DE69122240T2

DE69122240T2 - Antigen-wirkende proteine von borrelia burgdorferi

Info

Publication number: DE69122240T2
Application number: DE69122240T
Authority: DE
Inventors: Tom G. Hamilton Mt 59840 Schwan; Warren J. North East Valley Dunedin Simpson
Original assignee: US Department of Health and Human Services; US Department of Commerce
Current assignee: US Department of Health and Human Services; US Department of Commerce
Priority date: 1990-03-05
Filing date: 1991-03-05
Publication date: 1997-02-13
Anticipated expiration: 2011-03-06
Also published as: DE69122240D1; AU7496591A; AU645078B2; CA2077434A1; ATE142888T1; EP0524958A4; WO1991013630A1; EP0524958B1; EP0524958A1; JPH05501113A; CA2077434C

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf antigene Borrelia- Burgdorferi-Proteine und ihre kodierende DNA. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf zwei 39-Kilodalton-(kDa)- Borrelia-Burgdorferi-Proteine, die mit Lyme-Borreliose-Serum reagieren, und ein 28-kDa-Borrelia-Burgdorferi-Protein, das mit Lyme-Borreliose-Serum reagiert.

Hintergrundinformation

Lyme-Borreliose bei Menschen ist eine multisystemische Krankheit, die durch Infektion mit Zecken-Spirochaeten, Borrelia-Burgdorferi, verursacht wird (Burgdorfer et al., 1982, Science 216, 1317 bis 1319; Johnson et al., 1984, Int. J. Syst. Bacteriol. 34, 496 bis 497; und Steere et al., 1983, N. Engl. 3. Med. 308, 733 bis 740). Seit den ersten epidemiologischen Untersuchungen dieser Krankheit in Südmittel- Connecticut (Steere et al., 1977, Ann. Intern. Med. 86, 685 bis 698, und Steere et al. 1977, Arthritis. Rheum. 20, 7 bis 17), sind nun menschliche Fälle von Lyme-Borreliose in 43 Staaten der Vereinigten Staaten (Centers for Disease Control 1989, Lyme Disease - United States, 1987 und 1988, MMWR 38, 668 bis 672), 5 Provinzen von Kanada (Centers for Disease Control 1989, Lyme Disease - Kanada, MMWR 38, 677 bis 678), zahlreichen Staaten in ganz Europa und Asien (Ai et al. 1988, Ann. NY Acad. Sci. 539, 302 bis 313; Dekonenko et al., 1988, 3. Infect. Dis. 158, 748 bis 753; und Schmid, 1985, Rev. Infekt. Dis. 7, 41 bis 50), und möglicherweise in begrenzten Schwerpunkten in Australien (Stewart et al., 1982, Med. 3. Australia 1, 139) und Afrika (Haberberger et al., 1989, Trans. R. Soc Trop. Med. Ryg. 83, 556, und Stanek et al., 1986, Zentralbl. Bakteriol. Mikrobio. Hyg. (A) 263, 491 bis 495) identifiziert worden. Zwischen 1982 und 1988 wurden von den Centers von Disease Control Berichte von 13.825 Fällen von Lyme-Borreliose aus allen 50 Staaten der Vereinigten Staaten empfangen (Centers for Disease Control 1989, Lyme Disease - United States 1987 und 1988, MMWR 38, 668 bis 672), was diese Krankheit zur häufigsten durch Insekten verursachte Infektion in diesem Land macht.
Wegen der dramatischen Zunahme des Problembewußtseins, der Häufigkeit und der geographischen Verteilung von Lyme-Borrehose hat sich eine gewaltige neue Nachfrage für klinische Laboratorien nach serologischer Bestätigung von Krankheitsfällen (Magnarelli, 1989, 3. Am. Med. Assoc. 262, 3464 bis 3465, und Schwartz et al., 1989, 3. Am Med. Assoc. 262, 3431 bis 3434) oder zum Ausschließen dieser Krankheit bei zweifelhaften Diagnosen ergeben. Bei den gegenwärtig verfügbaren serologischen Tests für Lyme-Borreliose bestehen jedoch viele mögliche Probleme, die entweder zu falschen positiven oder falschen negativen Ergebnissen führen können (Magnarelli 1989, 3. Am. Med. Assoc. 262, 3464 bis 3465). Einige Untersuchungen haben sich auf die Verwendung von Geißelprotein von B. Burgdorferi konzentriert, um die Empfindlichkeit serobgischer Tests zu steigern (Hansen et al., 1989, J. Clin. Microbiol. 27, 545 bis 551, und Hansen et al., 1988, 3. Clin. Microbiol. 26, 338 bis 346), weil frühere Untersuchungen gezeigt haben, daß es die 41-Kilodalton-Geißeluntereinheit (Flagellin) des Spirochaeten zu sein scheint, der bei infizierten Menschen die frühesten Antikörperreaktion erzeugt (Barbour et al., 1983, 3. Clin. Invest. 72, 504 bis 515; Coleman et al., 1987, 3. Infect. Dis. 155, 756 bis 765; und Grodzicki et al., 1988, 3. Infect. Dis. 157, 790 bis 797). Eines von zwei möglichen Problemen bei der Verwendung von Geißelprotein liegt jedoch darin, daß Flagellen anderer Borrelia-Spezien gleiche Epitopen wie die Flagellen von B. Burgdorferi haben (Barbour et al., 1986, Infect. Immun. 52, 549 bis 554). Zum zweiten wurde in den meisten Rasteruntersuchungen menschlicher Seren durch Immunblotting-Analyse (Barbour, 1984, Yale 3. Biol. Med. 57, 581 bis 586; Barbour et al., 1983, J. Clin. Invest. 72, 504 bis 515; Coleman et al., 1987, J. Infect. Dis. 155, 756 bis 765; Craft et al., 1986, J. Clin. Invest. 78, 934 bis 939; und Nadal et al., 1989, Pediatr. Res. 26, 377 bis 382) angenommen, aber nicht nachgewiesen, daß das Protein bindende Antikörper mit einer anscheinenden Wanderung von 41kDa Flagellin sind.
Es ist daher klar, daß ein Bedürfnis nach einem Verfahren zum Nachweis der Lyme-Borreliose-Krankheit in Säugern existiert. Die vorliegende Erfindung schafft ein solches Verfahren.
Howe et al., Infection and Immunity 54 (1), 207 bis 212 (1986), beschreibt Gene, die zwei äußere Membran-Proteine des Lyme-Krankheitsagens Borrelia Burgdorferi kodieren.
Karlson et al, Serodiagnosis and Immunotherapy in Infectious Disease 2, 375 bis 386 (1986), und Nadal et al., Pediatric Research 26 (4), 377 bis 382, beschreiben Proteine von 39kD von Borrelia Burgdorferi, die durch Immunblotting mit Seren von Patienten mit Lyme-Krankheit identifiziert wurden.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einem Aspekt dieser Erfindung wird ein neues, aus Borrelia Burgdorferi erhältliches Protein mit einem Molekulargewicht von, durch SDS-PAGE bestimmt, etwa 39 Kilodalton, oder ein Teil hiervon, und mit spezifischer Reaktivität mit Säuger-Lyme-Borreliose-Serum, jedoch nicht mit Seren von Patienten, die an anderen durch Spirochaeten verursachten Krankheiten leiden, aus einem DNA-Fragment exprimiert, das die Nukleotidsequenz aufweist, wie sie unter einer der Sequenz- Identifikationsnummern 1, 2 und 3 dargestellt ist; hierbei wird auch auf ein analoges Protein Bezug genommen, das als P28 beschrieben ist (das nicht Teil dieser Erfindung ist).
Des weiteren kodiert ein neues DNA-Fragment ein Protein, wie oben definiert. Es kann in einen Vektor eingebaut sein und zum Transformieren einer Wirtszelle verwendet werden, die ihrerseits zum Exprimieren des Proteins eingesetzt werden kann.
Das Protein kann an einem festen Träger gebunden sein, um einen Komplex zu bilden. Eine mit dem Protein beschichtete Oberfläche kann in einem Bioversuch zur Diagnose der Lyme- Borreliose-Krankheit verwendet werden, indem die beschichtete Oberfläche mit Serum von einem Säuger in Berührung gebracht wird, der mutmaßlich die Lyme-Krankheit hat, und das Vorhandensein oder das Fehlen eines zwischen dem Protein und für das Protein spezifischen Antikörpern in dem Serum nachgewiesen wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfaßt für das neue Protein spezifische Antikörper. Ein neuer Komplex umfaßt den an einen festen Träger gebundenen Anitkörper. Eine mit dem Antikörper beschichtete Oberfläche kann in einem biologischen Test zur Diagnose der Lyme-Borreliose-Krankheit verwendet werden, in dem die beschichtete Oberfläche mit Serum von einem Säuger in Berührung gebracht wird, der vermutlich die Lyme-Krankheit hat, und das Vorhandensein oder Fehlen eines zwischen dem Antikörper und den im Serum vorhandenen Proteinen gebildeten Komplexes nachgewiesen wird.
Eine Diagnoseausrüstung nach der Erfindung enthält ein neues Protein und Hilfsreagenzien, die zur Verwendung beim Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern zu dem Protein geeignet sind. Des weiteren umfaßt ein Verfahren zum Prüfen eines Arzneimittels auf Anti-Lyme-Borreliose-Aktivität das In-Berührung- Bringen des Arzneimittels mit Zellen, die unter solchen Bedingungen mit Borrelia-Burgdorferi Berührung hatten, daß eine Hemmung der Anti-Lyme-Aktivität bewirkt werden kann.
Verschiedene andere Ziele und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den Zeichnungen und der folgenden Beschreibung der Erfindung.
Alle hier erwähnten Veröffentlichungen werden hiermit durch Bezugnahme einbezogen.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine genetische Karte von pSPR33. Spirochaeten- DNA ist als gestreifter Block dargestellt, und der Pfeil zeigt die Richtung an, in welcher der Lac-Promotor transkribiert wird. Innerhalb des Spirochaeten-EcoRI-Fragments waren keine Restriktions-Schnittstellen für AccI, KpnI, XbaI, XhoI oder SmaI vorhanden.
Fig. 2 ist eine Autoradiographie, welche die Hybridisierung einer ³²P-markierten Insert-DNA von pSPR33 mit Gesamt-DNA zeigt, die mit EcoRI von sieben Isolaten von B. Burgdorferi und fünf andere Borrelia-Arten abgebaut wurde. Die rechte Bahn enthielt mit EcoRI abgebautes pSPR33 (pSPR33). Lineare lsmolekulargewichtsmarken (Kb) sind rechts von der Darstellung angegeben.
Fig. 3 zeigt ein mit Ethidiumbromid gefärbtes Gel nicht abgebauter gesamt-DNA von sieben Isolaten von B. Burgdorferi (Tafel A) und eine Autoradiographie des gleichen Gels nach Blotting auf Nitrozellulose und Hybridisierung mit dem ³²P- markierten 6,3 Kb-EcoRI-Fragment von pSPR33 (Tafel B). Beachte das starke Hybridisierungssignal im Zusammenhang mit dem Chromosomenband.
Fig. 4 zeigt eine Immunblotting-Analyse von durch pSPR33 exprimierten Proteinen. Ganzzellen-Lysate des B.-Burgdorferi- Stamms Sh-2-82, pSPR33 tragendes E. Coli (E. Coli + pSPR33) und nur vektortragendes E. Coli (E. Coli + Vektor) wurden einem Immunblotting mit dem menschlichen Lyme-Borreliose- Serum unterzogen, das zum Untersuchen der DNA-Bibliothek von B. Burgdorferi verwendet wird.
Fig. 5 demonstriert die Spezifizität der P28-und P39-Expression in B. Burgdorferi. Ganzzellen-Lysate von verschiedenen B.-Burgdorferi-Stämmen (einschließlich niedriger (P6) und hoher (P246) In-Vitro-D.urchgängen der Kette Sh-2-82) und Isolate, die fünf zusätzliche Borrelia-Arten repräsentieren, wurden einem Immunblotting mit Anti-pSPR33-Serum unterzogen. Lysate von E. Coli, die P28 und P39 exprimieren (E. Coli + pSPR33), und die dies nicht tun (E. Coli + Vektor) wurden ebenfalls als positive bwz. negative Kontrollen einem Immunblotting unterzogen. Es sind nicht sämtliche der 20 getesteten B.-Burgdorferi-Isolate dargestellt (siehe Tafel 1).
Fig. 6 stellt die Reaktivität von Anti-pSPR33 und monoklonalem Antikörper H9724 dar. Die Komponenten in Ganzzellenlysaten von E. Coli plus pSPR33, E. Coli nur plus Vektor, B.- Burgdorferi-Stamm Sh-2-82 und B.-Hermsii-Stamm FRG wurden durch SDS-PAGE getrennt und wurden mit Anti-pSPR33, AntipSPR33 plus H9724, bzw. mit H9724 inkubiert. P39 (Pfeil 1); 41 kDa-Flagellin von B. Burgdorferi (Pfeil 2); 39-kDa- Flagellin von B. Hermsii (Pfeil 3).
Fig. 7 zeigt eine Immunblotting-Analyse von 10 menschlichen Lyme-Borreliose-Seren und ihre Reaktivität mit P28 und P39. Ganzzellenlysate von B.-Burgdorferi-Stamm Sh-2-82 (Bahn 1), E. Coli mit pSPR33 (Bahn 2) und E. Coli nur mit Vektor (Bahn 3) wurden einem Immunblotting mit menschlichen Lyme-Borrehose-Seren (NY) unterzogen. IFA-Lyme-Borreliose-Titer für jedes menschliche Serum sind unter ihren Bezeichnungen angegeben. Während fünf Stunden belichtete Autoradiographien (Darstellung A) stellten Seren dar, die eine schwächere Reaktivität als diejenigen haben, die während einer halben Stunde belichtet wurden (Darstellung B). Pfeile bezeichnen P39 (Pfeil 1) und ein 41-kDa-Antigen (Pfeil 2). Das Band B entspricht der Position von P28, und das Band A ist ein 58- 65-kDa-Antigen, das alle mit P39 reagierten Seren gebunden hat. An der rechten Seite jeder Darstellung sind Molekularmassenmarkierungen (kDa) angegeben.
Fig. 8 zeigt eine Immunblotting-Analyse von syphilitischen Seren. Ganzzellenlysate von B.-Burgdorferi-Stamm Sh-2-82, E. Coli mit pSPR33 und E. Coli nur mit Vektor wurde einem Immunblotting mit fünf syphilitischen Seren (1 bis 5) bzw. Anti- pSPR33 (Anti-pSPR33) unterzogen. Auf der rechten Seite sind Molekularmassenmarkierungen angegeben. Beachte das Fehlen von P39 in den mit syphilitischen Seren reagierten pSPR33-Bahnen, was im Gegensatz zu einem stark reaktiven 41-kDA-Antigen in drei der fünf B.-Burgdorferi-Bahnen steht.
Fig. 9. zeigt eine Restriktions-Endonuklease-Karte und Expressionsdaten für den P39-Ort von Borrelia Burgdorferi. Subklone und Deletionsvarianten des Plasmids pSPR33 (pSPR3B, pSPR45, pSPR51, pSPR54, pSPR56, pSPR57, pSPR59, pSPR38, pSPR45, pSPR51, pSPR54, pSPR56, pSPR57, pSPR59, pSPR46, pSPR44 und pSPR42) sind als nicht ausgefüllte Stäbe dargestellt.
Die Figuren loa und lob zeigen eine Karte der offenen Leseraster des Gens 1 und des Gens 2, welche das P39α -bzw. das P39β-Antigen von Borrelia Burgdorferi kodieren. Fig. 10a zeigt das Raster frei von Terminationsstellen (vollständige vertikale Linien).Fig. 10b zeigt Primerstellen mit überlappenden Sequenzen, die zur Bestimmung von Nucleotidsequenzen von beiden DNA-Strängen benutzt werden.
Fig. 11 zeigt eine genetische Karte des P39-Operons von Borrelia Burgdorferi mit der Position der Gene 1 und 2, der Anzahl abgeleiteter Aminosäuren, und der Richtung der Transkription.
Fig. 12 zeigt ein Northern-Blot von mit pSPR33 sondierter Borrelia-Burgdorferi-RNA, die ein 2,35 kb-RNA-Transkript geeigneter Größe für die einzelne Transkriptionseinheit für die Gene 1 und 2 zeigt.
Fig. 13 zeigt die abgeleiteten amino-terminalen Enden von P39α (Gen 1) und P39β (Gen 2), und die größeren äußeren Oberflächenproteine (Osp) A und B von Borrelia Burgdorferi.
Fig. 14 zeigt Hydrophobizitätskurven der abgeleiteten Aminosäuresequenzen von p39α (gestrichelte Linie) und P39β (durchgehende Linie) (Graphik A) und von OspA (gestrichelte Linie) und OspB (durchgezogene Linie) (Graphik B) von Borrelia Burgdorferi (positive Werte zeigen hydrophile Bereiche und negative Werte zeigen hydrophobe Bereiche der Proteine).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich zum Teil auf antigene Borrelia- Burgdorferi-Proteine und ihre kodierende DNA. Eine hauptsächliche Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf zwei antigene Borrelia-Burgdorferi-Proteine. Zwei Proteine sind durch ein durch SDS-PAGE bestimmtes Molekulargewicht von etwa 39 kDa (als 39α und 39β bezeichnet) und durch Reaktivität mit menschlichem Lyme-Borreliose-Serum gekennzeichnet. Die Erfindung bezieht sich auch auf einmalige Teile der obigen Proteine, wobei ein einmaliger Teil aus mindestens fünf (oder sechs) Aminosäuren besteht.
Die 39-kDa-Proteine sind im wesentlichen frei von Proteinen, mit denen sie normalerweise assoziiert sind. Eine im wesentlichen reine Form der Proteine nach der Erfindung kann vom Fachmann unter Anwendung von Standardmethodologien zur Proteinreinigung ohne übermäßiges Experimentieren erhalten werden. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Peptidfragmente des 39-kDa-Proteins. Alternativ können die Proteine und Peptide nach der Erfindung unter Verwendung bekannter Methoden chemisch synthetisiert werden.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein DNA-Fragment, welches das gesamte oder einen einmaligen Teil der 39-kDa-B.-Burgdorfen-Proteine nach der Erfindung kodiert. Eine hauptsächliche Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung bezieht sich auf das 6,3-Kilobasenpaar EcoRI-Fragment, das aus einer DNA-Bibliothek von B.-Burgdorferi-DNA erhalten wird, das die 39-kDa-Antigenproteine kodiert.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein DNA-Fragment, welches das gesamte oder einen einmaligen Teil des 39- kDaα-B.-Burgdorferi-Proteins oder das 39-kDa β-B.-Burgdorfen-Protein kodiert.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein rekombinantes DNA-Molekül und auf eine damit transformierte Wirtszelle. Unter Verwendung einer an sich auf dem Fachgebiet bekannten Standardmethodologie kann ein rekombinantes DNA- lomolekül hergestellt werden, das einen Vektor und ein DNA- Fragment umfaßt, das beide 39-kDa-Proteine nach der Erfindung kodiert, wobei jedes der 39-kDa-Proteine unter Anwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Methoden ohne übermäßiges Experimentieren aufgebaut werden kann. Das DNA-Fragment kann von B.-Burgdorferi isoliert werden, und es kann die Form eines cDNA-Klons einnehmen, das unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt wird, oder es kann durch Polymerase-Kettenreaktion hergestellt werden. Mögliche Vektoren zur Verwendung bei der Erfindung umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, ZAPII, pUC8, oder vorzugsweise Hochfrequenz-Expressionsvektoren wie beispielsweise pbluescript II SK, pNH8a. Die Wirtszelle kann prokaryontisch (beispielsweise bakteriell), niedriger eukaryontisch (beispielsweise von einem Pilz einschließlich Hefe) oder höher eukaryontisch (beispielsweise von Säugern) sein.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiter auf Antikörper, die für die 39-kDa-B.-Burgdorferi-Proteine der vorliegenden Erfindung spezifisch sind. Der Fachmann kann unter Anwendung einer Standard-Methotologie monoklonale Antikörper und polyklonale Antikörper zu den 39-kDa-Proteinen oder einen einmaligen Teil hiervon herstellen. Dies wird durch das Anti- pSPR33-Kaninchenantiserum beispielsweise verdeutlicht (siehe unten Beispiel 2).
Die Erfindung bezieht sich auch auf einen Impfstoff zur Verwendung bei Säugern gegen Lyme-Borreliose-Krankheit. Nach einer Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung kann, wie es bei Impfstoffen üblich ist, einer der beiden 39kDa-Proteine nach der Erfindung einem Säuger in einem pharmakologisch annehmbaren Träger verabreicht werden. Wie der Fachmann verstehen wird, ist es nicht notwendig, das gesamte Protein zu verwenden. Ein einmaliger Teil des Proteins (beispielsweise ein synthetisches Polypeptid, das einen Teil des 39- kDa-Proteins entspricht) kann auch verwendet werden. Impfstoffe nach der Erfindung können wirksame Mengen von bekanntermaßen eine Immunreaktion verstärkenden immunologischen Hilfsstoffen enthalten. Das Protein oder Polypeptid ist in den Impfstoff in einer ausreichenden Menge vorhanden, um eine Immunreaktion gegen das antigene Protein zu induzieren und dadurch gegen Lyme-Borreliose-Infektion zu schützen. Schützende Antikörper werden gewöhnlich am besten durch eine Reihe von 2 bis 3 Dosen hervorgerufen, die mit Abständen von etwa 2 bis 3 Wochen verabreicht werden. Die Reihen können wiederholt werden, wenn die Konzentration der zirkulierenden Antikörper im Patienten abfällt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiter auf diagnostische Tests zur Verwendung in der Human- und Veterinärmedizin. Zur Diagnose der Lyme-Borreliose-Krankheit wird das Vorhandensein von Antikörpern zu den 39kDa-Proteinen in Säugerserum bestimmt. Für diesen Nachweis können, wie der Fachmann erkennt, zahlreiche Testarten angewendet werden. Solche Tests schließen IFA, RIA, RIST, ELISA, Agglutination und Hämagglutination ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Diagnosetests können unter Verwendung von Standartprotokollen wie beispielsweise denjenigen durchgeführt werden, die von Magnarelli et al. 1984, J. Clin. Microbiol. 20, 181 bis 184; Craft et al., 1984, 3.Infect. Dis. 149, 789 bis 795; Enguall et al., 1971, Immunochemistry 8, 871 bis 874; und Russel et al., 1984, J. Infect. Dis. 149, 465 bis 470, beschrieben sind. Insbesondere kann ein Diagnosetest nach der Erfindung dadurch aufgebaut werden, daß auf eine Oberfläche (d.h. einen festen Träger), beispielsweise auf eine Mikrotiterplatte oder eine Membran (beispielsweise eine Nitrozellulosemembran), die gesamten oder ein einmaliger Teil der 39-kDa-Proteine (natürlich oder synthetisch) aufgebracht werden und mit dem Serum eines Patienten in Berührung gebracht werden, der mutmaßlich die Lyme-Borreliosekrankheit hat. Das Vorhandensein eines resultierenden Komplexes, der sich zwischen der Oberfläche und dafür spezifischen Antikörpern in dem Serum bildet, kann durch irgendeine der allgemein bekannten Methoden nachgewiesen werden, beispielsweise durch Fluoreszenz-Antikörperspektroskopie oder durch Colorimetrie.
Bei einer weiteren Ausführungsform eines Diagnosetests nach der Erfindung werden die gesamten oder ein einmaliger Teil der 39-kDa-Proteine an einen inerten Partikel beispielsweise von Bentonit oder Polystyrol-Latex gebunden. Die Partikel werden beispielsweise in einer Mulde einer Kunststoff-Agglutinationsschale mit Serum von einem Patienten vermisdht. Das Vorhandensein oder das Fehlen von Antikörpern im Patientenserum wird durch Beobachten des Absetzbilds der Partikel in der Mulde bestimmt.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Diagnosetests nach der Erfindung wird das Vorhandensein oder Fehlen der 39-kDa- Proteine in einer Serumprobe nachgewiesen. Für die 39-kDa- Proteine oder einen einmaligen Teil hiervon spezifische Antikörper können auf eine feste Oberfläche wie beispielsweise einen Kunststoff aufgebracht werden und mit der Serumprobe in Berührung gebracht werden. Nach dem Waschen wird das Vorhandensein oder Fehlen des an die fixierten Antikörper gebundenen Proteins aus dem Serum durch Zugabe eines markierten (z.B. fluoreszierend markierten) Antikörpers nachgewiesen, der für die 39-kDa-Proteine spezifisch ist.
Für den Fachmann ist klar, daß die Erfindung auch die Verwendung von Tests des Konkurrenztyps zum Nachweis der Antigene und Antikörper, auf welche die Erfindung sich bezieht, in einer Probe umfaßt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiter auf das Prüfen von Arzneimitteln auf Anti-Lyme-Borreliose-Wirkung. Bei einer Ausführungsform werden mögliche Anti-Lyme-Borreliosekrankheit-Arzneimittel auf ihre Fähigkeit getestet, die Expression der 39-kDa-Proteine in Zellen zu hemmen, die mit B. Burgdorfen in Berührung gebracht worden. Das Vorhandensein oder Fehlen der 39-kDA-Proteine in mit Testarzneimitteln behandelten exponierten Zellen kann durch irgendeine der oben erwähnten Standard-Diagnosetests bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf DNA-Fragmente, welche die unter den Sequenzidentifikationsnummern 1 bis 3 gezeigte Nukleotidsequenz oder Mutanten davon enthalten, weiter auf rekombinante Moleküle, welche die DNA- Fragmente enthalten, und auf mit den rekombinanten Molekülen transformierte Wirtszellen. Unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannter Standardmethodologie kann ein rekombinantes DNA-Molekül, das einen Vektor und die DNA-Fragmente nach der Erfindung umfassen, unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Methoden ohne übermäßiges Experimentieren aufgebaut werden. Die DNA-Fragmente können von B. Burgdorferi isoliert werden oder können durch eine Polymerase-Kettenreaktion hergestellt werden. Mögliche Vektoren zur Verwendung bei der Erfindung umfassen pUC, pbluescript oder pBr312, sind aber darauf nicht beschränkt. Die Wirtszelle kann prokaryontisch (beispielsweise bakteriell), niedriger eukaryontisch (beispielsweise von einem Pilz einschließlich Hefe) oder höher eukaryontisch (beispielsweise von einem Säuger) sein.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf Verfahren zum Herstellen rekombinanter Borrelia-Burgdorferi-39-kDa- Proteine, die ein Züchten der oben erwähnten Wirtszellen in einer Weise umfassen, welche die Expression der Proteine und das Isolieren der Proteine aus den Wirtszellen ermöglichen. Die zum Herstellen rekombinanter B.-Burgdorferi-Proteine angewandten Methodologien liegen im Bereich des Könnens eines Durchschnittsfachmanns.

Beispiele

Die folgenden Organismen und Materialien wurden in sämtlichen Beispielen verwendet.
Bakterienstämme: Die verwendeten B.-Burgdorferi-Stämme (siehe unten stehende Tafel 1) sind bereits beschrieben worden oder wurden freundlicherweise von Dr. John Anderson (Connecticut Agriculture Experiment Station, New Haven, Conn.), Dr. Alan Macdonald (Southampton Hospital, Long Island, N.Y.), und Ms. Glenna Teltow und Ms. Julie Rawlings (Medical Entomology Section, Bureau of Laboratories, Texas Department of Health, Austin, Tex.) bereitgestellt. Die fünf Stämme, die B. hermsii (HS1), B. Coriaceae (Co53), B. perken, B. turicatae und B. anserina darstellen, sind schon beschrieben worden (Schwan et al. 1989, J. Clin. Micorbiol. 27, 1734 bis 1738). Borrelia- Organismen wurden bei 32ºC in BSK-II-Medium gezüchtet, wie bereits beschrieben (Barbour, 1984, Yale J. Biol. Med. 57, 581 bis 586). Tafel 1 Zusammenstellung der in dieser Untersuchung verwendeten Borrelia-Burgdorferi-Stämme, die alle P28 und P39 exprimierten
&spplus;Zecke = Ixodes dammini (Id); Zecke = 1. pacificus (Ip); Zecke = 1. ricinus (Ir); Zecke = Amblyoma americanum (Aa); menschlich (H); Nagetier Peromyscus leucopus (Rp); Nagetier = Microtus (Rm); Hund = (D)
ºStämme mit 10 oder weniger Passagen (L); Stämme mit 20 oder mehr Passagen (H)
*USA-Bundesstaat oder Land
1 Schwan et al, 1989, J. Clin. Microbiol. 27, 1734, 1738
Menschliche syphilitische Seren wurden freundlicherweise von Dr. Wayne Hogefre und Mr. Jane Markley (Hillcrest Biologicals, Cypress, Calif.) bereitgestellt, amyotrophe Lateralsklerose-Seren (ALS-Seren) wurden von Dr. Jeffrey Smith (Mount Sinai Medical Center, ALS Clinic, New York, NY.) und Dr. Alan Mcdonald (Southampton Hospital, Lond Island, N.Y.) bereitgestellt, und Rückfallfieberseren wurden von Patienten aus Oregon und Washington entnommen. Normale Seren wurden von Angestellten und Laborpersonal der Rocky Mountain Laboratories erhalten. Menschliche Lyme-Borreliose-Seren wurden von Dr. Alan Mcdonald bereitgestellt und wurden von klinisch mit Lyme-Borreliose diagnostizierten Patienten von Long Island, New York, entnommen.
Das Plasmid pSPR33 (siehe unten) enthaltende Escherichia coli wurde am 28. Februar 1990 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 hinterlegt. Die Zugriffsnummer des Organismus ist 68243. Die Hinterlegung soll lebensfähig erhalten werden und ersetzt werden, falls sie nicht mehr lebensfähig werden sollte, und zwar über die Laufdauer des Patents während einer Periode von Jahren vom Hinterlegungsdatum an oder während 5 Jahren seit dem Datum der letzten Probenanforderung der Hinterlegung, je nachdem, welches der längere Zeitraum ist, und soll bei Ausgabe eines Patents aufgrund dieser Anmeldung der Öffentlichkeit unbeschränkt und gemäß den gesetzlichen Bestimmungen zugänglich gemacht werden. Der Comissioner of Patents and Trademarks soll auf Anforderung Zugang zu der Hinterlegung erhalten.

Beispiel 1: Klonieren und genetische Analyse von Borrelia-DNA

Zum Identifizieren von B.-Burgdorferi-Proteinen, die eine Antikörperreaktion während des Verlaufs einer Infektion induzieren, wurde eine DNA-Bibliothek von EcoRI-Fragmenten enthaltender B.-Burgdorferi in E. Coli mit demλ-Expressionsvektor λ ZAPII aufgebaut.
Die Gesamt-DNA wurde aus 500 ml Stationärphasen-Borrelia-Kulturen durch eine Modifikation des schon beschriebenen Verfahrens (Barbour 1988, J. Clin. Microbiol. 26, 475 bis 478) in neuer Form gewonnen. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren wiedergewonnen, in 20 ml PBS + 5 mM MgCl&sub3; gewaschen und in 2,4 ml TES (50 mM Tris, pH 8,0; 50 mM EDTA, 15% (Gewicht/Volumen) Sucrose) resuspendiert. Dann wurde Lysozym bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugegeben, und dann wurde die Zellensuspension auf Eis 10 Minuten lang stehen gelassen. Die Zellen wurden durch Zugabe von 3 ml TES + 1% (Volumen/Volumen) Natriumdesoxycholat lysiert und während 10 Minuten bei Raumtemperatur vorsichtig vermischt. Sodann wurde Proteinase K (1 mg) zugegeben, und die Probe wurde bei 37ºC eine Stunde lang inkubiert. Die DNA-Suspension wurde dann zweimal mit einem Volumenteil Phenolchloroform (1:1 (Volumen/Volumen)) und einmal mit Chloroform-Isoamylalkohol (24:1 (Volumen/Volumen)) extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol ausgefällt, zweimal mit 70%igem Ethanol gewaschen und auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml in TE (lomm Tris, pH 7,6; 1 mM EDTA) resuspendiert.
Die Gesamt-DNA (1µg) des B.-Burgdorferi-Stamm Sh-82 wurde mit ECORI abgebaut, zu den dephosphorilierten Armen des Expressionsvektors λ ZAPII legiert (Stratagene, La Jolla, Calif.) und entsprechend den Herstelleranweisungen verpackt.
Die Bibliothek wurde mit einem Konvaleszenzserum von einem menschlichem Lyme-Borreliose-Patienten von Long Island, New York (1:100) durch Immunblotting mit anschließender Absorption von Plaque-Proteinen auf Nitrozellulosefiltern (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) auf Borrelia untersucht. Nach Blockieren während einer Stunde bei 25ºC in TSE-Tween (50 mM Tris, pH 7,4; 150 mM NaCl; 5 mM EDTA, 0,05% Tween 20) wurden die Filter mit in TSI-Tween verdünntem Serum unter sanftem Schütteln bei 25ºC während einer Stunde inkubiert. Sie wurden dann während einer Stunde mit vier Änderungen von TSI-Tween gewaschen, und der gebundene Antikörper wurde durch Inkubieren der Filter mit ¹²&sup5;I-markiertem Protein A (500.000 cpm/ml) während einer Stunde unter Schütteln nachgewiesen. Jedes Filter wurde dann viermal während 15 Minuten jeweils mit TSE-Tween gewaschen, getrocknet und mit Kodak X-ARS-Film autoradiographiert.
Positive Klone wurden mit einer Häufigkeit von 5% nachgewiesen. Eine rekombinante Plaque, die mit menschlichem Serum reagierte, wurde Plaque-gereinigt, und das die Borrelia-DNA enthaltende Phagemid wurde von den Lambda-Sequenzen mit Hilfe des Helfer-Phagen R407 entsprechend der Lieferantenanweisungen (Stratagene) exzisiert. Die Exzision des klonierten Fragments aus dem gereinigten Fagen erzeugte den ein 6,3-Kilobasen-(Kb)-EcoRI-Fragment enthaltenden Fagemidteil, der als Plasmid pSPR33 (Fig. 1) bezeichnet wird. Das Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert, radiomarkiert und es wurde gezeigt, daß es mit einem größenmäßig ähnlichen Fragment in mit EcoRI abgebauter Gesamt-DNA aus allen 6 nordamerikanischen und einem europäischen B-Burgdorferi-Isolaten (Fig. 2) hybridisiert.
Das rekombinante Plasmid pPSR33 wurde aus E. Coli für Kartierungsuntersuchungen aus 500-ml-Kulturen isoliert und gereinigt, wie früher schon beschrieben (Simpson et al., 1987, Infect. Immun. 55, 2448 bis 2455), mit der Ausnahme, daß zwei aufeinanderfolgende Farbstoff-Schwimmdichte-Gradienten in einer Beckman-VTi8O-Schleuder bei 70.000 Umdrehungen pro Minute bei 4 Stunden bei 18ºC hergestellt wurden (Plasterk et al., 1985, Nature 318, 257 bis 263). Der ringförmige Plasmidteil mit Superhelix wurde nach dem Entfernen des Ethidiumpromids mit zwei Volumenteilen Wasser verdünnt und dann mit Ethanol ausgefüllt. Die Plasmid-DNA wurde dann in einem minimalen Volumenteil TE resuspendiert. Mini-Plasmid-Zubereitungen (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) von positiven Klonen wurden nach ihrem Abbau mit EcoRI durch Agarosegel-Elektrophorese untersucht, um die Insert-Größe zu bestimmen.
Eine Southern-Blotting-Analyse von nichtabgebauter DNA aus sieben ähnlichen Isolaten zeigte, daß das 6,3-Kb-Fragment stark mit chromosomaler DNA (Fig. 3) hybridisierte. Nicht abgebaute Gesamt-DNA wurde in 0,4-%igen Agarosegelen einer Elektrophorese unterzogen (12 Volt während 16 Stunden). Southern-Blotting-Verfahren umfassen das übertragen von DNA von Agarosegelen auf Nitrozellulose, hochstringente Hybridisierung (unter Zulassung von 10% Basenfehlpaarungen), und Autoradiographie fanden statt, wie schon beschrieben (Spanier et al., 1983, Virology 130, 514 bis 522) mit der Ausnahme, daß die Vorhybridisierung und die Hybridisierungspuffer und -Temperaturen wie bei Schwan et al. (Schwan et al. 1989, J. Clin. Microbiol. 27, 1734 bis 1738) erfolgten.
Die DNA-Sonde wurde aus Agarosegelen unter Verwendung von Gene Clean (BIO 101, Inc., La Jolla, Calif.) gewonnen und mit (α-³²P)dCTP (3000 Ci/mmol) durch Nick-Translation nach den Anweisungen des Herstellers (Nick Translation Kit, Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) markiert. Die Sonde wurde 4 Minuten lang gekocht und unmittelbar vor Zugabe zum Hybridisierungspuffer auf Eis abgeschreckt.
Restriktions-Endonucleasen wurden von Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Ind., gekauft, und Abbauvorgänge wurden durchgeführt, wie vom Hersteller empfohlen.
Das verschmierte Band in Agarosegelen, das heterogen fragmentierte DNA enthielt und geringfügig langsamer als das lineare 49-Kb-Plasmid des Stamms Sh-2-82 wanderte, wurde als chromosomale DNA vermutet. Gesamt-DNA von 5 zusätzlichen Borrelia-Arten einschließlich B. hermsii, B. parkeri, B. anserina, B. turicatae, B. coriaceae, hybridisierte nicht mit dem 6,3-Kb-Fragment (Fig. 2). Diese Daten zeigen an, daß die pSPR33-Insertsequenzen chromosomal lokalisiert und für B. Burgdorferi spezifisch sind.

Beispiel 2:

Immun-Blotting-Analyse von klonierten B.-Burgdorferi- Proteinen

Zum Identifizieren der durch pSPR33 kodierten spezifischen Proteinen, die mit dem zum Prüfen der Bibliothek verwendeten menschlichen Serum reagierten, wurden Ganzzellenlysate von pSPR33 enthaltenden E. Coli durch SDS-PAGE und Immunblotting analysiert.
Kaninchenserum, das gegen Ganzzellenlysate von E. Coli, die entweder pSPR33 (Anti-pSPR33) oder den Vektor pbluescript SK (Anti-E. Coli) enthielten, wurde wie folgt zubereitet. Aus 16-Stunden-Kulturen gewonnene bakterielle Zellen wurden einmal gewaschen und in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf eine Endkonzentration von 10&sup8; Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden durch Inkubieren während 30 Minuten bei 56ºC abgetötet und durch Beschallung auf Eis (zwei Minuten bei einer Ausgangsleistung von 4; Branson Sonifier-Cell Disrupter 185) zerstört. Weiße Neuseelandkaninchen wurden (ohne Adjuvanz) intramuskulär mit 1,5 ml des Zellensonikats immunisiert und 21 und 42 Tage nach der ersten Immunisierung mit dem gleichen Immundgen nachimunisiert. Danach wurden während 4 Monaten alle zwei Wochen Seren gesammelt, zusammengefaßt, und 5-ml-Aliquoten wurden mit blauen Zellen des E. Coli-Stamms XL1 (Stratagene) die aus 500-ml-Kulturen gesammelt wurden, absorbiert und unter Drehung bei 37ºC während 4 Stunden inkubiert. Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren in einem VTi80-Rotor bei 40.000 Umdrehungen pro Minute während 30 Minuten abgeschieden. Dieser Prozeß wurde zweimal wiederholt, und absorbierte Seren wurden dann durch ein steriles 0,22-Mikrometer-Filter (Millipore Corp., Medford, Mass.) gefiltert und bei -20ºC gelagert. Anti-pSPR33-und Anti-E.-Coli- Seren wurden mit einer verdünnung von 1:500 bzw. 1:50 verwendet. Die monoklonalen Antiköper H5332 (Barbour et al., 1983, Infect. Immun. 41, 795 bis 804), H5TS (Barbour et al., 1984, Infect. Immun. 45, 94 bis 100), und H9724 (Barbour et al., 1986, Infect. Immun. 52, 549 bis 554) wurden mit einer Verdünnung von 1:100 verwendet.
IFA-Titer von Lyme-Borreliose- und Rückfallfieberseren wurden bestimmt, wie vorbeschrieben (Burgdorfer et al., 1982, Science 216, 317 bis 319). Der B.-Burgdorferi-Stamm B31 bzw. der B.-hermsii-Stamm HSI wurden in den IFA-Tests als die Antigene verwendet.
Es wurden Immunblotting-Analysen von Ganzzellenlysaten im wesentlichen wie vor beschrieben durchgeführt (Schwan et al., 1989, Infect. Immun. 57, 3445 bis 3451), mit der Ausnahme, daß die Zellen wie folgt zubereitet wurden. Die Zellen wurden aus flussigen Kulturen durch Zentrifugieren (8000g während 5 Minuten) gewonnen und in PBS resuspendiert, um eine optische Dichte von 0,2 bei 600 nm zu ergeben. Zellen aus 2 ml dieser Suspension wurden durch Zentrifugieren gewonnen und in 100 Mikroliter destilliertem Wasser und 50 Mikroliter Probenpuffer (0,2 M Tris, pH6,8; 30% (Volumen/Volumen) Glycerol; 3% (Gewicht/Volumen) SDS; 0,002% (Gewicht/Volumen) Bromphenolblau) resuspendiert. Sodann wurden Proben während 4 Minuten gekocht, und 20 Mikroliter auf ein 12,5%iges SDS-PAGE- Gel aufgebracht. Die Gel-Elektrophorese, das Immunblotting und der Nachweis gebundener Antikörper unter Verwendung von ¹²&sup5;I-Protein A ist bereits beschrieben worden (Schwan et al., 1989, Infect. Immun. 57, 3445 bis 34 51).
Ein 28-kDa-(P28) und ein 39-kDa-Antigen (P39) im pSPR33- Immunblottingprofil waren die am meisten immunreaktiven Antigene, die nicht in Lysaten von E.-Coli-Zellen nachgewiesen uurden, die nur den Vektor (Fig. 4) enthielten. Antiseren, die zu Ganzzellenlysaten von nur den Vektor enthaltenden E. Coli aufgebaut wurden (Anti-E.-Coli-Serum) reagierte bei einer Verdünnung von 1:50 nicht mit P28 oder P39. Diese beiden Proteine sind daher in antigener Hinsicht unverwandt mit nativen E. Coli-Komponenten und scheinen durch die klonierten Borrelia-Sequenzen kodiert zu sein. P28 und P39 konnten nicht in entweder mit Coomassie-Blau oder Silbernitrat gefärbten SDS-PAGE-Gelen aufgelöst werden, da sie mit anderen, reicheren E.-Coli-Proteinen mitwandern.
Proteine ähnlicher Größe wie P28 und P39 wurden durch Immunblotting (Fig. 4) in Zellenlysaten des B.-Burgdorferi-Stamms Sh-2-82 nachgewiesen, was nahelegt, daß P28 und P39 durch diesen Stamm exprimiert werden. Um zu bestimmen, ob die in Ganzzellenlysaten gefundenen 28- und 39-kDa-Borrelia-Proteine identisch mit den Genprodukten P28 bzw. P39 sind, wurde zu pSPR33 enthaltenden Zellen erzeugtes Antiserum (Anti-pSPR33- Serum) mit einem Western-Blotting unterzogenen Ganzzellenlysaten von einem europäischen und 19 nordamerikanischen B.- Burgdorferi-Isolaten inkubiert und mit einem P28 und P39 erzeugenden Lysat von E. Coli verglichen (Fig. 5). Sämtliche 20 Borrelia-Isolate exprimierten ein 39-kDa-Protein, das zusammen mit P39 mitwanderte. Ein 28-kDa-Protein wurde ebenfalls nachgewiesen, aber dieses Protein wurde von beträchtlich weniger Antikörpern als das Protein P39 gebunden. Durch pSPR33 produziertes P39 reagierte auch mit Seren von 5 Weißfußmäusen (Peromyscus leucopus), die experimentell mit dem B. Burgdorferi-Stamm Sh-2-82 infiziert wurden, reagierte aber nicht mit den vorimmunisierten Seren dieser Tiere oder mit Seren von Mäusen, die nur mit E. Coli infiziert wurden. Weitere Spezien von Borrelia produzierten keine nachweisbaren Mengen von P28, P39 oder irgendwelchen anderen in antigener Hinsicht verwandten Proteinen unter den angewendeten Bedingungen (Fig. 5). Eine ausgedehnte Belichtung (mehr als 24 Stunden) von Autoradiographien zeigte schwache Bänder mit anderen Molekulargewichten als 28kDa und 39kDa in allen Borrelia-Profilen, aber diese haben keine spezifische Bindungseigenschaften. Daten einschließlich der Tatsache, daß DNA von anderen Spezien von Borellia keine Sequenzen mit nachher Identität zu denjenigen aufwiesen, die P28 und P39 kodieren (Fig. 2), zeigen, daß P28 und P39 für B. Burgdorferi spezifische Proteine sind. Des weiteren reagierte Anti-pSPR33 nicht mit den B.-Burgdorferi-Antigenen Osp A(31kDa), Osp B (34kDa) oder dem 41-kDa-Flagellin, was nahelegt, daß diese Proteine in antigener Hinsicht mit P28 und P39 unverwandt sind (Fig. 5).
Um dies zu bestätigen, wurde gezeigt, daß die monoklonalen Antikörper H5332, H5TS und H9724 (Fig. 6), die sich spezifisch an Osp A (Barbour et al., 1983 Infect. Immun. 41, 795 bis 804), Osp B (Barbour et al., 1984, Infect. Immun. 45, 94 bis 100) bzw. an das Flagellin (Barbour et al., 1986, Infect. Immun. 52, 549 bis 554) binden, sich nicht an P28 oder P39 binden, die entweder durch pSPR33 oder den Stamm Sh-2-82 produziert worden. Die Spezifität des monoklonalen Antikörper H9724 für Borrelia-Flagellin ist in Fig. 6 evident, da dieser monoklonale Antikörper sich nur an ein 41-kDa-Band in dem B.- Burgdorferi-Profil und an ein 39-kDa-Band gebunden hatte, das sein Flagellin (Barbour et al., 1986, Infect. Immun. 52, 549 bis 554) in dem B.-hermsii-Profil gebunden hatte. Des weiteren zeigte sich unter Verwendung von Elektronenmikroskopie und kolbidaler Goldfärbung, daß der monoklonale Antikörper H9724 sich an Endoflagellin von B. Burgdorferi gebunden hatte, Anti-pSPR33 jedoch nicht.

Beispiel 3: Lyme-Borreliose-Seren mit klonierten Borrelia- Proteinen

Zum Testen der Möglichkeit, daß P28 und P39 immundominante Proteine sind, wurden 94 menschliche Seren von Patienten, bei denen Lyme-Borreliose klinisch diagnostiziert wurde, auf Reaktivität mit kloniertem P28 und P39 bei einer Verdünnung von 1:100 getestet. Ganzzellenlysate wurden einer Elektrophorese in SDS-PAGE-Genen und einem Western-Blotting unterzogen, wie schon bei den obigen Beispielen beschrieben. Die Nitrozellulose wurde in gleiche Streifen (5 Streifen pro Gel geschnitten, so daß jeder Streifen Bahnen für E. Coli mit pSPR33, E. Coli nur mit dem Vektor, und den B.-Burgdorferi- Stamm Sh-2-82 enthielt. Jeder Streifen wurde mit einem anderen menschlichen Serum inkubiert, mit Ausnahme eines Streifens jedes Gels, das mit anti-pSPR33-Serum inkubiert wurde. Dieser letztere Streifen diente als Marker für die Positionen von P28 und P39. Alle 33 Seren mit IFA-Titern größer oder gleich 1:256 (100%), 13 von 17 Seren (76%) mit IFA-Titern von 1:128, und 14 von 44 Seren (32%) mit Titern kleiner oder gleich 1:64 reagierten mit P39 (s. u. stehende Tafel 2). Tafel 2 Zusammenstellung menschlicher Lyme-Borreliose-Seren, die auf Reaktivität mit P39 getestet wurden
Beispiele von Immunblottings für menschliche Seren, die mit P39 (Pfeil 1) reagieren, sind in Fig. 7 dargestellt. Ein stark reagierendes 58 bis 65-kDa-Band wurde in dem B. Burgdorfen-Profil (Fig. 7, Band A) bei allen Seren beobachtet, die mit P39 reagierten, aber da Anti-pSPR33-Serum nicht mit einem Band in diesem Bereich des Gels (Fig. 5) reagiert, sind P39 und das oder die 58 bis 65-kDa-Protein(e) mutmaßlich unverwandt. Obwohl P28 stark mit einigen Seren (Fig. 7 B, Band B) zu reagieren scheint, war bei anderen, weniger reaktiven Seren nicht klar, ob die Seren mit P28 oder mit irgendeinem anderen Protein reagierten. Dies lag daran, daß diese Seren auch mit mitwandernden E.-Coli-Proteinen reagierten, die bei längerer autoradiographischer Belichtung (Fig. 7A, Band B) nachgewiesen wurden. Daher scheint es, obwohl nicht klar ist, in welchem Ausmaß P28 tatsächlich mit menschlichem Lyme- Borreliose-Seren reagiert, daß Antikörper zu P39 in 100% aller Seren nachgewiesen ist, die IFA-Titer von gleich oder größer 1:256 hatten. Bemerkenswerterweise schienen viele auf p39 reaktive Seren nicht mit dem 41-kDa-Flagellin (Figuren 7A und 7B) zu reagieren. Im Hinblick darauf könnte der Antikörper zu P39 als Antikörper zu den Flagellin mißverstanden werden, wenn menschliche Seren durch Immunblotting unter Verwendung von Ganzzellenlysaten von B. Burgdorferi getestet werden. Weil durch Immunblotting gezeigt wurde, daß P39 für B. Burgdorferi spezifisch ist, ist es nicht überraschend, daß Kontrollseren, die Seren von 5 ALS-Patienten, 5 syphilitischen Patienten, 5 Rückfallfieber-Patienten und 10 normalen Personen, die keine Symptome klinischer Krankheit zeigten, nicht mit dem klonierten P39-Protein bei einer Verdünnung von 1:50 reagierten (siehe untenstehende Tafel 3). Immunblotting- Ergebnisse für die syphilitischen Seren sind in Fig. 8 dargestellt. Diese Daten legen nahe, daß P39 antigene Spezifizität für Seren von Patienten mit Lyme-Borreliose hat. Dies gilt trotz der Tatsache, daß sowohl die getesteten syphilitischen wie auch die Rückfallfieberseren signifikant hohe IFA-Lyme- Borreliose-Titer hatten (siehe unten stehende Tafel 3) und deshalb höchstwahrscheinlich auf andere B.- Burgdorferi- Antigene gerichtete kreuzreagierende Antikörper enthielten. Tafel 3 Zusammenstellung von IFA-Titern für Kontrollseren, die nicht mit P39 reagierten
1 = Portnoy, 1963, Amer. J. Clin. Pathol. 40, 473 bis 479
Die Immundominanz von P39 und das Potential dieses Antigens, ein Virulenzvaktor von B. Burgdorferi im Hinblick auf seine Immuneigenschaften und seinem Zusammenhang mit Infektivität zu sein, führte zu einer weiteren Charakterisierung der genetischen Basis für die P39-Expression.

Beispiel 4:

PSPR-33-Subklon- und Deletionsanalyse.

Es wurden 11 Subklone konstruiert, um die annähernde Position des P39- Orts in dem 6,3-kb-EcoRI-Inserts in dem Elternkonstrukt pSPR33 zu bestimmen. Die Endonukleasen EcoRI, ClaI, HindIII, BamHI und PstI wurden nach Herstelleranweisung (Boehringer Mannheim Biochemicals) verwendet, um verschiedene Restriktionsfragmente herzustellen, die dann zu dem linearisierten pBluescript-Klonierungsvektor (Stratagene) ligiert wurden, der mit dem entsprechenden Enzym oder der entsprechenden Kombination von Enzymen geschnitten wurde. Ein 4,4- kb-EcoRI-ClaI-Fragment wurde in den Vektor ligiert und in kompetente DHS-Alpha-Escherichia-Coli-Zellen transformiert (Bethesda Research Laboratories) und als pSPR3B bezeichnet (Fig. 9). Ein 2,3-kb-IcoRI-HindIII-Fragment erzeugte das Subklon pSPR45; ein 5,0-kb-BamHI-Fragment erzeugte das Subklon pSPR46; ein 3,3-kb-PstI-Fragment erzeugte das Subklon pSPR44; ein 1,4-kb-PstI-Fragment erzeugte das Subklon pSPR42. Weitere Subklone wurden als Deletionsprodukte durch Deletion von Sequenzen vom HindIII-Ende des IcoRI-HindIII-DNA-Fragments im Subklon pSPR45 erzeugt. Nach Aufschluß mit HindIII wurde Dnase während zunehmender Zeiträume eingesetzt, um das Fragment zu verkürzen. Das neue Ende wurde mit DNA-Polymerase behandelt, und es wurden Nukleotide hinzugefügt, um das Ende zur Ligasierung in linearisierte Vektoren mit glatten Enden (pbluescript) zu glätten. Durch aufeinanderfolgende Behandlungen wurden die Subklone pSPR51, pSPR54, pSPR57 und pSPR59 konstruiert (Fig. 9).
Um zu bestimmen, ob die Klone P39 exprimieren, wurden Expressionsversuche der P39-Deletions- und Subklon-Varianten (Fig. 9) mit polyklonalem Anti-P39-Serum (Anti-pSPR33, früher beschrieben), monoklonalem A6 und D1 und einem Western-Blotting unterzogenen Ganzzellenlysaten durchgeführt. Zwei monoklonale Antiköper zu dem P39-Antigen wurden unter Anwendung von dem Durchschnittsfachmann bekannten Standardtechniken hergestellt. Das rekombinante pSPR33 enthaltende Escherichia-Coli- Zellen wurden in BALB/c-Labormäusen in den Bauch inokuliert. Nach einem Monat wurden die Mäuse mit einem identischen Inokulum verstärkt. Eine Woche nach der Verstärkung wurden Serumproben von den Mäusen durch Western-Blotting-Analyse auf Anti-P39-Antikörper getestet, und seropositive Mäuse wurden wiederum mit rekombinanter E. Coli verstärkt. Nach drei Tagen wurde die Milz entfernt. Milzzellen wurden abgesondert und mit Hybridomzellen SP-20 in HY-Kulturmedium, 37ºC, 8% CO&sub2;, verschmolzen. Erfolgreiche Verschmelzungen wurden dann durch begrenzende Verdünnung in 96-Mulden-Mikrotiterplatten kloniert. Die Gewebekultur-überstände positiver Zellenkulturen wurden dann durch Western-Blotting-Analyse auf Anti-P39-Antikörper getestet. Zwei für eine solche Analyse positive Klone, die mit A6 und D1 bezeichnet werden, wurden bei der nachfolgenden Analyse von P39-Antigen und der Expression verschiedener Subklone von pSPR33 verwendet, wie früher beschrieben.
Zum Untersuchen verschiedener Antiseren und monoklonaler Antikörper durch Western-Blotting-Analyse auf Anti-P39- Antikörper wurde mit pSPR33 rekombinante E. Coli zunächst durch Wärme in 2-Merkaptoethanol lysiert und dann in einem 12,5-%-SDS-Polyacrylamidgel während 6 Stunden einer Elektrophorese unterzogen. Das Gel wurde dann während 3 Stunden mit dem Towbin-System einem Elektroblotting unterzogen, um die rekombinanten E. Coli-Proteine auf eine Nitrozellulosemembran zu übertragen. Nach der übertragung wurde die Membran TSE- Tween blockiert, um die nichtspezifische Bindung von Immunklobulinen zu verringern. Als nächstes wurde die Membran in das entsprechende Testserum bzw. den monoklonalen Antikörper eingetaucht und bei Raumtemperatur unter Schütteln während einer Stunde inkubiert. Die Membran wurde sodann mit Wasser gespült und anschließend in einer Lösung von 1-Protein A inkubiert, um an die Antigene auf der Membran gebundene Antikörper zu markieren. Nach der Inkubation und dem Abwaschen überschüssiger Markierung wurde die Membran getrocknet und auf Kodak-XAR-5-Film zum autoradiographischen Nachweis der Anti-P39-Antikörper aufgelegt. Ähnliche Untersuchungen wurden für die anderen Subklone durchgeführt.
Die Plasmide pSPR3B und pSPR46 exprimierten die gleiche Menge an P39 wie das primäre Klon pSPR33. Dies zusammen mit der Tatsache, daß das Plasmid pSPR51 P39 exprimierte, während pSPR54 das nicht tat, läßt darauf schließen, daß das Gen für P39 zwischen der BamHI- und der HindIII-Stelle liegt (Fig. 9, schwarzer Balken). Die P39-Menge bei den Zellenlysaten der Klone pSPR51 und pSPR454 ist kleiner als bei den anderen Klonen, die P39-Positiv waren. Dies läßt vermuten, daß Sequenzen auf der rechten Seite des Genorts für eine volle Expression wichtig waren. P39 wurde durch ein Klon (pSPR46) produziert, welches das Insert in entgegengesetzter Orientierung mit Bezug auf diejenige der anderen P39-produzierene den Klone (z.B. pSPR3B) enthielt. Deshalb war die Expression von P39 nicht vom Lac-Promoter (Fig. 9, schwarze Pfeile) abhängig. Das pst1-Fragment, das von pSPR33 subkloniert und als pSPR44 (Fig. 9) bezeichnet wurde, exprimierte keine nachweisbaren Mengen von P39. Deshalb wurde angenommen, daß das P39- Gen von links nach rechts transkribiert wird. Es wird vermutet, daß die zusätzlichen Sequenzen dem zweiten der beiden Gene entsprechen, das ähnliche, aber verschiedene Antigene exprimiert, und daß sie kollektiv die Antikörpermenge verstärken, die sich im Immunblotting-Versuch an das 39-kDa-Band binden. Weil das Plasmid pSPR44 keine mit polyklonalem Anti- P39-Serum reaktive Antigene exprimierte, kann die Expression des rechts von dem schwarzen Kasten (Fig. 9) gelegenen zweiten Gens von der Transkription des ersten Gens abhängig sein.

Beispiel 5:

DNA-Sequenzbestimmung des D39 kodierenden Gens.

Die DNA-Sequenz (Fig. 10) wurde für das BamHI-HindIII-Fragment (Fig. 9, schwarzer Kasten) durch die in Fig. 11b zusammengefaßte Strategie bestimmt. Im wesentlichen wurde die Sequenz unter Verwendung von Primern erhalten, die aus einer unter Verwendung des universellen M13-Primers und der Subklone pSPR46, pSPR44 und pSPR45 bestimmten DNA-Sequenz und den Mung-Bead-Nuclease-Deletionsvarianten pSPR51, pSPR54, pSPR56, und pSPR57 des Plasmids pSPR45 aufgebaut waren. Die DNA-Sequenz rechts von der HindIII-Restriktionsstelle wurde unter Verwendung von Primern bestimmt, die aus existierender Sequenzinformation aufgebaut waren.
Es wurde zunächst DNA-Sequenz unter Verwendung von Primern erhalten, die zur Verwendung mit dem M13-Universalprimer und verfügbarer Sequenz des Klonierungsvektors aufgebaut waren. Das Protokoll zur Durchführung der Sequenzreaktionen war exakt wie von United States Biochemical vorgegeben (Sequenase Version 2.0: Step-by-Step Protokolls for DNA Sequencing with Sequenase Version 2.0 - 5. Auflage). Die Sequenzreaktionen wurden in kleinen Kunststoff-Zentrifugenröhrchen durchgeführt. Jedes Reaktionsvolumen betrug 10 ml und umfaßte Primer, Puffer und DNA, um Primer wieder zu Matrizen reassozueren zu lassen. Die Markierung wurde durch Zugabe von Sequenase, ³&sup5;S-DATP und zusätzlichen Puffer durchgeführt. Die Beendigung der A-, T-, G- und C-Reaktionen erfolgte durch Zugabe einer Stopplösung. Sodann wurden Proben während 2 Minuten auf 70 bis 80ºC erwärmt, und dann wurden jeder Gelbahn 2 bis 3 ml jedes Gemisches zugegeben. Alle Sequenzierungsgele bestanden aus 6% Acrylamid - 7M-Harnstoff - 1 x TBE und wurden zwei bzw. vier Stunden lang benutzt. Nach der Benutzung wurden die Gele in 5% Essigsäure - 15% Methanol fixiert, um Harnstoff zu entfernen. Die Gele wurden dann unter Vakuum bei 80ºC getrocknet und dann auf Kodak-XAR-5-Film aufgelegt. Die belichteten Filme wurden dann auf autoradiographische Bänder analysiert, um die Sequenz zu bestimmen. Von jeder Reaktion wurden terminale Sequenzen verwendet, um neue Oligonukleotid-Primer zur Verwendung bei den nächsten Sequenzierungsreaktionen zu erzeugen. Daher konnten die gesamten Sequenzen jedes DNA-Strangs durch sukzessive Verlängerungen unter Verwendung von Primern bestimmt werden, die durch vorhergehende Reaktionen bestimmt wurden. Beispielsweise können synthetische Primer von 20 Nukleotiden aus einer Region der Sequenz mit der Identifikationsnummer 1 aufgebaut und zum Sequenzieren von etwa 300 Basen eingesetzt werden. Dann können weitere Primer aus der abgeleiteten Sequenz aufgebaut werden. Derartige Techniken sind Standard und sind dem Durchschnittsfachmann bekannt.
Die Analyse der vollständigen DNA-Sequenz (Sequenzidentifikationsnummer 1) brachte zwei offene Leseraster (Fig. 10a) zum Vorschein. Das Gen 1 war im Leseraster 1 und das Gen 2 war im Leseraster 3. Weitere signifikante offene Leseraster wurden nicht festgestellt. Die DNA-Sequenz wurde von dem Adenin-Rest des ATG-Startkodons für das durch das Gen 1 kodierte Protein aus numeriert, weil angenommen wird, daß dieses das erste transkribierte Gen ist. Dieses offene Leseraster (Nukleotide 1 bis 1020) wurde durch Sequenzieren der ersten 15 Aminosäuren von P39 bestätigt, das durch das Klon pSPR51 exprimiert wurde. Dieses Klon hatte das Gen 2 verloren, und deshalb wurde sein Genprodukt während der Proteinsequenzierung nicht festgestellt. Das Gen 1 entspricht einem Protein von 339n Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 36.926 kDa. Weil dieses Gen ein Protein kodiert, das mit allen 10 Serumproben reagierte, die von menschlichen Lyme- Patienten genommen waren, aber nicht mit den 10 normalen Kontrollproben (Daten nicht dargestellt), wird angenommen, daß dieses Protein mit P39 äquivalent ist. Wegen der Existenz eines zweiten Genprodukts mit einem ähnlichen Molekulargewicht, das ebenfalls menschliches Serum binden kann, wurde festgestellt, daß das P39-Antigen, wie vorstehend beschrieben, nicht ein Protein ist, sondern aus zwei Proteinen besteht (39α und 39β ). Dies wird durch die in Fig. 9 dargestellten Expressionsdaten nahegelegt, wo das P39-Signal verstärkt zu werden scheint, wenn beide Gene vorhanden sind. Das offene Leseraster (Nukleotide 1107 bis 2132) des Gens 2 ist als p39β bezeichnet worden. Das offene Leseraster dieses Gens beginnt 116 Nukleotide nach p39α wird ein Protein von 341 Aminosäuren (37.506 kDa). Ein Promotor 5' zu dem Startkodon in p39α schien in den klassischen -10- und -35-Regionen vorhanden zu sein, während bei p39β erkennbare Promotorsequenzen fehlten. Beide Gene hatten jedoch mutmaßliche ribosomale Bindungsstellen unmittelbar an der 5'-Stelle zu den Startkodonen und waren jeweils mit einem TAA-Kodon an den Positionen 1018 bzw. 2130 beendet. Die mutmaßlichen Promotorund ribosomalen Bindungsstellen ähneln denjenigen bei anderen Genen von B. Burgdorferi einschließlich dem Opsa-Operon und dem Flagellin-Gen (Wallich, R. S.E. Moter, M.M. Simon, K. Ebnet, A. Heiberger, und M. D. Kramer, 1990: "The Borrelia Burgdorferi Flagellum-associated 41 Kilodalton Antigen (Flagellin); Molecular cloning, expression and amplification of the Gen", Infect. Immun. 58, 1711 bis 1719). Anders als bei den das Flagellin kodierenden Genen, OspA und OspB, wurden am 3'-Ende sowohl von p39α als auch p39β keine Strukturen festgestellt, was nahelegt, daß die Termination außerhalb dessen liegt, was sequenziert worden ist. Trotzdem ist entsprechend den Transkriptionsterminationsregionen in vielen Bakterien einschließlich Borrelia diese Region AT-reich, was vermuten läßt, daß die Termination in der Nähe des Nukleotids 2170 liegt.
Ein Vergleich der DNA-Sequenzen von p39α und p39β durch das globale Abgleichprogramm von Needleman und Munsch (Needleman und Munsch. J.Mol. Biol., 148, 443 bis 453 (1970)) zeigt, daß diese Gene eine DNA-Sequenzgleichheit von 62% haben. Zwischen den P39-Genen und sowohl dem Ospa-Ospb-Operon als auch dem Flagellin-Gen wurde keine wesentliche Sequenzgleichheit festgestellt. Die Analyse von Kodonpräferenz und Gehalt an G+C des p39-Operons zeigte, daß keine signifikanten Differenzen zwischen ihm und den anderen Borrelia-Genen bestand.

Beispiel 6:

Bestimmung der Transkriptgröße von p39α und p39β

Northern-Blotting-Analysen (Fig. 12) der Gesamt-RNA von B.- Burgdoreri-Stämmen B31 und Sh-2-82 wurden mit einem mit Bezug auf die p39α - und p39β -Stellen (Fig. 11) internen PstI- HindIII-Fragment sondiert. Diese Sonde wies eine einfache 2,35 kb-Information nach und scheint zu bestätigen, daß die P39α - und β- mRNA polyzistronisch ist und das p39α und p39β ein Operon (p39) darstellen. Diese Schlußfolgerung wird von den oben beschriebenen DNA-Sequenzdaten gestütz, die zeigen, daß p39β keinen erkennbaren Promotor zu haben scheint. Des weiteren erklärt dies, warum Klone, die einen intakten p39β enthalten, aber bei denen der Promotor für p39α fehlt (z.B. pSPR44), keine mit polyklonalem Anti-P39-Serum (Anti-pSPR33) reaktiven Antigene exprimieren (Fig. 9). Als Kontrolle für die Spezifizität wurde gezeigt, daß Gesamt-RNA von E. Coli nicht zu dem PstI-HindIII-Borrelia-Fragment hybridisiert (Fig. 12). Die Aminosäurezusammensetzungen von p39α und P39β sind ähnlich (Sequenzidentifikationsnummern 2 und 3, Tafel 4), obwohl sie von der Aminosäurezusammensetzung von OspA und OspB verschieden sind. P39α und P39β enthielt vergleichsweise viel größere Mengen von Isoleucin, Prolin, Arginin, Phenylalanin, Tyrosin und Methionin. Des weiteren bildeten Lysin und Thrionin, die in OspA und OspB in größeren Mengen vorhanden sind, einen viel kleineren Anteil von P39α und P39β Zwischen P39α und P39β bestand der Hauptunterschied in den drei Cystein-Resten im letzteren Protein und den vier Histidin-Resten im ersteren Protein (Tafel 4). Tafel 4 Aminosäurezusammensetzung von durch das P39-Operon kodierten Proteinen
P39β hat wie OspA und OspB ein klassisches Signalpeptid einschließlich der mutmaßlichen Spaltstelle, die durch das Tetrapeptid Leu-X-X-Cys definiert ist (Fig. 13), wobei X gewöhnlich irgendeine neutrale Aminosäure darstellt. Bei P39β befindet sich der leu-Rest an der Position 12 und das Cystein an der Position 15 (Sequenzidentifikationsnummer 1). Obwohl P39α auch einen hydrophoben N-Terminus (Fig. 14) und ein Cystein in ähnlicher Position (Position 18) hat, weist dieses Protein das Tetrapeptid nicht auf, was vermuten läßt, daß seine mutmaßliche Signalsequenz in anderer Weise als bei der entsprechenden Region in P39β verarbeitet wird. Weil P39α und P39β jeweils ein Cystein in nahezu der gleichen Position wie das Cystein in OspA und OspB haben, und weil vorhergesagt wurde, daß die beiden letzteren Proteine am Mutationsort akyliert sind, können P39α und P39β wegen der Akylierung ihrer N-terminalen Cystein-Reste auch Lipoproteine sein.
Ein Aminosäuresequenzvergleich von P39α und P39β zeigte eine Sequenzidentität von 52%. Dies ist ähnlich wie die berichtete 53%ige Gleichheit zwischen OspA und OspB. Überraschend und im Gegensatz zu dem Befund bei OspA und OspB haben die p39-Operon-Proteine sehr ähnliche Hydropathie-Ergebnisse (Fig. 14). Dies zusammen mit dem hohen Maß an Sequenzähnlichkeit zeigt, das die beiden Proteine eine beträchtliche Anzahl an gleichen Epitopen mit immunogenen Eigenschaften gemeinsam haben. Gegen OspA eingesetzes Antiserum reagiert mit OspB, was anzeigt, daß Proteine wie P39α und P39β mit signifikantem Ausmaß an Aminosäureidentität kreuzreaktive Epitope gemeinsam haben.
Daß das immundominante Antigen P39 kodierende genetische Element wurde identifiziert und sequenziert. Es wurde gezeigt, daß dieses Element aus zwei Genen besteht, die ein Operon darstellen, das zwei ähnlich große Proteine kodiert, P39α und P38β , die eine beträchtliche Aminosäuresequenzgleichheit haben. Hier wird erstmals ein Operon berichtet, das mutmaßliche Membranproteine kodiert, die ihren chromosomalen Ursprung in B. Burgdorferi haben. Es wird angenommen, daß sowohl die α - wie auch die β -Form zu dem Signal beiträgt, wenn Antikörper von infizierten Tieren sich in Western-Blottings an das P39-Band binden (Simpson, W.J., B. Burgdorfer, M.E. Schrumpf, R.H. Karstens, und T.G. Schwan, 1991 "Antibody to a 39 kDa Borrelia Burgdorferi antigen (P39) as a marker for infection in experimentally and naturally inoculated animals", J. Clin. Microbio. 29, 236 bis 243; Simpson, W.J., M.E. Schrumpf, und T.G. Schwan, 1990: "Reactivity human Lyme borreliosis sera with a 39-kilodalton antigen specific to Borrelia Burgdorferi", J. Clin. Microbiol. 28, 1329 bis 1337). Daraus stellt sich die Frage, ob sämtliches Lyme-Serum gleichermaßen gut sowohl mit der α - als auch der β-Form reagiert, oder ob einiges Serum mit dem einen und nicht mit dem anderen reagiert.
Die Funktion von P39α und P39β ist nicht bekannt, aber mehrere von der vorhergesagten Aminosäuresequenz abgeleiteten Charakteristiken lassen mehrere Möglichkeiten vermuten. Diese Proteine zeigen abwechselnde hydrophobe und hydrophile Regionen, die für ein amphophiles bzw. transmembranes Protein charakteristisch sind. Entsprechend einer Membranstelle zeigen immunologische elektronenmikroskopische Analysen von B. Burgdorferi mit monoklonalem Antikörper A6, daß das P39- Antigen sich in den Membranen befindet bzw. diesen zugeordnet ist (unveröffentlichte Daten).
P39β ähnelt OspA und OspB darin, daß es typische Signalsequenz und die Spaltstelle am ersten Cystein-Rest hat. Ebenso wie OspA und OspB ist P39β wahrscheinlich der Membran zugeordnet und kann am N-Terminalen Cystein akyliert sein. P39α ist jedoch mit Bezug auf seine Signalsequenz verschieden, die nicht geteilt zu sein braucht, weil dort die Erkennungsstelle des Typs 1 fehlt. Falls dies so ist, kann P39α und daher auch das Antigen sekretiert werden, das während einer Infektion die Immunreaktion stimuliert. Diese Ansicht würde die frühere Beobachtung erklären helfen, daß Anti-P39-Antikörper leichter zusammen mit dem infizierten Zustand erscheinen, weil eine sekretierte Form während der frühen Stufen einer Infektion sich schneller ansammeln könnte als eine den Zellen zugeordnete Form (Simpson, W.J., W. Burgdorfer, M.E. Schrumpf, R.H. Carstens, und T.G. Schwan, März 91: Antibody to a 39 kDA Borrelia Burgdorferi Antigen (P39) as a marker for infection in experimentally and naturally inoculated animals" J. Clin. Microbiol. 29, 236 bis 243).

Beispiel 6:

Verstärkung des Gens 1 (P39α ) und des Gens 2 (P39β )

Um die Immunreaktivität sowohl von P39α als auch P39β zu bestimmen, werden das Gen 1 und das Gen 2 gesondert kloniert und die Expressionsprodukte auf ihre Reaktivität mit Lyme- Immunseren getestet. Zum Klonieren und Exprimieren jedes Gens können Standardmethoden angewendet werden; jedoch wird bevorzugt, jedes Gen gesondert unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und der in den Sequenzidentifikationsnummern 4 bis 7 identifizierten Primärsequenzen zu amplifizieren.
Die beschriebenen synthetischen Oligonukleotid-DNA-Primer wurden mit einem DNA-Synthesizer Model 380-B von Applied Biosystems Ind. unter Beachtung der Anweisungen des Herstellers aufgebaut. Bei diesem Verfahren werden kurze Ketten von Nukleotiden in einer spezifischen Reihenfolge in einer konzentrierten Ammoniumhydroxidlösung hergestellt. Dieses Material wird dann unter Vakuum zentrifugiert, um das Ammoniumhydroxyd abzuscheiden. Das trockene DNA-Pellet wird dann in TE-Puffer resuspendiert, und die DNA-Konzentration wird durch spektrophotometische Absorbanz bei 260 nm bestimmt. Sodann werden die Konzentration des DNA-Primers für die PCR entsprechend dem von Perkin-Elmer-Cetus erstellten Protokoll standardisiert.
Um B.-Burgdorferi-DNA durch PCR unter Verwendung der beschriebenen Primer zu amplifizieren, erfordert das Protokoll das Mischen der B.-Burgdorferi-DNA mit beiden Primern 1 und 2 für das Gen 1 (Sequenzen 4 und 5), den Primern 1 und 2 für das Gen 2 (Sequenzen 6 und 7) und den Sequenzen 4 und 7 zum Amplifizieren beider Gene 1 und 2 zusammen. Zu dem PCR-Gemisch wird außerdem die DNA-Taq-Polymerase, Puffer, und das Gemisch der 4 Nukleotide (dNTPs) zugegeben. Dieses Reaktionsgemisch wird dann wiederholten Zyklen mit 3 verschiedenen Temperaturen unterzogen, um das Denaturieren der DNA, das Reassozueren der Primer zur Matrizen-DNA, und die Verlängerung (Polymerisierung) zum Erzeugen eines neuen DNA-Strangs zu bewirken. Nach 30 Zyklen unter Verwendung des thermischen Zyklusgeräts wurden die PCR-Amplifikationsprodukte getestet, in dem 10 Mikroliter jeder Probe einer Elektrophorese in einem Agarosegel unterzogen wurden.
Damit die amplifizierten Produkte mittels dem Fachmann bekannter Standardtechniken in bekannte Vektoren eingesetzt werden können, werden am 5'-Ende jedes Primers Nukleotide hinzugefügt, die die Erkennungsstelle für die Ristriktionsendonuklease EcoRI (G/AATTC) kodieren.
Die amplifizierten DNA-Produkte bestehen aus jedem Gen unter Zusatz einer EcoRI-Stelle an jedem Ende, das auch das Einfügen dieser Sequenz in irgend einen von vielen verfügbaren Klonierungs- und Expressionsvektoren ermöglicht, die nur eine verfügbare EcoRI-Stelle haben, wie beispielsweise poc, pbluescript, pBR322 usw.. Diese Vektoren werden in Wirtszellen eingesetzt, um die Expression der DNA-Produkte zu erhalten. Diese Techniken sind dem Durchschnittsfachmann bekannt.
Als nächstes werden Rekombinanten, in welche die DNA mit der geeigneten Größe eingefügt ist (1017 Basen für das Gen 1, 1023 bp für das Gen 2) durch Southern-Blotting-Analyse untersucht, um die klonierten Fragmente zu identifizieren. DNA von rekombinanten mit dem mutmaßlichen Gen 1 bzw. Gen 2 wird in Agarosegelen abgetrennt, auf Nitrozelluslosemembranen übertragen, und mit dem gereinigten EcoRI-Fragment von pSPR33 sondiert. Solche Verfahren sind Stand der Techniken, die jedem Fachmann bekannt sind. Nach Bestätigung, daß die amplifizierten klonierten Fragmente mit dem pSPR33-Insert homolog sind, werden die verschiedenen Klone auf Expression von P39- Antigenen unter Anwendung von Standard-Western-Immunblotting-Techniken getestet. Kaninchen-Anti-pSPR33-Antiserum, monoklonale Anti-P39-Antikörper (wie vorstehend beschrieben), und Konvaleszensserum von menschlichen Lyme-Patienten werden jeweils mit Ganzzellenlysaten der verschiedenen Klone reagiert, um die Expressionsprodukte jedes Gens zu identifizieren und zu erhalten. Die synthetischen Peptide können kartiert werden, um spezifische immunreaktive Epitope zu identifizieren, die in Bioversuchen zum Nachweis von Lyme- Borreliose oder in Impfstoffen für Säuger gegen Lyme- Borreliose verwendet werden.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) Allgemeine Information:
(i) Anmelder:
(ii) Bezeichnung der Erfindung: Antigene Proteine von Borrelia Burgdorferi
(iii) Anzahl der Sequenzen: 7
(iv) Korrespondenzandresse:
(A) Adressat:
(B) Straße:
(C) Stadt:
(D) Staat:
(E) Land:
(F) Postleitzahl:
(v) Computerlesbare Form:
(A) Typ des Mediums: Diskette 3,5 Zoll, 1,44 Mb- Speicherkapazität
(B) Computer: IBM-PC-Kompatibel
(C) Betriebssystem: MS-DOS
(D) Software: Wordperfect 5.0
(vi) Gegenwärtige Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldungsnummer:
(B) Anmeldetag:
(C) Klassifikation:
(vii) Voranmeldungsdaten:
(A) Anmeldenummer:
(B) Anmeldetag:
(viii) Anwaltsdaten:
(A) Name:
(B) Registrierungsnummer:
(C) Anwaltsaktenzeichen:
(ix) Telekommunikationsdaten
(A) Telefon:
(B) Telefax:
(C) Telex:
(2) Information zu Sequenzidentifizierungsnummer 1:
(i) Sequenzcharakteristiken:
(A) Länge: 2.307
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: Linear
(ii) Molekültyp: Genomische DNA
(A) Beschreibung:
(iii) Hypothetisch:
(iv) Antisinn:
(v) Fragmenttyp:
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(A) Organismus: Borrelia Burgdorferi
(B) Stamm: Sh-2-82
(C) individuelles Isolat: Sh-2-82, P-6
(D) Entwicklungsstufe:
(E) Haplotyp:
(F) Gewebetyp:
(G) Zelltyp:
(H) Zelllinie:
(I) Organelle:
(vii) Direkte Herkunft:
(A) Bibliothek:
(B) Klon: pSPR33
(viii) Position in Genom:
(A) Chromosom/Segment:
(B) Kartenposition:
(C) Einheiten:
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel:
(B) Lage:
(C) Identifikationsmethode: Durch Experiment
(D) Weitere Information: Expression von P39-Ant igenen
(x) Publikationsdaten:
(A) Autoren:
(B) Titel:
(C) Zeitschrift:
(D) Band:
(E) Ausgabe:
(F) Seiten:
(G) Datum:
(H) Dokumentnummer:
(I) Anmeldetag:
(J) Veröffentlichungsdatum:
(K) Relevante Reste:
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 1
(2) Information zu Sequenzidentifikationsnummer 2:
(i) Sequenzcharakteristiken:
(A) Länge: 1.109
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: Linear
(ii) Molekültyp: Genomische DNA
(A) Beschreibung:
(III) Hypothetisch:
(iv) Antisinn:
(v) Fragmenttyp:
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(A) Organismus: Borrelia Burgdorferi
(B) Stamm: Sh-2-82
(C) Individuelles Isolat: Sh-2-82, P-6
(D) Entwicklungsstufe:
(E) Haplotyp:
(F) Gewebetyp:
(G) Zelltyp:
(H) Zelllinie:
(I) Organelle:
(vii) Direkte Herkunft:
(A) Bibliothek:
(B) Klon: pSPR33
(viii) Position in Genom:
(A) Chromosom/Segment:
(B) Kartenposition:
(C) Einheiten:
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel:
(B) Ort:
(C) Identifikationsmethode: durch Experiment
(D) Weitere Information:
(x) Publikationsdaten:
(A) Autoren:
(B) Titel:
(C) Zeitschrift:
(D) Band:
(E) Ausgabe:
(F) Seiten:
(G) Datum:
(H) Dokumentennummer:
(I) Anmeldetag:
(J) Veröffentlichungsdatum:
(K) Relevante Reste:
(xi) Sequenzbeschreibung:
Sequenz identifikationsnummer 2:
(2) Information zu Sequenzidentifikationsnummer 3:
(i) Sequenzcharakteristiken:
(A) Länge: 1.198
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: Linear
(ii) Molekültyp: Genomische DNA
(A) Beschreibung:
(iii) Hypothetisch:
(iv) Antisinn:
(v) Fragmenttyp:
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(A) Organismus: Borrelia Burgdorferi
(B) Stamm: Sh-2-82
(C) Individuelles Isolat: Sh-2-82, P-6
(D) Entwicklungsstufe:
(E) Haplotyp:
(F) Gewebetyp:
(G) Zelltyp:
(H) Zelllinie:
(I) Organelle:
(vii) Direkte Herkunft:
(A) Bibliothek:
(B) Klon: pSPR33
(viii) Position in Genom:
(A) Chromosom/Segment:
(B) Kartenposition:
(C) Einheiten:
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel:
(B) Ort:
(C) Identifikationsmethode:
(D) Weitere Information:
(x) Publikationsdaten:
(A) Autoren:
(B) Titel:
(C) Zeitschrift:
(D) Band:
(E) Ausgabe:
(F) Seiten:
(G) Datum:
(H) Dokumentennummer:
(I) Anmeldetag:
(J) Veröffentlichungsdatum:
(K) Relevante Reste:
(xi) Sequenzbeschreibung:
Sequenzidentifikationsnummer 3:
(2) Information zu Sequenzidentifikationsnummer 4:
(i) Sequenz charakteristiken:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: Linear
(ii) Molekültyp: Synthetische DNA
(A) Beschreibung: Primer aus der flankierenden Sequenz von 5' zu Gen 1 von P39 in B. Burgdorferi
(iii) Hypothetisch:
(iv) Antisinn:
(v) Fragmenttyp:
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(A) Organismus: Borrelia Burgdorferi
(B) Stamm: Sh-2-82
(C) Individuelles Isolat: Sh-2-82, P-6
(D) Entwicklungsstufe:
(E) Haplotyp:
(F) Gewebetyp:
(G) Zelltyp:
(H) Zelllinie:
(I) Organelle:
(vii) Direkte Herkunft:
(A) Bibliothek:
(B) Klon: pSPR33
(viii) Position in Genom:
(A) Chromosom/Segment:
(B) Kartenposition:
(C) Einheiten:
(ix) Merkmal: Primer aus der flankierenden DNA von 5' zum Gen 1 von P39 in B. Burgdorferi
(A) Name/Schlüssel:
(B) Ort:
(C) Identifikationsmethode:
(D) Weitere Information:
(x) Publikationsdaten:
(A) Autoren:
(B) Titel:
(C) Zeitschrift:
(D) Band:
(E) Ausgabe:
(F) Seiten:
(G) Datum:
(H) Dokumentennummer:
(I) Anmeldetag:
(J) Veröffentlichungsdatum:
(K) Relevante Reste:
(xi) Sequenzbeschreibung:
Sequenz identifikationsnummer 4:
ATG AAT AAA ATA TTG TTG 18
(2) Information zu Sequenzidentifikationsnummer 5:
(i) Sequenzcharakteristiken:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: Linear
(ii) Molekültyp: Synthetische DNA
(A) Beschreibung: Primer aus innerhalb der Insertionssequenz der Gene 1 und 2 von P39 in B. Burgdorferi
(iii) Hypothetisch:
(iv) Antisinn:
(v) Fragmenttyp:
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(A) Organismus: Borrelia Burgdorferi
(B) Stamm: Sh-2-82
(C) Individuelles Isolat: Sh-2-82, P-6
(D) Entwicklungsstufe:
(E) Haplotyp:
(F) Gewebetyp:
(G) Zelltyp:
(H) Zelllinie:
(I) Organelle:
(vii) Direkte Herkunft:
(A) Bibliothek:
(B) Klon: pSPR33
(viii) Position in Genom:
(A) Chromosom/Segment:
(B) Kartenposition:
(C) Einheiten:
(ix) Merkmal: Primer aus innerhalb der Insertionssequenz der Gene 1 und 2 von P39 in B. Burgdorferi
(A) Name/Schlüssel:
(B) Ort:
(C) Identifikationsmethode:
(D) Weitere Information:
(x) Publikationsdaten:
(A) Autoren:
(B) Titel:
(C) Zeitschrift:
(D) Band:
(E) Ausgabe:
(F) Seiten:
(G) Datum:
(H) Dokumentennummer:
(I) Anmeldetag:
(J) Veröffentlichungsdatum:
(K) Relevante Reste:
(xi) Sequenzbeschreibung:
Sequenz identifikationsnummer 5:
AAT AAA TTC TTT AAG AAA 18
(2) Information zu Sequenzidentifikationsnummer 6:
(i) Sequenzcharakteristiken:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: Linear
(ii) Molekültyp: Synthetische DNA
(A) Beschreibung: Primer aus innerhalb der Insertionssequenz der Gene 1 und 2 von P39 in B. Burgdorferi
(iii) Hypothetisch:
(iv) Antisinn:
(v) Fragmenttyp:
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(A) Organismus: Borrelia Burgdorferi
(B) Stamm: Sh-2-82
(C) Individuelles Isolat: Sh-2-82, P-6
(D) Entwicklungsstufe:
(E) Haplotyp:
(F) Gewebetyp:
(G) Zelltyp:
(H) Zelllinie:
(I) Organelle:
(vii) Direkte Herkunft:
(A) Bibliothek:
(B) Klon: pSPR33
(viii) Position in Genom:
(A) Chromosom/Segment:
(B) Kartenposition:
(C) Einheiten:
(ix) Merkmal: Primer von innerhalb der Insertionssequenz der Gene 1 und 2 von P39 in B. Burgdorferi
(A) Name/Schlüssel:
(B) Ort:
(C) Identifikationsmethode:
(D) Weitere Information:
(x) Publikationsdaten:
(A) Autoren:
(B) Titel:
(C) Zeitschrift:
(D) Band:
(E) Ausgabe:
(F) Seiten:
(G) Datum:
(H) Dokumentennummer:
(I) Anmeldetag:
(J) Veröffentlichungsdatum:
(K) Relevante Reste:
(xi) Sequenzbeschreibung:
Sequenz identifikationsnummer 6:
ATG AGA ATT GTA ATT TTT 18
(2) Information zu Sequenzidentifikationsnummer 7:
(i) Sequenzcharakteristiken:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: Linear
(ii) Molekültyp: Synthetische DNA
(A) Beschreibung: Primer aus innerhalb der Insertionssequenz der Gene 1 und 2 von P39 in B. Burgdorferi
(iii) Hypolhelisch:
(iv) Antisinn:
(v) Fragmenttyp:
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(A) Organismus: Borrelia Burgdorferi
(B) Stamm: Sh-2-82
(C) Individuelles Isolat: Sh-2-82, P-6
(D) Entwicklungsstufe:
(E) Haplotyp:
(F) Gewebetyp:
(G) Zelltyp:
(H) Zelllinie:
(I) Organelle:
(vii) Direkte Herkunft:
(A) Bibliothek:
(B) Klon: pspfl33
(viii) Position in Genom:
(A) Chroniosom/Segment:
(B) Kartenposition:
(C) Einheiten:
(ix ) Merkmal: Primer aus innerhalb der Insertionssequenz von 5' zu Gen 2 von p39 in B. Burgdorferi
(A) Name/Schlüssel:
(B) Ort:
(C) Identifikationsmethode:
(D) Weitere Information:
(x) Publikationsdaten:
(A) Autoren:
(B) Titel:
(C) Zeitschrift:
(D) Band:
(E) Ausgabe:
(F) Seiten:
(G) Datum:
(H) Dokumentennummer:
(I) Anmeldetag:
(J) Veröffentlichungsdatum:
(K) Relevante Reste:
(xi) Sequenzbeschreibung:
Sequenzidentifikationsnummer 7:
TAA ATT TAA TAT TTW TTT 18

Claims

1. Aus Borrelia burgdorferi erhältliches Protein mit einem Molekulargewicht von, durch SDS-PAGE bestimmt, etwa 39 Kilodalton, oder ein Teil hiervon, und mit spezifischer Reaktivität mit Säuger-Lyme-Borreliose-Serum, jedoch nicht mit Seren von Patienten, die an anderen durch Spirochaeten verursachten Krankheiten leiden, wobei das Protein aus einem DNA-Fragment exprimiert ist, das die Nukleotidsequenz aufweist, wie sie unter einer der Sequenz-Identifikationsnummern 1, 2 und 3 dargestellt ist.

2. Protein nach Anspruch 1, mit der unter der Sequenz-Identifikationsnummer 2 dargestellten Aminosäuresequenz,

3. Protein nach Anspruch 2, mit der unter der Sequenz-Identifikationsnummer 3 dargestellten Aminosäuresequenz.

4. Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Säuger ein Mensch ist.

5. DNA-Fragment, das ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert.

6. DNA-Fragment, das die Nukleotidsequenz, wie sie unter Sequenz-Identifikationsnummer 1 dargestellt ist, oder einen Mutanten davon enthält.

7. DNA-Fragment, das die Nukleotidsequenz, wie sie unter Sequenz-Identifikationsnummer 2 dargestellt ist, oder einen Mutanten davon enthält.

8. DNA-Fragment, welches die Nukleotidsequenz, wie sie unter Sequenz-Identifikationsnummer 3 dargestellt ist, oder einen Mutanten davon enthält.

9. Rekombinantes DNA-Molekül, zum Beispiel pSPR33, das ein DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 5 bis 8 und einen Vektor, zum Beispiel pBluescript SK, enthält.

10. Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 9 stabil transformiert und in der Lage ist, ein in dem DNA-Fragment kodiertes Protein zu exprimieren.

11. Wirtszelle nach Anspruch 10, bei der es sich um Escherichia coli handelt.

12. Verfahren zum Herstellen eines Borrelia burgdorferi-39- kD-Protein, bei welchem Wirtszellen nach Anspruch 10 oder 11 gezüchtet und das Protein isoliert wird.

13. Komplex, der ein an einen festen Träger gebundenes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 aufweist.

14. Für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 spezifischer Antikörper.

15. Antikörper nach Anspruch 14, der monoklonal ist.

16. Antikörper nach Anspruch 14, der polyklonal ist.

17. Komplex mit einem Antikörper nach einem der Ansprüche 14 bis 16, der an einen festen Träger gebunden ist.

18. Impfstoff für Säuger gegen Lyme-Borreliose-Krankheit, der ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

19. Impfstoff nach Anspruch 18, der außerdem ein Adjuvans enthält.

20. Biologischer Test zur Diagnose von Lyme-Borreliose-Krankheit, bestehend aus folgenden Schritten:

i) Beschichten einer Oberfläche mit einem Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4,

ii) In-Berührung-Bringen der beschichteten Oberfläche mit Serum eines Säugers, der mutmaßlich Lyme-Krankheit hat, und

III) Feststellen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines zwischen dem Protein und dafür spezifischen, in dem Serum vorhandenen Antikörpern gebildeten Komplexes.

21. Biologischer Test zur Diagnose von Lyme-Borreliose-Krankheit, mit folgenden Schritten:

i) Beschichten einer Oberfläche mit einem Antikörper nach einem der Ansprüche 14 bis 16,

iii) Feststellen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines zwischen den Antikörpern und in dem Serum vorhandenen Proteinen gebildeten Komplexes.

22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, wobei die Oberfläche ein Gel, ein Objektträger, eine Membran oder ein Mikrotiterplättchen ist.

23. Diagnoseausrüstung, die ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und Hilfsreagenzien enthält, die zur Verwendung beim Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern zu dem Protein in Säugerblut oder einer anderen Gewebeprobe geeignet sind.

24. Verfahren zum Prüfen eines Arzneimittels auf Anti-Lyme- Borreliose-Aktivität, wobei das Arzneimittel mit Zellen, die mit Borrelia burgdorferi Berührung hatten, unter solchen Bedingungen in Berührung gebracht wird, daß eine Hemmung der Expression des Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4 bewirkt werden kann.