JPH05501113A

JPH05501113A - ボレリア　ブルグドルフェリの抗原性タンパク質

Info

Publication number: JPH05501113A
Application number: JP3506159A
Authority: JP
Inventors: シンプソン，ウォーレン　ジェイ．; シュワン，トム　ジー．
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1990-03-05
Filing date: 1991-03-05
Publication date: 1993-03-04
Also published as: CA2077434C; AU7496591A; EP0524958B1; DE69122240T2; EP0524958A1; WO1991013630A1; AU645078B2; ATE142888T1; DE69122240D1; CA2077434A1; EP0524958A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ボレリア　ブルグドルフェリの抗原性タンパク質発明の分野本発明は抗原性ボレリア　ブルグドルフェリタンパク質（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）およびそれらをコード化するＤＮＡに関する。特に本発明はライムボレリア症血清（Ｌｙｍｅ　ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ　ｓｅｒｕｍ）と反応する２種の３９キロダルトン（ｋＤａ）ボレリア　ブルグドルフェリタンパク質およびライムボレリア症血清と反応する２８キロダルトン（ｋＤａ）ボレリア　ブルグドルフェリタンパク質に関する。

発明の背景ヒトにおけるライムボレリア症は、ダニ由来スピロヘータ・ボレリア　ブルグドルフェリでの感染により引き起こされる多様な全身系病気（ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｄｉｓｏｒｄｅｒ）である。（ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、１９８２．５ｃｉｅｎｃｅ　２１６　：１３１７−１３１９　；Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　１９８４．　丁ｎｔ、Ｊ、５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

３４　＋　４９６−４９７　；および５ｔｅｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ、　１９８３゜Ｎ、　［！ｎｇｌ。

Ｊ、　Ｍｅｄ、　３０８　：　７３３−７４０　）　。南中央コネチカットにおける該病気の最初の疫病学的調査（Ｓｔｅｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ、　１９７７゜Ａｎｎ、Ｉｎｔｅｒｎ、Ｍｅｄ、　８６　：６８５−６９８　および５ｔｅｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ。

１９７７、　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、Ｒｈｅｕｍ、　２０　：　７−１７）から、今では人間の場合のライムボレリア症はアメリカ合衆国の４３州〔Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　１９８９　、　Ｌｙｍｅ　ｄｉｓｅａｓｅ−Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ、１９８７　＆　１９８８．　ＭＭＷＲ３８：６６８−６７２：ｌ　、カテダの５地方（Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　１９８９．　Ｌｙｍｅｄｉｓｅａｓｅ　−Ｃａｎａｄａ、　ＭＭＷＲ３８：６７７−６７８　）　、ヨーロッパないしアジアの多数の国（Ａｉ　ｅｔ　ａｌ、　１９８８．　Ａｎｎ、ＮＹ　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、５３９：３０２−３１３　；Ｄｅｋｏｎｅｎｋｏ　ｅｔ　ａｌ、１９８８．　Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄｉｓ、　１５８ニア４８−７５３　；およびＳｃｈｍｉｄ、　１９８５．　Ｒｅｖ、Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄｉｓ、　７：４１−５０：ｌ　、オーストラリアのあっても限定された５地点（Ｓｔｅｉｖａｒｔ　ａｔ　ａｌ、　１９８２゜）Ｊｅｄ、Ｊ、Ａｕ５ｔｒａＬｉａ　１：１３９〕、およびアフリカ（Ｈａ、ｂｅｒｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ。１９８９．　Ｔｒａｎｓ。

Ｒ，５ｏｃ−Ｔｒｏｐ、　Ｍｅｄ、Ｈｙｇ、　８３：５５６および５ｔａｎｅｋ　ｅｔ　ａｌ。

１９８６、　Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ、　Ｂａｋｔｅｒｉａｌ、　Ｍｉｋｒａｂｉｏ、　）Ｉｙｇ、［Ａ］　２６３：４９１−４９５　）で捕捉されている。１９８２〜１９８８年の間に、ライムボレリア症の１３，８２５ケースが、合衆国全５０州立病気管理センター（ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　ＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌ　ｆｒｏｍ　ａｌｌ　５０５ｔａｔｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｃｌ　５ｔａｔｅｓ）に受理されており（Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｄｊｓｅａｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　１９８９゜しｙｍｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　−Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ、１９８７　＆　１９８８．　ＭＭＷＲ３８：６６８−６７２）　、この病気を国の最も有病率の高い節足動物由来感染としている。

ライムボレリア症の認識、有病率および地理的分布における劇的な増加につれて、各ケースの血清学的確認〔Ｍａｇｎａｒｅｌｌｉ、　１９８９．　Ｊ、Ａｍ、Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、２６２：３４６４−３４６５およびＳｃｈｗａｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、　１９８９．　Ｊ、Ａｍ、Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、２６２：３４３１− ３４３４　）について、または様々な診断において該病気を除外すべく、膨大な新たな要求が臨床研究機関になされてきている。しかしながら、ライムボレリア症についての最近の利用可能な血清学的試験には多くの潜在的問題が存在し、それは偽陽性か偽陰性のどちらかの結果となる（Ｍａｇｎａｒｅｌｌｉ、　１９８９．　Ｊ、Ａｍ、Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、２６２＋３４６４−３４６５〕。幾つかの研究は、血清学的試験の感受性を増大させるボレリア　ブルグドルフエリの鞭毛タンパク質の使用に焦点を当ててきており（Ｈａｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、１９８９．　Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　２７：５４５−５５１およびＨａｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　１９８Ｂ、　Ｊ。

Ｃ１１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　２６：３３８−３４６　：ｌ　、その理由は研究初期に、感染されたヒトにおける最も速い抗体反応を発生させるものはスピロヘータの４１キロダルトン（ｋＤａ）鞭毛サブユニット（フラゲリン：ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）　）であろうことが示されたからである（Ｂａｒｂｏｕｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９８３．　Ｊ、Ｃ１１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　７２：５０４−５ｆ５　；　Ｃａ１ｅｒｎａｎ　ｅｔ　ａｌ、１９８７．　Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、　１５５ニア５６−７６５；およびＧｒｏｄｚｉｃｋｉ　ｅｔ　ａｌ、　１９８８．　Ｊ。

Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、　１５７：７９０−７９７　）　、しかしながら、鞭毛タンパク質を用いることの二つの潜在的問題の一つは、他のボレリア種の鞭毛がボレリア　ブルグドルフエリの鞭毛に対しエピトープ（抗原決定基）を共有することである（Ｂａｒｂｏｕｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９８６．　丁ｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　５２：５４９−５４４　）　。

二つめとして、イムノプロット分析によりヒト血清をスクリーニングする殆どの研究（Ｂａｒｂｏｕｒ　１９８４．　Ｙａｌｅ　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、　５７：５８１−５８６；　Ｂａｒｂｏｕｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９８３．　Ｊ、Ｃ１１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　７２：５０４−５１５　；Ｃｏｌｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　１９８７．　Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄｉｓ、　１５５ニア５６−７６５　：Ｃｒａｆｔ　ｅｔ　ａｌ、１９８６．　Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ。

７８：９３４−９３９　、およびＮａｄａｌ　ｅｔ　ａｌ、　１９８９．　Ｐｅｄｉａｔｒ、Ｒｅｓ。

２６：３７７−３８２　］において、４１ｋＤａの明瞭な移動を示す抗体結合タンパク質が、想定されたフラゲリンであると証明されていない。

従って、哺乳動物におけるライムボレリア症を検定する必要があることは明らかである。本発明は、そんな方法を提供する。

発明の概要本発明の目的は、以前にまたは現在ライム病に感染しだ哺乳動物を検定する手段を提供することである。

−具体例において、本発明は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約３９キロダルトンの分子量を有するタンパク質および約２８キロダルトンの分子量を有するタンパク質であって、ライムボレリア症血清に反応性である実質的に純粋形態のボレリア　ブルグドルフェリタンパク質に関する。

別の具体例において、本発明は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約３９キロダルトンの分子量を有するタンパク質および約２８キロダルトンの分子量を育するタンパク質であって、ライムボレリア症血清に反応性であり、通常同伴するタンパク質が実質的に無いボレリア　ブルグドルフェリタンパク質に関する。

なお別の具体例において、本発明は、上記３９キロダルトンのボレリア　ブルグドルフエリタンパク質または２８キロダルトンのボレリア　ブルグドルフエリタンバり質の全部または特定部分をコード化するＤＮＡ断片に関する。

別の具体例において、本発明は、上記３９キロダルトンのボレリア　ブルグドルフエリタンパク質の１種の全部または特定部分をコード化するＤＮＡ断片に関する。

更なる具体例において、本発明は、上記ＤＮＡ断片およびベクターからなる組換えＤＮＡ分子に関する。また本発明は、ＤＮＡ断片中にコード化されたボレリア　ブルグドルフェリタンパク質の発現を許す方法で上記組換えＤＮＡ分子で安定して形質転換された宿主細胞にも関する。

別の具体例において、本発明は、上記３９ｋＤタンパク質の発現を許す方法でタンパク質を発現する宿主細胞を培養し、そしてその宿主細胞からのタンパク質を単離することからなる、約３９キロダルトンの分子量を有するタンパク質および約２８キロダルトンの分子量を有するタンパク質であって、ライムボレリア症血清に反応性である組換えボレリア　ブルグドルフエリタンパク質の産生方法に関する。

他の具体例において、本発明は、上記３９キロダルトンのボレリア　ブルグドルフェリタンパク質またはその特定断片あるいは上記２８キロダルトンのボレリア　ブルグドルフェリタンパク質またはその特定断片に特異的な精製形態の抗体に関する。

別の具体例において、本発明は、ライムボレリア症血清に反応性であるライムボレリア症に対する免疫を誘導するのに充分な量の３９ｋＤボレリア　ブルグドルフェリタンパク質または２８キロダルトンのボレリア　ブルグドルフェリタンパク質の全部または特定部分と、製薬学的に許容される担体とを含むライムボレリア症に対する哺乳動物用ワクチンに関する。

更なる具体例において、本発明は、表面に本発明の３９ｋＤタンパク質、各３９ｋＤタンパク質の何れか、または２８ｋＤａタンパク質（またはそれに特異的な抗体）をコーティングする段階；上記コーティングされた表面と血清とを接触させる段階；そしてコーティングされた抗体タンパク質（コーティングされた抗体）と血清中のそれに特異的な抗体（標的タンパク質）とで形成される複合体の存在または不在を検定する段階；からなるライムボレリア症の診断のためのバイオアッセイに関する。

別の具体例として、本発明は、天然のまたは組換え産生されたボレリア　ブルグドルフェリの３９ｋＤａタンパク質、各３９ｋＤａタンパク質の何れか、または２８ｋＤａタンパク質と補助試薬とからなる、哺乳動物組織試料中の上記タンパク質に対する抗体の存在の検定に使用するのに適する診断キットに関する。

さらに別の具体例において、本発明は抗ライム病活性が抑制され得るような条件下で、下記薬物とボレリアブルグドルフェリに接触した細胞とを接触させることからなる抗うイムボレリア症活性についての薬物スクリーニング方法に関する。

本発明の様々な他の目的および利、α（ま、図面および以下の本発明の説明から明らかとなるであろう。

本明細書で述べた刊行物の全ては、ここ（こ参照文献として組み込まれる。

図面の簡単な説明図１はｐｓＰＲ８３の遺伝子地図を示す。スピロヘータＤＮＡは斜線を付したブロックで表され、そして矢印はＬａｃプロモーターが転写される方向を示す。スピロヘータＥｃｏ　Ｒ１断片中にＡｃｃ　［、Ｋｐｎ　ｌ　、　Ｘｂａ　Ｉ　、Ｘｈｏ　［または５ｍａ　Ｉに対する制限部位は無かった。

図２は、ボレリア・ブルグドルフェリの７単離体および５つのその他のボレリア種からのｌｃｏ　ＲＩで消化された全ＤＮＡ、！＝ｐＳＰＲ３３からｃｖ　＄　１　ｐ標識挿入ＤＮＡとのハイブリッド形成を示すオートラジオグラフである。

右端の列はＥｃｏ　Ｒ１で消化されたｐｓＰＲ３８（ｐｓＰＲ３３）を含んでいた。直線状分子量マーカー（Ｋｂ）はパネルの右側に示されている。

図３はボレリア・ブルグドルフェリの７単離体からの未消化全ＤＮＡの臭化エチジウム染色ゲル（パネルＡ）および同じゲルをニトロセルロースにブロッティングし、そしてｐｓＰＲ３３からのＩ！Ｐ標識６，８ＫｂＥＣｏＲＩ断片とのハイブリッド形成した後のオートラジオグラフ（パネルＢ）である。強いハイブリッド形′成シグナルが染色体バンドと結合したことに着目せよ。

図４はｐＳＰＲ３″３により発現されたタンパク質のイムノプロット分析を示す。ボレリア・プルグドルフェリｃｏＬｉ　＋ｐＳＰＲ３３）　、およびベクターのみを含有する大腸菌（Ｅ、　ｃｏＬｉ＋ベクター）の全体の細胞溶菌液はボレリア・ブルグドルフェリのＤＮＡライブラリィをスクリーニングするために使用されるヒトライムボレリオシス（ｈｕｍａｎ　Ｌｙｍｅ　ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ）血清とのイムノブロッティングが行われた。

図５はボレリア・ブルグドルフエリにおけるＰ２ＯおよびＰ３９発現の特異性を示す。異なるボレリア・ブルグドルフェリ株（Ｓｈ−２−８２株のロー（Ｐ６）およびハイ（Ｐ２４６）試験管内継代培養体を含む）および５つの付加的なボレリア種を表す単離体の全体の細胞溶菌液は抗ｐＳＰＲ３３血清とのイムノブロッティングが行われた。Ｐ２ＯおよびＰ２Ｏを発現する大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ＋ｐＳＰＲ３３）および発現しない大腸菌（Ｅ。

ｃｏＬｉ＋ベクター）の溶菌液もまたそれぞれ陽性対照および陰性対照としてイムノブロッティングが行われた。

試験した２０のボレリア・プルグドルフェリ単離体の全てが示されているわけではない（表１参照）。

図６はアンチｐｓＰＲ３３およびモノクローナル抗体Ｈ９７２４の反応性を示す図面である。大腸菌＋ｐＳＰＲ３３、大腸菌＋ベクターのみ、ボレリア゛・ブルグドルフエリ５ｈ−２−８２株およびボレリア・ヘルミシイＦＲＧ株の全体の細胞溶菌液中の成分が５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、そしてアンチｐｓＰＲ３３、アンチｐｇＰＲ３３＋Ｈ９７２４またはＨ９７２４と保温された。

Ｐ２Ｏ（矢印１）：ボレリア・プルグドルフェリからの４１ｋＤａフラジエリン（矢印２）：ボレリア・ヘルミシイからの３９ｋＤａフラジエリン（矢印３）。

図７は１０種のヒトライムボレリオシス血清のイムノプロット分析およびＰ２ＯとＰ２Ｏとのそれらの反応性を示す。ボレリア・プルグドルフェリ５ｈ−２−８２株（列１）、ｐｓＰＲ３！３を含有する大腸菌（列２）およびベクターのみを含有する大腸菌（列３）の全体の細胞溶菌液はヒトライムボレリオシス血清（ＮＹ）とのイムノブロッティングが行われた。各々のヒト血清に対するＩＦＡライムボレリオシスの力価がそれらの名称の下に示されている。５時間露光したオートラジオグラフ（パネルＡ）は１／２時間露光したもの（パネルＢ）に比べより弱い反応性を有する血清を示した。矢印はＰ２Ｏ（矢印１）および４１ｋＤａ抗原（矢印２）を表す。バンドＢはＰ２Ｏの位置に相当し、そしてバンドＡはＰ２Ｏと反応する全ての血清を結合した５８−６５ｋＤａ抗原である。分子量マーカー（ｋＤａ）は各パネルの右側に示されている。

図８は梅毒血清のイムノプロット分析を示す。ボレリア・プルグドルフェリ５ｈ −２−８２株、’ｐｓＰＲ１３！３を含有する大腸菌およびベクターのみを含有する大腸菌の全体の細胞溶菌液１よ５種の梅毒血清（１ないし５）またはアンチｐＳＰＲ８３（アンチｐＳＰＲ３！ｌ）とのイに示されている。５つのボレリア・ブルグドルフェリ列のうちの３つにおいて、強い反応性の４１ｋＤａ抗原と対照的である梅毒血清と反応したｐＳＰＲ３３列中にＰ２Ｏがないことに着目せよ。

図９はボレリア・プルグドルフェリの制限エンドヌクレアーゼ地図およびＰ３９遺伝子座に対する発現データを示す。プラスミドｐｓＰＲ８３のサブクローンおよび欠失変種（ｐＳＰＲ１１１８，ｐｓＰＲ４５，ｐｓＰＲ５１゜ｐｓＰＲ５４，ｐＳＰＲ５６，ｐＳＰＲ５７，ｐＳＰＲ５９、ｐｓＰＲ４６，ｐＳＰＲ４４およびｐＳＰＲ４２）は白ヌキバーで示されている。

図１０ＡおよびＩＯＢはボレリア・ブルグドルフェリのＰ３９αおよびＰｉ３９ β抗原をそれぞれコード化する遺伝子１および遺伝子２の読み枠の地図を示す。

図１ＯＡは終止部位のない読み枠を示す（全垂線）。図１０ＢはＤＮＡの両方の鎖のヌクレオチド配列を決定するために使用される重複配列を有するプライマー部位を示す。

図１１は遺伝子１および２、推定アミノ酸数および転写方向を含むボレリア・ブルグドルフェリのＰ３９オペロンの遺伝子地図を示す。

図１２は遺伝子１および２の単一転写ユ′ニットのための適当な大きさの２．３５ｋｂＲＮＡ転写体を示す、ｐＳＰＲ３３をプローブとしたボレリア・ブルグドルフェリＲＮＡのノーザンプロットを示す。

図１３はボレリア・ブルグドルフェリのＰ８９α（遺伝子１）およびＰ３９β（遺伝子２）ならびに主要外表面タンパク質（Ｏｓｐ）ＡおよびＢの推定アミノ末端を示す。

図１４はボレリア・ブルグドルフェリのＰ８９α（点線）およびＰ８９β（実線）（パネルＡ）ならびに０６ｐＡ（点線）および０ｓｐＢ　（実線）（パネルＢ）の推定アミノ酸配列の疎水性プロットを示す（＋値はタンパク質の親水性領域を示し、モして一値は疎水性領域を示本発明は一つにはボレリア・ブルグドルフェリ抗原タンパク質およびそれらのコード化ＤＮＡに関する。本発明のこの一面の原理的実施態様は３つのボレリア・プルグドルフェリタンパク質に関する。２つのタンパク質は５ＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された約３９ｋＤａの分子量（３９αおよび３９βと表記される）およびヒトライムボレリオシス血清との反応性により特徴づけられる。

第３のタンパク質は５ＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された約２８ｋＤａの分子量およびヒトライムボレリオシス血清との反応性により特徴づけられる。本発明はまた、少な（とも５（または６）個のアミノ酸から゛なる上記タンパク質の特定部分に関する。

３９ｋＤａおよび２８ｋＤａのタンパク質はそれらが通信結合されるタンパク質を実質的にもたない。本発明のタンパク質の実質的に純粋な形態はタンパク質精製の標準的方法論を用いて当業者により不都合な試験なしに得られる。本発明はまた、８９ｋＤａまたは２８ｋＤａのタンパク質のペプチド断片に関する。また、本発明のタンパク質およびペプチドは公知方法を用いて化学的に合成され得る。

本発明はまた、本発明の３９ｋＤａボレリア・ブルグドルフェリタンパク質または２８ｋＤａボレリア・プルグドルフェリタンパク質の全体、または特定部分をコード化するＤＮＡ断片に関する。本発明のこの一面の原理的実施態様は３９ｋＤａおよび２８ｋＤａ抗原タンパク質をコード化するボレリア・ブルグドルフェリＤＮＡのＤＮＡライブラリィから得られた６、３キロ塩基対のＥｃｏ　Ｒ１断片に関する。

本発明はまた、３９ｋＤａαボレリア・ブルグドルフェリタンパク質または３９ｋＤａβボレリア・プルグドルフェリタンパク質の全体、または特定部分をコード化するＤＮＡ断片に関する。

本発明はさらに、組換えＤＮＡ分子およびそれで形質転換された宿主細胞に関する。当該分野でよく知られた標準的方法論を用いて、ベクターおよび本発明の３９ｋＤａタンパク質の両方、３９ｋＤａタンパク質または２８ｋＤａタンパク質の一方をコード化するＤＮＡ断片からなる組換えＤＮ−Ａ分子は不都合な試験なしに構築され得る。ＤＮＡ断片はボレリア・プルグドルフエリから単離され得、そしてそれは当業者によ（知られた方法を用いて製造されたｃＤＮＡクローンの形態を採っても、またポリメラーゼ鎖反応により調製されてもよい。本発明に使用できるベクターはλＺＡＰ　ＩＬ　ｐＵＣ８または好ましくは高頻度発現ベクター例えばｐブルースクリプトｌｌ５Ｋ、ｐＮＨ８ａを包含するが、これらに限定されない。宿主細胞は原核生物（例えばバクテリア）、下等な真核生物（例えば酵母を含む菌類）または高等な真核生物（例えば哺乳動物）であってよい。

本発明はさらに、本発明の８９ｋＤａボレリア・ブルグドルフェリタンパク質または２８ｋＤａタンパク質に特異的な抗体に関する。標準的方法論を用いる当業者は３９ｋＤａタンパク質もしくは２８ｋＤａタンパク質、またはそれらの特定部分に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を生起させ得る。これはアンチｐｓＰＲ３８ウサギ抗血清により説明されている（下の実施例２参照）。

本発明はまた、ライムボレ・リオシス疾病に対して哺乳動物に使用するためのワクチンに関する。本発明のこの一面の１つの実施態様において、ワクチンに対して慣用であるように、本発明の３９ｋＤａタンパク質の両方、３９ｋＤａタンパク質または２８ｋＤａダンバク質の一方が薬学的に許容され得るビヒクル中で哺乳動物に伝達され得る。当業者が理解するであろうように、全体のタンパク質を使用する必要はない。タンパク質の特定部分（例えば３９または２８ｋＤａタンパク質の一部に相当する合成ポリペプチド）が使用され得る。本発明のワクチンは免疫応答を高めることが知られている免疫学的アジュバントを有効量で含有し得る。タンパク質またはポリペプチドは抗原タンパク質に対して免疫応答を誘導し、その結果としてライムボレリオシス感染に対して保護するのに十分な量でワクチン中に存在する。保護抗体は通常的２ないし３週間毎の２ないし３回の一連の投与により最もよく誘導される。この一連の投与は患者滴薬で抗体１厚液を循環させる場合に繰り返され得る。

本発明はさらに、ヒト薬剤および獣医薬剤に使用するための診断アッセイに関する。ライムボレリオシス疾病の診断に対して、哺乳動物の血清中の両方の３９ｋＤａタンパク質に対する抗体の存在または２８ｋＤａタンパク質の存在が決定される。当業者が認識するであろうように、多（のタイプの試験が検出のために使用され得る。

そのような試験はＩ　ＦＡ、ＲＩＡＳＲＩ　ＳＴ、ＥＬ　ＩｓＡ、凝集および赤血球凝集を包含するが、これに限定されるものではない。診断アッセイは標準的プロトコル、例えばＭａｇｎａｒｅｌｌｉ等、　１９８４．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２０：１８１−１８４；　Ｃｒａｆｔ等、１９８４．　Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、１４９：　７８９−７９５；　Ｂｎｇｕａｌｌ等、　１９７１．　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ’８：　８７１−８７４；およびＲｕ５ｓｅｌ　１等、　１９８４．　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、　１４９：　４６５−４７０に記載されたブロードコルを用いて行われ得る。

１特に、本発明の診断アッセイは表面（すなわち固体支持体）例えば微量滴定プレートまたは膜（例えばニトロセルロース膜）に両方の３９ｋＤａタンパク質（天然または合成）、３９ｋＤａタンパク質（天然または合成）または２８ｋＤａタンパク質（天然または合成）のいずれかの全体または特定部分をコーティングし、そしてライムボレリオンス疾病を有する疑いのある患者からの血清と接触させることにより構成され得る。表面とそれに特異的な血清中の抗体とで形成される生成複合体の存在はこの分野では共通のあらゆる公知方法、例えば蛍光抗体分光法または比色分析法により検出され得る。

本発明の診断アッセイのもう一つの実施態様において、両方の８９ｋＤａタンパク質、３９ｋＤａタンパク質または２８ｋＤａタンパク質のいずれかの全体または特定部分は例えばベントナイトまたはポリスチレンラテックスの不活性粒子に結合される。該粒子は例えばプラスチック凝集器のウェル中の患者血清と混合される。患者血清中の抗体の存在または不在はウェル中で粒子の沈殿パターンを観察することにより決定される。

本発明の診断アッセイのさらに別の実施態様において、血清試料中の８９ｋＤａタンパク質または２８ｋＤａタンパク質の存在または不在が検出される。両方の５９ｋＤａタンパク質、８９ｋＤａタンパク質ま゛たは２８ｋＤａタンパク質のいずれか、またはその特定部分は固体表面、例えばプラスチ′ツクにコーティングされ、そして血清試熟と接触され得る。洗浄後、固定化抗体に結合した血清からのタンパク質の存在または不在は３９（または２８）ｋＤａタンパク質に対して特異的な標識化（例えば蛍光標識化）抗体の添加により検出される。

当業者は本発明が本発明に係る抗体と抗原を試料中に検出する際に競合型アッセイの使用を包含することを理解するであろう。

本発明はさらに、抗うイムボレリオシス疾病剤のスクリーニングに関する。一実施態様において、可能性のある抗うイムボレリオシス疾病剤は、ボレリア・プルグドルフェリと接触させた細胞中で３９ｋＤａタンパク質または２８ｋＤａタンパク質の発現を阻害する能力が試験される。試験薬剤で処理した暴露細胞中の３９ｋＤａタンパク質または２８ｋＤａタンパク質の存在または不在は上記標準的診断アッセイのいずれかにより決定され得る。

本発明はさらに、配列１ｄ番号１−３に示されるようなヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片、またはそれらの突然変異体、該ＤＮＡ断片を含む組換え分子および該組換え分子で形質転換した宿主細胞に関する。当該分野でよく知られた標準的方法論を用いて、ベクターおよび本発明のＤＮＡ断片を含む組換えＤＮＡ分子は不都合な試験なしに公知方法により構築され得る。Ｄ’ＮＡ断片はボレリア・プルグドルフェリから単離されるか、またはポリメラーゼ鎖反応により製造され得る。本発明に使用すまたはｐＢＲ３２２を包含するが、これらに限定されない。

宿主細胞は原核生物（例えばバクテリア）、下等な真核生物（例えば酵母を含む菌類）または高等な真核生物（例えば哺乳動物）であってよい。

本発明はさらに、組換えボレリア・ブルグドルフェリの３９ｋＤａおよび２８ｋＤａタンパク質の発現を可能にするように上記宿主細胞を培養し、そして該宿主細胞から上記タンパク質を単離することからなる上記タンパク質の製造方法に関する。組換えボレリア・ブルグドルフェリタンパク質を製造するために利用する方法論は十分に当業者の技術の範囲内である。

実施例下記の有機体と材料を実施例を通じて使用した。

細菌株、使用したＢ、プルグドルフエリ株（下記の表１を参照）は以前に記述されているかまたはジョン・アンダーソン博士（コネチカット州、ニューヘブン、コネチカット州農業実験場）、アラン・マクドナルド博士にューヨーク州、ロングアイランド、サウスハンプトン病院）、およびＭＳ、グレナ・チルトウとＭｓ、　ジュリエ・ローリンゲス（テキサス州、オースチン、テキサス保健局、研究部門、医療昆虫学課）等により提供して頂アエ（Ｂ、ｃｏｒｉａｃｅａｅ）　（Ｃｏ　５３　）　、Ｂ　、パーケリ（Ｂ、　ｐａｒｋｅｒｉ）　、　Ｂ、チュリカタ−ｒ−（Ｂ、　ｔｕｒｉｃａｔａｅ）およびＢ、アンセリ＋　（Ｂ、　ａｎｓｅｒｉｎａ）は、以前に記述されている（シュワン他、　１９８９年、　Ｊ、　ＣｌｉｎｏＭｉｃｒＣ１１ｎ０．２７：１７３４−１７３８）。ボレリア有機体は、以前に記述したようにＢＳＫ−１１培地中で３２℃で培養した（バーバー、　１９８４年、　ＹａｌｅＪ、　ＲｉａｌｏＭｅｄ、　５７：５８１−５８６）。

■ ヒトの梅毒性血清はウニイン・ホゲフレとＭ　ｓ　、ジェイン・マークレイ博士（カリホルニア州、サイプレス。

ヒルフレスト・バイオロジカルス、）から提供された；筋萎縮性外側硬化（Ａ、　Ｌ　Ｓ　）血清はジェフリ・スミス博士にューヨーク州、ニューヨーク、マウント・シナイ・メジカルセンター、ＡＬＳ臨床科、）およびアラン・マクドナルド博士にューヨーク州、ロングアイランド、サウスハンブトン病院）から提供された；そして再発性態血清はオレゴン州とワシントン州の患者から採取した。正常血清は、ロッキー山脈研究所（Ｒｏｃｋｙ　Ｍｏｕｎｔａｉｎしａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　）のｍ貝と研究所員から採取した。ヒトのライム・ボレリオシス症（Ｌｙｍｅ　ｂｏｒｒｅｊｉｏｓｉｓ）血清はアラン・マクドナルド博士により提供されそしてそれらレリオシス病（Ｌｙｍｅ　ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ）と臨床的に診断された患者から採取した。

プラスミドｐＳＰＲ３３（下記を参照）を持つ大腸菌はＡＴＣＣ（メリーランド　２０８５２．　ロックヴイレ２パークローンドライブ　１２３０１）に１９９０年２月２８日に寄託された。この有機体の寄託番号は６８２４３号である。寄託物は、特許の継続期間にわたり、寄託の日から３０年にわたりまたは寄託試料の請求の最後の日から５年間にわたり、どれよりも長（生存していなければならず、もしも生存していない場合は生存しているものと交換しなければならず、この出願から特許が発行された後は、法の規定のもとに制限なしに公衆に入手できるようになっていなければならない。特許及び商標長官は、請求によりこの供託物に到達しなければならな感染の際に、抗体感応を誘起するボレリア、ブルグドルフェリタンパク質を同定するために、ＥｃｏＲＩ断片を含有するボレリア、プルグドルフエリのＤＮＡライブラリーはλ発現ベクターλＺＡＰ　Ｉ　Ｉを持つＥ、ｃｏｌｉ中に組み込まれる。

全体のＤＮＡは、以前に報告した方法を変形して（バーバー、１９８８　、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　２６：４７５−４７８）５００ｍｌの固定相のボレリア培地から精製する。細胞を遠心分離により回収し、ＰＢＳ＋５ｍＭ　ＭｇＣｌ。

の２９ｍ１で洗浄し２．４ｍｌのＴＥＳ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０；５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１５％（Ｗ　／　Ｖ　）蔗糖）中に再けん濁する。リゾザイムを最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるようよして添加し、次いで細胞けん濁液を１０分間氷上に放置する。細胞を、Ｃ３ｍＩＴＥＳ÷１％（Ｖ／Ｖ）デオキシコリン酸ナトリウム〕を添加して分解し、室温で１０分間にわたり静かに混合する。

次いでプロテナーゼＫ（１ｍｇ）を添加し試料を３７°Ｃで１時間保持する。次いで、ＤＮＡけん濁液をフェノール−クロロホルム（１：　１　（ｖ／ｖ）　）の１容積で２回そして、クロロホルム−イソアミルアルコール（２４：　１　（Ｖ／Ｖ）　）で１回抽出する。ＤＮＡをエタノール沈積し、７０％エタノールで２回洗浄し、次いでＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，６；１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に１ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるようにして再けん濁する。

ボレリア、ブルグドルフエリ株５ｈ−２−８２からの全ＤＮＡ（１μｇ）をＥｃｏＲＩで切断し、発現ベクターλＺＡＰＩＩ（カリホルニア州、ラ　ジョル、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社）の脱リン酸化したアームにリゲートし、製造者の指示書に従ってパッケージした。

ライブラリーを、ニトロセルロース濾紙へのプラークタンパク質の吸着法〔マニアチス他、１９８２．ｒ分子クローニング：実験手引」コールド・スプリング・ハーバ−実験室刊行（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州・コールド・スプリング・ハーバ−在）に従って、にューヨーク州のロング・アイランドのヒト・ライム・ボレリア培地（ｈｕｍａｎｅ　Ｌｙｍｅ　ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ）症患者からの回復中の血清（１：１００）を使用して、免疫プロットにより、ボレリアについてスクリーニングした。

ＴＳＥ−トゥイーン（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７゜４；１５０ｍＭ　ＮａＣ１；５ｍＭ　ＥＤＴＡ；０．０５％トウィーン２０）中、２５℃で、■＃間にわたりブロックした後、濾紙をＴＳＥ−トウイーン中に希釈した血清と共に、２５℃ で１時間ゆっくりと振りながら維持する。次いで、それらをＴＳＥ−）ウィーンを４回取り替えて１時間にわたり洗浄した。そして結合した抗体を、振りながら１時間にわたり、　＋２Ｓ　ｌ−標識プロチインＡ　（５００，０００ｃｐｍ／ｍｌ）と共に濾紙を保温することにより検出した。次いで、各々の濾紙を、各回ＴＳＥ−トウイーンで１５分間、計４回洗浄し、乾燥し、コダック・Ｘ−ＡＲ５フィルムでオートラジオグラフィーした。

陽性のクローンは５％の頻度で検出された。ヒト血清と反応した一個の組換えプラークは精製したプラークでありそしてボレリアＤＮＡを担っているフチーゲミド（ｐｌｌａｇｅｍｉｄ）を、供給者の指針に従ってヘルツ５−ファージ・Ｒ４０７を利用して、λ配列から切り出した。精製したファージからのクローン化した断片の切出しは、６．３キロベース（Ｋｂ）ＥｃｏＲＩ断片を生成し、この断片はプラスミドｐＳＰＲ３３と命名された（図１）。

断片は、アガロースゲルから単離され、放射標識され、そして６個の北米と１個の欧州産のボレリア、プルグドルフェリ単離物の全部からのＥｃｏＲＩで切断した全ＤＮＡ中の同様の大きさの断片とハイブリッド形成することを示した（図２）。

組換えプラスミドｐＰｓＲ３３は地図検討のために、５００ｍ１培地からそして以前に報告したようにして（シンプソン他、　１９８７．　Ｉｎｆｅｃｔ、　ｉｎ＋＋＋＋ｏｎ、　５５：２４４８−２４５５）精製したが、１８℃で４時間にわたり７０，０００ｒｐｍでベックマン・ＶＴｉ８０・ロータリー中で、２回連続して染料−浮遊密度勾配（ブラスターク他、　１９８５．Ｎａｔｕｒｅ　３１８：２５７−２６３）　を実施した点が異なる。

超ラセン環状プラスミド部分は、臭化エチジウムを除いた後２容量の水で希釈して、次いでエタノールで沈積した。プラスミドのＤＮＡを次いでＴＥの最少容積中にけん濁した。陽性クローンのミニ−プラスミド調製〔マニアチス他、１９８２．ｒ分子クローニング：実験手引」コールド・スプリング・ハーバ−実験室刊行（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバ−在〕は、ＥｃｏＲＩで切断した後のアガロースゲル電気泳動により検査し、挿入部分の大きさを測定した。

７個の同様な分離物からの未切断ＤＮＡのサザンブロッティング法による解析は、６，３Ｋｂ断片がクロモシームＤＮＡと強固にハイブリッド形成していることを示した（図３）。未切断の全ＤＮＡを、０．４％アガロースゲル中で電気泳動した（１６時間にわたって１２ｖ）。

アガーロスゲルからニトロセルロースへのＤＮＡの移転、高ストリジェンシイハイブリッド形成（ｈｉｇｈ　ｓｔｒｆｎｇｅｎｃｙ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉａｎ）　（これは１０％の塩基対ミスマツチを許容する）、およびオートラジオグラフィーを含むサザンブロッティング法は、以前報告した通りであるが（スバニール他、　１９８３．　Ｖｉｒａｌｏｇｙ　１３０：５１４−５２２）　、前ハイブリッド形成とハイブリッド形成緩衝液と温度はシュワン他により報告されたとおりである（シュワン他、１９８９、　、ｌ　Ｃ１１ｎ、　Ｍｆｃｒａｂｉｏｌ、　２７：　１７３４−１７３８）。

ＤＮＡプローブを、ジーン・クリーン（Ｇｅｎｅ　Ｃ１，ｅａｎ）〔カリホルニア州、う・ジョラ、バイオ　１０１社（ＢＩＯ１０１，Ｉｎｃ、）製）を使用してアガロースゲルから回収し、製造者の指針（メリーランド州、ゲイテスブルグ、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−製、ニックトランスレーションキット）に従ってニックトランスレーションにより［α−”ＰＩ　ｄＣＴＰ　（３，００ＱＣｉ／ミリモル）で標識した。プローブを４分間煮沸し、ハイブリッド形成緩衝液に添加する直前に氷上冷却した。

制限エンドヌクレアーゼは、ボエリンガー・マンハイム・バイオケミカルス社（インジアナポリス、インジアナ州）から購入し、そして切断は製造社が推奨したようにして行った。

アガロースゲルにおいて、外来断片を導入したＤＮＡを含みそして５ｈ−２−８２株からの４９Ｋｂ直鎖状プラスミドより僅かに遅く移動する滲んだバンドは、クロモシームＤＮＡであると推定された。Ｂ、ヘルムシ、Ｂ、パーケリ、Ｂ、アンセリナ、Ｂ、チュリカタエ、およびＢ。

コリアシアエを含む追加の５種のボレリア種は６．３Ｋｂ断片にハイブリッドしなかった（図２）。これらのデータは、ｐｓＰＲ３３挿入配列は、染色体的に配置されそしてボレリア、ブルグドルフェリに特異的であることを示している。

実施例２．複製されたボレリア　ブルグドルフェリ蛋白ライブラリーを検索するために使用されるヒト血清と反応するｐＳＰＲ３３によってコード化された特異的な蛋白質を同定するために、ｐＳＰＲ３３を持っているイー、　コリの全細胞溶解物を５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノプロットによって分析した。

ｐｓＰＲ３３を持っているイー、コリの全細胞溶解物に対して製造されたウサギ血清（抗＝ｐＳＰＲ３３）又はベクター　ｐＢ１ｕｅスクリプト　ＳＫを持っているイー、コリの全細胞溶解物に対して製造されたウサギ血清（抗−イー、　コリ）は、下記の如く製造した。

１６時間培養液から回収したバクテリア細胞を一回洗浄し、次いで最終濃度１０ ″細胞／　ｍ　Ｉとするために燐酸塩を用いて緩衝化された生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。この細胞を５６℃で３０分同インキュベートすることによって殺し、次いで氷上で音波を付与する〔出力４で２分間；ブロンソン　ソニファーーセル　ディスラブター　Ｌ　８５　（Ｂｒａｎｓｏｎ　５ｏｎｉｆｆｅｒ−Ｃｅｌｌ　ＤｆＳｒｕｐｔｅｒ　１８５〕ことによって破砕した。ニューシーラント白ウサギを細胞音波破砕体１．５ｍｌを用いて筋肉内注射によって免疫化しく補助薬なし）、次いで第一免疫化２１日後及び４２日後に同一イムノゲンを用いて補助注射した。

血清をその後４箇月間２週間ごとに採取し、分割し、そして５ｍｌアリコツトに５００ｍ１培養液から採取したイー、コリ株ＸＬＩ−ｂｌｕｅ細胞〔ストラタジェン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　）を吸収させ、次いで回転しなから３７°Ｃで４時間インキュベートした。前記バクテリアは、ＶＴｉ８０ローター中で４０００Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離して除去した。前記方法を２回繰り返し、次いで吸収された血清を無菌の０．２２μｍフィルター〔ミリボア　コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐａｒｅ　Ｃａｒｐ、　）　、メッドフォード（Ｍｅｄｆｏｒｄ　）　ｒ　マサチューセッツ〕を通して濾過し、次いで一２０°Ｃで貯蔵した。抗＝ｐＳＰＲ３３及び抗−イー、コリ血清は、各々１：５００及び１：５０に希釈して使用した。モノクローン性抗体Ｈ５３３２（バーボー（Ｂａｒｂｏｕｒ　）他、１９８３年、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ。

４１　ニア９５−８０４）、Ｈ５ＴＳ　（パーボー他、１９８４年、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　４５　：　９４−１００　）　、及びＨ９７２４（パーボー他、１９８６年、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５２：５４９−５５４）は、１：１００に希釈して使用した。

ライム　ボレリア症及び回帰無血清のＩＦＡ価は、前サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２１６：１３１７−１３１９）。

ボレリア　ブルグドルフエリ株Ｂ３１及びボレリア　へルムシイ株ＨＳＩは各々、ＩＦＡ試験における抗原として使用された。

全細胞溶解物のイムノプロット分析は、下記の如く製造した細胞以外は基本的に前記の如（行った〔シュワン（Ｓｃｈｗａｎ）他、１９８９年、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５７　：　３４４５−３４５１）。細胞を遠心分離（８０００Ｘｇで５分間）によって液状培養物から回収し、次いで６００ｎｍで光学密度０．２を与えるためにＰＢＳ中に再懸濁させた。前記懸濁液２ｍｌからの細胞を遠心分離によって再回収し、次いで蒸留水１００μｍ及び試料緩衝液（０゜２Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ６，８；３０％（ｖ／ｖ）グリセロール；３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ　：　０．００２％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー〕　５０μ工中に再懸濁させた。

次いで試料を４分間沸騰させ、そして２０μｍを１２゜５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載置した。　＋２ｂＩ蛋白質Ａを使用するゲル電気泳動法、イムノプロット分析、及び結合された抗体の検出は報告されている（シュワン他。

１９８９年、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、５７　：　３４４５−８４５１）。

ｐＳＰＲ３３イムノプロットプロフィール中の２８ｋＤａ（Ｐ２８）抗原及び３９ｋＤａ　（Ｐ３９）抗原は、前記ベクターのみを持つイー、コリ細胞の溶解物中に）。前記ベクターのみを持つイー、コリの全細胞溶解物に生じた抗血清（抗 −イー、コリ血清）は、１：５０の希釈度の場合にはＰ２８又はＰ２Ｏと反応しなかった。前記２種の蛋白質は、それ故、本来のイー、コリ成分とは抗原的に無関係であり、且つ複製されたボレリア配列によってコード化されることは明らかである。Ｐ２８及びＰ２Ｏは、これらが他（更に多量のイー、コリ蛋白質）と共移動するので、クマシー　ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｊｅ　ｂｌｕｅ）又は硝酸銀を用いて染色された５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル中に溶解され得なかった。

Ｐ２８及びＰ２Ｏと同一寸法の蛋白質が、ボレリアブルグドルフェリ株５ｈ−２ −８２の細胞溶解物中にイムノプロット分析によって検出された（図４）ということは、Ｐ２８及びＰ２Ｏが前記味によって表わされるということを示唆している。全細胞溶解物中に見られる２８ｋＤａ及び３９ｋＤａが各々遺伝子生成物Ｐ２８及びＰ２Ｏと同一であった場合の決定のために、ｐＳＰＲ３３を持つ細胞に対して生じる抗血清（抗−ｐｓＰＲ３３血清）を１種のヨーロッパ産及び１９種の北アメリカ産ボレリア　ブルグドルフェリ単離体のウェスタン　プロットされた全細胞溶解物を用いてインキュベートし、次いでＰ２８及びＰ２Ｏを産生するイー、コリ単離体と比較した（図５）。２０種のボレリア単離体の全てが、Ｐ２Ｏと共移動した３９ｋＤａを発現した。２８ｋＤａ蛋白質も検出されたが、しかしＰ２Ｏに結合した抗体よりも前記蛋白質に結合した抗体の方が相当に少なかった。

ｐＳＰＲ３３によって産生されたＰ２Ｏも、ボレリアブルグドルフェリ株５ｈ− ２−８２に実験的に感染させた５匹の自足マウス〔ベロミスクス　レウコブス（ＰｅγＯ＊ｙｓｃｕｓ　Ｌｅｕｃｏｐｕｓ　）　）から得られた血清と反応するが、しかし前記動物から得られる予め免疫化された血清、又はイー、コリにのみ感染したマウスから得られた血清とは反応しなかった。ボレリアの他の種は、用いた条件下ではＰ２８．Ｐ２Ｏ又は何れかの他の抗原的に関連した蛋白質の検出可能な量を産生しなかった（図５）。オートラジオグラフの延長された暴露（〉２４時間）は、全ボレリアプロフィール中に２８ｋＤａ及び３９ｋＤａ以外の弱いバンドを示すが、しかしこれらは非特異性結合に起因している。データ（ボレリアの他の種から得られたＤＮＡは、Ｐ２８及びＰ２Ｏをコード化する配列にほぼ同一である配列を欠いたという事実を包含する）は、Ｐ２８及びＰ２Ｏはボレリア　ブルグドルフェリに特異的な蛋白質であるということを示している。更に、抗−ｐＳＰＲ３３がボレリア　プルグドルフェリ抗原０ｓｐＡ（３１ｋＤａ）、Ｏｓｐ　Ｂ（３４ｋＤａ）又は４１ｋＤａフラゲリンと反応しなかったということは、前記蛋白質は抗原的にＰ２８及びＰ２Ｏとは無関係であるということを示唆している。

このことを確認するために、モノクローン性抗体Ｈ５３３２、Ｈ５ＴＳ及びＨ９７２４（図６）〔これらは各々、Ｏｓｐ　Ａ（パーボー他、１９８３年、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、４１ニア９５−８０４）、Ｏｓｐ　Ｂ（パーボー他。

１９８４年、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　４５　：　９４−１００　）　、及びフラゲリン（パーボー他、１９８６年、　ｔｎｒｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、５２：５４９−５５４）と特異的に結合する〕は、ｐＳＰＲ３３又は株５ｈ−２ −８２によって産生されるＰ２８又はＰ２Ｏに結合しなかったということが示された。

ボレリアフラゲリンに対するモノクローン性抗体Ｈ９７２４の特異性は、このモノクローン性抗体がボレリアブルグドルフェリプロフィール中の４１ｋＤａバンド、及び３９ｋＤａバンド〔これは、ボレリア　ブルグドルフエリプロフィール中のそのフラゲリン（パーボー他。

１９８６年、　Ｉｎｆｅｃｔ、　ｆｍｍｕｎ、５２　：　５４９−５５４）　ニ相当する〕に結合するのみなので、図６より明らかである。更に、電子顕微鏡及びコロイド状金染色を使用して、モノクローン性抗体Ｈ９７２４はボレリア　ブルグドルフェリから得られたエンドフラゲリンに結合するが、他方、抗−ｐＳＰＲ３３は結合しないということが判った。

実施例３、ライム　ボレリア症血清と複製されたボレリア蛋白質との免疫反応性Ｐ２８及びＰ２Ｏが免疫優性蛋白質である可能性を試験するために、ライム　ボレリア症を有すると臨床的に診断された患者から採取された９４種のヒト血清を、１：１００の希釈度において複製されたＰ２８及びＰ２Ｏに対する反応性に関して試験した。全細胞溶解物は、上記実施例において既に述べた如く、５ＤＳ− ＰＡＧＥゲル中で電気泳動され、次いでウェスタン　プロットされイー、コリ、ベクター及びボレリア　ブルグドルフエリ株５ｈ−２−８２のみを持つイー、　コリのためのレイン（１ａｎｅ）を含むように、等しい細片に切断した（ゲル当たり５枚）。各細片を、抗−ｐＳＰＲ３３血清を用いてインキュベートした各ゲル当たり１枚の細片を除き、異なるヒト血清を用いてインキュベートした。前記後者の細片は、Ｐ２８及びＰ２Ｏの位置に対するマーカーとして役立つ。ＩＦＡ価≧１：２５６を有する３３種の血清の全て（１００％）、ＩＦＡ価＝１：１２８を有する１７種の血清のうちの１３種の血清（７６％）、及びＩＦＡ価≦１− ６４を有する４４種の血清のうちの１４種の血清（３２％）がＰ２Ｏと反応した（下記表２参照）。

陽性 ≧１＋２０４８　５　５１：！０２４　８　８１　コ　５１２　９　９１：１２８　１７　１３１：６４　１０　４ ≦１：１６　２５　５合計　９４　６０Ｐ３９と反応するヒト血清に対するイムノプロットの例（矢印ｌ）を図７に示す。Ｐ２Ｏと反応する全血清に対するボレリア　ブルグドルフエリプロフィール中に、強く反応している５８−６５ｋＤａバンドが観察されたが（図７．バンドＡ）、しかし抗＝ｐＳＰＲ３３血清はゲルのこの領域中ではバンドと反応しないので（図５）、Ｐ２Ｏ及び５８−６５ｋＤａ蛋白質（群）は恐らく無関係である。

Ｐ２８は幾つかの血清と強く反応することが明らかであるが（図７Ｂ、バンドＢ）、他のより反応性の小さい血清においては、血清がＰ２８又は幾つかの他の蛋白質と反応したかどうか明らかではない。これは、前記血清も共移動しているイー、　コリ蛋白質〔これは、より長いオートラジオグラフの暴露によって検出された（図７Ａ、バンドＢ））と反応するということに起因しシリア症血清と反応するか明らかではないが、Ｐ２Ｏに対する抗体がＩＦＡ価≧１：２５６を有する全ての血清特に、Ｐ２Ｏと反応性の多数の血清は４１ｋＤａフラゲリンと反応することが明らかではなかった（図７Ａ及び図７Ｂ）。この観点から、Ｐ２Ｏに対する抗体はボレリア　ブルグドルフェリの全細胞溶解物を使用するイムノプロットによってヒト血清を試験する場合にフラゲリンに対する抗体として間違えられ得なかった。Ｐ２Ｏはイムノプロットによってボレリア　ブルグドルフェリに対して特異的であることが示されたので、対照血清〔これは、５人のＡＬＳ患者、５人の梅毒患者、５人の回帰熱患者及び１０人の健常な個人（かれらは、臨床的な病気の症状を全く示さなかった）から得られた血清を包含する〕が１＝５０の希釈度において複製されたＰ３９蛋白質と反応しなかったということは驚くべきことでない（下記表３参照）。梅毒血清に対するイムノプロット知見を図８に示す。前記データは、Ｐ２Ｏがライム　ボレリア症の患者から採取された血清に対して抗原特異性を有するということを示唆している。このことは、試験された梅毒血清及び回帰熱血清の両方が非常に高いＩＦＡライム　ボレリア症価を有するという事実にもかかわらず（下記表３参照）、それ故、殆どの同様に含まれる交叉反応性抗体は他のボレリア　ブルグドルフエリ抗原に結びつく。

梅毒Ｐ３９の免疫優性、並びに免疫特性に関する及び感染性に関するボレリア　ブルグドルフェリの毒性因子である前記抗原の潜在力は、Ｐ３９発現のための遺伝子ベースの一層のキャラクタリゼーションを与える。

実施例４．ｐＳＰＲ３３サブクローン及び欠失分析１１種のサブクローンは、親構成体ｐＳＰＲ３３に関する６、３ｋｂ　ＥｃｏＲＩ挿入体中のＰ３９部位の近似的部分を決定するために構成した。エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩＳＣ１ａｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ及ＵＰｓｔｌを、製造方法［ボーリンジャー　マンハイム　バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　）に基づいて、種々の制限フラグメント〔これは、次いで適切な酵素又は酵素の組み合わせを用いて、線形化ｐＢ１ｕｅスクリプト　クローニング　ベクター（ストラタジェン）に結合した〕を製造するために使用した。

４．４ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｃ１ａｌフラグメントをベクターに結合し、次いでＤｌ５　アルファ　ニジエリチアコリ（Ｄｌ５　ａｌｐｈａ　Ｅ！５ｃｈｅｒｉｃｂｉａ　ｃｏｌｔ）反応性細胞〔ベテスダ　リサーチ　ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　）及び選定されたｐＳＰＲ３８に転換した（図９）、２．３ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｌＩＩフラグメントは、サブクローンｐＳＰＲ４５を産生した；５．Ｏｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントは、サブクローンｐＳＰＲ４６を産生した；３．３ｋｂ　Ｐｓｔｌフラグメントは、サブクローンｐＳＰＲ４４を産生した；１．４ｋｂ　Ｐｓｔｌフラグメントは、サブクローンｐＳＰＲ４２を産生した。追加のサブクローンを、サブクローンｐＳＰＲ４５においてＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌ　ＩＩ　ＤＮＡフラグメントのＨｉｎｄｌｌｌ末端から配列一度ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉを消化させ、フラグメントを短縮するための時間の長さを増加させるためにデオキシリボ核酸（Ｄｎａｓｅ　）を用いた。新しい末端をＤＮＡポリメラーゼを用いて処理し、次いで線形化された、末端鈍化ベクター（ｐＢ１ｕｅスクリプト）に結合させるために前記末端を鈍くするためにヌクレオチドを添加した。連続的に処理することによって、サブクローンｐＳＰＲ５１、ｐＳＰＲ５４，１）ＳＰＲ５７、及びｐＳＰＲ５９を構成した（図９）。

クローンがＰ３９を発現したかどうかを決定するために、Ｐ３９欠失の発現分析及びサブクローン変法（図９）をポリクローン性抗−Ｐ３９血清（ｌｒｉｒ記の抗−ｐＳＰＲ３３）、モノクローン性体Ａ６及びＤｌ並びにウェスタン　プロット化全細胞溶解物に対して行った。Ｐ３９抗原に対して２種のモノクローン性抗体が、当業者にとっての標準技術を使用して産生された。組み換えｐＳＰＲ３３を含むニジエリチア　コリ細胞を、ＢＡＬＢ／ｃ実験マウスに対して腹腔内的に接種した。１箇月後、このマウスに同一接種物を補助注射した。補助注射１週間後、マウスから得られた血清試料を抗−Ｐ３９抗体のためにウェスタン　プロット分析によって試験し、次いでマウスセロポジティブを組み換えイー、コリを用いて再び補助注射した。３日後、勝臓を除去した。膵臓細胞を分離し、次いで３７℃、８％ＣＯｔで、ＨＹ培養媒体中にハイプリドーマ細胞５Ｐ−２０とともに溶解した。

成功した溶解液を、次いで９６−穴ミクロ滴定プレート中で制限希釈によって複製した。陽性細胞培養物の組織タン　プロット分析によって試験した。前記分析のための２種のクローン陽性、選定されたＡ６及びＤｌを、前記の如くＰ３９抗原の続く分析及びｐＳＰＲ３３の種々のサブクローンの発現に関して使用した。

抗−Ｐ３９抗体のためのウェスタン　プロット分析によって種々の抗血清及びモノクローン性抗体を試験するために、ｐＳＰＲ３３を用いたイー、コリ組み換え体を２−メルカプトエタノール中で加熱することによって第一に溶解し、次いで１２．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で６時間電気泳動した。次いでこのゲルを、イー、コリ組み換え体蛋白質をニトロセルロース膜上に転移させるために３時間トウビン系（Ｔｏｗｂｉｎ　ｓｙｓｔｅｍ　）とともにエレクトロプロットした。転移後、イムノグロブリンの非特異性結合を減少させるために、前記膜をＴＳＥ−Ｔｗｅｅｎを用いてブロックした。次に、前記膜を適する試験血清又はモノクローン性抗体中に浸漬し、次いで１時間揺すりながら室温でインキュベートした。

前記膜を次いで水で濯ぎ、次に膜上の抗原に結合された抗体を標識するために１２６Ｉ−蛋白質への溶液中でインキュベートした。インキュベーション及び過剰の標識を洗い流した後、前記膜を乾燥し、次いで抗−Ｐ３９抗体のオートラジオグラフ的検出のためにコダック（Ｋｏｄａｋ　）ＸＡＲ−５フイルム上に載置した。同様な分析を、他のサブクローンについても行った＠ローンｐＳＰＲ３３としてＰ３９の同一量を発現した。

このことは、プラスミドｐｓＰＲ５１はＰ３９を発現するが、他方、プラスミドＩ）ＳＰＲ５４はＰ３９を発現しないという事実と合わせて、我々は、Ｐ２Ｏのための遺伝子はＲａｍＨＩ部位とＨｉｎｄｌ工Ｉ部位との間にあると結論付けた（図９．黒捧）。クローンｐｓＰＲ５１及びｐＳＰＲ４５の細胞溶解物と一緒になったＰ２Ｏの量は、Ｐ３９陽性であった他のクローンよりも少ない。

このことは、遺伝子部位の右側に対する配列は全発現のために重要であるということを示唆した。Ｐ２Ｏは、他のＰ３９産生クローン（例えばｐＳＰＲ３８）の配向に対して反対の配向中に挿入体を含むクローン（ｐＳＰＲ４６）によって産生された。それ故、発現又はＰ２Ｏは、Ｌａｃプロモーターに依存しなかった（図９．逆矢印）。

ｐＳＰＲ３３及び選定されたｐｓＰＲ４４からサブクローン化されたｐｓｔ１フラグメントは、Ｐ２Ｏの検出可能な量を発現しなかった。それ故、Ｐ３９遺伝子は左側から右側に転移すると仮定された。我々は、付加的配列は２種の遺伝子（これらは、類似するがしかし異なる抗原を発現し且つこれらは、イムノプロット分析において３９ｋＤａバンドに結合する抗体の量を全体として増加させる）の第二番目に相当すると推定している。プラスミドｐＳＰＲ４４は、ポリクローン性抗−Ｐ３９血清と反応性の如何なる抗原も発現しなかったので、ブラックボックス（図９）の右側に位置した第二番目の遺伝子の発現は、第一番目の遺伝子の転移に依存するかも知れない。

実施例５　Ｐ２Ｏをコード　する　−一のＤＮＡ　ケＤＮＡ配列（図ｉｏ）は、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄｒｌＩフラグメント（図９、ブラックボックス）について図１１ｂに要約された方策により決定された。本質的には、配列は、普遍的なＭ１３プライマー、およびサブクローンｐＳＰＲ４６、ｐＳＰＲ４４およびｐＳＰＲ４５、およびプラスミドｐＳＰＲ４５のＭｕｎｇ　Ｂｅａｄヌクレアーゼチー変体ｐｓＰＲ５１、ｐＳＰＲ５４、ｐＳＰＲ５６およびｐＳＰＲ５７を使用して決定されたＤＮＡ配列から考案されたプライマーを使用して得られた。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の右側のＤＮＡ配列は、実存する配列情報より考案されたプライマーを使用して決定された。

ＤＮＡ配列は、最初、Ｍ１３晋遍プライマーおよびクローニングベクターの入手可能な配列を用いる使用のために考案されたプライマーを使用することにより得た。配列化反応を行なうためのプロトコルは、Ｕｎｉｔｅｄ　ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌにより提供されたもの（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ−Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０　：　５ｔｅｐ−Ｂｙ−３ｔｅｐ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＷｉｔｈ　５ｅｑｕｅｎａｓｅ　”　Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０　−　５ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）　と正にそのものであった。配列化反応は、小、さいプラスチック遠心分離管内で行なった。各反応体積は、１ＯＮ１でありそしてプライマー、緩衝液およびプライマーを鋳型にアニールするＤＮＡを含むものとした。標識化は、シークヮナーゼ（５ｅｑｕｅｎａｓｅ）、８Ｓ− ｄＡＴＰ、および別の緩衝液を加えることにより行なった。Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ反応の終止は、停止溶液を加えることにより行なった。その後試料は、７０−８０℃に２分間加熱しそしてその後各混合物の２−３　Ｎｌをゲルの各レーンに加えた。全ての配列化ゲルは、６％アクリルアミド−７Ｍ尿素−１ｘＴＢＥでありそして２時間または４時間の間走査した。走査の後、ゲルは、５％酢酸−１５％メタノール中に固定して尿素を除去した。その後ゲルは、８０℃にて、真空下紐いてＫｏｄａｋ　ＸＡＲ−５フイルム上に置いて乾燥した。その後＃露されたフィルムは、オートラジオグラフィー帯について分析して、配列を決定した。各反応の末端配列は、次の配列化反応における使用のための新しいオリゴヌクレオチドブライマーを生成するのに使用した。従って、ＤＮＡの各ストランドの全配列は、以前の反応により決定されたプライマーを使用して継続的な延長を通して決定した。実施例によって、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１の域からの２０ヌクレオチドの合成プライマーは、約３００塩基の配列に構築そして実用することができる。

その後他のプライマーは、減じた配列から構築することができる。かかる技術は標準でありそして当業者に知られているであろう。

完成されたＤＮＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１．）の分析は、２つの転写解読枠（図１０ａ）を表わした。遺伝子１は枠１の中にそして遺伝子２は枠２の中にあった。他の重大な転写解読枠は検出されなかった。ＤＮＡ配列は、遺伝子１が転写された第一遺伝子であると思われるので、それによりコード化されたタンパク質についてのＡＴＧ開始コドンのアデニン残基から番号を付けた。この転写解読枠（ヌクレオチドエないし１０２０）はクローンｐｓＰＲ５１により表現されたＰ２Ｏの最初の１５個のアミノ酸を配列化することにより確認された。このクローンは、遺伝子２を欠失しており、そして従ってその遺伝子産生物は、タンパク質配列化の量検出されなかった。遺伝子ｌは、３６．９２６　ｋＤａの計算された分子量をもつ３３９個のアミノ酸のタンパク質に相当する。この遺伝子は、ヒトライム病患者から集められた１０個の血清標本全てと反応するが、１０個の健常者の対照標本とは反応しない（データ図示せず。）ところのタンパク質をコード化するので、このタンパク質はＰ２Ｏに等しいものと思われた。ヒト血清ともまた反応し得る同様の分子量をもつ第２遺伝子産生物が存在するがゆえに、以前に記載されたＰ３９抗原は−のタンパク質ではなく二つのタンパク質（３９α および２９Ｂ）であると決定されていた。これは、両遺伝子が存在するとき、Ｐ３９シグナルが高まるように見えるところの、図９に示される表現データにより示唆されている。

遺伝子２の転写解読枠（ヌクレオチド１１０７ないし２１３２）はＰ３９βと指定されてきた。この遺伝子、の転写解読枠はＰ３９αの下流側の１１６個のヌクレオチドに始まりそして３４１個のアミノ酸のタンパク質（３７，５０６ｋＤａ）をコード化する。Ｐ３９αにおける開始コドンへのプロモーター５゛は古典的な一１０域および一３５域に存在するとともに、　Ｐ３９βは認識可能なプロモーター配列に欠けていると思われていた。しかしながら、両遺伝子とも、推定上のリボソーム結合部位を開始コドンの間近の５゛に有しそして各々は位置１０１８および位置２１３０にて夫々ＴＡＡコドンで末端となっていた。推定上のプロモーターおよびリポソーム結合部位は、ｏｐｓＡ−オペロンおよびフラゲリン遺伝子を含むボレリアブルグドルフエリからの他の遺伝子と関連したものに近似している（　Ｗａｌｌｉｃｈ、　Ｒ，、ＳＥ、　Ｍｏｔｅｒ、　Ｍ、　Ｍ、　５ｉｉｏｎ、　Ｋ、　Ｅｂｎｅｔ、　Ａ、　Ｈｅｉｂｅｒｇｅｒ、　ａｎｄＭ、　Ｄ、　Ｋｒａｎ＋ｅｒ、　１９９０．　Ｔｈｅ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉｆｌａｇｅｌｌｕｍ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　４１　ｋＨｏｄａｌｔｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎ（ｆｌａｇｅｌｌｉｎｌ；　ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ、　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　ｒｍｍｕｎ　５８　；　１７１１−１７１９１゜フラゲリンをコード化する遺伝子、０ｓｐＡおよび０ｓｐＢとは異なり、ステムループ構造は、Ｐ３９αおよびＰ３９βのいずれの３゛末端にて検出されず、これは、末端は配列されているものの外側にあり得ることを示唆するものである。にもかかわらず、ボレリアブルグドルフエリを含め、多くの細菌における転写末端部位によれば、この部位はＡＴ豊富であり、これは末端がヌクレオチド２１７０の近くにあることを示唆してい、る。

ニードルマンアンドムンシュグロバルアラインメントプログラム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｍｕｎｓｃｈ　ｇｌｏｂａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｍｕｎｓｃｈ　、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　；　１４８　：　４４３−５３　（１９７０１）により　Ｐ３９αおよびＰ３９βのＤＮＡ配列を比較すると、それは、これらの遺伝子が６２％ＤＮＡ配列類似性を有することを示している。重大な配列類似性は、　Ｐ３９遺伝子と０ｓｐＡ　− ０ｓｐＢオペロンまたはフラゲリン遺伝子との間で検出されなかった。Ｐ３９オペロンのコドン優先とＧ十Ｃ含量分析は、それと他のボレリアブルグドルフエリ遺伝子との間で重大な差異が無いことを示しボレリアブルグドルフェリ菌株Ｂ３１および５ｈ−２−８２からの全ＲＮＡのノーザンプロット分析（図１２）は、Ｐ３９ａ座と　Ｐ３９β座の中間のＰｓｔＩ−）１ｉｎｄｌＩＩフラグメント（図１１）を用いてプローブした。このプローブは、単一の２．３５　ｋｂメツセージを検出し、またＰ３９αおよびβｍＲＮＡはポリシストロン性であること、そしてＰ３９αおよびＰ３９βは−のオペロンを構成すること（Ｆ３９）を確認するものである。この結論は、Ｐ３９βは認識可能なプロモーターをもつとは思われないことを示すところの上記したＤＮＡ配列データにより支持されている。

さらに、これは、完全なＰ３９βをもつがＰ３９αについてのプロモーターに欠けるところのクローン（例えば、ｐＳＰＲ４４）が、多クローン性抗−Ｐ３９血、清と反応活性である抗原（抗−ｐＳＰＲ３３）を表現しないことの理由をブルグドルフェリフラグメントに交雑しないことを示している（図１２）。０ｓｐＡおよび０ｓｐＢのアミノ酸組成からは別個であるけれども、Ｐ３９αおよびＰ３９βのアミノ酸組成は同様であるが（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２および３、表４）。

Ｆ３９（２およびＰ３９βは、相対的に多量のイソロイシン、プロリン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、およびメチオニンを含有していた。さらに、リシンおよびトレオニンは、０ｓｐＡおよび０ｓｐＢ中において多量に存在するが、ずっと小部分のＰ３９αおよびＰ３９βを構成するものである。Ｐ３９α と　Ｐ３９βとの間において、主要な相違は、後者のタンパク質における３システイン残基と前者のタンパク質における４ヒスチジン残基とにある（表４）。

表４．　Ｐ３９オペロンによりコード化されたタンパク　のアミノ酸Ｐ３９α（％）Ｐ３９β（％）アラニン　２５　（７，４１２２（６，５１システイン　ｌ　（０，３１３（０，９＋アスパルチン酸　２０　（５，９１２１Ｆ６．２１グルタミン酸　２６　（７，７１２１（６，２＋フエニルアラニン　１６　（４，７１１６（４，７１グリシン　３３　（９，７１３２（９，４１ヒスチジン　４　（１，２１１Ｆｏ、３１イソロイシン　３７　（１０，９１４３Ｆ７．６１リシン　３０　（８Ｊ）　２６　（７，６）ロイシン　３２　（９，４＋　２６　（７，６１メチオニン　５　（１，５１６（１，８１アスパラギン　１７　（５，０＋　２１　（６，２１プロリン　８　（２，４１７Ｆ２．１１グルタミン　４　（１，２１７（２，１１アルギニン　７　Ｆ２．１１　９　（２，６１セリン　２９　（８，６１・　３０　（８，８１トレオニン　１２　（３，５１５ｆｌ、５１バリン　１８　Ｆ５．３＋　２５　（７，３１トリプトフアン　１　ｆｏ、３１　、　２　ｆｏ、６１＊＊＊＊＊＊＊Ｐ３９β２ライン０ｓｐＡ８よび０ｓｐＢは、テトラペプチドＬｅｕ−Ｘ−Ｘ− Ｃｙｓ　（式中、Ｘは通常いかなる中性アミノ酸を表わす。）により定まる推定上の開裂部位を含む古典的シグナルペプチドを有する（図１３）、Ｐ３９βについては、ｌｅｕ残基は位置１２にありそしてシスティンは位置１５にある（ＳＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ、１　）　、またＰ３９ａは埋水性Ｎ−末端基（図１４）およびシスティンを同様の位置に（位置１８）有するけれども、このタンパク質は、テトラペプチドを有しておらず、これは、その推定上のシグナル配列がＰ３９βにおける対応する部位のそれと異なる方法により加工されることを示唆するものである。　Ｐ３９αおよびＰ３９βはシスティンを０ｓｐＡおよび０ｓｐＢにおけるシスティンのそれと同じ位置と近いところに有し、またそれは後二者のタンパク質がその部位でアシル化されていることを予測してきたので、Ｐ３９αおよびＰ３９βもまた、そのＮ−末端システィン残基のアシル化のため、リボ蛋白であろう。

Ｐ３９αと　Ｐ３９　Ｂとのアミノ酸配列を比較すると、５２％の配列同一性がみられた。これは、報、告された０ｓｐＡと０ｓｐＢとの間の５３％類似性と同様である。驚くべきことにそして０ｓｐＡおよｐＯｓｐＢについて見出されたものとは対照的に、Ｐ３９オペロンタンパク質は、大変類似した本漬療法プロットを有する（図１４）。これは、高い程度の配列類似性に沿い、二つのタンパク質が免疫原性を有する相当数の同じエピトープを分かち持つことを示している。０ｓｐＡについて生じた抗血清は、０ｓｐＢと反応し得るであろうし、これは、アミノ酸レベルにて重大な同一性をもつＰ３９αおよびＰ３９βに似たタンパク質が交差反応性エピトープを分かち持つであろうことを示している。

免疫優性抗原Ｐ３９をコード化する遺伝子要素は、同定されそして配列された。

この要素は、二つの同様サイズのタンパク質をコード化するオペロンを構成し、また相当なアミノ酸配列類似性を有する二つの遺伝子、Ｐ３９αおよびＰ３９β 、であることが示された。これは、ボレリアブルグドルフェリにおいて染色体複製起点を有する推定上の膜タンパク質をコード化するオペロンについての最初の報告である。α体およびβ体の両方とも、感染された動物からの抗体がウェスタンプロットにおいてＰ３９帯に結合する場合に、シグナルに寄与すると思われる（Ｓｉｍｐｓｏｎ、　Ｗ、Ｊ、、　Ｗ、　Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ、　Ｍ、Ｅ、　Ｓｃｈｒｕｍｐｆ、　Ｒ。

Ｈ，Ｋａｒｓｔｅｎｓ、　ａｎｄ　Ｔ、Ｇ、　Ｓｃｈｗａｎ、　１９９１．　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｏ　ａ３９　ｋＤａ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ　ａｎｔｉｇｅｎ　（Ｐ３９）　ａＳａｍａｒｋｅｒ　ｆｏｒ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ　ａｎｄｎａｔｕｒａｌｌｙ　１ｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ａｎｉｍａｌｓ、　Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ　２９：２３６−２４３．　Ｓｉｍｐｓｏｎ、　ＷＪ、、　Ｍ、Ｅ、　Ｓｃｈｒｕｍｐｆ、　ａｎｄ　Ｔ、Ｇ。

Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ　２８：１３２９−１３３７、　）。このことは、すべてのライム血清がα体および３体の両方に十分均等に反応するかどうか、あるいはある血清はそれと反応しそして他のとは反応しないのかどうかの疑問を引き起こすものである。

Ｐ３９αおよびＰ３９　Ｂの機能は知られていないが、予測されたアミノ酸配列から演鐸されたいくつかの特性は、いくつかの可能性を示唆するものである。これらタンパク質は、両親媒性または）・ランスメンブランタンパク質の特性たる、疎水性と親水性とを交互に示している。膜配置に従い、単一クローン性抗体へ６を用いたボレリアブルグドルフェリの電子顕微鏡免疫分析は、Ｐ３９抗原が膜の中にまたは膜と会合していることを示している（未公表データ）。

Ｐ３９βは、それが典型的なシグナル配列と開裂部位を最初のシスティン残基にて有する点で、０ｓｐＡおよび０ｓｐＢに似ている。０ｓｐＡおよび０ｓｐＢと同様、　Ｐ３９βは、おそら（は膜会合しておりそしてＮ−末端システィンにてアクリル化されつる。しかし、なから、Ｐ３９αは、それがタイプ１認識部位に欠けるため、開裂することができないところのそのシグナル配列に関して異なるものである。仮にそうであるならば、Ｐ３９αは分泌され、得、そして従って感染の間免疫応答を刺激する抗原も分泌されつる。この概念は、分泌体が細胞と会合しているものよりも感染の初期段階の間により急速に蓄積するので、抗−Ｐ３９抗体が感染体とより容易に会合するようにみえるというより以前の観察を説明するのに役立つであろう（Ｓｉｍｐｓｏｎ。

１１、、胃、Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ、Ｍ、Ｅ、Ｓｃｈｒｕｍｐｆ、Ｒ，Ｈ，Ｋａｒｓｔｅｎｓ。

ａｎｄ丁Ｇ、　Ｓｃｈｗａｎ、　１９９１．　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｏ　ａ　３９　ｋＤａ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ　ａｎｔｉｇｅｎ　（Ｐ３９１　ａｓ　ａ　ｍａｒｋｅｒ　ｆｏｒ　１ｎ−ｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ　ａｎｄ　ｎａｔｕｒａｌｌｙ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄａｎｉｍａｌｓ、Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉａ　２９：　２３６−２４３．）　。

実施例６：遺伝　ＩＰ３９α　および遣　−Ｌ」コ旦ｍ些ま１Ｐ３９αおよびＰ３９βの両方の免疫反応性を決定するために、遺伝子１および遺伝子２は別個にクローンすることができそして表現産生物はライム免疫血清とのその反応性について調べることができる。各遺伝子をクローンしそして表現するための標準方法論を用いることができる。二しかし、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、４ −　Ｎｏ、７において同定されたポリメラーゼ鎖反応性（ＰＣＲ）およびプライマー配列を使用して個別に増幅するのがより好ましい。

記載した合成オリゴヌクレオチドＤＮＡは、Ａｐｌ）ＬｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　３８０−８を用いて製造者により提供された指示に従い構成した。この手順において、特異的順序のヌクレオチドの短鎖は、水酸化アンモニウム濃厚溶液中において産生した。その後この材料は真空下遠心分離して水酸化アンモニウムを除去した。その後乾燥ＤＮＡベレットを、ＴＥ緩衝液中に再懸濁させ、そしてＤＮＡ？１度は２６０　ｒ＋＋ａでの分光光度吸光度により決定した。その後、ＤＮＡプライマーの濃度は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓにより提供されたプロトコルに従いＰＣＨについて標準化した。

上記のプライマーを使用してボレリアブルグドルフェ’Ｊ　Ｄ　Ｎ　ＡをＰＣＨにより増幅するために、プロトコルは、ボレリアブルグドルフエリＤＮＡを、遺伝子１についてはプライマーｌおよび２のいずれか、遺伝子２についてはプライマー１および２、そして遺伝子１および２を一緒に増幅するために配列４および７と、混合することを伴う。またＰＣＲ混合物に、ＤＮＡ　Ｔａｑポリメラーゼ、緩衝液、および４つのヌクレオチドの混合物（ｄＮＴＰｓ　）が加えた。その後この反応混合物は、３つの異なる温度の反復サイクルに受けさせて、ＤＮＡの変性、鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、および新しいストランドのＤＮＡを産生ずるための延長（重合）をひき起こさせた。熱サイクルを使用して３０回サイクルの後、ＰＣＲ増幅産生物を、電気泳動ゲル中で１０μｍの各試料を走査することにより調べた。

増幅産生物は当業者にとって公知の標準技術により知られたベクターの中に挿入することができるようにするために、各プライマーの５°末端に、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＥ　（Ｇ／ＡＡＴＴＣＩのための認識部位についてコード化するところのヌクレオチドを加えることができる。

増幅されたＤＮＡ産生物は、各末端にＥｃｏＲＩ部位の加入をもつ各遺伝子よりなるであろうし、これはこの配列を、利用できる唯一のＥｃｏＲＩ部位を有する入手可能な多くのクローニングおよび表現ベクターのうちいずれのもの、例えばｐＵＣ，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＲ３２２等の中に挿入することを可能にする。該ベクターは、ＤＮＡ産生物の表現を得るべく、宿主細胞の中に挿入される。かかる技術は当該分野の当業者にとって周知である。

次に、適当なサイズの挿入ＤＮＡを有する組換え体（遺伝子ｌについて１０１７個の塩基：遺伝子２について１０２３個の塩基）は、サウザンプロット分析によりクローン化フラグメントを同定するべく調べることができる。推定上の遺伝子ｌまたは遺伝子２をもつ組換え体からのＤＮＡは、アガロースゲル中で分離され、ニトロセルロース膜に移送され、そしてｐＳＰＲ３３からの精製ＥｃｏＲＩフラグメントを用いてプローブされる。かかる手順は、当業者の全てにとって周知の標準技術である。増幅されたクローン化フラグメントがｐＳＰＲ３３挿入物と相同であることを確認した後、種々のクローンは、標準ウェスタンイムノプロット技術を用いてＰ３９抗原の表現について試験−された。ウサギ抗−ｐＳＰＲ３３抗血清、抗−Ｐ３９単一クローン性抗体（以前に記載したもの）、およびヒトライム患者からの回復期の血清は、各々、種々のクローンの全細胞溶解産物と、各遺伝子の表現産生物、を同定しかつ取得するべく反応させることができる。合成ペプチドは、また、ライムボレリア病に対する哨乳類のワクチンに使用することができる。

上述の発明は明晰と理解の目的のためにいくらか詳細に記載されているが、当業者はこの開示の読みから、本発明の真の範囲および請求の範囲の記載より逸脱することなく形式および詳細について種々の変更を行なうことができるということを理解すべきである。

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の挿入配列の範囲内からＰ３９の遺伝子りへのプライマー（Ａ）　ＮＡＭＥ／ＫＥＹ　：（Ｂ）　ＬＯＣ：ＡＴＩＯＮ　：（Ｃ）　ＩＮＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ　ＭＥＴＨＯＤ　：（Ｉ））　０Ｔ）ＩＥＲＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ　：（ｘ　）　ＰＵＢＬＩＣＡＴＩＯＮ　工ＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ　：（Ａ）　ＡｔＪＴ）（ＥＲ：（Ｂ）　ＴＩＴＬＥ　：（Ｃ）　ＪＯｔＪＲＮＡＬ：（Ｄ）　ＶＯＬＵＭＥ　：（Ｅ）　工５ＳｔＪＥ　：（Ｆ）　ＰＡＧＥＳ　：（Ｇ）　ＤＡＴＥ　：（Ｈ）　ＤＯＣＵＭＥＮＴ　ＮＵＭＢＥＲ：（Ｉ）　ＦＩＬＩＮＧ　ＤＡＴＥ　：（Ｊ）　ＰＵＢＬＩＣ：ＡＴＩＯＮ　ＤＡＴＥ　：（Ｋ）　ＲＥＬＥＶＡＮＴ　ＲＥＳよりＵＥＳ　：（ｘｉ）　５ＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＥＳＣＲＩＰＴ工ＯＮ　：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア　：ＴＡＡ　ＡＴＴ　ＴＡＡ　ＴＡＴ　ＴＴＧ　ＴＴＴ　１８Ｂ、　ｂｕｒ９ｄｏｒｆｅｒｉＩｌｌ　１１１１１１！ＩＩＩ嘴− ＦｆＧ、　２ＦＩＧ、４・Ｂ、　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ１　１　１１１１＋１１１　Ｉｌｌ　ｌ　ｌ　ＩＩＡｎｔｉ−ｐＳＰＲ３３１１１＋　ｔｉｌｌ　１１１１謂ｌり江弓令ＦＩＧ、　１２望ｎへ−０１１一〜円内　へ　−〇　１　１　１要約本発明は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で２８ｋＤａまたは３９ｋＤａの分子量を有し、哺乳動物のライムボレリア症血清に反応性である、ボレリア　ブルグドルフェリに特異的な抗原性タンパク質およびその断片に関し、また対応するＤＮＡにも関する。該タンパク質、特に３９ｋＤａタンパク質（αおよびβ）は、ライムバレリア症の発症因子で以前に感染されたか現在感染している動物を診断するのに使用することができる。

国際調査報告Ｎｏ、２　、　１１１ｓｕ＊ｄ　Ｆｅｂｒｕ＋＋ｒｙ　１９９１Ｔ　Ｗ、Ｊ、Ｓｉｍｐｓａｎ、ｅ仁ａＩＮｏ、ａ、ｉｓｓ＋ｕｅｄ　Ａｕｇｕｓｔ　１９８９１　Ｋ、Ｅ、）ｌｅｃｈｅｍｙ、　ｅ亡ａｌ。

Claims

【特許請求の範囲】１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約３９キロダルトンの分子量を有し、哺乳動物のライムボレリア症血清に反応性である実質的に純粋形態のボレリアブルグドルフェリタンパク質。２．上記タンパク質がＰ３９αまたはＰ３９βである請求項１記載のタンパク質。３．哺乳動物がヒトである請求項１記載のタンパク質。４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約２８キロダルトンの分子量を有し、哺乳動物のライムボレリア症血清に反応性である実質的に純粋形態のボレリアブルグドルフェリタンパク質。５．哺乳動物がヒトである請求項４記載のタンパク質。６．通常同伴するタンパク質の無い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約３９キロダルトンの分子量を有し、哺乳動物のライムボレリア症血清に反応性であるボレリアブルグドルフェリタンパク質。７．上記タンパク質がＰ３９αまたはＰ３９βである請求項６記載のタンパク質。８．哺乳動物がヒトである請求項６記載のタンパク質。９．通常同伴するタンパク質の無い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約２８キロダルトンの分子量を有し、哺乳動物のライムボレリア症血清に反応性であるボレリアブルグドルフェリタンパク質。１０．哺乳動物がヒトである請求項４記載のタンパク質。１１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約３９キロダルトンの分子量を有し、哺乳動物のライムボレリア症血清に反応性であるボレリアブルグドルフェリタンパク質の全部または特定部分をコード化するＤＮＡ断片。１２．上記タンパク質がＰ３９αまたはＰ３９βである請求項１１記載のタンパク質。１３．哺乳動物のライムボレリア症血清に反応性であるボレリアブルグドルフェリタンパク質３９αおよびＰ３９βの全部または特定部分をコード化するＤＮＡ断片。１４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約２８キロダルトンの分子量を有し、哺乳動物のライムボレリア症血清に反応性であるボレリアブルグドルフェリタンパク質の全部または特定部分をコード化するＤＮＡ断片。１５．１）請求項１１記載のＤＮＡ断片；および２）ベクターからなる組換えＤＮＡ分子。１６．１）請求項１２記載のＤＮＡ断片；および２）ベクターからなる組換えＤＮＡ分子。１７．１）請求項１３記載のＤＮＡ断片；および２）ベクターからなる組換えＤＮＡ分子。１８．１）請求項１４記載のＤＮＡ断片；および２）ベクターからなる組換えＤＮＡ分子。１９．上記ベクターがｐブルースクリプトＳＫである請求項１５記載の組換えＤＮＡ分子。２０．上記ベクターがｐブルースクリプトＳＫである請求項１８記載の組換えＤＮＡ分子。２１．ｐＳＰＲ３３である請求項１５記載の組換えＤＮＡ分子。２２．上記ＤＮＡ断片中にコード化された上記タンパク質の発現を許す方法で請求項１５記載の組換えＤＮＡ分子で安定して形質転換された宿主細胞。２３．上記ＤＮＡ断片中にコード化された上記タンパク質の発現を許す方法で請求項１６記載の組換えＤＮＡ分子で安定して形質転換された宿主細胞。２４．上記ＤＮＡ断片中にコード化された上記タンパク質の発現を許す方法で請求項１７記載の組換えＤＮＡ分子で安定して形質転換された宿主細胞。２５．上記ＤＮＡ断片中にコード化された上記タンパク質の発現を許す方法で請求項１８記載の組換えＤＮＡ分子で安定して形質転換された宿主細胞。２６．上記宿主細胞が大腸菌である請求項２２記載の宿主細胞。２７．上記福主細胞が大腸菌である請求項１８記載の宿主細胞。２８．下記３９ｋＤタンパク質の発現を許す方法で請求項２２記載の宿主細胞を培養し、そして上記宿主細胞から下記３９ｋＤタンパク質を単離することからなる組換えボレリアブルグドルフェリ３９ｋＤタンパク質の産生方法。２９．下記３９ｋＤタンパク質の発現を許す方法で請求項２３記載の宿主細胞を培養し、そして下記３９ｋＤタンパク質を単離することからなる組換えボレリアブルグドルフェリ３９ｋＤａタンパク質の産生方法。３０．下記３９αおよび３９βｋＤタンパク質の発現を許す方法で請求項２４記載の宿主細胞を培養し、そして下記３９αおよび３９βｋＤタンパク質を単離することからなる組換えボレリアブルグドルフェリ３９αおよび３９βｋＤタンパク質の産生方法。３１．下記２８ｋＤタンパク質の発現を許す方法で請求項２５記載の宿主細胞を培養し、そして上記宿主細胞から下記２８ｋＤタンパク質を単離することからなる組換えボレリアブルグドルフェリ２８ｋＤタンパク質の産生方法。３２．固体支持体に結合した請求項１記載の上記タンパク質からなる複合体。３３．請求項１記載の上記タンパク質またはその特定部分に特異的な精製形態の抗体。３４．請求項２記載の上記タンパク質またはその特定部分に特異的な精製形態の抗体。３５．請求項４記載の上記タンパク質またはその特定部分に特異的な精製形態の抗体。３６．単クローン性である請求項３３記載の抗体。３７．単クローン性である請求項３５記載の抗体。３８．多クローン性である請求項３３記載の抗体。３９．多クローン性である請求項３５記載の抗体。４０．固体支持体に結合した請求項３３記載の上記抗体からなる複合体。４１．固体支持体に結合した請求項３５記載の上記抗体からなる複合体。４２．ライムボレリア症に対する免疫を誘導するのに充分な量の３９ｋＤボレリアブルグドルフェリタンパク質の全部または特定部分と、製薬学的に許容される担体とを含むライムボレリア症に対する哺乳動物用ワクチン。４３．上記タンパク質がＰ３９αまたはＰ３９βである請求項４２記載のワクチン。４４．ライムボレリア症に対する免疫を誘導するのに充分な量の３９ｋＤαおよびβタンパク質の全部または特定部分と、製薬学的に許容される担体とを含むライムボレリア症に対する哺乳動物用ワクチン。４５．ライムボレリア症に対する免疫を誘導するのに充分な量の２８ｋＤボレリアブルグドルフェリタンパク質の全部または特定部分と、製薬学的に許容される担体とを含むライムボレリア症に対する哺乳動物用ワクチン。４６．更に助剤を含む請求項４２記載のワクチン。４７．更に助剤を含む請求項４３記載のワクチン。４８．更に助剤を含む請求項４５記載のワクチン。４９．ｉ）表面に請求項１記載のタンパグ質の全部または特定部分をコーティングする段階；ｉｉ）上記コーティング表面と、ライム病を有すると推定される哺乳動物の血清とを接触させる段階；そしてｉｉｉ）上記タンパク質と、それに特異的な上記血清に存在する抗体とで形成される複合体の存在または不在を検定する段階；からなるライムボレリア症の診断のためのバイオアッセイ。５０．上記タンパク質がＰ３９αまたはＰ３９βである請求項４９記載のバイオアッセイ。５１．ｉ）表面に請求項４記載のタンパク質の全部または特定部分をコーティングする段階；ｉｉ）上記コーティングされた表面と、ライム病を有すると推定される哺乳動物からの血清とを接触させる段階；そしてｉｉｉ）上記タンパク質と、それに特異的な上記血清に存在する抗体とで形成される複合体の存在または不在を検定する段階；からなるライムボレリア症の診断のためのバイオアッセイ。５２．上記表面がゲル、スライド、膜またはミクロ滴定ブレートである請求項４９記載の方法。５３．ｉ）表面に請求項３３記載の抗体をコーティングする段階；ｉｉ）上記コーティングされた表面と、ライム病を有すると推定される哺乳動物からの血清とを接触させる段階；そしてｉｉｉ）上記抗体と、上記血清に存在するタンパク質とで形成される複合体の存在または不在を検定する段階；からなるライムボレリア症の診断のためのバイオアッセイ。５４．ｉ）表面に請求項３４記載の抗体をコーティングする段階；ｉｉ）上記コーティングされた表面と、ライム病を有すると推定される哺乳動物からの血清とを接触させる段階；そしてｉｉｉ）上記抗体と、上記血清に存在するタンパク質とで形成される複合体の存在または不在を検定する段階；からなるライムボレリア症の診断のためのバイオアッセイ。５５．ｉ）表面に請求項３５記載の抗体をコーティングする段階；ｉｉ）上記コーティングされた表面と、ライム病を有すると推定される哺乳動物からの血清とを接触させる段階；そしてｉｉｉ）上記抗体と、上記血清に存在するタンパク質とで形成される複合体の存在または不在を検定する段階；からなるライムボレリア症の診断のためのバイオアッセイ。５６．天然のまたは組換え産生されたボレリアブルグドルフェリ３９ｋＤａタンパク質と補助試薬とからなる、哺乳動物組織試料中の上記タンパク質に対する抗体の存在の検定に使用するのに適する診断キット。５７．上記タンパク質がＰ３９αまたはＰ３９βである請求項５６記載の診断キット。５８．試験されるべき上記組織試料が血液試料である請求項５６記載の診断キット。５９．下記抗ライム病活性が抑制され得るような条件下で、下記薬物とボレリアブルグドルフェリに接触した細胞とを接触させることからなる抗ライムボレリア症活性についての薬物スクリーニング方法。６Ｇ．ＳＥＱＩＤＮｏ．１またはその突然変異体に示されているヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片。６１．ＳＥＱＩＤＮｏ．２またはその突然変異体に示されているヌクレオチド型配列を含むＤＮＡ断片。６２．ＳＥＱＩＤＮｏ．３またはその突然変異体に示されているヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片。６３．１）請求項６０記載のＤＮＡ断片；および２）ベクターからなる組換え分子。６４．１）請求項６１記載のＤＮＡ断片；および２）ベクターからなる組換え分子。６５．１）請求項６２記載のＤＮＡ断片；および２）ベクターからなる組換え分子。６６．上記ＤＮＡ断片中にコード化された上記タンパク質の発現を許す方法で請求項６３記載の組換えＤＮＡ分子で安定して形質転換された宿主。６７．上記ＤＮＡ断片中にコード化された上記タンパク質の発現を許す方法で請求項６４記載の組換えＤＮＡ分子で安定して形質転換された宿主。６８．上記ＤＮＡ断片中にコード化された上記タンパク質の発現を許す方法で請求項６５記載の組換えＤＮＡ分子で安定して形質転換された宿主。６９．下記タンパク質の発現を許す方法で請求項６６記載の宿主細胞を培養し、そして該タンパク質を上記宿主細胞から単離することからなる組換えボレリアブルグドルフェリ３９キロダルトンタンパク質の産生方法。７０．下記３９キロダルトンαタンパク質の発現を許す方法で請求項６７記載の宿主細胞を培養し、そして該３９キロダルトンαタンパク質を上記宿主細胞から単離することからなる組換えボレリアブルグドルフェリ３９キロダルトンαタンパク質の産生方法。７１．下記３９キロダルトンβタンパク質の発現を許す方法で請求項６８記載の宿主細胞を培養し、そして該３９キロダルトンβタンパク質を上記宿主細胞から単離することからなる組換えボレリアブルグドルフェリ３９キロダルトンβタンパク質の産生方法。７２．請求項６９記載の方法により産生されたタンパク質。７３．請求項７０記載の方法により産生されたタンパク質。７４．請求項７１記載の方法により産生されたタンパク質。