ES2645679T3 - Método para el tratamiento de infección por flavivirus, moléculas y sus usos - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un método para bloquear lainfección del virus dengue a las células que comprende la interferencia en la interacción de la proteína de la envoltura del virus con un receptor celular directamente o a través de una proteínaportadora y los usos relacionados, siendo el receptor celular elreceptor de la alfa2-macroglobulina también conocido como proteína relacionada al receptor de lipoproteínas de baja densidad o CD91 y siendo la proteína portadora la alfa 2-macroglobulina humana.

Description

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Los métodos basados en informática se han convertido en herramientas poderosas para el diseño de fármacos. Estos métodos tienen la ventaja de poder evaluar grandes cantidades de compuestos, por lo cual proporcionan grandes ahorros en tiempo y trabajo experimental. El uso exitoso de estos métodos requiere la disponibilidad de datos sobre la estructura tridimensional de las proteínas y ligandos involucrados en la interacción para ser afectados. Cualquier dato experimental que ayude a definir la superficie de la interacción en cualquiera de las moléculas que reaccionan es también una ayuda inestimable en este contexto.

Teniendo en cuenta el estado del arte en técnicas computacionales para el desarrollo de fármacos basados en acoplamiento molecular, los hallazgos descritos en la presente invención sobre el papel de A2M y su receptor A2MR en la entrada celular de DV proporcionan un objetivo para experimentos de exámenes virtuales para compuestos que inhiben esta interacción, como potenciales fármacos antivirales o potenciales para su desarrollo. Las estructuras tridimensionales del ectodominio de la proteína E y del virión DV están disponibles, y también lo están las coordenadas estructurales del dominio que median la unión de A2M a A2MR, así como las de varios dominios de unión de ligandos de los miembros de la LDL familia receptora Por otro lado, la presente invención también define aminoácidos que participan en la interacción de DV con su receptor celular, y proporciona información sobre los determinantes estructurales para esta interacción.

Por lo tanto, un medio para obtener las secuencias de péptidos sintéticos y/o la estructura de moléculas pequeñas que pueden interferir la interacción de DV con el receptor A2MR puede ser el uso de métodos teóricos que implícitamente emplean uno o varios métodos de modelado computacional y modelos de la estructura tridimensional de DIII, así como de cualquiera de los dominios de unión al ligando del receptor A2MR. Empleando cualquiera de estos métodos para el modelado computacional y basándose en las coordenadas espaciales para la estructura de DIII, es posible modelar la columna vertebral de una cadena polipeptídica formando una horquilla beta antiparalela que incluye un giro beta en la cadena de conexión entre ambos hilos. Además, es posible modelar las cadenas laterales del polipéptido de tal manera que la identidad química de estas cadenas, así como su conformación, conduzcan a contactos atómicos energéticamente favorables. También es posible explorar computacionalmente el espacio de secuencia, así como el espacio conformacional del péptido, los rotámeros de las cadenas laterales y seleccionar las cadenas laterales más favorables usando como criterio una evaluación energética de los modelos, que es predictiva de mayor afinidad por la interacción péptido-proteína.

Las coordenadas del modelo de interacción de DIII con uno y/o varios dominios de unión a ligando del receptor A2MR pueden obtenerse a través de medios experimentales, usando técnicas de difracción de rayos X y/o RMN, o usando el modelado computacional.

También es posible utilizar un método computacional de acoplamiento molecular para reproducir los detalles atómicos de la interacción entre los péptidos correspondientes a la horquilla FG beta de DIII de la proteína E de diferentes flavivirus y los dominios de unión a ligando del receptor A2MR. Del mismo modo, es posible seleccionar de una base de datos de estructuras moleculares aquellos compuestos que reproducen las características de esta interacción, lo que constituiría, por lo tanto, posibles inhibidores para el bloqueo de las infecciones flavivirales.

Se pueden obtener otros agentes interferentes usando un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo seleccionado mediante cualquiera de los métodos disponibles en la técnica, por ejemplo por selección de bibliotecas de anticuerpos exhibidas en fagos. En este último caso, la selección puede implementarse de tal manera que propicie la obtención de una respuesta específica contra las regiones involucradas en las interacciones DV-A2MR o DV-A2M. Si la selección se implementa de tal manera que se seleccione una respuesta contra la región de interacción de A2MR o A2M, la selección debe permitir la discriminación entre la interferencia de esta interacción y la interferencia con la funcionalidad fisiológica de estas moléculas.

Se describe aquí también un método para bloquear la infección de células por DV, basado en el uso de un agente que interfiere con la expresión del receptor A2MR. Utilizando la metodología disponible en el estado de la técnica para el desarrollo de fármacos antivirales, es posible deducir que un ejemplo sería el uso de un ARN interferente corto (ARNsi) que disminuye o elimina temporalmente la expresión del receptor A2MR.

También se describe aquí un método para la prevención o el tratamiento de la enfermedad causada por la infección por DV, que comprende la administración de una cantidad efectiva de una molécula con actividad antiviral que interfiere con la interacción de DV con un receptor celular, en donde dicho celular receptor es el receptor celular A2MR. La molécula con actividad antiviral, formulada en condiciones aceptables de acuerdo con las regulaciones actuales para preparados farmacéuticos, se puede administrar en una dosis efectiva antes de la infección o después de la aparición de los síntomas de la enfermedad, con un diagnóstico confirmatorio de laboratorio para la infección por DV.

La molécula con actividad antiviral contra DV puede emplearse como un fármaco profiláctico antes de la exposición en áreas de alto riesgo para la infección por DV. Un área de alto riesgo para la infección de DV es una región geográfica conocida por albergar el vector para la transmisión de DV, es decir, el mosquito Aedes, y donde se produce la circulación detectable de cualquier serotipo de DV.

También se describe aquí un método para prevenir y/o tratar la enfermedad causada por DV, que comprende el uso

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(1992) Mapping of a region of dengue virus type-2 glycoprotein required for binding by a neutralizing monoclonal antibody. Gene. 116:139-50). Los aminoácidos adicionales, no presentes en la secuencia original pero introducidos durante el diseño, se representan en gris. Se usaron dos residuos de cisteína para introducir un puente de disulfuro que restringiría la libertad conformacional del péptido. La lisina N-terminal se introdujo para permitir la conjugación covalente de los péptidos a proteínas portadoras, y el residuo de β-alanina se incluyó como un espaciador. Se incluyen en el recuadro gris las secuencias de péptidos lineales utilizados en los informes precedentes en la literatura, DV2-1, DV1-1, DV2-2, DV2-3 (Hung JJ, Hsieh MT, Young MJ, Kao CL, King CC, Chang W (2004) An external loop region of domain III of dengue virus type 2 envelope protein is involved in serotype-specific binding to mosquito but not mammalian cells. J Virol. 78:378-88) and P'1 (Thullier P, Demangel C, Bedouelle H, Megret F, Jouan A, Deubel V, Mazie JC, Lafaye P (2001) Mapping of a dengue virus neutralizing epitope critical for the infectivity of all serotypes: insight into the neutralization mechanism J Gen Virol. 82(Pt 8):1885-92). Una representación tridimensional de la región abarcada por los péptidos (destacada en negro) sobre la estructura de DIII se encuentra en la parte inferior de la imagen.

Figura 16. Unión de los péptidos HDIII2CL y HDIII3CL a la superficie de las células blancas de la sangre humana periférica. Las células, aisladas por lisis de eritrocitos, se lavaron con PBS a pH 7.4, albúmina de suero bovino al 1% (BSA), NaN3 al 001%, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM y se fijaron con paraformaldehído al 1% en PBS a pH 7.4. Después del lavado, las células se incubaron con las diluciones del péptido durante 30 min. a 4°C en PBS a pH 7.4, 1% de BSA. La unión de los péptidos se detectó con un conjugado estreptavidina-FITC, utilizando citometría de flujo. Control celular: células fijas no tratadas con péptido o conjugado.

Figura 17. Inhibición de la infección de las células Vero con DV1 y DV2. (A) Se incubaron placas de seis pozos con una monocapa a aproximadamente el 90% de confluencia durante 30 min. a 37°C con diluciones de los péptidos en medio MEM. A continuación, se añadió una dilución de la cepa DV1 West Pac 74 o la cepa DV2 S16803, calculada para obtener un promedio de 100 placas líticas por pozo, y las placas se incubaron durante 30 min. a 37°C con la mezcla de virus/péptido. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces, se recibió la adición de medio MEM suplementado con aminoácidos no esenciales, 1% de suero de ternera fetal, 1% de CMC y finalmente se incubaron durante 5 días a 37°C bajo atmósfera de CO2. (B) Efecto inhibitorio de los péptidos a 100 μMol/L. NRpep: péptido no relacionado. Los datos sobre la secuencia de los péptidos 3H5 pept, pepDIII-1, HIII2CL y HIII3CL, así como en la región en la que se extienden sobre DIII de DV, se pueden obtener de la figura 11. El cálculo de los porcentajes de inhibición se describe en materiales y métodos. (C) Inhibición de la infección por DV2 mediante el uso de concentraciones variables de péptidos. Las placas víricas se visualizaron mediante tinción con Naphtol Blue Black. Control celular: células no tratadas. Control de virus: células incubadas con el virus, pero sin péptido. Para ambos péptidos se obtiene una inhibición del 50% a concentraciones de 22 a 45 μMol/L.

Figura 18. Alineación de secuencia múltiple de los residuos correspondientes a la horquilla beta FG de FV de interés para la salud humana y animal. (YFV) Virus de la Fiebre Amarilla, (WNV) Virus del Nilo Occidental, (JAE) Virus de la Encefalitis Japonesa, (TBE) Virus de la Encefalitis Transmitida por Garrapatas, (KUNJ) Virus Kunjin, (POW) Virus Powasan, (LAN) Virus Langat, (MVE) Virus de la encefalitis del valle de Murray y (SLE) virus de la encefalitis de Saint Louis.

Figura 19. Efecto producido en la unión de A2M y RAPR13 a la superficie de las células Vero mediante incubación simultánea con los péptidos. Las proteínas A2M y RAP13 fluoresceinadas se incubaron durante 30 minutos. a 4°C con células Vero pre-fijadas en presencia de concentraciones variables de HIII2CL y 3H5pept para alcanzar las relaciones de péptido/proteína molar indicadas. La unión de los ligandos marcados se detectó mediante citometría de flujo.

Figura 20. Inhibición de la infección de las células Vero con DV por preincubación con A2M. Las preparaciones virales se incubaron durante 1 hora a 25°C (A y C) o el tiempo indicado (B) con las proteínas por ejemplo, A2M activado (A2Mact), A2M no activado (A2M no act) y una proteína no relacionada (NR). Las mezclas de las proteínas con el virus se agregaron a monocapas de células Vero y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Las monocapas celulares se lavaron para eliminar el virus no unido. A continuación, se añadió medio MEM complementado con aminoácidos no esenciales y 1% de FBS, 1% de CMC y las células se incubaron durante 5 días a 37°C en una incubadora de CO2. Para visualizar las placas virales, las células Vero se tiñeron usando Naphtol Blue Black. Todos los puntos experimentales se realizaron en duplicados.

Figura 21. Perfil cromatográfico de la purificación de A2MR usando cromatografía de afinidad con A2M inmovilizado

(A) y análisis de fracciones SDS-PAGE eluidos usando un gel de gradiente de 5-15% (B). Efecto de la preincubación de las fracciones cromatográficas con DV2 sobre la infección de las células Vero (C). El ensayo de neutralización de reducción de placa se realizó como se describe en la figura 20. (D) Análisis de protección de ratones usando el modelo de encefalitis inducida por DV.

Figura 22. Análisis de protección de ratones utilizando el modelo de encefalitis inducida por DV. Enlace de GAGs de PepNR: péptido formado por un fragmento de secuencia de unión a glicosaminoglicanos y un fragmento de secuencia no relacionado.

Ejemplos

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en la cepa de E. coli BL21 (DE3) (Studier, F. W. and B. A. Moffatt. "Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes." J.Mol.Biol. 189.1 (1986): 113-30) e inoculación de una colonia bien aislada, un cultivo de 50 mL de medio ZYM5052 (Studier,F.W (2005) Protein production by autoinduction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification 41(1):207) complementada con kanamicina a 100 μg/ml en un matraz Erlenmeyer de 1 L que luego se incubó durante 16 horas a 28°C y 350 rpm. El cultivo inducido se centrifugó a 5000 x g durante 30 min. a 4°C, y la biomasa resultante se volvió a suspender en 30 mL de PBS y se rompió en 3 pases en una prensa francesa a 1500 kg/cm2. Después de centrifugar el homogeneizado resultante a 10 000 x g durante 30 min. a 4°C, la proteína se purificó del sobrenadante mediante cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (Sulkowski, E. (1985) Purification of proteins by IMAC. Trends Biotechnol. 3, 1-7) using Ni-NTA agarose (Qiagen Benelux B.V., Países Bajos), con un gradiente lineal de imidazol 10 a 300 mM en PBS/NaCl 0.3 M como regulador corriente para la elución. La proteína purificada tiene una pureza igual o superior al 90%, según lo estimado mediante el análisis de las exploraciones digitales de los geles de electroforesis de poliacrilamida desnaturalizantes teñidos con azul de Coomassie (SDS-PAGE) de las muestras, utilizando las rutinas densitométricas del paquete de aplicaciones de software ImageJ ver. 1.35d (Rasband W., http://rsb.info.nih.gov/ij/).

Síntesis de péptidos

Los péptidos se obtuvieron mediante síntesis en fase sólida en una resina Fmoc-AM-MBHA, usando la estrategia Fmoc/tBu (Barany, G. and Merrifield, R.B. J Am Chem Soc. 99 (1977) 7363-7365). Los aminoácidos se acoplaron mediante la activación con DIC/HOBt, monitoreando la finalización de la reacción de acoplamiento mediante el ensayo de ninhidrina (Kaiser, E., Colescott, R.L., Bossinger, C.D., Cook, P.I. Anal Biochem. 34 (1970) 595-598). Los péptidos sintetizados se separaron de la resina por tratamiento con una solución de TFA/EDT/H2O/TIS (94%/2.5%/2.5%/1%), se precipitaron con éter y se liofilizaron durante 72 h. La ciclización del péptido mediante la formación de un puente disulfuro se logró por oxidación con DMSO (Andreu, D., Albericio, F., Solé, N. A., Munson,

M. C., Ferrer, M. and Barany, G., Pennington, M. W. and Dunn, B. M. (Eds), Peptide Synthesis Protocols, Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, 1994, pp. 91-169). En todos los casos, los péptidos se purificaron mediante RP-HPLC y las fracciones recogidas se analizaron nuevamente mediante RP-HPLC analítica. La preparación final de cada péptido se obtuvo reuniendo las fracciones con una pureza cromatográfica igual o superior al 99%. La masa del péptido en cada preparación final se verificó mediante espectrometría de masas ESI-MS.

Ensayo para la unión de proteínas fluoresceinizadas a la superficie celular

Se obtuvieron células sanguíneas periféricas mononucleares mediante lisis de eritrocitos de muestras de sangre total de donantes sanos, que se habían obtenido por punción venosa en viales BD Vacutainer K3 EDTA. Se añadió a la sangre la solución de lisis (0.3 mol/L de NH4Cl, 20 mMol/L de KHCO3, 20 μmol/L de Na2EDTA), usando 2 ml por cada 100 µl de sangre, y las muestras se incubaron aproximadamente durante 15 minutos a 25°C, agitando las muestras a intervalos de 3 minutos. La reacción se detuvo mediante enfriamiento a 4ºC, y las células se separaron de la solución de lisis por centrifugación a 350 x g durante 5 minutos. Después de eliminar el sobrenadante, las células se lavaron con PBS a pH 7.4, albúmina de suero bovino al 1% (BSA), NaN3 al 0.01%, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM.

En el caso de células Vero cultivadas, se separaron de la superficie del matraz de cultivo sin usar proteasas, mediante incubación con PBS a pH 7.4, EDTA 5 mM durante 10 minutos a 37°C, tocando suavemente el exterior del matraz.

Las células, recogidas y lavadas como se describe anteriormente, se incubaron en solución de fijación (PBS a pH 7.4, paraformaldehído al 2%, NaN3 al 0.01%, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM durante 30 minutos a 4ºC y la solución de fijación se eliminó por centrifugación a 350 xg durante 5 minutos a 4°C. El ensayo se llevó a cabo incubando 1 x 105 células durante 1 hora a 4°C en un volumen total de 100 μL de cada dilución de las proteínas fluoresceinizadas (las diluciones se realizaron en PBS a pH 7.4, BSA al 1%, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM). Cada experimento incluyó controles con células no tratadas. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces y se incubaron nuevamente en solución de fijación. La intensidad de la fluorescencia se cuantificó mediante citometría de flujo en un citómetro PAS III (Partec, Alemania). Los valores para cada punto experimental se calcularon a partir de mediciones en un mínimo de 20000 células.

Inhibición de infección viral en células Vero

Las células Vero se cultivaron en placas de 24 pozos a aproximadamente el 90% de confluencia, y se lavaron dos veces con medio MEM sin FCS. Las diluciones que contenían las proteínas o los anticuerpos, de acuerdo con el objetivo del ensayo, se añadieron entonces y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Después de la incubación, se añadió el virus a una multiplicidad de infección de 0.1, seguido de una subsiguiente incubación durante 1 hora a 37ºC. Al final de la segunda incubación, el virus no unido se eliminó mediante lavado, y las células se incubaron durante 5 días a 37ºC en medio de alta densidad (MEM suplementado con aminoácidos no esenciales, 1 % de FCS, 1% de carboximetilcelulosa) para propiciar la aparición de placas líticas. Las placas se visualizaron mediante tinción con 0.1% de Azul Negro de Naftol en 0.15 mol/L de acetato de sodio. Se utilizaron dos réplicas por punto experimental en cada ensayo, y se realizaron tres determinaciones independientes. El porcentaje de inhibición se

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Ejemplo 2

El A2M humano interactúa directamente con DIII de la proteína E de DV2.

La presencia de fragmentos solubles de los receptores celulares en el plasma humano es ampliamente conocida. Por otro lado, también se sabe que la adición de suero a los medios de cultivo tiene una marcada influencia en la 5 eficacia de la infección de las células cultivadas por DV (Nash DR, Halstead SB, Stenhouse AC, McCue C. (1971) Nonspecific Factors in Monkey Tissues and Serum Causing Inhibition of Plaque Formation and Hemagglutination by Dengue Viruses. Infect Immun. 3:193-199). Por lo tanto, se decidió tratar de aislar las proteínas con afinidad por DIII de la proteína E del plasma humano, con el objetivo de detectar potenciales receptores celulares de DV. Las muestras de plasma, obtenidas de donantes sanos de 30 a 40 años de edad sin anticuerpos detectables contra el

10 virus, se inactivaron mediante incubación a 56°C durante 1 hora y las proteínas precipitadas se eliminaron de la solución mediante centrifugación (5000 x g, 10 min). El sobrenadante se almacenó a -80°C hasta su uso.

El aislamiento de proteínas que se unen a DIII se realizó mediante cromatografía de afinidad. Se mezclaron cuatro partes de plasma humano, procesadas como se describe anteriormente, con una parte de HEPES 100 mM a pH 6, NaCl 1.75 M, CaCl2 25 mM, MgCl2 5 mM y se cargaron en una columna (1.5 cm de diámetro x 1.2 cm de altura) 15 rellena con la resina de afinidad DIIIE2J, a un flujo de 10 cm/h. La muestra fue recirculada en estas condiciones en la columna durante 4 horas adicionales, a 25°C, y luego la columna se lavó extensamente con 100 volúmenes de columna de regulador HEPES 20 mM, pH 6, NaCl 0.35 M, CaCl2 5 mM, 1 mM MgCl2. Adicionalmente, la columna se lavó con regulador HEPES 20 mM pH 6, NaCl 0.5 M, CaCl2 5 mM, MgCl2 1 mM. Se logró la elución de la proteína unida cargando Gly 10 mM, pH 2.5, en la columna, monitoreando la absorbancia a 280 nm del eluato con un

20 detector UV.

Para identificar las especies de proteína presentes en el eluato, se precipitó una alícuota de 100 μL de la fracción recolectada con ácido tricloroacético al 10%, se resuspendió en 20 μl de regulador de muestra y se sometió a SDS-PAGE. Las bandas de proteína se escindieron y se digirieron con tripsina, seguido por el análisis ESI-MS de los péptidos eluidos.

25 Se inspeccionaron los espectros de masas obtenidos para cada banda de proteína, y las señales con la intensidad más alta se fragmentaron para obtener información de secuencia para los péptidos. En todos los casos, los péptidos secuenciados correspondieron a fragmentos trípticos de proteínas plasmáticas humanas (tabla 1).

Tabla 1. Resumen de las proteínas identificadas en el eluato de la cromatografía de afinidad con DIIIE2J inmovilizado.

Secuencia de péptidos

Identificación de Mascot1 Descripción de la proteína

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P01023 α2-macroglobulina humana

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P02743 Componente Amiloide P de suero humano

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P04220 Cadena pesada de IgM humana

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Q645G4 Albúmina de suero humano

DSTYSLSSTLTLSK

P01834 Región C de la cadena kappa de IgG humana

1: Número de acceso en la base de datos Swiss-Prot de la proteína identificada por MASCOT (Perkins DN, Pappin DJ, Creasy DM, Cottrell JS (1999) Probability-based protein identification by searching sequence

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Los ligandos naturales del receptor A2MR inhiben la unión de DIII a las células Vero y la infección viral.

La RAP es una chaperona molecular natural para LRP1. Esta proteína controla la actividad de LRP1, posiblemente al mediar un cambio conformacional que impide la unión y/o la internalización de varios ligandos para este receptor (Herz J, Goldstein JL, Strickland DK, Ho YK, Brown MS. (1991) 39-kDa protein modulates binding of ligands to low density lipoprotein receptor-related protein/alpha 2-macroglobulin receptor J Biol Chem. 266:21232-8). Por lo tanto, RAP constituye un ligando ideal para obtener evidencias de la implicación de LRP1 en la endocitosis de DV en células de mamíferos.

La línea celular Vero ha sido ampliamente utilizada en el estudio de la naturaleza de las interacciones de DV con sus receptores celulares. Estas células son altamente susceptibles a la infección por los cuatro serotipos virales. Constituyen una herramienta particularmente ventajosa para la evaluación de actividades antivirales contra DV, ya que pueden usarse para ensayos que miden la inhibición de la formación de placas líticas.

Dado que esta línea celular se deriva de células renales de mono (https://www.atcc.org/) y que los ligandos para el receptor A2MR utilizados en los ensayos son de origen humano, un paso preliminar y necesario fue la corroboración de la unión de las proteínas RAPR13 y A2M_MeNH2 a las células Vero. Con este objetivo, estas proteínas fueron fluoresceinizadas, y su unión a la superficie de las células Vero se midió mediante citometría de flujo. Ambas moléculas mostraron un comportamiento de unión saturable y dependiente de la concentración en esta línea celular (Figura 7A).

Después de este primer experimento, se determinó si RAPR13 era capaz de inhibir la unión de A2M-MeNH2 a células Vero, incubando células prefijadas durante 30 minutos a 4°C con mezclas de A2M_MeNH2 fluoresceinado y RAPR13 o EGF recombinante humano como control, usando las proteínas no marcadas en un exceso molar de 100 veces. Los resultados obtenidos evidencian una disminución de la fluorescencia de las células incubadas con A2M_MeNH2 en presencia de RAPR13, en contraste con las muestras incubadas con A2M_MeNH2 en presencia de EGF humano recombinante (Figura 7B). Estos resultados corroboran que tanto A2M_MeNH2 como RAPR13 se unen de manera específica y funcional al receptor A2MR en células Vero.

El ensayo para la inhibición de la infección se realizó en placas de 24 pozos sembradas con una monocapa de células Vero a aproximadamente el 90% de confluencia. La dilución del virus se ajustó para obtener aproximadamente 20 placas líticas por pozo. Los resultados del ensayo mostraron una reducción drástica en el número de placas líticas cuando las células se preincubaron antes de agregar el virus con la proteína RAPR13 o con una preparación de anticuerpos policlonales contra el receptor A2MR (tabla 2). No hubo reducciones significativas cuando las células se preincubaron con BSA o con preparaciones de anticuerpos contra un antígeno no relacionado.

Tabla 2. Ensayo para la inhibición de la infección de células Vero por un ligando natural del receptor A2MR o por anticuerpos anti-receptor1.

Proteína

DV1 DV2 DV3 DV4

RAPR13

65 76 60 75

BSA

7 - - -

α-A2MR

82 90 90 85

α-NR

5 - - -

1. Los resultados representan el promedio de tres determinaciones independientes. Las cepas virales utilizadas en el ensayo fueron West Pac 74 para DV1, S16803 para DV2, CH53489 para DV3 y TVP360 para DV4.

Las proteínas RAP13 y BSA se usaron a una concentración de 100 μg/mL en el ensayo. α-A2MR: anticuerpos obtenidos por inmunización con el receptor A2MR. α-NR: Anticuerpos obtenidos por inmunización con una proteína no relacionada. Ambas preparaciones de anticuerpos se usaron a una dilución 1/100.

De manera similar, fue posible mostrar mediante un ensayo de reducción de placa lítica que la inhibición de la infección obtenida para DV2 con la proteína RAPR13 depende de la concentración de proteína utilizada en el experimento (Figura 8). Este resultado constituye una fuerte evidencia de la participación del receptor A2MR en la mediación de la entrada de DV a su célula objetivo.

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Diseño de péptidos sintéticos topográficos y estructuralmente limitados.

Aunque se reconoce ampliamente el papel esencial desempeñado por DIII en la unión de FV a las células huésped, no hay informes de péptidos sintéticos derivados de DIII con una actividad potente (a niveles nanomolar o de bajo micromolar) para la inhibición de la infección de DV. Varias razones explican esta situación: 1) No es trivial imitar los determinantes estructurales de las proteínas enteras con péptidos sintéticos, ya que los parches superficiales involucrados en las interacciones proteína-proteína son a menudo topográficos, compuestos por residuos que están estrechamente posicionados en el tridimensional estructura pero separada a lo largo de la secuencia de la proteína, 2) Por lo general, estos parches de interacción son bastante grandes, con áreas que van desde varios cientos hasta algunos miles de Å2. Esta magnitud es mayor que la superficie total de pequeños péptidos, 3) Los péptidos tienen una estructura flexible en solución, lo que implica que habrá una pérdida considerable en la entropía conformacional al adoptar la estructura que es biológicamente relevante para la interacción con su compañero de unión y, por lo tanto, la afinidad del complejo péptido-proteína será significativamente menor que la del complejo proteína-proteína, 4) Es posible que el péptido adopte conformaciones relativamente estables en solución, pero estas conformaciones pueden ser diferentes de las adoptadas por el péptido en el contexto de su proteína nativa, 5) La unión del virus a su(s) receptor(es) de proteína puede implicar interacciones multipunto y, por lo tanto, tendrá una gran avidez, ya que la superficie viral tiene múltiples copias simétricas de DIII. Esto impone una barrera de alta energía para la competencia entre el virus y el péptido para el receptor.

Los datos obtenidos durante los estudios sobre la relación estructura-función de la interacción entre el receptor A2MR y sus ligandos naturales han demostrado el papel importante desempeñado por los grupos de residuos básicos y/o por las cadenas laterales de Lys/Arg en la superficie de los ligandos A2MR. Tal es el caso de Lys1370 para A2M (SEQ ID. 2) y Lys57 para exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, que, si se cambia por mutagénesis dirigida al sitio, dan como resultado caídas significativas en la unión del ligando al receptor (Arandjelovic S, Hall BD, Gonias SL (2005) Mutation of lysine 1370 in full-length human alpha2-macroglobulin blocks binding to the low density lipoprotein receptor-related protein-1. Arch Biochem Biophys. 438:29-35, Wedekind JE, Trame CB, Dorywalska M, Koehl P, Raschke TM, McKee M, FitzGerald D, Collier RJ, McKay DB. (2001) Refined crystallographic structure of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A and its implications for the molecular mechanism of toxicity J Mol Biol. 314:823-37). De manera similar, otros estudios han subrayado la importancia de un grupo básico formado por los residuos 136-150, junto con Arg172, para la proteína de la apoE (Raussens V, Slupsky CM, Ryan RO, Sykes BD (2002) NMR structure and dynamics of a receptor-active apolipoprotein E peptide. J Biol Chem. 277:29172-80).

Por otro lado, los dominios de unión al ligando del receptor A2MR y, en general, los de todos los miembros de la familia del receptor LDL, se caracterizan por un potencial electrostático significativamente negativo en la superficie de unión al ligando, debido a la presencia de los residuos de ácido conservados y expuestos que pueden interactuar favorablemente con los residuos básicos en el ligando que interactúa. Por ejemplo, la estructura cristalográfica de un complejo entre un fragmento del receptor VLDL y el rhinovirus humano 2, perteneciente al grupo minoritario de los rinovirus, muestra una interacción estrecha entre LYS224 de la proteína VP1 de la cápside viral y los residuos ASP139 y GLU137 de el receptor receptor (Verdaguer N, Fita I, Reithmayer M, Moser R, Blaas D (2004) X-ray structure of a minor group human rhinovirus bound to a fragment of its cellular receptor protein. Nat Struct Mol Biol. 11:429-34). La cadena lateral alifática de Lys224 de VP1 interactúa, además, con Trp132 del dominio receptor que, aunque no está estrictamente conservado entre todos los dominios de unión a ligando de A2MR, es el aminoácido más frecuente en esta posición (en 20 dominios de 31, con Leu que aparece en 4 dominios, Phe en 3, Arg en 2 y Lys y Ser en solo 1 cada uno) (Figura 9). La Tabla 3 muestra los parches de unión al ligando del receptor A2MR, definidos por las posiciones estructuralmente equivalentes a Trp132, ASP135, GLU137 y ASP139 en el receptor VLDL.

Tabla 3. Parches de unión de ligandos en el receptor A2MR1.

Dominio*

Primer resid. Último resid. Longitud en aa. P1 P2 P3 P4

A1

25 66 42 W45 D48 E50 D52

A2

70 110 41 R90 N93 V95 D97

A3

852 892 41 W871 D874 D876 D878

A4

893 933 41 W912 D915 D917 D919

A5

934 973 40 W953 D956 D958 D960

A6

974 1013 40 W994 D997 D999 D1001

Dominio*

Primer resid. Último resid. Longitud en aa. P1 P2 P3 P4

A7

1013 1053 41 W1032 D1035 D1037 D1039

A8

1060 1099 40 W1080 D1083 D1085 D1087

A9

1102 1142 41 W1123 D1126 D1128 D1130

A10

1143 1182 40 K1164 D1167 N1169 D1171

A11

2522 2563 42 L2542 D2545 V2547 H2549

A12

2564 2602 39 L2583 N2586 A2588 D2590

A13

2603 2641 39 S2622 N2625 F2627 D2629

A14

2642 2690 49 W2671 D2674 A2676 D2678

A15

2694 2732 39 W2713 D2716 E2718 D2720

A16

2732 2771 40 W2751 D2754 S2756 D2758

A17

2772 2814 43 W2792 D2795 D2797 D2799

A18

2816 2855 40 F2835 D2838 D2840 D2842

A19

2856 2899 44 W2876 D2879 E2881 D2783

A20

2902 2940 39 L2922 N2925 Q2927 D2929

A21

3332 3371 40 W3351 D3354 E3356 D3358

A22

372 3410 39 F3391 3394 D3396 D3398

A23

3411 3450 40 F2431 N2434 Q2436 N2438

A24

3451 3491 41 W3471 D3474 D3476 D3478

A25

3492 3533 42 W3512 D3515 E3517 D3519

A26

3534 3572 39 W3553 D3556 D3558 D3560

A27

3573 3611 39 W3592 D3595 D3597 D3599

A28

3611 3649 39 W3630 D3633 D3635 D3637

A29

3652 3692 41 W3671 D3674 E3576 D3678

A30

3693 3733 41 R3714 D3717 T3619 N3621

A31

3739 3778 40 L3759 N3762 F3764 D3766

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Dominio*

Primer resid. Último resid. Longitud en aa. P1 P2 P3 P4

1. La numeración en la tabla corresponde a la secuencia de A2MR humano (SEQ ID NO. 3). Dominio: Denominación de los dominios de unión al ligando del receptor A2MR humano en el banco de datos SwissProt. Primer resid. y ultimo resid., posiciones del primer y último residuo de los diferentes dominios de unión del ligando del receptor. Longitud en aa.: número total de aminoácidos del dominio de unión al ligando. P1-4: residuos que forman el parche de unión al ligando.

Dada la importancia de los residuos de Lys/Arg y, en general, de cargas electrostáticas en la interacción con los dominios de unión a ligando de la familia de receptores de LDL, se inspeccionó la localización de los residuos cargados en las superficies expuestas superior y lateral de los modelos tridimensionales de la estructura de DIII correspondientes a DV1-4.

Para este análisis, las estructuras de la proteína E de DV2 y DV3 (entradas 1oan y 1uzg en el banco de datos de proteínas) se usaron como plantillas para construir modelos de la estructura 3D de la proteína E de DV1 y DV4, usando el programa MODELLER (A. Sali, T.L. Blundell. (1993) Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. J. Mol. Biol. 234:779-815). Como se puede ver en la figura 10, hay cuatro parches de superficie correspondientes a cadenas laterales de lisina que se conservan en los cuatro serotipos. Con la excepción del parche definido por Lys310 en DV1, 2 y 4 (Lys308 en DV3), los parches restantes no se conservan estrictamente al nivel de su localización en la estructura primaria, sino más bien en su posición topográfica en la superficie de la proteína. Esto es posible debido a la aparición de mutaciones correlacionadas en posiciones cercanas en la estructura 3D de la proteína y debido a la flexibilidad de la cadena lateral de la lisina. Dos de los parches se ubican en la superficie expuesta correspondiente a la hoja beta definida por las cadenas A, B, C', D y E (Figura 11A), mientras que los parches restantes están ubicados en la superficie lateral/superior correspondiente o adyacente al FG beta horquilla.

Al menos uno de los cuatro parches de lisina conservados en la superficie de los DIII, y especialmente los dos parches localizados en o adyacentes a la superficie expuesta de la horquilla beta de FG, interactúan favorablemente con los parches de enlace de ligandos del receptor A2MR, definido en la tabla 3.

Con el fin de diseñar péptidos basados en DIII que pueden inhibir la infección de FV, el segmento Ser376-Trp391 (numeración de residuos de DV2) se seleccionó como el punto de partida. Este segmento comprende la horquilla beta de FG, que expone un área total de 745 Å2 al disolvente y es parte de la superficie superior/lateral del dominio que permanece expuesto en el contexto de la estructura del virión maduro. Se ha informado que varias mutaciones en esta región afectan la unión de anticuerpos neutralizantes que bloquean la interacción del virus con la célula o afectan el fenotipo viral. La estructura de la columna vertebral de este segmento se conserva entre las estructuras cristalográficas disponibles de la proteína E de DV2 y DV3 (Figura 11B). Esta conservación estructural también incluye el bucle F-G, que tiene un giro beta tipo II entre los residuos Glu383-Gln386 (numeración de residuos de acuerdo con SEQ ID 1). La conservación de la estructura de la columna vertebral del segmento FG también es aplicable a DV1 y DV4, considerando el grado de similitud entre las secuencias correspondientes, además de la similitud estructural entre los modelos 3D de la proteína E de estos virus, obtenidos mediante el modelado de homología basado en las coordenadas DV2 y DV3, respectivamente (Figura 11B).

La Figura 11 (C y D) muestra la estructura primaria y los modelos 3D de los péptidos sintéticos HDIII2CL y HDIII3CL, diseñados sobre la base de la horquilla FG de DV2 y DV3.

Los péptidos sintéticos incluyen dos cisteínas, una en el extremo N y otra en el extremo C. Estos residuos pueden formar un puente de disulfuro que es estructuralmente compatible con una estructura de horquilla beta, como lo indican los modelos de la estructura tridimensional de estos péptidos (Figura 11C y D). En estos modelos, los carbonos alfa de las cisteínas están separados por 5.7 Å, que es una distancia común para los puentes de disulfuro. La ciclización por un puente disulfuro contribuye a la estabilización de la estructura de horquilla del péptido al disminuir la entropía conformacional de su columna vertebral.

El diseño permite la formación de 6 enlaces de hidrógeno entre la cadena principal de las cadenas F y G del péptido, aumentando aún más su estabilidad (Figura C y D). Los residuos 4 y 6 (fila F) y 13, 15 y 17 (fila G) son hidrófobos y están orientados hacia la misma cara de la horquilla, lo que garantiza una interacción hidrófoba favorable entre ellos. Los residuos 4-6 de la cadena beta F están bifurcados en el carbono beta, y se caracterizan por una alta propensión a la adopción de estructuras beta/extendidas.

El péptido HDIII3CL (SEQ ID. 7) incluye los residuos Lys11 y Lys14, que corresponden a dos parches de lisina de DIII que constituyen sitios putativos para una interacción favorable con los dominios de unión a ligando de A2MR. El péptido HDIII2CL (SEQ ID. 5) solo tiene 1 parche formado por Lys14; mientras que HDIII1CL (DV1, SEQ ID. 6) tiene dos parches y HDIII4CL (DV4, SEQ. ID.8) no tiene ninguno.

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10

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55

Además, se diseñaron los péptidos cíclicos HDIII2Cs (SEQ ID. 4) y pepDIII-1, que corresponden respectivamente con las secuencias Ile379-Lys388 y Gly381-Gln386 de la proteína E de DV2 (Figura 12A). Ambos péptidos incluyen cisteínas en los extremos N y C para su ciclización mediante puentes disulfuro que son estructuralmente compatibles con la estructura 3D de la proteína nativa. El péptido HDIII2Cs es análogo al péptido HDIII2CL, pero incluye solo una porción de las cadenas beta F y G. Por otro lado, el péptido pepDIII-1 solo incluye el bucle F-G.

Ejemplo 6

El péptido HDIII2Cs reproduce un epítopo topográfico de DIII de DV2

Con el objetivo de evaluar el reconocimiento del péptido HDIII2Cs por mAb 3H5, los conjugados de péptido-BSA se prepararon y analizaron mediante transferencia de Western con este anticuerpo (Figura 12B). La proteína recombinante PD5 se utilizó como control positivo para este ensayo. Esta proteína está formada por DIII de la proteína E de DV2 (residuos 286-426) fusionada al C-terminal de la lipoamida deshidrogenasa (P64k) de Neisseria meningitidis. El PD5 se ha evaluado como candidato a vacuna y es capaz de provocar una respuesta inmune protectora evaluada por una prueba viral en modelos de infección en ratones y monos (Hermida L., Rodriguez R., Lazo L., Silva R., Zulueta A., Chinea G., Lopez C., Guzmán M.G. and Guillen G. (2004) A dengue-2 Envelope fragment inserted within the structure of the P64k meningococcal protein carrier enables a functional immune response against the virus in mice. J Virol Methods. 115: 41-49), lo que demuestra que esta proteína muestra epítopos importantes de esta región del virus.

El anticuerpo monoclonal 3H5 se obtuvo mediante inmunización con una preparación DV2 (Gentry MK, Henchal EA, McCown JM, Brandt WE, Dalrymple JM. (1982) Identification of distinct antigenic determinants on dengue-2 virus using monoclonal antibodies Am J Trop Med Hyg. 31(Pt 1):548-55), y reconoce en un serotipo específico un epítopo en DIII que depende de la presencia del puente disulfuro. Este anticuerpo neutraliza potentemente los aislamientos pertenecientes al serotipo 2. Los datos publicados indican que existe una alta correlación entre la actividad neutralizante de este mAb y su capacidad para inhibir la unión del virus a sus receptores celulares (He RT, Innis BL, Nisalak A, Usawattanakul W, Wang S, Kalayanarooj S, Anderson R (1995) Antibodies that block virus attachment to Vero cells are a major component of the human neutralizing antibody response against dengue virus type 2 J Med. Virol. 45:451-61). El reconocimiento específico del péptido HDIII2Cs por este anticuerpo evidencia que el péptido reproduce un epítopo topográfico de la superficie de DIII de mayor importancia funcional.

Una de las herramientas utilizadas para la caracterización de péptidos topográficos es la obtención y caracterización de sueros anti-péptido. Con el objetivo de reunir evidencia adicional que respalde la hipótesis de que el péptido diseñado reproduce las características antigénicas de la región equivalente de la proteína E en el virus, se inició un esquema de inmunización usando un conjugado HDIII2Cs-KLH como inmunógeno. El esquema comprendía la administración subcutánea de cinco dosis del conjugado HDIII2Cs-KLH a 10 ratones Balb C. El título antipéptido de los sueros de animales inmunizados (1/2700) se determinó usando un ensayo ELISA indirecto, recubriendo las placas con HDIII2C y comparando la reactividad de los sueros inmunes con los de sus controles preinmunes.

Para evaluar si el péptido HDIII2Cs era capaz de provocar una respuesta de anticuerpo dependiente de la conformación, se realizó un ensayo de transferencia de puntos en el que dos fragmentos de membrana de nitrocelulosa se sensibilizaron con la proteína PD5 y el péptido HDIII2Cs, ya sea sin modificar o reducirse y carbamidometilado (Figura 12C). El ensayo evidenció una disminución en la intensidad de la señal para el reconocimiento por los sueros de ambos PD5 y el péptido tras la pérdida de sus puentes disulfuro. El ensayo también evidenció que el péptido es reconocido por mAb 3H5, y esta señal se pierde al reducir y carbamidometilar el péptido.

Finalmente, evaluamos el reconocimiento por el suero antipéptido del virus obtenido después de la infección de las células Vero en un formato de transferencia de Western, así como su capacidad para inmunoprecipitar 35S_VD2. En la transferencia de Western, el suero anti-HDIII2Cs reconoció una banda en la misma posición de una banda reconocida por mAb 3H5, correspondiente al peso molecular de la proteína E (Figura 13A). No hubo señales en la membrana incubadas con los sueros preinmunes, lo que demuestra que el reconocimiento mediado por la respuesta antipéptido fue específico. Finalmente, el suero anti-HDIII2Cs fue capaz de inmunoprecipitar la proteína E de DV2 (Figura 13B).

Los resultados obtenidos demuestran que el péptido HDIII2C imita un epítopo dependiente de puente disulfuro de DIII de la proteína E de DV2 y que la restricción conformacional impuesta al péptido por el puente disulfuro tiene un efecto dominante sobre la respuesta de anticuerpo obtenida tras la inmunización con este antígeno. Por lo tanto, la ciclización del péptido es necesaria para imitar adecuadamente la estructura de este epítopo.

Ejemplo 7

El péptido HDIII2CL es una mejor imitación de la estructura del epítopo que el péptido HDIII2C

Se inició un programa de inmunización con el objetivo de determinar si el péptido HDIII2CL fue capaz de obtener una mejor respuesta que el péptido HDIII2C, evaluado sobre la base de las características conformacionales de esta región antigénica en la partícula viral. El esquema de inmunización también incluía los péptidos HDIII2C y pepDIII-1

5

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30

35

(Figura 12A). De forma similar al esquema anterior, este experimento usó conjugados de péptido-KLH como antígenos y siguió la misma ruta de dosificación e inmunización descrita en el ejemplo 6.

Los sueros antipéptido resultantes se analizaron en un ensayo ELISA indirecto, recubriendo las placas con PD5 y P64k en tres variantes: sin modificar, carbamidometilado y reducido/carbamidometilado. Tanto los sueros anti-HDIII2C como los sueros anti-HDIII2CL reconocen la proteína PD5 de una manera dependiente de la conformación, como lo demuestran las mayores reactividades con la proteína no modificada, en comparación con la variante reducida y carbamidometilada (Figura 14). Sin embargo, el impacto de la pérdida del puente disulfuro en el reconocimiento de la proteína por el suero anti-HDIII2CL es mayor que para el suero anti-HDIII2C y reproduce mejor el efecto observado para los sueros anti-DV2 obtenidos por la inmunización de ratones con preparaciones virales (Figura 14). Este resultado muestra que el rediseño que resultó en el péptido HDIII2CL logra una mejor representación de la conformación presente en esta región de DIII en el contexto del virus.

Ejemplo 8

Los péptidos topográficos correspondientes al giro FG muestran una inhibición de amplio espectro contra los cuatro serotipos de DV

Se realizó un ensayo con los péptidos HIII2CL y HIII3CL (Figuras 11C, 10D y 15) para estimar su capacidad para imitar las interacciones de DIII con las moléculas de la superficie celular. El ensayo empleó péptidos biotinilados para facilitar su detección en experimentos de citometría de flujo por medio de un conjugado de estreptavidina-FITC. La figura 16 representa los histogramas que representan el comportamiento de la intensidad de la fluorescencia en las células después de la incubación con diferentes diluciones de los péptidos HIII2CL y HIII3CL, además de un péptido no relacionado (0.3-0.02 mg/ml). Los resultados muestran que ambos péptidos se unen a la superficie celular de una manera dependiente de la concentración (Figura 16), lo que implica que la interacción es específica. El cambio en el histograma producido por el péptido HIII3CL es significativamente mayor que el producido por HIII2CL. Este resultado indica que el péptido HIII3CL establece una interacción de mayor afinidad, que es coherente con la presencia en esta molécula de dos residuos de lisina potencialmente importantes para la interacción con el receptor A2MR (Lys11 y Lys14, figuras 10C y 11D), frente a la ausencia de uno de ellos (Lys11, figuras 10B y 11C) del péptido HIII2CL.

DIII tiene una de las regiones más variables de la superficie expuesta de la proteína E. De hecho, una de las características antigénicas de este dominio es que los anticuerpos obtenidos contra esta región son predominantemente serotipo específicos (Roehrig JT, Bolin RA, Kelly RG (1998) Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the dengue 2 virus, Jamaica Virology 246:317-28). Sin embargo, durante el ensayo de inhibición con diferentes serotipos DV, los péptidos muestran una actividad inhibidora de amplio espectro, que inhibe eficazmente la infección de las cepas de los serotipos homólogos, así como de los serotipos heterólogos (tabla 3). Es importante notar que a la concentración ensayada (0.1 mg/ml) todos los péptidos en todas las condiciones, con la excepción del péptido HIII4CL para DV3, produjeron niveles de inhibición superiores al 50%.

Tabla 3. Inhibición de la infección de los cuatro serotipos de DV por los péptidos diseñados.

Péptido

DV1 DV2 DV3 DV4

HDIII1CL

+ + + +

HDIII2CL

+ + + +

HDIII3CL

+ + + +

HDIII4CL

+ + +/ +

HDIII2Cs

- - - -

3H5pept

- - - -

Los resultados mostrados corresponden a un ensayo de reducción del número de placas virales, realizado en células Vero. Los péptidos se usaron a una concentración de 0.1 mg/ml. Los símbolos representan el grado de reducción del número de placas víricas en estado experimental, en comparación con un control en el que las células se incubaron con el virus sin tratamiento previo con el péptido. (+) Disminución del 50% o superior, (+/-) Disminución del 10-50% en el número de placas, (-) Menos del 10% de disminución en el número de placas.

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Claims (1)

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