DE69938183T2

DE69938183T2 - Verwendungen eines borreliaziden epitops des aussermembranproteins c von borrelia burgdorferi (ospc) als impstoff

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Publication number: DE69938183T2
Application number: DE69938183T
Authority: DE
Inventors: Steven N. Onalaska CALLISTER; Steven D. Onalaska LOVRICH; Ronald F. Madison SCHELL; Dean A. LaCrosse JOBE
Original assignee: Gundersen Lutheran Medical Foundation Inc La Crosse; Gundersen Medical Foundation Ltd
Current assignee: Gundersen Lutheran Medical Foundation Inc La Crosse; Gundersen Medical Foundation Ltd
Priority date: 1998-07-31
Filing date: 1999-07-30
Publication date: 2009-02-19
Anticipated expiration: 2019-07-31
Also published as: NO20010412D0; US6464985B1; NO20010412L; NO329227B1; US6210676B1; CA2332570A1; DE69938183D1; CA2332570C; DK1100922T3; JP2002523019A; JP3631960B2; CY1107944T1; EP1100922B1; EP1100922A1; ES2302385T3; AU5328299A; WO2000006745A1; PT1100922E; ATE386805T1

Description

Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen Anmeldung Serial-Nr. 60/094 955, eingereicht am 31. Juli 1998.
BIBLIOGRAPHIE
Die vollständigen bibliographischen Angaben der Literaturstellen, auf die hier durch in Klammer stehende Zahlen Bezug genommen wird, finden sich im Abschnitt "Bibliographie" vor den Ansprüchen.
GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren, die für die Prävention, Behandlung und frühzeitige Diagnose der Lyme-Krankheit bei Menschen und Tieren nützlich sind. Mehr im Besonderen betrifft diese Erfindung Osp-Polypeptide (Osp, outer surface Protein, Oberflächenprotein), die in der Lage sind, in einem Patienten die Bildung einer spezifischen Immunantwort hervorzurufen, die für die Diagnose, zum Vorhersagen der erfolgreichen Bekämpfung der Infektion oder zum Schutz vor der Lyme-Krankheit in einem Säugetierwirt wirksam ist. Diese Erfindung betrifft auch ein Screening-Verfahren für den Nachweis der Aktivität borreliazider anti-Osp Antikörper, auf Diagnose-Kits, welche das DraI-SmaI-DNA-Fragment von OspC enthalten, und auf Vakzine davon zusammen mit einem Vakzine-Träger oder ohne einen solchen.
BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK
Die Lyme-Krankheit (Lyme-Borreliose) wird durch den Biss einer infizierten Zecke übertragen und ist die in Europa und Nordamerika am häufigsten gemeldete von Zecken übertragene Infektion (1). Diese Multisystemerkrankung hat weltweit signifikante Morbidität verursacht.
Die Lyme-Krankheit wird durch die Spirochäte Borrelia burgdorferi (B. b.) verursacht, die hauptsächlich während des Blutsaugens von Ixodes-ssp.-Zecken übertragen wird. An fangs infizieren die Spirochäten die Haut und verursachen in der Mehrzahl der frühen Stufen eine Erythema-migrans-Läsion (2). Es kann sein, dass die Betroffenen während mehrerer Wochen nicht erkranken und dass Nervensystem-Symptome (Kopfschmerzen, Schwindel, Hörprobleme, Kribbeln und Konzentrationsstörungen) Wochen oder Monate lang nicht auftreten. Es ist jetzt bekannt, dass sich die Infektion auf das Nervensystem oder auf Gelenke ausbreiten kann, und das Risiko neurologischer Komplikationen oder Gelenksprobleme steigt, je länger die Krankheit unbehandelt bleibt. Die Infektion kann asymptomatisch sein oder eine ganze Reihe klinischer Erscheinungsformen haben, je nach den betroffenen Geweben, der Dauer der Infektion, Wirtsfaktoren wie Anfälligkeit des Immunsystems und immungenetischen Faktoren, die eine Veranlagung zur Entwicklung bestimmter Komplikationen bei einem Patienten mit sich bringen.
Die Behandlung von Symptome aufweisenden Patienten erfolgt derzeit mit einer Reihe von Antibiotika, z. B. Tetracyclinen, Penicillin und Cephalosporinen, aber die Studien zeigen uneinheitliche Ergebnisse. Wenn keine Behandlung erfolgt, können sich die Bakterien in das Zentralnervensystem, Herz, Gehirn oder in die Gelenke ausbreiten, wobei sie Arthritis, Herzinfektionen und neurologische Probleme verursachen und in seltenen Fällen zum Tod führen (3–6).
Nach der Infektion mit Borrelien beginnen B-Zellen im Körper Antikörper zu produzieren, die den Fremdorganismus erkennen. Es gibt zumindest zwei funktionelle Typen von Antikörpern, die als Antwort auf eine Borrelien-Infektion gebildet werden. Eine Antwort ist eine Antwort der unspezifischen Bindung/Opsonisierung (Beschichtung), die das Antigen „markiert" und zur Aufnahme von B. b. durch Phagozyten führen kann. Diese unspezifischen Antikörper werden gegen Proteine produziert, die bei verschiedenen Bakterienspezies verbreitet sind (viz. 41-kDa-Proteine für viele bakterielle Flagellen). Diese Antikörper erkennen daher ähnliche Antigene auf anderen Bakterien und binden daran. Daher sind diagnostische Tests, welche diese unspezifisch bindendenden/opsonisierenden Antikörper erkennen, im Allgemeinen unspezifisch.
Eine zweite funktionelle Antikörperantwort ist die Produktion borreliazider (letaler) Antikörper, die spezifisch Epitope auf einigen individuellen Proteinen der B.-b.-Organismen erkennen. Nach dem Anbinden dieser Antikörper an die B.-b.-Organismen interagiert das Komplement mit den Antikörpern zur Bildung eines Membran-angreifenden Komplexes, der den B.-b.-Organismus ohne das Erfordernis des Einfangens durch Phagozyten tötet.
Diese hochspezifische borreliazide Antikörperantwort ist oft innerhalb der ersten 2 Wochen der Infektion nachweisbar. Der erfolgreiche Nachweis und die Induktion borreliazider Antikörper gewinnen Bedeutung für das diagnostische und präventive Rüstzeug in Bezug auf die Lyme-Krankheit.
Kurz nach der Entdeckung der Lyme-Borreliose haben Forscher festgestellt, dass die Impfung von Versuchstieren mit ganzen B. b. Schutz vor der Provokation (Challenge) bot (7, 8). Weitere Studien ermittelten die Rolle von Antikörper-vermitteltem Schutz und bestätigten, dass die Impfung mit B. b. in der Lage ist, Antikörper zu induzieren, welche den Schutz vor einer B.-b.-Infektion bieten (9–11). Bisher hat die Impfung von Tieren mit Osps von B. b., insbesondere OspA (12–14), OspB (12, 14) und OspC (14–16), Schutz vor einer Infektion mit der Lyme-Spirochäte geboten. Es hat sich gezeigt, dass der Schutz nach der Impfung mit OspA und OspB auf der Induktion borreliazider Antikörper beruhte, die spezifisch die B.-b.-Organismen töteten (13, 14, 17–24). Im Gegensatz dazu wurden borreliazide anti-OspC Antikörper nach dem Impfen nicht nachgewiesen (14–16), und Forscher haben postuliert, dass der Schutz nach der Impfung mit OspC auf anderen Mechanismen beruht (16).
Die meisten Anstrengungen waren bisher auf die Entwicklung einer OspA-Vakzine konzentriert, hauptsächlich wegen der großen Mengen OspA, die an der Oberfläche vieler B.-b.-Laborisolate exprimiert werden. Bisher hatten die meisten Borrelia-Spirochäten äußere Oberflächen, die hauptsächlich OspA aufwiesen. Daher hat man angenommen, dass das Induzieren borreliazider Antikörper gegen OspA einen Schutz vor den Spirochäten bieten würde. SmithKline Beecham (Philadelphia, Penn.) und Pasteur Merieux Connaught (Lyon, Frankreich) haben Vakzinen entwickelt, die auf der Produktion borreliazider Antikörper gegen OspA basieren. Die SmithKline-Beecham-Vakzine wurde für den allgemeinen Gebrauch zugelassen, und die Pasteur-Merieux-Connaught-Vakzine wird derzeit von der U. S. Food und Drug Administration geprüft. Wie man erwarten würde, haben sich OspA-Vakzinen in Tiermodellen als effizient erwiesen, wenn die Provokation bei den Tieren mithilfe einer Nadel erfolgte. Ferner bot die OspA-Impfung Schutz vor mit B. b. infizierten Zecken. Der Schutz vor einer Zecken-Provokation war jedoch vom Vorhandensein hoher Level borreliazider anti-OspA Antikörper abhängig. Schwan et al. (28) haben kürzlich gezeigt, dass Spirochäten in infizierten Zecken an ihrer Oberfläche während der Aufnahme einer Blutmahlzeit OspA herunterregulieren. OspA-Vakzinen müssen also hohe Titer borreliazider anti-OspA Antikörper induzieren, um die Spirochäten im Mitteldarm infizierter Zecken zu zerstören, bevor sie OspA herunterregulieren. Daher ist die Dauer hoher Titer an borreliaziden anti-OspA Antikörpern eine kritische Determinante der langfristigen Wirksamkeit einer OspA-Vakzine.
Die Anmelder haben kürzlich gezeigt, dass eine kommerzielle OspA-Impfung nicht in der Lage ist, entsprechende Level borreliazider anti-OspA Antikörper bei Menschen aufrechtzuerhalten (23). Es ist auch unwahrscheinlich, dass eine anamnestische Antwort schnell genug erfolgen wird, um B.-b.-Organismen aus infizierten Zecken zu eliminieren. Zur Unterstützung wurde die Infektion mit B. b. bei mit OspA geimpften Menschen und Hunden dokumentiert (26, 27). Diese Ergebnisse heben die Notwendigkeit hervor, andere Komponenten von Vakzinen gegen Lyme-Borreliose zu evaluieren.
Zudem wird die Lyme-Krankheit üblicherweise diagnostiziert, indem Antikörper im Blut oder in der Zerebrospinalflüssigkeit nachgewiesen werden, aber die am häufigsten verwendeten Tests sind oft ungenau. Falsch-negative und, was häufiger ist, falsch-positive Ergebnisse stören die Serodiagnose der Lyme-Krankheit. Es wurden verschiedene Schemata unter Verwendung herkömmlicher diagnostischer Tests entwickelt, um die Lyme-Krankheit genauer nachzuweisen. Leider hat es kaum Verbesserungen gegeben, und Fehldiagnosen haben nach wie vor signifikante wirtschaftliche und gesundheitliche Auswirkungen. Ferner wird die kürzlich erfolgte Zulassung einer OspA-Vakzine gegen die Lyme-Krankheit die herkömmlicher diagnostischen Tests weiter beeinträchtigen. Es besteht also nach wie vor Bedarf an einem empfindlichen und spezifischen Test auf die Lyme-Krankheit, der als handelsübliches Kit allgemein verfügbar gemacht werden kann und der zwischen geimpften Individuen und Patienten mit der Lyme-Krankheit unterscheiden kann.
Der Nachweis borreliazider Antikörper kann das Problem ebenfalls lösen. Es wurde gezeigt, dass borreliazide Antikörper als Basis für einen empfindlichen und hochspezifischen serodiagnostischen Test dienen (17, 25–27). Tatsächlich wurde ein diagnostischer Test für die Lyme-Krankheit, der diese Antikörperantwort nachweist, bereits entwickelt, patentiert (37) und er ist im Handel erhältlich. Dieser Test beruht auf dem Nachweis hochspezifischer borreliazider Antikörper, die durch verschiedene B.-b.-Osps kurz nach der Infektion induziert werden. Es ist wichtig anzumerken, dass der Geimpfte geschützt ist, wenn ausreichend hohe Level borreliazider Antikörper durch Impfung induziert werden. Wenn jedoch ein Individuum infiziert wird, bevor borreliazide Antikörper vorhanden sind, kann die Person die Lyme-Krankheit trotz des allfälligen Vorhandenseins hoher Konzentrationen borreliazider Antikörper bekommen. Dieser Test bietet einen empfindlicheren und spezifischen alternativen Zugang zur Bestätigung der Lyme-Krankheit. Ferner korreliert der Antikörper, der durch den Test auf borreliazide Antikörper nachgewiesen wird, nicht mit dem Antikörper, der durch herkömmliche Tests nachgewiesen wird. In Studien mit Hamstern nahm der Nachweis borreliazider Antikörper mit der Eliminierung von B. b. aus dem Wirt ab (43). Im Gegensatz dazu bleiben die Antikörperantworten, die mit herkömmlichen Tests nachgewiesen werden, erhöht oder nehmen weiter zu. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Test auf borreliazide Antikörper ein prognostischer Indikator für die Clearance der Spirochäte ist.
Callister et al. (30) haben kürzlich die Möglichkeit der Steigerung der Empfindlichkeit des Tests auf borreliazide Antikörper bei Aufrechterhaltung der hervorragenden Spezifität durch Verwendung eines Test-Antigens (8. b. 50772), das kein OspA oder OspB an der Oberfläche aufweist, gezeigt. Die Anmeldern nehmen an, dass die erhöhte Empfindlichkeit mit B. b. 50772 auf dem Nachweis borreliazider Antikörper gegen OspC oder andere Osps beruht. Diese Ergebnisse erhöhen die Nützlichkeit des Tests auf borreliazide Antikörper, wie er in US 5 385 826 (Schell et al.), die hier zur Gänze zum Inhalt gemacht wird, offenbart ist.
Ferner haben verschiedene Forscher die Möglichkeit der Impfung mit OspC zum Schutz von Labortieren vor Provokation mit der Nadel (14–15) und vor natürlicher Infektion (16) gezeigt. Eine neuere Forschungsarbeit hat auch gezeigt, dass der passive Transfer von Immunsera für OspC Arthritis, Karditis und Infektion mit B. b. beseitigen könnte (44). Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Impfung mit OspC wirksamer sein kann als Impfungen mit OspA. Da jedoch hohe Konzentrationen borreliazider anti-OspC Antikörper in Immunserum nicht nachgewiesen wurden (14–16), wurde vermutet, dass zusätzliche Mechanismen für den OspC-vermittelten Schutz verantwortlich sind (16). Dass der Mechanismus nicht bekannt ist, macht das Verfolgen einer OspC-Lyme-Krankheit-Vakzine viel schwieriger. Ferner war die Verfolgung von OspC als Impfstoffkandidaten gegen Lyme-Borreliose behindert, weil OspC immunologisch und genetisch heterogener zu sein scheint als OspA (35–37), was die Forscher veranlasst zu vermuten, dass die Entwicklung einer umfassenden OspC-Vakzine ökonomisch nicht machbar ist. Schwan et al. (28) haben jedoch kürzlich gezeigt, dass relativ große Mengen OspC kurz nach dem Anbrin gen infizierter Zecken an Säugetierwirten schnell von B. b. synthetisiert werden und dass OspA nicht mehr in hoher Konzentration an der Oberfläche von B. b. exprimiert wird.
Kürzlich wurde berichtet, dass kurz vor der Zeckeninokulation des Wirts mit der Spirochäte B.-b.-Organismen OspC hochregulieren und begleitend OspA herunterregulieren (31, 32). Dies erklärt, warum anti-OspC Antikörper in Patienten mit früher Lyme-Borreliose unter den ersten Antikörperantworten nachgewiesen werden. Daraufhin haben verschiedene Forscher versucht oder versuchen noch, enzymgekoppelte Immunadsorptionstests (enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA) unter Verwendung ganzer rekombinanter OspC-Proteine zu entwickeln (38–42). Diese diagnostischen Tests sind ausreichend empfindlich, aber es fehlt ihnen weiter an Spezifität. Ferner können die durch diese Tests nachgewiesenen anti-OspC Antikörperantworten hoch bleiben oder selbst nach Clearance von B. b. aus dem Wirt weiter expandieren. Von besonderer Wichtigkeit ist die Neigung von OspC zur Kreuzreaktion mit Antikörpern in Sera von Patienten mit anderen Erkrankungen, wie Cytomegalovirus (CMV) oder Epstein-Barr-Virus (EBV), und zu einer falsch-positiven Reaktion. Wegen dieses signifikanten Mangels an Spezifität und des Mangels an prognostischem Potential sind OspC-ELISAs alles andere als ideal.
WO 97/42221 offenbart ein Diagnoseverfahren, das kurze C-terminale Fragmente des von Borrelia burgdorferi sensu lato angeleiteten Proteins OspC verwendet. Es wurde gezeigt, dass die vier aminoterminalen Aminosäuren Pro-Lys-Lys-Pro bei der lmmunreaktivität zwischen Sera von an früher Borreliose leidenden Patienten und verschiedenen OspC-Derivaten essentiell sind, und es wurde gezeigt, dass bestimmte aufeinanderfolgende Aminosäurereste vorhanden sein sollten, damit die Wirksamkeit als Diagnosemittel gegeben ist. Daher umfasste ein immunologisches Mittel ein mindestens fünf Aminosäurereste langes Homologes eines Fragments, das mit den 10 C-terminalen Aminosäuren von OspC identisch ist. Es sind auch die kurzen Peptide verwendende Vakzinen offenbart sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes, immunogenes Polypeptidfragment bereitgestellt, wie es im Anspruch 1 spezifiziert ist.
Das isolierte Polypeptid kann aus den Resten 145 bis 194 von SEQ. ID. Nr. 2 bestehen.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes DNA-Molekül bereitgestellt, wie es im Anspruch 3 spezifiziert ist.
Vorzugsweise umfasst das isolierte DNA-Molekül eine Dral-Erkennungsstelle am 5'-Ende und eine SmaI-Erkennungsstelle am 3'-Ende oder es besteht aus einer Sequenz von Nukleotidbasenpaaren wie von den Nukleotiden 433–582 von SEQ. ID. Nr. 1 dargestellt.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Expressionsvektor bereitgestellt, wie er im Anspruch 6 spezifiziert ist.
Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, wie sie im Anspruch 7 spezifiziert ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann einen pharmazeutisch geeigneten Träger und/oder ein Adjuvans enthalten.
Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines isolierten Polypeptids wie im Anspruch 11 spezifiziert angegeben.
Gemäß einem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis von Borrelien-Infektionen wie im Anspruch 12 spezifiziert angegeben.
Vorzugsweise beinhaltet das Verfahren den Nachweis des Vorhandenseins einer Konjugation unter Anwendung eines Enzymimmunoassays (enzyme-linked immunosorbent assay).
Gemäß einem siebenten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Kit wie im Anspruch 14 spezifiziert bereitgestellt.
Vorteilhafterweise wird das erfindungsgemäße Polypeptid durch frühere Impfungen gegen die Lyme-Krankheit nicht gestört. Der Nachweis borreliazider anti-OspC Antikörper gegen das Dra-Fragment ist für die Diagnose der Lyme-Krankheit bei Patienten aus allen Teilen der Welt und auch für die Impfung gegen die Lyme-Krankheit, die durch Borrelia ssp. verursacht ist, nützlich. Es sind derzeit 3 hauptsächliche Spezies der Lyme-Krank heit-Spirochäten bekannt: B. b., B. garinii und B. afzelii. Die Erfinder haben borreliazide anti-OspC Antikörper in Patienten aus Slowenien nachgewiesen, die mit B. afzelii infiziert waren. Sie haben diese borreliaziden anti-OspC Antikörper nachgewiesen unter Verwendung von B. b. 50772, desselben Isolats, das zum Nachweis einer Antwort bei Patienten, die mit B. b. infiziert waren, verwendet wurde. Das Dra-Fragment von OspC scheint also in allen Borrelia-Spezies konserviert zu sein.
Ein Dra-Fragment-basierter ELISA ist ein ausgezeichneter ergänzender Test zum Test auf borreliazide Antikörper. Besonders wichtig ist, dass ein Dra-Fragment-basierter ELISA leicht als handelsübliches Kit hergestellt werden kann und zwischen Patienten, die geimpft sind mit früher Lyme-Krankheit unterscheiden kann.
Ein Test, der borreliazide Antikörper gegen das (die) borreliaziden) Epitope) von OspA und OspB zusätzlich zu OspC nachweist, würde verminderte Kreuzreaktivität, erhöhte Spezifität, größere Genauigkeit und weniger falsch-positive Diagnosen mit sich bringen. Der Nachweis borreliazider anti-OspC Antikörper ermöglicht vorteilhafterweise eine frühe Diagnose, was borreliazide anti-OspA und anti-OspB Antikörper nicht können. Die Identifizierung des (der) borreliaziden Epitops (Epitope) von OspB und OspA sind jedoch auch wertvolle Ergänzungen zu einem diagnostischen Test.
Der Einschluss borreliazider Epitope von OspA und OspB mit dem Dra-Fragment von OspC ergibt also auch eine umfassendere Lyme-Borreliose-Vakzine.
Weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden, in Verbindung mit den beigefügten Tabellen und Zeichnungen vorgenommenen ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung deutlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pX3-22. Der schattierte Teil repräsentiert den Bereich, der das B. b. S-1-10 ospC-Gen enthält.
2 ist eine schematische Darstellung der Schritte zur Schaffung des Plasmids pX2-22-Dra, welches das OspC Dra-Fragment Fusionsprotein kodiert.
3 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pX2-22-Dra. Der schattierte Teil repräsentiert den Bereich, der das B. b. S-1-10 ospC Dra-Fragment-Gen enthält.
4 ist die DNA und die kodierte Aminosäuresequenz des Dra-Fragment-Fusionsproteins. Der umrandete Bereich ist die DNA und die vorhergesagte Aminosäuresequenz, die es nur im OspC Dra-Fragment von B. b. S-1-10 gibt. Siehe auch SEQ ID Nr. 1.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Auffinden und die Charakterisierung des (der) Epitops (Epitope) von OspC, das (die) für die Induktion borreliazider Antikörper kurz nach der Infektion mit B. b. verantwortlich ist (sind). Diese antigene Determinante bietet ein hervorragendes diagnostisches Antigen, das eine frühe Infektion mit der Lyme-Krankheit nachweist, die erfolgreiche Beseitigung des Organismus aus dem Wirt vorhersagt und zwischen Individuen mit der Lyme-Krankheit und Individuen, die mit einer OspA-Lyme-Krankheit-Vakzine geimpft wurden, unterscheidet. Ferner ist (sind) das (die) borreliazide(n) OspC-Epitop(e) als Vakzine gegen eine Infektion mit B. b. nützlich, und die borreliaziden Antikörper, die gegen das OspC-Epitop gebildet werden, sind als Therapie zum Beseitigen einer etablierten B.-b.-Infektion und -Krankheit nützlich.
Die Erfinder haben borreliazide anti-OspC Antikörper gefunden. Das Auffinden von Antikörpern in Lyme-Krankheit-Sera, die spezifisch B. b. 50772 (infra) töten, ein Zeckenisolat, welches die Gene nicht hat, um OspA oder OspB zu machen, führte die Erfinder zu der Vermutung, dass das Oberflächenprotein OspC war und dass eine hochspezifische borreliazide Antikörperantwort auf dieses Protein gebildet wurde.
In einer früheren Studie haben Schwan et al. (28) gefunden, dass die Aufnahme von Blut, wenn eine Zecke an einem Menschen saugt, die B.-b.-Organismen veranlasst, OspA und OspB herunterzuregulieren und OspC hochzuregulieren. Die Anmelder haben daher vermutet, das dies wahrscheinlich etwas mit der Fähigkeit der Spirochäte zu tun hat, von der Zecke auf den Menschen überzugehen. Die Hypothese war, dass die Spirochäte OspC zum Überleben in einem neuen Wirt benötigt. Daher wurde angenommen, dass, wenn die Spirochäte OspA und OspB abstellt, das OspC an ihre Oberfläche bringt, anti-OspC Antikörper beim Verhindern einer Infektion mit B. b. wirksamer sein können.
Wenn OspC tatsächlich eine frühe B. b. borreliazide Antikörperantwort induziert, dann folgt, dass der Nachweis dieser hochspezifischen Antikörperantwort herangezogen werden kann, um die Lyme-Krankheit genauer nachzuweisen und die Eliminierung des Organismus nach der Therapie genauer zu verfolgen als mit anderen diagnostischen Assays, die nicht borreliazide anti-OspC Antikörper nachweisen.
Das Dra-Fragment
Indem sie diesen weiteren Schritt taten, stellten die Anmelder fest, dass das (die) borreliazide(n) Epitop(e) auf einem kleinen Fragment des OspC-Proteins lokalisiert ist (sind). Das OspC-Protein-Gen hat eine Gesamtlänge von etwa 600 Basenpaaren (bp). Die das borreliazide Fragment kodierende DNA ist etwa 151 bp. Das Fragment gibt es nur bei Borrelien. Unter Bezugnahme auf das Beispiel 2: Die DNA-Sequenz des DraI-SmaI-ospC-Genfragments (OspC Dra-Fragment) ist in der 4 gezeigt. Die kodierte Aminosäuresequenz dieses trunkierten OspC-Fusionsproteins ist ebenfalls in der 4 gezeigt.
Das Fragment wird Dra-Fragment genannt, hauptsächlich, weil DraI das Restriktionsenzym ist, das zum Schneiden der DNA-Sequenz bei einem speziellen Ablauf von Basen verwendet wird, welcher die Erkennungsstelle des Enzyms repräsentiert. Durch die Verwendung des Abschnitts des ospC-Gens, der (das) borreliazide Epitop(e) aufweist, sind die Spezifität und das prognostische Potential des diagnostischen Tests ohne signifikanten Verlust an Empfindlichkeit erhöht.
Das Dra-Fragment des OspC-Proteins ist auch eine lebensfähigere Vakzinenkomponente im Vergleich zu dem „full-length" OspC-Protein. Durch Eliminieren des Rests des OspC-Proteins werden Impfprobleme minimiert, da die anderen Teile des Proteins nicht vorhanden sind, sodass die Nebenwirkungen der Impfung eingeschränkt werden und es leichter wird, die wirksame schützende Antikörperantwort zu induzieren, aufrechtzuerhalten und zu verfolgen. Ferner kann die Immunantwort leicht nur gegen den schützenden Abschnitt des OspC-Proteins erhöht werden, indem das Dra-Fragment mit einem Adjuvans wie einem Tetanustoxoid oder anderen Vakzine-Adjuvantien kombiniert wird, welche die Immunantwort erhöhen. Das OspC Dra-Fragment kann auch de novo unter Verwendung herkömmlicher Lösungs- oder Festphasenpeptidchemie synthetisiert werden.
Impfstoffkandidat
Die Verwendung des Tests auf borreliazide Antikörper zum Verfolgen der Level an borreliaziden anti-OspAAntikörpern hat wichtige Einblicke in die Wirksamkeit derzeit üblicher OspA-Lyme-Borreliose-Vakzinen gegeben (13, 21, 23). Tatsächlich sind nun die Tests auf borreliazide Antikörper das Markenzeichen für die Überwachung der Fähigkeit von OspA-Lyme-Krankheit-Vakzinen, Schutz zu bieten. Die Impfung von Wüstenrennmäusen und Labormäusen mit OspC führt auch zu einem vollständigen Schutz vor experimenteller Provokation und/oder von Zecken übertragener Infektion mit homologen B.-b.-Isolaten. Ferner kann, anders als die Impfung mit OspA, die Impfung mit OspC auch zu einer Clearance von Spirochäten und zur Beseitigung von Symptomen führen, selbst wenn sie nach der Infektion mit B. b. verabreicht wird. Eine Osp-Vakzine wäre somit eine wertvolle Ergänzung zu den Bestrebungen, die Folgen der Lyme-Krankheit zu erleichtern.
Wie zuvor festgestellt, haben Forscher zuvor keinen Beweis gefunden, dass OspC-Vakzinen Schutz bieten, indem sie borreliazide Antikörper induzieren. Andere Forscher haben keine borreliazide anti-OspC Antikörper nach der Impfung nachgewiesen, trotz der Fähigkeit der OspC-Impfung, Schutz zu induzieren. Unsere Ergebnisse bestätigen jedoch, dass OspC tatsächlich borreliazide Antikörper induziert und andere Forscher werden schnell feststellen, dass sie wahrscheinlich nicht in der Lage waren, borreliazide anti-OspC Antikörper nachzuweisen, weil sie einen B.-b.-Organismus zum Testen verwendet haben, der nicht OspC an der Oberfläche exprimiert hat.
Derzeit verwendet keine Vakzine (ein) isolierte(s) borreliazide(s) Epitop(e). Die vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung des (der) borreliaziden Epitops (Epitope) von OspC als diagnostischen Test für und als Vakzine gegen die Lyme-Krankheit.
Pharmazeutische Zusammensetzung
Als pharmazeutische Zusammensetzung beinhaltet die vorliegende Erfindung einen pharmazeutisch geeigneten Träger und eine therapeutisch wirksame Menge des OspC-Dra-Polypeptids gemäß der Erfindung. Unter der „therapeutisch wirksamen Menge" wird jene Menge Polypeptid oder Antikörper verstanden, die bei Verabreichung an ein Tier eine Immunantwort hervorruft, die wirksam ist, die B.-b.-Infektion für einige Zeit zu verhindern oder ihre Stärke zu verringern.
Die Verabreichung des erfindungsgemäßen Polypeptids an das Tier kann nach einer ganzen Reihe von Standardmethoden erfolgen. Wenn ein Polypeptid verwendet wird, wird es vorzugsweise mit einem pharmazeutisch geeigneten Adjuvans verabreicht, wie komplettem oder inkomplettem Freund-Adjuvans, RIBI (Muramyldipeptide) oder ISCOM (immunstimulierende Komplexe). Solche Adjuvantien können das Polypeptid vor schneller Dispersion schützen, indem es in einem lokalen Depot abgesondert wird, oder sie können Substanzen enthalten, welche den Wirt stimulieren, Faktoren zu sezernieren, die für Makrophagen und andere Komponenten des Immunsystems chemotaktisch sind. Wenn ein Polypeptid verabreicht wird, beinhaltet das Immunisierungsschema vorzugsweise 2 oder mehr Verabreichungen des Polypeptids, verteilt über mehrere Wochen.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann verwendet werden, um die Lyme-Krankheit bei verschiedenen Tieren einschließlich Menschen zu behandeln oder zu verhindern. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in einer Reihe herkömmlicher Formen vorliegen, wie Tabletten, Dragees, Pulver, Flüssigkeiten oder Suspensionen, Kapseln, Suppositorien, injizierbaren und infundierbaren Lösungen, wie auf dem Gebiet bekannt. Die bevorzugte Form hängt vom geplanten Verabreichungsweg und der prophylaktischen Anwendung ab. Bei den meisten Anwendungen ist der bevorzugte Verabreichungsweg jedoch parenteral und am meisten bevorzugt intramuskulär.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch die Verwendung eines isolierten Polypeptids, das aus den Resten 145 bis 194 von SEQ. ID. Nr. 2 besteht, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Borrelien-Infektionen.
Die vorliegende Erfindung gibt ein Kit für die Diagnose einer Borrelien-Infektion bei Säugern einschließlich des Menschen an. Das Kit umfasst ein isoliertes Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz hat wie von den Resten 145 bis 194 von SEQ. ID Nr. 2 dargestellt, in einem hierfür geeigneten Behälter befindlich, sowie Anweisungen für die Verwendung des Kits.
BEISPIELE
Zur vollständigeren Erläuterung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Beispiele dargelegt. Die Beispiele, die auf die beigefügten Figuren Bezug nehmen, dienen nur der Erläuterung, um das bessere Verständnis der Erfindung zu unterstützen.
Beispiel 1
Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit von B.-b.-OspC, hohe Level borreliazider Antikörper zu induzieren, wenn es kurz nach einer B.-b.-Infektion verabreicht wird.
Materialien und Methoden
Organismen.
B. b. sensu stricto Isolat 297 (hinterlegt bei American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110, unter der ATTC-Zugangsnummer 53899) wurde aus menschlicher Spinalflüssigkeit isoliert. B. b. sensu stricto Isolat 50772 (hinterlegt bei American Type Culture Collection am 30. Juli 1999 gemäß dem Budapester Vertrag), das ursprünglich aus einer l.-scapularis-Zecke isoliert wurde, wurde von John F. Anderson (Connecticut Agricultural Experiment Station, New Haven, Connecticut) erhalten. Der Spirochäte fehlt das OspA/B-Operon und daher exprimiert sie OspA oder OspB nicht (25). Die ursprünglichen Suspensionen der Spirochäten wurden in Barbour-Stoenner-Kelly(BSK)-Medium, das in der Lage ist, das Wachstum von einem einzelnen Organismus zu unterstützen, 10-fach seriell verdünnt (46). Die resultierende Spirochäten-Population wurde dann 10-mal in frischem BSK-Medium bei 30°C oder 35°C passagiert, in 200-μl-Aliquoten in 1,5-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss (Sarstedt, Newton, North Carolina) gebracht und bis zur Verwendung bei –70°C gelagert. E. coli JM109 (Promega Corp., Madison, Wisconsin) wurde in allen Klonierungsversuchen verwendet.
Tiere.
10 Wochen alte weibliche C3H/HeJ-Mäuse (Jackson Laborstories, Bar Harbor, Maine) wurden jeweils zu dritt in einem Käfig bei Umgebungstemperatur untergebracht. Nahrung und Wasser waren ad libitum verfügbar.
Sera.
Lyme-Borreliose-Sera wurden von Patienten am Gundersen Lutheran Medical Center, La Crosse, Wisconsin, erhalten. Zehn Lyme-Borreliose-Serumproben waren von Individuen mit klinisch dokumentierten einzelnen oder mehrfachen Erythema-migrans-Läsionen. Zwei der Serumproben waren von Patienten mit Hautkulturen, die positiv für B. b. waren. Das Serum eines Individuums, das nicht B. b. sensu lato ausgesetzt war, wurde als Normalserum-Kontrolle verwendet. Diese Serumprobe wurde von 516 Laboratorien geprüft, die am nationalen „Lyme Proficiency Survey", gesponsert vom Wisconsin State Laborstory of Hygiene und dem College of American Pathologists, teilnahmen, und sie wurde als negativ in Bezug auf Antikörper gegen B. b. ausgewiesen (31).
Western-Blotting.
Western-Blotting wurde wie früher beschrieben (17) durchgeführt. Kurz gesagt, wurden B. b. 50772-Zellen in Probenpuffer 5 min gekocht und 150 μg Gesamtprotein wurden auf ein 0,1% SDS – 12% Polyacrylamidgel (4% Polyacrylamid-Stapelgel ohne Kamm) geladen. Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem Bio-Rad Proteinbestimmungs-Kit nach den Anweisungen des Herstellers (Bio-Rad Inc., Richmond, Kalifornien) durchgeführt. Zwei Gele wurden gleichzeitig in einer Elektrophorese-Einheit (SE600; Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, Kalifornien) bei 55 mA für 3 Stunden mit dem Puffersystem von Laemmli (32) verwendet. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine 3 Stunden bei 300 mA unter den von Towbin et al. (33) beschriebenen Bedingungen auf Nitrocellulose transferiert. Die Nitrocellulose wurde in Streifen geschnitten und mit Phosphat-gepufferter Lösung (PBS)-0,3% TWEEN 20 Detergens 30 min bei 22°C blockiert. Die Streifen wurden 1 Stunde bei 22°C mit Humanserum, 1:100 verdünnt, inkubiert und 3-mal mit PBS-0,05% TWEEN 20 Detergens gewaschen. Meerrettichperoxidase-markierte anti-human IgM oder IgG (schwere und leichte Ketten; Organon Teknika Cappel, Malvern, Pennsylvania) wurde zugesetzt, und die Streifen wurden 30 min bei 22°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Streifen gewaschen und entwickelt (TMB Membrane Peroxidase Substrate System; Kirkegaard & Perry Laborstories, Gaithersburg, Maryland).
Klonieren und Amplifizieren des ospC-Gens.
Plasmid-angereicherte DNA wurde aus B. b. sensu stricto Isolat S-1-10 (13) isoliert. Die DNA wurde als Template für die Amplifikation des ospC-Gens unter Verwendung des GeneAmp Kit (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Connecticut) (34) verwendet. Primer wurden bei einer Endkonzentration von 1,0 μM in einer 1,5 mM Konzentration von MgCl₂ verwendet. Die Thermocycling-Parameter waren 95°C für 5 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen wie folgt: 1) 95°C für 30 s, 2) 50°C für 30 s, 3) 72°C für 90 s. Die abschließende Verlängerung erfolgte bei 72°C für 7 min, um trunkierte DNA-Stränge vollständig zu verlängern. Der aminoterminale Primer C1 (5'-CGTGGATCCATGAAAAAGAATACATTAAGTGCGATA-3') und der carboxyterminale Primer C2 (5'-AATTCCCGGGTTAAGGTTTTTTTGGACTTTCTGC-3') wurden zum Amplifizieren verwendet. Unterstreichungen zeigen die Regionen an, die von den Primern erkannt werden. Amplifizierte DNA wurde unter Verwendung von GeneClean (Bio101, La Jolla, Kalifornien) gereinigt. Nach dem Verdau mit SmaI und BamHI (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland) wurden gereinigte DNA-Fragmente in den PinPoint pXa-3 Vektor (Promega Corp., Madison, Wisconsin) mit T4-DNA-Ligase (Gibco BRL, Rockville, Maryland) ligiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente E. coli JM109 zu transformieren. Transformierte E. coli wurden auf 2xTY-Medium plattiert, das Ampicillin (100 μg pro ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) enthielt, und 24 Stunden bei 37°C inkubiert. OspC exprimierende Kolonien wurden mittels Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugats (Gibco BRL) und eines frühen Lyme-Krankheit-Serums, das anti-OspC Antikörper enthielt, nachgewiesen.
Die DNA-Sequenz des ospC-Gens wurde mittels Doppelstrangsequenzierung (TaqTrack, Promega, Madison, Wisconsin) bestimmt. Analyse und BLAST-Suchen erfolgten unter Verwendung des GCG-Software-Systems (GCG, Madison, Wisconsin). Das ospC-Gen von B. b. sensu stricto S-1-10 war ähnlich (78,5%) wie B. b. sensu stricto B31 (35). Ferner unterschied sich die S-1-10 OspC-Nukleotidsequenz um 3 Basen (98% Homologie) von B. b. sensu stricto (36).
Reinigung von rekombinantem OspC.
Das ospC-Gen enthaltende E. coli wurden in 100 ml Ampicillin enthaltendem 2×TY-Medium 12 h bei 37°C kultiviert. Die Kultur wurde 1:10 mit 2×TY-Medium verdünnt und eine weitere Stunde inkubiert. Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid (Endkonzentration 0,1 mM, Sigma) wurde zu der Kultur zugegeben und weitere 4 h inkubiert. Die Suspension wurde 15 min bei 10 000 × g bei 4°C zentrifugiert, in Reinigungspuffer (50 mM Tris (pH 8,0), 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,1% Triton X-100) resuspendiert und mit einem Ultraschallgerät (Model W350; Branson Sonic Power Co., Danbury, Connecticut) lysiert. Sonifizierte E. coli wurden 15 min bei 10 000 × g zentrifugiert und der Überstand wurde bei 0,5 ml pro min bei 4°C über eine Säule geschickt, die SoftLink-Harz (Promega, Madison, Wisconsin) enthielt. Die Säule wurde dann mit 5 Säulenvolumina Reinigungspuffer gewaschen. OspC wurde mit 5 mM Biotin (Sigma) eluiert und die gewonnenen Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert.
OspC-ELISA.
Rekombinantes OspC wurde in Beschichtungspuffer (0,015 M Na₂CO₃, 0,035 M NaHCO₃, pH 9,6) auf 750 ng/ml verdünnt und 100-μl-Mengen wurde in die einzelnen Flachboden-Mikrotiter-Vertiefungen (Dynatech Laborstories, Chantilly, VA) gebracht. Die Mikrotiterplatten wurden 4 Stunden bei 35°C inkubiert, gefolgt von Inkubation bei 4°C über Nacht. Nach der Inkubation wurde die Platten 3-mal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,2), die 0,05% TWEEN 20 Detergens enthielt, gewaschen, verschlossen und bei 4°C gelagert. Vor der Verwendung wurden die Platten mit PBS-0,05% TWEEN 20 Detergens, das 1% Rinderserumalbumin enthielt, 30 min bei 22°C blockiert, zweimal mit PBS-0,05% TWEEN 20 Detergens gewaschen, und 100 μl serielle zweifache Verdünnungen von Normal- oder Lyme-Borreliose-Serum in PBS wurden in die einzelnen Vertiefungen gegeben. Die Platten wurden 1 Stunde bei 22°C inkubiert, gefolgt von dreimaligem Waschen mit PBS-0,05% TWEEN 20 Detergens. 100 Mikroliter anti-human IgM Meerrettichperoxidase-konjugierte Antikörper (Organon Teknika Cappel), 1:3000 in PBS-0,05% TWEEN 20 Detergens verdünnt, wurden zugegeben, und die Platten wurden 1 h bei 22°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 100 μl o-Phenylendiaminphosphat (0,4 mg/ml, Sigma) in jede Vertiefung gegeben, und es wurde 30 min bei 22°C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 100 μl 1 N H₂SO₄ gestoppt und die Absorbanz bei 490 nm (Model EL307, Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, Vermont) wurde sofort bestimmt. Ein OD-Wert > 0,200 über der Normalserum-Kontrolle wurde als positiv betrachtet.
Nachweis borreliazider Antikörper.
Der Durchflusszytometrie-Test auf borreliazide Antikörper erfolgte nach Callister et al. (29, 30). Kurz gesagt, wurde ein eingefrorenes 200-μl-Aliquot B.-b.-Isolat 50772 oder 297 aufgetaut, in 6 ml frisches BSK-Medium inokuliert, und die Kulturen wurden 72 Stunden bei 35°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Konzentration der Spirochäten unter Verwendung einer Petroff-Hausser-Zählkammer bestimmt und in frischem BSK-Medium auf eine Konzentration von 10⁶ Organismen pro Milliliter verdünnt. Serumproben wurden 1:20 in frischem BSK-Medium verdünnt und durch Passage durch ein 0,2-μm-Microfuge-Filter (Costar, Cambridge, Massachusetts) sterilisiert. Ein 100-μl-Aliquot wurde in ein 1,5-ml-Microfuge-Röhrchen mit Schraubverschluss (Sarstedt) transferiert und das verdünnte Serum wurde 10 min bei 56°C Hitzeinaktiviert. Nach der Inaktivierung durch Hitze wurde ein 100-μl-Aliquot von B. b. 50772 und 15 μl steriles Meerschweinchenserum (200, 50% hämolytische Komplement-Einheiten pro ml; Sigma) zu den verdünnten Sera zugegeben. Nach leichtem Bewegen wurden die Assay-Suspensionen 16–24 Stunden bei 35°C inkubiert.
Nach der Inkubation wurden 100 μl der Assay-Suspensionen 1:5 verdünnt mit PBS (0,01 mol/l, pH 7,2), das Acridinorange enthielt (Endkonzentration 5,4 × 10⁹ mol/l). Borreliazide Antikörper wurden mittels FACScan Single-Laser Durchflusszytometer (Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, Kalifornien) nachgewiesen. Ereignisse wurden 1 bis 2 min bei einer auf niedrig gestellten Flussrate (12 μl/min) erfasst und mittels FACScan Lysys II Research Software analysiert. Seitenstreuung und Fluoreszenzintensitätsparameter wurden herangezogen, um B. b. von BSK und Komplementpartikeln zu unterscheiden. Die Spirochäten wurden während der Datenerhebung eingegrenzt (gated), und Fluoreszenzsignale wurden logarithmisch verstärkt und in eine lineare Skala konvertiert. Eine Zunahme ≥ 13% bei der Fluoreszenzintensität im Vergleich zu Normalserum-Kontrollen wurde als positiv betrachtet (30). Alle Assays wurden zwei- oder dreifach ausgeführt.
Impfung von Mäusen und Gewinnung von Anti-OspC-Sera.
Mäuse wurden intramuskulär mit 75 μg gereinigtem OspC in 100 μl komplettem Freund-Adjuvans (Sigma) geimpft. Anschließend wurden die Mäuse mit 75-μg-Mengen OspC in 100 μl inkomplettem Freund-Adjuvans (Sigma) 2 und 4 Wochen nach der Erstimpfung geboostet. Zwei Wochen nach dem zweiten Booster wurde Blut durch intrakardiale Punktion entnommen. Das Blut wurde gerinnen gelassen und Serum wurde durch 5-minütige Zentrifugation bei 3500 UpM abgetrennt. Das Serum wurde entfernt und bis zur Verwendung in 50-μl-Mengen bei –70°C gelagert.
Flusszytometrischer Immunfluoreszenz-Assay.
Anti-OspC-Antikörper enthaltende Mausserumproben wurden in BSK-Medium (1:20 bis 1:40960) seriell verdünnt. 100 Mikroliter BSK-Medium, das 10⁵ lebende B. b. 297 oder 50772 Organismen enthielt, wurden zu jeder Verdünnung zugegeben. Die Suspensionen wurden behutsam gevortext und 30 min bei 35°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 10 μl Fluoresceinisothiocyanat(FITC)-konjugierte Ziege-anti-Maus IgG (ICN/Cappel, Aurora, Ohio) Antikörper, 1:20 in sterilem PBS (pH 7,2) verdünnt, zu jedem Assay hinzugefügt. Die Assays wurden behutsam gevortext und weitere 30 min bei 35°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 100-μl-Aliquote jeder Suspension mit 400 μl 0,22-μm-Filter-sterilisiertem PBS vereinigt. Diese Suspensionen wurden dann unter Verwendung eines FACScan Durchflusszytometers analysiert.
Neutralisation der borreliaziden Aktivität.
Die borreliazide Aktivität von Serumproben nach der Entfernung von IgM- oder IgG-Antikörper wurde wie früher beschrieben bestimmt (17). Kurz gesagt, wurden 125 μl dialysierte Ziege-anti-human IgM oder IgG (schwere und leichte Kette; Kallestad Diagnostics, Chaska, Minnesota) zu 25 μl Normal- oder Lyme-Borreliose-Serum zugegeben, und die Mischung wurde 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 5000 × g (Surespin; Helena Laborstories, Beaumont, Texas) wurde der Überstand mit frischem BSK-Medium zweifach verdünnt, durch Passage durch ein 0,2-μm-Microfuge-Filter (Costar) sterilisiert und hinsichtlich borreliazider Aktivität untersucht. Die borreliazide Aktivität von Normal- und Lyme-Borre linse-Sera ohne Behandlung mit anti-IgM oder anti-IgG wurde nach der Zugabe von 125 μl PBS (pH 7,2) bestimmt.
Adsorption von Lyme-Borreliose-Sera mit OspC.
Die Adsorption von anti-OspC Antikörpern aus Lyme-Borreliose-Sera erfolgte unter Verwendung einer Modifizierung eines früher beschriebenen Verfahrens (17). TetraLink Tetrameric Avidin Harz (Promega) wurde mit PBS gewaschen und ein 1-ml-Volumen wurde in eine Säule geladen. Drei Mikrogramm dialysiertes biotinyliertes OspC in einem 1-ml-Volumen wurden über die Säule geschickt und die Absorbanz (OD) bei 280 nm wurde verfolgt, um die Bindung von OspC an der Säule zu bestätigen. Eine 1-ml-Probe von jedem von 10 humanen Lyme-Borreliose-Sera, zehnfach verdünnt mit PBS (pH 7,2), wurde dann 10- bis 15-mal bei 4°C über die Säule geleitet, um anti-OspC-Antikörper zu entfernen. Die Entfernung von anti-OspC-Antikörpern wurde mittels Western-Blotting bestätigt.
Diese Untersuchung zeigte, dass die Impfung von Mäusen mit OspC hohe Konzentrationen borreliazider anti-OspC Antikörper induziert, und führte zu verstärkten Anstrengungen (in den folgenden Beispielen) zur Evaluation der Fähigkeit von OspC, Schutz vor einer Infektion mit B. b. zu bieten, da dies einen plausiblen Immunmechanismus bereitstellt, der die Fähigkeit einer OspC-Impfung zum Schützen vor der Lyme-Krankheit oder zu ihrer Heilung erklärt. Außerdem wurde gefunden, dass große Konzentrationen borreliazider anti-OspC Antikörper leicht in Serum von Patienten aus den gesamten US nachgewiesen werden können, wenn nur ein einziger Organismus, B. b. 50772, als Testantigen verwendet wird, was auch anzeigt, dass das (die) borreliazide(n) anti-OspC Epitop (Epitope) konserviert werden kann (können). Somit behindert die OspC-Heterogenität die Anstrengungen zur Entwicklung einer umfassenden OspC-Vakzine nicht.
Diese Feststellungen stehen in direktem Kontrast zu anderen publizierten Beobachtungen. In früheren Berichten war der Nachweis abhängig vom Vorhandensein hoher Level OspC an der Oberfläche von B. b. Diese borreliaziden anti-OspC Antikörper wurden nur nachgewiesen, wenn B.-b.-Isolat 50772, das hohe Level OspC an der Oberfläche exprimiert, verwendet wurde.
Beispiel 2
Dieses Beispiel zeigt, dass die borreliaziden Epitope von OspC in der Dra-Fragment-Region lokalisiert sind.
Schritt a: Isolation von Plasmiden, Klonieren und Amplifizieren des ospC-Gens.
Plasmidangereicherte DNA wurde aus B. b. sensu stricto Isolat S-1-10 unter Verwendung von Standardverfahren isoliert (13). Die DNA wurde dann als Template für die Amplifikation des ospC-Gens nach dem GeneAmp-Protokoll (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Connecticut) unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (34) verwendet. Primer wurde in einer Endkonzentration von 1,0 μM mit einer MgCl₂-Konzentration von 1,5 mM verwendet. Die Thermocycling-Parameter waren 95°C für 5 min, gefolgt von 35 Zyklen wie folgt: 1) 95°C für 30 s, 2) 50°C für 30 s, 3) 72°C für 90 s. Die abschließende Verlängerung erfolgte bei 72°C für 7 min, um trunkierte DNA-Stränge vollständig zu verlängern. Der aminoterminale Primer C1 5'-CGTGGATCCATGAAAAAGAATACATTAAGTGCGATA-3' und der carboxyterminale Primer C2 5'-AATTCCCGGGTTAAGGTTTTTTTGGACTTTCTGC-3' wurden zum Amplifizieren verwendet. Die amplifizierte DNA wurde unter Verwendung von GeneClean (Bio101, La Jolla, Kalifornien) gereinigt. Nach dem Verdau mit SmaI und BamHI (Bethesda Research Laborstories, Gaithersburg, Maryland) wurden die gereinigten DNA-Fragmente in den PinPoint pXa-3 Vektor (Promega Corp., Madison, Wisconsin) ligiert. Das Insert und das Plasmid wurden mit T4-DNA-Ligase (Bethesda Research Laborstories) ligiert und die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente E. coli JM109 zu transformieren. Anschließend wurden die Organismen auf 2× Trypton-Hefe(TY)-Medium, das Ampicillin (100 μg/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) enthielt, plattiert und 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Das OspC-Fusionsprotein exprimierende Kolonien wurden mittels Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Streptavidinalkalische Phosphatase-Konjugats (Bethesda Research Laborstories) und eines frühen Lyme-Krankheit-Serums, das anti-ospC Antikörper enthielt, nachgewiesen. Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung pX3-22, und es ist in der 1 illustriert.
Schritt b: Schaffung der ospC-Gen-Trunkierunq.
Um ein carboxyterminales Fragment des OspC-Proteins zu machen, wurde das Plasmid pX3-22 mit den Restriktionsenzymen BamHI und SmaI (Gibco) verdaut. Das ~0,6-kb-BamHI-Smal-Fragment, welches das ospC-Gen enthält, wurde dann mit dem Restriktionsenzym DraI (Gibco) verdaut, wie in der 2 illustriert. Dieser Verdau führte zu einem ~0,4-kb-BamHI-DraI-Fragment, das für das aminoterminale Ende des OspC-Proteins kodiert, und einem ~0,2-kb-DraI-SmaI- Fragment, das für das carboxyterminale Ende kodiert. Dieses DraI-SmaI-Fragment wurde dann mit SmaI-verdautem PinPoint Vektor pXa-2 (Promega Corporation, Madison, WI) ligiert, um den passenden Leserahmen des resultierenden trunkierten Proteins zu erhalten. Die Ligationsmischung wurde dann verwendet, um kompetente E. coli JM109 zu transformieren. Es wurden Restriktionsverdaue durchgeführt, um einen Klon mit der passenden Orientierung der ospC-Genfragmentinsertion zu identifizieren. Dieses Plasmid wurde mit pX2-22-Dra bezeichnet und ist in der 3 illustriert.
Schritt c: Molekulare Analyse des ospC-Genfragments.
Die DNA-Sequenz von pX2-22-Dra wurde mittels Doppelstrangsequenzierung bestimmt. Der Primer C2 (siehe Schritt a des Beispiels 2), der für die Amplifikation konstruiert wurde, und der PinPoint Sequenzierungsprimer (Promega) wurden verwendet. Die Sequenz des DraI-SmaI-ospC-Genfragments (ospC-Dra-Fragment) ist in der 4 gezeigt. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz dieses trunkierten OspC-Fusionsproteins ist auch in der 4 gezeigt.
Schritt d: Reinigung des Dra-Fragment OspC.
Transformierte E. coli-Organismen, die pX3-22 und pX2-22-Dra enthielten, wurden in 100 ml Ampicillin enthaltendem 2×TY-Medium 12 Stunden 37°C kultiviert. Die Kultur wurde 1:10 mit 2×TY-Medium verdünnt und eine weitere Stunde inkubiert. Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (Endkonzentration 0,1 mM, Sigma) wurde zu der Kultur zugegeben, und es wurde weitere 4 Stunden inkubiert. Die Bakteriensuspension wurde dann zentrifugiert (10 000 × g, 15 min bei 4°C), in Reinigungspuffer (50 mM Tris (pH 8,0) 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,1% „TRITON X-100" Puffer) resuspendiert und durch 5 × 30 s Pulse mit einem Ultraschallgerät (Model W350; Branson Sonic Power Co., Danbury, Connecticut) lysiert. Die sonifizierten E.-coli-Organismen wurden 15 min bei 10 000 × g zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen, und der Überstand wurde bei 0,5 ml pro Minute bei 4°C über eine Säule von SoftLink Harz (Promega) geschickt. Die Säule wurde dann mit 5 Säulenvolumina Reinigungspuffer gewaschen. Säulen-gebundenes OspC-Dra-Fragment-Fusionsprotein wurde unter Verwendung von Reinigungspuffer eluiert, der 5 mM Biotin (Sigma) enthielt. Die Fraktionen wurden mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert.
Schritt e: Adsorption von Lyme-Borreliose-Sera mit ganzem und Dra-Fragment-ospC.
Die Adsorption von anti-ospC oder Dra-Fragment Antikörpern aus Lyme-Borreliose-Sera erfolgte unter Verwendung einer Modifizierung eines früher beschriebenen Verfahrens (17). TetraLink Tetrameric Avidin Harz (Promega) wurde mit PBS gewaschen und ein 1- ml-Volumen wurde auf eine Säule geladen. 3 Mikrogramm dialysiertes biotinyliertes ganzes OspC (Fusionsprotein von pX3-22) oder Dra-Fragment-OspC (Fusionsprotein von pX2-22-Dra) in einem 1-ml-Volumen wurden dann über die Säule geschickt, und die Absorbanz bei 280 nm wurde verfolgt, um die Bindung von Protein an der Säule zu bestätigen. Eine 1-ml-Probe von jedem Serum, zehnfach verdünnt mit PBS (pH 7,2), wurde dann 10- bis 15-mal über die Säule geschickt, um anti-OspC oder anti-Dra-Fragment Antikörper zu entfernen.
Unter Verwendung der Materialien und Verfahren der Beispiele 1 und 2 haben wir anfangs 7 frühe Lyme-Krankheit-Serumproben, die hohe Titer borreliazider anti-OspC Antikörper enthielten, untersucht und bestätigt, dass die borreliaziden Antikörper gegen eine spezifische Region des OspC-Proteins innerhalb des Dra-Fragments, das hier beschrieben ist, gerichtet waren.

OspC- oder Dra-Fragment-Fusionsproteine wurden an Agaroseperlen gebunden und es wurden separate Immunaffinitätssäulen gerichtet. Lyme-Krankheit-Sera wurden über die Säulen geschickt, um anti-OspC oder anti-Dra-Fragment Antikörper durch Adsorption an die OspC- bzw. Dra-Fragment-Fusionsproteine zu entfernen. Die borreliazide Aktivität gegen B. b. 50772 wurde vor und nach der Entfernung der Antikörper bestimmt. Die Entfernung von anti-OspC und anti-Dra-Fragment Antikörpern aus den frühe Lyme-Krankheit-Sera brachte fast vollständige Aufhebung der borreliaziden Aktivität, wie in der Tabelle 1 illustriert. Tabelle 1. Borreliazide Aktivität von frühen Lyme-Krankheit-Sera nach der Entfernung von Antikörpern gegen ganzes OspC oder Dra-Fragment.

Patient Nummer	Borreliazide Aktivität^a vor und (nach) der Entfernung von OspC-Antikörpern	Borreliazide Aktivität^a vor und (nach) der Entfernung von Dra-Antikörpern
1	10240 (20)	20480 (80)
2	40960 (20)	40960 (20)
3	10240 (40)	20480 (40)
4	640 (20)	1280 (20)
5	2560 (20)	5120 (20)
6	1280 (40)	5120 (20)
7	10240 (320)	20480 (1280)

a Reziproke Verdünnung des Serumtiters

Die Tabelle 1 zeigt die Titer borreliazider Antikörper von frühen Lyme-Sera nach der Entfernung von Antikörpern gegen ganzes OspC-Fusionsprotein oder das OspC-Dra-Fragment. Unter Bezugnahme auf die Tabelle 1 kann man sehen, dass die borreliaziden Antikörper gegen die spezifische Region des OspC-Proteins waren, die im Dra-Fragment lokalisiert ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass borreliazide anti-OspC Antikörper fast vollständig durch das (die) Epitop(e) induziert werden, das (die) in der Dra-Fragment-Region von OspC lokalisiert ist (sind).
Beispiel 3
Dieses Beispiel zeigt, dass anti-OspC Antikörper, die spezifisch für die Dra-Fragment-Region von OspC sind, mittels ELISA nachgewiesen werden können.
Dra-Fragment-ELISA.
Gereinigtes OspC Dra-Fragment wurde in Beschichtungspuffer (0,015 M Na₂CO₃, 0,035 M NaHCO₃, pH 9,6) zu 750 ng/ml verdünnt und in N-Oxysuccinimid Oberflächen Aminobindung Flachboden-Mikotitervertiefungen gebracht. Die ELISA-Platten wurden 4 Stunden bei 35°C inkubiert, gefolgt von Inkubation bei 4°C über Nacht. Nach der Inkubation wurden die Platten 3-mal mit PBS, das 0,05% TWEEN 20 Detergens enthielt, gewaschen, verschlossen und bei 4°C gelagert. Vor der Verwendung wurden die Platten mit PBS-0,05% TWEEN 20 Detergens, 1% Rinderserumalbumin enthaltend, 30 min bei Umgebungstemperatur blockiert. Die Platten wurden zweimal mit PBS-0,05% TWEEN 20 Detergens gewaschen und 100 μl serieller 2-facher Verdünnungen von Serum in PBS wurden in die einzelnen Mikrotiter-Vertiefungen gebracht. Die Platten wurden 1 Stunde bei 22°C inkubiert, gefolgt von 3-maligem Waschen mit PBS-0,05% TWEEN 20 Detergens. Anti-human IgM oder IgG Meerrettichperoxidase-konjugierter Antikörper (Organon Teknika Cappel, Malvern, Pennsylvania) wurde in PBS-0,05% TWEEN 20 Detergens 1:3000 oder 1:5000 verdünnt. Aliquote (100 μl) des Konjugats wurden zu den Vertiefungen zugegeben und 1 Stunde bei 22°C inkubiert. Anschließend wurden 100 μl o-Phenylendiaminphosphat (Sigma) zugesetzt, und die Platten wurden 30 min bei 22°C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 100 μl 1 N H₂SO₄ gestoppt, und die Absorbanzen wurden bei 490 nm bestimmt.
Es wurde bestimmt, ob die anti-Dra-Fragment Antikörper, die in den 7 frühe Lyme-Krankheit-Serumproben vorhanden waren, leicht unter Verwendung eines Dra-Fragment IgM oder IgG ELISA nachgewiesen werden konnten. Es wurden Dra-Fragment-ELISA-Platten bereitet und verwendet, um die Menge an Dra-spezifischem Antikörper zu messen, die nachgewiesen wurde, wenn die Sera 1:200 mit PBS (pH 7,2), das 0,5% TWEEN 20 Detergens enthielt, verdünnt wurden. Das ist eine Verdünnung, die üblicherweise in diagnostischen Laboratorien verwendet wird, wenn ELISA-Assays durchgeführt werden.
Signifikante Level an IgM anti-Dra-Fragment Antikörper waren in allen 7 frühe Lyme-Krankheit-Serumproben nachweisbar, wie in der Tabelle 2 illustriert. Der IgG ELISA wies auch anti-Dra-Fragment Antikörper in 3 (42%) der 7 frühen Serumproben nach. Die Tabelle 2 illustriert die OspC (ganzes Protein) und Dra-Fragment IgM ELISA-Reaktivität unter Verwendung früher Lyme-Krankheit-Sera (n = 7), die borreliazide anti-OspC und anti-Dra Antikörper enthalten. Die Tabelle 2 zeigt, dass ein Dra-Fragment-ELISA anti-Dra-Fragment-Antikörper in den frühe Lyme-Krankheit-Sera bei 0,200 Absorbanz und einer Verdünnung von 1:200 nachweisen konnte. Tabelle 2. Dra-Fragment-ELISA^a-Reaktivität unter Verwendung früher Lyme-Krankheit-Sera (n = 7), die borreliazide anti-Dra Antikörper enthalten.

Anzahl (%) von Sera IgM reaktiv bei: Anzahl (%) von Sera IgG reaktiv bei:

≥ 0,1 ≥ 0,2 ≥ 0,3 ≥ 0,1 ≥ 0,2 ≥ 0,3

7 (100) 7 (100) 7 (100) 3 (43) 0 0

a Sera 1:200 verdünnt in Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,2), 0,05% TWEEN 20 enthaltend. Reaktivität mittels Absorbanz von 490 nm bestimmt.

Beispiel 4
Dieses Beispiel soll die Spezifität eines B.-b. OspC-ELISA und eines Dra-Fragment-ELISA zum Nachweis der Lyme-Krankheit zeigen.
Ob der Dra-Fragment-ELISA spezifischer war als der OspC-ELISA, wurde bestimmt, indem Normalsera und Sera von Patienten mit EBV und CMV-Infektionen untersucht wurden. Es wurden auch Serumproben untersucht, die rheumatoiden Faktor enthielten, und Serumproben von Patienten mit Syphilis, weil von diesen zwei Arten von Sera auch bekannt ist, dass sie stark mit herkömmlichen Tests auf die Lyme-Krankheit reagieren.
Ferner wurden Serumproben von Individuen getestet, die vorher mit einer OspA-Lyme-Krankheit-Vakzine geimpft wurden. Beide ELISAs wurden durch eine vorherige Impfung gegen die Lyme-Krankheit nicht beeinflusst. Eine ähnlich kleine Anzahl der Normalserumproben, der rheumatoiden Faktor enthaltenden Sera und der syphilitischen Sera waren unter Verwendung der IgM OspC oder Dra-Fragment ELISAs positiv. Der OspC ELISA war jedoch oft falsch-positiv, wenn Sera von Patienten mit anderen Krankheiten, einschließlich EBV und CMV, verwendet wurden, hauptsächlich wenn hinsichtlich IgM getestet wurde. Das ist nicht überraschend, da IgM-Antikörper während der frühen Lyme-Krankheit in hohen Konzentrationen vorhanden sind. IgG-Antikörper treten üblicherweise erst in späteren Krankheitsstadien auf. Im Gegensatz dazu war IgM Dra-Fragment ELISA signifikant weniger reaktiv bei Verwendung von Sera von Patienten mit CMV und EBV. Es wird auf die nachstehende Tabelle 3 Bezug genommen. Somit war der Dra-Fragment ELISA signifikant spezifischer als der ELISA, der das ganze OspC-Protein enthielt.

Die Tabelle 3 zeigt IgM OspC (ganzes Protein) und Dra-Fragment ELISA versus Lyme-Krankheit kreuzreaktive Sera (Serumverdünnung 1:200). Unter Bezugnahme auf die Tabelle 3: Dra-Fragment-ELISA war signifikant spezifischer als OspC-ELISA. Tabelle 3. Anzahl (%) der potentiell kreuzreaktiven Sera mit OspC und Dra-Fragment IgM ELISA Reaktivität^a

Sera (getestete Anzahl)	Anzahl (%) der positiven Ergebnisse unter Verwendung von OspC-ELISA			Anzahl (%) der positiven Ergebnisse unter Verwendung von Dra-ELISA
Sera (getestete Anzahl)	≥ 0,100	≥ 0,200	≥ 0,300	≥ 0,100	≥ 0,200	≥ 0,300
endemisch normal (28)	1 (3,6)	0	0	0	0	0
CMV (39)	11 (28,2)	7 (17,9)	3 (7,6)	3 (7,6)	0	0
EBV (47)	12 (25,5)	3 (6,4)	3 (6,4)	1 (2,1)	0	0
Syphilis (25)	3 (12,0)	2 (8,0)	0	4 (16,0)	2 (8,0)	1 (4,0)
Rheumatoider Faktor (15)	2 (13,3)	2 (13,3)	2 (13,3)	2 (13,3)	2 (13,3)	2 (13,3)
Gesamt (154)	29 (18,8)	14 (17,0)	8 (5,2)	10 (6,5)	8 (5,2)	3 (1,9)

a Sera 1:200 verdünnt in Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,2), die 0,05% TWEEN 20 enthielt. Absorbanz bei 490 nm bestimmt.

Beispiel 5
Dieses Beispiel soll zeigen, dass OspC- und Dra-Fragment ELISA ähnliche Empfindlichkeit hatten. Die Empfindlichkeit des Dra-Fragment ELISA wurde mit OspC ELISA verglichen, indem 20 Serumproben von Patienten mit Kultur-definierter Lyme-Krankheit untersucht wurden. Diese Sera enthielten auch unterschiedliche Level borreliazider anti-OspC Antikörper. Die OspC- und Dra-Fragment ELISAs hatten ähnliche Empfindlichkeit. Die OspC und Dra-Fragment ELISAs wiesen IgM Antikörper (Absorbanz ≥ 0,200) in 12 (60%) bzw. 10 (50%) der 20 frühen Lyme-Krankheit-Sera nach, wie in der Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4. Nachweis von OspC oder Dra-Fragment Antikörpern mittels IgM ELISA^a in 20 frühen Lyme-Krankheit-Serumproben, die borreliazide anti-B. burgdorferi 50772 Antikörper enthielten.

Anzahl (%) der Sera IgM reaktiv bei:

ELISA > 0,100 > 0,200

OspC 15 (75) 12 (60)

Dra-Fragment 12 (60) 10 (50)

a Sera 1:200 in Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,2) verdünnt, die 0,05% TWEEN 20 enthielt. Absorbanz-Werte wurden bei 490 nm bestimmt.

Ferner korrelierte die Fähigkeit zum Nachweis von anti-OspC- oder anti-Dra-Fragment Antikörpern eng mit der borreliaziden anti-B. b. Aktivität. Mit wenigen Ausnahmen wurden hohe Konzentrationen an anti-OspC oder anti-Dra-Fragment IgM Antikörpern in frühen Lyme-Krankheit-Sera nachgewiesen, die auch hohe Konzentrationen borreliazider Antikörper enthielten. Wenn die borreliazide Aktivität niedrig war, waren beide ELISAs am häufigsten negativ. Das war nicht unerwartet, da gezeigt wurde, dass der Test auf borreliazide Antikörper ungefähr 3-mal empfindlicher ist als ein handelsüblicher ELISA (30).
Beispiel 6
Wir arbeiten derzeit daran, die Empfindlichkeit des Dra-Fragment-ELISA zu erhöhen, indem die Verdünnungen des getesteten Serums erniedrigt werden. Das sollte aufgrund der hochspezifischen Natur der Dra-Fragment-Antikörperantwort leicht möglich sein. Wir gehen davon aus, dass Verfeinerungen der Dra-Fragment-ELISA-Testverfahren (z. B. Serumverdünnung, Konzentration an Antigen/Vertiefung) die Empfindlichkeit signifikant auf Level erhöhen wird, die enger mit der Nachweisempfindlichkeit in Bezug auf borreliaziden anti-B. b. 50772 Antikörper in Beziehung stehen.
Beispiel 7
Dieses Beispiel bestätigt die prognostischen Fähigkeiten des Dra-Fragment ELISA. Mehrere Serumproben von 2 Patienten mit früher Lyme-Krankheit wurden geprüft, wobei der Dra-Fragment-ELISA herangezogen wurde. Serumproben wurden vor, während und nach der Behandlung mit antimikrobiellen Mitteln genommen. Die borreliazide anti-50772 Aktivität wurde mit dem Dra-Fragment ELISA überwacht. Beim Patienten 1 waren anti-OspC Antikörper 5 Tage nach der Infektion und 6 und 11 Tage nachdem die Antibiotikabehandlung eingesetzt hatte, nachweisbar. Borreliazide anti-50772 Antikörper und anti-Dra-Fragment Antikörper waren 5 Tage nach der Infektion und 6 Tage nach der Behand lung nachweisbar, aber nicht mehr nach 11 Tagen. Ähnlich waren anti-OspC Antikörper 7 Tage nach der Infektion und 10 und 24 Tage nach der Antibiotikabehandlung im Serum des Patienten 2 nachweisbar. Borreliazide Antikörper und anti-Dra-Fragment Antikörper waren jedoch nur vor der Antibiotikabehandlung nachweisbar. Diese Ergebnisse zeigen die Fähigkeit des Dra-Fragment ELISA, mit Infektion mit B. b. zu korrelieren. Somit ist Dra-Fragment ELISA auch als Test bezüglich einer Heilung nützlich.
Beispiel 8
Die Fähigkeit von OspC, borreliazide Antikörper zu induzieren, hat die Identifizierung des (der) Epitops (Epitope) ermöglicht, das (die) für die Induktion der Aktivität verantwortlich ist (sind). Da der Schutz nach der Impfung mit OspA von der Induktion und dem Aufrechterhalten hoher Level borreliazider anti-OspAAntikörper abhängt, hängen der Schutz oder die Clearance von B. b. von infizierten Individuen auch von der Induktion borreliazider anti-OspC Antikörper ab. Da die borreliaziden anti-OspC Antikörper aus frühen Lyme-Krankheit-Sera durch Adsorption an das Dra-Fragment entfernt werden können, sollte die Impfung mit dem Dra-Fragment auch borreliazide Antikörper induzieren. Mäuse, die mit rekombinantem OspC geimpft wurden, produzieren tatsächlich borreliazide Antikörper.
Unter Verwendung der Verfahren des Beispiels 1 wurden Mäuse mit B. b. 50772 geimpft und der Level borreliazider Antikörper wurde in verschiedenen Zeitintervallen nach der Impfung bestimmt. Die borreliazide Aktivität war 14 Tage nach der Anfangsimpfung nachweisbar und erreichte einen Höhepunkt nach 56 Tagen, wie in der Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5. Entwicklung von borreliaziden anti-B. burgdorferi 50772 Antikörpern in Mäusen nach Impfung mit B. burgdorferi 50772-Organismen.

Borreliazide Aktivität gegen B. burgdorferi 50772

Tage nach der Primärimpfung^a Maus 1 Maus 2

14 20b 20

28 320 320

42 160 160

56 2560 640

112 1280 320

a Mäuse wurden am Tag 0 geimpft und es wurden ihnen vier Booster-Impfungen in Zwei-Wochen-Intervallen verabreicht.
b Reziproke der höchsten Serumverdünnung mit signifikanter borreliazider Aktivität.

In einem ähnlichen Versuch wurden anti-Dra-Fragment Antikörper durch Adsorption an anti-Dra-Fragment-Fusionsprotein entfernt. Die Level borreliazider Antikörper wurden dann vor und nach der Adsorption und Entfernung von anti-Dra-Fragment-Antikörpern gemessen. Die borreliazide Aktivität nahm von 1:2560 bis 1:640 nach der Entfernung von anti-Dra-Fragment Antikörpern ab. Eine Impfung mit dem Dra-Fragment wird also schützende borreliazide Antikörper induzieren.
Beispiel 9
Dieses Beispiel soll zeigen, dass das Dra-Fragment ein besserer Impfstoffkandidat ist als das ganze OspC-Protein. Tiere werden mit OspC geimpft und Serum mit hohem Level borreliazider Aktivität wird gesammelt. Das Serum wird geteilt und die borreliazide Aktivität aus einer Probe durch Entfernung der anti-Dra-Fragment Antikörpern eliminiert. Die Tiere mit oder ohne borreliazide Antikörper (anti-Dra-Fragment) für separate Gruppen von Empfängertieren werden dann passiv appliziert bevor sie mit B. b. und in verschiedenen Intervallen nach der Infektion provoziert werden. Das Serum, das borreliazide anti-Dra-Fragment Antikörper enthält, schützt vor und eliminiert Organismen und klinische Symptome nach der Infektion. Im Gegensatz dazu erwarten wir, dass anti-OspC-Serum ohne borreliazide Antikörper beim Verhindern oder Heilen der Infektion unwirksam ist. Es gibt somit einen eindeutigen Beweis der Nützlichkeit des Dra-Fragments als wichtige Komponente einer Lyme-Krankheit-Vakzine.
Beispiel 10
Die Lyme-Krankheit verursacht auch beträchtliche Morbidität und eine gewisse Mortalität bei Hunden und Katzen. Es gibt Ähnlichkeiten zwischen der Krankheit bei Menschen und Hunden, einschließlich der Migration der Spirochäten zu Gelenken und der Entwicklung von Lyme-Arthritis (45). Interessanterweise haben Straubinger et al. (27) kürzlich berichtet, dass natürlich infizierte Hunde – anders als Menschen – keine borreliaziden Antikörper produzieren.

Wir haben jedoch kürzlich gezeigt, dass natürlich infizierte Hunde tatsächlich hohe Konzentrationen borreliazider Antikörper entwickeln. Wir haben 15 12–24 Wochen alte pathogenfreie Beagles natürlich infiziert, indem 10 weibliche und 6 männliche Ixodus-scapularis-Zecken an den Tieren angebracht und bis zur Sättigung saugen gelassen wurden. Ungefähr 44% der Zecken waren mit B. b. infiziert. Es waren hohe Konzentrationen bor reliazider anti-B.-b. 50772 Antikörper in 8 (53%) von 15 Hunden 1 Woche nach Anwendung der Zecke nachweisbar. Es wird auf die Tabelle 6 Bezug genommen. Tabelle 6. Nachweis borreliazider Antikörper gegen B. burgdorferi 50772 in Hunde-Sera nach Zecken-Provokation^a.

Wochen nach Provokation	Zahl der Sera mit ziden Antikörpern^b/gesamt (%)	mittlere borreliazide Aktivität^c
Vor-Provokation	0/14 (0)	NRD^d
1	8/15 (53)	518
2	12/14 (86)	402
3	13/15 (87)	558
4	13/15 (87)	1645
5	13/15 (87)	2074
6	13/15 (87)	3700
7	13/15 (87)	3814
8	12/14 (86)	2552
9	12/13 (92)	2407

a Zehn weibliche und sechs männliche Ixodes-scapularis-Zecken ließ man bis zur Sättigung saugen (44% der Zecken waren mit B. burgdorferi infiziert. Die Wahrscheinlichkeit, dass der zuletzt provozierte Hund mindestens eine infizierte Zecke bekam, war 99,4%. Alle Zecken wurden an einem endemischen Lyme-Krankheit-Fokus nahe Ettrick, WI, gesammelt).
b Signifikante borreliazide Aktivität bei einer Serumverdünnung ≥ 1:20.
c Reziproke Verdünnung von durchschnittlichem borreliazidem Antikörpertiter.
d NRD, keine Antwort nachgewiesen.

2 bis 9 Wochen nach der Infektion hatten ≥ 86% der Hunde hohe Konzentrationen borreliazider Antikörper in ihrem Serum. Ferner entwickelten 83% der infizierten Hunde klinische Zeichen und Symptome (Lahmheit), die mit der Lyme-Krankheit in Verbindung stehen, und B.-b.-Organismen wurden von der Haut und den Gelenken von > 90% der Tiere erhalten. Wir haben auch anti-OspC- und anti-Dra-Fragment-Antikörper aus 3 Hundesera mit hohen Titern an borreliazidem anti-B. b. 50772 Antikörper entfernt. Die Entfernung dieser Antikörper führte zu einer fast vollständigen Aufhebung der borreliaziden Aktivität. Diese Feststellungen sind fast identisch mit unseren Ergebnissen unter Verwendung von Humansera. Es ist also wahrscheinlich, dass das OspC-Dra-Fragment auf die gleiche Art wie oben für Menschen beschrieben für Haus- und Nutztiere nützlich sein wird.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes, immunogenes Polypeptidfragment von OspC aus Borrelia burgdorferi, bestehend aus einem Epitop von OspC mit der Aminosäuresequenz wie von den Resten 145 bis 194 von SEQ. ID Nr. 2 dargestellt.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 1, bestehend aus den Resten 145 bis 194 von SEQ. ID Nr. 2.
Isoliertes DNA-Molekül, welches für ein Polypeptid nach Anspruch 2 kodiert.
Isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 3, ferner umfassend eine Dral-Erkennungsstelle an seinem 5'-Ende und eine SmaI-Erkennungsstelle an seinem 3'-Ende.
Isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 3, bestehend aus seiner Sequenz von Nukleotid-Basenpaaren wie von den Nukleotiden 433 bis 582 von SEQ. ID Nr. 1 dargestellt.
Expressionsvektor, umfassend eine isolierte DNA, welche für ein Polypeptid kodiert, das aus einer Aminosäuresequenz besteht wie von den Resten 145 bis 194 von SEQ. ID Nr. 2 dargestellt.
Pharmazeutische Zusammensetzung für die Impfung gegen und die Behandlung von Borrelien-Infektion in Säugetieren, einschließlich Menschen, wobei die Zusammensetzung eine Menge eines isolierten Polypeptids umfasst, welches aus einer Aminosäuresequenz besteht wie von den Resten 145 bis 194 von SEQ. ID Nr. 2 dargestellt, wobei die Menge wirksam ist für die Vorbeugung oder Behandlung von Borrelien-Infektion in Säugetieren.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, ferner umfassend einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder 8, ferner umfassend ein Adjuvans.
Isoliertes Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz wie von den Resten 145 bis 194 von SEQ. ID Nr. 2 dargestellt, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers mittels Chirurgie, Therapie oder Diagnose.
Verwendung eines isolierten Polypeptids, bestehend aus der Aminosäuresequenz wie von den Resten 145 bis 194 von SEQ. ID Nr. 2 dargestellt, bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Borrelien-Infektion.
Verfahren zur Erkennung von Borrelien-Infektion in Säugetieren, einschließlich Menschen, umfassend: a) Inkontaktbringen einer Körperflüssigkeit eines Säugetierwirts, welcher im Verdacht steht, an Borrelien-Infektion zu leiden, mit einem isolierten Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz wie von den Resten 145 bis 194 von SEQ. ID Nr. 2 dargestellt; und anschließend b) Feststellen, ob das isolierte Polypeptid mit in der Körperflüssigkeit des Säugetierwirts vorhandenen Antikörpern konjugiert ist, wobei das Vorhandensein von Konjugation das Vorhandensein von Borrelien-Infektion in dem Wirt anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei in Schritt b) das Vorhandensein von Konjugation mittels eines enzymgekoppelten Immunadsorptionstests festgestellt wird.
Kit für die Diagnose von Borrelien-Infektion in Säugetieren, einschließlich Menschen, umfassend ein isoliertes Polypeptid, welches aus der Aminosäuresequenz besteht wie von den Resten 145 bis 194 von SEQ. ID Nr. 2 dargestellt, befindlich in einem hierfür geeigneten Behälter, sowie Anweisungen für die Verwendung des Kits.