捨てた後、３７℃で１０分間保温し、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地５ｍｌを加え、ピペッテイングによりＨＬ細胞を剥離して、細胞浮遊液を調製した。
【００３２】
７５ｃｍ２のプラスチック製培養フラスコで培養するときは、培養フラスコに上記細胞浮遊液１ｍｌ及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培地１５〜２０ｍｌを加え、また、６ウェルプラスチック製培養容器で培養するときは、上記細胞浮遊液８ｍｌと１０％牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培地２９２ｍｌとの混合液４ｍｌずつを各ウェルに加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下で培養した。
【００３３】
（Ｂ）クラミジア・ニューモニエ ＹＫ４１の培養
６ウェルプラスチック製培養容器（底面上）に増殖したＨＬ細胞の培養上清をピペットで取り除き、これに前述のクラミジア・ニューモニエＹＫ４１株の浮遊液〔クラミジア・ニューモニエＹＫ４１保存液を、１リットルあたり庶糖７５ｇ、リン酸一カリウム０．５２ｇ、リン酸二カリウム１．２２ｇ及びグルタミン酸０．７２ｇを含む水溶液（以下、ＳＰＧという）で１２ないし２４倍に希釈し、超音波で１分間処理し、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した上清〕を１ウェルあたり２ｍｌ加えて、２，０００ｒｐｍで１時間遠心吸着を行った。遠心吸着後、クラミジア・ニューモニエ浮遊液を除き、１μｇ／ｍｌシクロヘキシミド及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地をウェルあたり４ｍｌ加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で３日間培養した。培養後、滅菌したシリコン片で細胞を剥離し、細胞を回収した。これを８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、沈殿をＳＰＧに再懸濁し、−７０℃で保存した（以下、これをクラミジア・ニューモニエＹＫ４１保存液という）。
【００３４】
（Ｃ）クラミジア・ニューモニエＹＫ４１の基本小体の精製
−７０℃に保存しておいたクラミジア・ニューモニエＹＫ４１感染凍結ＨＬ細胞浮遊液を融解し、テフロンホモジナイザーでホモジナイズした。２，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿は再びＳＰＧに懸濁し、同様の操作を行い、上清を回収した。同様の操作を更に２回行い、得られた上清は集めて合わせた。
【００３５】
別途、遠心管に５０％（ｗ／ｖ）庶糖を含む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液 （ｐＨ７．４）、次いで、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）３容量と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）７容量との混合液を重層し、この上に先に回収した上清を注意深く重層し、８，０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。５０％（ｗ／ｖ）庶糖を含む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）層及び沈殿を回収し、この回収液に同容量のＳＰＧを加え、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清を捨て、沈殿をＳＰＧに懸濁した。遠心分離管に、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）の３５％から５０％（総量に対する前者の容量比）までの連続密度勾配液を作製し、この上に懸濁液を重層し、８０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。クラミジア・ニューモニエ ＹＫ４１の基本小体に相当するバンドを回収し、これをＳＰＧで２倍に希釈し、１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。得られた沈殿をＳＰＧに懸濁し、タンパク質濃度を測定（バイオラッド社のタンパク測定キットを用い、牛血清アルブミンを標準とした）後、−７０℃で保存した。
【００３６】
（Ｄ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株のゲノムＤＮＡの調製
上記精製クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本小体の懸濁液３００μｌ（タンパク質濃度：１．３７ｍｇ／ｍｌ）を４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。沈殿に１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０（以下、ＴＥ緩衝液という）５００μｌを加えて懸濁した。同様の遠心分離を再度行い、沈殿を３００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。１％ＳＤＳ水溶液３０μｌ及び１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ水溶液３０μｌを加え、５６℃で３０分間インキュベートし、基本小体を溶解させた。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）飽和フェノール３５０μｌを加え、ボルテックスミキサーでよく混合後、４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、水層を回収した（ＤＮＡの抽出）。この抽出操作はもう一度繰り返した。１０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ溶液を２μｌ加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＲＮＡを分解した。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）飽和フェノール、クロロホルム及びイソアミルアルコールの２５：２４：１（容量比）の混合液（以下、ＰＣＩという）３００μｌを加え、ボルテックスミキサーでよく混合し、４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、水層を回収した。この操作を合計５回繰り返した。
【００３７】
得られた液にその１／１０容の１０Ｍ酢酸アンモニウム水溶液及び２容のエタノールを加え、５分間放置し、ＤＮＡを析出させたのち、４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。沈殿は７０％エタノール水溶液６００μｌを加え、混合し、４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する洗浄を２回繰り返した。遠沈管のふたを開けたまま１５分間放置して沈殿を乾燥させ、これにＴＥ２００μｌを加えて溶かし、−２０℃に保存した。
【００３８】
（Ｅ）ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作製
ゲノムＤＮＡ溶液１００μｌに、制限酵素用Ｍ−ｂｕｆｆｅｒ１０μｌ、制限酵素混合液（ＡｃｃＩ、ＨａｅＩＩＩ及び１／５０希釈のＡｌｕＩ各０．４μｌとＴＥ２０μｌを混合）１０μｌを加え、３７℃で２０分間反応させた。なお、上記２０分の反応時間は、ＤＮＡが１ｋｂｐ〜７ｋｂｐの大きさの部分消化ＤＮＡに分解される時間で、予め少量のゲノムＤＮＡを用いて試験した。上記反応液にＰＣＩを１００μｌ加え、ボルテックスミキサーでよく混ぜ、４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、水層を回収した。これに３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液１０μｌ及びエタノール２２０μｌを加え、−８０℃に１５分間静置し、部分消化ＤＮＡを析出させた。４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清液を捨てたのち、沈殿に７０％エタノール水溶液５００μｌを加えて混ぜ、再び、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清液を捨て、沈殿を減圧下に乾燥した。
【００３９】
得られた部分消化ＤＮＡを精製水２０μｌに溶かし、その１９μｌをとり、これに下記化１で示すリンカー（２０ｐｍｏｌｅ／μｌ）１４μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ４ ．５μｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭジチオスレイトール及び５００μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン含有０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６、以下、１０倍濃度ライゲーション用緩衝液という）４．５μｌ、精製水２μｌ及びＴ４リガーゼ１μｌを加え、１６℃で４時間反応させ、リンカーを付加させた。
【化１】
【００４０】
リンカーを付加させた部分消化ＤＮＡを、０．１Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液を移動相とするＣｈｒｏｍａ ｓｐｉｎ ６０００カラムにかけた。溶出液２滴ずつを分取し、各分画の一部を０．８％アガロースゲル電気泳動で分析して、１ｋｂｐから７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回収した。得られた分画１４４μｌに、精製水１３μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ ２０μｌ、０．１Ｍ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭスペルミジン塩酸塩及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６、以下、１０倍濃度リン酸化反応用緩衝液という）２０μｌ、及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ３μｌを加え、３７℃で３０分間反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリン酸化した。ＰＣＩ ２００μｌを加えてよく振り混ぜた後、４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、水層を回収した。２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン水溶液１μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液２０μｌ及びエタノール４００μｌを加えてヌクレオチドを析出させた。４℃、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿に７０％エタノール２００μｌを加え混ぜ、再び遠心分離し、上清を捨て、沈殿を風乾し、精製水１μｌを加え溶かした。
【００４１】
この液０．６μｌに、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したλｇｔ１１ ＤＮＡ（１μｇ／μｌ、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社）１μｌ、１０倍濃度ライゲーション用緩衝液０．５μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ０．５μｌ、Ｔ４リガーゼ０．４μｌ及び精製水２μｌを加え、４℃で一晩反応させた。次いで、ギガパック（Ｇｉｇａｐａｃｋ）ＩＩ Ｇｏｌｄパッケージングキット（ストラタジーン社）を用い、得られた組換えλｇｔ１１ＤＮＡをパッケージングした。
【００４２】
（Ｆ）抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング
大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の一白金耳を１０ｍＭ ＭｇＳＯ４３ｍｌ、０．２％マルトース及び５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有のＬＢ（水１Ｌ中にＮａＣｌ ５ｇ、ポリペプトン１０ｇ及び酵母エキス５ｇを含む）培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養したのち、これを２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿（大腸菌）に１０ｍＭ ＭｇＳＯ４水溶液９ｍｌを加えて混ぜ、この大腸菌懸濁液の０．３５ｍｌを採り、これにλｇｔ１１（ＤＮＡライブラリー）懸濁液を０．１〜１０μｌ加え、３７℃で２０分間インキューベートし、大腸菌にλｇｔ１１を感染させた。予め４７℃に保温した液状ＬＢ寒天培地２．５ｍｌに、上記λｇｔ１１感染大腸菌を加え、これを直ちにＬＢ寒天培地上に撒いた。上層寒天培地が固化した後、４２℃で３〜４時間培養し、プラークが観察された時点で１０ｍＭ ＩＰＴＧ水溶液に浸漬したニトロセルロースフィルター（φ８２ｍｍ）を上層寒天培地に乗せ、３７℃で１２時間培養した。黒インクをつけた注射針で非対称に３ヵ所突き刺してフィルターに目印をつけた後、フィルターを寒天培地からとり出し、１５０ｍＭＮａＣｌ及び０．１％ツィーン２０含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、ＴＴＢＳ緩衝液という）で３回洗浄した。寒天培地は冷蔵庫中に保存した。
【００４３】
フィルターを１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、ＴＢＳ緩衝液という）の０．１％牛血清アルブミン含有液に浸し、３７℃で１時間振とうし、ブロッキング反応を行った。次いで、フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で２回洗浄したのち、５〜１０μｇ／ｍｌのクラミジア属細菌に特異的なモノクローナル抗体（７０）のＴＴＢＳ溶液に浸し、３７℃、１時間振とうした。フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識の（５０ｎｇ／ｍｌ）抗マウスＩｇＧ抗体溶液（ＴＴＢＳ緩衝液）中、３７℃で１時間振とうした。フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で３回、及びＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、発色基質液（ＴＢＳ緩衝液１００ｍｌに３０％過酸化水素水溶液６０μｌと０．３％ ４−クロロ−１−ナフトールのメタノール溶液２０ｍｌを加えて調製）に浸漬し、室温で約３０分間放置した。十分発色した時点でフィルターをとり出し、精製水で洗浄し、風乾した。
【００４４】
フィルターの発色スポットに対応する寒天培地上のプラークを捜して同定し、この部分の寒天をパスツールピペットでつき刺し、プラークを回収した。回収したプラークはクロロホルム１滴を加えた０．１Ｍ ＮａＣｌ、８ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．０１％ゼラチン含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） （以下、ＳＭ緩衝液という。）中に採り、４℃で一晩放置しプラーク中のλファージを抽出した。プラークが全て上記モノクローナル抗体と反応するようになるまで、前記操作を繰り返し、抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡをクローン化した。
このようにして、クラミジア属細菌特異的モノクローナル抗体反応性のクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドを発現するλファージが得られ、これを７０−２Ｓλファージと命名した。
【００４５】
（Ｇ）７０−２Ｓλファージの培養とＤＮＡ精製
前記（Ｆ）で述べた方法と同様にしてプラークを形成させ、一つのプラークを回収し、１００μｌのＳＭ緩衝液に入れ、４℃で一晩放置しλファージを抽出した。ＬＢ培養液で一晩培養した大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株２５０μｌに、λファージ液５〜１０μｌを加え、３７℃で２０分間放置し、大腸菌にλファージを感染させた。予め３７℃に温めておいた１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含むＬＢ培地５０ｍｌに接種し、λファージによる大腸菌の溶菌が起こるまで３７℃で５〜７時間振とう培養した。２５０μｌのクロロホルムを加え、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し大腸菌細胞残渣を除き、λファージ懸濁液を得た。λファージＤＮＡは、Ｗｉｚａｒｄ λ ｐｒｅｐｓ キット（プロメガ社）を用いて精製した。
【００４６】
（Ｈ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの増幅
６００μｌ用のマイクロチューブに、精製水６１．５μｌ、１０倍濃度 反応用緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ゼラチンを含むトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．３）１０μｌ、２０ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、７０−２ＳλファージＤＮＡ溶液０．１μｌ、２０ｎＭ λｇｔ１１ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造株式会社）１μｌ、２０ｎＭ λｇｔ１１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造株式会社）１μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μｌを入れ、ミネラルオイルを２〜３滴重層した。９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７３℃ ２分のサイクルのインキュベーションを３０回繰返し、ＤＮＡを増幅した。反応後、１．２％低温融解アガロースゲル電気泳動を行い、増幅されたＤＮＡを切り出して Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐ キット（プロメガ社）で精製した。
【００４７】
（Ｉ）ＤＮＡ塩基配列分析
ＤＮＡ塩基配列分析は、ＰＣＲで増幅したＤＮＡを鋳型として、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータサイクルシークエンス法でシークエンス反応を行い、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオシステムズ社）で分析を行った。得られたＤＮＡ塩基配列を遺伝子配列分析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジニアリング社）を用いて、編集、連結、アミノ酸翻訳領域の推定を行ない、配列番号５の配列を得た。
配列番号５の配列の解析結果から、７３ＫＤａ抗原ポリペプチドについて、そのＮ末端からＣ末端に向けて約９０％のアミノ酸配列が解明されたことが分かった。また、コード領域の塩基配列は配列番号２の配列となっており、その推定アミノ酸配列は配列番号１の配列となっていた。
【００４８】
実施例２ クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターの作製、及びそれを含む形質転換体の作製
７０−２ＳλファージＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、このＤＮＡ断片５０ｎｇに、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断してあるプラスミドｐＢＲ３２２のＤＮＡ１００ｎｇを添加し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造）を用いてこれらのＤＮＡを連結する。この反応物を大腸菌ＨＢ１０１株コンピテントセル（宝酒造）に入れ、形質転換体を作製する。
このプラスミドは、７３Ｋ抗原ポリペプチドの一部をコードするＤＮＡを含むものである。この７３Ｋ抗原ポリペプチドの一部をコードするＤＮＡの塩基配列は配列番号２のようになっており、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列はを配列番号１のようになっている。プラスミドから７３Ｋ抗原ポリペプチドの一部をコードするＤＮＡを切りだし、発現ベクターに入れ、これを大腸菌等の宿主に入れてＤＮＡを発現させると、コードされているタンパク質が菌体内に蓄積される。このタンパク質を電気泳動、ニトロセルロース膜への転写、モノクローナル抗体での検出を同様に行うと上記ポリペプチドに相当するバンドが観察され、クラミジア属の細菌に特異的に反応するモノクローナル抗体と反応することができる７３Ｋ抗原ポリペプチドを発現していることが示される。
【００４９】
実施例３ クラミジア・ニューモニエの５３Ｋ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製
モノクローナル抗体７０の代わりに、モノクローナル抗体ＡＹ６Ｅ２Ｅ８又はＳＣＰ５３を使用し、実施例１と同様の手順で操作した。クローン５３−３Ｓλファージが得られ、これから配列番号６の配列が得られた。
配列番号６の配列の解析結果から、クラミジア・ニューモニエに特異的な５３Ｋ抗原タンパク質については、そのＮ末端からＣ末端に向けて約６０％のアミノ酸配列が解明されたことが分かった。また、コード領域の塩基配列は配列番号３の配列となっており、その推定アミノ酸配列は配列番号４の配列となっていた。
【００５０】
実施例４ 抗原ポリペプチドを抗原として用いる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定
抗原ポリペプチドとして、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドを用い、これをマイクロタイタープレートに固定し、牛血清アルブミンを含むＰＢＳを加え、４℃で一晩以上放置し、ブロッキングを行なう。牛血清アルブミンを含むＰＢＳを除いた後、０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に２回洗浄後、ウェルに患者の血清を加え、室温で２時間放置する。０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回洗浄後、ウェルにパーオキシダーゼ標識化マウス抗ヒトＩｇＧ抗体を加え、室温で２時間放置する。０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回洗浄後、ウェルにＡＢＴＳ溶液（ＫＰＬ社製）を加え、室温で１５分〜１時間放置して発色反応させ、９６ウエルＥＩＡプレート用光度計で４０５ｎｍの吸光度を測定する。
【００５１】
【発明の効果】
本発明（１）の検出・測定方法は、簡便で、クラミジア・ニューモニエの抗体検査等に好適である。
本発明（２）の検出・測定方法は、上記（１）の検出・測定方法の効果を奏し、さらに、抗原として用いられるポリペプチドがクラミジア属細菌に特異的な抗原ポリペプチドの抗原部分を有するので、抗体検査やクラミジア属細菌感染の簡便な診断に極めて適切であり、また、抗原としてクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原ポリペプチドを合わせて利用することにより、感染している種の容易な区別に利用できる。
本発明（３）の検出・測定用試薬は、クラミジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエ感染の簡便な診断に好適である。
本発明（４）の検出・測定用試薬は、上記（３）の検出・測定用試薬の効果を奏し、さらに、抗原として用いられるポリペプチドがクラミジア属細菌に特異的な抗原ポリペプチドの抗原部分を有するので、抗体検査やクラミジア属細菌感染の簡便な診断に極めて適切であり、また、抗原としてクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原ポリペプチドを合わせて利用することにより、感染している種の容易な区別に利用できる。
本発明（５）の診断薬は、クラミジア・ニューモニエ感染の簡便な診断に好適である。
本発明（６）の診断薬は、上記（５）の診断薬の効果を奏し、さらに、抗原として用いられるポリペプチドがクラミジア属細菌に特異的な抗原ポリペプチドの抗原部分を有するので、抗体検査やクラミジア属細菌感染の簡便な診断に極めて適切であり、また、抗原としてクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原ポリペプチドを合わせて利用することにより、感染している種の容易な区別に利用できる。
【００５２】
【配列表】
【００５３】
【００５４】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【産業上の利用分野】
本発明は、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及びその試薬、並びにクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬に関する。本発明は医薬品工業、特にクラミジア・ニューモニエ感染症の診断薬の製造において有効に利用される。
【０００２】
【従来の技術】
クラミジア属の細菌は、クラミジア・トラコマチス、クラミジア・シッタシ、クラミジア・ニューモニエ等の種（Ｓｐｅｃｉｅｓ）が知られている。クラミジア・トラコマチスは、トラコーマ、性病性リンパ肉芽腫、泌尿生殖器感染症、封入体結膜炎、新生児肺炎等を引き起こす原因菌であり、クラミジア・シッタシは、オウム病等の原因菌であり、またクラミジア・ニューモニエは、呼吸器感染症、異形肺炎等の原因菌である。
【０００３】
クラミジア・ニューモニエの引き起こす呼吸器感染症の症状は、マイコプラズマ・ニューモニエやインフルエンザウイルスが原因で起こる感染症の症状と類似しているので、しばしば誤診されやすい。そのため、クラミジア・ニューモニエの簡便な診断方法の開発が望まれていた。
【０００４】
感染症の診断は、通常、感染部位等における原因菌の存在の検出か、血清・その他の体液中における（原因菌に対する）抗体の存在の検出により確定的になされる。前者は抗原検査、後者は抗体検査と呼ばれ、いずれも臨床で重要な意義があり、クラミジア・ニューモニエの抗体検査としては、クラミジア・ニューモニエの基本小体を用いて抗体の存在を検出する方法が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、クラミジア・ニューモニエの基本小体は、クラミジア・ニューモニエ以外のクラミジア属細菌、すなわち、クラミジア・トラコマチス又はクラミジア・シッタシにも共通に存在する抗原を含むため、この基本小体を用いる方法ではクラミジア・ニューモニエに対する抗体だけでなく、他の種のクラミジアに対する抗体とも反応し、特異性に欠ける難点があった。本発明は、クラミジア・トラコマチスやクラミジア・シッタシ等のクラミジア・ニューモニエ以外のクラミジア属細菌に対する抗体に反応せず、クラミジア・ニューモニエ特異的抗体とのみ反応し、これを検出するための抗原ポリペプチドを提供し、また、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマチス、クラミジア・シッタシ等のクラミジア属細菌に共通に反応する抗体を検出するための抗原ポリペプチドを提供するものである。これにより、抗クラミジア属細菌抗体もしくは抗クラミジア・ニューモニエ抗体の簡便な検出・測定方法とその試薬、並びにクラミジア属細菌感染もしくはクラミジア・ニューモニエ感染を簡便に診断する診断薬を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、クラミジア・ニューモニエ特異的抗原ポリペプチド又はクラミジア属細菌特異的（すなわち、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマチス、クラミジア・シッタシ等のクラミジア属細菌共通の抗原ポリペプチド）を純粋に、かつアミノ酸配列が解明された形で取得するため、先ず、クラミジア・ニューモニエを宿主細胞中に培養し、そのクラミジア・ニューモニエからゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素で部分分解し、これをλｇｔ１１ＤＮＡに挿入してゲノムＤＮＡライブラリーを作成し、これを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染させ、クラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体又はクラミジア属細菌特異的モノクローナル抗体を用いてクラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドを発現する感染大腸菌のコロニーをスクリーニングし、陽性の感染大腸菌からλファージを抽出し、この操作を繰り返してλファージを精製し、これを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染させて増幅させた後そのＤＮＡの塩基配列を分析し、これをポリペプチドに翻訳して、抗原ポリペプチドのアミノ酸配列を決定し、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は下記（１）〜（６）に関するものである。
（１）配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＣを抗原として用いることを特徴とする、抗クラミジア属細菌抗体もしくは抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法。
（２）配列番号１のポリペプチドを抗原として用いることを特徴とする、抗クラミジア属細菌抗体もしくは抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法。
（３）配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＣを抗原として含有してなる、抗クラミジア属細菌抗体もしくは抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定用試薬。
（４）配列番号１のポリペプチドを抗原として含有してなる、抗クラミジア属細菌抗体もしくは抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定用試薬。
（５）配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＣを有効成分とする、クラミジア属細菌感染もしくはクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
（６）配列番号１のポリペプチドを有効成分とする、クラミジア属細菌感染もしくはクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
【０００８】
以下、本発明の詳細を、１．形質転換体の作製、２．抗原ポリペプチドの製造方法、３．得られた抗原ポリペプチド、４．抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡ、、５．抗原ポリペプチドを抗原として用いる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及び試薬、並びに抗原ポリペプチドを有効成分とするクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬、の順に説明する。
【０００９】
１．形質転換体の作製
１．１ クラミジア・ニューモニエの培養
培養したＨＬ細胞から細胞浮遊液を調製し、培養上清を除去した後にクラミジア・ニューモニエの浮遊液を添加してこれを培養し、遠心分離してクラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を取得する。クラミジア・ニューモニエとしては、例えばクラミジア・ニューモニエＹＫ４１株（金本ら：ミクロバイオロジカル・イムノロジー、３７巻、４９５−４９８頁、１９９３年（Ｙ．Ｋａｎａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， Ｖｏｌ．３７， ｐ．４９５−４９８， １９９３））が使用できる。
１．２ クラミジア・ニューモニエの基本小体の精製
クラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を破砕し、遠心分離し、上清を回収する。ウログラフィン（シェーリング社製）を用いた連続密度勾配液にこの上清を添加して遠心分離し、クラミジア・ニューモニエの基本小体に相当するバンドを回収する。
【００１０】
１．３ クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡの調製
クラミジア・ニューモニエの基本小体を、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、ＴＥ緩衝液という）に懸濁し、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液及び１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ水溶液を加えて保温し、基本小体を溶解させる。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）飽和フェノールを加えて撹拌し、遠心分離し、水層を回収する。さらにＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）処理をし、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理とエタノール沈殿処理をし、クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡを取得する。
【００１１】
１．４ ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作製
ゲノムＤＮＡを制限酵素ＡｃｃＩ、ＨａｅＩＩＩ及びＡｌｕＩで消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理とエタノール沈殿処理をし、部分消化ＤＮＡを取得する。この部分消化ＤＮＡにリンカー、アデノシン−５′−三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５′−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、以下、ＡＴＰと略す）及びＴ４リガーゼを添加して、部分消化ＤＮＡにリンカーを付加させる。
これを、０．１Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液を移動相とするクロマ・スピン６０００（Ｃｈｒｏｍａ ｓｐｉｎ ６０００）カラムにかけ、溶出液を分取し、１ｋｂｐから７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回収する。得られた分画にＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを加えて反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリン酸化する。反応液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理及びエタノール沈殿処理し、５′端がリン酸化されたＤＮＡ断片を取得する。
このＤＮＡ断片に、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断しておいたλｇｔ１１ＤＮＡ、ＡＴＰ及びＴ４リガーゼを加えて反応させ、市販のパッケージングキットを用い、得られた組換えλｇｔ１１ＤＮＡをパッケージングし、ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーを作製する。
【００１２】
１．５ 抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング
大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の培養液に上記ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーを感染させ、寒天培地上で培養し、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）水溶液に浸漬したニトロセルロースフィルターを利用して、挿入ＤＮＡの発現により菌体内に産生されたタンパク質をニトロセルロースフィルターに付着させる。このフィルターを牛血清アルブミンを用いてブロッキング反応させ、洗浄し、次いでフィルターを抗クラミジア・ニューモニエモノクローナル抗体と反応させる。抗クラミジア・ニューモニエモノクローナル抗体としては、例えば、７０、ＡＹ６Ｅ２Ｅ８及びＳＣＰ５３を使用することができる。７０及びＳＣＰ５３をは本発明者の一人の松本等がクラミジア・ニューモニエＫＫｐｎ−１株を抗原としてマウスを免疫し、その脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させて得られたハイブリドーマ７０及びハイブリドーマＳＣＰ５３が分泌する抗体である。ＳＣＰ５３を産生するハイブリドーマについてはジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー、１３２巻、５８３−５８８頁（１９９４）（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１３２， ｐ．５８３−５８８， １９９４）に記載されている。また、ＡＹ６Ｅ２Ｅ８は本発明者の一人の井筒等が、クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本小体を抗原として、マウスを免疫し、その脾臓細胞をミエローマと細胞融合させて得られたハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８が分泌する抗体ＡＹ６Ｅ２Ｅ８であり、ＡＹ６Ｅ２Ｅ８を産生するハイブリドーマは工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１３６８８として寄託されている。反応後、フィルターを洗浄し、パーオキシダーゼ等の酵素で標識された抗マウスＩｇＧ抗体を反応させる。反応後、フィルターを洗浄し、発色基質液を添加して反応させる。発色基質液としては、例えば、過酸化水素水溶液及び４−クロロ−１−ナフトールのメタノール溶液を含む液を利用することができる。反応後、フィルターを洗浄し、風乾させる。
【００１３】
フィルターの発色スポットに対応する寒天培地上のプラークを同定し、プラークに含まれるλファージを取得する。プラークが全て上記モノクローナル抗体と反応するようになるまで前記操作を繰り返し、抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡをクローン化し、抗クラミジア・ニューモニエモノクローナル抗体反応性のクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドを発現するλファージを取得する。
【００１４】
１．６ クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの取得
取得したλファージを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染させ、培養し、λファージを大量に生産する。市販のキットを用いてλファージからＤＮＡを取得・精製する。このＤＮＡにプライマー、タックポリメラーゼ（Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）及びデオキシヌクレオチド類を添加し、加熱、冷却、保温の工程を繰り返し、λｇｔ１１に挿入されたＤＮＡを増幅させる。プライマーとしては、例えば、λｇｔ１１・フォワード・プライマー（λｇｔ１１ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）及びλｇｔ１１・リバース・プライマー（λｇｔ１１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（いずれも宝酒造株式会社製）があり 、タックポリメラーゼとしては、例えば、アンプリタック・ＤＮＡ・ポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）がある。このＤＮＡ増幅方法の一般的手法はＰＣＲ法として知られており、詳細は「サムブロック他編集、モレキュラー・クローニング 第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）（１９８９年）」（Ｊ．Ｓａｍｂｌｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）、以下、本文献を文献″モレキュラー・クローニング″という）に記載されている。
【００１５】
増幅されたＤＮＡを取得し、塩基配列を決定・解析する。ＤＮＡの取得には市販のキットを使用することができ、例えばウイザード・ＰＣＲ・プレップキット（Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製品）を使用することができる。また、塩基配列を決定はタックポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータサイクルシークエンス法で行うことができ、この方法を用いるには、パーキン・エルマー・ジャパン社から販売されているキットを使用することができる。また、分析にあたっては市販の機械、例えば３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオシステムズ社）を利用することができる。
【００１６】
塩基配列の決定後、得られたＤＮＡ塩基配列を遺伝子配列分析ソフトで解析し、編集、連結、アミノ酸翻訳領域の推定を行なう。遺伝子配列分析ソフトとしては、「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジニアリング社）を用いることができる。
解析の結果、完全長の遺伝子が取得できていない場合は、既に取得されているＤＮＡの前後のＤＮＡをゲノムウォーキングによって取得する。ゲノムウォーキングを行うには、宝酒造（株）から販売されているキットを使用することができる。
【００１７】
１．７ 抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターの作製、及びそれを含む形質転換体の作製
上記１．６で取得したλファージ自体も上記抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターであるが、上記１．６で取得したクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを常法で既存のプラスミドベクターやファージベクター等に挿入して、新たに組換えベクターを作製することもできる。その際、必要に応じ、リンカーを使用する。既存のプラスミドベクターとしては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等を使用することができ、これらは市販されている。また、ファージベクターとしてはλｇｔ１１ファージ、λｇｔ１０ファージ等が利用できる。いずれも、用いた親ベクターに対応する組換えベクターが得られる。
上記抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターとしては、後述するように、５３−３Ｓλファージ、７０−２Ｓλファージ等がある。
【００１８】
得られた組換えベクターを宿主に入れ、形質転換体を作製する。大腸菌由来のプラスミドやλファージを使用する場合は宿主としては大腸菌を使用することができ、例えば大腸菌ＨＢ１０１株を使用することができる。この宿主をコンピテントセルとなるように処理をする。大腸菌ＨＢ１０１株を処理して得たコンピテントセルは宝酒造から販売されている。上記連結の反応物を宿主に入れ、形質転換体を作製する方法は文献″モレキュラー・クローニング″に記載されている。得られた形質転換体を培養してコロニーを形成させ、各コロニーからプラスミドＤＮＡを取得し、適切な制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動で分析し、所望の組換えプラスミドをもつ形質転換体を選択する。
【００１９】
２．抗原ポリペプチドの製造方法
本発明の抗原ポリペプチドを製造する場合は、形質転換体の培養、形質転換体の破砕、ストレプトマイシン処理、硫安沈殿、液体クロマトグラフィー、の各工程を行う。
形質転換体の培養は、その形質転換体が成長しうる培地でこの抗原ポリペプチドが形質転換体内に十分蓄積されるまで適温で培養器を振とうする。形質転換体として、プラスミドベクターｐＢＲ３２２に本発明のＤＮＡを挿入した組換えベクターを入れた大腸菌ＨＢ１０１株を使用する場合は、アンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃で一晩振とう培養し、その後、この培養液をアンピシリンを含むＴＢ培地等に接種してさらに３７℃で一晩振とう培養する。ＴＢ培地の調製方法は、文献″モレキュラー・クローニング″に記載されている。
培養した形質転換体を破砕するには、遠心分離で形質転換体を集め、緩衝液に懸濁し、これに超音波を照射する。形質転換体が大腸菌の場合は、上記懸濁液にリゾチームを加え、ＳＤＳを含む緩衝液を加えることよって菌体を溶菌させてもよい。
【００２０】
形質転換体の破砕後、遠心分離して細胞残渣を除去し、上清を取得する。この上清にストレプトマイシン硫酸塩を添加し、しばらく撹拌し、遠心分離することによって、核酸を沈殿物として除去し、上清を取得する。
この上清を液体クロマトグラフィーによって分画し、各画分に含まれる蛋白質について、前述のクラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体を用い、ウェスタン・ブロット法行い、抗原ポリペプチドを含む画分を取得する。細胞膜等の残渣の除去、ストレプトマイシン硫酸塩を添加するＤＮＡの除去、硫酸アンモニウムを添加する蛋白質の取得、及びウェスタン・ブロット法の具体的方法は、文献″モレキュラー・クローニング″に記載されている。
【００２１】
３．得られた抗原ポリペプチド
本発明に係る抗原ポリペプチドは、配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＣからなるものである。
配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＣは、望ましくは２０個以上、より望ましくは１００個以上、さらに望ましくは２５０個以上のアミノ酸からなるものがよい。
ポリペプチドＣとしては、例えば配列番号１のポリペプチドを使用することができるし、配列番号１のポリペプチドからアミノ酸１〜２５０個が欠落しているポリペプチドや配列番号１のポリペプチドの中のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置換されているポリペプチドを使用することもできる。
また、ポリペプチドＣとして、配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列にアミノ酸若しくは２〜１０００個のアミノ酸配列が結合したポリペプチドも使用することもできる。
【００２２】
配列番号１のポリペプチドからアミノ酸１〜２５０個が欠落しているポリペプチドとしては、例えば、配列番号１のポリペプチドの１〜３２１番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドがある。
配列番号１のポリペプチドの中のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置換されているポリペプチドとしては、配列番号１のポリペプチドの中の任意の箇所のアミノ酸を類似の性質をもつ他のアミノ酸に置換したポリペプチドがあり、例えば、配列番号１のポリペプチドの５７１番目のアミノ酸であるグリシンがアラニンに置換されたポリペプチドがある。
配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列に結合するアミノ酸若しくは２〜１０００個のアミノ酸配列としては、例えば、ロイシン、ロイシン−メチオニン、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、β−ガラクトシダーゼ等がある。
ポリペプチドＣの具体例としては、例えば配列番号１のポリペプチド、配列番号１のポリペプチドの１〜３２１番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドがある。
【００２３】
本発明に係る配列番号１のポリペプチドは、配列表に示すとおり、５７１個のアミノ酸残基から成る抗原ポリペプチドである。
本発明に係る配列番号３のポリペプチドは、配列表に示すとおり、２５９個のアミノ酸残基から成る抗原ポリペプチドである。
ポリペプチドＣの中では、クラミジア・ニューモニエの７３ＫＤａの抗原ポリペプチドのアミノ酸配列そのものを含む配列番号１のポリペプチドが望ましい。
【００２４】
４．抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡ
本発明において、配列番号１のポリペプチドをコードするＤＮＡとは、配列番号１のポリペプチドをトリプレット暗号表（それぞれのアミノ酸に対して、１〜６通りのヌクレオチド配列が割り当てられている）に従ってアミノ酸をヌクレオチド配列に読み替えたときのＤＮＡ群（この中には、配列番号２のＤＮＡも含まれる。）から選ばれるＤＮＡのことである。
同様に、本発明において、配列番号３のポリペプチドをコードするＤＮＡとは、配列番号３のポリペプチドをトリプレット暗号表（それぞれのアミノ酸に対して、１〜６通りのヌクレオチド配列が割り当てられている）に従ってアミノ酸をヌクレオチド配列に読み替えたときのＤＮＡ群（この中には、配列番号４のＤＮＡも含まれる）から選ばれるＤＮＡのことである。
【００２５】
５．抗原ポリペプチドを抗原として用いる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及び試薬、並びに抗原ポリペプチドを有効成分とするクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬
抗クラミジア・ニューモニエ抗体を検出・測定するには、例えば、上記抗原ポリペプチドを担体に固定化し、検体を添加し、洗浄し、標識化された二次抗体を添加し、洗浄し、この標識を直接的又は間接的に検出・測定する。
担体としては、例えば、ラテックスの粒子やセルロースの糸、その他プラスチック製のアッセイプレートや粒子等を利用することができる。
上記抗原ポリペプチドを担体に固定化するには、例えば共有結合や物理吸着を利用する。
検体としては、例えばヒトの血清等を使用する。なお、検体中の他の抗体等が担体に非特異的に結合するのを防止するため、検体の添加前に牛血清アルブミン等で担体の表面をブロッキングしておくことが望ましい。
洗浄は界面活性剤を含むリン酸緩衝液等を利用して行う。
【００２６】
標識化された二次抗体としては、例えば標識化された抗ヒトモノクローナル抗体がある。標識としては種々のものが利用でき、例えばアルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、ペルオキシダーゼ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）等の酵素、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎｅ）等の蛍光物質を利用することができる。また、抗体と標識物の間にビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）、アビジン（Ａｖｉｄｉｎ）、ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ）、ディゴキシゲニン（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）等の化学物質を介在させてもよい。
標識を直接的又は間接的に検出・測定するには、例えば、その標識が酵素である場合は基質を添加し、酵素の触媒作用により発生する光や発色を検出・測定するか吸光度の変化を測定する。また、標識が蛍光物質である場合は反応系に紫外線を照射し、発生する蛍光を検出・測定する。必要に応じ、増感剤を使用する。
【００２７】
上記抗原ポリペプチドを抗原として用いる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定用試薬としては、例えば上記抗原ポリペプチドを担体に固定化したものやさらに上記標識化された二次抗体や基質等が必要量同封されたものがある。上記抗原ポリペプチドを有効成分とするクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬としては、例えば上記試薬をそのまま利用することができる。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
【００２９】
以下の実施例において使用したモノクローナル抗体は、表１に示されるように、モノクローナル抗体のＳＣＰ５３及びＡＹ６Ｅ２Ｅ８は Ｃ．ニューモニエに特異的であり、モノクローナル抗体の７０はクラミジア属細菌に特異的である。
【００３０】
【表１】
【００３１】
実施例１ クラミジア・ニューモニエの７３Ｋ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製
（Ａ）宿主細胞（ＨＬ細胞）の培養
予め、プラスチック製培養フラスコ（７５ｃｍ２）の底面いっぱいに増殖させたＨＬ細胞をリン酸緩衝化生理食塩液（以下、ＰＢＳという）マグネシウム不含 （−）液５ｍｌで洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）トリプシンを含むＰＢＳを５ｍｌ加えて細胞表面全体に行き渡らせ、その液を捨てた後、３７℃で１０分間保温し、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地５ｍｌを加え、ピペッテイングによりＨＬ細胞を剥離して、細胞浮遊液を調製した。
【００３２】
７５ｃｍ２のプラスチック製培養フラスコで培養するときは、培養フラスコに上記細胞浮遊液１ｍｌ及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培地１５〜２０ｍｌを加え、また、６ウェルプラスチック製培養容器で培養するときは、上記細胞浮遊液８ｍｌと１０％牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培地２９２ｍｌとの混合液４ｍｌずつを各ウェルに加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下で培養した。
【００３３】
（Ｂ）クラミジア・ニューモニエ ＹＫ４１の培養
６ウェルプラスチック製培養容器（底面上）に増殖したＨＬ細胞の培養上清をピペットで取り除き、これに前述のクラミジア・ニューモニエＹＫ４１株の浮遊液〔クラミジア・ニューモニエＹＫ４１保存液を、１リットルあたり庶糖７５ｇ、リン酸一カリウム０．５２ｇ、リン酸二カリウム１．２２ｇ及びグルタミン酸０．７２ｇを含む水溶液（以下、ＳＰＧという）で１２ないし２４倍に希釈し、超音波で１分間処理し、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した上清〕を１ウェルあたり２ｍｌ加えて、２，０００ｒｐｍで１時間遠心吸着を行った。遠心吸着後、クラミジア・ニューモニエ浮遊液を除き、１μｇ／ｍｌシクロヘキシミド及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地をウェルあたり４ｍｌ加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で３日間培養した。培養後、滅菌したシリコン片で細胞を剥離し、細胞を回収した。これを８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、沈殿をＳＰＧに再懸濁し、−７０℃で保存した（以下、これをクラミジア・ニューモニエＹＫ４１保存液という）。
【００３４】
（Ｃ）クラミジア・ニューモニエＹＫ４１の基本小体の精製
−７０℃に保存しておいたクラミジア・ニューモニエＹＫ４１感染凍結ＨＬ細胞浮遊液を融解し、テフロンホモジナイザーでホモジナイズした。２，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿は再びＳＰＧに懸濁し、同様の操作を行い、上清を回収した。同様の操作を更に２回行い、得られた上清は集めて合わせた。
【００３５】
別途、遠心管に５０％（ｗ／ｖ）庶糖を含む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液 （ｐＨ７．４）、次いで、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）３容量と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）７容量との混合液を重層し、この上に先に回収した上清を注意深く重層し、８，０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。５０％（ｗ／ｖ）庶糖を含む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）層及び沈殿を回収し、この回収液に同容量のＳＰＧを加え、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清を捨て、沈殿をＳＰＧに懸濁した。遠心分離管に、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）の３５％から５０％（総量に対する前者の容量比）までの連続密度勾配液を作製し、この上に懸濁液を重層し、８０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。クラミジア・ニューモニエ ＹＫ４１の基本小体に相当するバンドを回収し、これをＳＰＧで２倍に希釈し、１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。得られた沈殿をＳＰＧに懸濁し、タンパク質濃度を測定（バイオラッド社のタンパク測定キットを用い、牛血清アルブミンを標準とした）後、−７０℃で保存した。
【００３６】
（Ｄ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株のゲノムＤＮＡの調製
上記精製クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本小体の懸濁液３００μｌ（タンパク質濃度：１．３７ｍｇ／ｍｌ）を４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。沈殿に１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０（以下、ＴＥ緩衝液という）５００μｌを加えて懸濁した。同様の遠心分離を再度行い、沈殿を３００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。１％ＳＤＳ水溶液３０μｌ及び１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ水溶液３０μｌを加え、５６℃で３０分間インキュベートし、基本小体を溶解させた。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）飽和フェノール３５０μｌを加え、ボルテックスミキサーでよく混合後、４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、水層を回収した（ＤＮＡの抽出）。この抽出操作はもう一度繰り返した。１０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ溶液を２μｌ加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＲＮＡを分解した。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）飽和フェノール、クロロホルム及びイソアミルアルコールの２５：２４：１（容量比）の混合液（以下、ＰＣＩという）３００μｌを加え、ボルテックスミキサーでよく混合し、４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、水層を回収した。この操作を合計５回繰り返した。
【００３７】
得られた液にその１／１０容の１０Ｍ酢酸アンモニウム水溶液及び２容のエタノールを加え、５分間放置し、ＤＮＡを析出させたのち、４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。沈殿は７０％エタノール水溶液６００μｌを加え、混合し、４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する洗浄を２回繰り返した。遠沈管のふたを開けたまま１５分間放置して沈殿を乾燥させ、これにＴＥ２００μｌを加えて溶かし、−２０℃に保存した。
【００３８】
（Ｅ）ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作製
ゲノムＤＮＡ溶液１００μｌに、制限酵素用Ｍ−ｂｕｆｆｅｒ１０μｌ、制限酵素混合液（ＡｃｃＩ、ＨａｅＩＩＩ及び１／５０希釈のＡｌｕＩ各０．４μｌとＴＥ２０μｌを混合）１０μｌを加え、３７℃で２０分間反応させた。なお、上記２０分の反応時間は、ＤＮＡが１ｋｂｐ〜７ｋｂｐの大きさの部分消化ＤＮＡに分解される時間で、予め少量のゲノムＤＮＡを用いて試験した。上記反応液にＰＣＩを１００μｌ加え、ボルテックスミキサーでよく混ぜ、４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、水層を回収した。これに３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液１０μｌ及びエタノール２２０μｌを加え、−８０℃に１５分間静置し、部分消化ＤＮＡを析出させた。４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清液を捨てたのち、沈殿に７０％エタノール水溶液５００μｌを加えて混ぜ、再び、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清液を捨て、沈殿を減圧下に乾燥した。
【００３９】
得られた部分消化ＤＮＡを精製水２０μｌに溶かし、その１９μｌをとり、これに下記化１で示すリンカー（２０ｐｍｏｌｅ／μｌ）１４μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ４ ．５μｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭジチオスレイトール及び５００μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン含有０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６、以下、１０倍濃度ライゲーション用緩衝液という）４．５μｌ、精製水２μｌ及びＴ４リガーゼ１μｌを加え、１６℃で４時間反応させ、リンカーを付加させた。
【化１】
リンカーを付加させた部分消化ＤＮＡを、０．１Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液を移動相とするＣｈｒｏｍａ ｓｐｉｎ ６０００カラムにかけた。溶出液２滴ずつを分取し、各分画の一部を０．８％アガロースゲル電気泳動で分析して、１ｋｂｐから７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回収した。得られた分画１４４μｌに、精製水１３μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ ２０μｌ、０．１Ｍ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭスペルミジン塩酸塩及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６、以下、１０倍濃度リン酸化反応用緩衝液という）２０μｌ、及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ３μｌを加え、３７℃で３０分間反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリン酸化した。ＰＣＩ ２００μｌを加えてよく振り混ぜた後、４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、水層を回収した。２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン水溶液１μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液２０μｌ及びエタノール４００μｌを加えてヌクレオチドを析出させた。４℃、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿に７０％エタノール２００μｌを加え混ぜ、再び遠心分離し、上清を捨て、沈殿を風乾し、精製水１μｌを加え溶かした。
【００４１】
この液０．６μｌに、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したλｇｔ１１ ＤＮＡ（１μｇ／μｌ、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社）１μｌ、１０倍濃度ライゲーション用緩衝液０．５μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ０．５μｌ、Ｔ４リガーゼ０．４μｌ及び精製水２μｌを加え、４℃で一晩反応させた。次いで、ギガパック（Ｇｉｇａｐａｃｋ）ＩＩ Ｇｏｌｄパッケージングキット（ストラタジーン社）を用い、得られた組換えλｇｔ１１ＤＮＡをパッケージングした。
【００４２】
（Ｆ）抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング
大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の一白金耳を１０ｍＭ ＭｇＳＯ４３ｍｌ、０．２％マルトース及び５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有のＬＢ（水１Ｌ中にＮａＣｌ ５ｇ、ポリペプトン１０ｇ及び酵母エキス５ｇを含む）培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養したのち、これを２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿（大腸菌）に１０ｍＭ ＭｇＳＯ４水溶液９ｍｌを加えて混ぜ、この大腸菌懸濁液の０．３５ｍｌを採り、これにλｇｔ１１（ＤＮＡライブラリー）懸濁液を０．１〜１０μｌ加え、３７℃で２０分間インキューベートし、大腸菌にλｇｔ１１を感染させた。予め４７℃に保温した液状ＬＢ寒天培地２．５ｍｌに、上記λｇｔ１１感染大腸菌を加え、これを直ちにＬＢ寒天培地上に撒いた。上層寒天培地が固化した後、４２℃で３〜４時間培養し、プラークが観察された時点で１０ｍＭ ＩＰＴＧ水溶液に浸漬したニトロセルロースフィルター（φ８２ｍｍ）を上層寒天培地に乗せ、３７℃で１２時間培養した。黒インクをつけた注射針で非対称に３ヵ所突き刺してフィルターに目印をつけた後、フィルターを寒天培地からとり出し、１５０ｍＭＮａＣｌ及び０．１％ツィーン２０含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、ＴＴＢＳ緩衝液という）で３回洗浄した。寒天培地は冷蔵庫中に保存した。
【００４３】
フィルターを１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、ＴＢＳ緩衝液という）の０．１％牛血清アルブミン含有液に浸し、３７℃で１時間振とうし、ブロッキング反応を行った。次いで、フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で２回洗浄したのち、５〜１０μｇ／ｍｌのクラミジア属細菌に特異的なモノクローナル抗体（７０）のＴＴＢＳ溶液に浸し、３７℃、１時間振とうした。フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識の（５０ｎｇ／ｍｌ）抗マウスＩｇＧ抗体溶液（ＴＴＢＳ緩衝液）中、３７℃で１時間振とうした。フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で３回、及びＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、発色基質液（ＴＢＳ緩衝液１００ｍｌに３０％過酸化水素水溶液６０μｌと０．３％ ４−クロロ−１−ナフトールのメタノール溶液２０ｍｌを加えて調製）に浸漬し、室温で約３０分間放置した。十分発色した時点でフィルターをとり出し、精製水で洗浄し、風乾した。
【００４４】
フィルターの発色スポットに対応する寒天培地上のプラークを捜して同定し、この部分の寒天をパスツールピペットでつき刺し、プラークを回収した。回収したプラークはクロロホルム１滴を加えた０．１Ｍ ＮａＣｌ、８ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．０１％ゼラチン含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） （以下、ＳＭ緩衝液という。）中に採り、４℃で一晩放置しプラーク中のλファージを抽出した。プラークが全て上記モノクローナル抗体と反応するようになるまで、前記操作を繰り返し、抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡをクローン化した。
このようにして、クラミジア属細菌特異的モノクローナル抗体反応性のクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドを発現するλファージが得られ、これを７０−２Ｓλファージと命名した。
【００４５】
（Ｇ）７０−２Ｓλファージの培養とＤＮＡ精製
前記（Ｆ）で述べた方法と同様にしてプラークを形成させ、一つのプラークを回収し、１００μｌのＳＭ緩衝液に入れ、４℃で一晩放置しλファージを抽出した。ＬＢ培養液で一晩培養した大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株２５０μｌに、λファージ液５〜１０μｌを加え、３７℃で２０分間放置し、大腸菌にλファージを感染させた。予め３７℃に温めておいた１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含むＬＢ培地５０ｍｌに接種し、λファージによる大腸菌の溶菌が起こるまで３７℃で５〜７時間振とう培養した。２５０μｌのクロロホルムを加え、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し大腸菌細胞残渣を除き、λファージ懸濁液を得た。λファージＤＮＡは、Ｗｉｚａｒｄ λ ｐｒｅｐｓ キット（プロメガ社）を用いて精製した。
【００４６】
（Ｈ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの増幅
６００μｌ用のマイクロチューブに、精製水６１．５μｌ、１０倍濃度 反応用緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ゼラチンを含むトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．３）１０μｌ、２０ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、７０−２ＳλファージＤＮＡ溶液０．１μｌ、２０ｎＭ λｇｔ１１ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造株式会社）１μｌ、２０ｎＭ λｇｔ１１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造株式会社）１μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μｌを入れ、ミネラルオイルを２〜３滴重層した。９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７３℃ ２分のサイクルのインキュベーションを３０回繰返し、ＤＮＡを増幅した。反応後、１．２％低温融解アガロースゲル電気泳動を行い、増幅されたＤＮＡを切り出して Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐ キット（プロメガ社）で精製した。
【００４７】
（Ｉ）ＤＮＡ塩基配列分析
ＤＮＡ塩基配列分析は、ＰＣＲで増幅したＤＮＡを鋳型として、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータサイクルシークエンス法でシークエンス反応を行い、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオシステムズ社）で分析を行った。得られたＤＮＡ塩基配列を遺伝子配列分析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジニアリング社）を用いて、編集、連結、アミノ酸翻訳領域の推定を行ない、配列番号５の配列を得た。
配列番号５の配列の解析結果から、７３ＫＤａ抗原ポリペプチドについて、そのＮ末端からＣ末端に向けて約９０％のアミノ酸配列が解明されたことが分かった。また、コード領域の塩基配列は配列番号２の配列となっており、その推定アミノ酸配列は配列番号１の配列となっていた。
【００４８】
実施例２ クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターの作製、及びそれを含む形質転換体の作製
７０−２ＳλファージＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、このＤＮＡ断片５０ｎｇに、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断してあるプラスミドｐＢＲ３２２のＤＮＡ１００ｎｇを添加し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造）を用いてこれらのＤＮＡを連結する。この反応物を大腸菌ＨＢ１０１株コンピテントセル（宝酒造）に入れ、形質転換体を作製する。
このプラスミドは、７３Ｋ抗原ポリペプチドの一部をコードするＤＮＡを含むものである。この７３Ｋ抗原ポリペプチドの一部をコードするＤＮＡの塩基配列は配列番号２のようになっており、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列はを配列番号１のようになっている。プラスミドから７３Ｋ抗原ポリペプチドの一部をコードするＤＮＡを切りだし、発現ベクターに入れ、これを大腸菌等の宿主に入れてＤＮＡを発現させると、コードされているタンパク質が菌体内に蓄積される。このタンパク質を電気泳動、ニトロセルロース膜への転写、モノクローナル抗体での検出を同様に行うと上記ポリペプチドに相当するバンドが観察され、クラミジア属の細菌に特異的に反応するモノクローナル抗体と反応することができる７３Ｋ抗原ポリペプチドを発現していることが示される。
【００４９】
実施例３ クラミジア・ニューモニエの５３Ｋ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製
モノクローナル抗体７０の代わりに、モノクローナル抗体ＡＹ６Ｅ２Ｅ８又はＳＣＰ５３を使用し、実施例１と同様の手順で操作した。クローン５３−３Ｓλファージが得られ、これから配列番号６の配列が得られた。
配列番号６の配列の解析結果から、クラミジア・ニューモニエに特異的な５３Ｋ抗原タンパク質については、そのＮ末端からＣ末端に向けて約６０％のアミノ酸配列が解明されたことが分かった。また、コード領域の塩基配列は配列番号３の配列となっており、その推定アミノ酸配列は配列番号４の配列となっていた。
【００５０】
実施例４ 抗原ポリペプチドを抗原として用いる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定
抗原ポリペプチドとして、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドを用い、これをマイクロタイタープレートに固定し、牛血清アルブミンを含むＰＢＳを加え、４℃で一晩以上放置し、ブロッキングを行なう。牛血清アルブミンを含むＰＢＳを除いた後、０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に２回洗浄後、ウェルに患者の血清を加え、室温で２時間放置する。０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回洗浄後、ウェルにパーオキシダーゼ標識化マウス抗ヒトＩｇＧ抗体を加え、室温で２時間放置する。０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回洗浄後、ウェルにＡＢＴＳ溶液（ＫＰＬ社製）を加え、室温で１５分〜１時間放置して発色反応させ、９６ウエルＥＩＡプレート用光度計で４０５ｎｍの吸光度を測定する。
【００５１】
【発明の効果】
本発明（１）の検出・測定方法は、簡便で、クラミジア・ニューモニエの抗体検査等に好適である。
本発明（２）の検出・測定方法は、上記（１）の検出・測定方法の効果を奏し、さらに、抗原として用いられるポリペプチドがクラミジア属細菌に特異的な抗原ポリペプチドの抗原部分を有するので、抗体検査やクラミジア属細菌感染の簡便な診断に極めて適切であり、また、抗原としてクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原ポリペプチドを合わせて利用することにより、感染している種の容易な区別に利用できる。
本発明（３）の検出・測定用試薬は、クラミジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエ感染の簡便な診断に好適である。
本発明（４）の検出・測定用試薬は、上記（３）の検出・測定用試薬の効果を奏し、さらに、抗原として用いられるポリペプチドがクラミジア属細菌に特異的な抗原ポリペプチドの抗原部分を有するので、抗体検査やクラミジア属細菌感染の簡便な診断に極めて適切であり、また、抗原としてクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原ポリペプチドを合わせて利用することにより、感染している種の容易な区別に利用できる。
本発明（５）の診断薬は、クラミジア・ニューモニエ感染の簡便な診断に好適である。
本発明（６）の診断薬は、上記（５）の診断薬の効果を奏し、さらに、抗原として用いられるポリペプチドがクラミジア属細菌に特異的な抗原ポリペプチドの抗原部分を有するので、抗体検査やクラミジア属細菌感染の簡便な診断に極めて適切であり、また、抗原としてクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原ポリペプチドを合わせて利用することにより、感染している種の容易な区別に利用できる。
【００５２】
【配列表】
Claims (6)
- 配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＣを抗原として用いることを特徴とする、抗クラミジア属細菌抗体もしくは抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法。
- 配列番号１のポリペプチドを抗原として用いることを特徴とする、抗クラミジア属細菌抗体もしくは抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法。
- 配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＣを抗原として含有してなる、抗クラミジア属細菌抗体もしくは抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定用試薬。
- 配列番号１のポリペプチドを抗原として含有してなる、抗クラミジア属細菌抗体もしくは抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定用試薬。
- 配列番号１のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチドＣを有効成分とする、クラミジア属細菌感染もしくはクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
- 配列番号１のポリペプチドを有効成分とする、クラミジア属細菌感染もしくはクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
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| JP10601495A JP3578233B2 (ja) | 1995-04-28 | 1995-04-28 | 抗クラミジア・ニューモニエ抗体の検出・測定方法及びその試薬、並びにクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬 |
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|---|---|---|---|---|
| WO2013008743A1 (ja) * | 2011-07-11 | 2013-01-17 | 富士レビオ株式会社 | クラミジアニューモニエ抗原及びその利用 |
-
1995
- 1995-04-28 JP JP10601495A patent/JP3578233B2/ja not_active Expired - Lifetime
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|---|---|
| JPH08304404A (ja) | 1996-11-22 |
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