JP3570737B2 - リステリア検出のための方法および試薬 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属の細菌、とくにリステリア・モノシトゲネス（Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、の検出のための試薬および方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リステリア属の細菌はグラム陽性の桿状菌で広範に分布している。この属には次の７菌種、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ． ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌ． ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌ． ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌ． ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌ． ｍｕｒｒａｙｉおよびＬ． ｇｒａｙｉがある。このうち、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのみがヒトに対して病原性を有していて、とくに新生児、妊婦および高齢者、さらに免疫抑制の対象となる患者を脅かす。Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ感染による死亡もしばしばみられる。
【０００３】
汚染された食物では、この細菌は４℃付近の低温においても増殖することができ、しばしばリステリア感染の原因となる。すなわち、種々のリステリアの流行が汚染された食物、例えば生乳、チーズまたはコールスローなどの摂取によって起きている。したがって、リステリアの、とくに食物や臨床試料中におけるリステリアの迅速な検出法が危急に求められている。これらの検出法は、加えてＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓとヒトに対して非病原性の他の菌種とを識別できるものでなくてはならない。さらに、ヒトに病原性示す菌種であるＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの全ての変種株の検出が可能でなければならない。最近の考察の結果、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによる汚染の可能性を調べるための指示菌としてＬ． ｉｎｎｏｃｕａを用いることが提案された。したがって、Ｌ． ｉｎｎｏｃｕａの検出もまた、きわめて有用である。
【０００４】
Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの検出は、微生物の培養を基礎とする既知の方法を用いて行うことができる。Ｉｎｔ． Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４、 ２４９−２５６、 １９８７に記載の方法は、２週間を要する。いくらか速い方法が国際酪農連盟（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄａｉｒｙ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ （ＩＤＦ））によって推奨されたが、それも少なくとも６〜８日かかる。両方法とも時間がかかるために、迅速な同定法としては不適である。加えて、単離コロニーを得るために栄養培地に繰り返して接種しなくてはならないこと、続いて単離コロニーを生化学的および血清学的な検査手法を用いて特徴づけしなければならないことから、両方法はきわめて手間がかかる。
【０００５】
近年市場に出てきた免疫学的試験法は２、３時間しか要しないが、リステリアの異なる菌種間の重要な違いを区別することができない。これらの方法においてもまた、増殖富化のための前培養に２日間を要する。
【０００６】
Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５４、 ２９３３−２９３７、 １９８８に記載の方法では、合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブを用いてＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが特異的に検出される。しかし、用いられるプローブはヒトに対して非病原性の菌種であるＬ． ｓｅｅｌｉｇｅｒｉとも反応することから、充分に特異的ではない。細菌の前増殖がこの場合にも必要とされる。すなわち、食物試料、あるいはそれらの希釈物を寒天プレートに塗布して、次いでそれらプレートをインキュベートしてから、放射性標識したＤＮＡプローブを用いるコロニーハイブリダイゼーション手法によって調べる。検出はオートラジオグラフィーによって行われる。この方法も人手と時間がかかる。
【０００７】
Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのｉａｐ（ｉｎｖａｓｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、侵入関連タンパク質）遺伝子のＤＮＡ配列は、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ５８、 １９４３−１９５０、 １９９０に記載されている。この遺伝子は、全リステリア菌種の変株にみられるｐ６０としても知られているタンパク質をコードするものである。Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおいて、このタンパク質は動物細胞への侵入能に関係している。この遺伝子からの構成配列を有するポリヌクレオチド（４００塩基）は、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを他の菌種から識別するためのＤＮＡプローブとして適している。
【０００８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって核酸のインビトロ複製がなされ、こ方法を用いる場合は前培養は一般に不要である。反応を開始するために、短い核酸断片（プライマー）が必要であって、プライマーは複製されるゲノムの部分に包含される。通常、二つのプライマーが要求され、そのそれぞれがひとつの核酸鎖とハイブリダイズする。したがって、プライマーのひとつは遺伝子の関連部分に対して相補的な配列を有する。これらプライマーの選択によって、検出反応の特異性が決定される。Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの検出のためのこのプロセスの使用は、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５７、 ６０６−６０９、 １９９１、Ｌｅｔｔｅｒｓ Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １１、 １５８−１６２、 １９９０およびＪ． Ａｐｐｌ． Ｂａｃｔ． ７０、 ３７２−３７９、 １９９１に記述されている。これらプロセスの詳細についてのより広範な情報は、これら文献にみられる。これらＤＮＡプライマーは、リステリア溶血素であるリステリオリシンの遺伝子に結合する。これらプライマーの特異性は不確かであり、Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｂａｃｔ． ７０中にはＬ． ｓｅｅｌｉｇｅｎｉはＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓから確実には識別できないという言及がみられる。このように、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの確実な検出はＰＣＲ法の使用では可能ではない。
【０００９】
Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｐ６０に対するポリクローナル抗体は、他の非病原性のリステリア菌種のｐ６０タンパク質とも反応する。したがってそのような抗体は免疫学的方法でＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを特異的に検出するには適していない。明らかに、この性質の多価抗血清を阻害抗体画分の特異的吸収によって精製することは原理的に可能である。この目的のために、他の全リステリア菌種からのｐ６０タンパク質を担体に共有結合させる。不要な抗体画分を特異的に吸収させることができ、このようにして残った抗血清はＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ６０タンパク質とだけ反応しない。Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ特異性血清を得るためのこの方法は手がこんでいる。かなり多量の多価抗血清が出発材料として要求され、さらに、種々のリステリア菌種のｐ６０ｉａｐ遺伝子産物が必要である。ｐ６０タンパク質に対するモノクローナル抗体の獲得ではこのような大量の材料を必要としないだろうが、特定のエピトープに対する抗体を生じさせることは偶然による。まず第一に、大量の抗体産生細胞クローンを調製することが必要であり、それから適当なクローンを選択しなければならない。これまで、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに特異的なエピトープに対する抗体を目的の方法で得ることは可能ではなかった。Ｌ． ｉｎｎｏｃｕａに特異的なエピトープに関しても同様である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、リステリア属の細菌を識別するため、とくにＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ菌種の細菌を検出するための、改良された試薬および方法を提供することにある。とくに、本発明によれば、ＰＣＲ法に適するプライマー配列、および菌種Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓとＬ． ｉｎｎｏｃｕａとの免疫学的な検出に適する特異的抗体の目的生産のためのペプチドが提供される。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、核酸複製のための、例えばポリメラーゼ連鎖反応などの方法でｉａｐ遺伝子から選択されたプライマーに関し、プライマーは構成配列として一般式Ｉａ〜Ｉｈのひとつによる少なくともひとつの配列および／またはそれに対応する相補的配列を含み、２０個までのさらなるヌクレオチド部分をこの構成配列の前方および／または後方に結合することができることを特徴とする。そのようなプライマーは、リステリア属、とくにＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ菌種を含む細菌のＰＣＲ法による検出および識別のために適している。
これに関連して、式ＩＩａ〜ＩＩｈの少なくともひとつによる配列および／またはそれに対応する相補的配列を含むプライマーがとくに好ましい。
本発明は、加えて、式ＩＩＩａ〜ＩＩＩｉのひとつによる少なくともひとつの配列を構成配列として含むペプチドに関し、それぞれの場合、７個までのアミノ酸をペプチド結合によってこの構成配列の前方および／または後方に結合させることが可能である。
これに関連して、第２ａ−ｉ図および第６ａ−ｄ図のひとつによる配列を有するペプチドがとくに好ましい。
【００１２】
本発明はまた、式ＩＩＩａ〜ＩＩＩｉのひとつによる構成配列を有する、該ペプチドのひとつの、免疫原性抱合体の調製のための使用に関する。第２ａ−ｉおよび第６ａ−ｄのひとつによる配列を有するペプチドがこの目的のためにとくに好ましい。
【００１３】
本発明はまたエピトープに結合する抗体に関し、これは第３図によるポリペプチドから形成されるか式ＩＩＩａ〜ＩＩＩｉのひとつ、好ましくは第２ａ−ｉおよび第６ａ−ｄによるペプチドを含む。
【００１４】
本発明はさらに、第３図によるポリペプチドまたは第３図によるポリペプチドから選択される７〜２４個のアミノ酸を有するペプチドを含む免疫原性抱合体を用いて実験動物を免疫することによって調製することができる抗体に関する。
【００１５】
本発明はまた、実験動物を免疫原で免疫して抗体を単離することによるリステリアからのｐ６０タンパク質に対する抗体の調製法であって、第３図によるポリペプチドまたは第３図によるポリペプチドを含む免疫原性抱合体を免疫原として用いることを特徴とする。これに関連して、免疫原性抱合体は、第３図によるポリペプチドから選択される７〜２４個のアミノ酸を有するペプチドを含むか、式ＩＶａ〜ＩＶｉのひとつによるペプチドを含むことが好ましい。
【００１６】
式中Ｘ３およびＸ４は、それぞれ独立して水素、任意のアミノ酸または７個までのアミノ酸を含む任意のオリゴペプチドである。
第２ａ−ｉ図および第６ａ−ｄ図のひとつによる配列を有するペプチドがとくに好ましい。
【００１７】
最後に、本発明は、式Ｉａ〜Ｉｈのひとつによる構成配列または好ましくは式ＩＩａ〜ＩＩｈのひとつによる配列または関連の相補的配列を含むプライマーの、リステリア属細菌の検出のための使用に関する。
【００１８】
本発明はまた、式Ｉａ〜Ｉｈのひとつによる構成配列または好ましくは式ＩＩａ〜ＩＩｈのひとつによる配列または関連の相補的配列を含むプライマーを用いることによる、リステリア属細菌を検出する方法に関する。
【００１９】
本発明はさらに、第３図によるポリペプチド配列からのエピトープに対する、または第２ａ−ｉ図または第６ａ−ｄ図のひとつによるアミノ酸配列を有するエピトープのひとつに対する抗体の、リステリア属細菌の検出のための使用に関する。
【００２０】
本発明はまた、第３図によるポリペプチド配列からのエピトープに対する、または第２ａ−ｉ図または第６ａ−ｄ図のひとつによるアミノ酸配列を有するエピトープのひとつに対する抗体を用いることによる、リステリア属細菌の検出法に関する。
【００２１】
最後に、本発明は、式Ｉａ〜Ｉｈのひとつによる構成配列または好ましくは式ＩＩａ〜ＩＩｈのひとつによる配列または関連の相補的配列を含むプライマーを含む、例えばポリメラーゼ連鎖反応による核酸の複製による、リステリア属細菌、とくにＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ菌種の検出のための試験キットに関する。
【００２２】
本発明はさらに、第３図によるポリペプチド配列からのエピトープ、または第２ａ−ｉ図のひとつによるアミノ酸配列を有するエピトープのひとつに対する抗体を含むリステリア・モノシトゲネス菌種の細菌の免疫学的検出のための試験キット、および第６ａ−ｄ図のひとつによるアミノ酸配列を有するエピトープに対する抗体を含むリステリア・イノキュア菌種の細菌の免疫学的検出のための試験キットに関する。
【００２３】
本発明は、後記によってより詳細に説明される。これに関連して、当業者に公知であって文献に詳細が記述されているような生化学的、免疫学的および分子生物学的方法の詳細については、一般にはここには記述しない。これら方法において、自体公知の変法もまた使用できるが、その詳細はここには記述しない。
【００２４】
式Ｉａ〜ＩｈおよびＩＩａ〜ＩＩｈによって表される本発明によるオリゴヌクレオチドは、核酸複製法のためのプライマーとして、したがって、リステリア属細菌の特異的検出のために、適している。これらの配列は、通常の方法、すなわち５′末端から３′末端の方向に記述されている。いかなる場合も用いられる複製システムの要求に応じて、本発明による配列を有するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドが用いられる。後者の場合、チミジン部分はそれぞれウリジンによって置き換えられる。さらに、核酸配列中のひとつまたは２、３個の塩基が置き換えられても生物学的性質に変化がないことがしばしばあることは当業者に公知である。この理由のために、本発明によるヌクレオチド配列もまた、配列Ｉａ〜ＩｈおよびＩＩａ〜ＩＩｈからの塩基置換に由来し、その生物学的効果はオリジナル配列を有するそれぞれのプライマーと同様である、ヌクレオチド配列からなる。通常、ひとつのプライマーはそれぞれＤＮＡ鎖のひとつと反応することから、プライマーのひとつは相補的配列で用いられる。相補的配列は、塩基対合のルールによって既知の方法で得られる。
【００２５】
各配列に基づいて、本発明によるオリゴヌクレオチドは、例えばホスホトリエステル法やホスホアミダイト法などの当業者に公知の方法によって合成することができる。ホスホアミダイト法は、とくに機械化された合成機による方法が好ましく用いられる。この方法は、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ、 ２２、 １８５９−１８６２、 １９８１に記述されている。同様の合成法のさらなる詳細は、例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ、 Ｅ． Ｌ． （１９８５）、 Ｇｅｎｅ ｕｎｄ Ｋｌｏｎｅ ［Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｃｌｏｎｅｓ］、 ４４−６１ （ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｂＨ、 Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）に記述されている。
【００２６】
本発明によるプライマーは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるＤＮＡ複製に適している。この目的のために、ＤＮＡをまず最初に加熱によって１本鎖に解離する。二つのプライマーを用いてそれぞれＤＮＡ鎖のひとつの上の相同的ＤＮＡセグメントとそれぞれハイブリダイズさせる。これら二つのプライマーの間にあるゲノムセグメントが複製される。ＤＮＡに付いたプライマーは、複製の開始点を表す。次いで、四つのヌクレオチド三燐酸の存在下でポリメラーゼ、好ましくはｔａｑＤＮＡポリメラーゼによって、オリジナルＤＮＡの配列に対応する第二の鎖が完成される。次いで、生じた２本鎖を、再び加熱によって１本鎖に分離する。この複製サイクルは、何回も繰り返すことができる。充分な回数の複製サイクルの後に、複製された核酸を既知の方法によって検出することができる。この目的のために、ＤＮＡを電気泳動によって分離して、次いで臭化エチジウムによって染色し、最後にＵＶ励起を用いる蛍光によって検出することができる。ＤＮＡハイブリダイゼーションを用いる検出もまた、可能である。適当な複製および検出法の詳細もまた、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）、 ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｉｎｃ．、 Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ、 Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）などの総説に記述されている。本発明によるプライマーを用いることができる他の核酸複製法についてもまた、文献から知ることができる。これらには、Ｂｏｎｄ、 Ｓ．らによって記述されているリガーゼ連鎖反応が含まれる。
【００２７】
好ましい式ＩＩａ〜ＩＩｈによるプライマーの選択によって、ｉａｐ遺伝子上の開始点の位置が、すなわち、検出反応の特異性が決まる。このように、ｉａｐ遺伝子の配列から選択されたプライマーの組み合わせは非特異的であり、その結果、ＤＮＡ複製によるリステリア検出には不適当であることが証明された（これに関連して、例えば、表１のＦ欄を参照されたい）。しかし、他の選択された組み合わせはリステリア属に、他のものはリステリア菌種グループに、他のものはまた個々のリステリア菌種に、それぞれ特異的であることが証明された。したがって、結論として、プライマーの選択と構成が決定因子となる。二つのプライマーのひとつの選択はとくに常に重要で、第二番目のプライマーは検出反応の特異性を有意に変えることなくより容易に変更することができる。したがって、本発明の教示によれば、この第二のプライマーのために、式Ｉａ〜ＩｈまたはＩＩａ〜ＩＩｈのひとつに対応しない配列を選択することも可能である。
【００２８】
本発明によると、プライマーの少なくともひとつが式Ｉａ〜Ｉｈまたは好ましくは式ＩＩａ〜ＩＩｈから選択される。既に説明したように、第二のプライマーは第一のプライマーよりも複製反応の特異性への影響が実質的に少ない。しかし、両プライマーが式Ｉａ〜ＩｈまたはＩＩａ〜ＩＩｈから選択される組み合わせが好ましい。このような好ましい組み合わせの例は次のようなものである（典型的な結果を表１に要約する）。
【００２９】
ａ） 式ＩＩｃによるプライマーと式ＩＩｂによる相補的配列のプライマーとの組み合わせを用いる場合、リステリアのＤＮＡのみが複製されて他のタイプの細菌のＤＮＡは複製されない（表１のＤ欄を参照されたい）。
【００３０】
ｂ） 式ＩＩｄによるプライマーと式ＩＩｂによる相補的配列のプライマーとの組み合わせを用いる場合、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのＤＮＡのみが複製されて他のリステリアまたは他の細菌のＤＮＡは複製されない（表１のＢ欄を参照されたい）。
【００３１】
ｃ） 式ＩＩｆによるプライマーと式ＩＩｂによる相補的配列のプライマーとの組み合わせを用いる場合、特定のリステリア菌種のＤＮＡのみ、すなわち、Ｌ． ｓｅｅｌｉｎｇｅｒｉ、Ｌ． ｗｅｌｓｈｉｍｉｒｉおよびＬ． ｉｖａｎｏｖｉｉのＤＮＡが排他的に複製される。この結果、グループ−特異的検出が可能になる（表１のＥ欄を参照されたい）。 ｄ） グループ−特異的検出の他の例としては、式ＩＩｈによるプライマーと式ＩＩｂによる相補的配列のプライマーとの組み合わせの使用によって、Ｌ． ｇｒａｙｉおよびＬ． ｍｕｒｒａｙｉのＤＮＡのみが複製される（表１のＧ欄を参照されたい）。 ｅ） 異なるリステリア菌種の複製産生物は、種々の分子量を有することから、リステリア属の細菌は、いくつかのプライマー（式ＩＩｄ、ＩＩｆ、ＩＩｇおよびＩＩｈによる）と式ＩＩｂの相補的配列のプライマーとの組み合わせによって、単一のポリメラーゼ反応を用いて区別することができる。ポリメラーゼ手法のこのさらなる展開の詳細は実施例８から明かである（表１のＨ欄および第１図を参照されたい）。
【００３２】
既述したように、核酸ハイブリダイゼーションによって複製産生物を検出することもまた、可能である。これを行うために、適当な核酸断片（核酸プローブ）を反応混合物に複製後に加える。これら核酸プローブは、複製された遺伝子セグメントと完全にまたは部分的に相補的な塩基配列を有している。加えて、これらプローブは、検出反応のために標識されている。すなわち、これらは放射性同位元素を含むか、蛍光標識を有するか、または酵素で標識することができる。適当な標識剤、核酸プローブへのそれらの導入法および検出方法は、当業者に公知のものである。
【００３３】
とくに、複製反応はリステリア属に（より詳細は上記ａ）に記述）、またはリステリア菌種のグループ（より詳細は上記ｃ）およびｄ）に記述）に特異的にデザインすることができる。それぞれひとつの菌種に特異的な核酸プローブを用いることによって、リステリアのこれら菌種の存在が反応混合物中に確認される。プローブに異なる標識剤が含まれる場合には、異なる菌種もまた並行して検出することができる。したがって、この方法の変法によって、上記のｅ）に記述の方法と同様にして異なるリステリア菌種が並行して検出できる。
【００３４】
ひとつの核酸プローブまたは全リステリア菌種の複製産生物と反応する異なる核酸プローブの混合物の使用によって、複製反応の特異性のチェックまたは異なるリステリア菌種のための単一の検出試薬の調製が可能になる。
【００３５】
式ＩＶａ〜ＩＶｉによるおよび第２ａ−ｉ図および第６ａ−ｄ図による、本発明によるペプチドを免疫原性抱合体に取り込むことができる。これら抱合体を用いて、リステリア属の細菌を免疫学的手法を用いて特異的に検出するための抗体を生産することができる。
【００３６】
リステリア・モノシトゲネスからのｐ６０タンパク質の全体の配列における本発明によるペプチドの位置は、次のように記述される。
【００３７】
ａ） 式ＩＩＩａによる配列は、ｐ６０配列の１４８位のプロリンで始まり（第４図）、第２ａ、２ｅおよび２ｆ図によるペプチドもまたこの領域に位置している。
【００３８】
ｂ） 式ＩＩＩｂによる配列は、ｐ６０配列の１７８位のスレオニンで始まり（第４図）、第２ｂおよび２ｈ図によるペプチドもまたこの領域に位置している。 ｃ） 式ＩＩＩｃによる配列は、ｐ６０配列の２４３位のアラニンで始まり（第４図）、第２ｃおよび２ｉ図によるペプチドもまたこの領域に位置している。
【００３９】
ｄ） 式ＩＩＩｄによる配列は、ｐ６０配列の２９２位のグルタミンで始まり（第５図）、第２ｄ図によるペプチドもまたこの領域に位置している。
【００４０】
ｅ） 式ＩＩＩｅによる配列は、ｐ６０配列の７１位のバリンで始まり（第４図）、第２ｇ図によるペプチドもまたこの領域に位置している。
【００４１】
第６ａ−ｄ図に示された本発明によるペプチドの配列は、リステリア・イノクラからのタンパク質ｐ６０の全配列に由来する。これは式ＩＩＩｆ−ｉおよび式ＩＶｆ−ｉに示された部分配列についても同様である。
【００４２】
ペプチド中のひとつまたは二、三のアミノ酸の変化はその生物学的性質を変えないことがしばしばあることは当業者に公知である。この理由によって、本発明によるペプチドもまた、アミノ酸交換によって、第２ａ−ｉ図による、第６ａ−ｄ図による、または第３図による配列に由来し、オリジナル配列を有するそれぞれのペプチドと同様の効果を生物学的に示すものを含む。
【００４３】
本発明によるペプチドの選択は決定的に重要であることは明かである。例えば、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに特異的な遺伝子セグメントによってコードされる特定のペプチドが抗体産生に選択されると、驚いたことに、どの抗血清もｐ６０タンパク質との反応を示さない。
【００４４】
アミノ酸配列に基づいて、当業者に公知の方法によって、例えばｔｂｏｃまたはｆｍｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、または９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）法によって、合成することができる。これらの方法の詳細は、例えば、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５、 ２１４９−２１５４、 １９６３およびＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｇｅｎｓ （Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ （ｅｄｓ．） Ｅｌｓｅｖｉｅｒ １９８８ （Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙシリーズ第９巻）などに記述されている。ｆｍｏｃ法、とくにその機械化された変法が好ましい。方法の詳細および適当なアミノ酸保護基は当業者に公知である。
【００４５】
一般にペプチドは抗体の産生に適していない。しかし、ペプチドを高分子量の担体物質に結合させれば、免疫原性の抱合体が形成される。本発明によるペプチドは、既知の担体物質と抱合させることができる。それらには、ポリエチレングリコール、血清アルブミン、ＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ヘモシアニン）、卵白アルブミン、バチルス・メガテリウムからのグルコースデヒドロゲナーゼおよびＰＰＤ（ツベルクリンの精製タンパク質誘導体）などがある。好ましい担体物質は、ＫＬＨおよびバチルス・メガテリウムからのグルコースデヒドロゲナーゼである。
【００４６】
この他に、架橋化合物（リンカー）もまた、しばしば用いられる。これらは、少なくとも二つの架橋できる官能基を有する低分子量有機化合物である。適当な化合物は当業者に公知であるが、例えば、１、２−ジアミノエタン、コハク酸、β−アラニン、１、６−ジアミノヘキサン、６−アミノカプロン酸、アジピン酸およびシステインなどがあげられる。システインはリンカーとして好ましく用いられ、このアミノ酸残基はペプチド合成中に取り込まれる。アミノおよびカルボキシル基の両方を含むリンカー（例えば、β−アラニン、６−アミノカプロン酸またはシステイン）は、ペプチドのＣ−末端またはＮ−末端のいずれにも結合することができる。ｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）は、ペプチドと担体物質間の結合を調製するために好ましく用いられる。
【００４７】
該免疫原性抱合体は、既知の方法による実験動物における抗体の産生に用いられる。通常、この目的のためにはヒツジ、ヤギ、ウサギおよびマウスなどの哺乳動物が用いられる。ポリクローナル抗体の産生にはウサギが好ましい。しかし、本発明による免疫原性抱合体を用いてモノクローナル抗体を産生することもまた可能である。
【００４８】
免疫学的方法の詳細は当業者に公知である。加えて、これらの方法を実施するための手順は、文献に既述されており、その例を以下にあげる。
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、 Ｈ． Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ． Ｌａｎｅ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ （１９８８）
Ｗｏｏｄａｒｄ、 Ｌ．Ｆ． ａｎｄ Ｊａｓｍａｎ、 Ｒ．Ｌ． （１９８５） Ｖａｃｃｉｎｅ ３、 １３７−１４４
Ｗｏｏｄａｒｄ、 Ｌ．Ｆ． （１９８９） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉ ３９、 ２２２−２２５
Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９８６） Ｗｅｉｒ、 Ｄ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．：
Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、 Ｏｘｆｏｒｄ、 ＧＢ．
これらの方法には、例えば、抱合および免疫方法、さらに抗体の調製および精製、また免疫学的検出法なども含まれる。本発明による抗体を用い得る免疫学的検出法には、好ましくは凝集法、免疫度検出法、イムノブロット法およびとくにサンドイッチＥＬＩＳＡ法などが含まれる。
【００４９】
本発明においては、抗体の概念には、免疫グロブリンと抗血清の両方が包含される。さらに、単一のエピトープに対する単一の抗体の代わりに特異性を異にする種々の抗体の混合物がしばしば用いられることは、当業者に公知である。これは、とくに検出感度に関して有利な結果となる。これはとくにモノクローナル抗体に適用されるが、また、それぞれひとつのエピトープに対する他の抗体についても適用される。したがって、式ＩＩＩａ〜ＩＩＩｉによる、または第３図、第２ａ−ｉ図または第６ａ−ｄ図のひとつによる異なるペプチド構造に対する複数の抗体を、本発明による使用および／または本発明による方法のために組み合わせることは有利と考えられる。
【００５０】
【実施例】
本発明によるプライマーおよびペプチドの調製、さらにそれらの使用に関する詳細を次の実施例によって明らかにする。当業者はさらなる方法の詳細を引用文献に見出だすことができる。実施例は本発明の内容を説明するものであって、本発明を制限することを意図するものではない。
実施例１： 式ＩＩａによるプライマーの調製
式ＩＩａによるプライマーを、アプライド・バイオシステムズの３８０Ａ型ＤＮＡ合成機を用いてホスホアミダイト法によって調製する。この方法の要点はＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２２、 １８５９−１８６２、 １９８１に記述されている。さらなる詳細は、機器製造業者によって提供される文献に見出される。
【００５１】
式ＩＩｃ、ＩＩｄ、ＩＩｆ、ＩＩｇおよびＩＩｈによるプライマーを対応する方法によって調製する。式ＩＩｂおよびＩＩｅによるプライマーを、それぞれの相補的配列（ＩＩｂ：ＴＴＧＧＣＴＴＣＧＧＴＣＧＣＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡ；ＩＩｅ：ＧＣＡＣＴＴＧＡＡＴＴＧＣＴＧＴＴＡＴＴＧ）に調製する。
実施例２： Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの菌種特異的検出のためのＰＣＲ反応の実施
細菌を含む試料を、約１μｇのＤＮＡとともに５０μｌの緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２および５０ｍＭＫＣｌ）に懸濁させて、１１０℃で５分間加熱する。次いで、式ＩＩｄおよびＩＩｅによるプライマー（実施例１を参照、各０．４μｇ）および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ファルマシア製）を反応緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２および５０ｍＭＫＣｌ）に溶解して、それぞれ２００μｍｏｌのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを加える（反応総液量１００μｌ）。最初の変性段階を９４℃で３分間続ける。次いで、反応混合物を５５℃の温度で３０秒間（アニーリング期）、および７２℃の温度で１分間（伸長期）保持する。次いで、変性段階（９４℃）を４５秒間続ける。３０回の反応サイクルの後、５分間保持の終結伸長段階（７２℃）を行う。
【００５２】
ＰＣＲ産生物を、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を含むトリス−ホウ酸塩（それぞれ５０ｍＭ）の泳動緩衝液中でポリアクリルアミドゲル（６％）上で分離する。次いで、分離したＰＣＲ産生物を臭化エチジウム（０．１ｍｇ／ｍｌ水中）を用いて染色して、ＵＶ光（２６０ｎｍ）で照射して可視化する。
【００５３】
ＰＣＲ産生物は、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのＤＮＡまたは細胞が試料中に存在する場合にのみ観察される（表１のＡ欄を参照されたい）。
実施例３： Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの菌種特異的検出のためのＰＣＲ反応の実施
式ＩＩｄおよびＩＩｅによるプライマーの代わりに式ＩＩｄおよびＩＩｂによるプライマー（実施例１を参照）を用いて、実施例２に記述の方法を繰り返す。この場合もまた、ＰＣＲ産生物は、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのＤＮＡまたは細胞が試料中に存在する場合にのみ観察される（表１のＢ欄を参照されたい）。
実施例４： リステリア属細菌の属特異的検出のためのＰＣＲ反応の実施
細菌を含む試料を、約１μｇのＤＮＡとともに５０μｌの水に懸濁させて、１１０℃で５分間加熱する。次いで、式ＩＩｃおよびＩＩｂによるプライマー（実施例１を参照、各０．４μｇ）および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ファルマシア製）を反応緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２および５０ｍＭＫＣｌ）に溶解して、それぞれ２００μｍｏｌのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを加える（反応総液量１００μｌ）。最初の変性段階を９４℃で３分間続ける。次いで、反応混合物を５６℃の温度で３０秒間（アニーリング期）、および７２℃の温度で２分間（伸長期）保持する。次いで、変性段階（９４℃）をそれぞれ４５秒間続ける。３０回の反応サイクルの後、５分間保持の終結伸長段階（７２℃）を行う。
【００５４】
ＰＣＲ産生物を、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を含むトリス−ホウ酸塩（それぞれ５０ｍＭ）の溶出緩衝液中でアガロースゲル（１％）上で分離する。次いで、分離したＰＣＲ産生物を臭化エチジウム（０．１ｍｇ／ｍｌ水中）を用いて染色して、ＵＶ光（２６０ｎｍ）で照射して可視化する。
【００５５】
この場合、ＰＣＲ産生物はリステリア属の細菌からのＤＮＡまたは細胞が試料中に存在する場合にのみ観察される（表１のＤ欄を参照されたい）。
実施例５： リステリアのグループ特異的検出のためのＰＣＲ反応の実施
細菌を含む試料を、約１μｇのＤＮＡとともに５０μｌの水に懸濁させて、１１０℃で５分間加熱する。次いで、式ＩＩｆおよびＩＩｂによるプライマー（実施例１を参照、各０．４μｇ）および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ファルマシア製）を反応緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２および５０ｍＭＫＣｌ）に溶解して、それぞれ２００μｍｏｌのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを加える（反応総液量１００μｌ）。最初の変性段階を９４℃で３分間続ける。次いで、反応混合物を５８℃の温度で４５秒間（アニーリング期）、および７２℃の温度で１分間（伸長期）保持する。次いで、変性段階（９４℃）を４５秒間続ける。３０回の反応サイクルの後、５分間保持の終結伸長段階（７２℃）を行う。
【００５６】
ＰＣＲ産生物を、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を含むトリス−ホウ酸塩（それぞれ５０ｍＭ）の溶出緩衝液中でアガロースゲル（１％）上で分離する。次いで、分離したＰＣＲ産生物を臭化エチジウム（０．１ｍｇ／ｍｌ水中）を用いて染色して、ＵＶ光（２６０ｎｍ）で照射して可視化する。
【００５７】
この場合、ＰＣＲ産生物は、Ｌ． ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌ． ｓｅｅｌｉｇｅｒｉおよびＬ． ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ群からの細菌のＤＮＡまたは細胞が試料中に存在する場合にのみ観察される（表１のＥ欄を参照されたい）。
実施例６： Ｌ． ｉｎｎｏｃｕａの菌種特異的検出のためのＰＣＲ反応の実施
細菌を含む試料を、約１μｇのＤＮＡとともに５０μｌの緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２および５０ｍＭＫＣｌ）に懸濁させて、１１０℃で５分間加熱する。次いで、式ＩＩｇおよびＩＩｂによるプライマー（実施例１を参照、各０．４μｇ）および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ファルマシア製）を反応緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２および５０ｍＭＫＣｌ）に溶解して、それぞれ２００μｍｏｌのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを加える（反応総液量１００μｌ）。最初の変性段階を９４℃で３分間続ける。次いで、反応混合物を６２℃の温度で６０秒間（アニーリング期）、および７２℃の温度で４５秒間（伸長期）保持する。次いで、変性段階（９４℃）を４５秒間続ける。３０回の反応サイクルの後、５分間保持の終結伸長段階（７２℃）を行う。
【００５８】
ＰＣＲ産生物を、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を含むトリス−ホウ酸塩の溶出緩衝液（それぞれ５０ｍＭ）中でアガロースゲル（１％）上で分離する。次いで、分離したＰＣＲ産生物を臭化エチジウム（０．１ｍｇ／ｍｌ水中）を用いて染色して、ＵＶ光（２６０ｎｍ）で照射して可視化する。
【００５９】
ＰＣＲ産生物は、Ｌ． ｉｎｎｏｃｕａのＤＮＡまたは細胞が試料中に存在する場合にのみ観察される（表１のＣ欄を参照されたい）。
実施例７： リステリアの群特異的検出のためのＰＣＲ反応の実施
細菌を含む試料を、約１μｇのＤＮＡとともに５０μｌの水に懸濁させて、１１０℃で５分間加熱する。次いで、式ＩＩｈおよびＩＩｂによるプライマー（実施例１を参照、各０．４μｇ）および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ファルマシア製）を反応緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２および５０ｍＭＫＣｌ）に溶解して、それぞれ２００μｍｏｌのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを加える（反応総液量１００μｌ）。最初の変性段階を９４℃で３分間続ける。次いで、反応混合物を５６℃の温度で４５秒間（アニーリング期）、および７２℃の温度で４５秒間（伸長期）保持する。次いで、変性段階（９４℃）を４５秒間続ける。３０回の反応サイクルの後、５分間保持の終結伸長段階（７２℃）を行う。
【００６０】
ＰＣＲ産生物を、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を含むトリス−ホウ酸塩の溶出緩衝液（それぞれ５０ｍＭ）中でアガロースゲル（１％）上で分離する。次いで、分離したＰＣＲ産生物を臭化エチジウム（０．１ｍｇ／ｍｌ水中）を用いて染色して、ＵＶ光（２６０ｎｍ）で照射して可視化する。
【００６１】
この場合、ＰＣＲ産生物は、Ｌ． ｇｒａｙｉおよびＬ． ｍｕｒｒａｙｉ群からの細菌のＤＮＡまたは細胞が試料中に存在する場合にのみ観察される（表１のＧ欄を参照されたい）。
実施例８： Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＬ． ｉｎｎｏｃｕａの菌種特異的検出のための、およびＬ． ｉｖａｎｏｖｉｉ／Ｌ． ｓｅｅｌｉｎｇｅｒｉ／Ｌ． ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ群およびＬ．ｇｒａｙｉ／Ｌ． ｍｕｒｒａｙｉ群の群特異的検出のための、組み合わせＰＣＲ反応の実施
細菌を含む試料を、約１μｇのＤＮＡとともに５０μｌの緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２および５０ｍＭＫＣｌ）に懸濁させて、１１０℃で５分間加熱する。次いで、式ＩＩｄ、ＩＩｆ、ＩＩｇ、ＩＩｈおよびＩＩｂによるプライマー混合物（実施例１を参照、各０．４μｇ）および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ファルマシア製）を反応緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２および５０ｍＭＫＣｌ）に溶解して、それぞれ２００μｍｏｌのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを加える（反応総液量１００μｌ）。最初の変性段階を９４℃で３分間続ける。次いで、反応混合物を５６℃の温度で４５秒間（アニーリング期）、および７２℃の温度で１分間（伸長期）保持する。次いで、変性段階（９４℃）を４５秒間続ける。３０回の反応サイクルの後、５分間保持の終結伸長段階（７２℃）を行う。
【００６２】
ＰＣＲ産生物を、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を含むトリス−ホウ酸塩（それぞれ５０ｍＭ）の溶出緩衝液中でポリアクリルアミドゲル（４％）上で分離する。加えて、核酸混合物（例えば、ＳｐｐＩファージＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩによる切断からの産物）を分子量標準物として含める。次いで、分離したＰＣＲ産生物を臭化エチジウム（０．１ｍｇ／ｍｌ水中）を用いて染色して、ＵＶ光（２６０ｎｍ）で照射して可視化する。
【００６３】
Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ菌種からの、Ｌ． ｉｎｎｏｃｕａ菌種からの、Ｌ． ｉｖａｎｏｖｉｉ／Ｌ． ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ／Ｌ． ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ群からのまたはＬ． ｇｒａｙｉ／Ｌ．ｍｕｒｒａｙｉ群からの細菌のＤＮＡまたは細胞の存在は、分子量の違いに基づいて識別できる（表１のＨ欄および第１図を参照されたい）。
実施例９： ペプチドＣｙｓＧｌｎＧｌｎＧｌｎＴｈｒＡｌａＰｒｏＬｙｓＡｌａＰｒｏＴｈｒＧｌｕの合成
ｆｍｏｃ法（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル保護基）をペプチドＣｙｓＧｌｎＧｌｎＧｌｎＴｈｒＡｌａＰｒｏＬｙｓＡｌａＰｒｏＴｈｒＧｌｕの合成に用いる。このペプチドは、Ｎ−末端にシステイン基をリンカーとして追加した式ＩＶｄのペプチドに対応する。アプライド・バイオシステムズのペプチド合成機を合成に用いる。プロセスパラメーターは、機器資料のものを用いる。
【００６４】
４−（２′４′−ジメトキシフェニルアミノメチル）フェノキシ基を有する重合支持体を固相として用いる。アミノ酸をα−Ｎ−ｆｍｏｃ誘導体として用いる。アミノ酸に含まれる反応性側基を、トリフルオル酢酸を用いて加水分解して除去することができる追加の保護基でマスクする。ペプチド結合を、ジイソプロピルカルボジイミドでカルボキシル基を活性化することによって形成する。アミノ酸誘導体を挿入する順序は、所望される配列によって決定される。
【００６５】
合成サイクルの最初のステップにおいて、固相上のアミノ基、すなわち支持体の４−（２′４′−ジメトキシフェニルアミノメチル）フェノキシ残基のアミノ基は、α−Ｎ−ｆｍｏｃ誘導体として取り入れられた、適宜保護された側鎖を有する、ジイソプロピルカルボジイミドによって活性化された導入アミノ酸のカルボキシル基と反応し、これは以下に続くサイクルで導入アミノ酸が付される最後のアミノ酸のα−アミノ基と同様である。未反応のアミノ酸誘導体をジメチルホルムアミドで洗浄除去する。次いで、ｆｍｏｃ基をジメチルフォルムアミド中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンで処理して除去する。残りの保護基はこの反応の間は変化することなく保持される。α−Ｎ−保護基の除去に続いて、次の反応サイクルが開始される。目的の配列に対応する最後のアミノ酸が付加された段階で、側鎖の保護基および支持体樹脂との結合をトリフルオル酢酸を用いる酸加水分解によって切断する。次いで、ペプチドを高圧液体クロマトグラフィーによって精製する。
【００６６】
本発明による配列を有する残りのペプチドもまた、上記の方法によって合成する。
実施例１０： ペプチドＣｙｓＧｌｎＧｌｎＧｌｎＴｈｒＡｌａＰｒｏＬｙｓＡｌａＰｒｏＴｈｒＧｌｕのグルコースデヒドロゲナーゼとの抱合
ａ） グルコースデヒドロゲナーゼの誘導体化：
３０ｍｇのメルク社製のバチルス・メガテリウムからのグルコースデヒドロゲナーゼ（製品番号Ｎｏ．１３７３２）を４ｍｌの燐酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に溶解する。６．７８ｍｇのＮ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミド（カルバイオケム社製）を５０μｌのジメチルスルホキシドに溶解して、２．４ｍｌのこの溶液に添加して、混合物を室温で３０分間放置する。次いで、過剰のＮ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドをＰＤ−１０（ファルマシア社製）上のゲル濾過によるクロマトグラフィーで分離除去する。クロマトグラフィーの後、３．５ｍｌの活性化された担体タンパク質の溶液が４．５ｍｇ／ｍｌの濃度で得られる。
ｂ） ペプチドとの結合：
実施例９によって調製されたペプチドの５．２ｍｇを１ｍｌの燐酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に溶解して、１．１ｍｌの上記のステップからの溶液に添加して、混合物を室温で３時間放置する。次いで、結合しなかったペプチドをＰＤ−１０（ファルマシア製）上のゲル濾過によるクロマトグラフィーで分離除去する。クロマトグラフィーの後、３．５ｍｌの抱合体が２．３ｍｇ／ｍｌの濃度で得られる。
【００６７】
本発明に対応する他のペプチドの抱合体もまた、上記の方法によって調製される。
実施例１１： ペプチドＣｙｓＧｌｎＧｌｎＧｌｎＴｈｒＡｌａＰｒｏＬｙｓＡｌａＰｒｏＴｈｒＧｌｕに対するポリクローナル抗体の製造
２羽のウサギに、０．１８ｍｌの実施例１０からの抱合体、０．０７ｍｌの燐酸塩緩衝生理的食塩水および０．２５ｍｌのオイルアジュバント（ＭＩＳＡ５０、仏国セピック社製）からなる乳濁液をそれぞれ筋肉内注射する。同量のブースター注射を、最初の注射の３、５および７週間後に行う。最後の注射の１週間後に、動物を殺してから放血する。血液が凝固した後、遠心分離によって抗血清が得られ、これにアジ化ナトリウムを最終濃度が０．０２％になるように加える。抗血清は−２０℃で凍結保存する。
実施例１２： ペプチドＣｙｓＧｌｎＧｌｎＧｌｎＴｈｒＡｌａＰｒｏＬｙｓＡｌａＰｒｏＴｈｒＧｌｕに対するモノクローナル抗体の製造
２匹のマウスに、０．１ｍｌの実施例１０からの抱合体および０．１ｍｌのオイルアジュバント（ＭＩＳＡ５０、仏国セピック社製）からなる乳濁液をそれぞれ皮下注射する。同量のブースター注射を、最初の注射の２、４および６週間後に行う。最後の注射の３日後に、動物を殺してから脾臓を分離する。脾臓からの細胞を通常の方法で分離して、ネズミ固定細胞系と融合させる。ペプチドＣｙｓＧｌｎＧｌｎＧｌｎＴｈｒＡｌａＰｒｏＬｙｓＡｌａＰｒｏＴｈｒＧｌｕに対する抗体を形成する細胞系を融合産物から選択する。
実施例１３：Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの免疫学的検出
ａ） 前培養および細菌の遠心分離： １０ｍｌのＣＡＳＯブロスにＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのいくつかのコロニーからの材料を接種して、３０℃で一晩培養する。次いで、１ｍｌの培養物をそれぞれ取り出す。遠心分離（１３０００ｒｐｍ）によって細菌体を除去する。
ｂ） 同定反応： 前ステップからの上清液のそれぞれ３００μｌを、マイクロタイタープレートのウェルにピペットで入れて、４℃で一晩インキュベートする。次いで、それぞれ１００μｌの洗浄液（９ｇ／リットルＮａＣｌおよび０．０５％ツイーン２０の水溶液）で各ウェルを３回洗浄する。実施例１１によって調製された抗血清の１００μｌを、ここで各ウェルにピペットで入れて、プレートを室温で１時間インキュベートする。各ウェルをそれぞれ１００μｌの洗浄液で３回再洗浄する。アルカリホスファターゼ（シグマ社製、製品番号Ａ８０２５）で標識した抗ウサギ抗体溶液の１００μｌを次いで各ウェルにピペットで入れて、プレートを室温で３０分間インキュベートする。それぞれのウェルを１００μｌの洗浄液で再度洗浄してから、次いで、結合した酵素標識抗体を検出する。これを行うために、基質を含む２００μｌの緩衝溶液を各ウェルに加えて、プレートを室温で３０分間インキュベートする。１００μｌの２ＮのＮａＯＨ溶液（メルク社製、製品番号９１３６）を各ウェルに添加することによって反応を停止して、反応生産物を可視化する。黄橙色はＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの存在を示す。
実施例１４： イムノブロッティング法を用いるＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの特異的検出
実施例１３ａ）の記述のようにして細菌を前培養して、細菌細胞を遠心分離する。遠心分離された細胞を集めて、１ｍｌの燐酸塩緩衝生理的食塩水に懸濁させる。この懸濁液の２μｌをニトロセルロース膜（ハイボンドＣ、０．４５μｍ、アメルシャム社製、製品番号ＲＰＮ２８３Ｃ）上にピペットで移す。溶液が乾いたら、膜を室温で１時間ウシ血清アルブミン燐酸塩緩衝生理食塩水溶液（１０ｇ／リットル）で処理する。実施例１１で得られた抗血清の希釈物（１：２００）を、ウシ血清アルブミン（１０ｇ／リットル）およびツイーン２０（０．５ｇ／リットル）の燐酸塩緩衝生理食塩水溶液を用いて調製し（抗体溶液Ａ）、同様に、同じ希釈液を用いてペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体（抗ウサギＩｇＧ、ＩＣＮイムノバイオロジカルズ社製、製品番号６８−３９７）のさらなる希釈物（１：５００）を調製する（ＨＲＰ−抗体溶液）。抗体溶液Ａとともに膜を室温で１時間インキュベートして、次いで０．０５％ツイーン２０を含む燐酸塩緩衝生理的食塩水で３回洗浄する。結合している抗体を検出するために、次いで膜をＨＲＰ−抗体溶液とともに室温で１時間インキュベートしてから、ａ）ツイーン２０（０．５ｇ／リットル）燐酸塩緩衝生理的食塩溶液、ｂ）燐酸緩衝生理的食塩水およびｃ）トリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４、２００ｍＭＮａＣｌを含む）でそれぞれ３回洗浄する。呈色反応のために、４−クロロ−１−ナフトール（３ｍｇ／ｍｌメタノール溶液）を５倍量のトリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４、２００ｍＭのＮａＣｌを含む）で希釈して、過酸化水素を加える（最終濃度０．１ｇ／リットル）。この基質溶液中で膜をインキュベートする。青黒色呈色はＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】複製産生物の電気泳動分離の結果を示す。実験の詳細は実施例８に示されている。
【図２】ａからｉはリステリア・モノシトゲネスからのｐ６０タンパク質の配列から選択されたとくに好ましい免疫原性ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図３】そのエピトープがリステリア属細菌の免疫学的検出のために適しているリステリア・モノシトゲネスからのｐ６０タンパク質の配列から選択されたポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図４】リステリア・モノシトゲネスからのｐ６０タンパク質のアミノ酸配列の１位から２５６位までを比較のために示したもので、この配列は図５に示す２５７位に続く。
【図５】リステリア・モノシトゲネスからのｐ６０タンパク質のアミノ酸配列の２５７位から４７８位までを比較のために示したもので、この配列は図４に示す２５６位から続く。
【図６】ａからｄはリステリア・イノクアからのｐ６０タンパク質の配列から選択されたとくに好ましい免疫原性ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【産業上の利用分野】
本発明は、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属の細菌、とくにリステリア・モノシトゲネス（Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、の検出のための試薬および方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リステリア属の細菌はグラム陽性の桿状菌で広範に分布している。この属には次の７菌種、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ． ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌ． ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌ． ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌ． ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌ． ｍｕｒｒａｙｉおよびＬ． ｇｒａｙｉがある。このうち、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのみがヒトに対して病原性を有していて、とくに新生児、妊婦および高齢者、さらに免疫抑制の対象となる患者を脅かす。Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ感染による死亡もしばしばみられる。
【０００３】
汚染された食物では、この細菌は４℃付近の低温においても増殖することができ、しばしばリステリア感染の原因となる。すなわち、種々のリステリアの流行が汚染された食物、例えば生乳、チーズまたはコールスローなどの摂取によって起きている。したがって、リステリアの、とくに食物や臨床試料中におけるリステリアの迅速な検出法が危急に求められている。これらの検出法は、加えてＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓとヒトに対して非病原性の他の菌種とを識別できるものでなくてはならない。さらに、ヒトに病原性示す菌種であるＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの全ての変種株の検出が可能でなければならない。最近の考察の結果、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによる汚染の可能性を調べるための指示菌としてＬ． ｉｎｎｏｃｕａを用いることが提案された。したがって、Ｌ． ｉｎｎｏｃｕａの検出もまた、きわめて有用である。
【０００４】
Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの検出は、微生物の培養を基礎とする既知の方法を用いて行うことができる。Ｉｎｔ． Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４、 ２４９−２５６、 １９８７に記載の方法は、２週間を要する。いくらか速い方法が国際酪農連盟（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄａｉｒｙ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ （ＩＤＦ））によって推奨されたが、それも少なくとも６〜８日かかる。両方法とも時間がかかるために、迅速な同定法としては不適である。加えて、単離コロニーを得るために栄養培地に繰り返して接種しなくてはならないこと、続いて単離コロニーを生化学的および血清学的な検査手法を用いて特徴づけしなければならないことから、両方法はきわめて手間がかかる。
【０００５】
近年市場に出てきた免疫学的試験法は２、３時間しか要しないが、リステリアの異なる菌種間の重要な違いを区別することができない。これらの方法においてもまた、増殖富化のための前培養に２日間を要する。
【０００６】
Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５４、 ２９３３−２９３７、 １９８８に記載の方法では、合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブを用いてＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが特異的に検出される。しかし、用いられるプローブはヒトに対して非病原性の菌種であるＬ． ｓｅｅｌｉｇｅｒｉとも反応することから、充分に特異的ではない。細菌の前増殖がこの場合にも必要とされる。すなわち、食物試料、あるいはそれらの希釈物を寒天プレートに塗布して、次いでそれらプレートをインキュベートしてから、放射性標識したＤＮＡプローブを用いるコロニーハイブリダイゼーション手法によって調べる。検出はオートラジオグラフィーによって行われる。この方法も人手と時間がかかる。
【０００７】
Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのｉａｐ（ｉｎｖａｓｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、侵入関連タンパク質）遺伝子のＤＮＡ配列は、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ５８、 １９４３−１９５０、 １９９０に記載されている。この遺伝子は、全リステリア菌種の変株にみられるｐ６０としても知られているタンパク質をコードするものである。Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおいて、このタンパク質は動物細胞への侵入能に関係している。この遺伝子からの構成配列を有するポリヌクレオチド（４００塩基）は、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを他の菌種から識別するためのＤＮＡプローブとして適している。
【０００８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって核酸のインビトロ複製がなされ、こ方法を用いる場合は前培養は一般に不要である。反応を開始するために、短い核酸断片（プライマー）が必要であって、プライマーは複製されるゲノムの部分に包含される。通常、二つのプライマーが要求され、そのそれぞれがひとつの核酸鎖とハイブリダイズする。したがって、プライマーのひとつは遺伝子の関連部分に対して相補的な配列を有する。これらプライマーの選択によって、検出反応の特異性が決定される。Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの検出のためのこのプロセスの使用は、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５７、 ６０６−６０９、 １９９１、Ｌｅｔｔｅｒｓ Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １１、 １５８−１６２、 １９９０およびＪ． Ａｐｐｌ． Ｂａｃｔ． ７０、 ３７２−３７９、 １９９１に記述されている。これらプロセスの詳細についてのより広範な情報は、これら文献にみられる。これらＤＮＡプライマーは、リステリア溶血素であるリステリオリシンの遺伝子に結合する。これらプライマーの特異性は不確かであり、Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｂａｃｔ． ７０中にはＬ． ｓｅｅｌｉｇｅｎｉはＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓから確実には識別できないという言及がみられる。このように、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの確実な検出はＰＣＲ法の使用では可能ではない。
【０００９】
Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｐ６０に対するポリクローナル抗体は、他の非病原性のリステリア菌種のｐ６０タンパク質とも反応する。したがってそのような抗体は免疫学的方法でＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを特異的に検出するには適していない。明らかに、この性質の多価抗血清を阻害抗体画分の特異的吸収によって精製することは原理的に可能である。この目的のために、他の全リステリア菌種からのｐ６０タンパク質を担体に共有結合させる。不要な抗体画分を特異的に吸収させることができ、このようにして残った抗血清はＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ６０タンパク質とだけ反応しない。Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ特異性血清を得るためのこの方法は手がこんでいる。かなり多量の多価抗血清が出発材料として要求され、さらに、種々のリステリア菌種のｐ６０ｉａｐ遺伝子産物が必要である。ｐ６０タンパク質に対するモノクローナル抗体の獲得ではこのような大量の材料を必要としないだろうが、特定のエピトープに対する抗体を生じさせることは偶然による。まず第一に、大量の抗体産生細胞クローンを調製することが必要であり、それから適当なクローンを選択しなければならない。これまで、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに特異的なエピトープに対する抗体を目的の方法で得ることは可能ではなかった。Ｌ． ｉｎｎｏｃｕａに特異的なエピトープに関しても同様である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、リステリア属の細菌を識別するため、とくにＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ菌種の細菌を検出するための、改良された試薬および方法を提供することにある。とくに、本発明によれば、ＰＣＲ法に適するプライマー配列、および菌種Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓとＬ． ｉｎｎｏｃｕａとの免疫学的な検出に適する特異的抗体の目的生産のためのペプチドが提供される。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、核酸複製のための、例えばポリメラーゼ連鎖反応などの方法でｉａｐ遺伝子から選択されたプライマーに関し、プライマーは構成配列として一般式Ｉａ〜Ｉｈのひとつによる少なくともひとつの配列および／またはそれに対応する相補的配列を含み、２０個までのさらなるヌクレオチド部分をこの構成配列の前方および／または後方に結合することができることを特徴とする。そのようなプライマーは、リステリア属、とくにＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ菌種を含む細菌のＰＣＲ法による検出および識別のために適している。
【００１２】
本発明はまた、式ＩＩＩａ〜ＩＩＩｉのひとつによる構成配列を有する、該ペプチドのひとつの、免疫原性抱合体の調製のための使用に関する。第２ａ−ｉおよび第６ａ−ｄのひとつによる配列を有するペプチドがこの目的のためにとくに好ましい。
【００１３】
本発明はまたエピトープに結合する抗体に関し、これは第３図によるポリペプチドから形成されるか式ＩＩＩａ〜ＩＩＩｉのひとつ、好ましくは第２ａ−ｉおよび第６ａ−ｄによるペプチドを含む。
【００１４】
本発明はさらに、第３図によるポリペプチドまたは第３図によるポリペプチドから選択される７〜２４個のアミノ酸を有するペプチドを含む免疫原性抱合体を用いて実験動物を免疫することによって調製することができる抗体に関する。
【００１５】
本発明はまた、実験動物を免疫原で免疫して抗体を単離することによるリステリアからのｐ６０タンパク質に対する抗体の調製法であって、第３図によるポリペプチドまたは第３図によるポリペプチドを含む免疫原性抱合体を免疫原として用いることを特徴とする。これに関連して、免疫原性抱合体は、第３図によるポリペプチドから選択される７〜２４個のアミノ酸を有するペプチドを含むか、式ＩＶａ〜ＩＶｉのひとつによるペプチドを含むことが好ましい。
【００１６】
式中Ｘ３およびＸ４は、それぞれ独立して水素、任意のアミノ酸または７個までのアミノ酸を含む任意のオリゴペプチドである。
【００１７】
最後に、本発明は、式Ｉａ〜Ｉｈのひとつによる構成配列または好ましくは式ＩＩａ〜ＩＩｈのひとつによる配列または関連の相補的配列を含むプライマーの、リステリア属細菌の検出のための使用に関する。
【００１８】
本発明はまた、式Ｉａ〜Ｉｈのひとつによる構成配列または好ましくは式ＩＩａ〜ＩＩｈのひとつによる配列または関連の相補的配列を含むプライマーを用いることによる、リステリア属細菌を検出する方法に関する。
【００１９】
本発明はさらに、第３図によるポリペプチド配列からのエピトープに対する、または第２ａ−ｉ図または第６ａ−ｄ図のひとつによるアミノ酸配列を有するエピトープのひとつに対する抗体の、リステリア属細菌の検出のための使用に関する。
【００２０】
本発明はまた、第３図によるポリペプチド配列からのエピトープに対する、または第２ａ−ｉ図または第６ａ−ｄ図のひとつによるアミノ酸配列を有するエピトープのひとつに対する抗体を用いることによる、リステリア属細菌の検出法に関する。
【００２１】
最後に、本発明は、式Ｉａ〜Ｉｈのひとつによる構成配列または好ましくは式ＩＩａ〜ＩＩｈのひとつによる配列または関連の相補的配列を含むプライマーを含む、例えばポリメラーゼ連鎖反応による核酸の複製による、リステリア属細菌、とくにＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ菌種の検出のための試験キットに関する。
【００２２】
本発明はさらに、第３図によるポリペプチド配列からのエピトープ、または第２ａ−ｉ図のひとつによるアミノ酸配列を有するエピトープのひとつに対する抗体を含むリステリア・モノシトゲネス菌種の細菌の免疫学的検出のための試験キット、および第６ａ−ｄ図のひとつによるアミノ酸配列を有するエピトープに対する抗体を含むリステリア・イノキュア菌種の細菌の免疫学的検出のための試験キットに関する。
【００２３】
本発明は、後記によってより詳細に説明される。これに関連して、当業者に公知であって文献に詳細が記述されているような生化学的、免疫学的および分子生物学的方法の詳細については、一般にはここには記述しない。これら方法において、自体公知の変法もまた使用できるが、その詳細はここには記述しない。
【００２４】
式Ｉａ〜ＩｈおよびＩＩａ〜ＩＩｈによって表される本発明によるオリゴヌクレオチドは、核酸複製法のためのプライマーとして、したがって、リステリア属細菌の特異的検出のために、適している。これらの配列は、通常の方法、すなわち５′末端から３′末端の方向に記述されている。いかなる場合も用いられる複製システムの要求に応じて、本発明による配列を有するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドが用いられる。後者の場合、チミジン部分はそれぞれウリジンによって置き換えられる。さらに、核酸配列中のひとつまたは２、３個の塩基が置き換えられても生物学的性質に変化がないことがしばしばあることは当業者に公知である。この理由のために、本発明によるヌクレオチド配列もまた、配列Ｉａ〜ＩｈおよびＩＩａ〜ＩＩｈからの塩基置換に由来し、その生物学的効果はオリジナル配列を有するそれぞれのプライマーと同様である、ヌクレオチド配列からなる。通常、ひとつのプライマーはそれぞれＤＮＡ鎖のひとつと反応することから、プライマーのひとつは相補的配列で用いられる。相補的配列は、塩基対合のルールによって既知の方法で得られる。
【００２５】
各配列に基づいて、本発明によるオリゴヌクレオチドは、例えばホスホトリエステル法やホスホアミダイト法などの当業者に公知の方法によって合成することができる。ホスホアミダイト法は、とくに機械化された合成機による方法が好ましく用いられる。この方法は、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ、 ２２、 １８５９−１８６２、 １９８１に記述されている。同様の合成法のさらなる詳細は、例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ、 Ｅ． Ｌ． （１９８５）、 Ｇｅｎｅ ｕｎｄ Ｋｌｏｎｅ ［Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｃｌｏｎｅｓ］、 ４４−６１ （ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｂＨ、 Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）に記述されている。
【００２６】
本発明によるプライマーは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるＤＮＡ複製に適している。この目的のために、ＤＮＡをまず最初に加熱によって１本鎖に解離する。二つのプライマーを用いてそれぞれＤＮＡ鎖のひとつの上の相同的ＤＮＡセグメントとそれぞれハイブリダイズさせる。これら二つのプライマーの間にあるゲノムセグメントが複製される。ＤＮＡに付いたプライマーは、複製の開始点を表す。次いで、四つのヌクレオチド三燐酸の存在下でポリメラーゼ、好ましくはｔａｑＤＮＡポリメラーゼによって、オリジナルＤＮＡの配列に対応する第二の鎖が完成される。次いで、生じた２本鎖を、再び加熱によって１本鎖に分離する。この複製サイクルは、何回も繰り返すことができる。充分な回数の複製サイクルの後に、複製された核酸を既知の方法によって検出することができる。この目的のために、ＤＮＡを電気泳動によって分離して、次いで臭化エチジウムによって染色し、最後にＵＶ励起を用いる蛍光によって検出することができる。ＤＮＡハイブリダイゼーションを用いる検出もまた、可能である。適当な複製および検出法の詳細もまた、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）、 ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｉｎｃ．、 Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ、 Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）などの総説に記述されている。本発明によるプライマーを用いることができる他の核酸複製法についてもまた、文献から知ることができる。これらには、Ｂｏｎｄ、 Ｓ．らによって記述されているリガーゼ連鎖反応が含まれる。
【００２７】
好ましい式ＩＩａ〜ＩＩｈによるプライマーの選択によって、ｉａｐ遺伝子上の開始点の位置が、すなわち、検出反応の特異性が決まる。このように、ｉａｐ遺伝子の配列から選択されたプライマーの組み合わせは非特異的であり、その結果、ＤＮＡ複製によるリステリア検出には不適当であることが証明された（これに関連して、例えば、表１のＦ欄を参照されたい）。しかし、他の選択された組み合わせはリステリア属に、他のものはリステリア菌種グループに、他のものはまた個々のリステリア菌種に、それぞれ特異的であることが証明された。したがって、結論として、プライマーの選択と構成が決定因子となる。二つのプライマーのひとつの選択はとくに常に重要で、第二番目のプライマーは検出反応の特異性を有意に変えることなくより容易に変更することができる。したがって、本発明の教示によれば、この第二のプライマーのために、式Ｉａ〜ＩｈまたはＩＩａ〜ＩＩｈのひとつに対応しない配列を選択することも可能である。
【００２８】
本発明によると、プライマーの少なくともひとつが式Ｉａ〜Ｉｈまたは好ましくは式ＩＩａ〜ＩＩｈから選択される。既に説明したように、第二のプライマーは第一のプライマーよりも複製反応の特異性への影響が実質的に少ない。しかし、両プライマーが式Ｉａ〜ＩｈまたはＩＩａ〜ＩＩｈから選択される組み合わせが好ましい。このような好ましい組み合わせの例は次のようなものである（典型的な結果を表１に要約する）。
【００２９】
ａ） 式ＩＩｃによるプライマーと式ＩＩｂによる相補的配列のプライマーとの組み合わせを用いる場合、リステリアのＤＮＡのみが複製されて他のタイプの細菌のＤＮＡは複製されない（表１のＤ欄を参照されたい）。
【００３０】
ｂ） 式ＩＩｄによるプライマーと式ＩＩｂによる相補的配列のプライマーとの組み合わせを用いる場合、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのＤＮＡのみが複製されて他のリステリアまたは他の細菌のＤＮＡは複製されない（表１のＢ欄を参照されたい）。
【００３１】
ｃ） 式ＩＩｆによるプライマーと式ＩＩｂによる相補的配列のプライマーとの組み合わせを用いる場合、特定のリステリア菌種のＤＮＡのみ、すなわち、Ｌ． ｓｅｅｌｉｎｇｅｒｉ、Ｌ． ｗｅｌｓｈｉｍｉｒｉおよびＬ． ｉｖａｎｏｖｉｉのＤＮＡが排他的に複製される。この結果、グループ−特異的検出が可能になる（表１のＥ欄を参照されたい）。 ｄ） グループ−特異的検出の他の例としては、式ＩＩｈによるプライマーと式ＩＩｂによる相補的配列のプライマーとの組み合わせの使用によって、Ｌ． ｇｒａｙｉおよびＬ． ｍｕｒｒａｙｉのＤＮＡのみが複製される（表１のＧ欄を参照されたい）。 ｅ） 異なるリステリア菌種の複製産生物は、種々の分子量を有することから、リステリア属の細菌は、いくつかのプライマー（式ＩＩｄ、ＩＩｆ、ＩＩｇおよびＩＩｈによる）と式ＩＩｂの相補的配列のプライマーとの組み合わせによって、単一のポリメラーゼ反応を用いて区別することができる。ポリメラーゼ手法のこのさらなる展開の詳細は実施例８から明かである（表１のＨ欄および第１図を参照されたい）。
【００３２】
既述したように、核酸ハイブリダイゼーションによって複製産生物を検出することもまた、可能である。これを行うために、適当な核酸断片（核酸プローブ）を反応混合物に複製後に加える。これら核酸プローブは、複製された遺伝子セグメントと完全にまたは部分的に相補的な塩基配列を有している。加えて、これらプローブは、検出反応のために標識されている。すなわち、これらは放射性同位元素を含むか、蛍光標識を有するか、または酵素で標識することができる。適当な標識剤、核酸プローブへのそれらの導入法および検出方法は、当業者に公知のものである。
【００３３】
とくに、複製反応はリステリア属に（より詳細は上記ａ）に記述）、またはリステリア菌種のグループ（より詳細は上記ｃ）およびｄ）に記述）に特異的にデザインすることができる。それぞれひとつの菌種に特異的な核酸プローブを用いることによって、リステリアのこれら菌種の存在が反応混合物中に確認される。プローブに異なる標識剤が含まれる場合には、異なる菌種もまた並行して検出することができる。したがって、この方法の変法によって、上記のｅ）に記述の方法と同様にして異なるリステリア菌種が並行して検出できる。
【００３４】
ひとつの核酸プローブまたは全リステリア菌種の複製産生物と反応する異なる核酸プローブの混合物の使用によって、複製反応の特異性のチェックまたは異なるリステリア菌種のための単一の検出試薬の調製が可能になる。
【００３５】
式ＩＶａ〜ＩＶｉによるおよび第２ａ−ｉ図および第６ａ−ｄ図による、本発明によるペプチドを免疫原性抱合体に取り込むことができる。これら抱合体を用いて、リステリア属の細菌を免疫学的手法を用いて特異的に検出するための抗体を生産することができる。
【００３６】
リステリア・モノシトゲネスからのｐ６０タンパク質の全体の配列における本発明によるペプチドの位置は、次のように記述される。
【００３７】
ａ） 式ＩＩＩａによる配列は、ｐ６０配列の１４８位のプロリンで始まり（第４図）、第２ａ、２ｅおよび２ｆ図によるペプチドもまたこの領域に位置している。
【００３８】
ｂ） 式ＩＩＩｂによる配列は、ｐ６０配列の１７８位のスレオニンで始まり（第４図）、第２ｂおよび２ｈ図によるペプチドもまたこの領域に位置している。 ｃ） 式ＩＩＩｃによる配列は、ｐ６０配列の２４３位のアラニンで始まり（第４図）、第２ｃおよび２ｉ図によるペプチドもまたこの領域に位置している。
【００３９】
ｄ） 式ＩＩＩｄによる配列は、ｐ６０配列の２９２位のグルタミンで始まり（第５図）、第２ｄ図によるペプチドもまたこの領域に位置している。
【００４０】
ｅ） 式ＩＩＩｅによる配列は、ｐ６０配列の７１位のバリンで始まり（第４図）、第２ｇ図によるペプチドもまたこの領域に位置している。
【００４１】
第６ａ−ｄ図に示された本発明によるペプチドの配列は、リステリア・イノクラからのタンパク質ｐ６０の全配列に由来する。これは式ＩＩＩｆ−ｉおよび式ＩＶｆ−ｉに示された部分配列についても同様である。
【００４２】
ペプチド中のひとつまたは二、三のアミノ酸の変化はその生物学的性質を変えないことがしばしばあることは当業者に公知である。この理由によって、本発明によるペプチドもまた、アミノ酸交換によって、第２ａ−ｉ図による、第６ａ−ｄ図による、または第３図による配列に由来し、オリジナル配列を有するそれぞれのペプチドと同様の効果を生物学的に示すものを含む。
【００４３】
本発明によるペプチドの選択は決定的に重要であることは明かである。例えば、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに特異的な遺伝子セグメントによってコードされる特定のペプチドが抗体産生に選択されると、驚いたことに、どの抗血清もｐ６０タンパク質との反応を示さない。
【００４４】
アミノ酸配列に基づいて、当業者に公知の方法によって、例えばｔｂｏｃまたはｆｍｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、または９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）法によって、合成することができる。これらの方法の詳細は、例えば、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５、 ２１４９−２１５４、 １９６３およびＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｇｅｎｓ （Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ （ｅｄｓ．） Ｅｌｓｅｖｉｅｒ １９８８ （Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙシリーズ第９巻）などに記述されている。ｆｍｏｃ法、とくにその機械化された変法が好ましい。方法の詳細および適当なアミノ酸保護基は当業者に公知である。
【００４５】
一般にペプチドは抗体の産生に適していない。しかし、ペプチドを高分子量の担体物質に結合させれば、免疫原性の抱合体が形成される。本発明によるペプチドは、既知の担体物質と抱合させることができる。それらには、ポリエチレングリコール、血清アルブミン、ＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ヘモシアニン）、卵白アルブミン、バチルス・メガテリウムからのグルコースデヒドロゲナーゼおよびＰＰＤ（ツベルクリンの精製タンパク質誘導体）などがある。好ましい担体物質は、ＫＬＨおよびバチルス・メガテリウムからのグルコースデヒドロゲナーゼである。
【００４６】
この他に、架橋化合物（リンカー）もまた、しばしば用いられる。これらは、少なくとも二つの架橋できる官能基を有する低分子量有機化合物である。適当な化合物は当業者に公知であるが、例えば、１、２−ジアミノエタン、コハク酸、β−アラニン、１、６−ジアミノヘキサン、６−アミノカプロン酸、アジピン酸およびシステインなどがあげられる。システインはリンカーとして好ましく用いられ、このアミノ酸残基はペプチド合成中に取り込まれる。アミノおよびカルボキシル基の両方を含むリンカー（例えば、β−アラニン、６−アミノカプロン酸またはシステイン）は、ペプチドのＣ−末端またはＮ−末端のいずれにも結合することができる。ｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）は、ペプチドと担体物質間の結合を調製するために好ましく用いられる。
【００４７】
該免疫原性抱合体は、既知の方法による実験動物における抗体の産生に用いられる。通常、この目的のためにはヒツジ、ヤギ、ウサギおよびマウスなどの哺乳動物が用いられる。ポリクローナル抗体の産生にはウサギが好ましい。しかし、本発明による免疫原性抱合体を用いてモノクローナル抗体を産生することもまた可能である。
【００４８】
免疫学的方法の詳細は当業者に公知である。加えて、これらの方法を実施するための手順は、文献に既述されており、その例を以下にあげる。
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、 Ｈ． Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ． Ｌａｎｅ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ （１９８８）
Ｗｏｏｄａｒｄ、 Ｌ．Ｆ． ａｎｄ Ｊａｓｍａｎ、 Ｒ．Ｌ． （１９８５） Ｖａｃｃｉｎｅ ３、 １３７−１４４
Ｗｏｏｄａｒｄ、 Ｌ．Ｆ． （１９８９） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉ ３９、 ２２２−２２５
Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９８６） Ｗｅｉｒ、 Ｄ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．：
Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、 Ｏｘｆｏｒｄ、 ＧＢ．
これらの方法には、例えば、抱合および免疫方法、さらに抗体の調製および精製、また免疫学的検出法なども含まれる。本発明による抗体を用い得る免疫学的検出法には、好ましくは凝集法、免疫度検出法、イムノブロット法およびとくにサンドイッチＥＬＩＳＡ法などが含まれる。
【００４９】
本発明においては、抗体の概念には、免疫グロブリンと抗血清の両方が包含される。さらに、単一のエピトープに対する単一の抗体の代わりに特異性を異にする種々の抗体の混合物がしばしば用いられることは、当業者に公知である。これは、とくに検出感度に関して有利な結果となる。これはとくにモノクローナル抗体に適用されるが、また、それぞれひとつのエピトープに対する他の抗体についても適用される。したがって、式ＩＩＩａ〜ＩＩＩｉによる、または第３図、第２ａ−ｉ図または第６ａ−ｄ図のひとつによる異なるペプチド構造に対する複数の抗体を、本発明による使用および／または本発明による方法のために組み合わせることは有利と考えられる。
【００５０】
【実施例】
本発明によるプライマーおよびペプチドの調製、さらにそれらの使用に関する詳細を次の実施例によって明らかにする。当業者はさらなる方法の詳細を引用文献に見出だすことができる。実施例は本発明の内容を説明するものであって、本発明を制限することを意図するものではない。
実施例１： 式ＩＩａによるプライマーの調製
式ＩＩａによるプライマーを、アプライド・バイオシステムズの３８０Ａ型ＤＮＡ合成機を用いてホスホアミダイト法によって調製する。この方法の要点はＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２２、 １８５９−１８６２、 １９８１に記述されている。さらなる詳細は、機器製造業者によって提供される文献に見出される。
【００５１】
式ＩＩｃ、ＩＩｄ、ＩＩｆ、ＩＩｇおよびＩＩｈによるプライマーを対応する方法によって調製する。式ＩＩｂおよびＩＩｅによるプライマーを、それぞれの相補的配列（ＩＩｂ：ＴＴＧＧＣＴＴＣＧＧＴＣＧＣＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡ；ＩＩｅ：ＧＣＡＣＴＴＧＡＡＴＴＧＣＴＧＴＴＡＴＴＧ）に調製する。
実施例２： Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの菌種特異的検出のためのＰＣＲ反応の実施
細菌を含む試料を、約１μｇのＤＮＡとともに５０μｌの緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２および５０ｍＭＫＣｌ）に懸濁させて、１１０℃で５分間加熱する。次いで、式ＩＩｄおよびＩＩｅによるプライマー（実施例１を参照、各０．４μｇ）および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ファルマシア製）を反応緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２および５０ｍＭＫＣｌ）に溶解して、それぞれ２００μｍｏｌのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを加える（反応総液量１００μｌ）。最初の変性段階を９４℃で３分間続ける。次いで、反応混合物を５５℃の温度で３０秒間（アニーリング期）、および７２℃の温度で１分間（伸長期）保持する。次いで、変性段階（９４℃）を４５秒間続ける。３０回の反応サイクルの後、５分間保持の終結伸長段階（７２℃）を行う。
【００５２】
ＰＣＲ産生物を、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を含むトリス−ホウ酸塩（それぞれ５０ｍＭ）の泳動緩衝液中でポリアクリルアミドゲル（６％）上で分離する。次いで、分離したＰＣＲ産生物を臭化エチジウム（０．１ｍｇ／ｍｌ水中）を用いて染色して、ＵＶ光（２６０ｎｍ）で照射して可視化する。
【００５３】
ＰＣＲ産生物は、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのＤＮＡまたは細胞が試料中に存在する場合にのみ観察される（表１のＡ欄を参照されたい）。
実施例３： Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの菌種特異的検出のためのＰＣＲ反応の実施
式ＩＩｄおよびＩＩｅによるプライマーの代わりに式ＩＩｄおよびＩＩｂによるプライマー（実施例１を参照）を用いて、実施例２に記述の方法を繰り返す。この場合もまた、ＰＣＲ産生物は、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのＤＮＡまたは細胞が試料中に存在する場合にのみ観察される（表１のＢ欄を参照されたい）。
実施例４： リステリア属細菌の属特異的検出のためのＰＣＲ反応の実施
細菌を含む試料を、約１μｇのＤＮＡとともに５０μｌの水に懸濁させて、１１０℃で５分間加熱する。次いで、式ＩＩｃおよびＩＩｂによるプライマー（実施例１を参照、各０．４μｇ）および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ファルマシア製）を反応緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２および５０ｍＭＫＣｌ）に溶解して、それぞれ２００μｍｏｌのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを加える（反応総液量１００μｌ）。最初の変性段階を９４℃で３分間続ける。次いで、反応混合物を５６℃の温度で３０秒間（アニーリング期）、および７２℃の温度で２分間（伸長期）保持する。次いで、変性段階（９４℃）をそれぞれ４５秒間続ける。３０回の反応サイクルの後、５分間保持の終結伸長段階（７２℃）を行う。
【００５４】
ＰＣＲ産生物を、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を含むトリス−ホウ酸塩（それぞれ５０ｍＭ）の溶出緩衝液中でアガロースゲル（１％）上で分離する。次いで、分離したＰＣＲ産生物を臭化エチジウム（０．１ｍｇ／ｍｌ水中）を用いて染色して、ＵＶ光（２６０ｎｍ）で照射して可視化する。
【００５５】
この場合、ＰＣＲ産生物はリステリア属の細菌からのＤＮＡまたは細胞が試料中に存在する場合にのみ観察される（表１のＤ欄を参照されたい）。
実施例５： リステリアのグループ特異的検出のためのＰＣＲ反応の実施
細菌を含む試料を、約１μｇのＤＮＡとともに５０μｌの水に懸濁させて、１１０℃で５分間加熱する。次いで、式ＩＩｆおよびＩＩｂによるプライマー（実施例１を参照、各０．４μｇ）および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ファルマシア製）を反応緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２および５０ｍＭＫＣｌ）に溶解して、それぞれ２００μｍｏｌのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを加える（反応総液量１００μｌ）。最初の変性段階を９４℃で３分間続ける。次いで、反応混合物を５８℃の温度で４５秒間（アニーリング期）、および７２℃の温度で１分間（伸長期）保持する。次いで、変性段階（９４℃）を４５秒間続ける。３０回の反応サイクルの後、５分間保持の終結伸長段階（７２℃）を行う。
【００５６】
ＰＣＲ産生物を、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を含むトリス−ホウ酸塩（それぞれ５０ｍＭ）の溶出緩衝液中でアガロースゲル（１％）上で分離する。次いで、分離したＰＣＲ産生物を臭化エチジウム（０．１ｍｇ／ｍｌ水中）を用いて染色して、ＵＶ光（２６０ｎｍ）で照射して可視化する。
【００５７】
この場合、ＰＣＲ産生物は、Ｌ． ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌ． ｓｅｅｌｉｇｅｒｉおよびＬ． ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ群からの細菌のＤＮＡまたは細胞が試料中に存在する場合にのみ観察される（表１のＥ欄を参照されたい）。
実施例６： Ｌ． ｉｎｎｏｃｕａの菌種特異的検出のためのＰＣＲ反応の実施
細菌を含む試料を、約１μｇのＤＮＡとともに５０μｌの緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２および５０ｍＭＫＣｌ）に懸濁させて、１１０℃で５分間加熱する。次いで、式ＩＩｇおよびＩＩｂによるプライマー（実施例１を参照、各０．４μｇ）および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ファルマシア製）を反応緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２および５０ｍＭＫＣｌ）に溶解して、それぞれ２００μｍｏｌのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを加える（反応総液量１００μｌ）。最初の変性段階を９４℃で３分間続ける。次いで、反応混合物を６２℃の温度で６０秒間（アニーリング期）、および７２℃の温度で４５秒間（伸長期）保持する。次いで、変性段階（９４℃）を４５秒間続ける。３０回の反応サイクルの後、５分間保持の終結伸長段階（７２℃）を行う。
【００５８】
ＰＣＲ産生物を、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を含むトリス−ホウ酸塩の溶出緩衝液（それぞれ５０ｍＭ）中でアガロースゲル（１％）上で分離する。次いで、分離したＰＣＲ産生物を臭化エチジウム（０．１ｍｇ／ｍｌ水中）を用いて染色して、ＵＶ光（２６０ｎｍ）で照射して可視化する。
【００５９】
ＰＣＲ産生物は、Ｌ． ｉｎｎｏｃｕａのＤＮＡまたは細胞が試料中に存在する場合にのみ観察される（表１のＣ欄を参照されたい）。
実施例７： リステリアの群特異的検出のためのＰＣＲ反応の実施
細菌を含む試料を、約１μｇのＤＮＡとともに５０μｌの水に懸濁させて、１１０℃で５分間加熱する。次いで、式ＩＩｈおよびＩＩｂによるプライマー（実施例１を参照、各０．４μｇ）および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ファルマシア製）を反応緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２および５０ｍＭＫＣｌ）に溶解して、それぞれ２００μｍｏｌのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを加える（反応総液量１００μｌ）。最初の変性段階を９４℃で３分間続ける。次いで、反応混合物を５６℃の温度で４５秒間（アニーリング期）、および７２℃の温度で４５秒間（伸長期）保持する。次いで、変性段階（９４℃）を４５秒間続ける。３０回の反応サイクルの後、５分間保持の終結伸長段階（７２℃）を行う。
【００６０】
ＰＣＲ産生物を、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を含むトリス−ホウ酸塩の溶出緩衝液（それぞれ５０ｍＭ）中でアガロースゲル（１％）上で分離する。次いで、分離したＰＣＲ産生物を臭化エチジウム（０．１ｍｇ／ｍｌ水中）を用いて染色して、ＵＶ光（２６０ｎｍ）で照射して可視化する。
【００６１】
この場合、ＰＣＲ産生物は、Ｌ． ｇｒａｙｉおよびＬ． ｍｕｒｒａｙｉ群からの細菌のＤＮＡまたは細胞が試料中に存在する場合にのみ観察される（表１のＧ欄を参照されたい）。
実施例８： Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＬ． ｉｎｎｏｃｕａの菌種特異的検出のための、およびＬ． ｉｖａｎｏｖｉｉ／Ｌ． ｓｅｅｌｉｎｇｅｒｉ／Ｌ． ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ群およびＬ．ｇｒａｙｉ／Ｌ． ｍｕｒｒａｙｉ群の群特異的検出のための、組み合わせＰＣＲ反応の実施
細菌を含む試料を、約１μｇのＤＮＡとともに５０μｌの緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２および５０ｍＭＫＣｌ）に懸濁させて、１１０℃で５分間加熱する。次いで、式ＩＩｄ、ＩＩｆ、ＩＩｇ、ＩＩｈおよびＩＩｂによるプライマー混合物（実施例１を参照、各０．４μｇ）および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ファルマシア製）を反応緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２および５０ｍＭＫＣｌ）に溶解して、それぞれ２００μｍｏｌのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを加える（反応総液量１００μｌ）。最初の変性段階を９４℃で３分間続ける。次いで、反応混合物を５６℃の温度で４５秒間（アニーリング期）、および７２℃の温度で１分間（伸長期）保持する。次いで、変性段階（９４℃）を４５秒間続ける。３０回の反応サイクルの後、５分間保持の終結伸長段階（７２℃）を行う。
【００６２】
ＰＣＲ産生物を、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を含むトリス−ホウ酸塩（それぞれ５０ｍＭ）の溶出緩衝液中でポリアクリルアミドゲル（４％）上で分離する。加えて、核酸混合物（例えば、ＳｐｐＩファージＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩによる切断からの産物）を分子量標準物として含める。次いで、分離したＰＣＲ産生物を臭化エチジウム（０．１ｍｇ／ｍｌ水中）を用いて染色して、ＵＶ光（２６０ｎｍ）で照射して可視化する。
【００６３】
Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ菌種からの、Ｌ． ｉｎｎｏｃｕａ菌種からの、Ｌ． ｉｖａｎｏｖｉｉ／Ｌ． ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ／Ｌ． ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ群からのまたはＬ． ｇｒａｙｉ／Ｌ．ｍｕｒｒａｙｉ群からの細菌のＤＮＡまたは細胞の存在は、分子量の違いに基づいて識別できる（表１のＨ欄および第１図を参照されたい）。
実施例９： ペプチドＣｙｓＧｌｎＧｌｎＧｌｎＴｈｒＡｌａＰｒｏＬｙｓＡｌａＰｒｏＴｈｒＧｌｕの合成
ｆｍｏｃ法（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル保護基）をペプチドＣｙｓＧｌｎＧｌｎＧｌｎＴｈｒＡｌａＰｒｏＬｙｓＡｌａＰｒｏＴｈｒＧｌｕの合成に用いる。このペプチドは、Ｎ−末端にシステイン基をリンカーとして追加した式ＩＶｄのペプチドに対応する。アプライド・バイオシステムズのペプチド合成機を合成に用いる。プロセスパラメーターは、機器資料のものを用いる。
【００６４】
４−（２′４′−ジメトキシフェニルアミノメチル）フェノキシ基を有する重合支持体を固相として用いる。アミノ酸をα−Ｎ−ｆｍｏｃ誘導体として用いる。アミノ酸に含まれる反応性側基を、トリフルオル酢酸を用いて加水分解して除去することができる追加の保護基でマスクする。ペプチド結合を、ジイソプロピルカルボジイミドでカルボキシル基を活性化することによって形成する。アミノ酸誘導体を挿入する順序は、所望される配列によって決定される。
【００６５】
合成サイクルの最初のステップにおいて、固相上のアミノ基、すなわち支持体の４−（２′４′−ジメトキシフェニルアミノメチル）フェノキシ残基のアミノ基は、α−Ｎ−ｆｍｏｃ誘導体として取り入れられた、適宜保護された側鎖を有する、ジイソプロピルカルボジイミドによって活性化された導入アミノ酸のカルボキシル基と反応し、これは以下に続くサイクルで導入アミノ酸が付される最後のアミノ酸のα−アミノ基と同様である。未反応のアミノ酸誘導体をジメチルホルムアミドで洗浄除去する。次いで、ｆｍｏｃ基をジメチルフォルムアミド中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンで処理して除去する。残りの保護基はこの反応の間は変化することなく保持される。α−Ｎ−保護基の除去に続いて、次の反応サイクルが開始される。目的の配列に対応する最後のアミノ酸が付加された段階で、側鎖の保護基および支持体樹脂との結合をトリフルオル酢酸を用いる酸加水分解によって切断する。次いで、ペプチドを高圧液体クロマトグラフィーによって精製する。
【００６６】
本発明による配列を有する残りのペプチドもまた、上記の方法によって合成する。
実施例１０： ペプチドＣｙｓＧｌｎＧｌｎＧｌｎＴｈｒＡｌａＰｒｏＬｙｓＡｌａＰｒｏＴｈｒＧｌｕのグルコースデヒドロゲナーゼとの抱合
ａ） グルコースデヒドロゲナーゼの誘導体化：
３０ｍｇのメルク社製のバチルス・メガテリウムからのグルコースデヒドロゲナーゼ（製品番号Ｎｏ．１３７３２）を４ｍｌの燐酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に溶解する。６．７８ｍｇのＮ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミド（カルバイオケム社製）を５０μｌのジメチルスルホキシドに溶解して、２．４ｍｌのこの溶液に添加して、混合物を室温で３０分間放置する。次いで、過剰のＮ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドをＰＤ−１０（ファルマシア社製）上のゲル濾過によるクロマトグラフィーで分離除去する。クロマトグラフィーの後、３．５ｍｌの活性化された担体タンパク質の溶液が４．５ｍｇ／ｍｌの濃度で得られる。
ｂ） ペプチドとの結合：
実施例９によって調製されたペプチドの５．２ｍｇを１ｍｌの燐酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に溶解して、１．１ｍｌの上記のステップからの溶液に添加して、混合物を室温で３時間放置する。次いで、結合しなかったペプチドをＰＤ−１０（ファルマシア製）上のゲル濾過によるクロマトグラフィーで分離除去する。クロマトグラフィーの後、３．５ｍｌの抱合体が２．３ｍｇ／ｍｌの濃度で得られる。
【００６７】
本発明に対応する他のペプチドの抱合体もまた、上記の方法によって調製される。
実施例１１： ペプチドＣｙｓＧｌｎＧｌｎＧｌｎＴｈｒＡｌａＰｒｏＬｙｓＡｌａＰｒｏＴｈｒＧｌｕに対するポリクローナル抗体の製造
２羽のウサギに、０．１８ｍｌの実施例１０からの抱合体、０．０７ｍｌの燐酸塩緩衝生理的食塩水および０．２５ｍｌのオイルアジュバント（ＭＩＳＡ５０、仏国セピック社製）からなる乳濁液をそれぞれ筋肉内注射する。同量のブースター注射を、最初の注射の３、５および７週間後に行う。最後の注射の１週間後に、動物を殺してから放血する。血液が凝固した後、遠心分離によって抗血清が得られ、これにアジ化ナトリウムを最終濃度が０．０２％になるように加える。抗血清は−２０℃で凍結保存する。
実施例１２： ペプチドＣｙｓＧｌｎＧｌｎＧｌｎＴｈｒＡｌａＰｒｏＬｙｓＡｌａＰｒｏＴｈｒＧｌｕに対するモノクローナル抗体の製造
２匹のマウスに、０．１ｍｌの実施例１０からの抱合体および０．１ｍｌのオイルアジュバント（ＭＩＳＡ５０、仏国セピック社製）からなる乳濁液をそれぞれ皮下注射する。同量のブースター注射を、最初の注射の２、４および６週間後に行う。最後の注射の３日後に、動物を殺してから脾臓を分離する。脾臓からの細胞を通常の方法で分離して、ネズミ固定細胞系と融合させる。ペプチドＣｙｓＧｌｎＧｌｎＧｌｎＴｈｒＡｌａＰｒｏＬｙｓＡｌａＰｒｏＴｈｒＧｌｕに対する抗体を形成する細胞系を融合産物から選択する。
実施例１３：Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの免疫学的検出
ａ） 前培養および細菌の遠心分離： １０ｍｌのＣＡＳＯブロスにＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのいくつかのコロニーからの材料を接種して、３０℃で一晩培養する。次いで、１ｍｌの培養物をそれぞれ取り出す。遠心分離（１３０００ｒｐｍ）によって細菌体を除去する。
ｂ） 同定反応： 前ステップからの上清液のそれぞれ３００μｌを、マイクロタイタープレートのウェルにピペットで入れて、４℃で一晩インキュベートする。次いで、それぞれ１００μｌの洗浄液（９ｇ／リットルＮａＣｌおよび０．０５％ツイーン２０の水溶液）で各ウェルを３回洗浄する。実施例１１によって調製された抗血清の１００μｌを、ここで各ウェルにピペットで入れて、プレートを室温で１時間インキュベートする。各ウェルをそれぞれ１００μｌの洗浄液で３回再洗浄する。アルカリホスファターゼ（シグマ社製、製品番号Ａ８０２５）で標識した抗ウサギ抗体溶液の１００μｌを次いで各ウェルにピペットで入れて、プレートを室温で３０分間インキュベートする。それぞれのウェルを１００μｌの洗浄液で再度洗浄してから、次いで、結合した酵素標識抗体を検出する。これを行うために、基質を含む２００μｌの緩衝溶液を各ウェルに加えて、プレートを室温で３０分間インキュベートする。１００μｌの２ＮのＮａＯＨ溶液（メルク社製、製品番号９１３６）を各ウェルに添加することによって反応を停止して、反応生産物を可視化する。黄橙色はＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの存在を示す。
実施例１４： イムノブロッティング法を用いるＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの特異的検出
実施例１３ａ）の記述のようにして細菌を前培養して、細菌細胞を遠心分離する。遠心分離された細胞を集めて、１ｍｌの燐酸塩緩衝生理的食塩水に懸濁させる。この懸濁液の２μｌをニトロセルロース膜（ハイボンドＣ、０．４５μｍ、アメルシャム社製、製品番号ＲＰＮ２８３Ｃ）上にピペットで移す。溶液が乾いたら、膜を室温で１時間ウシ血清アルブミン燐酸塩緩衝生理食塩水溶液（１０ｇ／リットル）で処理する。実施例１１で得られた抗血清の希釈物（１：２００）を、ウシ血清アルブミン（１０ｇ／リットル）およびツイーン２０（０．５ｇ／リットル）の燐酸塩緩衝生理食塩水溶液を用いて調製し（抗体溶液Ａ）、同様に、同じ希釈液を用いてペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体（抗ウサギＩｇＧ、ＩＣＮイムノバイオロジカルズ社製、製品番号６８−３９７）のさらなる希釈物（１：５００）を調製する（ＨＲＰ−抗体溶液）。抗体溶液Ａとともに膜を室温で１時間インキュベートして、次いで０．０５％ツイーン２０を含む燐酸塩緩衝生理的食塩水で３回洗浄する。結合している抗体を検出するために、次いで膜をＨＲＰ−抗体溶液とともに室温で１時間インキュベートしてから、ａ）ツイーン２０（０．５ｇ／リットル）燐酸塩緩衝生理的食塩溶液、ｂ）燐酸緩衝生理的食塩水およびｃ）トリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４、２００ｍＭＮａＣｌを含む）でそれぞれ３回洗浄する。呈色反応のために、４−クロロ−１−ナフトール（３ｍｇ／ｍｌメタノール溶液）を５倍量のトリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４、２００ｍＭのＮａＣｌを含む）で希釈して、過酸化水素を加える（最終濃度０．１ｇ／リットル）。この基質溶液中で膜をインキュベートする。青黒色呈色はＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】複製産生物の電気泳動分離の結果を示す。実験の詳細は実施例８に示されている。
【図２】ａからｉはリステリア・モノシトゲネスからのｐ６０タンパク質の配列から選択されたとくに好ましい免疫原性ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図３】そのエピトープがリステリア属細菌の免疫学的検出のために適しているリステリア・モノシトゲネスからのｐ６０タンパク質の配列から選択されたポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図４】リステリア・モノシトゲネスからのｐ６０タンパク質のアミノ酸配列の１位から２５６位までを比較のために示したもので、この配列は図５に示す２５７位に続く。
【図５】リステリア・モノシトゲネスからのｐ６０タンパク質のアミノ酸配列の２５７位から４７８位までを比較のために示したもので、この配列は図４に示す２５６位から続く。
【図６】ａからｄはリステリア・イノクアからのｐ６０タンパク質の配列から選択されたとくに好ましい免疫原性ペプチドのアミノ酸配列を示す。
Claims (10)
- リステリア・モノシトゲネス菌種の細菌からのｐ６０タンパク質の配列から選択されたペプチドであって、
下記式ＩＶａまたはＩＶｄによる配列を特徴とするペプチド。
Ｘ 3 ＰｒｏＶａｌＡｌａＰｒｏＴｈｒＧｌｎＸ 4 （ＩＶａ）
Ｘ 3 ＧｌｎＧｌｎＴｈｒＡｌａＰｒｏＬｙｓＡｌａＰｒｏＴｈｒＸ 4 （ＩＶｄ）
［ただし、各式中Ｘ 3 およびＸ 4 は、それぞれ独立に水素、任意のアミノ酸または７個までのアミノ酸を有する任意のオリゴペプチドである。］ - 以下のａ、ｄ、ｅ及びｆ：
ａ： Val Ser Thr Pro Val Ala Pro Thr Gln
ｄ： Gln Gln Gln Thr Ala Pro Lys Ala Pro Thr Glu
ｅ： Ser Thr Pro Val Ala Pro Thr Gln Glu Val Lys Lys
ｆ： Pro Val Ala Pro Thr Gln Glu Val Lys Lys
のひとつの配列を特徴とする請求項１に記載のペプチド。 - 請求項１または２に記載のペプチドの、免疫原性抱合体の調製のための使用。
- リステリア・モノシトゲネスからのｐ６０タンパク質に対する抗体であって、
以下のａ、ｄ、ｅ及びｆ：
ａ： Val Ser Thr Pro Val Ala Pro Thr Gln
ｄ： Gln Gln Gln Thr Ala Pro Lys Ala Pro Thr Glu
ｅ： Ser Thr Pro Val Ala Pro Thr Gln Glu Val Lys Lys
ｆ： Pro Val Ala Pro Thr Gln Glu Val Lys Lys
の配列のひとつを含むエピトープに結合することを特徴とする抗体。 - ７〜２４個のアミノ酸を有するペプチドを含む免疫原性抱合体を用いて実験動物を免疫することによって調製し得る抗体であって、
前記ペプチドが、下記式ＩＶａ、ＩＶｄ、ａ、ｄ、ｅまたはｆ：
ＩＶａ：Ｘ 3 ＰｒｏＶａｌＡｌａＰｒｏＴｈｒＧｌｎＸ 4 ；
ＩＶｂ：Ｘ 3 ＧｌｎＧｌｎＴｈｒＡｌａＰｒｏＬｙｓＡｌａＰｒｏＴｈｒＸ 4 ；
ａ： Val Ser Thr Pro Val Ala Pro Thr Gln ；
ｄ： Gln Gln Gln Thr Ala Pro Lys Ala Pro Thr Glu ；
ｅ： Ser Thr Pro Val Ala Pro Thr Gln Glu Val Lys Lys ；または
ｆ： Pro Val Ala Pro Thr Gln Glu Val Lys Lys ；
の配列のひとつを含むことを特徴とする抗体。 - 免疫原を用いて実験動物を免疫し、得られた抗体を単離することによるリステリア・モノシトゲネスからのｐ６０タンパク質に対する抗体の製造方法であって、
前記使用される免疫原として、下記式ＩＶａまたはＩＶｄ：
Ｘ 3 ＰｒｏＶａｌＡｌａＰｒｏＴｈｒＧｌｎＸ 4 （ＩＶａ）
Ｘ 3 ＧｌｎＧｌｎＴｈｒＡｌａＰｒｏＬｙｓＡｌａＰｒｏＴｈｒＸ 4 （ＩＶｄ）
［ただし、式中Ｘ 3 およびＸ 4 は、それぞれ独立に水素、任意のアミノ酸または７個までのアミノ酸を有する任意のオリゴペプチドである。］
によるペプチドを含む免疫原性抱合体を用いる
ことを特徴とする抗体の製造方法。 - 前記使用される免疫原が、以下のａ、ｄ、ｅ及びｆ：
ａ： Val Ser Thr Pro Val Ala Pro Thr Gln
ｄ： Gln Gln Gln Thr Ala Pro Lys Ala Pro Thr Glu
ｅ： Ser Thr Pro Val Ala Pro Thr Gln Glu Val Lys Lys
ｆ： Pro Val Ala Pro Thr Gln Glu Val Lys Lys
の配列のひとつによるペプチドを含む免疫原性抱合体である請求項６に記載の抗体の製造方法。 - リステリア・モノシトゲネス菌種の細菌の検出のための請求項４または５に記載の抗体の使用。
- 免疫反応を用いたリステリア・モノシトゲネス菌種の細菌の検出法であって、請求項４または５に記載の抗体を用いることを特徴とする検出法。
- リステリア・モノシトゲネス菌種の細菌のイムノアッセイによる検出のための試験キットであって、
請求項４または５に記載の抗体を含むことを特徴とする試験キット。
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