DE69718903T2

DE69718903T2 - Verwendung von aus osp-c abgeleiteten peptidefragmenten für diagnostische methoden

Info

Publication number: DE69718903T2
Application number: DE69718903T
Authority: DE
Inventors: Arne Holm; Jartved Mathiesen; Soren Ostergaard; Michael Theisen
Original assignee: DakoCytomation Denmark AS
Current assignee: Oxoid Ely Ltd
Priority date: 1996-05-02
Filing date: 1997-05-02
Publication date: 2003-12-04
Anticipated expiration: 2017-05-03
Also published as: ATE232212T1; WO1997042221A1; CA2253374A1; DE69718903D1; DK0896583T3; CA2253374C; DE896583T1; EP0896583B1; EP0896583A1

Description

Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Diagnose der Lyme-Borreliose oder genauer ein Verfahren zum Nachweis von Antikörper gerichtet gegen das OspC-Protein von Borrelia burgdorferi sensu lato. Weiterhin richtet sich die Erfindung auf ein immunologisches Agens umfassend ein vom C-Terminus von OspC stammendes spezifisches Peptidfragment und dessen Verwendung in der Diagnose der Lyme-Borreliose, genauso wie als Vakzin. Die. Erfindung betrifft schließlich auch neue Polypeptidfragmente die vom C-Terminus von OspC stammen, genauso wie kurze Peptide die aus diesem Bereich rühren.

Hintergrund der Erfindung

Der von Zecken übertragene Spirochet Borrelia burgdorferi ist das ethiologische Mittel der Lyme-Borreliose, die am häufigsten vorkommende vektorübertragene Erkrankung des Menschen in Europa und Nordamerika. Lyme- Borreliose ist eine übliche zeckenübertragende Erkrankung, hervorgerufen durch eine der drei Genospezien von B. Burgdorferi sensu lato: B. burgdorferi sensu stricto, B. garin ü und B. afzel ü. Die klinische Manifestation ist unterschiedlich und kann die Haut, das zentrale Nervensystem, Herz und Gelenke beinhalten. Die Symptome können in drei Stadien unterteilt werden: erstes Stadium: Hautläsion; zweites Stadium: Meningitis, Arthritis und Myokarditis; drittes Stadium: chronische Meningitis, chronische Arthritis und chronische Hautläsionen.
Es ist wünschenswert einen Assay zu besitzen, der eine hohe diagnostische Sensitivität bereits während des ersten Stadiums der Lyme- Borreliose hat, um Patienten zu diagnostizieren und zu behandeln bevor sie schwere Symptome der späteren Stadien der Lyme-Borreliose entwickeln.
Die Labordiagnose von Lyme-Borreliose ist seit der Entdeckung von B. burgdorferi im Jahr 1982 möglich. Der ultimative diagnostische Assay wurde allerdings bisher nicht entwickelt. Eine Bestätigung der Lyme-Borreliose durch das Labor beruht nach wie vor auf den Nachweis von Antikörpern gegen B. burgdorferi. Assays, die auf Gesamtzell-B. burgdorferi-Extrakte beruhen, fehlt die diagnostische Spezifität aufgrund der Kreuzreaktion von Antikörpern mit Antigenen aus einem weiten Bereich von Bakterienarten. Western-Blot (WB) stellte sich aufgrund der Unterschiede bei den Stämmen, der Komplexität der Bandenmuster und der inhärenten Probleme bei der Standardisierung von Western-Blot im allgemeinen, als schwierig heraus. Die Bemühungen waren daher hauptsächlich auf die Identifikation von einzelnen immundominanten Antigenen, entweder in ihrer nativen Form oder als rekombinante Proteine, die dann aufgereinigt werden können und als Testantigene verwendet werden können, gerichtet.
Gemäß Western-Blot-Studien existieren nur zwei B. burgdorferi- Antigene, die dieses wesentliche Kriterium des Hervorrufens einer frühen und starken Antikörperantwort in der Mehrzahl der Patienten erfüllen. Dieses sind das B. burgdorferi-Flagellum und das äußere Oberflächenprotein C (OspC). Während das Durchführen von EIA's mit aufgereinigtem nativen B. burgdorferi flagellum gut dokumentiert ist, sind Berichte über Erfahrungen mit OspC EIA's nach wie vor sehr begrenzt.
Andere Wege der spezifischen Diagnose der Lyme-Borreliose wurden vorgeschlagen. Eine Fraktion von Proteinen und Lipiden, die in Verbindung mit der Membran stehen, bekannt als "Fraktion B", wurde in EP-A-445 135 offenbart und es zeigte sich, daß diese eine verbesserte diagnostische Spezifität auf zeigte, die Bereitstellung der Fraktion B erfordert aber, daß Borrelia burgdorferi sensu lato kultiviert wird und anschließend mit einer Vielzahl von Schritten behandelt wird.
Eine starke Häufigkeit von IgM Anti-OspC-Antikörpern wurde in Patienten in den ersten beiden Stadien der Lyme-Borreliose mit Hilfe von Western-Blots gefunden, unter Verwendung von nativen und rekombinante OspC (rOspC) und mit Hilfe von ELISA unter Verwendung von rOspC (Fung B. P. et al. (1994); Gerber M. A. et al. (1995); Wilske B. et al. (1994); Padula S. J. et al. (1994)).
WO 94/25596 offenbart eine Vielzahl von OspC-Antigenen, die als OspC- Vakzin nützlich sind.
WO 95/35379 offenbart ein Antigen aus Borrelia burgdorferi sensu lato, diese sind in den drei Borrelia-Stämmen, die mit der Lyme-Erkrankung in Beziehung stehen, konserviert, das Antigen kann aber nicht in Borrelia- Arten gefunden werden die mit Rückfallfieber und Affenborreliose in Beziehung stehen. Dieses Antigen wurde als ein Kandidat für ein Vakzin und zur Diagnose in bezug auf Infektionen mit Borrelia burgdorferi sensu lato vorgeschlagen.

Zusammenfassung der Erfindung

Allgemein gesagt wurde durch die Erfinder festgestellt, daß die Sensitivität der Diagnose von frühen Stadien der Lyme-Borreliose erhöht werden kann durch Kombination der Ergebnisse eines Immunoassays, basierend auf dem Nachweis von Anti-OspC-Antikörpern und den Ergebnissen von zur Zeit erhältlichen Immunoassays auf das Flagellum.
Genauer sind die Erfinder zu dem Ergebnis gekommen, daß bestimmte Cterminale Fragmente von OspC ein Epitop umfassen, das wesentlich für die Erkennung des OspC durch das menschliche Immunsystem ist. Weiterhin wurde gefunden, daß die serodiagnostische Sensitivität des C-terminalen Fragments überraschend hoch war wenn sie mit der von OspC in seiner gesamten Länge verglichen wurde.
Diese Schlüsse wurden erzielt nachdem immunologische Experimente überraschend zeigten, daß 1) ein synthetisches Peptid, das vom C-Terminus von OspC von B. burgdorferi sensu lato stammt, eine immunologische Sensitivität beim Nachweis in Seren humaner Lyme-Borreliose-Patienten aufzeigte, die mindestens 85% des rekombinanten B. burgdorferi sensu lato- Gesamt-OspC.(rOspCfl) ist, wenn es in gleichen Assays verwendet wird und daß 2), wenn ein rekombinantes B. burgdorferi sensu lato OspC, so verkürzt wurde, daß die 7 carboxyterminalen Aminosäuren fehlen (rOspCt) im Vergleich zu dem rekombinanten Gesamtlängen OspC (rOspCfl) eine sehr geringe, immunologische Reaktivität mit Seren von Patienten die an Lyme-Borreliose leiden, aufzeigen, wenn überhaupt.
Diese immunologischen Experimente waren Teil einer wissenschaftlichen Arbeit mit dem Ziel, einen Immunoassay herzustellen, basierend auf das Erkennen von rekombinanten OspC durch Antiseren. Im ersten Versuch wurde allerdings eine diagnostische Sensitivität von weniger als 5% im frühen Stadium der Lyme-Borreliose erreicht (diese beinhaltet das erste und das zweite Stadium der Lyme-Borreliose), siehe Beispiel 1. Hier wurde die abgeleitete Aminosäuresequenz von drei OspC-Proteinen, die jeweils einen der drei B. burgdorferi-Genospezies darstellt (B. burgdorferi sensu stricto, B. garin ü und B. afzel ü) als Testantigene verwendet. Den rekombinanten Proteinen fehlten aber die sieben C-terminalen Aminosäurereste, da diese bisher noch nicht für drei entsprechenden Isolate von Borrelia burgdorferei sensu lato bestimmt waren.
In einem zweiten Versuch wurden die rekombinanten OspC-Gesamtproteine (rOspCfl) von allen drei Stämmen hergestellt, einschließlich der letzten sieben Aminosäureresten, die entsprechend abgeleitet wurden. Weiterhin war die abgeleitete Aminosäuresequenz im C-Terminus des OspC-Proteins für die Genospezies von B. garinii und B afzelii, wie sie im ersten Versuch verwendet wurden, identisch, während die von B. burgdroferi sensu stricto einen Valin-Rest anstelle eines Alanin-Rests in der Position 205 aufzeigt. Durch Nutzen der rOspCfl-Proteine als Testantigene in einem ELISA wurde eine diagnostische Sensitivität von 44% für IgM im ersten Stadium der Lyme-Borreliose und 48% für IgM im zweiten Stadium der Lyme-Borreliose in vorläufigen Tests erzielt. Die diagnostische Sensitivität für Borreliose war für alle drei Genospezies identisch. Daher wurde ein umfangreicheres Testen der immunologischen Reaktivität von rOspCfl und von synthetischen Peptiden, die vom C-Terminus stammen, durchgeführt, siehe Beispiel 2.
Aufgrund dieser Befunde wurde geschlossen, daß die sieben Carboxyterminalen Aminosäurereste ein Antigenepitop umfassen, darstellen oder einen Teil davon bilden, das wesentlich für die humane immunologische Erkennung von OspC ist und es wurde daher angenommen, daß dieser Epitopbereich die Basis für neue und verbesserte diagnostische Mittel darstellen kann.
Es wurde weiterhin untersucht, wie der. Anteil der einzelnen Aminosäuren zur Immunreaktivität des C-Terminus von OsgC beiträgt und es wurde gefunden, daß die letzten 5 Aminosäuren nur in einem sehr begrenzten Ausmaß variiert werden können, während z. B. Alanin-Substitutionen in den anderen Aminosäuren im C-Terminus keinen oder nur einen geringen Einfluß auf die Immunreaktivität hatten.
Eine Vielzahl von Vorteilen können durch Verwendung von kurzen OspC- Fragmenten als Teil eines immunologischen Agens zur Diagnose von Lyme- Borreliose im frühen Stadium bereitgestellt werden. Als wichtigster Punkt erleichtert ein Immunoassay, wie ein ELISA, der auf ein synthetisches Peptid basiert, im Gegensatz zum Gesamtlängen oder fast Gesamtlängen-OspC die Herstellung und die Aufreinigungsschritte der Komponenten des Assays und hilft somit den Assay zu standardisieren.
Weiterhin kann die Verwendung eines kurzen Peptids in einem Immunoassay zu einer Verringerung der Kreuzreaktivität mit Antikörpern, die gegen andere Antigene gerichtet sind, führen als Konsequenz des Weglassens einer großen Zahl von möglichen kreuzreaktiven Epitopen in OspC (z. B. fehlt den vorliegenden Peptiden eine Sequenzhomologie mit den variablen Membranproteinen von B. hermsii). Andererseits hat die Verwendung eines Antigens, wie das Gesamtlängen-OspC, das eine Vielzahl von Epitopen umfaßt, üblicherweise zum Ergebnis, das ein Signal eines kreuzreagierenden Epitops "untergeht" in den Signalen der anderen Epitope, ein Effekt, das von einem Antigen das nur wenige Epitope umfaßt nicht erwartet werden kann. Daher sollte das kurze Peptid bevorzugt ein sehr spezifisches Muster der immunologischen Reaktion mit Antikörpern gegen andere Antigene aufzeigen, siehe hierzu die Diskussion zur Spezifität unten.
Als Testantigen in einem Immunoassay sollte das erfindungsgemäße Peptid eine überlegene diagnostische Sensitivität im frühen Stadium der Lyme-Borrreliose im Vergleich zu z. B. einem rOspCfl-ELISA aufzeigen. Dies ist in der Tatsache begründet, daß die relativ geringe Größe des erfindungsgemäßen Peptids das Binden einer großen Zahl von Peptiden an die feste Oberfläche des ELISAs erlaubt, ohne den Nebeneffekt, daß diese Peptide untereinander sich stören, während die relativ großen rOspCfl-Moleküle tatsächlich miteinander wechselwirken und z. B. Epitope, die möglicherweise mit Antikörpern reagieren können, verdecken.
Obwohl erwartet wird, daß die Verwendung eines kurzen Peptids zu einer deutlichen Abnahme in der Sensitivität beim Testen von Patientenantiseren führt (welche üblicherweise polyklonal sind), zeigen die Erfinder, daß kurze Peptide eine hohe Sensitivität im Vergleich zu rOspCfl aufzeigen (siehe Beispiel 2).
Daher sind die Peptidfragmente vom C-Terminus vom Borrelia burgdorferi sensu lato OspC erfindungsgemäß als diagnostische Werkzeuge in der Diagnose der Lyme-Borreliose nützlich.
Im weitesten Sinne betrifft die Erfindung daher ein Verfahren zur Bestimmung einer vorangegangenen Sensitivisierung eines Objekts mit OspC- Polypeptid aus Borrelia burgdorferi sensu lato, das Verfahren umfaßt
das Inkontaktbringen von Immunglobulinen oder T-Zellen des Objekts mit mindestens einem immunologischen Agens, umfassend ein Polypeptidfragment mit einer Länge von höchstens 60 Aminosäureresten und welches carboxyterminal ein Peptid mit der allgemeinen Formel I enthält:
A&sup5;-A&sup4;-A³-A²-A¹
wobei A¹ und A&sup4; unabhängig voneinander einen Aminosäurerest bezeichnen, wobei ein Stickstoffatom, das Teil einer Peptidbindung bilden kann, ein Teil einer Ringstruktur ist;
A² und A³ sind unabhängig voneinander positiv geladene oder polare Aminosäurereste; und
A&sup5; bezeichnet irgendeinen Aminosäurerest;
so daß das Peptid der Formel I einen Grad an Sequenzidentität von mindestens 60% mit den 5 Aminosäureresten der Untersequenz der SEQ ID Nr. 1: Ser-Pro-Lys-Lys-Pro aufweist
und anschließend Nachweis, wenn gegeben, des Ausmaßes an immunologischer Reaktivität zwischen den Immunglobulinen und dem immunologischen Agens oder zwischen den T-Zellen und dem immunologischen Agens, eine signifikante immunologische Reaktion ist für eine vorherige Sensitivisierung mit OspC-Polypeptid aus Borrelia burgdorferi sensu lato indikativ.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung diese Polypeptidfragments zur Herstellung eines diagnostischem Mittels zur Diagnose von Erkrankungen verursacht durch Borrelia burgdorferi sensu lato.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Kit zum Durchführen des beschriebenen Verfahrens.
Die vorliegende Erfindung stellt somit kurze (normalerweise synthetische) Peptide bereit, die anti-Borrelia-Antikörper im Serum von Patienten in einem frühen Stadium der Lyme-Borreliose binden. Diese Peptide können zusammen mit anderen Mitteln, die einen einfachen Nachweis von Borrelia burgdorferi sensu lato-Infektion ermöglichen, verwendet werden. Ein serodiagnostischer Assay, basierend auf der Verwendung dieser Peptide, gegebenenfalls kombiniert mit anderen Antigenen von B. burgdorferi, erhöhen die gesamtdiagnostische Sensitivität. Entsprechend können Patienten behandelt werden, bevor sie Symptome im zentralen Nervensystem ausbilden.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Das immunologische Mittel der vorliegenden Erfindung zeigt eine überraschen höhere Sensitivität im Nachweis von Borrelia-Antikörpern in Seren von Patienten mit Lyme-Borreliose. Die Sensitivität der Anti-Borrelia- Immunoassays kann daher erhöht werden und dies stellt einen wichtigen Fortschritt der Möglichkeit eines Nachweises der Erkrankung in einem frühen Stadium dar.
Im folgenden werden eine Anzahl von Begriffen ausführlicher erklärt.
Der Begriff "immunologisches Agens" bedeutet hier eine chemisch Einheit, die in der Lage ist, mit Antikörpern, entwickelt gegen ein C-terminales Epitop des OspC-Polypeptids von Borrelia burgdorferi sensu lato, zu reagieren. Das Agens umfaßt ein Polypeptidfragment, enthaltend das oben definierte Peptid, es kann allerdings auch weitere Merkmale aufweisen, wie Linker und Marker, siehe Diskussion unten.
Der Begriff "Polypeptidfragment" bedeutet im vorliegenden Zusammenhang ein Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid, das normalerweise ein Teil eines Proteins ausbildet, während ein "Peptid" hier ein Polypeptidfragment mit einer Länge von höchstens 10 Aminosäureresten bedeutet.
Der Begriff "Grad an Sequenzidentität" bedeutet einen Prozentsatz an übereinstimmenden Aminosäureresten (unter Berücksichtigung von sowohl der Position als auch der Art) im erfindungsgemäßen Peptid und eines in Übereinstimmung gebrachten Peptids gleicher Länge und mit dem Begriff "Untersequenz" wird hier ein fortlaufender Bereich von Aminosäureresten aus der SEQ ID NO: 1 angesehen. Es gibt 20 spezifische Untersequenzen der SEQ ID NO: 1, die eine Länge von mindestens 5 Aminosäuren haben.
Durch den Begriff "immunologische Reaktivität" wird hier der Grad an immunologischer Bindung zwischen einem Antigen und einem Antikörper (gemessen mit einem Immunoassay) oder den Grad der T-Zellreaktivität, hervorgerufen durch Inkontaktbringen eines Antigens mit einer T-Zelle (gemessen als Proliferationsantwort oder Cytokinfreisetzung) beschrieben.
Ein "Immunoglobulin" ist ein natürlich vorkommender Antikörper, der Klassen IgM, IgG, IgA, IgE und IgD.
Der Begriff "Sensitivität", wie er hier verwendet wird, ist definiert als die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen Verfahrens Antikörper gegen das OspC-Antigen in einer Probe eines Individuums mit klinisch diagnostizierter Lyme-Borreliose nachzuweisen. Die Sensitivität ist mathematisch definiert als Pmeas/Ptrue, worin Pmeas die Zahl der durch Test positiv gefundenen ist und Ptrue ist die Gesamtzahl der getesteten Proben (Proben, die von Individuen genommen wurden, die alle klinisch diagnostiziert wurden).
Der relative Begriff "Spezifizität", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Fähigkeit eines Verfahrens falsch positive Ergebnisse oder Signale zu produzieren, d. h. das Vermeiden ein positives Signal für die Anwesenheit von anti-OspC-Antikörpern zu ergeben, wenn diese tatsächlich nicht anwesend sind. Es ist klar, daß ein Verfahren, das eine niedrige Rate an falsch positiven Ergebnissen oder Signalen produziert, ein Verfahren mit einem hohen Maß an Spezifizität ist. Die Spezifizität eines Tests ist definiert als nmeas/ntrue, wobei nmeas die Zahl der gemessenen negativen Proben im Test ist und ntrue ist die Gesamtzahl an Personen, die nicht von der Erkrankung betroffen sind.
In diesem Zusammenhang bezieht sich der Begriff "Signal" auf eine meßbare Ausgabe eines Assays, der das Vorkommen von anti-OspC-Antikörpern testet. In einem ELISA ist das Signal normalerweise die optische Dichte (OD), die kann definiert werden OD = log 1/1-A, wobei "A" die relative Absorption des Lichts ist (im Bereich zwischen 0 und 1), diese wird durch einen Null-Standard korrigiert.
Im vorliegenden Kontext bezieht sich der Begriff "Ausschlußwert" auf das minimale Signal eines Assays, das als positives Signal bewertet wird. Damit hat abgesehen von der immunologischen Art des als Probe im Immunoassay verwendeten Antigens auch der Ausschlußwert, wie er für den Assay verwendet wird, einen Einfluß auf die Sensitivität und Spezifität eines Assays. Wenn z. B. der Ausschlußwert auf einen sehr niedrigen Wert des gemessen Parameters gesetzt wird (z. B. der OD), ist die Sensitivität des Assays ca. 1, dies geht aber auf Kosten der Spezifizität, welche nahe Null sein wird, da fast alle in Wahrheit Negativen als angeblich Positive im Assay bestimmt werden und somit nmeas ca. Null sein wird.
Es ist daher klar, daß die Wirksamkeit eines gegebenen Immunoassays sehr stark vom Ausschlußwert abhängt und daß die Bestimmung des Ausschlußwerts weiterhin abhängig ist von der gewünschten Verwendung des Assays. Natürlich ist die normale Situation so, daß ein Assay sowohl sensitiv als auch spezifisch sein soll, unter einigen Umständen ist das aber nicht unbedingt zwingend. Dies kann z. B. der Fall in Situationen sein, wo ein sensitiver Screening-Assay verwendet wird, um "den Untersuchungsbereich" einzugrenzen und ein oder mehrere spezifische Verifikationsassay(s) verwendet werden um das Ergebnis des Screening-Assays zu bestätigen. In dieser Situation muß der ersten Screening-Assay nicht sehr spezifisch sein und entsprechend muß der Verifikations-Assay nicht sehr sensitiv sein, wenn der Verifikationsschritt insgesamt die gleiche Sensitivität wie der Screening-Assay hat. Aus praktischen Gründen wurde bei den hier unter Verwendung der ELISA-Techniken durchgeführten Experimente der Ausschlußwert definiert als die optische Dichte, die 98% der Seren von gesunden Spendern ausschließt. Mit anderen Worten wurde der ausgewählte Ausschlußwert hier so ausgewählt, daß davon ausgegangen werden kann, daß 2% falsch positive Signale von gesunden oder nicht-sensibilisierten Individuen stammen. In der Praxis wurden Seren von 100 zufällig ausgewählten Blutspendern bei ELISAs, wie sie in den Beispielen beschrieben sind unterworfen und die optische Dichte wurde bestimmt. Der Ausschlußwert wurde definiert als die dritte OD in absteigender Reihenfolge, d. h. der dritthöchste gemessene Wert.
Entsprechend bezeichnet der Begriff "positives Signal" (auch bezeichnet als "eine signifikante immunologische Reaktion"), d. h. ein endgültiges oder vorläufiges Ergebnis, das besagt, daß die Probe Anti-OspC- Antikörper enthält, ein Signal oberhalb des ausgewählten Ausschlußwerts und der Begriff "negatives Signal" (oder "negative Reaktion"), d. h. ein endgültiges oder vorläufiges Ergebnis, das besagt, daß die Probe kein Anti- OspC-Antikörper enthält, bezeichnet ein Signal unterhalb des Ausschlußwerts.
Ein "tatsächlich positives" Signal oder Ergebnis ist hierin definiert als positives Signal oder Ergebnis, das klinisch mittels anderer erhältlicher diagnostischer Möglichkeiten bestätigt werden kann und ein "tatsächlich negatives Signal" ist somit ein negatives Signal, das auch zu keinem positiven Signal führt, wenn andere diagnostische Mittel verwendet werden.
Entsprechend ist ein "falsch positives" Signal oder Ergebnis definiert als ein positives Signal oder Ergebnis, das nicht bestätigt werden kann, ein "falsch negatives" Signal oder Ergebnis ist definiert als ein negatives Signal oder Ergebnis, das nicht als negativ bestätigt werden kann.
Abgesehen von dem Ausschlußwert eines gegebenen Assays, hat das genaue Umfeld, wo der Assay verwendet wird, einen Einfluß auf die Spezifizität. Es kann durchaus sein, daß ein Immungssay nicht-spezifisch ist, wenn er gegenüber einem breiten Bereich von zufällig ausgewählten Proben getestet wird, der Assay kann aber trotzdem als spezifisch "in der Praxis" angesehen werden, da die kreuzreagierenden Proben Material darstellt, das vom klinischen Standpunkt aus nie getestet werden würde.
Es wird erwartet, daß das erfindungsgemäße Verfahren, wenn es endgültig eingestellt ist, zu einem Verfahren führt, das in seiner Sensitivität höher ist als Verfahren die das Gesamlängen-OspC verwenden. Wie in den Beispielen aufgezeigt, ist in den frühen Stadien (1 und 2) der Lyme- Borreliose die mit einen ELISA unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptidfragments bestimmte optische Dichte wesentlich höher als die optische Dichte bestimmt mit einem ELISA unter Verwendung des Gesamtlängen-OspC.
Erfindungsgemäß ist das in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Peptid ein Homolog des von Borrelia burgdorferi sensu lato stammenden Peptids mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder eine Untersequenz der SEQ ID NO: 1 mit mindestens 5 Aminosäureresten und die Homologie ist mindestens 50% Sequenzidentität mit der SEQ ID NO: 1, siehe oben. Es ist bevorzugt, daß der Grad an Sequenzidentität mit der SEQ ID NO: 1 (oder dessen Untersequenzen) mindestens 60% ist, höhere Prozentgrenzen, d. h. 70%, 80% und 90% sind noch mehr bevorzugt, da angenommen wird, daß die optimale immunologische Reaktivität des Peptids erhalten wird, wenn es größtmöglichst der SEQ ID NO: 1 (oder dessen Untersequenzen) ähnelt. Daher ist die am meisten bevorzugte Sequenzidentität zwischen dem erfindungsgemäßen Peptid und der SEQ ID NO: 1 (oder dessen Untersequenz) 100%.
Die Länge des erfindungsgemäßen Peptids ist, wenn es sich dabei ein Homolog einer Untersequenz vom Borrelia burgdorferi sensu lato stammenden Peptid handelt, erfindungsgemäß mindestens 5 Aminosäurereste, da dies die minimale Länge eines linearen Epitops ist: In diesem Zusammenhang sollte angemerkt werden, daß Beispiel 3 die Wichtigkeit der letzten 5 C-terminalen Aminosäurerest der SEQ ID NO: 1 für die Immunreaktivität gegenüber OspC- positiven Seren aufzeigt (tatsächlich sind selbst die letzten 4 Aminosäuren von OspC in der Lage die Bindung zwischen rOspC und einigen Antiseren zu stören).
Gemäß der Erfindung kann die Länge der Untersequenz mindestens 6, bevorzugt mindestens 7 und noch bevorzugter 8 Aminosäurereste sein, um eine hohe Spezifität bei der Immunreaktivität aufrechtzuerhalten. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Untersequenz mindestens 9 Aminosäurereste lang. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform hat das von Borrelia burgdorferi sensu lato stammende Peptid die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1, da ein Peptid dieser Länge sich als ein wirksames diagnostisches Mittel in einem umfangreichen Experiment herausstellte. Es wird allerdings angenommen, daß kürzere Peptide sich als gleich wirksam in solchen Assays herausstellen und daß die am meisten bevorzugten Peptide der Erfindung eine Länge zwischen 5 und 10 Aminosäureresten haben (d. h. 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Aminosäurereste).
Wie man aus den Beispielen erkennen kann, haben die Erfinder gezeigt, daß die sieben carboxyterminalen Aminosäuren von OspC bei der humoralen Immunantwort des Menschen gegen das Gesamt-OspC essentiell sind, Daher umfassen oder bilden diese 7 Aminosäuresequenzen einen Teil eines essentiellen Epitops und entsprechend mindestens 2 aufeinanderfolgende Aminosäuren dieses 7 Aminosäurenbereichs sollten Teil des im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Peptids darstellen. Es wurde weiterhin gezeigt, daß mindestens 4 Aminosäuren quasi-essentiell für die Immunreaktivität der kurzen von OspC stammenden Peptide sind und es ist daher insbesondere bevorzugt, daß das von Borrelia burgdorferi sensu lato stammende Peptid als "template" für das erfindungsgemäße Peptid diese vier Aminosäuren umfaßt. Somit ist bevorzugt, daß das erfindungsgemäße Peptid einen 5-Aminosäurereste langen C-Terminus umfaßt, dessen Grad an Sequenzidentität zumindest 60% (bevorzugt mindestens 80% und am meisten bevorzugt eine totale Identität) mit den 5 C-terminalen Aminosäureresten der SEQ ID NO: 1 aufweist. Es ist insbesondere bevorzugt, daß das erfindungsgemäße Peptid die Aminosäuresequenz -Pro-Lys-Lys-Pro-COOH im C-Terminus aufzeigt.
Damit schließt erfindungsgemäß die Untersequenz des von Borrelia burgdorferi sensu lato stammenden Peptids bevorzugt mindestens 4 dieser 7 carboxyterminalen Aminosäurereste der SEQ ID NO: 1 ein. Höhere Konservierungsgrade werden bevorzugt, d. h. die Untersequenz schließt 5, 6 oder sogar alle 7 carobxyterminalen Aminosäuren der SEQ ID NO: 1 ein.
Obwohl erwartet werden kann, daß das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Peptid einen hohen Gräd an Ähnlichkeit mit der SEQ ID NO: 1 haben soll, ist es begründet anzunehmen, daß die Peptidspezifität und -sensitivität als diagnostisches Werkzeug weiter erhöht werden kann durch Modifizieren der Aminosäuresequenz des Peptids. Die Aminosäuresequenz kann dargestellt werden durch die allgemeine Formel (I):
A¹&sup0;-A&sup9;-A&sup8;-A&sup7;-A&sup6;-A&sup5;-A&sup4;-A³-A²-A¹ (I)
(die natürlich die obigen Kriterien erfüllt) und worin
A¹ und A&sup4; unabhängig voneinander Reste einer Aminosäure bezeichnen, worin ein Stickstoffatom, das Teil einer Peptidbindung sein kann, Teil einer Ringstruktur ist;
A² und A³ bezeichnen unabhängig voneinander Reste einer positiv geladenen oder polaren Aminosäure;
A&sup5;, A&sup6;, A&sup7;, A&sup8;, A&sup9; und A¹&sup0; sind unabhängig voneinander und sind entweder nicht vorhanden oder bezeichnen irgendeinen Aminosäurerest, sind aber bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Cystin, Glycin, Glutaminsäure, Glutamin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin, 2-Aminoadipinsäure, 3-Aminoadipinsäure, beta-Alanin, 2-Aminobuttersäure, Piperidinsäure, 6-Aminocapronsäure, 2-Aminoheptansäure, 2-Axäinoisobuttersäure, 3-Aminoisobuttersäure, 2-Aminopimelinsäure, 2,4-Diaminobuttersäure, Desmosin, 2,2'-Diaminopimelinsäure, 2,3-Diaminopropionsäure, N-Ethylglycin, N-Ethylasparagin, Hydroxylysin, Allo-Hydroxylysin, 3-Hydroxyprolin, 4-Hydroxyprolin, Isodesmosin, Allo-Isoleucin, N-Methylglycin, N-Methylisoleucin, 6-N-Methyllysin, N-Methylvalin, Norvalin, Norleucin, 6-Aminohexansäure, L-Thiazolidin-4-carbonsäure und Ornithin.
Es wird bevorzugt, daß die Aminosäuren, die als Substituenten in der SEQ ID NO: 1 verwendet werden, um im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbare Peptide herzustellen, sehr ähnlich den Aminosäuren sind, die im Carboxyterminus der natürlich vorkommenden Variante des nativen OspC vorliegen. Zur Zeit wissen die Erfinder über die folgenden natürlich vorkommenden Variationen im C-Terminus von OspC (basierend u. a. auf die Offenbarungen in WO 94/25596): A¹&sup0; kann Prolin sein (eine hydrophobe Aminosäure), A&sup9; kann Valin oder Isoleucin sein (beides hydrophobe Aminosäure), A&sup8; kann Valin sein (hydrophob), A&sup7; kann Alanin, Valin, Threonin und Serin (hydrophob und polar, d. h. ungeladen), A&sup6; Glutaminsäure sein (eine negativ geladene Aminosäure), A&sup5; kann Serin, Threonin, Asparagin und Alanin sein (alles ungeladene Aminosäuren), A&sup4; und A¹ können Prolin sein (wobei das Stickstoffatom, das einen Teil der Peptidbindung bildet, ein Teil der Ringstruktur ist), A³ kann Lysin sein (positiv geladen) und A² kann Lysin (positiv geladen) und Asparagin (polar) sein. Weiterhin hat die Substitution von einem A&sup5; bis A¹&sup0; mit Alanin (oder mit Phenylalanin für A&sup7;) keinen Einfluß auf die Immunreaktivität von OspC-positiven Seren und dem Decapeptid mit SEQ ID NO: 1 (wenn substituiert), wie in Beispiel 3 gezeigt.
In diesem Zusammenhang soll der Begriff "hydrophobe Aminosäure" alle natürlich vorkommenden L-Aminosäuren einschließen wie Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Methionin, Phenylalanin und Tryptophan, genauso wie andere nicht-natürlich vorkommende oder unübliche Aminosäuren (einschließlich D-Form), die bei pH 7 nicht polar sind.
Der Ausdruck "polare Aminosäure" soll einschließen natürlich vorkommende L-Aminosäuren, wie Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin genauso wie andere nicht-natürlich vorkommende oder unübliche Aminosäuren (einschließlich D-Formen), die bei pH 7 polar aber nicht geladen sind.
Der Begriff "negativ geladenen Aminosäure" soll einschließen natürlich vorkommende L-Aminosäuren, Asparaginsäure und Glutaminsäure, genauso wie andere nicht-natürlich vorkommende oder unübliche Aminosäuren (einschließlich D-Formen), die eine insgesamt negative Ladung bei pH 7 tragen.
Der Begriff "positiv geladene Aminosäure" soll einschließen natürlich vorkommende L-Aminosäuren wie Lysin, Arginin und Histidin, genauso wie nicht-natürlich vorkommende oder unübliche Aminosäuren (einschließlich D-Form), die insgesamt eine positive Ladung bei pH 7 tragen.
Somit ist bevorzugt, daß die Substituenten A&sup5;-A¹&sup0; in der Formel (I) wie folgt definiert sind:
A&sup5; ist nicht vorhanden oder bezeichnet einen Rest einer nicht-geladenen Aminosäure;
A&sup6; ist nicht vorhanden oder bezeichnet einen Rest einer negativ geladenen Aminosäure;
A&sup7; ist abwesend oder bezeichnet einen Rest einer hydrophoben oder polaren Aminosäure; und
A&sup8;, A&sup9; und A¹&sup0; sind unabhängig voneinander und eine abwesend oder bezeichnen einen Rest einer hydrophoben Aminosäure.
Es ist bevorzugt, daß A¹ und A&sup4; unabhängig voneinander einen Rest einer Aminosäure bezeichnen, ausgewählt aus Prolin und L-Thiazolidin-4- carbonsäure; A² und A³ bezeichnen unabhängig voneinander einen Aminosäurerest ausgewählt aus Lysin und Asparagin; A&sup5; ist abwesend oder bezeichnet eine Aminosäure, ausgewählt aus Serin, Threonin, Asparagin und Alanin; A&sup6; ist abwesend oder bezeichnet eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Asparaginsäure, Glutaminsäure und Alanin; A&sup7; ist abwesend oder bezeichnet einen Rest einer Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alanin, Phenylalanin, Valin, Threonin und Serin; und A&sup8;, A&sup9; und A¹&sup0; sind unabhängig voneinander abwesend oder bezeichnen einen Aminosäurerest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alanin, Valin, Isoleucin und Prolin.
Es ist insbesondere bevorzugt, daß die Substituenten (wenn vorhanden) ausgewählt sind aus den obigen Aminosäureresten, für die gezeigt wurde, daß sie im nativen OspC vorkommen. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform hat das erfindungsgemäß Peptid die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder eine Untersequenz davon, die die 5 C-terminalen Aminosäurerest einschließt.
Die Verwendung von nicht-natürlich vorkommenden Aminosäureresten in der Sequenz des erfindungsgemäßen Peptids hat den Vorteil, daß das Peptid relativ resistent gegenüber einem in vivo-Abbau durch Peptidasen ist. Dieser Effekt sollte die Produktion von stabilen Vakzinen, die die erfindungsgemäßen Peptide einbauen, ermöglichen, siehe Diskussion unten zu Vakzine.
Die erfindungsgemäß verwendeten Peptide können Teil eines größeren Polypeptidfragments bilden. Gemäß der Erfindung hat das Polypeptidfragment bevorzugt eine Länge von höchsten 60 Aminosäureresten, kürzere Polypeptidfragmente sind aber bevorzugt, da dieser einfacher und wirtschaftlicher zu synthetisieren sind und es bevorzugt wird, daß das erfindungsgemäße Polypeptidfragment ein synthetisch hergestelltes Polypeptidfragment ist.
Somit ist in den wichtigen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt, daß das Polypeptidfragment eine Länge von höchsten 50 Aminosäureresten, wie von höchstens 40, 35, 30, 25 und 20 Aminosäureresten hat. Es wird erwartet, daß Peptide mit einer Länge von zwischen 10 und 20 Aminosäureresten sich am wirksamsten als diagnostisches Werkzeug herausstellen und damit sind insbesondere bevorzugte Längen des Polypeptidfragments, wie es in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, 18, wie 15, 14, 13, 12 und selbst 11 Aminosäurerest. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Polypeptidfragment identisch zu den oben definierten Peptid, d. h. dem Polypeptidfragment wie es als Peptid ausführlich oben beschrieben ist.
Wie hierin diskutiert ist die immunologische Sensitivität zum Nachweis der Lyme-Borreliose (oder genauer: einem Nachweis von Antikörpern gegen OspC) überraschend hoch, wenn ein C-terminales Fragment von OspC verwendet wird (im Vergleich zur Sensitivität von Gesamt-OspC). In den hierin offenbarten Experimenten wurde eine Sensitivität von 85% des Gesamt-OspC gezeigt, die OD-Titer in einem ELISA unter Verwendung der kurzen Peptide sind aber signifikant höher als die des rOspC-ELISA. Es wird daher erwartet, daß die immunologische Sensitivität des Assays, die die kurzen Peptide verwenden, erhöht werden kann durch Optimierung der Bedingungen des entsprechenden Assays und somit ist es bevorzugt, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine durchschnittliche immunologische Sensitivität im Nachweis von zufällig ausgewählten Antiseren von Patienten, die an dem frühen Stadium der Lyme-Borreliose leiden, mindestens 85% der ist, die mit rekombinanten Gesamt-OspC in einem ansonsten entsprechenden Assay erzielt wird. Es wird allerdings erwartet, daß selbst höhere Sensitivitäten erzielt werden können (siehe Diskussion über die Sensitivität und die Ausschlußwerte) und daher sind durchschnittliche immunologische Sensitivität von mindestens 90%, wie mindestens 95%, 98%, 100% und selbst von mindestens 105%, wie mindestens 110%, 120%, 150%, 175% und 200% erfindungsgemäß möglich.
Um die Immunerkennung zu verbessern, kann das in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete immunologische Mittel mindestens 2 Kopien des oben beschriebenen Peptids umfassen, da dann mehr Kopien des essentiellen Epitops für die Reaktion mit Immunglobulinen zur Verfügung steht. Der Einbau von mehr als einer Kopie des Peptids kann in einer Vielzahl von Wegen, wie sie allgemein bekannt sind, erzielt werden. Z. B. kann das immunologische Mittel ein "Rückgrad" (z. B. ein Polymer) enthalten, woran mehrere Kopien des erfindungsgemäßen Peptids (oder Polypeptidfragments) N-terminal gekoppelt sind, so daß eine große Zahl des essentiellen Epitops anwesend sind. Ein gleiches Ergebnis kann erzielt werden, indem das Polypeptidfragment sich zusammensetzt aus mindestens zwei aufeinanderfolgenden Kopien des erfindungsgemäßen Peptids oder das immunologische Agens kann einfach eine herkömmliche Trägersubstanz sein, die das Peptid bindet (oder Polypeptidfragment in unspezifischer Weise). Da aber gezeigt wurde (siehe Beispiel 3) daß die freie Carbonsäure-Gruppe der C-terminalen Aminosäure wesentlich für die immundiagnostischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Peptids ist, ist es bevorzugt diesen Teil des Peptids der Umgebung auszusetzen, indem der diagnostische Assay durchgeführt wird. Somit sollte der Träger normalerweise einer sein, der entweder das Polypeptidfragment N-terminal bindet oder mindestens eines, das die immunologischen Eigenschaften der C-terminalen Aminosäure des erfindungsgemäßen Peptids nicht verschlechtert.
In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden andere OspC-abstammende Epitope (d. h. Aminosäurebereiche von mindestens 5 Aminosäuren mit immunologischen Eigenschaften) in die Sequenz des erfindungsgemäßen Polypeptidfragment eingefügt. Dies erlaubt möglicherweise weitere immunologische Sensitivität.
In einer sehr wichtigen Ausführungsform verwendet das erfindungsgemäße Verfahren mehrere (mindestens 2) unterschiedliche immunologische Mittel, wobei sich die immunologischen Agenzien der Aminosäuresequenz des Polypeptidfragments unterscheiden, bevorzugt in der Aminosäuresequenz des Peptids. Das Prinzip dieser Ausführungsform ist die natürliche Variation in den C-terminalen Aminosäureresten, wie oben beschrieben. Es wird erwartet, daß ein Assay, der diese natürliche Variabilität berücksichtigt, indem er bekannte natürliche Varianten dieser Peptide (oder Analoga dieser bekannten Varianten) in das erfindungsgemäße immunologische Agens aufnimmt, höhere Sensitivität als die hierin dargestellten Assays aufzeigen wird, da Antikörper gegen diese phänotypischen Varianten des OspC mit großer Wahrscheinlichkeit mit dem (den) immunologischen Agens (Agenzien) interagiert.
Es ist eine bevorzugte Ausführungsform das Vorliegende Diagnoseverfahren mit anderen Diagnoseassays für Lyme-Borreliose zu kombinieren (d. h. Assays zur vorherigen Sensibilisierung mit Borrelia burgdorferi senso lato Antigenen), da, wie in den Beispielen gezeigt, die Gesamtsensitivität eines solchen kombinierten Assays bei den frühen Stadien der Lyme- Borreliose größer ist als ein einzelner Test für Flagellum-Antikörper. Es ist insbesondere bevorzugt, daß der Kombinationsassay einen Assay für das Vorkommen von Antikörpern gegen Flagellum vor Borrelia burgdorferi sensu lato umfaßt.
Es ist klar, daß das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren sowohl in vitro als auch in vivo durchgeführt werden kann. Im folgenden werden in vitro-Verfahren diskutiert:
Ein in vitro-Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens beruht entweder auf 1) dem Nachweis einer signifikanten immunologischen Reaktion zwischen Anti-OspC-Antikörpern und den immunologischen Agens oder 2) der Nachweis einer signifikant immunologischen Reaktion zwischen geprimten T-Zellen und dem immunologischen Agens. Im ersten Fall umfaßt der Immunassay im allgemeinen
- Immobilisieren der nachzuweisenden Immunoglobuline, Zugabe des immunologischen Agens und anschließend Nachweis des Bindungsgrads des immunologischen Agens an die Immunglobuline, gegebenenfalls indem das immunologische Agens markiert ist oder durch Zugabe einer markierten Substanz, wie ein markierter Antikörper, der spezifische das immunologische Agens erkennt.
- Immobilisieren des immunologischen Agens, Zugabe der Immunglobuline und anschließend Nachweis der an das immunologische Agens gebundene Menge von Immunglobulienen, gegebenenfalls durch Zugabe einer markierten Substanz, wie markierten Antikörpern, die spezifisch die Immunglobuline erkennen, oder
- Umsetzen der Immunglobuline und des immunologischen Agens, wobei keines der Reaktanten immobilisiert ist und anschließend Nachweis der Menge an Komplexen vom immunologischen Agens und Immunoglobulinen, gegebenenfalls indem das immunologische Agens markiert ist, oder durch Zugabe einer markierten Substanz, wie einen markierten Antikörper, der spezifisch das immunologische Agens erkennt.
Das Immobilisieren des immunologischen Agens kann entweder kovalent oder nicht-kovalent erfolgen und die nicht-kovalente Immobilisierung kann unspezifisch sein (2.8. unspezifische Bindung an eine Polystyroloberfläche z. B. einer Mikrotitervertiefung). Spezifische oder halbspezifische Bindung an einen festen oder halbfesten Träger, Support oder Oberfläche kann mit dem immunologischen Agens erzielt werden, das zusätzlich zu dem Polypeptidfragment, weiter einen Bereich (Teil) umfaßt, der kovalentes oder nicht-kovalentes Binden des Polypeptidfragments an einen festen oder halbfesten Träger, Suppert oder Oberfläche erlaubt. Insbesondere kann nicht- kovalente Bindung an den Träger, Support oder Oberfläche erzielt werden, indem dieser Bereich eine Affinität zu einer Komponente, die an einen Träger, Support oder Oberfläche angeheftet ist, erzielt werden. In diesem Falle kann der Teil ein Biotin oder eine Biotinyl-Gruppe oder ein Analog davon an eine Aminosäure-Gruppe des Polypeptidfragments, wie 6-Aminohexansäure, gebunden sein und die Komponente ist dann Avidin, Streptavidin oder ein Analog davon. Eine Alternative ist eine Situation, wo der Teil die Aminosäuresequenz His-His-His-His-His-His aufweist und wo der Träger ein Nitrilotriessigsäure-Derivat (NTA), geladen mit Ni&spplus;&spplus;-Ionen, umfaßt.
Die Protokolle für Immunoassays, die Antigene zum Nachweis von spezifischen Antikörpern verwenden, sind allgemein bekannt. Gemäß der Erfindung können das Peptid, Polypeptidfragment oder immunologische Agens in Sandwich-Assays zum Nachweis von Lyme-Borreliose in Patienten oder in bekannten Modifikationen und Variationen von Sandwich-Assayprotokollen verwendet werden. Alternativ können die Antikörper und Antigen-bindenden Fragmente davon in verschiedenen kompetitiven Assayarten, wie sie allgemein bekannt sind, verwendet werden. Grundlage dieser Assayprotokolle sind dargelegt in Current Protocols in Immunology (1995). Wenn es zur Diagnose der Lyme-Borreliose verwendet wird, ist es bevorzugt einen Festphasen-Assap zu verwenden.
Somit ist es bevorzugt, daß das erfindungsgemäße Verfahren eines ist, wobei das immunologische Agens an eine feste oder halbfeste Oberfläche oder Träger durch kovalente oder nicht-kovalente Bindung immobilisiert ist, entweder vor oder nach der Zugabe der Immunglobuline. In diesem Zusammenhang wird daran erinnert, daß sie der Immobilisierung die Carbonsäure- Gruppe der C-terminalen Aminosäure in dem erfindungsgemäßen Peptid, das Teil des immunologischen Agens darstellt, freigelassen wird, siehe obige Diskussion.
Vorrichtungen zur Durchführung der spezifischen Bindungsassys, insbesondere Immunoassays, sind bekannt und können einfach angepaßt werden an die Verwendung der vorliegenden Peptide zum Nachweis von Anti-Borrelia- Antikörper. Festphasenassays sind im allgemeinen einfacher durchzuführen als heterogene Assayverfahren, wie Präzipitations-Assays, da die Trennung der Reagenzien einfacher und schneller geht. Festphasenassay-Vorrichtungen schließen Mikrotiterplatten, Durchfluß-Assayvorrichtungen, Eintauch- und immunkapillare oder immunchromatographische Immunoassay-Vorrichtungen ein.
Somit kann die feste oder halbfeste Oberfläche oder Träger erfindungsgemäß der Boden oder die Wand einer Mikrotitervertiefung sein; eine Filteroberfläche; eine Hohlfaser; ein kugelförmiges chromatographisches Medium ausgewählt aus Agarose oder Polyacrylamidgel; ein magnetisches Kügelchen; eine fasrige Cellulosematrix; eine HPLC-Matrix; eine FPLC- Matrix; eine Substanz mit Molekülen, so daß die Größe der Moleküle mit dem daran gebundenen immunologischen Agens durch Filter zurückgehalten werden kann, wenn diese Moleküle in einer flüssigen Phase gelöst oder dispergiert sind; eine Substanz, die in der Lage ist Micellen zu bilden oder an der Bildung von Micellen teilnehmen kann, so daß dies erlaubt eine Flüssigphase auszutauschen oder zu ersetzen ohne Mitnehmen der Micellen; ein wasserlösliches Polymer oder irgendein anderer geeigneter Träger, Support oder Oberfläche.
In einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann das immunologische Agens mit einem geeigneten Marker, der den Nachweis ermöglicht, bereitgestellt werden. Es ist ebenfalls möglich, daß der Nachweis durchgeführt wird unter Verwendung einer Substanz, die eine Affinität für das homologische Agens oder für die betroffenen Immunglobuline aufweist, solch eine Substanz (üblicherweise ein Antikörper) kann ebenfalls mit einem geeigneten Marker bereitgestellt werden. Solch ein Marker kann z. B. ein radioaktiver, ein enzymatischer, ein Fluoreszenz- und irgendein anderer nachweisbarer Marker sein, wie ein Avidin/Biotin-System.
Genauer können eine Vielzahl von geeigneten Indikatormöglichkeiten, wie sie allgemein bekannt sind, verwendet werden, einschließlich radioaktiver, enzymatischer oder anderer Liganden wie Avidin/Biotin, die in der Lage sind ein nachweisbares Signal zu geben. In bevorzugten diagnostischen Ausführungsformen ist es wünschenswert, ein angehängtes Enzym zu verwenden, wie alkalische Phosphatase oder Peroxidase anstelle von Radioaktivität oder anderen umwelttechnisch nicht gewünschten Reagenzien. Im Falle von angehängten Enzym sind kolorimetrische Indikatorsubstrate bekannt, die verwendet werden können, um eine Möglichkeit bereitzustellen, die es dem menschlichen Auge oder spektrophotometrisch ermöglicht spezifische Hybridisierung zwischen der pathogene Nukleinsäure enthaltende Probe zur Identifikation sichtbar zu machen. Lumineszierende Substrate, die Licht nach enzymatischem Abbau abgeben, können ebenfalls verwendet werden und können eine erhöhte Sensitivität bereitstellen.
Es wird bevorzugt, daß der Nachweis des Umfangs der immunologischen Reaktivität in dem erfindungsgemäßen Verfahren mit Hilfe eines Immunoassays ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem direkten oder indirektem EIA wie ELISA, einer Immunoblot-Technik wie Western-Blot (siehe das Experiment wie in Beispiel 4 beschrieben), einen RIA und andere nicht-enzymatisch verknüpfte Antikörper-Bindungsassays oder Verfahren wie Fluoreszenz, Agglutinierung oder Präzipitationsreaktion und Nephelometrie, geschieht.
Da eine Infektion mit Borrelia burgdorferi sensu lato anscheinend keine signifikante Anti-OspC-IgG-Antwort bei Menschen hervorruft, ist es bevorzugt, daß die erfindungsgemäß nachgewiesenen Immunglobuline IgM, IgE, IgD oder IgA sind. IgM-Antikörper sind insbesondere bevorzugt, da diese für eine ablaufende oder eine kürzliche Infektion indikativ sind. Dies würde daher z. B. IgG-sensitive Assays auf Flagellum ergänzen, da eine positive Antwort in solch einem Test indikativ für sowohl eine fortschreitende, kürzliche als auch vorherige Infektion sein kann.
Obwohl die vorliegenden Beispiele nur die Wirksamkeit der C-terminalen Peptide bei der Diagnose einer humoralen Immunantwort aufzeigen, wird erwartet, daß auch die zellvermittelte Immunantwort nachgewiesen werden kann, da das wesentliche Epitop mit großer Wahrscheinlichkeit linear ist, und da T-Zell-Epitope immer linear sind. Somit wird erwartet, daß das wesentliche Epitop im C-Terminus auch als T-Zell-Epitop funktioniert.
Es wird daher angenommen, daß es ebenfalls möglich ist, die immunologische Reaktivität zwischen geprimten T-Zellen und dem immunologischen Agens gemäß der Erfindung zu bestimmen. Dieses kann in vitro durch Inkubieren der T-Zellen, isoliert aus dem Objekt, mit dem immunologischen Agens geschehen und dem anschließenden Messen der Immunreaktivität z. B. durch Messen der darauffolgenden T-Zell-Proliferation oder durch Messen der Freisetzung von Cytokinen durch die T-Zellen, wie IFN-γ; diese Modelle sind allgemein bekannt, z. B. offenbart in EP-A-706571.
Wenn das erfindungsgemäße Verfahren in vivo durchgeführt wird, ist es wünschenswert, dieses in Form eines Hauttest zu tun, d. h. durch intradermale Injektion eines immunologischen Agens oder eines Polypeptidfragments, wie sie oben beschrieben sind, in das Objekt, eine positive Hautantwort am Ort der Injektion ist indikativ, daß die Person Lyme-Borreliose hat und/oder hatte und eine negative Hautantwort am Ort der Injektion ist indikativ, daß die Person keine Lyme-Borreliose hat/hatte. Somit beruht die in vivo-Version des erfindungsgemäßen Verfahrens auf den Nachweis einer T-Zellantwort im Objekt.
Ein weiterer Teil der Erfindung betrifft das immunologische Agens, wie oben definiert, d. h. alle Überlegungen bezüglich des immunologischen Agens, wie es in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, trifft in gleicher Weise auf das erfindungsgemäße immunologische Agens zu. D. h. die gesamten Diskussionen, die das Polypeptidfragment und die Peptide im immunologischen Agens betreffen, genauso wie die Diskussion bezüglich der Art des immunologischen Agens im Hinblick auf die Marker und Koppeln an den Träger usw. sind ebenfalls für das erfindungsgemäße immunologische Agens relevant.
In gleicher Weise richtet sich ein Teil der Erfindung auf ein Polypeptidfragment, wie es oben diskutiert wurde und entsprechend gelten alle Überlegungen bezüglich des Polypeptidfragments, wie sie beim erfindungsgemäßen Verfahren gemacht wurden, ebenfalls für das erfindungsgemäße Polypeptidfragment.
Entsprechend ist ein vierter Teil der Erfindung ein Peptid wie es im Zusammenhang mit einem erfindungsgemäßen Verfahren definiert ist und hierauf treffen ebenfalls alle Überlegungen, Definitionen usw., wie sie zum Peptid des erfindungsgemäßen Verfahren gemacht wurden, in gleicher Weise auf das erfindungsgemäße Peptid zu.
Im Einklang mit dem obigen betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung dieses erfindungsgemäßen immunologischen Agens, des Polypeptidfragments gemäß der Erfindung und des erfindungsgemäßen Peptids zur in vivo-Diagnose, genauso wie zur Verwendung zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung/Agens für die spezifische in vivo-Diagnose einer vorherigen Sensibilisierung eines Objekts mit OspC aus Borrelia burgdorferi sensu lato.
Alle Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen immunologischen Agens, erfindungsgemäßen Polypeptidfragments und erfindungsgemäßen Peptids werden durch diese Erfindung eingeschlossen. Das Peptid und Polypeptidfragment können beide entweder durch chemische Synthese (durch Fest- oder Flüssigphasen-Synthese) oder durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden.
Grundsätzlich können das Peptid und/oder Polypeptidfragment unter Verwendung irgendeines Verfahrens zur Festphasen- oder Flüssigphasen- Peptidsynthese, wie sie allgemein bekannt sind, synthetisiert werden, z. B. durch das Festphasenverfahren von Merrifield (Merrifield (1969)y oder durch das modifizierte Festphasenverfahren von Sheppard and Atherton (WO 86/03494), beide gibt es automatisiert. Jedenfalls kann ein allgemein bekanntes Verfahren der Flüssigphasensynthese nützlich sein, Festphasensynthese ist aber bevorzugt.
Wenn das Peptid oder Polypeptidfragment mittels rekombinanter Technologie hergestellt wird, umfaßt das Verfahren das Einfügen eines Nukleinsäurefragments, codierend für das Polypeptidfragment oder das Peptid (gegebenenfalls gekoppelt an ein Nukleinsäurefragment, das einen geeigneten Fusionspartner codiert) in einen Vektor, der in einer Wirtszelle sich vermehren kann, Einführen des erhaltenen rekombinanten Vektors in die Wirtszelle, Kultivieren der Wirtszelle in einem geeigneten Kulturmedium unter entsprechenden Bedingungen, so daß das Polypeptidfragment oder Peptid (und der optionale Fusionspartner) exprimiert wird und Gewinnen des Polypeptidfragments oder Peptids zusammen mit optionalen Fusionspartner aus der Wirtszelle oder dem Kulturmedium, gegebenenfalls Abtrennen des optionalen Fusionspartners von dem Polypeptidfragment oder Peptid und Isolieren und/oder Aufreinigen des so hergestellten Polypeptidfragments oder Peptids.
Wenn das immunologische Agens hergestellt wird, werden die Verfahren zur Herstellung des Polypeptidfragments oder des Peptids mit einem Schritt verbunden, worin das Polypeptidfragment oder Peptid gekoppelt oder vermischt wird mit einem Teil oder Marker, wie oben diskutiert.
Alle Herstellungsverfahren werden kombiniert mit einem Schritt wo das Produkt zumindestens teilweise aufgereinigt oder isoliert wird.
Dis ausgewählte Vorrichtung und die Reagenzien zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können verpackt in Form eines gebrauchsfertigen Kits vorliegen. Z. B. kann solch ein Kit eine entsprechende Assay- Vorrichtung, Beschichtungsreagenzien, Reagenzien zur Entwicklung des Assays wie Puffer und Reagenzien zum Nachweis der ausgewählten Markers enthalten. Solch ein Kit ist natürlich bei der Reduktion des Risikos der Entwicklung von zweiten und dritten Stadien Lyme-Borreliose hilfreich, da die Behandlung dieser Infektion sofort begonnen werden kann, nachdem sie diagnostiziert wurde. Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit, umfassend in einer Verpackung ein immunologisches Agens gemäß der Erfindung, zusammen mit Mittel die den Nachweis einer spezifischen Bindung zwischen dem immunologischen Agens und Immunglobuline, die spezifisch mit OspC-Protein reagieren.
Die folgenden experimentellen nicht-begrenzenden Beispiele sollen bestimmte Merkmale und Ausführungsformen der Erfindungen besser darstellen.
Materialien und Verfahren die in den Beispielen verwendet werden
Synthese von immunologischen Agens, enthaltend C-terminal abstammende Peptide
Das antigene "Modell" Peptid hat die Aminosäuresequenz: NH&sub2;-Pro-Val- Val-Ala-Glu-Ser-Pro-Lys-Lys-Pro-COOH (SEQ ID NO: 1). Dieses Peptid stellt den Ausgangspunkt zur Synthese einer ganzen Anzahl von Varianten dar, siehe unten.
Wenn es direkt in einem ELISA verwendet wurde, wurde das "Modell"- Peptid und bestimmte Varianten an ein 6-Aminohexansäure-Rest am Endterminus gekoppelt. Dieser Rest dient als Verbindungsstück zwischen dem Träger und dem Peptid. Ohne in irgendeiner Weise auf irgendein bestimmtes Verfahren beschränkt zu sein, mit dem die Erfindung durchgeführt werden kann, nehmen die Anmelder an, daß durch Bereitstellung eines solchen Verbindungsstücks die negativen Wirkungen der Bindung an die ELISA-Platte auf die Konformation des Peptids reduziert werden kann, so daß es ermöglicht, daß das Peptid eine Konformation einnehmen kann, die besser dem natürlichen vorkommenden Epitop des OspC-Proteins entspricht.
In den vorliegenden Beispielen wurden synthetische Peptide mit Hilfe einer automatisierten Festphasensynthese synthetisiert, gefolgt Aufreinigen mittels HPLC und Sequenzbestätigung mittels Massenspektroskopie. Genauer wurde die Präparation der Peptide wie folgt durchgeführt:
Festphasenpeptidsynthese wurde durchgeführt mit Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) Strategie durch Verwendung von Mehrfachsäulen-Peptidsynthese, wie bereits in Holm (1989) und Meldal (1993) beschrieben. Alle Peptide wurden mit Fmoc Aminosäuren synthetisiert (MilliGen und Calbiochem- Novablochem) unter Verwendung von TBTU (O-(¹H-Benzotriazol-1-yk)-1,1,3,3- tetramethyluroniumtetrafluoroborat) und HOBt (N-Hydroxybenzotriazol) als Kopplungsmittel. Asn (MilliGen) wurde mit Trityl-verwendet, Lys (MilliGen) mit tBoc- (tert-Butyloxycarbonyl), Glu und Ser (MilliGen) mit tBu- (tert- Butyl) und Arg (MilliGen) mit Pmc- (2,2,5,7,8-Pentamethylenchroman-6- sulfonyl) Seitenkettenschutz. Die folgenden Nicht-Proteinaminosäuren wurden in der gleichen Weise gekoppelt: N-α-Fmoc-N-β-Boc-L-Diaminopropionsäure, Fmco-O-t-Butyl-L-hydroxyprolin, Fmoc-L-Indolin-2-carbonsäure, N-α-Fmoc-N-α- Boc-Diaminoessigsäure, N-α-Fmoc-N-γ-Boc-L-Diaminobuttersäure, Fmoc-1,2,3,4- L-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure, Fmoc-L-Thiazolidin-4-carbonsäure (Neosystems Laboratoire, Straßburg, Frankreich), Fmoc-Homopro-OH (Bachem Feinchemikalien AG, Deutschland), Fmoc-L-Orn(Boc)-OH (Novablochem), Fmoc-D- Arg(Pmc)-OH, Fmoc-D-Lys(Boc)-OH und Fmoc-D-Pro-OH (Novablochem).
0,4 M Lösungen (DMF (Dimethylformamid) der Aminosäuren (3-facher Überschuß) enthalten äquivalente Mengen an TBTU und HOBt und 1,5 Äquivalente DIEA (D üsopropylethylamin) (Aldrich) wurden für die Kopplung verwendet. Ein säurelabiles H-Pro-2-ClTrt-Harz (Novablochem; s = 0,8 mmol/g)) wurden zur Herstellung von C-terminalen Prolin-enthaltenden Peptidcarboxylaten verwendet. Für Peptidcarboxamide wurde ein PepSyn K-Harz (Novablochem) ausgerüstet mit einem AM-Linker (Novobiochem) verwendet (s Å 0,1 mmol/g). DMF wurde vor Verwendung auf einer Kationenaustauschsäule gepackt mit Lewatit S 100 MB/H (Bayer AG Leverkusen, Deutschland) aufgereinigt. Biotinylierte 6-Amino-hexan-Peptide wurden nach dem Anordnen der Peptidkette und der Fmoc-Entschützung unter Verwendung von TBTU und HOBt als Kopplungsmittel hergestellt.
Die angeordneten Peptide wurden vom Harz mit TFA (Trifluoressigsäure)-H&sub2;O-Thioanisol (90 : 5 : 5, V/V/V) bei Raumtemperatur für 2 h abgespalten und dann mit TFA-H&sub2;O (95 : 5, v/V) gewaschen. Die vereinigten TFA- Waschungen wurden im Vakuum einkonzentriert und das Peptid wurde präzipitiert und mit Ether gewaschen, getrocknet und aus Wasser lyophilisiert mit Ausnahme der 4-6 mer-Peptide, diese wurden nach Einkonzentration der vereinigten TFA-Waschungen aus Wasser lyophilisiert und mit Ether gewaschen. HPLC (Hochleistungsflüssigchromatographie) wurde mit einem Waters Millenium HPLC-System mit einer C18 Umkehrphasensäule durchgeführt (Waters Rad-Pak Delta-Pack C18, 15 mm, 100 Å, 8 mm · 100 mm; Flußrate 1,5 ml/min zur analytischen Auftrennung), Puffer A (0,1% TFA) und Puffer B (0,1% TFA und 10% Wasser in Acetonitril) und Aminosäureanalysen wurden mit einem Waters PICOTAG-System durchgeführt. Alle Verbindungen waren größer als ca. 90% rein gemäß den Analysen. Die Identität von allen Peptiden wurden bestätigt mittels MALDI TOF (matrix assisted laser desorption iniozation time of flight) Massenspektroskopie mit einem Fisons TofSpec E-Instrument. Für den ELISA wurden die Konzentration der Peptidproben bestimmt mittels Aminosäureanalyse durchgeführt mit dem PICOTAG- System (Waters).

Herstellung von rOspCfl und rOspCt

Die verwendeten rOspCfl-Proteine stammen vom Stamm DK7 von Borrelia burgdorferi sensu stricto (mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 5, codiert durch die SEQ ID NO: 4), Stamm Dk6 von Borrelia garnin ü (mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 und Codiert durch SEQ ID NO: 2) und Stamm DK26 von Borrelia afzelii (mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 7, codiert durch SEQ ID NO: 6). Das rOspCfl-Protein wurde wie folgt hergestellt:
Die OspC-Gene, die die oben dargestellten OspCfl-Sequenzen codieren, wurden aus der genomischen DNA unter Verwendung von Standard-PCR- Bedingungen und drei Primer-Paaren, spezifisch für entweder B. garin ü DK6: BF22 (5'-ATA GAT ATC AAT AAT TCA GGT GGG GAT TC-3' [SEQ ID NO: 8]) und BF65 (5'-TTT GAT ATC TCA AGG TTT TTT TGG ACT TTC TGC-3' [SEQ ID NO: 9]); B. burgdorferi sensu stricto DK7: BF26 (5-ATA GAT ATC AAT AAT TCA GGA AAA GAT GGG AAT AC-3' [SEQ. ID NO: 10]) und BF65; oder B. afzelii DK26: BF24 (5'-ATA GAT ATC AAT AAT TCA GGG AAA GGT GGG G-3' [SEQ ID NO: 11]) und BF62 amplifiziert. Alle Primer enthalten nicht-homologe Sequenzen, um anschließendes Klonieren der PCR-Produkte zu erleichtern. Die Gene wurden in pMST24 kloniert, um die Plasmide pBF144, pBF147 und pBF145 zu erhalten.
pMST24 ist ein Expressionsplasmid, das einmalige Restriktionsstellen enthält, dies erlaubt die Konstruktion von Fusionen in diese Rahmen mit künstlicher Leaderpeptiden zusammengesetzt aus einem Bereich von sechs His- Resten, gefolgt von einer Rinderfaktor Xa-Schnittstelle. Die mRNA für das entsprechende Peptid wird von einer Plasmid-codierten Translationsstartstelle translatiert und durch den Tac-Promotor kontrolliert. Das Plasmid codiert ebenfalls den lac-Repressor, um eine gute Kontrolle der Genexpression herzustellen.
Die Proteinproduktion wurde induziert durch Zugabe von 2 mM IPTG zu einer Kultur in der späten 10 g-Phase von XLlblue die entweder pBF144, pBF147 oder pBF145 enthielten.
Sechs aufeinanderfolgende Histidinreste (6 · His) zu selektiven Bindung an Ni²&spplus; erlauben die Aufreinigung der Fusionsproteine durch Metallchelat-Affinitätschromatographie. Die Fusionsproteine wurden auf einer Ni²&spplus;-IDA (Iminodiessigsäure-Epoxy-aktivierte Sepharose 6B fast flow (Sigma Chemical Co., Lt. Lois, Mo.))-Säule wie ausführlich im QlAexpressionist, Protokoll 5, Seiten 42-43 beschrieben, aufgereinigt. Zu den aus der Kultur geernteten Zellen wurden vor Ultraschallbehandlung Enzymhemmer zugegeben (Pepstatin (1 ug/ml), PMSF (100 ug/ml), Aprotinin (1 ug/ml) und TLCK (50 ug/ml)), genauso wie notwendige Puffer zur Aufreinigung.
Das OspCt wurde durch ein identisches Verfahren hergestellt, dem aufgereinigten Produkt fehlen aber die sieben C-terminalen Aminosäuren. Die verwendeten Primer waren die folgenden: Für B. garinii DK6: BF22 und BF23 (5'-TTT GAT ATC TCA CAC AAC AGG ATT TGT AAC CTC TTT AAC-3' [SEQ ID NO: 12]); für B. burgdorferi sensu stricto DK7: BF26 und BF27 (TTT GAT ATC TCA CAC AAC AGA CTG TAA GCT CTT AAC TGA AT-3' [SEQ ID NO: 12]) und für B. afzel ü DK26: BF24 und BF25 (5-'TTT GAT ATC TCA TAC AAC AGG ACT TGT AAG TTC TTT AAC TGA-3' [SEQ ID NO: 14]).
Indirekter ELISA für IgM-Antikörper für Gesamtlängen und verkürztes rekombinantes OspC (rOspC-ELISA)
Flachboden-Mikrotiterplatten (Maxisorb; Nung, Roskilde, Dänemark) wurden mit 100 ul rOspC verdünnt in 0,05 M Bicarbonat pH 9,6 für 1 Stunde bei 20ºC auf einem Schüttler und anschließend über Nacht bei 4ºC beschichtet. Die optimale Beschichtungskonzentration wurde definiert als die Antigenverdünnung, die zu dem höchsten Verhältnis der optischen Dichte (OD) zwischen einem positiven und einem negativem Kontrollserum führte (P/N- Verhältnis). Die Platten wurden viermal für eine Minute mit PBS, enthaltend 0,5 M NaCl und 0,1% (V/V) Tween 20 (pH 7,2) gewaschen und unspezifische Proteinbindung wurde mit 100 ul 3% (G/V) Milchpulver in PBS für eine Stunde blockiert. Die Platten wurden viermal à eine Minute mit PBS, enthaltend 0,5 M NaCl und 0,1% (V/V) Tween 20 (pH 7,2) gewaschen. 100 ul Serum verdünnt 1 : 200 in PBS, enthaltend 0,1% (V/V) Tween 20, 0,02% NaN&sub3; und 1% (G/V) Milchpulver wurden an die Vertiefungen gegeben und für 2 h bei 20ºC inkubiert. Die Platten wurden dann 4-mal für eine Minute mit PBS, enthaltend 0,5 M NaCl und 0,1% (V/V) Tween 20 (pH 7,2) gewaschen und 100 ul Peroxidase konjugiertes Kaninchen-anti-Human-Immunglobulin M (IgM) (Dakopats, Kopenhagen, Dänemark, Code P-215) verdünnt 1 : 1000 in PBS pH 7,4 mit 0,05% (V/V) Tween 20 und 1% (G/V) Milchpulver zugegeben. Nach Inkubation für 1 h bei 20ºC wurden die Platten viermal für eine Minute mit PBSenthaltend 0,5 M NaCl und 0,1% (V/V) Tween 20 (pH 7,2) gewaschen und 200 ul des Substrat o-Phenylendiamin (0,4 mg/ml; Sigma) in Citratpuffer (pH 5) mit 0,04% (V/V) H&sub2;O&sub2;) wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Nach 15 Minuten unter Lichtausschluß wurde die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 50 ul 3M H&sub2;SO&sub4; gestoppt. Die optische Dichte (OD) wurde bei 492 nm spektrophotometrisch ausgewiesen (Immuno Reader, Easy reader EAR 400 AC - SLT Labinstruments, Österreich). Die Proben wurden 2-fach getestet und dieses wurde wiederholt wenn die zwei OD-Werte mehr als 10% vom Durchschnitt abweichen. Um Platten-zu-Platten- und Tag-zu-Tag- Variationen zu eliminieren, wurde ein Referenzserumpool, basierend auf sieben positive Western-Blot-Seren in jeder Platte mit einer zweifachen Verdünnung von 1 : 200 bis 1 : 6400 eingeschlossen, um eine Standardverdünnungskurve herzustellen. Die OD-Werte von jeder Probe wurden auf diese Standardkurve hin eingestellt. Positive und negative Kontrollseren wurden bei jeder Platte mitgemacht. Das positive Kontrollserum von 1 : 200, 1 : 400 und 1 : 800 auf jeder Platte verdünnt, um Parallelen zwischen der Standardreferenzkurve und der Verdünnungskurve des positiven Kontrollserums zu überprüfen.
Die Gesamtassaygenauigkeit des rOspC-ELISA wurde bestimmt durch Testen der positiven Kontrollseren in 20 unabhängigen Assays. Die Untersuchung eines positiven Kontrollserums, das dreimal verdünnt wurde zeigte durchschnittliche OD-Werte für die Verdünnung von 1 : 200 von 1,829, Standardabweichung (SD) 0,148 und einen Variationskoeffizienten (CV) von 10%; durchschnittliche OD-Werte für die Verdünnung 1 : 400 war 0,965 mit SD 0,101 und CV 15%; durchschnittliche OD-Werte für die Verdünnung 1 : 800 war 0,502 mit SD 0,053 und CV 11%.
Die diagnostische Ausschluß-OD wurde eingestellt auf 98% spezifisch für ein IgM-Assay auf einer Basis von Serumproben von 100 gesunden dänischen Blutspendern und diese war 0,230 für den IgM-Assay.

Indirekter Streptavidin-ELISA für IgM-Antikörper gegen Carboxyterminales OspC-Deca-Peptid (Peptid-ELISA)

Flachboden-Mikrotiterplatten (Maxisorb); Nung, Roskilde, Dänemark) Wurden mit 100 ul Streptavidin (ZYMED, S. Avidinii) 2,5 ug/ml in Citratpuffer (pH 5) beschichtet und über nacht bei 4ºC inkubiert. Die Platten wurden 4-mal für eine Minute mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 0,5 M NaCl und 0,1% (V/V) Tween 20 (pH 7,2) gewaschen, 100 ul des biotynilierten synthetischen Peptids
6-Aminohexansäure-Pro-Val-Val-Ala-Glu-Ser-Pro-Lys-Lys-Pro (SEQ ID NO: 40)
(vorverdünnt in PBS, enthaltend 0,37 M NaCl, 0,5% (V/V) Tween 20 und 1% (G/V) Milchpulver (pH 7,0)) wurden zu den Vertiefungen gegeben und die Platten wurden über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Platten wurden anschließend viermal für eine Minuten mit PBS, enthaltend 0,5 M NaCl und 0,1% (V/V) Tween 20 (pH 7,2) gewaschen und 100 ul des Teststerums, verdünnt 1 : 200 in PBS, enthaltend 0,7 M NaCl, 0,1% (V/V) Tween 20 und 1% (G/V) Milchpulver (pH 7,2)) wurden zu den Vertiefungen gegeben und für 2 Stunden bei 20ºC auf einem Schüttler inkubiert. Die Platte wurden viermal für eine Minute mit PBS, enthaltend 0,5 M NaCl und 0,1% (V/V) Tween 20 (pH 7,2) gewaschen und 100 ul Peroxidase konjugiertes Kaninchen-anti-Human- IgM (Code P215; Dako-patts, Kopenhagen, Dänemark) verdünnt 1 : 1000 in PBS, enthaltend 0,5% Tween 20 und 1% Milchpuler (pH 7,4) wurden zu den Vertiefungen gegeben und für 1 h bei 20ºC inkubiert. Die Platten wurden viermal à eine Minute mit PBS, enthaltend 0,5 M NaCl und 0,1% (V/V) Tween 20 (pH 7,2) gewaschen und 200 ul Substrat o-Phenylendiamin (0,33 mg/ml; Kem- En-Tec, Dänemark, Tabletten von 10 mg) in Citratpuffer (pH 5) mit 0,04% (V/V) H&sub2;O&sub2; wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Nach 15 Minuten lichtgeschützt wurde die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 50 ul 3 M H&sub2;SO&sub4; gestoppt. Die optische Dichte (OD) wurde bei 492 nm spektroskopisch auf einem Immuno Reader, Easy reader EAR 400 AC, SLT Labinstruments, Österreich ausgelesen. Die Proben wurden 2-fach getestet und dieses wurde wiederholt wenn die zwei OD-Werte sich mehr als 10% vom Durchschnitt unterschieden. Um Platten-zu-Platten- und Tag-zu-Tag-Variationen zu eliminieren, wurde ein Referenzserumpool, basierend auf sieben positive Western-Blot-Seren in jeder Platte mit einer zweifachen Verdünnung von 1 : 200 bis 1 : 6400 eingeschlossen, um eine Standardverdünnungskurve herzustellen. Die OD-Werte von jeder Probe wurden auf dieser Standardkurve hin eingestellt. Positive und negative Kontrollseren wurden bei jeder Platte mitgemacht. Das positive Kontrollserum von 1 : 200, 1 : 400 und 1 : 800 auf jeder Platte verdünnt, um Parallelen zwischen der Standardreferenzkurve und der Verdünnungskurve des positiven Kontrollserums zu überprüfen.
Die diagnostische Ausschluß-OD wurde auf 98% spezifische IgM auf Basis der Serumproben von gesunden dänischen Spendern eingestellt und war 0,450 für IgM-Assay.

Beispiel 1

Immunologische Reaktivität von Gesamtlängen und verkürztes rOspC (rOspCfl und rOspCt) mit Antiseren von Patienten die an Lyme-Borreliose leiden

In einem ersten Aufbau wurde rOspCt in dem oben beschriebenen rOspC- ELISA verwendet. Seren von 47 Patienten mit EM, 50 mit NB, 30 mit ACA und 29 mit Syphilis wurden gegen rOspCt getestet.

Serumproben der Patienten

Auswahl 1 besteht aus Seren von 117 Patienten mit klinischen Symptomen von definierter aktiver und unbehandelter LB:

(i) Die Seren von 47 Patienten mit Erythema Migrans (EM)

Die Diagnose wurde durch Kultivieren von Hautbiopsie bei 22 Patienten verifiziert und bei den verbleibenden 25 Fällen geschah die Diagnose aufgrund klinischer Beweise ohne vorherige serologische Tests. Diese Seren wurden 1989 bis 1992 gesammelt. Die durchschnittliche Krankheitsdauer war 3 Wochen und reichte von weniger als 1 Woche bis zu 1 Jahr.

(ii) Seren von 50 fortlaufenden Patienten mit Neuroborreliose (NB) 1991 gesammelt

Die Diagnose basierte auf klinische Beweise; alle außer zwei Patienten hatten lymphozytische Pleozytose im CSF; bei einem Patient wurde keine CSF-Cytologie durchgeführt und bei anderen wurde die CSF-Cytologie nach Antibiotikabehandlung durchgeführt; beide Patienten hatten eine bekannte Krankheitsgeschichte der klinischen Neuroborreliose und positive intrathekale Antikörpersynthese. Alle Patienten hatten B. burgdorferie- spezifische intrathekale Antikörpersynthese. Der durchschnittliche Krankheitsverlauf war 3 Wochen und reichte von 1 Woche bis 1 1/2 Jahre nach Beginn der neurologischen Symptome.

(iii) Seren von 20 Patienten mit Acrodermatitis chronica atrophicans (ACA) gesammelt von 1987 bis 1990

Die klinische Diagnose wurde bei jeden Patienten durch einen Dermatologen durchgeführt. Die Krankheitsdauer reichte von 8 Monaten bis 10 Jahre, durchschnittlich 4 Jahre.

Kontrollserumproben

(i) Seren von 29 Patienten mit früher Syphilis mit sehr hohen IgM- und/oder IgG-Antikörpermengen (OD > 1,5) im Reiter-treponemeflagellum-ELISA

Alle Seren waren positiv in WR, RPR und dem FTA-Absorptionstest.

(ii) 100 zufällig ausgewählte Seren von dänischen Spendern

Alle Seren wurden bei -20ºC gelagert.

Ergebnisse

In der Tabelle 1 sind die Ergebnisse des rOspC-ELISA durchgeführt mit der Serum-Auswahl 1 unter Verwendung von rOspCt aufgeführt. Die Ergebnisse sind von B. garinii rOspCt, ähnliche Ergebnisse wurden aber für die verkürzten Formen von den anderen beiden Borrelia-Stämmem erhalten, tatsächlich wurden keine Positiven gefunden, wenn B. afzelii-abstammendes rOspCt verwendet wurde. Tabelle 1
Wie man deutlich erkennen kann, ist die immunologische Reaktivität von rOspCt gering und entsprechend wurde geschlossen, daß die 7 C-terminalen Aminosäurereste des OspC bei der immunologischen Erkennung durch das humane Immunsystem für OspC wichtig sind. Daher wurde die immunologische Reaktivität des C-Terminus von OspC, genauso wie das Gesamtlängen rOspC (rOspCfl) weiteren Untersuchungen unterworfen, siehe nächstes Beispiel.

Beispiel 2

Die diagnostischen Leistungen eines Decapeptid-ELISA und eines rOspC (rOspCfl)-ELISA verglichen mit der diagnostischen Leistung eines kommerziell erhältlichen Flagellum-Assays
Die Kapazität eines immunologischen Agens gemäß der vorliegenden Erfindung mit Seren von Patienten verschiedener Stadien der Lyme- Borreliolse zu reagieren wurde bewertet gegenüber rekombinanten OspC von B. garinii und, gegen herkömmlichen Flagellum-ELISAs (durchgeführt wie in Hansen K., et al. (1991) und Handen K., et al. (1988) beschrieben). Die Flagellum-Assays (die auf IgM- und IgG-Antikörper gegenüber natives B. burgdorferi flagellum testen) sind kommerziell erhältlich, ein u-Capture- ELISA (DAKO, Dänemark Code K006) und ein inderekter IgG-ELISA (DAKO, Dänemark Code K416). Beide Assays nutzen vom Stamm DK1, der zu den Genospezien von B. azfelii gehört, aufgereinigte Flagellen. Die ELISAs wurden gemäß den Anleitungen der Hersteller durchgeführt und die Ergebnisse wurden ausgedrückt als optische Dichte (OD)-Werte. Bei beiden Assays war die diagnostische Ausschlußmenge so eingestellt, daß eine Spezifität von 98%, bezogen auf die Untersuchung von 100 Blutspendern war.
Obwohl nur Ergebnisse für Immunoassays unter Verwendung von rOspCfl von B. garinii hier dargestellt sind, zeigte sich fast identisches Bild bei der Verwendung von rOspCfl von B. burgdorferi sensu stricto und B. afzelii.

Serumproben von Patienten

Eine Gesamtzahl von 210 Serumproben von Patienten mit aktiver unbehandelter Lyme-Borreliose wurde bei den ELISAs getestet. Sie wurden in drei Gruppen gemäß dem klinischen Erscheinungsbild der Erkrankung unterteilt.

(i) Seren von 60 schwedischen Patienten und 20 dänischen Patienten mit Erythema Migrans (EM)

Die Diagnose von 60 schwedischen Patienten mit EM basierte auf klinische Beweise und wurde durch Eva Åsbrink (Department of Dermatology, Söderjukhuset, Stockholm, Schweden) gemacht und die Diagnose der 20 dänischen Patienten mit EM wurde durch Kultur nach Hautbiopsie verifiziert. Die Seren wurden im Zeitraum von 1984-1992 von Patienten (5 bis 83 Jahre alt (durchschnittliches Alter 53 Jahre)) gesammelt. Die Erkrankungsdauer reichte von einer halben Woche bis 26 Wochen (durchschnittliche Dauer 4 Wochen).

(ii) Seren von 101 dänischen Patienten mit Neuroborreliose (NB)

100 dänische Patienten mit NB wurde alle 1994 im Krankenhaus eingeliefert (58 männliche und 42 weibliche mit einem Alter von 4 bis 80 Jahren; durchschnittliches Alter 49). Die Diagnose basierte auf klinische Anzeichen, insbesondere der typischen schmerzvolle sensorischen Radikulitis und lymphozytischer Pleozytose in der Zerebralflüssigkeit (CSF). In vielen Fällen war die Spezifizität der klinischen Diagnose weiter gestärkt durch vorherige Beobachtung eines Zeckenbisses (31 Patienten) und vorheriger Erythema migrans (42 Patienten). Alle hatten lymphozytische Pleocytose im CSF mit Zahlen von 3 · 10&sup6; bis 1200 · 10&sup6; Zellen pro Liter (durchschnittliche Zellzahl 123 · 10&sup6; Zellen pro Liter). Alle Patienten hatten intrathekale B. burgdorferi-spezifische Antikörpersynthese. Die Dauer der Erkrankung, definiert als die Zeit nach Beginn der neurologischen Symptome bis eine Blutprobe genommen wurde, war im Bereich von 1 Woche bis 26 Wochen (durchschnittliche Dauer 3 Wochen).

(iii) Seren von 30 schwedischen Patienten mit ACA

Serum von 30 schwedischen Patienten mit Acrodermatitis atrophicans (ACA) zwischen 36 und 89 Jahren (Durchschnittsalter 61). Die Diagnose wurde in jedem Fall durch einen Dermatologen gestellt auf Basis des typischen klinischen Auftretens von ACA und einem hohen IgG-Titer gegen B. burgdorferi im Serum. Die Krankheitsdauer reichte von 1 bis 5 Jahren (Durchschnittsdauer 2 Jahre).

Kontrollseren

Seren von 150 gesunden Kontrollen wurden zur Bestimmung des 98%igen spezifischen Ausschlußniveaus im ELISA verwendet. Weiterhin wurden 30 Patienten mit früher Syphilis mit sehr hohen IgM- und IgG-Antikörpermengen (OD < 1,5) im Reiter-treponeme-flagellum-ELISA getestet. Alle Seren zeigten eine positive Wassermannreaktion, einen positiven schnellen Plasma- Reagintest und eine Reaktivität ≥ 3+ im Fluoreszenz-treponemalen Antikörper-Absorptionstest.

Ergebnisse

Vergleich des Peptid-ELISA mit der rOspCfl-ELISA

Die folgende Tabelle (Tabelle 2) zeigt die Häufigkeit (%) von positiven Lyme-Borreliose-Seren im frühen Stadium der Lyme-Borreliose, gefunden mit Hilfe des oben beschriebenen Peptid- bzw. rOspCfl-ELISAs. Tabelle 2
Zuerst kann festgestellt werden, daß die Verwendung von rOspCfl anstelle von rOspCt die immunologische Sensitivität des rekombinanten ELISA erhöht, somit wird auch der Verdacht bestätigt, daß der C-Terminus von OspC essentiell für die immunologische Erkennung von OspC durch den Menschen ist.
Fig. 1 und 2 vergleichen die individuellen Ergebnisse erhalten von Patienten mit Erythema Migrans (EM) und Neuroborelliose (NB) der ersten beiden Stadien der Lyme-Borreliose im Hinblick auf die quantitative Messung von IgM im Peptid-ELISA und dem rOspCfl-ELISA. Die horizontalen und vertikalen durchbrochenen Linien markieren die 98%-spezifische Diagnostikausschlußniveaus für den entsprechenden Peptid- und rOspC-ELISA (0,460 und 0,230). Wie man erkennen kann ist der OD-Titer wesentlich höher für den Peptid-ELISA. Dies wird auch aus den Fig. 3 und 4 deutlich, diese zeigen den Unterschied der logarithmischen OD-Werte der beiden Assays in den beiden Patientengruppen.
Es kann daraus geschlossen werden, daß mit diesem Aufbau die Sensitivität des Peptid-ELiSA ca. 86% des rOspCfl-ELISA im Nachweis der frühen Lyme-Borreliose (Stadium 1 und 2) war. Dies ist eine überraschend hohe Sensitivität wenn man bedenkt, daß die antigene Diversität im C-Terminus von OspC deutlich ist (eine Zahl von Serotypen sind bekannt, die z. B. andere Aminosäuren als Serin in der 6-Position von SEQ ID NO: 1 haben) und daß das Gesamtlängen-OspC eine wesentlich höhere Zahl von Epitopen umfaßt als das im vorliegenden Peptid-ELISA verwendete Decapeptid.
Weiterhin ist der OD-Ausschlußwert im Peptid-ELISA zur Zeit sehr hoch mit 0,460. Es wird daher angenommen, daß eine bessere Abstimmung des ELISAs im Hinblick auf die Konzentration der Reagenzien (insbesondere Streptavidin) zu einer Erniedrigung des Ausschlußwerts führt. Da weiterhin humane Antikörper gegen Avidin beschrieben wurden, ist es möglich, daß humane Antikörper mit Streptavidin reagieren und daher werden eine Änderung des Verbindungssystems oder ein effizientes Blocken des Streptavidins als Möglichkeiten untersucht. Weiterhin wird überlegt, die Auswahl an Seren von gesunden Blutspendern auszudehnen, um eine bessere statistische Basis für die Bewertung des Ausschlußwerts bereitzustellen; zur Zeit könnte es Individuen in der Spendergruppe geben, die mit OspC sensibilisiert sind und diese haben natürlich eine Wirkung auf die Bewertung des Aufschlußwerts, welcher dann höher ist als die Negativkontrollen, die tatsächlich negativ sind.
In den Fig. 5 und 6 sind schließlich ROC-Auftragungen dargestellt, die die Genauigkeit des Peptid-ELISA und des rOspCfl-ELISA bei Patienten, die an EM bzw. NB leiden, darstellt. Die ROC-Auftragung stellt einen reinen Genauigkeitsindex dar, in dem das gesamte Spektrum der Sensitivität/Spezifität- Paare für einen bestimmten Test graphisch aufgezeigt werden. Eine Entscheidungsschwelle muß bei einem Test ausgewählt werden, der in der Patientenbehandlung verwendet wird, es ist allerdings nicht notwendig eine bestimmte Entscheidungsschwelle zur Beurteilung der Genauigkeit auszuwählen. Der ROC-Graph ist eine Darstellung von allen Sensitivitäts/Spezifitätspaaren, die sich ergeben durch kontinuierliches Ändern der Entscheidungsschwelle über den gesamten beobachteten Ergebnisbereich. Auf der y-Achse ist die Sensitivität aufgetragen und auf der x-Achse die falschpositive Fraktion (oder 1-Spezifizität). Eine Auftragung die oberhalb liegt und die links von einer anderen Auftragung liegt, zeigt eine höhere beobachtet Genauigkeit an. Ein Review der Verwendung von ROC- Auftragungen sind in Zweig and Campbell (1993) dargestellt.
Das Ergebnis, wie es auch den Fig. 5 und 6 deutlich wird, ist das, daß der Peptid-ELISA genauer ist bei Patienten die an NB leiden, während das andere für den Fall von EM-Patienten gilt.
(Es wird angemerkt, daß ein ELISA unter Verwendung von einem direkten Beschichten der Mikrotiterplatten mit C-terminalen OspC-Fragmenten ebenfalls entwickelt wurde, wobei genau die gleichen Bedingungen wie für den rOspC-ELISA, wie er oben beschrieben ist, angewendet wurden einschließlich einer Beschichtungskonzentration des Peptidfragments von 0,4 ug/ml. Die Ergebnisse stimmten allerdings mit den oben berichteten Ergebnissen für dieses Beispiel überein, sie zeigten, daß die speziellen Bedingungen, wie sie in ELISA verwendet wurden, nicht entscheidend sind.)

Wirkung der Kombination eines Flagellum-Assays mit dem rOspC-ELISA und dem Peptid-ELISA

Aus den in der folgenden Tabelle (Tabelle 3) dargestellten Ergebnissen wird es deutlich, daß eine signifikante Patientenzahl entweder nur eine Anti-rOspC oder eine alleinige Anti-Flagellum-Antikörperantwort aufzeigt. Die Gesamtdiagnose-Sensitivität für IgM nahm um 15% zu wenn die rOspCfl-ELISA-Ergebnisse zu dem Flagellum-ELISA-Ergebnissen addiert wurden im ersten Stadium der Lyme-Borreliose (Etythema migrans, EM) und um 12% im zweiten Stadium der Lyme-Borreliose (Neuroborreliose, NB). Wenn die Peptid- ELISA-Ergebnisse zugenommen werden wurde die gesamte Sensitivität für IgM um 7,5% bzw. 12% in den ersten und zweiten Stadien erhöht. Tabelle 3 Vergleiche der IgM rOspCfl- und IgM-Decapeptid-ELISA-Ergebnisse mit dem IgM-Flagellum-ELLSA-Ergebnissen in frühen Stadien der Lyme-Borreliose
Im dritten Stadium der Lyme-Borreliose (ACA) war die Vorherrschaft von anti-OspC gering und fügte nichts signifikant der Gesamtsensitivität hinzu (Daten nicht gezeigt).
Schlußfolgerung: die kombinierte Verwendung eines rOspC-ELISA und des Flagellum-ELISA erhöht die gesamtdiagnostische Sensitivität der IgM-Serodiagnose der frühem Lyme-Borreliose. Dies stimmt ebenfalls für den Peptid- ELISA, obwohl im derzeitigen Aufbau in einem kleineren Bereich. Wie oben diskutiert, wird allerdings erwartet, daß der Peptid-ELISA noch besser eingestellt wird und somit zu einer höheren Sensitivität als der derzeitige führt.
Es wird angemerkt, daß ein Versuch die IgG-rOspC-ELISA-Ergebnisse zu den Ergebnissen eines kommerziell erhältlichen IgG-Flagellum-ELISA zu addieren keine signifikante Verbesserung ergab, möglicherweise aufgrund eines Fehlens der IgG, die mit OspC reaktiv sind.

Beispiel 3

Entwicklung und Test von Analoga des Decapeptids mit der SEQ ID NO: 1

Nachdem gezeigt wurde, daß ein kurzes OspC-abstammendes C-terminales Decapeptid ein essentielles Epitop umfaßt, ist es wichtig den Ort und die genaue Art des Epitops zu identifizieren. Daher wurden Experimente durchgeführt, worin die Fähigkeit einer Anzahl von Analoga des C-Terminus der SEQ ID NO: 3 getestet wurden, die Immunreaktivität zwischen rOspCfl und ausgewählten Antisera in einem ELISA zu hemmen. Genauer die Fähigkeit von verschiedenen Analoga, die Bindung von polyklonalen Antio-OspC-Antikörpern in Lösung zu hemmen wurde mit Seren von LB-Patienten auf rOspC-beschichteten ELISA-Platten untersucht.
Die Reaktivität gegenüber OspC wurde spezifiziert unter Verwendung von sechs zufällig ausgewählten NB-Seren mit einer OD > 1,5 IgM-rOspC-ELISA. Die entsprechenden Serumverdünnungen wurden bestimmt, basierend auf der Serumverdünnungskurve, erhalten, im IgM-rOspC-ELISA für jedes der sechs Seren. Die höchste Verdünnung, die noch einen maximalen OD-Wert ergab, wurde verwendet. 5 Seren wurden 1 : 200 verdünnt und ein Serum 1 : 1000. Die Seren wurden mit den im IgM rOspC-ELISA verwendeten Puffer verdünnt.
Die Affinität der OspC-Derivate wurde gemessen durch Inkubieren der jeweiligen sechs Seren mit den entsprechenden OspC-Derivaten bei 10 verschiedenen Verdünnungen (diese decken eine Zweifachbereich ab), über Nacht bei 4ºC. Der rOspC-ELISA wurde dann wie vorher beschrieben durchgeführt, um die Wirkung der IgM-Bindung auf OspC zu untersuchen.
Mit diesem Aufbau wurden die folgenden Experimente durchgeführt:

Wichtigkeit der Länge des C-terminalen Fragments von OspC

10 überlappende Peptide entsprechend den Carboxyterminalen 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 und 20 Aminosäuren von OspC wurden ebenfalls getestet, um die Wichtigkeit der Länge des C-terminalen Epitops für die Affinität der OspC-Antikörper zu bestimmen. Die folgenden Fragmente wurden somit synthetisiert:
NH&sub2;-LTNSVKELTNPWAESPKKP-COOH (SEQ ID NO: 15),
NH&sub2;-KELTNPWAESPKKP-COOH (SEQ ID NO: 16),
NH&sub2;-PVVAESPKKP-COOH (SEQ ID NO: 1),
NH&sub2;-WAESPKKP-COOH (SEQ ID NO: 17),
NH&sub2;-VAESPKKP-COOH (SEQ ID NO: 18),
NH&sub2;-AESPKKP-COOH (SEQ ID NO: 19),
NH&sub2;-ESPKKP-COOH (SEQ ID NO: 20),
NH&sub2;-SPKKP-COOH (SEQ ID NO: 21) und
NH&sub2;-PKKP-COOH (SEQ ID NO: 22).
Die Experimente zur Hemmung mit diesen Fragmenten verschiedener Länge ergaben als Ergebnis, daß alle bis auf das 4-mer PKKP (SEQ ID NO: 22) in der Lage waren die Bindung zwischen rOspCfl und Antikörpern in 5 von 6 Seren zu hemmen (nur ein einzelnes Serum konnte durch das 4-mer gehemmt werden). Eines der Seren konnte überhaupt nicht gehemmt werden und dieses wurde von den folgenden Tests ausgeschlossen.
Die Schlußfolgerung ist somit, daß das Peptid eine Länge von mindestens 5 Aminosäureresten haben muß um wirksam bei der Bindung von OspC-spezifischen Antikörpern aus humanen Seren zu sein.

Alanin-Scan-Test des C-Terminus von OspC

10 verschiedene OspC-Fragmente wurden in diesen Experimenten verwendet:
NH&sub2;-PVVAESPKKA-COOH (SEQ ID NO: 12),
NH&sub2;-PVVAESPKAP-COOH (SEQ ID NO: 24),
NH&sub2;-PVVAESPAKP-COOH (SEQ ID NO: 25),
NH&sub2;-PVVAESAKKP-COOH (SEQ ID NO: 26),
NH&sub2;-PVVAEAPKKP-COOH (SEQ ID NO: 27),
NH&sub2;-PVVAASPKKP-COOH (SEQ ID NO: 28),
NH&sub2;-PVVFESPKKP-COOH (SEQ ID NO: 29),
NH&sub2;-PVAAESPKKP-COOH (SEQ ID NO: 30),
NH&sub2;-PAVAESPKKP-COOH (SEQ ID NO: 31) und
NH&sub2;-AVVAESPKKP-COOH (SEQ ID NO: 32).
Diese 10 Analoga des nativen C-terminalen Decamers von OspC, worin jeder Aminosäurerest einzeln ersetzt wurde durch L-Alanin (mit Ausnahme des Ersetzens des nativen Alanins in der 4. Position von SEQ ID NO: 1 mit Phenylalanin), wurden für eine systematische Studie verwendet, um die Rolle auf die Antigenizität eines bestimmten Rests im Peptid zu beurteilen. Diese Technik wird als "Alanin-Scan" bezeichnet. L-Alanin wird als Austausch in den Analoga verwendet, da damit die Signifikanz von dieser Seitenkette untersucht werden kann. Es wird angenommen, daß einzelne Austausche durch L-Alanin nicht die Sekundärstruktur zerstören oder die Hydrophobizität beenden. Damit ist es möglich, die Rolle der funktionalen Gruppen der Seitenketten auf die Affinität der Antikörper zu untersuchen.
Der Alanin-Scan ergab die folgenden Ergebnisse: Decapeptid-Analoga von SEQ ID NO: 1 mit einem einzelnen Alanin-Austausch in den Resten 1, 2, 3, 4 (ersetzt mit Phenylalanin), 5 oder 6 von SEQ ID NO: 1 waren alle in der Lage Bindung zwischen rOspCfl und in 5 Antiseren zu hemmen. Alanin- Austausch in den verbleibenden 4 Resten führten zu Peptiden, die keine oder reduzierte Wirkung auf die Immunreaktivität zwischen den 5 Antiseren und rOspCfl (Peptiden mit Alaninaustausch in den Resten 7, 8, 9 und 10 konnten die Bindung von 1, 3, 1 bzw. 0 Seren hemmen).
Somit scheint die Sequenz der 4 C-terminalen Aminosäure in OspC wesentlich für die Immunerkennung von positiven Seren und OspC zu sein und es scheint so, daß das Vorkommen des C-terminalen Prolin-Rests wesentlich ist im Hinblick auf das Vorkommen einer Ringstruktur ähnlich der des Prolins.

Wichtigkeit der Carboxy-Gruppe im C-terminälen Prolin

Eine Variante (NH&sub2;-PVVAESPKKP-CONH&sub2; (SEQ ID NO: 33)) des C-terminalen Decamers von OspC, worin die Carboxyl-Gruppe durch eine Amino-Gruppe ersetzt wurde, wurde ebenfalls hiermit getestet.
Dieses amidierte Peptid war nicht in der Lage die Bindung von rOspCfl und den 5 Antiseren zu hemmen. Damit scheint neben der Wichtigkeit des Vorkommens einer Prolin-artigen Struktur eine Carboxy-Funktion im C-Terminus wesentlich zu sein.

Beurteilung von unüblichen Aminosäureaustauschen

Um die Wichtigkeit von einzelnen Aminosäureresten im C-Terminis aufzuklären, wurde eine Zahl von Substitutionsanaloga präpariert. Diese Analoga haben die allgemeinen Formeln:
NH&sub2;-PVVAESPK#P-COOH (SEQ ID NO: 34),
NH&sub2;-PVVAES*KKP-COOH (SEQ ID NO: 35) und
NH&sub2;- KKP-COOH (SEQ ID NO: 36)
worin
* bezeichnet L-Hydroxyprolin, 1,2,3,4,L-Tetrahydroisochinolin-3- carbonsäure, L-Thiazolidin-4-carbonsäure, Homoprolin und D-Prolin;
# bezeichnet L-Diaminopropionsäure, Diaminoessigsäure, L-Diaminobuttersäure, L-Ornithin, D-Arginin und D-Lysin und
bezeichnet L-Indolin-2-carbonsäure.
Die Verwendung von unüblichen Aminosäureresten als Substituenten in der SEQ ID NO: 1 ergab als Ergebnis daß nur ein Peptid, wo das Prolin in Position 7 mit L-Thiazolidin-4-carbonsäure-Rest ersetzt wurde in der Lage war, im Testsystem alle 5 Seren zu hemmen. Dieser Aminosäurerest ähnelt Prolin, hat aber eine -S-Gruppe anstelle einer -CH&sub2;-Gruppe in der 4- Position der Ringstruktur und ist damit etwas mehr polar als Prolin.
Es scheint somit zu sein, daß die Polarität des Restes 7 in SEQ ID NO: 1 relativ unwichtig ist, während das Vorkommen einer Ringstruktur (oder mindestens einer starken "Verbiegung" der Peptidkette, die so eingeführt wird) wesentlich ist hinsichtlich des Einflusses auf die Immunreaktivität eines Alaninaustausches in diesem Rest.
Es muß allgemein festgestellt werden, daß Substitutionen der 5 C- terminalen Aminosäuren von OspC einen negativen Einfluß auf die diagnostische Verwendbarkeit haben, es muß aber ebenfalls festgestellt werden, daß bestimmte Substitutionen mit sehr ähnlichen Aminosäureresten möglich sind ohne die diagnostische Verwendbarkeit des C-terminalen Peptids negativ zu beeinflussen.
Es sollte schließlich angemerkt werden, daß eines der Testseren mit einer sehr großen Zahl von getesteten Analoga Reaktivität aufzeigt. Andere substituierte Analoga
Die Analoga NH&sub2;-PVVPESPKKP-COOH (SEQ ID NO: 37), NH&sub2;-PVVAESPKNP-COOH (SEQ ID NO: 38) und NH&sub2;-PPPPESPKKP-COOH (SEQ ID NO: 39) wurden synthetisiert und untersucht um festzustellen, ob u. a. eine Prolin- Helixstruktur ein wesentliches Merkmal der Epitopregion ist und die Wichtigkeit des Lysinrests an der Position 9 von SEQ ID NO: 1 zu untersuchen.
Dis erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt:
Die Schlußfolgerung ist, daß die Immunreaktivität von allen 3 Peptiden im Vergleich zu den Peptiden der SEQ ID NO: 1 reduziert war. Es ist weiter aufgezeigt, daß die Art der ersten 5 Reste von SEQ ID NO: 1 weniger wichtig sind als die Art der letzten 5 Reste, da das Peptid PPPPESPKKP (SEQ ID NO: 39) einen hohen Grad an Reaktivität im Antiserum beibehält, obwohl dieses Peptid eine Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 1 von nur 70% aufzeigt (und daß die ersten 5 Reste nur eine 40%ige Identität zu den ersten 5 Resten von SEQ ID NO: 1 aufzeigen).
Weiterhin wurde die Wichtigkeit der Sequenz PKKP (SEQ ID NO: 22) im C-Terminus für die Immunreaktivität noch einmal bestätigt durch den negativen Effekt des Austausches von 9-lys mit einem 9-Asn. Aufgrund dieses Befundes scheint es zu sein, daß der Rest 9 von SEQ ID NO: 1 positiv geladen sein soll und/oder eine lange Seitenkette aufzeigen soll, damit das Peptid seine Immunreaktivität mit den Testseren beibehält. Um dies weiter zu untersuchen wurde 9-lys mit 9-arg ersetzt und getestet und trotz der geladenen Seitenkette beim Arginin und der Länge dieser Seitenkette zeigte diese Variante keinen Effekt in den Hemmungsassay. Das Lysin an der 9-Position von SEQ ID NO: 1 scheint somit essentiell zu sein.
Es wird weiterhin angemerkt, daß natürlich vorkommende Varianten von OspC existieren, die ein Asparagin als Rest entsprechend den 9-lys in SEQ ID NO: 1 haben. Entsprechend ist es möglich daß keines der Testseren gegen diese OspC-Variante gerichtet ist und dies läßt es wahrscheinlicher lassen, daß ein diagnostisches Agens zur globalen Verwendung auch Peptide mit der C-terminalen Sequenz PKNP beinhalten soll. Dies sollte einem "Einfangen" von mehr serumpositiven gegen OspC als "einzelnes antigenes Agens" führen.

Beispiel 4

Western-Blot mit dem Decapeptid mit SEQ ID NO: 1

In vorläufigen Experimenten wurde aufgezeigt, daß das Peptid mit SEQ ID NO: 1 als ein serodiagnostisches Testantigen in Western-Blots verwendet werden kann, indem 10 ug des Peptids in PBS-Puffer zu einer Nitrocellulose- Membran (NC) gegeben wurden, Blockieren in Tris-gepufferter Salzlösung mit 1% BSA über Nacht, 3-maligem Waschen mit Tris-gepufferter Salzlesung mit Tween und Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 Stunden mit Serum eines Patienten mit etablierter Neuroborreliose (verdünnt 1 : 100 in Tris- gepufferter Saline mit 1% BSA). Nach dreimaligem weiterem Waschen in Tris- gepufferter Saline mit Tween wurden Antikörper, die mit dem Peptid reagierten, mit alkalischer Phosphatase gekoppelten Kaninchen-anti-Hummanimmunglobulim M (DAKO, Dänemark; Kat. Nr. 337) nachgewiesen. Das Konjugat wurde 1 : 1000 in Tris-gepufferter Saline mit 1% BSA verdünnt und die NC- Membran wurde mit dem Farbsubstrat (BCIP und NBT; 1 : 500) für 10 Minuten inkubiert.

Beispiel 5

Verwendung des C-terminalen Peptids in einem Vakzinierungsagens

Zwei verschiedene Beobachtungen legen nahe, daß es schwierig ist hohe IgG-Antikörpertiter gegen die C-terminale Region zu induzieren. Erstens wurde gefunden, daß nur wenige Lyme-Borreliose-Seren IgG-Antikörper gegen das C-terminale Decapeptid umfassen und zweitens produzierten Kaninchen, die mit Gel-aufgereinigten nativen OspC mit Freunds kompletten Adjuvans immunisiert wurden, keine Antikörper gegen die C-terminale Region (Daten nicht gezeigt). Diese letztere Beobachtung stützt die Hypothese, daß die räumliche Organisation von OspC in der äußeren Membran sehr eng verknüpft ist mit der Spezifität der natürlich vorkommenden Antikörper. Somit wird für die Zwecke der Vakzin-Entwicklung vorgeschlagen daß das C-terminale B-Zellepitop an ein starkes T-Zellepitop gekoppelt sein soll. Dieses Epitop kann irgendeiner Natur sein, z. B. ausgewählt aus bekannten B. burgdorferi- Antigenen oder den sekretierten Antigenen von Mycobacterium tuberculosis (PPD), um eine langanhaltende protektive Antikörperantwort mit hohen Titer zu induzieren.
Zur Zeit ist es geplant, das Decapaptid mit SEQ ID NO: 1 am N-Terminus mit einem Peptid, umfassend ein bekanntes T-Zellepitop aus M. tuberculosis-Antigen ESAT-6 zu fusionieren (Brandt et al., (1996) offenbart zwei solcher T-Zell-Epitope). Das sich ergebende Fusionspeptid ist z. B. eines mit 25 Aminosäureresten und wird wie in der vorliegenden Beschreibung beschrieben formuliert und verabreicht.

Liste der Referenzen

Altman D. G., Pracitcal statistics for medical research, 1. Auflage 1991 (textbooky
Brandt et al. (1996), J. Immunol. 157: 3527-3533, Current Protocols in Immunology (1995), John Wiley and sons, Inc.
Fung B. P. et al (1994), Infect. and Immun. 62: 3213-3221
Gerber M. A. et al. (1995), J. Infect. Dis. 171: 724-7
Hansen K. et al. (1991), J. Clin. Microbiol. 29: 166-173
Hansen K. et al. (1988), J. Clin. Microbiol. 26: 338-346
Holm A. und Meldal M. (1989), Multiple column peptide synthesis, S. 208E, Bayer und G. Jung (Hrsg.), Peptides 1988, Walter de Gruyter & Co. Berlin-New York
Meldal M. et al. (1993), Multiple Column peptide synthesis, Teil 2, Int. J. Peptide % Protein Res. 41: 250-260.
Merrifield (1969), Advan. Enzymol. 32: 221
Padula S. J. et al. (1994), J. Clin. Microbiol. 32: 1733-1738
The QIAexpressionist. 2. Ausgabe, KEBO lab. Joanne Crowe, QIAGEN Inc. and Karsten Henco, DIAGEN GmbH
Ulmer J. B. et al. (1993), Curr. Opin. Invest. Drugs, 2: 983-989
Wilske B. et al. (1994), Med. Microbiol. Immuno. 183: 43-59
Zweig M. H. und Campbell G (1993), Clin. Chem. 39: 561-577.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER:
(A) NAME: Statens Seruminstitut
(B) STRASSE: Artillerivej 5
(C) ORT: Kopenhagen
(E) LAND: Dänemark
(F) POSTLEITZAHL: 2300
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Neue von OspC-stammende Peptidfragmente
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 40
(iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Ausgabe #1.0, Version #1.30 (EPO)

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Borrelia garinii
(B) STAMM: DK6
(C) INDIVIDUAL ISOLATE: BN1068
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) KLON: Cosmid-Klon p98/1 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 630 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Borrelia garinii
(B) STAMM: DK6
(C) INDIVIDUAL ISOLATE: BN1068
(iv) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 10..630 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 207 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 642 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Borrelia burgdorferi sensu stricto
(B) STAMM: DK7
(C) INDIVIDUAL ISOLATE: BN1067
(iv) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 10..642 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 211 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 645 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Borrelia asfzelii
(B) STAMM: DK26
(C) INDIVIDUAL ISOLATE: BN1066
(iv) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 10..645 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 212 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 35 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 31 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 41 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(i) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc-feature
(B) LAGE: 10
(D) SONSTIGE ANGABEN: Pro ist amidiert (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc-feature
(B) LAGE: 9
(D) SONSTIGE ANGABEN: Xaa ist L-Hydroxyprolin oder
Xaa ist 1,2,3,4-L = Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure oder
Xaa ist L-Thiazolidin-4-carbonsäure oder
Xaa ist Homoprolin oder
Xaa ist D-Prolin (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 35:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc-feature
(B) LAGE: 7
(D) SONSTIGE ANGABEN: Xaa ist L-Diaminopropionsäure oder
Xaa ist Diaminoessigsäure oder
Xaa ist L-Diaminobuttersäure oder
Xaa ist L-Ornithin oder
Xaa ist D-Arginin oder
Xaa ist D-Lysin (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 36:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc-feature
(B) LAGE: 1
(D) SONSTIGE ANGABEN: Xaa ist L-Indolin-2-carbonsäure (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 36:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 37:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 38:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 38:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 39:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 39:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 40:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc-feature
(B) LAGE: 1
(D) SONSTIGE ANGABEN: Xaa ist 6-Aminohexansäure (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 40:

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung einer vorangegangenen Sensitivisierung eines Objekts mit OspC-Polypeptid aus Borrelia burgdorferi sensu lato, das Verfahren umfaßt

das Inkontaktbringen von Immunglobulinen oder T-Zellen des Objekts mit mindestens einem immunologischen Agens, umfassend ein Polypeptidfragment mit einer Länge von höchstens 60 Aminosäureresten und welches carboxyterminal ein Peptid mit der allgemeinen Formel I enthält:

A&sup5;-A&sup4;-A³-A²-A¹

wobei A¹ und A&sup4; unabhängig voneinander einen Aminosäurerest bezeichnen, wobei ein Stickstoffatom, das Teil einer Peptidbindung bilden kann, ein Teil einer Ringstruktur ist;

A² und A³ sind unabhängig voneinander positiv geladene oder polare Aminosäurereste; und

A&sup5; bezeichnet irgendeinen Aminosäurerest;

so dass das Peptid der Formel I einen Grad an Sequenzidentität von mindestens 60% mit den 5 Aminosäureresten der Untersequenz der SEQ ID Nr. 1: Ser-Pro-Lys-Lys-Pro aufweist

und anschließend Nachweis, wenn gegeben, des Ausmaßes an immunologischer Reaktivität zwischen den Immunglobulinen und dem immunologischen Agens oder zwischen den T-Zellen und dem immunologischen Agens, eine signifikante immunologische Reaktion ist für eine vorherige Sensitivisierung mit OspC-Polypeptid aus Borrelia burgdorferi sensu lato indikativ.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei A¹ und A&sup4; unabhängig voneinander einen Aminosäurerest bezeichnen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Prolin und L-Thiazolidin-4-carbonsäure.

3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei A¹ ein Prolin bezeichnet.

4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei A&sup4; ein Prolin bezeichnet.

5. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei A² und A³ unabhängig voneinander einen Aminosäurerest bezeichnen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lysin und Asparagin.

6. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei A² einen Aminosäurerest bezeichnet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lysin und Asparagin.

7. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei A³ Lysin bezeichnet.

8. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei A&sup5; einen nicht geladenen Aminosäurerest bezeichnet.

9. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei A&sup5; einen Aminosäurerest bezeichnet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Serin, Threonin, Asparagin und Alanin.

10. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Grad an Sequenzidentität mindestens 80% ist.

11. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Peptid der Formel 1 identisch ist mit dem carboxyterminalen Teil des Polypeptids der SEQ ID Nr. 1.

12. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Polypeptidfragment eine Länge von höchstens 50 Aminosäureresten hat, wie z. B. höchstens 40, höchstens 35, höchstens 30, höchstens 25, höchstens 20, höchstens 18, höchstens 15, höchstens 14, höchstens 13, höchstens 12 oder höchstens 11 Aminosäurereste.

13. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Polypeptidfragment eine Länge von höchstens 10 Aminosäureresten hat, wie höchstens 9, höchstens 8, höchstens 7 oder höchstens 6 Aminosäurereste.

14. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Polypeptidfragment identisch mit dem Peptid ist.

15. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Polypeptidfragment die 4 carboxyterminalen Aminosäurereste der SEQ ID Nr. 1 einschließt.

16. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die durchschnittliche immunologische Sensitivität in zufällig ausgewählten Antisera von Patienten die an einem frühen Stadium der Lymborreliose leiden, beim Nachweis mindestens 85% von dem unter Verwendung von rekombinanten OspC in seiner Gesamtlänge in einen ansonsten entsprechenden Immunoassay ist.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die durchschnittliche immunologische Sensitivität ist mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 100%, mindestens 105%, mindestens 110%, mindestens 120%, mindestens 150%, mindestens 175% oder mindestens 200%.

18. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei das immunologische Agens oder das Polypeptidfragment mindestens zwei Kopien des Peptids umfaßt.

19. Verfahren gemäß einem der vorherigen. Ansprüche, wobei mindestens zwei verschiedene immunologischen Agenzien verwendet werden, die immunologischen Agenzien unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz des Polypeptidfragments, bevorzugt in der Aminosäuresequenz des Peptids.

20. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei mindestens zwei verschiedene immunologische Agenzien verwendet werden, wobei eines der immunologischen Agenzien die Anwesenheit von Antikörpern gegen das Flagellum von Borrelia burgdorferi sensu lato aufzeigt.

21. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche kombiniert mit mindestens einem zweiten Assay, der ein Diagnostikum für eine vorherige Sensitivisierung mit Antigen von B. burgdorferi sensu lato ist.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei der mindestens zweite Assay ein Assay ist für die Anwesenheit für Antikörper gegen das Flagellum von B. burgdorferi sensu lato.

23. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, das in vitro durchgeführt wird.

24. Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei das immunologische Agens zusätzlich zu dem Polypeptidfragment einen Teil umfaßt, der kovalente oder nicht-kovalente Bindung des Polypeptidfragment an einen festen oder halbfesten Träger, Support oder Oberfläche erlaubt.

25. Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei die nicht-kovalente Bindung an den Träger, Support oder Oberfläche durch den Teil mit einer Affinität zu einer Komponente, die an den Träger, Support oder Oberfläche gebunden ist, ermöglicht wird, und wobei dieser Teil bevorzugt ist

- ein Biotin oder Biotinylgruppe oder ein Analog davon gebunden an eine Aminosäuregruppe des Polypeptidfragments, wie 6-Aminohexansäure und die Komponente ist Avidin, Streptavidin oder ein Analog davon, oder

- die Aminosäuresequenz His-His-His-His-His-His aufweist, der Träger umfaßt ein Nitrilotriessigsäurederivat (NTA) geladen mit Ni&spplus;&spplus;-Ionen.

26. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei das immunologische Agens an die feste oder halb-feste Oberfläche oder den Träger mit Hilfe von kovalenter oder nicht-kovalenter Bindung immobilisiert ist, entweder vor oder nach der Zugabe der Immunglobuline.

27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei die feste oder halb-feste Oberfläche oder der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend ans dem Boden den Wänden einer Mikrotitervertiefung; einer Filteroberfläche; einer Hohlfaser; einem Chromatographiemedium auf Kugelbasis, ausgewählt aus Agarose oder Polyacrylamidgel; einer magnetische Kugel; einer fasrigen Cellulosematrix; einer HPLC-Matrix; einer FPLC- Matrix; einer Substanz mit einer solchen Molekülgröße, dass die Moleküle mit darin gebundenen immunologischen Agens, wenn sie in einer flüssigen Phase gelöst oder dispergiert werden, mit Hilfe eines Filters zurückgehalten werden können; einer Substanz, die in der Lage ist Micellen zu bilden oder teilhaben kann an der Bildung von Micellen, die es erlauben ohne Entfernen der Micellen eine flüssige Phase auszutauschen oder zu entfernen; und einem wasserlöslichen Polymer.

28. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei das immunologische Agens mit einer nachweisbaren Markierung ausgestattet ist, diese ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer radioaktiven, einer enzymatischen, einer fluoreszierenden oder anderen Markierung, wie Avidin/Biotin.

29. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Ausmaß an immunologischer Reaktivität nachgewiesen wird mit Hilfe eines Immunoassays, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem direkten oder indirekten EIA, wie ELISA, einer Immunoblottechnik, wie Western-Blot, ein RIA und anderen nicht-enzymatisch verknüpften Antikörperbindungsassay oder Verfahren, wie einer Fluoreszenz, Agglutinierung oder Präzipitationsreaktion und Nephelometrie.

30. Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei der Immunoassay umfaßt:

- Immobilisieren von nachzuweisenden Immunglobulinen, Zugabe des immunologischen Agens und anschließend Nachweis der Menge an immunologischem Agens gebunden an die Immunglobuline, gegebenenfalls in dem das immunologische Agens markiert ist oder durch Zugabe einer markierenden Substanz, wie eines markierten Antikörpers, der spezifisch das immunologische Agens erkennt,

- Immobilisieren des immunologischen Agens, Zugabe der Immunglobuline und anschließend Nachweis der Menge an Immunglobuline gebunden an das immunologische Agens, gegebenenfalls durch Zugabe einer markierten Substanz, wie eines markierten Antikörpers, der spezifisch die Immunglobuline erkennt, oder

- Reagieren der Immunglobuline und des immunologischen Agens ohne dass eine der Reaktanten immobilisiert wurden und anschließend der Nachweis der Menge an Komplexen aus immunologischen Agens und Immunglobulinen, gegebenenfalls in dem das immunologische Agens markiert wurde oder durch Zugabe einer markierten Substanz, wie eines markierten Antikörpers, der spezifisch das immunologische Agens erkennt.

31. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Immunglobuline vom IgM- oder vom IgA-Typ sind.

32. Verwendung eines Polypeptidfragments, wie in einem der Ansprüche 1 bis 15 definiert, zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose von Erkrankungen, hervorgerufen durch Borrelia burgdorferi sensu lato.

33. Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 31, umfassend in einer Packung ein immunologisches Agens wie in einem der Ansprüche 1 bis 21 und 24 definiert zusammen mit Vorrichtungen, die den Nachweis von spezifischen Bindungen zwischen dem immunologischen Agens und dem Immunglobulinen, die spezifische mit OspC-Protein reagieren, erlauben.