DE60031990T2

DE60031990T2 - Synthetische verbindungen mit zwei epitopen für immunoassays

Info

Publication number: DE60031990T2
Application number: DE60031990T
Authority: DE
Inventors: Nathalie Isabelle GARRIC; Karine Isabelle GIULIANI; Christiane Catherine LARUE; Yves Francois RIEUNIER; Marie-France Sylvie TRINQUIER
Original assignee: Bio Rad Pasteur SA
Current assignee: Bio Rad Innovations SAS
Priority date: 1999-08-16
Filing date: 2000-08-14
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2020-08-15
Also published as: DE60031990D1; FR2797689A1; JP4447811B2; WO2001013114A1; ATE346295T1; JP2003507711A; FR2797689B1; ES2275542T3; CA2382035A1; EP1204865B1; CA2382035C; EP1204865A1; US8013115B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft synthetische Verbindungen, welche als Standard oder Referenz bei Immunassays, insbesondere für die Dosierung von Troponin I, verwendbar sind, ihr Verfahren zur Herstellung, Zusammensetzungen und Zusammenstellungen, welche solche Verbindungen enthalten, wie auch die Verfahren zur Immundosierung unter Einsatz solcher Verbindungen.
Es ist bekannt, dass Troponin ein myofibrillärer proteinischer Komplex ist, gebildet von drei Proteinen, den Troponinen I, T und C. Dieser proteinische Komplex ermöglicht es zu der Regulierung der Muskelkontraktion durch das Ion Ca²⁺ beizutragen, indem Wechselwirkung mit dem Myosin und dem Actin erfolgt. Genauer gesagt, es ist bekannt, dass beim Eintreffen eines Nervenimpulses auf dem Niveau der motorischen Endplatte eines Muskels eine Erzeugung eines Wirkungspotentials vorliegt, welche zum sarkoplasmatischen Retikulum übertragen wird. Das Ca²⁺ wird dann in dem Cytosol freigesetzt und bindet auf dem Troponin C, was eine Verstärkung der Wechselwirkung zwischen dem Troponin I und dem Troponin C mit sich bringt, und damit eine Veränderung der Konformation des Troponinkomplexes I, T, C. Es erfolgt daher Freisetzung von Wechselwirkungsplätzen Actin-Myosin, dies ermöglicht die Kontraktionsbewegung des Muskels.
Wenn der Muskel beschädigt ist, wie dies beim Herzmuskel bei einer Myocardnekrose als Folge eines Myocardinfarktes der Fall ist, oder wie dies bei einem Skelettmuskel bei längeren physischen Belastungen der Fall ist, erscheinen die dabei freigesetzten Troponine mehr oder weniger rasch im Blutkreislauf.
So hat man in neuerer Zeit die Dosierung von Troponin für die frühzeitige Diagnostik auf Myokardinfarkt, sei es diejenige von Troponin T in Circulation (1991), 83, S. 902–912, oder von Troponin I in Am. Heart J. (1987), 110, S. 1333–1344, und Molecular Immunology (1992), 29 (2), S. 271–278, vorgeschlagen. In gleicher Weise hat man die Dosierung von Herz-Troponin T zur Messung des Fortschrittes der thrombolytischen Therapie als Folge eines Myokardinfarktes in Br. Heart J., (1994), 71, S. 242–248, wie auch die Dosierung von Skelett-Troponin I für die Messung der Schädigung von Skelettmuskeln (Zusammenfassung Nr. 35 des American Association for Clinical Chemistry, 46. National Meeting, New Orleans, 17.–21. Juli 1994) vorgeschlagen. Es ist darauf hinzuweisen, dass die Dosierung von unterschiedlichen Herz- und Skelett-Troponinen heute ein sehr nützliches Mittel für die Diagnostik von pathologischen Zuständen bei Menschen und Tieren ist.
Es ist wohlbekannt, dass die durchgeführten Immunassays in den Laboratorien für biologische Analysen die Lieferung durch den Hersteller hinsichtlich der erforderlichen Reaktionsteilnehmer für die Dosierung erfordern (d.h. Antikörper, markiert oder nicht, Entwicklermittel und Verdünnungslösungen), eines Standards für die zu bestimmende Verbindung, welcher bei der Verwendung unter analogen Bedingungen zu denjenigen der zu untersuchenden Probe als Referenz für die Berechnung der Resultate und/oder des positiven Nachweises dient.
Zum Erhalt des Standards und/oder des Nachweises der zu bestimmenden Verbindung kann man diese gereinigte Verbindung unter lyophilisierter Form (begleitet von einem Lösungsmittel, in welchem die Verbindung durch den Anwender vor der Verwendung aufgelöst werden muß) oder fertig zur Verwendung benutzen.
Wegen der Tatsache, dass biologische Reaktionsteilnehmer instabil sind, werden die Standard- oder Nachweislösungen, hergestellt aus dem Lyophilisat, in Einheitsdosierungen zusammen eingefroren und bei –80°C aufbewahrt. Man hat darüber hinaus festgestellt, dass solche Lösungen nicht länger als einige Stunden bei +4°C stabil waren, selbst wenn Proteasehemmer oder antibakterielle Mittel hier zugesetzt wurden. Dies erfordert daher, dass die Benutzer ihre Standardlösungen an Ort und Stelle herstellen.
Die Patentanmeldung, veröffentlicht unter der Nummer FR-A-2 701 954, beschreibt eine stabilisierte Lösung von Troponin I oder T für einen Immunassay, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer wässrigen Lösung gebildet ist, welche Troponin I oder Troponin T enthält, in Mischung mit Troponin C und insbesondere in den Anteilen von 1 bis 10 Moläquivalenten von Troponin C pro Äquivalent von Troponin I oder T, und Calciumchlorid. Diese Technik ermöglicht die Aufbewahrung während mehrerer Tage bei +4°C von mehr oder weniger verdünnten Standardlösungen für Troponin I oder T.
Die veröffentlichte Patentanmeldung unter der Nummer FR 2 734 267 beschreibt Standardlösungen von Troponin, zusammengesetzt aus einem Dreierkomplex, gebildet durch Troponin I, Troponin T und Troponin C.
Die verwendeten Ausgangsmaterialien zum Erhalt der Standardlösungen sind von menschlichem oder tierischem Ursprung, und die so erhaltenen Standardlösungen oder Nachweislösungen sind während ungefähr einem Monat bei +4°C stabil.
Die Anmeldung WO 94/15217 beschreibt bestimmte synthetische Peptide, welche als Immungene zur Herstellung von Antikörpern brauchbar sind, welche das N-endständige Peptid von Troponin I erkennen. Bestimmte dieser Peptide können als Standard bei den Immundosierungen von Troponin I verwendet werden, wobei die Antikörper eingesetzt werden, welche Gegenstände der durch die Anmeldung WO 94/15217 abgedeckten Erfindung sind.
Darüber hinaus weist die Anmeldung des Patentes WO 94/27156 auf ein Verfahren zur Dosierung von Herz-Troponin I hin, wobei spezifische Antikörper für Herz-Troponin I eingesetzt werden. Diese Antikörper können aus peptidischen Fragmenten hergestellt werden, welche eine bei Troponin I von Skelettmuskeln fehlende Sequenz haben und daher spezifisch für Herz-Troponin I sind. Diese Anmeldung offenbart jedoch nicht die Möglichkeit der Verwendung von bestimmten peptidischen Fragmenten als Standardlösungen bei den Immundosierungen von Troponin I noch legt sie diese nahe.
Ebenfalls kennt man aus der Anmeldung WO 96/27661 wässrige Lösungen zum Stabilisieren von Proteinen und Peptiden. Solche Lösungen finden häufig ihre Anwendung in den diagnostischen Tests auf Proteine oder Peptide.
Gemäß der WO 97/27661 ermöglichen solche wässrigen Lösungen selbst die Erhöhung der Stabilität von Fragmenten von Troponin I, welche bekanntermaßen weniger stabil als das Gesamt-Troponin I sind.
Die Anmeldung EP-A-752 426, veröffentlicht am 8. Januar 1997, beschreibt ebenfalls Standardlösungen für Troponin I, zusammengesetzt aus einem oder mehreren Peptiden, fixiert auf einem Trägermolekül, wie den Proteinen mit hohem Molekulargewicht (> 100 KD) oder von Polymeren.
Die Anmeldung EP-A-650 053 beschreibt synthetische Standards, welche aktive Plätze für einen oder mehrere Rezeptoren enthalten, verbunden untereinander durch eine verzweigte Struktur. Diese Anmeldung beschreibt speziell synthetische Stan dardlösungen für Troponin T, welche in Lösung nur während drei Wochen stabil sind.
Die WO 98/24816 beschreibt biepitopische synthetische Verbindungen, welche als Standard bei den biologischen Dosierungen von Troponin I anwendbar sind.
Solche Verbindungen werden durch lineare Strukturen gebildet, welche zwei unterschiedliche epitopische peptidische Sequenzen für Troponin I umfassen, verbunden untereinander durch eine Bindungsgruppe ("Linker"), gebildet durch ein Kohlenwasserstoffskelett und/oder ein peptidisches Skelett, in welchem die zwei Epitope darüber hinaus jeweils durch ihre endständigen N- und C-Endgruppen an zusätzliche peptidische Sequenzen gebunden sind.
Die so erhaltenen epitopischen synthetischen Verbindungen weisen eine ausgezeichnete Stabilität in Lösung auf, jedoch eine unzureichende Linearität der Verdünnung.
Unter "Linearität der Verdünnung" versteht man die Funktion, die das Signal wiedergibt, das als Funktion des Verdünnungsfaktors der Referenzverbindung erhalten wird, wobei diese Funktion idealerweise durch eine Gerade wiedergegeben wird.
Darüber hinaus sind durch die Anmeldung WO 95/04543 peptidische synthetische Strukturen bekannt, welche durch eine Matrix von peptidischer Natur gebildet werden, die Verzweigungen umfaßt, welche durch verzweigte Peptide auf den Seitengruppierungen der Peptidmatrix unter Zwischenschaltung einer dendritischen Bindung gebildet sind.
Solche verzweigten peptidischen Strukturen sind für die Konzeption von Proteinen brauchbar, welche eine bestimmte wendelförmige Topologie aufweisen.
Die Arbeiten der Erfinder, welche zu der vorliegenden Erfindung führten, haben es ermöglicht, zu finden, dass die verzweigten Strukturen des in der WO 94/04543 beschriebenen Typs verzweigte Seitenarme umfassen, welche wenigstens zwei unterschiedliche epitopische Sequenzen von Troponin I tragen, welche Standard- oder Nachweislösungen für Immunassays im Hinblick auf die Dosierung von Troponin I liefern, wobei diese gleichzeitig eine erhöhte Stabilität in Lösung bei 4°C und eine ausgezeichnete Linearität bei der Verdünnung liefern.
Die Erfindung hat als Gegenstand die Verwendung von wenigstens einer synthetischen Verbindung, umfassend:

– ein Trägermolekül, das eine peptidische Kohlenwasserstoffkette besitzt, gebildet
a) durch Verknüpfungen von 7 bis 50 Aminosäuren, die eine offene Kohlenwasserstoffkette bilden, welche wenigstens eine Verknüpfung umfasst, die Steifigkeit in das Molekül derart einführt, dass die durch die Atome der Kohlenwasserstoffkette gebildeten Verknüpfungen nicht mehr in freier Rotation sind; oder
b) durch Verknüpfungen von 8 bis 50 Aminosäuren, die einen Ring bilden, wobei diese Kohlenwasserstoffkette wenigstens zwei Reste umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, welche durch Aminosäuren mit basischen Seitenketten, Aminosäuren mit negativ geladenen Seitenketten, Aminosäuren mit hydroxylierten Seitenketten und Aminosäuren mit Schwefel enthaltenden Seitenketten gebildet wird, welche die Pfropfung der Seitenarme auf dieser Kohlenwasserstoffkette erlauben; und
– wenigstens zwei verschiedene Epitope für Troponin, die auf diesen gepfropften Seitenarmen auf diesem Trägermolekül getragen sind als Standard oder Nachweis für Immundosierungen von biologischen Molekülen, insbesondere Polypeptiden oder Proteinen.

Es ist wünschenswert, einen minimalen Abstand von reaktionsfähigen Funktionen oder zur Reaktion fähigen Funktionen zu haben, auf welchen die Epitope tragenden Seitenarme gepfropft sind.
Zu diesem Zweck bevorzugt man es, dass die Epitope auf den Seitenarmen um wenigstens 40 Å getrennt sind, dies entspricht einem Abstand von wenigstens drei Aminosäuren.
Darüber hinaus bevorzugt man es, dass die Seitenarme, welche die Epitope tragen, auf dem Trägermolekül derart angeordnet sind, dass es keine sterische Behinderung noch eine Wechselwirkung zwischen diesen Armen gibt, insbesondere bei der immunologischen Reaktion von einem oder mehreren dieser Epitope mit Antikörpern.
Vorteilhafterweise sind die Seitenarme derart angeordnet, dass sie zwischen ihnen einen Winkel bilden, wobei dieser durch Einführung einer Drehung oder Steifigkeit in der Kohlenwasserstoffkette derart erhalten wird, dass die Seitenarme in nicht parallelen Orientierungen angeordnet sind und bevorzugt gegenüberliegend vorliegen.
Die Kohlenwasserstoffkette ist vorteilhafterweise ein Oligopeptid oder Polypeptid, gebildet von natürlichen Aminosäuren, wie sie in Prokaryoten- oder Eukaryotenproteinen gefunden werden, oder auch durch nicht natürliche Aminosäuren.
In diesem Fall bevorzugt man, dass zwei aufeinander folgende Seitenarme durch zwei Aminosäuren getragen werden, wie die zuvor definierten, welche voneinander durch eine Anzahl von 2n + 1 Aminosäuren getrennt sind, bevorzugt keine reaktionsfähigen Seitenkette tragen oder eine inaktivierte reaktionsfähige Seitenkette tragen, wobei n eine ganze Zahl darstellt und vorteilhafterweise zwischen 1 und 6 liegt. Bevorzugt ist n = 2, wobei Werte von n = 3, n = 4 und n = 5 dennoch gute Ergebnisse ergeben.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung ist die Kohlenwasserstoffkette offen und umfaßt wenigstens eine Verknüpfung, welche eine Steifigkeit in das Molekül derart einführt, dass die durch die Atome der Kohlenwasserstoffkette gebildeten Verknüpfungen nicht mehr alle in freier Rotation vorliegen.
Es kann sich beispielsweise um ein Kohlenstoffatom sp² handeln, beispielsweise wenn die Kohlenwasserstoffkette nicht von peptidischer Natur oder nicht ausschließlich von peptidischer Natur ist, oder um ein Kohlenstoffatom eines Ringes.
Wenn die Kohlenwasserstoffkette von peptidischer Natur ist, wird der Abstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Seitenarmen, welcher die Vermeidung von Wechselwirkungen zwischen den Atomen eines Seitenarmes mit den Atomen des anderen Seitenarmes dadurch erhalten, dass ein Abstand von 2n + 1 Aminosäuren zwischen den die Seitenarme tragenden Aminosäuren vorgesehen wird, wobei n wie oben definiert ist, oder indem in die peptidische Kette eine cyclische Aminosäure eingeführt wird, welche eine Steifigkeit in dieser Kette erzeugt oder auch indem gleichzeitig die eine oder die andere dieser Alternativen vorgesehen wird.
Die Steifigkeit des Trägermoleküls kann beispielsweise durch einen Prolinrest erteilt werden.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung ist die Kohlenwasserstoffkette, insbesondere oligopeptidisch oder polypeptidisch, in der Weise geschlossen, dass sie einen Ring bildet.
Eine peptidische Sequenz, welche am besten die oben genannten Zustände zu erfüllen erlaubt, um den gewünschten Abstand zu erhalten, entspricht der Formel: X₁-A₁-A₂-A₃-A₄-A₅-X₂-A₆ worin
X₁ und X₂, identisch oder verschieden, Aminosäuren sind, welche die Seitenarme tragen und ausgewählt sind unter einer Aminosäure mit basischer Seitenkette, einer Aminosäure mit negativ geladener Seitenkette, einer Aminosäure mit hydroxylierter Seitenkette und einer Aminosäure mit Schwefel tragender Seitenkette, wobei X₁ und X₂ bevorzugt Lysin darstellen.
A₁ und A₂ stellen eine Aminosäure dar, ausgewählt unter Prolin, Phenylalanin, Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin;
mit der Maßgabe, dass eines von A₁ und A₂ unter Prolin und Phenylalanin ausgewählt ist,
A₃ stellt eine Aminosäure dar, ausgewählt unter Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin, bevorzugt Glycin,
A₄ stellt eine Aminosäure dar, ausgewählt unter Arginin, Histidin, bevorzugt Arginin,
A₅ stellt eine Aminosäure dar, ausgewählt unter Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin, bevorzugt Alanin,
A₆ stellt eine Aminosäure dar, ausgewählt unter Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin, bevorzugt Glycin.
Daher sind die minimalen besonders bevorzugten Peptidsequenzen die Sequenzen:
Man bevorzugt, dass das Trägermolekül wenigstens zwei Reste umfasst, ausgewählt unter den Aminosäuren mit basischen Seitenketten, insbesondere Lysin, den Aminosäuren mit negativ geladenen Seitenketten, insbesondere Glutaminsäure oder Aspartinsäure, den Aminosäuren mit hydroxylierten Seitenketten, insbesondere Serin und Threonin, und den Aminosäuren mit Schwefel enthaltenden Seitenketten, insbesondere Cystein, wobei Lysin bevorzugt ist. In allgemeiner Weise hat das Trägermolekül gemäß der Erfindung eine Molmasse, welche ungefähr 10 Kilodalton nicht übersteigt, bevorzugt ungefähr 8 Kilodalton nicht übersteigt. Die bevorzugten Trägermoleküle gemäß der Erfindung haben eine Molmasse unterhalb von ungefähr 5 Kilodalton. Die minimal erforderliche Molmasse beträgt im Allgemeinen ungefähr 1 mit mehr oder weniger 0,2 Kilodalton.
Die Epitope können aus beliebigen Epitopen von biologischem zu dosierenden Molekül bestehen, für welche Antikörper vorliegen, bevorzugt spezifische Antikörper.
Für Troponin I kann man die Antikörper nennen, welche von Larue et al. (Molec. Immunology, (1992), Vol. 20 Nr. 29, S. 271–278), Bodor et al. (Clin. Chem. (1992), Vol. 38 Nr. 11, S. 2203–2214), Granier et al. (Protein Science, (1997), Vol. 6 Suppl. 1, S. 61) und in der Anmeldung WO 94/15217 beschrieben sind. Der größte Teil solcher Antikörper ist im Handel erhältlich (Hytest LTD-Turku, Finnland). Man bevorzugt insbesondere die Antikörper 11E12 und 8E1.
Die Epitope werden im Folgenden mit E1 und E2 bezeichnet, E1 ist von E2 verschieden.
Die Epitope E1 und E2 können in einem einzigen Exemplar vorliegen, jedes auf dem Trägermolekül, oder als mehrere, insbesondere zwei, drei oder vier Exemplare.
In diesem letzten Fall können die zwei Exemplare desselben Epitops auf demselben Seitenarm oder auf zwei unterschiedlichen Seitenarmen vorliegen.
In vorteilhafter Weise kann die Synthese von Verbindungen gemäß der Erfindung streng gesteuert werden: zur Sicherstellung der Zahl von Epitopen E1 und E2, welche man auf dem Trägermolekül ansammelt, kann man folgende Arbeitsweisen anwenden: Synthetic Peptides A user's guide, herausgegeben von Gregory A. Grant (UWBC Biotechnological Resource Series, Richard R. Burgess series, Herausgeber), 1992, im Kapitel 4: Einstufung des fertigen Produktes, siehe nachfolgend.
Man bevorzugt doch, dass ein und derselbe Seitenarm nicht mehr als zwei identische oder verschiedene Epitope trägt.
In dem Fall, in welchem die Epitope zu mehr als zwei Exemplaren vorliegen, bevorzugt man, dass diese auf um so mehr Ergänzungsseitenarmen getragen sind.
Wenn sie in zwei Exemplaren auf denselben Seitenarmen angeboten werden, sind die Epitope E1 und E2 vorteilhafterweise voneinander durch eine Bindungsgruppe Z ("Linker") getrennt, wobei dieser von peptidischer oder nicht-peptidischer Natur sein kann.
Ebenfalls kann die Bindungsgruppe Z darstellen:

– eine peptidische Sequenz von 1 bis 40, bevorzugt 3 bis 20 Aminosäuren, immer jedoch unter der Bedingung, dass die durch die Epitope und die Bindungsgruppe Z gebildete Verknüpfung zusammen nicht einen Teil der Sequenz des zu dosierenden biologischen Moleküls, insbesondere dem Troponin I, bilden;
– eine lineare oder verzweigte Kette Aminoalkyl-(C₁-C₁₀)-carbonyl;
– eine gemischte Konstruktion, gebildet durch wenigstens eine peptidische Sequenz von 1 bis 10 Aminosäuren und wenigstens eine lineare oder verzweigte Kette Aminoalkyl(C₁-C₁₀)carbonyl.

Man beachtet, dass -E₁-Z-E₂- nicht ein Teil der Sequenz des zu dosierenden biologischen Moleküls, insbesondere dem Troponin I, ist, wenn -E₁-Z-E₂- sich von einem Fragment unterscheidet, welches von der Sequenz des zu dosierenden Moleküls, beispielsweise dem Troponin I, durch nicht konservative Substitution, Weglassen oder Einsetzen von wenigstens einer Aminosäure, bevorzugt von 2 Aminosäuren, bevorzugt von 5 Aminosäuren gegeben ist.
Z kann insbesondere darstellen

• eine Kette der Formel: -NH-(CH₂)_m-CO- in welcher m eine ganze Zahl von 1 bis 10 darstellt,
• ein gemischter Aufbau der Formeln: -[pep₁-NH-(CH₂)_m-CO]_p- -[pep₁-NH-(CH₂)_m-CO-pep₂]_p- -[NH-(CH₂)_m-CO-pep₂]_p- worin
– m eine ganze Zahl von 1 bis 10 darstellt,
– p eine ganze Zahl von 1 bis 5 darstellt, und
– pep₁ und pep₂, identisch oder verschieden, eine peptidische Kette darstellen, welche 2 bis 10 Aminosäuren trägt.

Die Seitenarme, welche die Epitope tragen, umfassen bevorzugt an den Enden N- und C-Endgruppen von Epitopen, worin die Verknüpfung durch E₁-Z-E₂ von Ergänzungsgruppen Z₁ bzw. Z₂ gebildet wird.
Vorteilhafterweise stellt Z₁ dar:

• ein Wasserstoffatom, eine Acetylgruppe, eine peptidische Sequenz von 1 bis 10 Aminosäuren, eine peptidische Sequenz von 1 bis 10 α-acetylierten Aminosäuren mit N-Endgruppen, eine Cysteinyl-, Biotinyl- oder Biocytinylgruppe, eine peptidische Sequenz von 1 bis 10 Aminosäuren, welche einen Cysteinyl-, Amino-, Hydroxyl-, Halogen-, Carboxyl-, Biotinyl- oder Biocytinylrest tragen,
• eine lineare oder verzweigte Kette Aminoalkyl(C₁-C₁₀)carbonyl,
• eine lineare oder verzweigte N-α-acetylierte Kette Aminoalkyl(C₁-C₁₀)carbonyl,
• einen Mischaufbau, gebildet von wenigstens einer peptidischen Sequenz von 1 bis 10 Aminosäuren und wenigstens einer linearen oder verzweigten Kette Aminoalkyl(C₁-C₁₀)carbonyl, oder
• einen Mischaufbau, gebildet von wenigstens einer peptidischen Sequenz von 1 bis 10 Aminosäuren und wenigstens einer linearen oder verzweigten Kette Aminoalkyl(C₁-C₁₀)carbonyl, welche einen Amino-, Halogen-, Hydroxyl-, Carboxyl-, Biotinyl-, Biocytinyl- oder Cysteinylrest trägt.

Vorteilhafterweise stellt Z₂ dar:

• ein Hydroxylrest, ein Aminorest, eine peptidische Sequenz von 1 bis 10 Aminosäuren, eine peptidische Sequenz von 1 bis 10 Aminosäuren, welche eine endständige Aminogruppe, Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe, Halogengruppe, Cysteinylgruppe, Biotinylgruppe oder Biocytinylgruppe trägt,
• eine lineare oder verzweigte Kette Aminoalkyl(C₁-C₁₀)carbonyl,
• eine lineare oder verzweigte Kette Aminoalkyl(C₁-C₁₀)carbonyl, welche einen Hydroxylrest oder einen Aminorest trägt,
• ein Mischaufbau, gebildet durch wenigstens eine peptidische Sequenz von 1 bis 10 Aminosäuren und wenigstens eine lineare oder verzweigte Kette Aminoalkyl(C₁-C₁₀)carbonyl,
• ein Mischaufbau, gebildet durch wenigstens eine peptidische Sequenz von 1 bis 10 Aminosäuren und wenigstens eine lineare oder verzweigte Kette Aminoalkyl(C₁-C₁₀)carbonyl, welche einen Hydroxylrest oder einen Aminorest trägt.

Die Seitenarme sind an das Trägermolekül gebunden, entweder direkt oder durch Zwischenschaltung eines Abstandshalters (<<Spacer>>), wobei dies eine bifunktionelle Gruppe sein kann, welche an ihren Enden zwei reaktionsfähige Funktionen trägt, ausgewählt zur Reaktion mit den reaktionsfähigen Gruppierungen, welche jeweils von dem Trägermolekül und Z₁ oder Z₂ getragen werden.
Es wird bevorzugt, dass die Seitenarme Epitope umfassen, gebildet höchstens 10, vorteilhafterweise höchstens 6 Aminosäuren, und dass die Gruppen Z und Z₁ und Z₂ von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren gebildet werden.
Die synthetischen Verbindungen gemäß der Erfindung können nach einem Verfahren erhalten werden, welches die folgenden Stufen umfasst:

– Stufe A: Liefern eines Trägermoleküls, welches eine peptidische Kohlenwasserstoffkette trägt, welche wenigstens zwei reaktionsfähige Gruppen umfasst, welche das Pfropfen der Seitenarme ermöglichen.
– Stufe B: Gegebenenfalls Ringbildung des Trägermoleküls.
– Stufe C: Lieferung von Molekülen, welche die Seitenarme bilden, umfassend wenigstens eine reaktionsfähige Funktion, welche mit der reaktionsfähigen Gruppe des Trägermoleküls reaktiv ist.
– Stufe D: Kupplung der Seitenarme und des Trägermoleküls unter geeigneten Bedingungen.

Wenn die Abstandshalter (<<Spacer>>) von polypeptidischer Art sind, können die oben beschriebenen Stufen vorteilhafterweise bestehen aus:
Stufe A: Liefern eines Oligopeptids oder Polypeptids, welches wenigstens zwei Aminosäurereste umfasst, welche wenigstens zwei funktionelle Seitengruppen tragen (beispielsweise: Amino), identisch oder verschieden.
Im Fall eines cyclisierten Peptids werden die funktionellen Gruppen derart ausgewählt, dass es keine Störung bei der Cyclisierung gibt, oder gegebenenfalls sind diese zeitweise mit Hilfe einer üblichen Schutzgruppe geschützt.
Stufe B: Gegebenenfalls erfolgt die Cyclisierung des Peptids entweder direkt oder unter Zwischenschaltung eines Kupplungsmittels.
Beispielsweise kann die Kupplung im Fall der Bildung einer Amidbindung unter Zwischenschaltung der Hexafluorphosphatkupplung von Benzotriazolyl-oxy-tris-(dimethylamin)phosphonium/1-hydroxybenzotriazol (BOP/HOBt) in Anwesenheit einer Base durchgeführt werden.
Stufe C: Lieferung von Peptiden mit nicht geschützten Seitenarmen, wobei jede eine funktionelle Gruppierung trägt, welche in der Lage ist, direkt oder unter Zwischenschaltung eines Kupplungsmittels zu reagieren; anschließend
Stufe D: Kupplung dieses Oligopeptids oder Polypeptids mit Peptiden, welche die Seitenarme in der Art bilden, dass die synthetische Verbindung gemäß der Erfindung erhalten wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die reaktiven Funktionen des Trägermoleküls Aminofunktionen, aktiviert unter Zwischenschaltung einer bifunktionellen Gruppe _sSMCC.
In der Stufe D wird die Bindung zwischen einem Seitenarm und dem Trägermolekül durch eine nukleophile Substitutionsreaktion zwischen einem Rest-SH des Peptids dieses Seitenarms auf einer Maleinimidgruppe des Trägermoleküls realisiert.
Das Trägermolekül und die Seitenarme werden durch klassische Verfahren der organischen Synthese und/oder der Peptidchemie, je nach Fall, erhalten.
Die Peptide des Trägermoleküls und der Seitenarme, welche die Epitope tragen, können durch Synthese in fester Phase entsprechend den klassischen Methoden erhalten werden, welche beschrieben sind von R. B. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. (1963), 85, S. 2149–2154; R. C. Sheppard, in <<Peptides 1971>>, Nesvadba H. (Herausgeber), North Holland, Amsterdam, S. 111; E. Atherton und R. L. Sheppard in <<Solid phase peptide synthesis, a practical approach>>, IRL PRESS, (1989), Oxford University Press, S. 25–34.
Als automatische Synthesevorrichtung kann man die Synthesevorrichtung <<9050 Plus Pep Synthesizer>> von Millipore, "Pioneer" Perspective oder die Synthesevorrichtung "433A" von ABI verwenden.
Die Peptide können ebenfalls durch Synthese in homogener Phase erhalten werden.
Der für die Synthesen verwendete feste Träger muß mit der Technik und der angewandten Chemie verträglich sein. Beispielsweise wird es für eine Synthese auf der Synthesevorrichtung <<9050 Plus pep. Synthesizer>> empfohlen, ein an die mit <<in kontinuierlichem Fluß>> bezeichnete Arbeitsweise angepaßtes Harz zu verwenden. Die Harze PEG PS entsprechen diesen Kriterien. Solche Träger sind aus einem Abstandsarm (<<Spacer>>) auf Basis von Polyethylenglykol (PEG) aufgebaut, das zwischen der funktionellen Gruppierung des Polystyrols in Form von kleinen Kügelchen und dem Brückenbildungspunkt der ersten Aminosäure angeordnet ist. Die Art dieses Punktes der Verankerung kann entsprechend der gewählten C-Endfunktion variieren. Beispielsweise kann man für ein Peptid in Form von Amid ein Harz vom Typ PAL PEG PS nehmen.
Die Harze von Novabiochem entsprechen ebenfalls den erforderlichen Kriterien für die Synthese in fester Phase bei kontinuierlichem Fluß. Sie weisen darüber hinaus den Vorteil auf, dass sie das Peptid nach der Synthese unter sanft bezeichneten sauren Bedingungen freisetzen können, dies ermöglicht den Erhalt von peptidischen Fragmenten, deren Seitenketten von Aminosäuren noch durch chemische Gruppen geschützt sind.
Das Ausgangsharz und die als Startmaterial verwendeten Aminosäuren sind im Handel erhältliche Produkte (PerSeptive-Biosystem, Perkin-Elmer, Novabiochem).
Die Schutzgruppen der Seitenketten, welche verwendet werden können, sind in Tabelle I wiedergegeben:
Tabelle I: Schutzgruppen.
Der zeitweilige Schutz der Primäraminfunktion bei α von Aminosäuren kann mit Hilfe der Gruppe 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) herbeigeführt werden. Die Entfernung des Schutzes kann durch Verwendung einer Lösung von Piperidin mit 20% in Dimethylformamid durchgeführt werden.
Für das Kuppeln verwendet man bevorzugt einen Überschuß von Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI) und von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt).
Für cyclische Peptide, welche das Trägermolekül bilden, verwendet man bevorzugt das Harz Fmoc Ala nova Syn.
Nach der Synthese wird das Harz mit organischen Lösungsmitteln (Dimethylformamid, dann Dichlormethan) gewaschen, unter Vakuum getrocknet, dann mit einer Lösung auf saurer Basis behandelt.
Die auf diese Weise isolierten Peptide werden anschließend ausgefällt und mit Ether gewaschen.
Für Trägermoleküle, welche durch cyclische Peptide gebildet werden, kann man beispielsweise eine Cyclisierung, welche "Kopf-Schwanz" genannt wird, durchführen. Für diese Stufe wird das Peptid in DMF aufgelöst, das Kupplungsmittel ist das Paar BOP/HOBt in Anwesenheit einer Base wie Diisopropylenamin (DIEA) oder N-Methylmorpholin (NMM). Nach Extraktion wird das cyclisierte Peptid ausgefällt, dann mit einer Lösung auf Etherbasis gewaschen.
Das so erhaltene Peptid wird anschließend mit einer Trifluoressigsäurelösung behandelt, dann erneut ausgefällt und mit Ether gespült.
Für Trägermoleküle von nicht cyclisierter peptidischer Natur verwendet man ein Harz PALPEG PS. Nach der Synthese wird das Harz mit organischen Lösungsmitteln (Dimethylformamid, Dichlormethan) gewaschen, unter Vakuum getrocknet, anschließend mit einer Lösung auf Basis von Trifluoressigsäure, abgekühlt auf 0°C und geeignete "Fänger" enthaltend, behandelt. Man kann beispielsweise den Reaktionsteilnehmer K verwenden, welcher 82% Trifluoressigsäure, 5% Phenol, 5% Wasser, 5% Thioanisol und 3% Ethandithiol enthält.
Die Peptide, welche die Seitenarme bilden, können insbesondere so erhalten werden, wie dies in der Anmeldung WO 98/24816 beschrieben ist.
Die so isolierten synthetischen Peptide werden anschließend mit Ether ausgefällt.
Die cyclischen oder linearen synthetischen Verbindungen werden anschließend mittels Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie gereinigt, und ihre Reinheit wird durch Massenspektroskopie bestimmt. Als Pühase kann man beispielsweise die Phase Bondapak C-18 verwenden.
Die Peptide werden mittels eines Lineargradienten zwischen zwei Pufferlösungen eluiert, wobei die erste im Wesentlichen wässrig ist (beispielsweise Wasser-TFA 0,1%) und die zweite stärker organisch ist (beispielsweise ein Gemisch, welches Acetonitril 60%, Wasser 40% und TFA 0,08% enthält). Die gesammelten reinen Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum eingeengt und lyophilisiert und ihre Reinheit wird durch Massenspektrometrie kontrolliert, wie dies in dem folgenden Werk angegeben ist: Synthetic Peptides A user's guide, herausgegeben von Gregory A. Grant (UWBC Biotechnological Resource Series, Richard R. Burgess series, Herausgeber), 1992, im Kapitel 4: Bewertung des Endproduktes.
Die Funktionen von Seitenketten von bestimmten Aminosäuren (beispielsweise von Lysin, von Arginin, von Cystein, usw.), welche Bestandteile des Oligopeptid- oder Polypeptidträgers sind, werden anschließend durch eine bifunktionelle Gruppe aktiviert, welche die Bindung in spezifischer Weise oder nicht spezifischer Weise von einem oder mehreren Peptiden (welche die Seitenarme bilden) erlaubt. Als Beispiel der oben genannten Seitenkette, welche bei diesem Bindungstyp verwendet werden kann, kann man die Seitenkette nennen, welche Aminogruppen (primär/sekundär), Carboxylgruppen, Thiolgruppen, Hydroxylgruppen, Aldehydgruppen, etc. tragen.
Als Beispiel von Verbindungen, welche bifunktionelle Gruppen umfassen, kann man die folgenden Verbindungen verwenden:

– BS₃: Bis(sulfosuccinimidyl)suberat;
– _sSMCC: (Sulfosuccinimidyl-4-N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat.
– BMH: Bis-Maleidohexan
– DSG: Disuccinimidylglutarat
– 5MBS: m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccimidester
– MPBH: 4-(4-N-Maleimidophenyl)-buttersäurehydroxid
– EDC: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropylat)-carbodiimid.

Unter Anwendung der oben genannten Massenspektrometrietechnik auf synthetische Endverbindungen gemäß der Erfindung kann der Fachmann auf dem Gebiet das Ausmaß der Reinheit einer solchen Verbindung feststellen. Darüber hinaus kann er in klarer und nicht zweideutiger Weise kontrollieren, dass die Molekülmasse dieser Verbindung, welche tatsächlich durch Spektrometrie gemessen wurde, gut der der erwarteten Molekülmasse im Hinblick auf die Molekülmassen der Ausgangsmoleküle (Trägermolekül, Epitope, ...) entspricht. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es daher dem Fachmann auf dem Gebiet, präzise die Synthesen zu steuern, welcher er durchführt, und genau zu wissen, was er hergestellt hat.
Die Erfindung hat ebenfalls Verbindungen zum Gegenstand, welche zwei unterschiedliche Epitope für Troponin I tragen, wie sie zuvor definiert wurden.
Als Epitope für Troponin I kann man insbesondere die peptidischen Sequenzen TEPH (Seq. Nr. 5), ALLGAR (Seq. Nr. 6) und FAEL (Seq. Nr. 7) oder diese letztgenannten umfassende Sequenzen nennen.
Die Erfindung hat ebenfalls Zusammensetzungen zum Gegenstand, welche die Verbindungen der Erfindung enthalten, umfassend wenigstens zwei Epitope für Troponin I.
Es handelt sich bevorzugt um wässrige Lösungen oder um Zusammensetzungen, gebildet durch biepitopische synthetische Verbindungen, wie sie zuvor beschrieben wurden, in einer Pufferlösung. Als Pufferlösung kann man beispielsweise eine Phosphat-Pufferlösung (KH₂PO₄/K₂HPO₄ pH = 6,5–7,5) verwenden, welche ^®Kathon, Rinderalbuminserum (BSA) oder ^®Kathon, ^®Régilait und EDTA, oder ^®Kathon, ^®Plasmion und gegebenenfalls EDTA, oder ^®Kathon, Casein und EDTA enthält.
Ebenfalls kann man eine Succinat-Pufferlösung (pH = 5–6) oder Tris HCl (pH = 7,5–8,5) verwenden, welche ^®Kathon und Rinderalbuminserum, oder ^®Kathon, oder ^®Régilait und EDTA oder ^®Kathon, ^®Plasmion und gegebenenfalls EDTA, oder ^®Kathon, Casein und EDTA enthalten.
Pufferlösungen, welche das Glycin, ^®Kathon, ^®Régilait und EDTA enthalten, können ebenfalls verwendet werden.
Man bevorzugt die Verwendung einer Succinat- oder Phosphat-Pufferlösung, welche ^®Kathon, ^®Régilait und EDTA enthält.
Das ^®Kathon, ein von der Firma Rohm und Haas in den Handel gebrachtes antibakterielles Mittel wird gebildet durch 5-Chlor-2-methyl-4-isothiazolin-3-on und 2-Methyl-4-isothiazolin-3-on (1,5%).
Das ^®Régilait ist ein entrahmtes Milchpulver, in den Handel gebracht durch die Société Régilait (Frankreich).
Das ^®Plasmion wird durch die Laboratoires Bellon (Frankreich) in den Handel gebracht und wird durch modifizierte flüssige Gelatine (30 g/l), NaCl (5,382 g/l), MgCl (143 mg/l), KCl (373 mg/l), Natriumlactat (3,360 g/l) in Wasser gebildet.
Die folgenden Pufferlösungen sind besonders bevorzugt:

– Succinat-Pufferlösung 0,1 M (pH = 6), enthaltend ^®Kathon (mit 0,2%), ^®Régilait (0,05–2%) und EDTA 2 mM,
– Succinat-Pufferlösung 0,1 M (pH = 6), enthaltend ^®Kathon (mit 0,2%), Casein (0,01–0,5%) und EDTA 2 mM,
– Succinat-Pufferlösung 0,1 M (pH = 6), enthaltend ^®Kathon (mit 0,2%) und BSA mit 1%,
– Phosphat-Pufferlösung KH₂PO₄/K₂HPO₄ 0,1 M (pH = 7,5), enthaltend ^®Kathon (mit 0,2%), ^®Régilait (0,05–0,5%) und EDTA 2 mM,
– Phosphat-Pufferlösung KH₂PO₄/K₂PO₄ 0,1 M (pH = 7,5), enthaltend ^®Kathon (mit 0,2%), Casein (0,01–0,1%) und EDTA 2 mM,
– Phosphat-Pufferlösung KH₂PO₄/K₂PO₄ 0,1 M (pH = 7,5), enthaltend ^®Kathon (mit 0,2%) und BSR mit 1%.

Zusammensetzungen, welche Plasma oder Serum und eine der zuvor definierten Verbindungen der Erfindung enthalten, bilden ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung.
Bei Immundosierungsverfahren, welche als Standard oder Nachweis die Verbindungen enthalten, wie sie zuvor definiert wurden, bilden ebenfalls Teil der Erfindung.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Zusammenstellungen zum Einsatz bei Immundosierungen, welche wenigstens eine der zuvor definierten biepitopischen Verbindung und wenigstens eine Zusammensetzung, welche ein zuvor definiertes biepitopisches Peptid enthält, einschließen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung und werden nicht einschränkend gegeben.
BEISPIEL 1:
Herstellung von synthetischen biepitopischen Verbindungen gemäß der Erfindung.
A. Herstellung des Trägermoleküls.
Man stellt ein cyclisches Peptid der Formel her:
wobei der Kode der Kode in Buchstaben ist.
Dieses Peptid wird in fester Phase nach einer 1963 von Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, S. 2149–2154) beschriebenen Arbeitsweise hergestellt, wie diese zuvor beschrieben wurde.
Für die Synthese der oben genannten Verbindung verwendete man als Syntheseeinrichtung die Syntheseeinrichtung 9050 Plus Synthesizer und als Harz das Harz Fmoc Ala Nova Syn. Die unterschiedlichen Etappen der Synthese sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt: Tabelle II: Stufen der Synthese
Dc* bezeichnet Doppelkupplung. Eine Doppelkupplung kann zur Erhöhung der Reinheit des Peptides durchgeführt werden.
Am Ende der Synthese wird das Harz mit Dimethylformamid, dann mit Dichlormethan gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Anschließend wird as Harz mit einer Lösung behandelt, welche Essigsäure, Methanol und Dichlormethan (5/1/4 V/V/V) enthält. Das Harz wird von dem Peptid in Lösung durch Filtration isoliert. Das Filtrat wird konzentriert, und das Peptid durch Ausfällung mit gekühltem Ether isoliert. Man erhält auf diese Weise 0,145 g der Verbindung.
Das Peptid wird anschließend in folgender Weise cyclisiert:
100 mg der Verbindung werden in 18 ml Dimethylformamid, zu welchen aufeinander folgend 2 Äquivalente BOP, 2 Äquivalente HOBt und 5 Äquivalente DIEA zugesetzt werden, aufgelöst.
Nach zwei Stunden der Reaktion wird das cyclisierte Peptid in einem Scheidetrichter extrahiert.
Die organische Phase wird anschließend über Na₂SO₄ getrocknet, dann im ^®Rotavapor oder mit Hilfe eines beliebigen anderen geeigneten Rotationsverdampfers konzentriert. Das cyclisierte Peptid wird anschließend in einer Mischung von Ether, Ethylacetat und Hexan (6/3/1) (V/V/V) während 15 Stunden bei 0°C ausgefällt. Man erhält 70 mg des cyclisierten Peptids, d.h. 70 mg Trägermolekül.
B. Herstellung von biepitopischen synthetischen Verbindungen gemäß der Erfindung.
8 mg Trägermolekül (d.h. wie oben cyclisiertes Peptid), aufgelöst in einem Gemisch DMF/Puffer (1/3/2/3), werden durch 6 Äquivalente von tropfenweise zugesetztem _sSMCC aktiviert. Die Reaktion wird unter Rühren während ungefähr 45 Minuten bei 18–25°C aufrechterhalten. Das aktivierte Trägermolekül wird von dem Überschuß von _sSMCC durch HPLC getrennt. Die reinen Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. Man erhält 4,5 mg aktiviertes Trägermolekül (Ausbeute ≈ 45%).
2 mg aktiviertes Trägermolekül werden in einem Puffer PBS pH 6,5 aufgelöst. Zu dieser Lösung werden 2 Äquivalente (d.h. 8 mg) des Peptids TRP 1116 Ac zugesetzt, entsprechend:
Die peptidischen Sequenzen zwischen den Klammern stellen Epitope für Troponin I dar.
Die Reaktion wird unter Rühren während vier Stunden bei 18–25°C aufrechterhalten.
Die auf diese Weise erhaltene Verbindung gemäß der Erfindung wird anschließend entsalzt (HPLC/Dialyse).
Ihre Molekülmasse wird durch Massenspektrometrie bestimmt (gemäß dem. Protokoll, angegeben in dem Werk Synthetic Peptides A user's guide, herausgegeben von Gregory A. Grant (UWBC Biotechnological Resoure Series, Richard R. Burgess Reihe, Herausgeber), 1992, im Kapitel 4: Einstufung des Endproduktes.
In gleicher Weise stellt man die Verbindung gemäß der Erfindung PEP 5, PEP 9 und PEP 10 mit den folgenden Formeln her:

– Verbindung PEP 5:
– Verbindung PEP 9:
– Verbindung PEP 10:

Die Ergebnisse der Stabilität und der Linearität der Verdünnung von Verbindungen gemäß der Erfindung werden im Folgenden angegeben:
BEISPIEL 2:
Stabilität von Verbindungen gemäß der Erfindung.
Die Stabilität der Verbindungen PEP5, PEP9 und PEP10 wurde mittels ELISA-Versuch unter Bestimmung der Chemilumineszenz (Signal ausgedrückt in relativen Einheiten der Lumineszenz oder URL) mit Hilfe des Automaten Access^® der Firma Beckmann, vertrieben durch Bio-Rad (Marnes la Coquette, Frankreich), anschließend mit derjenigen einer biepitopischen Vergleichsverbindung, welche nicht cyclisiert ist, des Standes der Technik (TRP 1116 Ac), welche in gleicher Weise analysiert wurde, verglichen.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III wiedergegeben.
Die Verbindung des Standes der Technik TRP 1116 Ac ist nicht stabil am Tag + 24 Stunden und darüber bei +4°C.
Die Verbindungen gemäß der Erfindung PEP5, PEP9 und PEP10 sind alle bei +4°C nach 3 Monaten stabil, sogar 6 Monate für PEP9 und 12 Monate für PEP5.
BEISPIEL 3:
Ergebnisse der Linearitäten der Verdünnungskurven.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 5 wiedergegeben.
Angenommene Norm von Verdünnungen: das Verhältnis von experimentellem Signal/theoretischem Signal bei einer vorgegebenen Verdünnung muss gleich 1,00 + 0,2 sein, damit die Verbindung verdünnungsfähig ist. Die Verdünnungen, welche Signale unterhalb 100 000 Einheiten URL geben, dürfen nicht berücksichtigt werden.
Ergebnisse, ausgedrückt in Signaleinheiten (URL)
TABELLE 5
Die Verdünnungskurven von Verbindungen gemäß der Erfindung PEP 5, PEP 9 und PEP 10 weisen noch eine gute Linearität auf, selbst bei starken Verdünnungen, im Gegensatz zum Peptid TRP 1116 Ac.
Infolgedessen können zuverlässige Ergebnisse mit den Verbindungen gemäß der Erfindung erhalten werden: diese erweisen sich nicht nur von einer größeren Stabilität als die Verbindungen des Standes der Technik, sondern sie erlauben darüber hinaus noch den Erhalt einer linearen Verdünnungskurve. Anders ausgedrückt, sie lösen das gestellte Problem.
Sequenz-Auflistung

Claims

Synthetische Verbindung, umfassend: – ein Trägermolekül, das eine peptidische Kohlenwasserstoffkette besitzt, gebildet a) durch Verknüpfungen von 7 bis 50 Aminosäuren, die eine offene Kohlenwasserstoffkette bilden, welche wenigstens eine Verknüpfung umfasst, die Steifigkeit in das Molekül derart einführt, dass die durch die Atome der Kohlenwasserstoffkette gebildeten Verknüpfungen nicht mehr alle in freier Rotation sind; oder b) durch Verknüpfungen von 8 bis 50 Aminosäuren, die einen Ring bilden, wobei diese Kohlenwasserstoffkette wenigstens zwei Reste umfasst, ausgewählt in der Gruppe, welche durch Aminosäuren mit basischen Seitenketten, Aminosäuren mit negativ geladenen Seitenketten, Aminosäuren mit hydroxylierten Seitenketten und Aminosäuren mit Schwefel enthaltenden Seitenketten gebildet wird, welche die Pfropfung der Seitenarme auf dieser Kohlenwasserstoffkette erlauben; und – wenigstens zwei verschiedene Epitope für Troponin I, die auf diesen gepfropften Seitenarmen auf diesem Trägermolekül getragen sind.
Synthetische Verbindung gemäß Anspruch 1, in welcher diese zwei Reste, die das Pfropfen der Seitenarme auf dieser Kohlenwasserstoffkette erlauben, Lysine sind.
Synthetische Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, in welcher diese Kohlenwasserstoffkette einen Prolinrest umfasst.
Synthetische Verbindung gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, in welcher jeder dieser Seitenarme wenigstens zwei verschiedene Epitope für Troponin I trägt.
Synthetische Verbindung gemäß Anspruch 4, in welcher jeder dieser Seitenarme zwei verschiedene Epitope von Troponin I trägt.
Synthetische Verbindung gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, in welcher zwei aufeinanderfolgende Seitenarme, welche die Epitope tragen, durch Aminosäuren getragen werden, die voneinander durch eine Zahl von 2n + 1 Aminosäuren getrennt sind, worin n eine ganze Zahl darstellt und zwischen 1 und 6 liegt.
Synthetische Verbindung gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, in welcher die Kohlenwasserstoffkette von peptidischer Art die Folge umfasst: X₁-A₁-A₂-A₃-A₄-A₅-X₂-A₆, in welcher -X₁ und -X₂, gleich oder verschieden, die Seitenarme tragen und ausgewählt sind unter einer Aminosäure mit basischer Seitenkette, einer Aminosäure mit negativ geladener Seitenkette, einer Aminosäure mit hydroxylierter Seitenkette und einer Aminosäure mit Schwefel enthaltender Seitenkette, wobei X₁ und X₂ bevorzugt Lysin darstellen, -A₁ und -A₂ eine Aminosäure darstellen, ausgewählt unter Prolin, Phenylalanin, Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin, mit der Maßgabe, dass eines von A₁ und A₂ unter Prolin und Phenylalanin ausgewählt ist, -A₃ eine Aminosäure darstellt, ausgewählt unter Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin, bevorzugt Glycin, -A₄ eine Aminosäure darstellt, ausgewählt unter Arginin und Histidin, bevorzugt Arginin, -A₅ eine Aminosäure darstellt, ausgewählt unter Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin, bevorzugt Alanin, und -A₆ eine Aminosäure darstellt, ausgewählt unter Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin, bevorzugt Glycin.
Synthetische Verbindung gemäß Anspruch 7, in welcher die Kohlenwasserstoffkette von peptidischer Art eine Sequenz umfasst, ausgewählt in der Gruppe, gebildet durch die Sequenzen:
Synthetische Verbindung gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, in welcher jedes Epitop wenigstens eine Sequenz umfasst, die in der Gruppe ausgewählt ist, gebildet durch die Sequenzen:
Synthetische Verbindung gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, in welcher das Trägermolekül aus der Gruppe ausgewählt ist, die gebildet ist von:
Verwendung einer synthetischen Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 als Standard oder Nachweis für Immundosierungen von Troponin I.
Zusammensetzung, enthaltend wenigstens eine Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 in Lösung in Wasser, im Plasma oder in der Pufferlösung.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung unter Phosphat-, Succinat- und Tris-HCl-Pufferlösungen ausgewählt ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 13, in welcher die Pufferlösung in der Gruppe ausgewählt ist, die durch folgende Lösungen gebildet wird: – Succinat-Pufferlösung (pH = 5–6), enthaltend ^®Kathon, Règilait und EDTA, – Succinat-Pufferlösung (pH = 5–6), enthaltend ^®Kathon, Règilait, Casein und EDTA, – Succinat-Pufferlösung (pH = 5–6), enthaltend ^®Kathon und BSA, – Phosphat-Pufferlösung (KH₂PO₄/K₂HPO₄ pH 6,5–7,5), enthaltend ^®Kathon, Règilait und EDTA, – Phosphat-Pufferlösung (KH₂PO₄/K₂HPO₄ 0,1 M pH 6,5–7,5), enthaltend ^®Kathon, Casein und EDTA, – Phosphat-Pufferlösung (KH₂PO₄/K₂HPO₄ 0,1 M pH 6,5–7,5), enthaltend ^®Kathon und BSA.
Verfahren zur Immundosierung, welches als Standard oder Nachweis wenigstens eine synthetische Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 verwendet.
Verfahren gemäß Anspruch 15, bei welchem die Immundosierung von Sandwich-Typ ist.
Zusammenstellung für Immundosierung, umfassend: – wenigstens eine synthetische Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 oder eine Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 12 bis 14, – wenigstens einen Reaktionsteilnehmer, der bei der Durchführung einer Immnundosierung üblichweise eingesetzt wird.