WO2013014312A1

WO2013014312A1 - Polipeptidos quimericos derivados de la proteina vimentina con utilidad para el diagnostico de la artritis reumatoide

Info

Publication number: WO2013014312A1
Application number: PCT/ES2012/070555
Authority: WO
Inventors: Isabel Haro Villar; María José GÓMARA ELENA; Raimon SANMARTÍ SALA
Original assignee: Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic); Fundacio Privada Clinic Per A La Recerca Biomedica
Priority date: 2011-07-28
Filing date: 2012-07-20
Publication date: 2013-01-31

Abstract

La presente invención se refiere a polipéptidos quiméricos derivados de la proteína vimentina, capaces de detectar los anticuerpos generados en la artritis reumatoide (AR), que comprenden al menos dos subunidades peptídicas citrulinadas de entre las siguientes: (i) una procedente de la vimentina, (¡i) una procedente de la cadena α de la fibrina y (iii) una procedente de la filagrina. Además, la invención comprende una composición antigénica, un método y un kit para el diagnóstico de la artritis reumatoide, a partir de la detección de los auto-anticuerpos generados durante el curso de dicha enfermedad.

Description

POLIPEPTIDOS QUIMERICOS DERIVADOS DE LA PROTEINA VIMENTINA CON UTILIDAD PARA EL DIAGNOSTICO DE LA ARTRITIS REUMATOIDE

SECTOR DE LA INVENCIÓN

La presente invención se enmarca en el sector químico-farmacéutico, concretamente en el desarrollo de nuevas composiciones y kits de diagnóstico basados en péptidos sintéticos. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La artritis reumatoide (AR) es una de las enfermedades autoinmunes más comunes, con un origen desconocido y que afecta al 0.5-1 % de la población, destruyendo progresivamente las articulaciones, causándoles deformidad y pérdida de función, además de producir complicaciones sistémicas.

En esta enfermedad la terapia agresiva/enérgica aplicada en estadios iniciales ofrece resultados muy positivos, siendo fundamental su diagnóstico prematuro. El criterio de clasificación para la AR según el Colegio Americano de Reumatología (ACR) (Arnelt FC, et al. Arthritis Rheum. 1988; 31:315-24) está basado en parámetros puramente clínicos, aunque estos criterios no son útiles para el diagnóstico temprano de la AR (Saraux A, et al. Arthritis Rheum 2001; 44: 2485- 91). En la actualidad existen diferentes métodos serológicos que permiten el diagnóstico de la AR y la distinguen de otras patologías similares en fases tempranas de su evolución. En este sentido, se conocen una serie de anticuerpos específicos para la AR, tales como: el factor antiperinuclear (APF), anticuerpos antifilagrina (AFA) y los anticuerpos antiqueratina (AKA). Los epítopos reconocidos por estos anticuerpos (auto-anticuerpos anti-proteínas citrulinadas) son generados por modificaciones post-traduccionales que consisten en la deiminación de la arginina a citrulina por la enzima peptidilarginina deiminasa ( Vossenaar ER, et al. Bioessays 2003; 25: 1106-18). Una de las herramientas más específicas en el diagnóstico de AR consiste en la detección de los auto-anticuerpos, generados frente a péptidos o proteínas citrulinadas (ACPAs), constituyendo éstos unos de los marcadores serológicos más eficaces de esta patología que se conocen (Nijenhuis S, et al. Clin. Chim. Acta 2004; 350: 17-34). Los pacientes de AR pueden clasificarse en dos grandes grupos; los que tienen ACPAs y los que no, estando la presencia de estos ACPAs claramente relacionada con un mayor y más temprano desarrollo de erosiones así como con una menor remisión de la enfermedad.

Se han desarrollado diversos tests serológicos que están basados en la detección de estos ACPAs y que emplean proteínas citrulinadas como la filagrina, fibrina o vimentina, y/o diversas secuencias peptídicas citrulinadas sintéticas como sustratos antigénicos (tests comerciales denominados CCP1 , CCP2 y anti-MCV).

ES2307421 B1 describe unos péptidos quiméricos que contienen péptidos de las proteínas fibrina y filagrina (CFFCP) altamente sensibles y específicos para la AR, los cuales son capaces de detectar pacientes de AR que muestran una elevada destrucción articular y que son negativos para el test comercial CCP2. También se han identificado una serie de péptidos citrulinados derivados de la proteína vimentina humana como epítopos de células T en pacientes HLA-DR4 con AR {Feitsma A.L. et al., Arthritis Rheum. 2010; 62(1): 117-25). Los péptidos fueron sintetizados químicamente a partir de la proteína vimentina, comprendiendo en su secuencia al menos un residuo citrulinado y se emplearon para inmunizar ratones transgénicos DR4. Únicamente se producían respuestas T específicas en los ratones inmunizados con dos grupos de péptidos citrulinados sintetizados, el grupo 1 y el grupo 7. Por tanto, se concluyó que esos grupos de péptidos citrulinados derivados de la proteína vimentina, eran los únicos que contenían epítopos inmunogénicos capaces de ser reconocidos por las células T en pacientes HLA-DR4 con AR.

Existe un creciente interés por mejorar la precisión de los tests o pruebas específicas basados en péptidos citrulinados para el diagnóstico de AR así como su diferenciación temprana respecto a otras enfermedades reumáticas que afectan a las articulaciones y tejido conectivo, sobre todo en el caso de pacientes con un pronóstico más pobre o aquéllos con un desarrollo más temprano de la enfermedad. La identificación de nuevos péptidos antigénicos citrulinados derivados de proteínas citrulinadas presentes en los tejidos sinoviales de pacientes de AR, como las proteínas fibrina, filagrina y vimentina, permitirá identificar aquellos pacientes que requieren terapias más agresivas desde el mismo momento del diagnóstico de la enfermedad, permitiendo así un mayor control de ésta y, consecuentemente, conseguir menores daños articulares y una mejor prognosis de la enfermedad. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los autores de la presente invención en su afán de mejorar los sistemas de diagnóstico de AR que se emplean actualmente, han demostrado que existen una serie de péptidos citrulinados derivados de la proteína vimentina con especial sensibilidad y especificidad frente a los auto-anticuerpos ACPAs, que se generan durante el desarrollo de la AR. Además, uno de estos péptidos citrulinados y/o su análogo cíclico denvado de la proteína vimentina fue unido covalentemente bien a un péptido cíclico de la filagrina obteniéndose un polipéptido quimérico (vimentina- filagrina) o a una región de la proteína α-fibrina previamente descrita en ES2307421 B1 (polipéptido quimérico fibhna-vimentina). Los péptidos quiméricos resultantes fueron capaces de complementar o mejorar los resultados de sensibilidad y especificidad obtenidos con los sistemas CCP2 y/o anti-MCV.

Así, un primer aspecto de la invención se refiere a un polipéptido quimérico citrulinado que comprende al menos dos subunidades peptídicas citrulinadas (a) y (b), unidas covalentemente en orden (a)-(b) o (b)-(a). En la presente invención el término "polipéptido quimérico" se refiere a la combinación en una misma molécula de al menos dos péptidos que pertenecen a dominios peptídicos de distintas proteínas, entre los cuales media un enlace covalente y donde la unión puede darse con o sin grupos espaciadores. Dicho polipéptido quimérico está citrunilado, es decir, durante su proceso de síntesis se ha sustituido en cada subunidad peptídica (a) y (b), al menos una arginina por una citrulina, la cual forma parte de cada subunidad. En el ámbito de esta memoria, el aminoácido citrulina puede ser referido abreviadamente como X, según la nomenclatura de aminoácidos por el sistema de una letra, o como Cit, según el sistema de tres letras de la nomenclatura de aminoácidos.

Por tanto, la presente invención hace referencia a un polipéptido quimérico citrulinado que comprende al menos dos subunidades peptídicas citrulinadas (a) y (b) unidas covalentemente, caracterizado porque: a) la subunidad peptídica citrulinada (a) tiene al menos un 85% de homología, preferentemente al menos un 88%, o un 92%, o un 96%, con un fragmento de al menos 15 aminoácidos, preferentemente entre 20 y 30 aminoácidos, más preferentemente entre 23 y 28 aminoácidos, comprendido en la proteína vimentina con SEQ ID No: 1 (sin citrulinar), y b) la subunidad (b) tiene al menos un 80% de homología, preferentemente al menos un 90%, con un fragmento de al menos 10 aminoácidos, preferentemente entre 10 y 25 aminoácidos, más preferentemente entre 14 y 21 aminoácidos, comprendido en:

b.1 ) la proteína a-fibrina con SEQ ID No: 2 (sin citrulinar), o b.2) la región 304-324 de la proteína filagrina con SEQ ID No: 3

(sin citrulinar),

caracterizado porque dicho polipéptido quimérico citrulinado es capaz de interaccionar con auto-anticuerpos específicos de la artritis reumatoide.

En la presente invención el término "auto-anticuerpos específicos de la artritis reumatoide" se refiere a los anticuerpos específicos de la artritis reumatoide que genera el sistema inmunitario como respuesta a los antígenos del propio organismo.

En la presente invención el término "homología" se refiere al grado de similitud que se mantiene entre los péptidos que se obtienen después de modificar (delación, deiminación, sustitución de aminoácidos, etc.) determinadas regiones o fragmentos de la proteína filagrina, de la -fibrina o de la vimentina respecto de estos fragmentos en las secuencias originales. Por tanto, cuando en la presente invención se hace referencia a una subunidad peptídica citrulinada que tiene un determinado porcentaje de homología con un fragmento de una proteína sin citrulinar, se entiende que tras la síntesis y citrulinación de dicha subunidad peptídica la cual se denomina "subunidad peptídica citrulinada", se mantiene un determinado grado de similitud con el fragmento de la proteína sin citrulinar.

En una realización preferida de la presente invención, la citada subunidad peptídica citrulinada (a) anteriormente definida en el apartado a), se caracteriza porque tiene al menos un 85% de homología con un fragmento de al menos 15 aminoácidos de la proteína vimentina, donde dicho fragmento está comprendido entre las posiciones aminoacídicas 47 - 72 de dicha proteína vimentina, con SEQ ID No: 4 (sin citrulinar). En otra realización preferida de la presente invención, la citada subunidad peptídica citrulinada (a) anteriormente definida en el apartado a) se selecciona de entre el siguiente grupo: SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 1 1 , SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 16, SEQ ID No: 17, SEQ ID No: 18 y SEQ ID No: 19 (Tabla 1 ). Dichas secuencias SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 1 1 , SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 16, SEQ ID No: 17, SEQ ID No: 18 y SEQ ID No: 19, están citrulinadas, es decir, presentan sustituida al menos una arginina por una citrulina.

Tabla 1. Secuencias peptídicas, con distinta relación Arg/Cit, preferentemente compuestas de 26 aminoácidos y derivadas de la región (47-72) de la proteína vimentina. X: citrulina

nombre péptido secuencia

SEQ ID No: 5 (p44) _{[C ¡t}50,64,69,71 _{]v¡ m (47}.₇₂₎ STSXSLYASSPGGVYATXSSAVXLXS

SEQ ID No: 6 (p45) [Cit⁵⁰]Vim(47-72) STSXSLYASSPGGVYATRSSAVRLRS

SEQ ID No: 7 (p46) [Cit⁶⁴]Vim(47-72) STSRSLYASSPGGVYATXSSAVRLRS

SEQ ID No: 8 (p47) [Cit⁶⁹]Vim(47-72) STSRSLYASSPGGVYATRSSAVXLRS

SEQ ID No: 9 (p48) [Cit⁷¹]Vim(47-72) STS RS LYASS PG G VYAT R SS AV R LXS

SEQ ID No: 10 (p49) [Cit^69J1]Vim(47-72) STSRSLYASSPGGVYATRSSAVXLXS

SEQ ID No: 1 1 (p50) [Cit^64J1]Vim(47-72) STSRSLYASSPGGVYATXSSAVRLXS

SEQ ID No: 12 (p51) [Cit⁵⁰'⁷¹]Vim(47-72) STSXSLYASSPGGVYATRSSAVRLXS

SEQ ID No: 13 (p52) [Cit⁶⁴'⁶⁹]Vim(47-72) STSRSLYASSPGGVYATXSSAVXLRS

SEQ ID No: 14 (p53) [Cit⁵⁰'⁶⁹]Vim(47-72) STSXSLYASSPGGVYATRSSAVXLRS

SEQ ID No: 15 (p54) [Cit⁵⁰'⁶⁴]Vim(47-72) STSXSLYASSPGGVYATXSSAVRLRS SEQ ID No: 16 (p55) [Cit⁶⁴'^69J1]Vim(47-72) STSRSLYASSPGGVYATXSSAVXLXS

SEQ ID No: 17 (p56) [Cit⁵⁰'^64J1]Vim(47-72) STSXSLYASSPGGVYATXSSAVRLXS

SEQ ID No: 18 (p57) [Cit⁵⁰'^69J1]Vim(47-72) STSXSLYASSPGGVYATRSSAVXLXS

SEQ ID No: 19 (p58) [Cit⁵⁰'⁶⁴'⁶⁹]Vim(47-72) STSXSLYASSPGGVYATXSSAVXLRS

En una realización preferente de la presente invención, la citada subunidad peptídica citrulinada (a) anteriormente definida en el apartado a) es SEQ ID No: 9 (p48) [Cit⁷¹]Vim(47-72). Dicha secuencia SEQ ID No: 9 está citrulinada, presentando la arginina de la posición 71 sustituida por una citrulina.

En una realización aún más preferente, la citada subunidad peptídica citrulinada (a) anteriormente definida en el apartado a) es un análogo cíclico de SEQ ID No: 9. Preferentemente las serinas de las posiciones 55 y 66 están sustituidas por dos cisternas formando un puente disulfuro que cicla la subunidad.

En la presente invención, el término "cíclico", "ciclado" o "que cicla la subunidad" se entiende que se refiere a la sustitución, durante el proceso de síntesis, de al menos dos residuos, preferentemente de serina, de una misma subunidad por residuos de cisteína que forman un puente disulfuro, generando un ciclo en dicha molécula o subunidad.

En la presente invención el término péptido o fragmento "análogo" se refiere a los péptidos o fragmentos donde al menos uno de sus aminoácidos ha sido sustituido por otro de características similares según se indica a continuación:

- Neutros polares, hidrófilos o (polares): serina (Ser), treonina (Thr), cisteína (Cys), asparagina (Asn) y glutamina (Gln). - Neutros no polares, apolares o hidrófobos: glicina (Gly), alanina (Ala), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (lie), metionina (Met), prolina (Pro), fenilalanina (Phe), triptófano (Trp)y tirosina (Tyr).

- Con carga negativa, o ácidos: ácido aspártico (Asp) y ácido glutámico (Glu).

- Con carga positiva, o básicos: lisina (Lys), arginina (Arg), histidina (His), y Citrulina (Cit).

- Formando un ciclo entre cisternas de la misma subunidad. En una realización preferida de la presente invención, la citada subunidad peptídica citrulinada (b) antenormente definida en el apartado b.1 ) se caracteriza porque tiene al menos un 80% de homología con un fragmento de al menos 10 aminoácidos de la proteína a-fibrina, donde dicho fragmento está comprendido entre las posiciones aminoacídicas 617-631 de dicha proteína a-fibrina con SEQ ID No: 20 (sin citrulinar).

En otra realización preferida de la presente invención, la citada subunidad peptídica citrulinada (b) antenormente definida en el apartado b.1 ) se selecciona de entre el siguiente grupo: SEQ ID No: 21 , SEQ ID No: 22, y SEQ ID No: 23. Dichas secuencias SEQ ID No: 21 , SEQ ID No: 22, y SEQ ID No: 23 están citrulinadas, es decir, presentan sustituida al menos una arginina por una citrulina.

SEQ ID No: 21 HSTKRGHAKSRPVXG

SEQ ID No: 22 HSTKRGHAKSXPVXG

SEQ ID No: 23 HSTKXGHAKSRPVXG

En una realización aún más preferida de la presente invención, la citada subunidad peptídica citrulinada (b) anteriormente definida en el apartado b.1 ) es la SEQ ID No: 21 . Dicha secuencia SEQ ID No: 21 está citrulinada, es decir, presenta la arginina de la posición 630 sustituida por una citrulina.

En otra realización preferida de la presente invención, la citada subunidad peptídica citrulinada (b) anteriormente definida en el apartado b.2) es la SEQ ID No: 24. Dicha secuencia SEQ ID No: 24 está citrulinada, es decir, presenta la arginina de la posición 312 sustituida por una citrulina.

En otra realización más preferida de la presente invención, la citada subunidad peptídica citrulinada (b) anteriormente definida en el apartado b.2) es un análogo cíclico de SEQ ID No: 24, con SEQ ID No: 25. Preferentemente las serinas de las posiciones 306 y 319 están sustituidas por dos cisternas formando un puente disulfuro que cicla la molécula. HQCHQESTXGRSRGRCGRSGS

En una realización preferida de la presente invención, el polipéptido quimérico citrulinado definido anteriormente se caracteriza porque las dos subunidades peptídicas citrulinadas (a) y (b) están unidas covalentemente como (b)-(a), y donde: a) la subunidad peptídica citrulinada (a) tiene al menos un 85% de homología con un fragmento de al menos 15 aminoácidos comprendido entre las posiciones aminoacídicas 47 - 72 de la proteína vimentina, con SEQ ID No: 4 (sin citrulinar), preferentemente la subunidad peptídica citrulinada (a) es SEQ ID No: 9, y presenta la arginina de la posición 71 sustituida por una citrulina, y b) la subunidad peptídica citrulinada (b) tiene al menos un 80% de homología con un fragmento de al menos 10 aminoácidos comprendido entre las posiciones aminoacídicas 617-631 de la proteína a-fibrina con SEQ ID No: 20 (sin citrulinar), preferentemente la subunidad peptídica citrulinada (b) es SEQ ID No: 21 , y presenta la arginina de la posición 630 sustituida por una citrulina.

En una realización aún más preferida de la presente invención, el polipéptido quimérico citrulinado definido anteriormente se denomina polipéptido quimérico citrulinado fibrina/vimentina (CFVCP) y se caracteriza por la SEQ ID No: 26. Dicha secuencia SEQ ID No: 26 está citrulinada, es decir, presenta sustituida al menos una arginina por una citrulina.

En una realización aún más preferida de la presente invención, el polipéptido quimérico citrulinado definido anteriormente se denomina polipéptido quimérico citrulinado fibrina/vimentina ciclada (CFVcCP) y es un análogo cíclico de SEQ ID No: 26, con SEQ ID No: 27, donde las serinas de las posiciones 55 y 66 de la subunidad a) están sustituidas por dos cisternas formando un puente disulfuro que cicla la subunidad. En una realización preferida de la presente invención, el polipéptido quimérico citrulinado definido antenormente se caracteriza porque las dos subunidades peptídicas citrulinadas (a) y (b) están unidas covalentemente como (a)-(b), donde: a) la subunidad peptídica citrulinada (a) tiene al menos un 85% de homología con un fragmento de al menos 15 aminoácidos comprendido entre las posiciones aminoacídicas 47 - 72 de la proteína vimentina, con SEQ ID No: 4 (sin citrulinar), preferentemente la subunidad peptídica citrulinada (a) es SEQ ID No: 9, y presenta la arginina de la posición 71 sustituida por una citrulina, y b) la subunidad peptídica citrulinada (b) tiene al menos un 80% de homología con un fragmento de al menos 10 aminoácidos comprendido en la región 304- 324 de la proteína filagrina con SEQ ID No: 3 (sin citrulinar), preferentemente la subunidad peptídica citrulinada (b) es SEQ ID No: 24, y presenta la arginina de la posición 312 sustituida por una citrulina.

En una realización aún más preferida de la presente invención, el polipéptido quimérico citrulinado definido antenormente se denomina polipéptido quimérico citrulinado vimentina/filagrina (CVFCP) y es un análogo cíclico de SEQ ID No: 24, con SEQ ID No: 28, donde las serinas de las posiciones 306 y 319 de la subunidad b) están sustituidas por dos cisteínas formando un puente disulfuro que cicla la molécula.

Tabla 2. Estructura primaria de los péptidos quiméricos que preferentemente contienen un análogo de la región (47-72) de la proteína vimentina.

SEQ ID No: 26 (CFVCP): péptido quimérico citrulinado fibhna/vimentina

O

H₂N-HSTKRGHAKSRPVXG-STSRSLYASSPGGVYATRSSAVRLXS-CNH₂

SEQ ID No: 27 (CFVcCP): péptido quimérico citrulinado fibhna/vimentina O

II

H₂N-H S TKRGH AKS RP VXG- S TSRS L YAC S PGGV YATRS C A VRLXS- CNH

SEQ ID No: 28 (CVFCP): péptido quimérico citrulinado vimentina/filagrina

De tal forma que el péptido quimérico citrulinado fibrina/vimentina (CFVCP) presenta la SEQ ID No: 26, formada por las siguientes subunidades citrulinadas unidas covalentemente en orden (b)-(a): a) la subunidad peptídica citrulinada (a) correspondiente al fragmento citrulinado con SEQ ID No: 9, análogo al fragmento de la proteína vimentina entre las posiciones aminoacídicas 47-72, y que presenta la arginina de la posición 71 sustituida por una citrulina, y b) la subunidad peptídica citrulinada (b) correspondiente al fragmento citrulinado con SEQ ID No: 21 , análogo al fragmento de la proteína fibrina entre las posiciones aminoacídicas 617-631 , y que presenta la arginina de la posición 630 sustituida por una citrulina.

De tal forma que el péptido quimérico citrulinado fibrina/vimentina (CFVcCP) presenta la SEQ ID No: 27, formada por las siguientes subunidades citrulinadas unidas covalentemente en orden (b)-(a): a) la subunidad peptídica citrulinada (a) correspondiente al análogo cíclico del fragmento citrulinado con SEQ ID No: 9, y análogo al fragmento de la proteína vimentina entre las posiciones aminoacídicas 47-72, y que presenta la arginina de la posición 71 sustituida por una citrulina, y las serinas de las posiciones 55 y 66 sustituidas por dos cisternas formando un puente disulfuro que cicla la molécula, y b) la subunidad peptídica citrulinada (b) correspondiente al fragmento citrulinado con SEQ ID No: 21 , análogo al fragmento de la proteína fibrina entre las posiciones aminoacídicas 617-631 , y que presenta la arginina de la posición 630 sustituida por una citrulina.

De tal forma que el péptido quimérico citrulinado vimentina/filagrina (CVFCP) presenta la SEQ ID No: 28, formada por las siguientes subunidades unidas covalentemente en orden (a)-(b): a) la subunidad peptídica citrulinada (a) correspondiente al fragmento citrulinado con SEQ ID No: 9, análogo al fragmento de la proteína vimentina entre las posiciones aminoacídicas 47-72, y que presenta la arginina de la posición 71 sustituida por una citrulina, y b) la subunidad peptídica citrulinada (b) correspondiente al fragmento citrulinado con SEQ ID No: 25, análogo al fragmento de la proteína filagrina entre las posiciones aminoacídicas 304-324 con SEQ ID No: 24, y que presenta una arginina sustituida por una citrulina en la posición 312 y las serinas de las posiciones 306 y 319 sustituidas por dos cisteínas formando un puente disulfuro que cicla la molécula.

En adelante todos los polipéptidos quiméricos citrulinados y péptidos análogos definidos anteriormente serán denominados como "polipéptidos de la invención".

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con una composición antigénica para el diagnóstico y/o pronóstico de la AR que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención. En adelante esta composición será denominada como "composición antigénica de la invención".

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de al menos un polipéptido de la invención o una composición antigénica de la invención definidos antenormente, o combinaciones de los mismos, para su uso en un método de adquisición o procesamiento de datos para la detección in vitro de auto- anticuerpos específicos de la artritis reumatoide, en una muestra biológica ya obtenida, que pueden posteriormente ser usados con fines diagnósticos. Dicho método de adquisición o procesamiento de datos para la detección in vitro de auto-anticuerpos específicos de la artritis reumatoide se realiza mediante un ensayo inmunoenzimático, como por ejemplo pero sin limitarse, el ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), técnicas inmunofluorescentes o ensayos radioinmunológicos (RIA). Preferentemente, el ensayo inmunoenzimático es un ELISA.

La presente invención también se refiere a un método para la detección in vitro de auto-anticuerpos específicos de la artritis reumatoide en una muestra biológica aislada y obtenida previamente de un animal, preferentemente humano, que comprende: a) poner en contacto dicha muestra biológica con al menos un polipéptido de la invención o una composición antigénica de la invención definidos anteriormente, o combinaciones de los mismos, y

b) detectar la interacción entre los auto-anticuerpos específicos de la artritis reumatoide presentes en la muestra biológica y al menos un polipéptido de la invención o una composición antigénica de la invención definidos anteriormente, o combinaciones de los mismos, citados en a), donde dicha interacción puede ser detectada mediante metodologías sobradamente conocidas en el estado de la técnica, a través de medición de absorbancia, medición de la densidad óptica de la muestra, etc.

En la presente invención, la muestra biológica aislada es un fluido corporal y más preferentemente, el fluido es sangre.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, se pone en contacto con la muestra biológica al menos uno de los polipéptidos quiméricos de la invención.

La presente invención hace también referencia a un kit o dispositivo para el diagnóstico y/o pronóstico de la artritis reumatoide, que comprende: a) al menos un polipéptido de la invención o una composición antigénica de la invención definidos anteriormente, b) los reactivos y tampones necesarios para tener el medio apropiado para producirse una reacción inmunológica con formación del complejo antígeno- anticuerpo entre los auto-anticuerpos específicos presentes en dicha muestra biológica y al menos un polipéptido de la invención, o una composición antigénica de la invención definidos anteriormente, citados en a), y c) los reactivos y tampones necesarios para la detección del citado complejo antígeno-anticuerpo producido por dicha reacción inmunológica.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIGURA 1. Reactividad de sueros procedentes de pacientes con AR (n=4) con los péptidos derivados de la proteína vimentina mostrados en la Tabla 3. La mediana de los valores de absorbancia alcanzados se indica con una línea horizontal.

FIGURA 2. Reactividad de sueros procedentes de pacientes con AR (n=4) con los péptidos derivados del dominio (35-108) de la proteína vimentina mostrados en la Tabla 4. La mediana de los valores de absorbancia alcanzados se indica con una línea horizontal

FIGURA 3. Reactividad de sueros procedentes de pacientes con AR (n=6) con la familia de péptidos derivada de la proteína vimentina que se muestra en la Tabla 1 . La mediana de los valores de absorbancia alcanzados se indica con una línea horizontal.

FIGURA 4. Niveles de anticuerpos anti-p48 y anti-p53 en sueros procedentes de pacientes de AR altamente positivos frente a péptidos quiméricos fibrina-filagrina

(CFFCPs) (·, A ) y CFFCPs negativos (o, Δ).

Se indica la mediana de los niveles de anticuerpos ^***p< 0.001 FIGURA 5. Análisis por curvas ROC de los péptidos quiméricos citrulinados fibrina/vimentina (CFVCP and CFVcCP) y del test anti-MCV en cohortes de pacientes con AR (n=100) y donantes sanos (n=100). Los valores de sensibilidad y especificidad se calcularon para todos los valores de cut-off (línea de corte a partir de la cual el valor se considera positivo). Sensibilidad de 58%, 62% y 75% para CFVCP, CFVcCP y anti-MCV, respectivamente a valores de especificidad del 99%; sensibilidad de 75%, 77% y 82% para CFVCP, CFVcCP y anti-MCV, respectivamente a valores de especificidad del 91 %.

EJEMPLOS

A continuación se detallan los materiales y métodos que fueron empleados para el desarrollo de la presente invención, así como sus ejemplos de realización. Dichos ejemplos no limitan la invención, sino que su finalidad es ¡lustrarla, poniendo de manifiesto la sensibilidad y especificidad de péptidos descritos y los polipéptidos quiméricos de la invención.

Síntesis de péptidos. Procedimiento general

La síntesis de los péptidos, con distinto grado de deiminación (Tabla 1 ), fueron sintetizados mediante un proceso de síntesis de péptidos en fase sólida empleando una resina Tentagel RAM (Rapp Polymere GmbH, Germany) (12 pmol, 0.24 meq/g). La síntesis se realizó en un sintetizador sem ¡automático de péptidos (SAM, Multisyntech, Germany) y se obtuvieron las secuencias en forma de carboxamidas C-terminales. Se siguió una estrategia 9-Fluorenilmetoxicarbonil / tert-butilo (Fmoc / tBu).

La protección de los grupos funcionales de las cadenas laterales de los aminoácidos se llevó a cabo empleando los siguientes grupos protectores: trifenilmetil (Trt) para Glutamina, Asparagina e Histidina; ter-butilo (tBu) para Aspártico, Glutámico, Serina, Treonina y Tirosina; 2,2,5,7,8-pentametilcromano-6- sulfonilo (Pmc) para Arginina, terbutiloxicarbonilo (Boc) para Lisina y Triptófano y acetamidometil (Acm) para Cisteina. Así, se adicionaron secuencialmente 3 equivalentes de aminoácido totalmente protegido, 3 equivalentes del hexafluorofosfato de 2-(7-Aza-1 H-benzotriazol-1 -il)- 1 , 1 ,3,3-tetrametiluronio (HATU) y 6 equivalentes de /V,/V-d¡¡soprop¡let¡lamina (DIEA) en 3 ml_ de /V,/V-d¡met¡lformamida (DMF), manteniéndose la mezcla bajo agitación continua durante 30 minutos. A continuación, se eliminó el disolvente por filtración y se lavó la resina 5 veces durante 30 segundos con DMF. La extensión de la reacción de acoplamiento entre aminoácidos se evaluó mediante el ensayo colorimétrico de Kaiser o De Clercq. La etapa de desprotección del grupo protector Fmoc se realizó también por duplicado empleando piperidina (20%) en DMF (v/v) durante 10 minutos. La elongación de la cadena peptídica se llevó a cabo siguiendo el mismo procedimiento para el segundo y siguientes aminoácidos hasta la incorporación de todos los aminoácidos que componen la secuencia peptídica deseada. Los péptidos fueron desprotegidos y simultáneamente desanclados de la resina en una única etapa empleando una mezcla de ácido trifluoroacético (TFA) / etanoditiol (EDT) / triisopropilsilano (TIS) / H₂0 (95/2/1/2 v/v) durante 3 horas. Los péptidos se precipitaron con éter dietílico frío, se centrifugaron y liofilizaron en un 10% de ácido acético. Los péptidos así obtenidos se analizaron por HPLC analítico a 215 nm. Su identidad se confirmó por espectrometría de masas (Tabla 3).

Péptidos quiméricos

Los péptidos quiméricos se sintetizaron siguiendo el procedimiento general de síntesis de péptidos lineales descrito en el apartado anterior.

En el caso de péptidos cíclicos, a continuación tuvo lugar la etapa de desprotección de los grupos Acm de las cadenas laterales de las cisteinas y posterior delación Así, tras la liberación del péptido quimérico de la resina éste fue disuelto en ácido acético / H₂0 (1/1 v/v) y se adicionaron ácido clorhídrico 1 M y l₂ (20 equiv / grupo Acm). Tras 4 horas se adicionó ácido ascórbico 1 M gota a gota hasta la decoloración completa de la disolución y ésta se concentró bajo presión reducida hasta aproximadamente un tercio de su volumen inicial. El producto final se purificó mediante HPLC sem ¡preparativa y finalmente se caracterizó mediante UPLC y espectrometría de masas ES-MS (Tabla 3).

Tabla 3. Caracterización por HPLC y espectrometría de masas por electrospray (ES-MS) de los péptidos p1 -p58 y quiméricos

Muestras de suero

Las muestras de suero analizadas procedieron de pacientes del Servicio de Reumatología del Hospital Clínico de Barcelona. Se trabajó con un total de 200 muestras de suero, de las cuales 100 correspondían a pacientes diagnosticados con artritis reumatoide (AR), según los criterios revisados de la Asociación Americana de Reumatología en 1987 (ahora Colegio Americano de Reumatología). Los 100 sueros restantes se obtuvieron de donantes sanos y se emplearon como control negativo.

Las muestras fueron previamente testadas por ELISA con los kits comerciales CCP2 (Immunoscan RA; Eurodiagnostica, distribuido por Diasorin, Madrid, Spain) y anti-MCV (Orgentec Diagnostika GmbH, Germany). Ensayos de ELISA

Las secuencias peptídicas se unieron covalentemente a placas de titulación de ELISA (Costar Corp., DNA-bind N-oxysuccinimide surface, Cambrigde, MA), como se ha descrito previamente (Pérez, T.; Gómez, et al. Lett. Peptide Sci. 2002, 9, 291 -300).

Brevemente, se diluyeron los péptidos a una concentración de 10 mg/mL en tampón carbonato/bicarbonato (pH 9.6) 0.05 M. Se adicionaron 100 μί de solución peptídica a cada pocilio de la microplaca de titulación y se incubó toda la noche a 4°C. Cada placa contenía pocilios control que incluían todos los reactivos excepto la muestra de suero, para estimar el ruido de fondo y pocilios que incluían todos los reactivos excepto el péptido, para evaluar así las reacciones no específicas del suero. En los controles, los pocilios se bloquearon con albúmina de suero bovino (BSA) 2 mg / pocilio. Tras la incubación, las placas se bloquearon con 2% de BSA en tampón carbonato/bicarbonato (pH 9.6) 0.05 M durante 1 hora a temperatura ambiente. Los sueros se diluyeron 50 veces en tampón RIA (1 % BSA, 350 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI, pH 7.6, 1 % vol/vol Tritón X-100, 0.5% wt/vol Na-deoxicolato, 0.1 % SDS (dodecil sulfato sódico)) suplementado con suero fetal bovino al 10%. Se adicionaron 100 L/pocillo y se incubaron durante 1 .5 horas a temperatura ambiente. Tras realizar seis lavados con PBS/0.05% Tween-20, se adicionaron 100 L/pocillo de IgG anti-humana conjugada a peroxidasa, diluida 1 : 1000 en tampón RIA. Tras 1 hora de incubación a temperatura ambiente, se lavaron las placas seis veces con tampón fosfato salino (PBS) / 0.05% Tween-20 y los anticuerpos unidos se detectaron con dihicrocloruro de o-fenilenodiamina (OPD, Sigma Chemical Company) y 0.8 mL/mL de 30% de peróxido de hidrógeno. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se detuvo con 50 mL de H₂SO₄ 2N y los valores de absorbancia obtenidos fueron medidos a una longitud de onda de 492 nm. Todos los sueros se testaron por duplicado. También se incluyeron sueros control para monitorizar las variaciones inter- e intra-ensayos.

Análisis estadístico Los análisis según las curvas ROC (curvas de Característica Operativa del Receptor) y de regresión se realizaron empleando el programa GraphPad Prism 5. Las curvas ROC representan la sensibilidad frente a (1 -especificidad) EJEMPLO 1: Identificación de epítopos de vimentina

Con el objeto de detectar aquéllos péptidos de la proteína vimentina que fuesen más reactivos frente a sueros de pacientes de AR, se procedió a sintetizar una familia de péptidos (Tabla 4) que cubriese toda la estructura primaria de la proteína vimentina (GenBank Accession No: P08670) citrulinada. Cada uno de los 28 péptidos de esta familia se solapaba en 5 aminoácidos con el siguiente, estaba formado por 20 residuos de aminoácidos y contenía al menos un residuo de citrulina en su secuencia. Los péptidos finalmente fueron sintetizados en fase sólida y caracterizados por HPLC y espectrometría de masas ES-MS.

Tabla 4. Secuencias de péptidos formados por 20 aminoácidos derivados de la proteína vimentina. X: citrulina nombre peptido secuencia

SEQ ID No: 29 [Cit⁴^^ia]Vim(2-21) STXSVSSSSYXXMFGGPGT (P1) A

SEQ ID No: 30 [Cit²³'²⁸'³⁶]Vim(17-36) GPGTASXPSSSXSYVTTST (P2) X

SEQ ID No: 31 _[C¡t36,45,5o_]V¡m(32__{51 )} TTSTXTYSLGSALXPSTSXS (P3)

SEQ ID No: 32 [Cit⁵⁰'⁶]Vim(47-66) STSXSLYASSPGGVYATXS (P4) S

SEQ ID No: 33 _[C¡t64,69,71,78_]v¡m(62__{81 )} ATXSSAVXLXSSVPGVXLLQ (P5)

SEQ ID No: 34 [Cit⁷⁸]V¡m (77-96) VXLLQDSVDFSLADAINTEF

(P6)

SEQ ID No: 35 [Cit⁰⁰]V¡m(92-111) INTEFKNTXTNEKVELQELN

(P7)

SEQ ID No: 36 [Cit ³' ²²]Vim(107-126) LQELNDXFANYIDKVXFLEQ (P8)

SEQ ID No: 37 [Cit²²]Vim(122-141) XFLEQQNKILLAELEQLKGQ (P9)

[Cit ⁵ _' ⁵⁵]V¡m(137-156)

SEQ ID No: 38 QLKGQGKSXLGDLYEEEMX (p10) E

SEQ ID No: 39 [Cit¹⁵⁵-^15e-¹⁵⁹-¹⁷⁰]Vim(152-171) E E MXE LXXQVD Q LTN D KAX (P11) V

SEQ ID No: 40 _[C¡t170,175,184,186_]v¡m(167_₁₈₆₎ D KAXVEVEXD N LAE D I MXLX (p12)

SEQ ID No: 41 [Cit⁸ ' ⁸⁶' ⁹⁶]V¡m(182-201) I MXLXE KLQEEMLQXE E AE N (p13)

SEQ ID No: 42 [Cit²⁰⁷]V¡m(197-216) EEAENTLQSFXQDVDNASL (p14) A

SEQ ID No: 43 [Cit²⁷'²²²]Vim(212-231) NASLAXLDLEXKVESLQEEI (p15)

SEQ ID No: 44 [Cit²⁷⁰'²⁷³]Vim(257-276) DVDVS KP D LTAALXD VXQ Q (p16) Y

SEQ ID No: 45 [Cit²⁷³]V¡m(272-291 ) VXQQYESVAAKNLQEAEEW

(p17) Y

SEQ ID No: 46 [Cit³⁰ ]Vim(287-306) AEEWYKSKFADLSEAANXN

(p18) N

SEQ ID No: 47 [C it³⁰⁴'³¹ °'³²⁰'³²¹ ]V¡ m (302-321 ) ANXNN DALXQAKQE STEYX

(p19) X

SEQ ID No: 48 [Cit³²⁰'³² ]Vim(317-336) TE YXXQVQ S LTC EVD AL KG

(p20) T

SEQ ID No: 49 [Cit^{3 2}'^{3 5}]Vim(332-351 ) ALKGTNESLEXQMXEMEEN

(p21 ) F

SEQ ID No: 50 [Cit³⁶ ]Vim (347-366) MEENFAVEAANYQDTIGXL

(p22) Q

SEQ ID No: 51 [Cit³⁶ '³⁷⁸'³⁸ ]Vim(362-381 ) IGXLQDEIQNMKEEMAXHLX

(p23)

SEQ ID No: 52 [Cit³⁷⁸'³⁸ ]Vim(377-396) AXHLXEYQDLLNVKMALDIE

(p24)

SEQ ID No: 53 [Cit ⁰ ' ⁰]Vim(392-41 1 ) ALDIEIATYXKLLEGEESXI

(p25)

SEQ ID No: 54 [Cit ⁰' ² ]Vim(407-426) EESXISLPLPNFSSLNLXET

(p26)

SEQ ID No: 55 [Cit ² ' ⁰]Vim(422-441 ) NLXETNLDSLPLVDTHSKXT

(P27)

SEQ ID No: 56 [Cit ⁰' ⁵⁰]Vim (437-456) HSKXTFLIKTVETXDGQVIN

(P28)

Estos péptidos fueron ensayados por inmunoensayo (ELISA) para determinar su capacidad de reconocer auto-anticuerpos presentes en sueros de pacientes de AR. Para identificar que péptidos representaban el mejor sustrato para los auto- anticuerpos todos los péptidos sintetizados fueron inicialmente ensayados con 4 sueros de pacientes de AR perfectamente caracterizados. Tal y como se muestra en la Figura 1 , la mediana de los valores de absorbancia alcanzados indicaron que los péptidos p4, p7 y p18 fueron los que mostraron una mayor reactividad, siendo posteriormente analizados frente a un mayor número de muestras (139 muestras de suero de pacientes de AR) donde el péptido p18 dio lugar a valores de absorbancia significativamente menores.

Considerando las secuencias peptídicas seleccionadas p4 y p7, se sintetizó la segunda familia de péptidos que se muestra en la Tabla 5. Esta familia cubre el dominio (35-108) de la vimentina y está formada por 15 péptidos solapados en 17 residuos. Tabla 5. Secuencias peptídicas derivadas del dominio (35- 1 08) de la proteína vimentina compuestas de 20 aminoácidos. X: citrulina. nombre peptido secuencia

SEQ ID No: 57 (p29) [Cit^a '^{4Ü ÜU}]V¡m(35-54) TXTYS LGS ALXPSTSXS LYA

SEQ ID No: 58 (p30) [Cit ⁵'⁵⁰]V¡m(38-57) YSLGSALXPSTSXSLYASSP

SEQ ID No: 59 (p31 ) [Cit ⁵'⁵⁰]Vim(41 -60) GSALXPSTSXSLYASSPGGV

SEQ ID No: 60 (p32) [Cit ⁵'⁵⁰]Vim(44-63) LXPSTSXSLYASSPGGVYAT

SEQ ID No: 61 (p33) [Cit⁵⁰'⁶ '⁶⁹]Vim(50-69) XSLYASSPGGVYATXSSAVX

SEQ ID No: 62 (p34) [Cit⁶ '^69J ]Vim(53-72) YASSPGGVYATXSSAVXLXS

SEQ ID No: 63 (p35) [Cit⁶ '^69J ]Vim(56-75) SPGGVYATXSSAVXLXSSVP

_{[C ¡t}64,69,71 ,78_{]v¡ m (59}_₇₈₎

SEQ ID No: 64 (p36) GVYATXSSAVXLXSSVPGVX

SEQ ID No: 65 (p37) [Cit^{69J J8}]Vim(65-84) SSAVXLXSSVPGVXLLQDSV

SEQ ID No: 66 (p38) [Cit^{69J J8}]Vim(68-87) VXLXSSVPGVXLLQDSVDFS

SEQ ID No: 67 (p39) [Cit^{7 J8}]Vim(71 -90) XSSVPGVXLLQDSVDFSLAD

SEQ ID No: 68 (p40) [Cit⁷⁸]Vim (74-93) VPGVXLLQDSVDFSLADAIN

SEQ ID No: 69 (p41 ) [Cit ⁰⁰]Vim(83-102) SVDFSLADAINTEFKNTXTN

SEQ ID No: 70 (p42) [Cit ⁰⁰]Vim(86-105) FSLADAINTEFKNTXTNEKV

SEQ ID No: 71 (p43) [Cit ⁰⁰]Vim(89-108) ADAINTEFKNTXTNEKVELQ Asimismo, y dado que el péptido p4 seleccionado de la primera familia de péptidos mostrada en la Tabla 5, contiene 2 residuos de citrulina, con el efecto de estudiar la influencia de la relación arginina/citrulina en la antigenicidad alcanzada, se obtuvieron y analizaron frente a los mismos cuatro sueros de pacientes de AR anteriormente mencionados, los péptidos análogos p4-1 : [Cit⁵⁰]Vim (47-66) y p4-2: [Cit⁶ ]Vim(47-66). De este modo se seleccionaron los péptidos p34 y p4-2 (Figura 2).

Sorprendentemente, estos dos péptidos (p34 y p4-2) se solapan en 14 aminoácidos. Por ello, y al efecto de presentar estos dos dominios relacionados de la vimentina en una única secuencia peptídica, se seleccionó un péptido de 26 aminoácidos que contiene los péptidos anteriores p34 y p4-2, cuatro residuos de citrulina y representa la región (47-72) de la vimentina. Llegado este punto, se consideró de interés el estudio tanto del grado de citrulinación como de la posición de los residuos de citrulina en esta región (47-72) y se obtuvo por síntesis de péptidos en fase sólida una tercera familia de péptidos, compuesta por 15 análogos peptídicos, constituidos por 26 residuos de aminoácidos, y que se muestra en la Tabla 1 .

5 Tras el análisis inicial con 6 muestras de suero procedentes de pacientes de AR bien caracterizados, se seleccionaron los análogos peptídicos p48 y p53 (Figura 3), los cuales fueron seguidamente analizados comparativamente frente a un mayor número de sueros: 26 sueros procedentes de pacientes con AR que resultaban ser falsos negativos frente a los péptidos quiméricos fibrina-filagrina y 10 17 sueros procedentes de pacientes con AR altamente positivos frente a los péptidos quiméricos fibrina-filagrina. Como se ¡lustra en la Figura 4, se obtuvieron valores significativamente distintos entre ambos péptidos, siendo seleccionado finalmente el péptido p48, esto es la región [Cit⁷¹]Vim(47-72).

15 EJEMPLO 2: Ensayos de detección de auto-anticuerpos AR mediante péptidos quiméricos vimentina-filagrina y fibrina-vimentina.

En base a resultados previos obtenidos con péptidos multiméricos que contienen distintas regiones epitópicas en una misma molécula, se procedió al diseño y 0 síntesis en fase sólida de los péptidos quiméricos vimentina-filagrina y fibrina- vimentina que se han mostrado con anterioridad en la Tabla 2.

Se ensayó la reactividad frente a 100 sueros de pacientes de AR y 100 controles negativos procedentes de donantes sanos mediante un ensayo inmunoenzimático 5 (ELISA)

Los análisis mediante curvas ROC de los resultados obtenidos por ELISA mostraron que los polipéptidos quiméricos que contenían un ciclo en su secuencia (CVFCP y CFVcCP) ofrecían sorprendentemente unos valores de área bajo la

30 curva (AUC) algo más elevados que los correspondientes a péptidos quiméricos lineales. Por otro lado, cuando éstos fueron analizados por curvas ROC, comparativamente con el test comercial basado en la proteína vimentina mutada (anti-MCV), se observaron valores de sensibilidad/especificidad bastante comparables (Figura 5).

35 Por todo ello, teniendo en cuenta, además, las ventajas que aporta el empleo de secuencias peptídicas cortas en comparación con la proteína completa, los péptidos quiméricos vimentina-filagrina y fibrina-vimentina, objeto de patente, se consideran de un claro interés para el desarrollo de nuevos sistemas de diagnóstico serológico de la AR basados en péptidos.

EJEMPLO 3: Ensayos comparativos de detección de auto-anticuerpos AR mediante péptidos quiméricos vimentina-filagrina, fibrina-vimentina, y tests comerciales CCP2 y anti-MCV

Se realizó el estudio por ELISA de la reactividad de los péptidos quiméricos derivados de la proteína vimentina frente a 31 muestras de suero procedentes de pacientes de AR que resultaron ser falsos negativos frente a péptidos quiméricos fibrina-filagrina. Sorprendentemente, ahora se observó positividad en un 29% de los casos (9/31 ), resultando además también un valor positivo en 4 pacientes que además eran falsos negativos con el test CCP2 (Tabla 6). Este resultado representa una mejora en la diagnosis de pacientes de AR con el sistema CCP2. Además los anticuerpos anti-vimentina estudiados se correlacionan bien entre ellos, así como con los otros anticuerpos (anti-CCP2 y anti-quiméricos fibrina- filagrina -anti-CFFCP1 -) y con el factor reumatoide (RF). Aquellos pacientes que resultan positivos para los péptidos derivados de la vimentina presentan una enfermedad más erosiva. Asimismo, en estos casos se observa una menor remisión clínica de la enfermedad (DAS28<2.6) que en aquellos pacientes que resultan negativos para los péptidos quiméricos derivados de la vimentina (Tabla 7)

Tabla 6. Reactividad de 31 sueros procedentes de pacientes de AR que son negativos frente a los péptidos quiméricos fibrina-filagrina

* cut-off 91 % especificidad: 0.285

** cut-off 91 % especificidad: 0.518

*** cut-off 91% especificidad: 0.380 Tabla 7. Características generales de los pacientes de AR

CVFCP CVFCP Valor p CFVcCP CFVcCP Valor p positivo negativo positivo negativo

RF positivo (%) 83 56 0,009 84 54 0,003

CCP2 positivo 93 34 < 0,000 95 33 <0,0001 (%) 1 Anti-quimérico 92 22 < 0,000 93 21 < 0,0001 positivo! %) 1

Enfermedad 69 32 0,002 72 26 < 0,0001 erosiva (%)

Remisión (%) 37 67 0,028 37 67 0,028

Claims

REIVINDICACIONES

1 . Un polipéptido quimérico citrulinado que comprende al menos dos subunidades peptídicas citrulinadas (a) y (b) unidas covalentemente, caracterizado porque:

a) la subunidad peptídica citrulinada (a) tiene al menos un 85% de homología con un fragmento de al menos 15 aminoácidos comprendido en la proteína vimentina con SEQ ID No: 1 , y

b) la subunidad peptídica citrulinada (b) tiene al menos un 80% de homología con un fragmento de al menos 10 aminoácidos comprendido en:

b.1 ) la proteína a-fibrina con SEQ ID No: 2, o

b.2) la región 304-324 de la proteína filagrina con SEQ ID No: 3, caracterizado porque dicho polipéptido quimérico citrulinado es capaz de interaccionar con auto-anticuerpos específicos de la artritis reumatoide.

2. El polipéptido quimérico citrulinado según la reivindicación 1 , caracterizado porque la subunidad peptídica citrulinada (a) tiene al menos un 85% de homología con un fragmento de al menos 15 aminoácidos de la proteína vimentina, donde dicho fragmento está comprendido entre las posiciones aminoacídicas 47 - 72 de dicha proteína, con SEQ ID No: 4.

3. El polipéptido quimérico citrulinado según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la subunidad peptídica citrulinada (a) se selecciona de entre el siguiente grupo: SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 1 1 , SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 16, SEQ ID No: 17, SEQ ID No: 18 y SEQ ID No: 19.

4. El polipéptido quimérico citrulinado según la reivindicación 3, caracterizado porque la subunidad peptídica citrulinada (a) es SEQ ID No: 9.

5. El polipéptido quimérico citrulinado según la reivindicación 4, caracterizado porque la subunidad peptídica citrulinada (a) es un análogo cíclico de SEQ ID No: 9.

6. El polipéptido quimérico citrulinado según las reivindicaciones 1 -5 caracterizado porque la subunidad peptídica citrulinada (b) tiene al menos un 80% de homología con un fragmento de al menos 10 aminoácidos de la proteína a-

5 fibrina, donde dicho fragmento está comprendido entre las posiciones aminoacídicas 617-631 de dicha proteína, con SEQ ID No: 20.

7. El polipéptido quimérico citrulinado según las reivindicaciones 1 -6, caracterizado porque la subunidad peptídica citrulinada (b) se selecciona de entre

10 el siguiente grupo: SEQ ID No: 21 , SEQ ID No: 22, y SEQ ID No: 23.

8. El polipéptido quimérico citrulinado según la reivindicación 7, caracterizado porque la subunidad peptídica citrulinada (b) es SEQ ID No: 21 .

15 9. El polipéptido quimérico citrulinado según las reivindicaciones 1 -8, caracterizado porque la subunidad peptídica citrulinada (b) es SEQ ID No: 24.

10. El polipéptido quimérico citrulinado según la reivindicación 9, caracterizado porque la subunidad peptídica citrulinada (b) es un análogo cíclico de SEQ ID No:

20 24, con SEQ ID No: 25.

1 1 . El polipéptido quimérico citrulinado según las reivindicaciones 1 -5, caracterizado porque las dos subunidades peptídicas citrulinadas (a) y (b) están unidas covalentemente como (b)-(a), y donde:

25 a) la subunidad peptídica citrulinada (a) tiene al menos un 85% de homología con SEQ ID No: 4 de la proteína vimentina, y

b) la subunidad peptídica citrulinada (b) tiene al menos un 80% de homología con SEQ ID No: 20 de la proteína a-fibrina.

30 12. El polipéptido quimérico citrulinado según la reivindicación 1 1 , caracterizado por SEQ ID No: 26.

13. El polipéptido quimérico citrulinado según la reivindicación 12, caracterizado por un análogo cíclico de SEQ ID No: 26, con SEQ ID No: 27.

14. El polipéptido quimérico citrulinado según las reivindicaciones 1 -13 caracterizado porque las dos subunidades peptídicas citrulinadas (a) y (b) están unidas covalentemente como (a)-(b), donde:

5 a) la subunidad peptídica citrulinada (a) tiene al menos un 85% de homología con SEQ ID No: 4 de la proteína vimentina, y

b) la subunidad peptídica citrulinada (b) tiene al menos un 80% de homología con SEQ ID No: 3 de la proteína filagrina.

10 15. El polipéptido quimérico citrulinado según la reivindicación 14, caracterizado por SEQ ID No: 24.

16. El polipéptido quimérico citrulinado según la reivindicación 15, caracterizado por un análogo cíclico de SEQ ID No: 24, con SEQ ID No: 28.

15

17. Una composición antigénica para la detección in vitro de auto-anticuerpos específicos de la artritis reumatoide, caracterizada por comprender al menos un polipéptido quimérico definido en las reivindicaciones 1 a 16.

20 18. Uso de al menos un polipéptido quimérico definido en las reivindicaciones 1 a 16 para la detección in vitro de auto-anticuerpos específicos de la artritis reumatoide mediante un ensayo inmunoenzimático.

19. Uso de al menos un polipéptido quimérico según la reivindicación 18, 25 caracterizado porque el ensayo inmunoenzimático es un ELISA.

20. Método para la detección in vitro de auto-anticuerpos específicos de la artritis reumatoide en una muestra biológica aislada obtenida previamente, caracterizado por comprender las siguientes etapas:

30 a) poner en contacto una muestra biológica con al menos un polipéptido quimérico definido en las reivindicaciones 1 a 16, y

b) detectar la interacción entre los auto-anticuerpos específicos de la artritis reumatoide, presentes en la muestra biológica y al menos un polipéptido quimérico citado en a).

21 . Kit para el diagnóstico y/o pronóstico de la artritis reumatoide, que comprende:

a) al menos un polipéptido quimérico definido en las reivindicaciones 1 a 16, y

b) los reactivos y tampones necesarios para tener el medio apropiado para producirse una reacción inmunológica con formación del complejo antígeno- anticuerpo entre los auto-anticuerpos específicos presentes en una muestra biológica y al menos un polipéptido quimérico o combinaciones de los mismos, citados en a), y

c) los reactivos y tampones necesarios para la detección del citado complejo antígeno-anticuerpo producido por dicha reacción inmunológica.