JP2003507711A - 免疫検定用の2個のエピトープを保持する合成化合物 - Google Patents
免疫検定用の2個のエピトープを保持する合成化合物Info
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Abstract
Description
して使用することができる合成化合物、その調製方法、そのような化合物を含有
する組成物およびキット、ならびにそのような化合物を用いた免疫検定法に関す
る。
維のタンパク質複合体であることが知られている。このタンパク質複合体は、ミ
オシンおよびアクチンとの相互作用によりそれがCa2+イオンによる筋収縮の制
御に寄与することを可能にしている。より正確には、神経の刺激が筋の運動終板
のレベルに達すると、筋小胞体に伝達される活動電位が発生することが知られて
いる。次いでCa2+がサイトゾル中に放出され、トロポニンCと結合し、トロポ
ニンIとトロポニンCの間の相互作用を強め、その結果トロポニンI、T、C複
合体の高次構造の変化をもたらす。次いで筋収縮運動を可能にするアクチン−ミ
オシン相互作用の部位が解放される。
わった時の骨格筋であろうと筋が損傷すると、解放されるトロポニンが多かれ少
なかれ血流中に急速に現れる。
定でも、「Am. Heart J.」 110、1333-1344 (1987)および「Molecular Immunolo
gy」 29 (2)、271-278 (1992) 中のトロポニンIの検定でも、トロポニンの検定
は心筋梗塞の早期診断のために推奨されている。同様に、心筋梗塞後の血栓融解
治療が成功したかどうかを測定するための心筋のトロポニンTの検定が「Br. He
art J.」71、242-248 (1994)で提案され、また骨格筋の損傷を測定するための骨
格のトロポニンIの検定(American Association for Clinical Chemistry, 46t
h National Meeting, New Orleans, 1994年7月17〜21日の抄録第35号)も提案
されている。様々な心筋および骨格のトロポニンの検定が今日、ヒトおよび動物
の病状診断に非常に役に立つ手段であることに注目されたい。
すなわち標識または別の方法による抗体、顕現剤、および希釈液)に加えて、試
験される試料と類似の条件下で用いられ、結果を計算するための参照としておよ
び/または正の制御として働くことになる、判定すべき化合物に対する標準の製
造業者による供給が必要である。
態(ユーザーがその化合物を使用前に溶解することになる溶媒を添えた)または
すぐ使える精製された上記化合物を使用することができる。
は対照溶液は、用量単位で凍結され−80℃で貯蔵される。さらにこれらの溶液
は、たとえプロテアーゼ阻害剤または抗菌剤を加えたとしても+4℃で数時間を
超えて安定ではないことが観察された。したがってユーザーは使用直前にその標
準溶液を調製することが必要である。
IまたはT、具体的にはトロポニンIまたはトロポニンT 1当量当たりトロポニ
ンC 1〜10モル当量の割合と塩化カルシウムを含有する水溶液からなることを特
徴とする免疫検定用のトロポニンIまたはTの安定化した組成物が開示されてい
る。この技術は、より大きなまたはより小さな程度まで希釈したトロポニンIま
たはトロポニンTの標準溶液を+4℃で数日間保存することを可能にする。
ロポニンCによって形成される三重複合体から構成されるトロポニンの標準溶液
について記述している。
、こうして得られた標準または対照は+4℃で約1ヶ月間安定である。
用の免疫原として有用な幾つかの合成ペプチドについて記述している。これらの
ペプチドの幾つかは、国際公開第94/15217号が対象範囲とする発明の主題である
抗体を用いたトロポニンIの免疫検定の標準として使用することができる。
て心筋のトロポニンIを検定する方法に関する。これらの抗体は、骨格筋のトロ
ポニンIのない、したがって心筋のトロポニンIに特異的な配列を有するペプチ
ド断片から調製することができる。しかしながらこの出願は、トロポニンIの免
疫検定における標準としてある種のペプチドを使用する可能性については開示し
ておらず、また示唆もしていない。
液について記述していることもまた知られている。これらの溶液は、特にタンパ
ク質またはペプチドの診断検査に用途が見出される。
なことが分かっているトロポニンI断片の安定性を増すことさえも可能にする。
パク質(>100 KD)またはポリマーなどのキャリヤー分子と結合した1以上のペ
プチドから構成されるトロポニンIの標準について記述している。
に対する活性部位を含有する合成による標準について記述している。この出願は
、より具体的にわずか3週間のみ溶液中で安定なトロポニンT用の合成による標
準について記述している。
用することができる合成ビエピトープ化合物ついて記述している。
ーによって相互に結合したトロポニンIの2つの異なるエピトープペプチド配列
を含む線状構造からなり、これに加えてその2個のエピトープはそれぞれそのN
およびC末端により付加的なペプチド配列と結合してもよい。
十分な希釈直線性は示さない。
られる信号を表す関数を意味するものと理解され、それは理想的には直線によっ
て表されるはずである。
成される枝を含むペプチド性の母体からなる合成のペプチド構造が、国際公開第
95/04543号で知られている。
設計するために有用である。
るエピトープ配列を保持する分岐サイドアームを備えた国際公開第95/04543号に
記載の型の分岐構造が、4℃の溶液中で高い安定性とすぐれた希釈直線性の両方
を示すトロポニンI検定のための免疫検定用の標準または対照を提供するという
発見を可能にした。
少なくとも12個、好ましくは少なくとも14個、かつ多くとも300個、有利
には多くとも100個、好ましくは多くとも50個の原子を有し、しかも炭化水
素鎖上にサイドアームをグラフトすることを可能にする反応性のあるまたは反応
することが可能な少なくとも2個の官能基を備えた炭化水素鎖を持つキャリヤー
分子と、 上記キャリヤー分子上にグラフトされた上記サイドアームによって保持された
少なくとも2個の異なるエピトープ、 とを含む少なくとも1種類の合成化合物の生体分子、特にポリペプチドまたはタ
ンパク質の免疫検定用の標準または対照としての使用法である。
〜300、有利には10〜100、好ましくは10〜50の整数)で形成するこ
とができ、上記鎖は、問題のエピトープを保持するサイドアームを上記炭化水素
上へグラフトすることを可能にする少なくとも2個の原子または基、具体的には
アミノ、ヒドロキシル、チオール、カルボキシル、またはカルボニル基が炭化水
素鎖または炭化水素鎖の置換基に割り込むメンバーとして存在するという条件で
、O、S、N、P、およびSiなどの1以上のヘテロ原子またはヘテロ基、特に
窒素含有ヘテロ基によって、および/またはハロゲン、(C6〜C12)アルキル、
(C6〜C12)アリール、(C6〜C12)アリール−(C1〜C12)アルキル、アルコキ
シ、ヒドロキシル、アルデヒド、(C1〜C12)アルキルカルボニル、アミノ、チ
オ、カルボキシル、オキソ、ヒドロキシ−(C1〜C12)アルキル、チオ(C1〜C12 )アルキル、カルボキシ−(C1〜C12)アルキル、アミノ(C1〜C12)アルキル、
あるいはヘテロ環が特にO、S、=N、またはNR(Rは水素原子またはC1〜C1 2 アルキル基)である飽和または不飽和のヘテロ環式のC1〜C12の基などの原子ま
たは基で置換された1以上のヘテロ原子またはヘテロ基によって割り込まれてい
る。
または反応することが可能な官能基の最小限のスペースを有することが望ましい
。
のサイズの少なくとも9原子の間隔、あるいはペプチド性の炭化水素鎖の場合に
は少なくともアミノ酸3個の間隔に相当する少なくとも40Åだけ離して配置さ
れることが好ましい。
の1以上と抗体との免疫反応中に、上記アームの間のステアリン酸障害または相
互作用が生じないようにキャリヤー分子上に配列されることが好ましい。
が非平行配列、好ましくは反対方向に配列するように炭化水素鎖中にねじれまた
は剛性を導入することにより相互作用を避けることができる。
然のアミノ酸、あるいは非天然のアミノ酸からなるオリゴペプチドまたはポリペ
プチドである。
ない、または不活性化した反応性の側鎖を含有する2n+1個のアミノ酸(ただ
しnは整数を表し、有利には1〜6である)により相互に分離された上記で規定
した2個のアミノ酸によって保持されることが好ましい。好ましくはn=2であ
るが、n=3、n=4、およびn=5の値でもよい結果が得られる。
オリゴペプチドまたはポリペプチドのすべての原子は回転が自由な結合、すなわ
ち環外の結合を形成する。
相互作用を避けることを可能にする2つの連続するサイドアームの間の間隙は、
アミノ酸によって保持された2つの連続するサイドアームが上記の間隔の条件に
相当する場合に得られる(すなわち「2n+1」)。
の原子によって形成される結合がすべて自由回転することがないように分子中に
剛性を導入する少なくとも1つの結合を含む。
はそれのみではない場合、これは例えばsP2炭素原子を意味してもよい。
一方のサイドアームの原子の間の相互作用を避けることを可能にする2つの連続
するサイドアームの間の間隙は、サイドアームを保持するアミノ酸の間に2n+
1個(nは上記の定義による)のアミノ酸間隙をとることにより、またはペプチ
ド鎖にその鎖中に剛性を生じさせる環状アミノ酸を導入することにより、または
これら選択肢のどちらも同時に考慮に入れることによって得られる。 キャリヤー分子の剛性は例えば、プロリン残基によって付与することができる
。
プチドの鎖は閉じて環を形成する。
配列は、式 X1−A1−A2−A3−A4−A5−X2−A6 に相当し、 上式でX1およびX2は、同じでも異なっていてもよく、サイドアームを保持す
るアミノ酸であり、塩基性の側鎖をもつアミノ酸、ヒドロキシル化された側鎖を
もつアミノ酸、およびイオウを含有する側鎖をもつアミノ酸から選択され、X1
およびX2は好ましくはリシンを表し、 A1およびA2は、A1およびA2の一方がプロリンおよびフェニルアラニンから
選択されるという条件で、プロリン、フェニルアラニン、グリシン、アラニン、
バリン、ロイシン、およびイソロイシンから選択されるアミノ酸を表し、 A3は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンから選
択されるアミノ酸を表し、好ましくはグリシンであり、 A4は、アルギニンおよびヒスチジンから選択されるアミノ酸を表し、好まし
くはアルギニンであり、 A5は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンから選
択されるアミノ酸を表し、好ましくはアラニンであり、 A6は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンから選
択されるアミノ酸を表し、好ましくはグリシンである。
のアミノ酸で、かつ多くとも100個、有利には50個、好ましくは30個のア
ミノ酸、特に20個のアミノ酸、また環状の場合には少なくとも8個、好ましく
は少なくとも10個で、かつ多くとも100個、有利には50個、好ましくは3
0個、特に20個のアミノ酸の結合のみからなり、しかもそれは塩基性の側鎖を
もつアミノ酸、具体的にはリシン;負に帯電した側鎖をもつアミノ酸、具体的に
はグルタミン酸またはアスパラギン酸;ヒドロキシル化された側鎖をもつアミノ
酸、具体的にはセリンおよびトレオニン;およびイオウを含有する側鎖をもつア
ミノ酸、具体的にはシステイン;から選択される少なくとも2個の残基を含むこ
とが好ましく、リシンは〔ラクナ〕のものである。
くは約8 kDaを超えない。本発明による好ましいキャリヤー分子は約5 kDa未満の
分子質量を有する。望ましい最小分子質量は一般に約1±0.2 kDaである。
生体分子の任意のエピトープからなる。
-278 (1992))、Bodor等(Clin. Chem. Vol.38, No.11, 2203-2214 (1992))、G
ranier等(Protein Science, vol.6, suppl. 1, p.61 (1997))によって記述さ
れた、また国際公開第94/15217号中に記述された抗体を挙げることができる。こ
れら抗体の大部分は市販されている(Hytest LTD, Turku, Finland)。抗体11E1
2および8E1が特に好ましい。
数コピー、具体的には2、3、または4コピーとして存在することができる。 後者の場合、同一エピトープの2つのコピーが同一のサイドアーム上または2
つの異なるサイドアーム上に存在することができる。
による化合物の合成を厳しく制御するのが有利であり、手順書、Gregory A. Gra
ntによって発表された「Synthetic Peptides A user’s guide」 (UWBC Biotech
nological Resource Series, Richard R. Burgess series editor (1992)) の第
4章Evaluation of the finished productを用いることができる。下記参照。
プを含まないことが好ましい。 エピトープが2コピーを超えて存在する場合には、それらは同数の追加のサイ
ドアームによって保持されることが好ましい。 同一のサイドアーム上に2コピーが存在する場合には、エピトープE1およびE2
は有利にはペプチド性または非ペプチド性のリンカーZにより相互に分離される
。
具体的にはトロポニンIの一部を一緒には形成しないという条件で、アミノ酸1
〜40個、好ましくは3〜20個のペプチド配列か、
の線状または分岐したアミノ(C1〜C10)アルキルカルボニル鎖からなる混合構
築物を表すことができる。
なくともアミノ酸1個、好ましくはアミノ酸2個、特にアミノ酸5個の非保存的
置換、欠失、または挿入によるトロポニンIの与えられた断片と異なる場合、検
定すべき生体分子、具体的にはトロポニンIの配列の一部ではないと考えられる
。
またpep1およびpep2は同一でも異なっていてもよくアミノ酸2〜10個を含有す
るペプチド鎖を表す)を表すことができる。
端、またはE1−Z−E2によって形成される結合のNおよびC末端にそれぞれ付
加的な基、Z1およびZ2を備える。
0個のα−アセチル化したN末端のペプチド配列;システイニル、ビオチニル、
またはビオシチニル基;システイニル、アミノ、ヒドロキシル、ハロ、カルボキ
シル、ビオチニル、またはビオシチニル残基を保持するアミノ酸1〜10個のペ
プチド配列か、 線状または分岐したアミノ(C1〜C10)アルキルカルボニル鎖か、 線状または分岐したN−α−アセチル化したアミノ(C1〜C10)アルキルカル
ボニル鎖か、 アミノ酸1〜10個の少なくとも1つのペプチド配列、および少なくとも1つ
の線状または分岐したアミノ(C1〜C10)アルキルカルボニル鎖からなる混合構
築物か、または アミノ酸1〜10個の少なくとも1つのペプチド配列と、アミノ、ハロ、ヒド
ロキシル、カルボキシル、ビオチニル、ビオシチニル、またはシステイニル残基
を保持する少なくとも1つの線状または分岐したアミノ(C1〜C10)アルキルカ
ルボニル鎖とからなる混合構築物を表す。
;および末端のアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロ、システイニル、ビ
オチニル、またはビオシチニル基を保持するアミノ酸1〜10個のペプチド配列
か、 線状または分岐したアミノ(C1〜C10)アルキルカルボニル鎖か、 ヒドロキシルラジカルまたはアミノラジカルを保持する線状または分岐したア
ミノ(C1〜C10)アルキルカルボニル鎖か、 アミノ酸1〜10個の少なくとも1つのペプチド配列、および少なくとも1つ
の線状または分岐したアミノ(C1〜C10)アルキルカルボニル鎖からなる混合構
築物か、または ヒドロキシルラジカルまたはアミノラジカルを保持する、アミノ酸1〜10個
の少なくとも1つのペプチド配列および少なくとも1つの線状または分岐したア
ミノ(C1〜C10)アルキルカルボニル鎖からなる混合構築物を表す。
ペーサーはキャリヤー分子によって保持された反応基と、またZ1およびZ2とそ
れぞれ反応するように選択された2種類の反応性官能基をその末端に備えた二官
能性の基であることができる。
ピトープを含み、またZ、Z1、およびZ2基は天然および/または非天然アミノ
酸からなるのが好ましい。
たキャリヤー分子を準備すること、 段階B:任意にそのキャリヤー分子を環化すること、 段階C:そのキャリヤー分子の反応基と反応性のある少なくとも1個の官能基
を備えたサイドアーム形成用の分子を準備すること、 段階D:適切な条件下でサイドアームのカップリングとキャリヤー分子のカッ
プリングを行なうこと。
記の段階は下記の段階からなる。
を含有する少なくとも2個のアミノ酸残基を備えたオリゴペプチドまたはポリペ
プチドを準備すること。
はそれらが通例の保護基を用いて一時的に保護されるように選択される。
うこと。
ルオロリン酸ベンゾトリアゾリル−オキシ−トリス(ジメチルアミノ)ホスホニ
ウム/1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(BOP/HOBt)の対を介して得ることが
できる。
々保持する保護されていないサイドアームのペプチドを準備し、次いで 段階D:本発明による合成化合物を含有するように、サイドアームを形成する
ペプチドで上記オリゴペプチドまたはポリペプチドをカップリングすること。
MCCを介して活性化されるアミノ官能基である。
ムのペプチドの-SH残基とキャリヤー分子のマレイミド基の間の求核置換反応に
よって行なわれる。
ペプチド化学の従来の方法によって得られる。
ドは、「J. Amer. Chem. Soc.」85、2149-2154 (1963) のR. B. Merrifieldの論
文;「Peptides 1971」(Nesvadba H.編、North Holland, Amsterdam, p.111)
中のR. C. Sheppardの記述;「Solid phase Peptide Synthesis, a practical a
pproach」(IRL PRESS, Oxford University Press, p.25-34 (1989))中のE. At
hertonおよび R. L. Sheppardの記述に記載されている従来の方法による固相合
成によって得ることができる。
Perspective製の「Pioneer」、またはABI製の「433A」を用いることができる。
らない。例えば合成装置「9050 Plus Pep Synthesizer」上で合成するには、い
わゆる「定常流」の技術に適した樹脂を使用することが推奨され、PEG PS樹脂が
この基準を満たす。これらの担体は、ビーズのポリスチレンの官能基と第一アミ
ノ酸の付着点の間に位置するポリエチレングリコール(PEG)を基材とするスペ
ーサーアームからなる。この固定点の性質は選択されるC末端の官能基により変
わる可能性がある。例えばアミドの形態のペプチドに対してはPAL PEG PS型の樹
脂を採用することができるはずである。
。さらにこれらは合成後いわゆる穏やかな酸性条件下でペプチドを放出すること
ができるという利点を有し、アミノ酸の側鎖が化学的な基によって未だ保護され
たままのペプチド断片を得ることを可能にする。
rSeptive-Biosystem、Perkin-Elmer、Novabiochem)である。
キシカルボニル(Fmoc)基の助けを借りて行なうことができる。脱保護は、ジメ
チルホルムアミドに溶かしたピペリジンの20%溶液で行なうことができる。
)および1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)が用いられる。
樹脂が用いられる。
タン)、真空下で乾燥し、次いで酸をベースとする溶液で処理する。
向に一列に並んだ(head-to-tail)」環化を行なうことができる。この段階に関
してはペプチドはDMFに溶解し、カップリング剤はジイソプロピルエチルアミン
(DIEA)またはN−メチルモルホリン(NMM)などの塩基の存在下のBOP/HOBtの
対である。抽出後、環化したペプチドを沈殿させ、次いでエーテルベースの溶液
で洗浄する。
再度沈殿させ、エーテルで洗浄する。
合成後、樹脂を有機溶剤(ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン)で洗浄し、
真空下で乾燥し、次いで適切なスカベンジャーを含有する0℃に冷却したトリフ
ルオロ酢酸ベースの溶液で処理する。例えば、トリフルオロ酢酸82%、フェノ
ール5%、チオアニソール5%、およびエタンジチオ−ル3%を含有するK試薬
を用いることが可能かも知れない。 サイドアームを形成するペプチドは、具体的には国際公開第98/24816号に記載
のように得ることができる。 次いでこうして単離された合成ペプチドをエーテルで沈殿させる。
、その純度を質量分析法により決定する。相としては、例えばBondapak C-18相
を用いることができる。ペプチドを2種類の緩衝液の間の直線勾配により溶出し
、その第一部は本質的に水性(例えば、水およびTFA 0.1%)であり、その第二部
はむしろ有機性(例えば、アセトニトリル60%、水40%、およびTFA 0.08%を含有
する混合物)である。集められた純粋な画分を一緒にし、真空下で濃縮し、凍結
乾燥し、その純度を手順書、Gregory A. Grantによって発表された「Synthetic
Peptides A user’s guide」 (UWBC Biotechnological Resource Series, Richa
rd R. Burgess series editor (1992)) の第4章Evaluation of the finished p
roduct中に示されているように質量分析法によって検査する。
的結合を可能にする二官能性の基で、キャリヤーのオリゴペプチドまたはポリペ
プチドのある特定の構成アミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、システインな
ど)の側鎖の官能基を活性化する。この型の結合に用いることができる上記で標
的にされる側鎖の例としては、アミノ(第一/第二)、カルボキシル、チオール
、水酸化物、およびアルデヒド基などを保持する鎖を挙げることができる。
る。すなわち、 BS3:スベリン酸ビス(スルホスクシニミジル) sSMCC:シクロヘキサン−1−カルボン酸(スルホスクシニミジル−4−N−
マレイミド−メチル) BMH:ビス−マレイミドへキサン DSG:グルタル酸ジスクシニミジル 5MBS:m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスルホスクシミドエステル MPBH:水酸化4−(4−N−マレイミドフェニル)酪酸 EDC:1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピラート)−カルボジイミ
ド
術を用いてこのような化合物の純度を検証することができる。さらに当業技術者
ならば、分光測定法によって有効に測定される上記化合物の分子質量が、出発分
子(キャリヤー分子、エピトープなど)の分子質量に照らして予想される分子質
量に確かに相当することをはっきりと曖昧でなく確認することができる。したが
って本発明は、当業技術者が自分が行なっている合成を精密に制御し、自分が何
をしているかを正確に知ることを可能にする。
を備えた化合物である。
よびFAEL、あるいはその後者を含む配列を挙げることができる。
発明の化合物を含有する組成物である。
る水溶液または組成物である。緩衝液としては例えば、Kathon(登録商標)およ
びウシ血清アルブミン(BSA);あるいはKathon(登録商標)、Regilaitv(登
録商標)、およびEDTA;あるいはKathon(登録商標)、Plasmion(登録商標)お
よび任意にEDTA;あるいはKathon(登録商標)、カゼイン、およびEDTAを含有す
るリン酸緩衝液(KH2PO4/K2HPO4、pH=6.5〜7.5)を用いることができる。
n(登録商標)、Regilait(登録商標)、およびEDTA;あるいはKathon(登録商
標)、Plasmion(登録商標)および任意にEDTA;あるいはKathon(登録商標)、
カゼイン、およびEDTAを含有するコハク酸緩衝液(pH=5〜6)またはトリス−HCl
緩衝液(pH=7.5〜8.5)を用いることもできる。
含有する緩衝液を用いることもできる。
たはリン酸緩衝液の使用が好ましい。
は、5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オンおよび2−メチル
−4−イソチアゾリン−3−オン(1.5%)からなる。
粉乳である。
水に溶かした変性液状ゼラチン(30 g/l)、NaCl(5.382 g/l)、MgCl2(143 mg
/l)、KCl(373 mg/l)、乳酸ナトリウム(3.360 g/l)からなる。
M EDTAを含有する0.1Mコハク酸緩衝液(pH=6); Kathon(登録商標)(0.2%)、カゼイン(0.01〜0.5%)、および2mM EDTAを含
有する0.1Mコハク酸緩衝液(pH=6); Kathon(登録商標)(0.2%)および1% BSAを含有する0.1Mコハク酸緩衝液(pH
=6); Kathon(登録商標)(0.2%)、Regilait(登録商標)(0.05〜0.5%)、および
2mM EDTAを含有する0.1Mリン酸緩衝液KH2PO4/K2HPO4(pH=7.5); Kathon(登録商標)(0.2%)、カゼイン(0.01〜0.1%)、および2mM EDTAを含
有する0.1Mリン酸緩衝液KH2PO4/K2HPO4(pH=7.5);および Kathon(登録商標)(0.2%)および1% BSAを含有する0.1Mリン酸緩衝液KH2PO4 /K2HPO4(pH=7.5)。
、本発明の一部を形成する。
明の一部を形成する。
上記で規定したビエピトープ化合物を含有する少なくとも1種類の組成物を包含
する免疫検定を実施するためのキットに関する。
る。
149-2154 (1963))によって1963年に開発された技術により固相上で合成さ
れる。
、樹脂としてFmoc Ala Nova Syn樹脂を用いた。合成の様々な段階を下記の表II
にまとめる。
めるために行なうことができる。
、真空下で乾燥する。
溶液で樹脂を処理する。
冷エーテルで沈殿させて単離した。こうして化合物0.145gが得られる。
2当量、およびDIEA 5当量を相次いで加える。
の他の適切な回転式蒸発器を用いて濃縮する。次いでエーテル、酢酸エチル、お
よびヘキサンの混合物(6/3/1 v/v/v)から、環化されたペプチドを0℃で15
時間沈殿させる。環化されたペプチド70 mg、すなわちキャリヤー分子70 mgが得
られる。
記環化されたペプチド)8 mgにsSMCC 6当量を1滴ずつ加えて活性化させる。反
応物を18〜25℃で約45分間撹拌し続ける。活性化したキャリヤー分子をHP
LCによって過剰のsSMCCから分離する。純粋な画分を一緒にし、凍結乾燥する。
活性化したキャリヤー分子4.5 mgが得られる(収率約45%)。
にペプチドTRP 1116 Ac、すなわち、Ac-GSSNYRAYA-(TEPH)-AKK-Hx-PLELAGLG-(FA
EL)-QDLCRQ-NH2 2当量(すなわち8 mg)を加える。
された手順書、「Synthetic Peptides A user’s guide」(UWBC Biotechnologic
al Resource Series, Richard R. Burgess series editor (1992)) の第4章Eva
luation of the finished product中に示されている実験計画案による)。
調製した。
e, France)から販売されているBeckman社製の自動装置Access(登録商標)の助
けを借りた化学発光表示値(相対発光単位すなわちRLUで表される信号)を用い
たELISA検定によって評価し、次いで同じ方法で分析した従来技術の環化してい
ない参照用ビエピトープ化合物(TRP 1116 Ac)の値と比較した。
度に対する実験に基づく信号/理論に基づく信号の比が1.00±0.2と同等である
べきである。100,000 RLU未満の信号を示す希釈度は考慮に入れるべきではない
。 ** 安定性の受け入れ基準:許容される実施X日後の安定性については、1.00
±0.2と同等の実施時+X日後における信号/実施時における信号の比を得る必要
がある。 *** 0.2%のKathon、0.2%のRegilait、および2mM EDTAを含有する0.1Mコハク酸
緩衝液、pH 6.0(または0.2%のKathonおよび1%のBSAを含有する0.1Mコハク酸緩
衝液、pH 6.0)。
い。 本発明による化合物PEP 5、PEP 9、およびPEP 10はすべて+4℃で3ヶ月後も
安定であり、またPEP 9の場合は6ヶ月後、PEP 5の場合は12ヶ月後でさえ安定
である。
に対する実験に基づく信号/理論に基づく信号の比が1.00±0.2と同等であるべ
きである。100,000 RLU未満の信号を示す希釈度は考慮に入れるべきではない。
ドTRP 1116 Acとは異なり、高い希釈度でさえ未だよい直線性を示す。
これらが従来技術の化合物よりもすぐれた安定性をもつことが分かるだけでなく
、直線的な希釈曲線を得ることも可能になる。すなわちこれらは提起された問題
を解決する。
Claims (26)
- 【請求項1】 生体分子、特にポリペプチドまたはタンパク質の免疫検定用
の標準または対照として、 C、N、O、S、P、およびSiから選択された少なくとも10個、有利には
少なくとも12個、好ましくは少なくとも14個、かつ多くとも300個、有利
には多くとも100個、好ましくは多くとも50個の原子を有し、しかも炭化水
素鎖上にサイドアームをグラフトすることを可能にする反応性のあるまたは反応
することが可能な少なくとも2個の官能基を備えた炭化水素鎖を持つキャリヤー
分子と、 前記キャリヤー分子上にグラフトされた前記サイドアームによって保持された
少なくとも2個の異なるエピトープ、 とを含む少なくとも1種の合成化合物の使用法。 - 【請求項2】 炭化水素鎖、特にオリゴペプチドまたはポリペプチドを形成
する炭化水素鎖が、アミド結合により相互に結合したアミノ酸からなる、請求項
1に記載の使用法。 - 【請求項3】 エピトープを保持するサイドアームがグラフトされる反応性
官能基が、少なくとも9個の原子または少なくとも3個のアミノ酸によって分離
される、請求項2に記載の使用法。 - 【請求項4】 エピトープを保持する2つの連続するサイドアームが請求項
1で規定されたアミノ酸によって保持され、2n+1個(ただし、nは整数を表
し、1〜6である)のアミノ酸により相互に分離される、請求項2に記載の使用
法。 - 【請求項5】 炭化水素鎖、任意にオリゴペプチドまたはポリペプチドが開
鎖を形成する、前記請求項の1項に記載の使用法。 - 【請求項6】 炭化水素鎖、有利にはオリゴペプチドまたはポリペプチドの
原子が自由に回転できる結合を形成する、請求項5に記載の使用法。 - 【請求項7】 炭化水素鎖、有利にはオリゴペプチドまたはポリペプチドが
少なくとも1つの自由に回転できない結合、具体的には環状のメンバーを含む、
請求項5に記載の使用法。 - 【請求項8】 炭化水素鎖がオリゴペプチドまたはポリペプチド性のもので
あり、プロリン残基を含む、請求項7に記載の使用法。 - 【請求項9】 炭化水素鎖、有利にはオリゴペプチドまたはポリペプチドが
環を形成する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用法。 - 【請求項10】 オリゴペプチドまたはポリペプチドが配列 X1−A1−A2−A3−A4−A5−X2−A6 を含み、 上式でX1およびX2は、同一でも異なっていてもよくサイドアームを保持する
アミノ酸であり、塩基性の側鎖をもつアミノ酸、負に帯電した側鎖をもつアミノ
酸、ヒドロキシル化した側鎖をもつアミノ酸、およびイオウを含有する側鎖をも
つアミノ酸から選択され、X1およびX2が好ましくはリシンを表し、 A1およびA2は、A1およびA2の1つがプロリンおよびフェニルアラニンから
選択されるという条件で、プロリン、フェニルアラニン、グリシン、アラニン、
バリン、ロイシン、およびイソロイシンから選択されるアミノ酸を表し、 A3は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、好ま
しくはグリシンから選択されるアミノ酸を表し、 A4は、アルギニンおよびヒスチジン、好ましくはアルギニンから選択される
アミノ酸を表し、 A5は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、好ま
しくはアラニンから選択されるアミノ酸を表し、 A6は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、好ま
しくはグリシンから選択されるアミノ酸を表す、請求項2に記載の使用法。 - 【請求項11】 オリゴペプチドまたはポリペプチドが配列 −KGPGRAKG− −KGFGRAKG− −KPGGRAKG−および −KFGGRAKG− から選択される配列を含む、請求項10に記載の使用法。
- 【請求項12】 第一エピトープによって形成された結合、前記ペプチド配
列、および第二エピトープが一緒には生体分子の配列の一部を形成しないという
条件で、同一のサイドアーム上に保持されたエピトープが少なくとも1個の炭素
原子を含む炭化水素鎖によって相互に分離され、任意にN、O、S、P、および
Siから選択された少なくとも1個のヘテロ原子によって割り込まれており、前
記炭化水素鎖が任意に1〜40個のアミノ酸の結合からなる、前記請求項の1項
に記載の使用法。 - 【請求項13】 C、N、O、S、P、およびSiから選択された少なくと
も10個、有利には少なくとも12個、好ましくは少なくとも14個、かつ多く
とも300個、有利には多くとも100個、好ましくは多くとも50個の原子を
有し、しかも炭化水素鎖上にサイドアームをグラフトすることを可能にする反応
性の少なくとも2個の官能基を備えた炭化水素鎖を持つキャリヤー分子と、 前記キャリヤー分子上にグラフトされた前記サイドアームによって保持された
トロポニンIの少なくとも2個の異なるエピトープ、 とを含む合成化合物。 - 【請求項14】 炭化水素鎖が請求項2、または4から8のいずれか1項に
規定される、請求項13に記載の合成化合物。 - 【請求項15】 炭化水素鎖がペプチド性のものであり、かつエピトープを
保持するサイドアームをグラフトする反応性官能基が少なくとも3個のアミノ酸
によって分離される、請求項13または請求項11に記載の合成化合物。 - 【請求項16】 オリゴペプチドまたはポリペプチドが配列 X1−A1−A2−A3−A4−A5−X2−A6 を含み、 上式でX1およびX2は、同一でも異なっていてもよくサイドアームを保持する
アミノ酸であり、塩基性の側鎖をもつアミノ酸、負に帯電した側鎖をもつアミノ
酸、ヒドロキシル化した側鎖をもつアミノ酸、およびイオウを含有する側鎖をも
つアミノ酸から選択され、X1およびX2が好ましくはリシンを表し、 A1およびA2は、A1およびA2の1つがプロリンおよびフェニルアラニンから
選択されるという条件で、プロリン、フェニルアラニン、グリシン、アラニン、
バリン、ロイシン、およびイソロイシンから選択されるアミノ酸を表し、 A3は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、好ま
しくはグリシンから選択されるアミノ酸を表し、 A4は、アルギニンおよびヒスチジン、好ましくはアルギニンから選択される
アミノ酸を表し、 A5は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、好ま
しくはアラニンから選択されるアミノ酸を表し、 A6は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、好ま
しくはグリシンから選択されるアミノ酸を表す、請求項5に記載の合成化合物。 - 【請求項17】 オリゴペプチドまたはポリペプチドが配列 −KGPGRAKG− −KGFGRAKG− −KPGGRAKG−および −KFGGRAKG− から選択される配列を含む、請求項16に記載の合成化合物。
- 【請求項18】 最小エピトープが各々、 TEPH、 ALLGAR、および FAEL から選択される少なくとも1つの配列を含む、請求項13〜17のいずれか1項
に記載の合成化合物。 - 【請求項19】 反応性の側方官能基が塩基性アミノ酸、特にリシンのNH 2 基である、請求項13〜18のいずれか1項に記載の合成化合物。
- 【請求項20】 キャリヤー分子が5〜50個、有利には5〜30個、好ま
しくは7〜20個のアミノ酸を含むオープンペプチドであるか、または8〜50
個、有利には8〜30個、好ましくは10〜20個のアミノ酸を含む環状ペプチ
ドである、請求項13〜19のいずれか1項に記載の合成化合物。 - 【請求項21】 水、血漿、または緩衝液の溶液中に請求項13から20の
いずれか1項に記載の少なくとも1種類の化合物を含有する組成物。 - 【請求項22】 緩衝液がリン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、およびトリスH
Cl緩衝液から選択される、請求項21に記載の組成物。 - 【請求項23】 緩衝液が、 Kathon(登録商標)、Regilait(登録商標)、およびEDTAを含有するコハク酸
緩衝液(pH=5〜6)と、 Kathon(登録商標)、カゼイン、およびEDTAを含有するコハク酸緩衝液(pH=5
〜6)と、 Kathon(登録商標)およびBSAを含有するコハク酸緩衝液(pH=5〜6)と、 Kathon(登録商標)、Regilait(登録商標)、およびEDTAを含有するリン酸緩
衝液(KH2PO4/K2HPO4、pH=6.5〜7.5)と、 Kathon(登録商標)、カゼイン、およびEDTAを含有するリン酸緩衝液(KH2PO4 /K2HPO4、0.1M、pH=6.5〜7.5)と、 Kathon(登録商標)およびBSAを含有するリン酸緩衝液(KH2PO4/K2HPO4、0.1M
、pH=6.5〜7.5) とからなる群から選択される、請求項16および17のいずれかに記載の組成物
。 - 【請求項24】 請求項13〜20のいずれか1項に記載の少なくとも1種
類の合成化合物を標準または対照として用いる免疫検定法。 - 【請求項25】 免疫検定がサンドウィッチ式のものである、請求項24に
記載の方法。 - 【請求項26】 請求項13〜20のいずれか1項で規定した少なくとも1
種類の合成化合物または請求項21〜23のいずれか1項に記載の組成物と、 免疫検定を行なうための少なくとも1種類の通例の試薬、 とを含む免疫検定キット。
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