JP2004154141A - リステリア検出のための方法および試薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 検出試薬には、L. monocytogenesのiap遺伝子から選択した配列を有するプライマーが含まれる。さらに、本発明による試薬には、その配列がp60タンパク質から選択されたものであってL. monocytogenesの免疫学的検出のための特異的抗体の産生に適するペプチドが含まれる。
【選択図】 なし
Description
Int. J. Food Microbiol. 4、 249-256、 1987 Appl. Environ. Microbiol. 54、 2933-2937、 1988 Infect. Immun. 58、 1943-1950、 1990 Appl. Environmental Microbiology 57、 606-609、 1991 Letters Appl. Microbiol. 11、 158-162、 1990 J. Appl. Bact. 70、 372-379、 1991
AATATGAAAAAAGC・・・(Ia)
GCTTCGGTCGCGTA・・・(Ib)
ACAGCTGGGATTGC・・・(Ic)
ACTGCTAACACAGCT・・・(Id)
TAACAGCAATTCAAG・・・(Ie)
CTGAGGTAGCGAGC・・・(If)
AGCACTCCAGTTGTTA・・・(Ig)
GCAGTTTCTAAACCT・・・(Ih)
これに関連して、下記式IIa〜IIhの少なくともひとつによる配列および/またはそれに対応する相補的配列を含むプライマーがとくに好ましい。
ATGAATATGAAAAAAGCAAC・・・(IIa)
TTGGCTTCGGTCGCGTATAA・・・(IIb)
GCTACAGCTGGGATTGCGGT・・・(IIc)
CAAACTGCTAACACAGCTACT・・・(IId)
CAATAACAGCAATTCAAGTGC・・・(IIe)
TAACTGAGGTAGCGAGCGAA・・・(IIf)
ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC・・・(IIg)
CCAGCAGTTTCTAAACCTGCT・・・(IIh)
本発明は、加えて、下記式IIIa〜IIIiのひとつによる少なくともひとつの配列を構成配列として含むペプチドに関し、それぞれの場合、7個までのアミノ酸をペプチド結合によってこの構成配列の前方および/または後方に結合させることが可能である。
ProValAlaProThrGln・・・(IIIa)
ThrGlnAlaThrThrProAla・・・(IIIb)
AlaIleLysGlnThrAlaAsnThrAla・・・(IIIc)
GlnGlnThrAlaProLysAlaProThr・・・(IIId)
ValAsnAsnGluValAlaAlaAlaGluLysThrGlu・・・(IIIe)
ThrProValValLysGlnGluValLys・・・(IIIf)
ValLysGlnProThrThrGlnGlnThrAlaPro・・・(IIIg)
IleLysGlnProThrLysThrValAlaPro・・・(IIIh)
GlnGlnThrThrThrLysAlaProThr・・・(IIIi)
これに関連して、第2a−i図および第6a−d図のひとつによる配列を有するペプチドがとくに好ましい。
X3ProValAlaProThrGlnX4・・・(IVa)
X3ThrGlnAlaThrThrProAlaX4・・・(IVb)
X3AlaIleLysGlnThrAlaAsnThrAlaX4・・・(IVc)
X3GlnGlnThrAlaProLysAlaProThrX4・・・(IVd)
X3ValAsnAsnGluValAlaAlaAlaGluLysThrGluX4・・・(IVe)
X3ThrProValValLysGlnGluValLysX4・・・(IVf)
X3ValLysGlnProThrThrGlnGlnThrAlaProX4・・・(IVg)
X3IleLysGlnProThrLysThrValAlaProX4・・・(IVh)
X3GlnGlnThrThrThrLysAlaProThrX4・・・(IVi)
第2a−i図および第6a−d図のひとつによる配列を有するペプチドがとくに好ましい。
a) 式IIcによるプライマーと式IIbによる相補的配列のプライマーとの組み合わせを用いる場合、リステリアのDNAのみが複製されて他のタイプの細菌のDNAは複製されない(表1のD欄を参照されたい)。
b) 式IIdによるプライマーと式IIbによる相補的配列のプライマーとの組み合わせを用いる場合、L. monocytogenesのDNAのみが複製されて他のリステリアまたは他の細菌のDNAは複製されない(表1のB欄を参照されたい)。
c) 式IIfによるプライマーと式IIbによる相補的配列のプライマーとの組み合わせを用いる場合、特定のリステリア菌種のDNAのみ、すなわち、L.seelingeri、L. welshimiriおよびL. ivanoviiのDNAが排他的に複製される。この結果、グループ−特異的検出が可能になる(表1のE欄を参照されたい)。
d) グループ−特異的検出の他の例としては、式IIhによるプライマーと式IIbによる相補的配列のプライマーとの組み合わせの使用によって、L. grayiおよびL. murrayiのDNAのみが複製される(表1のG欄を参照されたい)。
e) 異なるリステリア菌種の複製産生物は、種々の分子量を有することから、リステリア属の細菌は、いくつかのプライマー(式IId、IIf、IIgおよびIIhによる)と式IIbの相補的配列のプライマーとの組み合わせによって、単一のポリメラーゼ反応を用いて区別することができる。ポリメラーゼ手法のこのさらなる展開の詳細は実施例8から明かである(表1のH欄および第1図を参照されたい)。
a) 式IIIaによる配列は、p60配列の148位のプロリンで始まり(第4図)、第2a、2eおよび2f図によるペプチドもまたこの領域に位置している。
b) 式IIIbによる配列は、p60配列の178位のスレオニンで始まり(第4図)、第2bおよび2h図によるペプチドもまたこの領域に位置している。
c) 式IIIcによる配列は、p60配列の243位のアラニンで始まり(第4図)、第2cおよび2i図によるペプチドもまたこの領域に位置している。
d) 式IIIdによる配列は、p60配列の292位のグルタミンで始まり(第5図)、第2d図によるペプチドもまたこの領域に位置している。
e) 式IIIeによる配列は、p60配列の71位のバリンで始まり(第4図)、第2g図によるペプチドもまたこの領域に位置している。
一般にペプチドは抗体の産生に適していない。しかし、ペプチドを高分子量の担体物質に結合させれば、免疫原性の抱合体が形成される。本発明によるペプチドは、既知の担体物質と抱合させることができる。それらには、ポリエチレングリコール、血清アルブミン、KLH(keyhole limpet ヘモシアニン)、卵白アルブミン、バチルス・メガテリウムからのグルコースデヒドロゲナーゼおよびPPD(ツベルクリンの精製タンパク質誘導体)などがある。好ましい担体物質は、KLHおよびバチルス・メガテリウムからのグルコースデヒドロゲナーゼである。
Antibodies、 H. Harlow and D. Lane、 Cold Spring Harbor (1988);
Woodard、 L.F. and Jasman、 R.L. (1985) Vaccine 3、 137-144;
Woodard、 L.F. (1989) Laboratory Animal Sci 39、 222-225;
Handbook of Experimental Immunology (1986) Weir、 D.M. et al. eds.;及び
Blackwell Scientific Publications、 Oxford、 GB.
これらの方法には、例えば、抱合および免疫方法、さらに抗体の調製および精製、また免疫学的検出法なども含まれる。本発明による抗体を用い得る免疫学的検出法には、好ましくは凝集法、免疫度検出法、イムノブロット法およびとくにサンドイッチELISA法などが含まれる。
式IIaによるプライマーを、アプライド・バイオシステムズの380A型DNA合成機を用いてホスホアミダイト法によって調製する。この方法の要点はTetrahedron Lett 22、 1859-1862、 1981に記述されている。さらなる詳細は、機器製造業者によって提供される文献に見出される。
式IIc、IId、IIf、IIgおよびIIhによるプライマーを対応する方法によって調製する。式IIbおよびIIeによるプライマーを、それぞれの相補的配列(IIb:TTGGCTTCGGTCGCGTAGAATTCATA;IIe:GCACTTGAATTGCTGTTATTG)に調製する。
細菌を含む試料を、約1μgのDNAとともに50μlの緩衝液(10mMトリス−HCl(pH8.5)、1.5mMMgCl2および50mMKCl)に懸濁させて、110℃で5分間加熱する。次いで、式IIdおよびIIeによるプライマー(実施例1を参照、各0.4μg)および2.5UのTaqポリメラーゼ(ファルマシア製)を反応緩衝液(10mMトリス−HCl(pH8.5)、1.5mMMgCl2および50mMKCl)に溶解して、それぞれ200μmolのdGTP、dATP、dTTPおよびdCTPを加える(反応総液量100μl)。最初の変性段階を94℃で3分間続ける。次いで、反応混合物を55℃の温度で30秒間(アニーリング期)、および72℃の温度で1分間(伸長期)保持する。次いで、変性段階(94℃)を45秒間続ける。30回の反応サイクルの後、5分間保持の終結伸長段階(72℃)を行う。
式IIdおよびIIeによるプライマーの代わりに式IIdおよびIIbによるプライマー(実施例1を参照)を用いて、実施例2に記述の方法を繰り返す。この場合もまた、PCR産生物は、L. monocytogenesからのDNAまたは細胞が試料中に存在する場合にのみ観察される(表1のB欄を参照されたい)。
細菌を含む試料を、約1μgのDNAとともに50μlの水に懸濁させて、110℃で5分間加熱する。次いで、式IIcおよびIIbによるプライマー(実施例1を参照、各0.4μg)および2.5UのTaqポリメラーゼ(ファルマシア製)を反応緩衝液(10mMトリス−HCl(pH8.5)、1.5mMMgCl2および50mMKCl)に溶解して、それぞれ200μmolのdGTP、dATP、dTTPおよびdCTPを加える(反応総液量100μl)。最初の変性段階を94℃で3分間続ける。次いで、反応混合物を56℃の温度で30秒間(アニーリング期)、および72℃の温度で2分間(伸長期)保持する。次いで、変性段階(94℃)をそれぞれ45秒間続ける。30回の反応サイクルの後、5分間保持の終結伸長段階(72℃)を行う。
細菌を含む試料を、約1μgのDNAとともに50μlの水に懸濁させて、110℃で5分間加熱する。次いで、式IIfおよびIIbによるプライマー(実施例1を参照、各0.4μg)および2.5UのTaqポリメラーゼ(ファルマシア製)を反応緩衝液(10mMトリス−HCl(pH8.5)、1.5mMMgCl2および50mMKCl)に溶解して、それぞれ200μmolのdGTP、dATP、dTTPおよびdCTPを加える(反応総液量100μl)。最初の変性段階を94℃で3分間続ける。次いで、反応混合物を58℃の温度で45秒間(アニーリング期)、および72℃の温度で1分間(伸長期)保持する。次いで、変性段階(94℃)を45秒間続ける。30回の反応サイクルの後、5分間保持の終結伸長段階(72℃)を行う。
細菌を含む試料を、約1μgのDNAとともに50μlの緩衝液(10mMトリス−HCl(pH8.5)、1.5mMMgCl2および50mMKCl)に懸濁させて、110℃で5分間加熱する。次いで、式IIgおよびIIbによるプライマー(実施例1を参照、各0.4μg)および2.5UのTaqポリメラーゼ(ファルマシア製)を反応緩衝液(10mMトリス−HCl(pH8.5)、1.5mMMgCl2および50mMKCl)に溶解して、それぞれ200μmolのdGTP、dATP、dTTPおよびdCTPを加える(反応総液量100μl)。最初の変性段階を94℃で3分間続ける。次いで、反応混合物を62℃の温度で60秒間(アニーリング期)、および72℃の温度で45秒間(伸長期)保持する。次いで、変性段階(94℃)を45秒間続ける。30回の反応サイクルの後、5分間保持の終結伸長段階(72℃)を行う。
細菌を含む試料を、約1μgのDNAとともに50μlの水に懸濁させて、110℃で5分間加熱する。次いで、式IIhおよびIIbによるプライマー(実施例1を参照、各0.4μg)および2.5UのTaqポリメラーゼ(ファルマシア製)を反応緩衝液(10mMトリス−HCl(pH8.5)、1.5mMMgCl2および50mMKCl)に溶解して、それぞれ200μmolのdGTP、dATP、dTTPおよびdCTPを加える(反応総液量100μl)。最初の変性段階を94℃で3分間続ける。次いで、反応混合物を56℃の温度で45秒間(アニーリング期)、および72℃の温度で45秒間(伸長期)保持する。次いで、変性段階(94℃)を45秒間続ける。30回の反応サイクルの後、5分間保持の終結伸長段階(72℃)を行う。
細菌を含む試料を、約1μgのDNAとともに50μlの緩衝液(10mMトリス−HCl(pH8.5)、1.5mMMgCl2および50mMKCl)に懸濁させて、110℃で5分間加熱する。次いで、式IId、IIf、IIg、IIhおよびIIbによるプライマー混合物(実施例1を参照、各0.4μg)および2.5UのTaqポリメラーゼ(ファルマシア製)を反応緩衝液(10mMトリス−HCl(pH8.5)、1.5mMMgCl2および50mMKCl)に溶解して、それぞれ200μmolのdGTP、dATP、dTTPおよびdCTPを加える(反応総液量100μl)。最初の変性段階を94℃で3分間続ける。次いで、反応混合物を56℃の温度で45秒間(アニーリング期)、および72℃の温度で1分間(伸長期)保持する。次いで、変性段階(94℃)を45秒間続ける。30回の反応サイクルの後、5分間保持の終結伸長段階(72℃)を行う。
fmoc法(9−フルオレニルメチルオキシカルボニル保護基)をペプチドCysGlnGlnGlnThrAlaProLysAlaProThrGluの合成に用いる。このペプチドは、N−末端にシステイン基をリンカーとして追加した式IVdのペプチドに対応する。アプライド・バイオシステムズのペプチド合成機を合成に用いる。プロセスパラメーターは、機器資料のものを用いる。
a) グルコースデヒドロゲナーゼの誘導体化:
30mgのメルク社製のバチルス・メガテリウムからのグルコースデヒドロゲナーゼ(製品番号No.13732)を4mlの燐酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH8.0)に溶解する。6.78mgのN−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミド(カルバイオケム社製)を50μlのジメチルスルホキシドに溶解して、2.4mlのこの溶液に添加して、混合物を室温で30分間放置する。次いで、過剰のN−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドをPD−10(ファルマシア社製)上のゲル濾過によるクロマトグラフィーで分離除去する。クロマトグラフィーの後、3.5mlの活性化された担体タンパク質の溶液が4.5mg/mlの濃度で得られる。
b) ペプチドとの結合:
実施例9によって調製されたペプチドの5.2mgを1mlの燐酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH7.0)に溶解して、1.1mlの上記のステップからの溶液に添加して、混合物を室温で3時間放置する。次いで、結合しなかったペプチドをPD−10(ファルマシア製)上のゲル濾過によるクロマトグラフィーで分離除去する。クロマトグラフィーの後、3.5mlの抱合体が2.3mg/mlの濃度で得られる。
2羽のウサギに、0.18mlの実施例10からの抱合体、0.07mlの燐酸塩緩衝生理的食塩水および0.25mlのオイルアジュバント(MISA50、仏国セピック社製)からなる乳濁液をそれぞれ筋肉内注射する。同量のブースター注射を、最初の注射の3、5および7週間後に行う。最後の注射の1週間後に、動物を殺してから放血する。血液が凝固した後、遠心分離によって抗血清が得られ、これにアジ化ナトリウムを最終濃度が0.02%になるように加える。抗血清は−20℃で凍結保存する。
2匹のマウスに、0.1mlの実施例10からの抱合体および0.1mlのオイルアジュバント(MISA50、仏国セピック社製)からなる乳濁液をそれぞれ皮下注射する。同量のブースター注射を、最初の注射の2、4および6週間後に行う。最後の注射の3日後に、動物を殺してから脾臓を分離する。脾臓からの細胞を通常の方法で分離して、ネズミ固定細胞系と融合させる。ペプチドCysGlnGlnGlnThrAlaProLysAlaProThrGluに対する抗体を形成する細胞系を融合産物から選択する。
a) 前培養および細菌の遠心分離: 10mlのCASOブロスにL. monocytogenesのいくつかのコロニーからの材料を接種して、30℃で一晩培養する。次いで、1mlの培養物をそれぞれ取り出す。遠心分離(13000rpm)によって細菌体を除去する。
b) 同定反応: 前ステップからの上清液のそれぞれ300μlを、マイクロタイタープレートのウェルにピペットで入れて、4℃で一晩インキュベートする。次いで、それぞれ100μlの洗浄液(9g/リットルNaClおよび0.05%ツイーン20の水溶液)で各ウェルを3回洗浄する。実施例11によって調製された抗血清の100μlを、ここで各ウェルにピペットで入れて、プレートを室温で1時間インキュベートする。各ウェルをそれぞれ100μlの洗浄液で3回再洗浄する。アルカリホスファターゼ(シグマ社製、製品番号A8025)で標識した抗ウサギ抗体溶液の100μlを次いで各ウェルにピペットで入れて、プレートを室温で30分間インキュベートする。それぞれのウェルを100μlの洗浄液で再度洗浄してから、次いで、結合した酵素標識抗体を検出する。これを行うために、基質を含む200μlの緩衝溶液を各ウェルに加えて、プレートを室温で30分間インキュベートする。100μlの2NのNaOH溶液(メルク社製、製品番号9136)を各ウェルに添加することによって反応を停止して、反応生産物を可視化する。黄橙色はL. monocytogenesの存在を示す。
実施例13a)の記述のようにして細菌を前培養して、細菌細胞を遠心分離する。遠心分離された細胞を集めて、1mlの燐酸塩緩衝生理的食塩水に懸濁させる。この懸濁液の2μlをニトロセルロース膜(ハイボンドC、0.45μm、アメルシャム社製、製品番号RPN283C)上にピペットで移す。溶液が乾いたら、膜を室温で1時間ウシ血清アルブミン燐酸塩緩衝生理食塩水溶液(10g/リットル)で処理する。実施例11で得られた抗血清の希釈物(1:200)を、ウシ血清アルブミン(10g/リットル)およびツイーン20(0.5g/リットル)の燐酸塩緩衝生理食塩水溶液を用いて調製し(抗体溶液A)、同様に、同じ希釈液を用いてペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体(抗ウサギIgG、ICNイムノバイオロジカルズ社製、製品番号68−397)のさらなる希釈物(1:500)を調製する(HRP−抗体溶液)。抗体溶液Aとともに膜を室温で1時間インキュベートして、次いで0.05%ツイーン20を含む燐酸塩緩衝生理的食塩水で3回洗浄する。結合している抗体を検出するために、次いで膜をHRP−抗体溶液とともに室温で1時間インキュベートしてから、a)ツイーン20(0.5g/リットル)燐酸塩緩衝生理的食塩溶液、b)燐酸緩衝生理的食塩水およびc)トリス緩衝液(50mM、pH7.4、200mMNaClを含む)でそれぞれ3回洗浄する。呈色反応のために、4−クロロ−1−ナフトール(3mg/mlメタノール溶液)を5倍量のトリス緩衝液(50mM、pH7.4、200mMのNaClを含む)で希釈して、過酸化水素を加える(最終濃度0.1g/リットル)。この基質溶液中で膜をインキュベートする。青黒色呈色はL. monocytogenesを示す。
+ PCR産生物検出
− PCR産生物非検出
1)相補的配列
2)Mack.:Mackaness株
3)M: 式IId、IIf、IIgおよびIIhによるプライマーの混合物
複製産生物は分子量に基づいて識別することができる。
Claims (6)
- 式Va〜Vhのひとつによる配列および/またはそれに対応する相補的配列を特徴とする、iap(侵入関連タンパク質)遺伝子から選択された、核酸複製のためのプライマー。[ただし、式中、X1およびX2は、それぞれ独立に水素、任意のヌクレオチドまたは20個までのヌクレオチド部分を有する任意のオリゴヌクレオチドである。]
X1AATATGAAAAAAGCX2 Va
X1GCTTCGGTCGCGTAX2 Vb
X1ACAGCTGGGATTGCX2 Vc
X1ACTGCTAACACAGCTX2 Vd
X1TAACAGCAATTCAAGX2 Ve
X1CTGAGGTAGCGAGCX2 Vf
X1AGCACTCCAGTTGTTAX2 Vg
X1GCAGTTTCTAAACCTX2 Vh - 式IIa〜IIhのひとつによる配列を特徴とするプライマー。
ATGAATATGAAAAAAGCAAC IIa
TTGGCTTCGGTCGCGTATAA IIb
GCTACAGCTGGGATTGCGGT IIc
CAAACTGCTAACACAGCTACT IId
CAATAACAGCAATTCAAGTGC IIe
TAACTGAGGTAGCGAGCGAA IIf
ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC IIg
CCAGCAGTTTCTAAACCTGCT IIh - リステリア属細菌の検出のための、請求項1または2に記載のプライマーの使用。
- 請求項1または2に記載のプライマーを用いることを特徴とする、遺伝子複製によるリステリア属細菌の検出法。
- 請求項1または2に記載のプライマーを含むことを特徴とする、ポリメラーゼ連鎖反応によるリステリア属細菌の検出のための試験キット。
- リステリア・モノシトゲネス菌種の細菌の検出のための、請求項4に記載の試験キット。
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