JP2024508799A - ヒトサイトメガロウイルス糖タンパク質ｂポリペプチドにおける新規創薬可能領域およびその使用方法 - Google Patents
ヒトサイトメガロウイルス糖タンパク質ｂポリペプチドにおける新規創薬可能領域およびその使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）ポリペプチドを有するヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の感染によって引き起こされる疾患のための候補治療剤を同定するための方法であって、創薬可能領域を含むＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドと、化合物とを接触させることを含み、前記化合物の結合が、候補治療剤を示す、方法に関する。本発明はまた、ＨＣＭＶ活性のモジュレーターおよび阻害剤を含む候補治療剤ならびに前記モジュレーターおよび阻害剤を含む医薬組成物ならびにその使用方法にも関する。【図１】TIFF2024508799000020.tif15650
Description
関連出願
本出願は、２０２１年２月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／１５３，１６４号および２０２２年２月４日に出願された米国仮特許出願第６３／３０６，６６９号の優先権の利益を主張する。前記出願のそれぞれの全内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年２月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／１５３，１６４号および２０２２年２月４日に出願された米国仮特許出願第６３／３０６，６６９号の優先権の利益を主張する。前記出願のそれぞれの全内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に出願され、．ｔｘｔ形式の電子的に提出された配列表を含む。．ｔｘｔファイルは２０２２年２月３日に作成され、１，３７４ＫＢのサイズを有する、「ＰＣ７２７１５＿Ｆｅｂ２０２２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」の表題の配列表を含有する。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に出願され、．ｔｘｔ形式の電子的に提出された配列表を含む。．ｔｘｔファイルは２０２２年２月３日に作成され、１，３７４ＫＢのサイズを有する、「ＰＣ７２７１５＿Ｆｅｂ２０２２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」の表題の配列表を含有する。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）ポリペプチドにおける新規創薬可能領域および例えば、創薬のための、その使用方法に関する。
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、β－ヘルペスウイルス科の二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＨＣＭＶは、妊娠女性における潜在ウイルスの感染または再活性化後の垂直ウイルス伝染の結果生じる先天性難聴および新生児難聴の主因である。さらに、ＨＣＭＶは、固形臓器および幹細胞移植患者、ＡＩＤＳ患者などの免疫抑制患者に影響する一般的な日和見病原体である。ＨＣＭＶに対するワクチンの開発は米国医学研究所によって最優先事項として列挙されているが、今まで認可されたものはない。
ＨＣＭＶゲノムは、いくつかのエンベロープ糖タンパク質をコードするが、その１つは糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）である。糖タンパク質Ｂは、細胞中へのウイルス進入にとって必要である融合因子であり、感染に対する中和抗体（ｎＡｂ）応答のための重要な標的である。ｇＢサブユニット抗原を含むＨＣＭＶワクチンが、開発中である。
融合は、ウイルス感染力における重要なステップであるため、ｇＢタンパク質内の創薬可能領域の同定はさらに、融合を特異的に阻害し、したがって、ＨＣＭＶによるウイルス感染を阻害することができる治療剤の同定および開発を可能にするであろう。
ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質構造は、その融合前と融合後のコンフォメーションの両方において、以下で詳細に説明されるように解明されており、それによって、ポリペプチド、およびそこに含まれる創薬可能領域、ドメインなどの構造に関する情報を提供し、その全てを合理的薬物設計の努力において使用することができる。
したがって、本発明は、部分的には、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質における新規創薬可能領域を提供する。化合物と、そのような領域との相互作用、または化合物を用いたそのような領域の活性のモジュレーションは、ウイルス融合、したがって、ウイルス感染力を阻害することができる。一態様では、本発明は、例えば、ウイルス融合阻害剤などの、ｇＢタンパク質を有するＨＣＭＶによって引き起こされるＨＣＭＶ感染のための候補治療剤を探索するためにこれらの創薬可能領域に対する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
さらに、本発明は、ＨＣＭＶ感染によって引き起こされる疾患を処置または防止するための候補治療剤を同定するための方法であって、創薬可能領域を含む糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）ポリペプチドを有するＨＣＭＶと、化合物とを接触させることを含み、前記化合物の結合が、候補治療剤を示す、方法を提供する。化合物は、ある特定の実施形態では、以下のクラスの化合物：タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、抗体、核酸、および低分子から選択することができるか、または化合物のライブラリーから選択することができる。そのようなライブラリーを、コンビナトリアル合成法によって生成することができる。結合を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかでアッセイすることができる。この方法のある特定の実施形態では、タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質であり、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の創薬可能領域に由来する、少なくとも１個の残基、好ましくは、３個の残基を含む。そのような創薬可能領域を、構造決定、薬物スクリーニング、薬物設計、および本明細書に記載され、特許請求される他の方法において利用することもできる。
一実施形態では、創薬可能領域は、配列番号１の残基Ｋ１３０～Ａ１３５、Ｄ２１６～Ｗ２３３、Ｒ２５８～Ｋ２６０、Ａ２６７～Ｖ２７３、Ｒ３２７～Ｄ３２９、Ｗ３４９～Ｅ３５０、Ｖ４８０～Ｋ５１８およびＮ６７６～Ｙ６９０を含む。これらの残基は、融合後コンフォメーションにおけるＨＣＭＶ ｇＢタンパク質のドメインＶのための結合ポケットを形成する。
さらに別の実施形態では、創薬可能領域は、融合後コンフォメーションにおけるＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の融合ループまたはその一部を含む。
別の態様では、本発明は、ｇＢタンパク質を有するＨＣＭＶによって引き起こされる感染を処置または防止するための候補治療剤を同定するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、そのような方法は、創薬可能領域を含むｇＢタンパク質と、化合物とを接触させることを含み、前記ｇＢタンパク質の活性のモジュレーションは、候補治療剤を示す。他の実施形態では、そのような方法は、創薬可能領域を含むｇＢタンパク質と、化合物とを接触させることを含み、前記創薬可能領域の移動または相互作用の妨害は、候補治療剤を示す。さらに他の実施形態では、前記ｇＢタンパク質の機能または活性のモジュレーションは、融合後コンフォメーション変化の完了を妨害することを含む。さらに別の実施形態では、前記ｇＢタンパク質の機能または活性のモジュレーションは、コンフォメーション変化の第１段階を妨げることを含む。別の実施形態では、そのような方法は、創薬可能領域を含むｇＢタンパク質と、化合物とを接触させることを含み、前記ウイルスの融合の阻害は、候補治療剤を示す。さらに別の実施形態では、そのような方法は、創薬可能領域を含むｇＢタンパク質と、化合物とを接触させることを含み、前記ＨＣＭＶのウイルス感染力の阻害は、候補治療剤を示す。さらに別の実施形態では、対象におけるＨＣＭＶ感染によって引き起こされる疾患の少なくとも１つの症状の低減は、候補治療剤を示す。
さらなる実施形態では、本発明は、ｇＢタンパク質を有するＨＣＭＶの感染によって引き起こされる疾患のための候補治療剤を同定するための方法であって、創薬可能領域を含むｇＢタンパク質と、化合物とを接触させることを含み、化合物が、ｇＢタンパク質のドメインＶまたはその断片がその結合ポケットにおいて結合するのを防止する、方法を提供する。一実施形態では、ｇＢタンパク質のドメインＶのための結合ポケットは、配列番号１の残基Ｋ１３０～Ａ１３５、Ｄ２１６～Ｗ２３３、Ｒ２５８～Ｋ２６０、Ａ２６７～Ｖ２７３、Ｒ３２７～Ｄ３２９、Ｗ３４９～Ｅ３５０、Ｖ４８０～Ｋ５１８およびＮ６７６～Ｙ６９０を含む。
別の態様では、ｇＢタンパク質に関する、本明細書で学習および記載される全ての情報を、その生物活性のモジュレーターを設計する方法において使用することができる。一実施形態では、ｇＢタンパク質を有するＨＣＭＶの感染によって引き起こされる疾患の防止または処置のためのモジュレーターを設計するための方法は、（ａ）ｇＢタンパク質の三次元構造を提供すること；（ｂ）三次元構造を参照することによって、ｇＢタンパク質を有するＨＣＭＶの感染によって引き起こされる疾患の防止または処置のための潜在的なモジュレーターを同定すること；（ｃ）ｇＢタンパク質と、潜在的なモジュレーターとを接触させること；および（ｄ）モジュレーターとの接触後に、ｇＢタンパク質の活性をアッセイすること、または前記ｇＢタンパク質を有するウイルスの生存能力を決定することを含み、タンパク質の活性またはウイルスの生存能力の変化は、モジュレーターがウイルス関連疾患または障害の防止または処置にとって有用であり得ることを示す。ある特定の実施形態では、潜在的なモジュレーターは、ｇＢタンパク質を有するＨＣＭＶの三次元構造を参照することによって同定される。他の実施形態では、潜在的なモジュレーターは、ｇＢタンパク質の創薬可能領域またはその断片の三次元構造を参照することによって同定される。
さらなる態様では、本発明は、ＨＣＭＶ感染のモジュレーター（ある特定の実施形態では、阻害剤）、ならびにそれを含む医薬組成物およびキットを提供する。そのようなモジュレーターは、ある特定の実施形態では、本発明の創薬可能領域と相互作用し得る。さらに別の態様では、本発明は、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質のドメインＶの断片（またはそのような断片のホモログもしくはそのような断片の模倣体）であり、その創薬可能領域について競合するモジュレーターを対象とする。上記の創薬可能領域のいずれかのモジュレーターを、単独で、または相補的な手法において使用して、ＨＣＭＶによる感染を処置または防止することができる。
最後に、本発明は、配列番号１の残基Ｋ１３０～Ａ１３５、Ｄ２１６～Ｗ２３３、Ｒ２５８～Ｋ２６０、Ａ２６７～Ｖ２７３、Ｒ３２７～Ｄ３２９、Ｗ３４９～Ｅ３５０、Ｖ４８０～Ｋ５１８およびＮ６７６～Ｙ６９０を含むＨＣＭＶ ｇＢの創薬可能領域を提供する。一態様では、創薬可能領域の残基は、融合後コンフォメーション中にある。
本発明の実施形態および実施、他の実施形態、ならびにその特性および特徴は、以下の説明、図面および特許請求の範囲から明らかであると共に、特許請求の範囲は全て、この参照によってこの発明の概要に組み込まれる。
配列識別子
配列番号１は、ネイティブＨＣＭＶ ｇＢ（Ｔｏｗｎｅ株）に由来するアミノ酸配列を記載する。
配列番号１は、ネイティブＨＣＭＶ ｇＢ（Ｔｏｗｎｅ株）に由来するアミノ酸配列を記載する。
配列番号２は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｑ９８Ｃ、Ｇ２７１Ｃ。
配列番号３は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｑ９８Ｃ、Ｉ６５３Ｃ。
配列番号４は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｇ９９Ｃ、Ａ２６７Ｃ。
配列番号５は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｔ１００Ｃ、Ａ２６７Ｃ。
配列番号６は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｔ１００Ｃ、Ｓ２６９Ｃ。
配列番号７は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｔ１００Ｃ、Ｌ６５１Ｃ。
配列番号８は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｄ２１７Ｃ、Ｆ５８４Ｃ。
配列番号９は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｙ２１８Ｃ、Ａ５８５Ｃ。
配列番号１０は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｓ２１９Ｃ、Ｄ６５４Ｃ。
配列番号１１は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｎ２２０Ｃ、Ｄ６５２Ｃ。
配列番号１２は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｔ２２１Ｃ、Ｄ６５２Ｃ。
配列番号１３は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｗ２４０Ｃ、Ｇ７１８Ｃ。
配列番号１４は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｙ２４２Ｃ、Ｋ７１０Ｃ。
配列番号１５は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｙ２４２Ｃ、Ｄ７１４Ｃ。
配列番号１６は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｓ２６９Ｃ、Ｉ６５３Ｃ。
配列番号１７は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｇ２７１Ｃ、Ｐ６１４Ｃ。
配列番号１８は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｓ３６７Ｃ、Ｌ４９９Ｃ。
配列番号１９は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｔ３７２Ｃ、Ｗ５０６Ｃ。
配列番号２０は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｆ５４１Ｃ、Ｑ６６９Ｃ。
配列番号２１は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｌ５４８Ｃ、Ａ６５０Ｃ。
配列番号２２は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ａ５４９Ｃ、Ｉ６５３Ｃ。
配列番号２３は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｓ５５０Ｃ、Ｄ６５２Ｃ。
配列番号２４は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｇ６０４Ｃ、Ｆ６６１Ｃ。
配列番号２５は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｎ６０５Ｃ、Ｅ６６５Ｃ。
配列番号２６は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｒ６０７Ｃ、Ｓ６７５Ｃ。
配列番号２７は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｔ６０８Ｃ、Ｄ６７９Ｃ。
配列番号２８は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｅ６０９Ｃ、Ｆ６７８Ｃ。
配列番号２９は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｒ６７３Ｃ、Ｓ６７４Ｃ。
配列番号３０は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｎ６７６Ｃ、Ｖ６７７Ｃ。
配列番号３１は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｌ６８０Ｃ、Ｅ６８１Ｃ。
配列番号３２は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｉ６８３Ｃ、Ｍ６８４Ｃ。
配列番号３３は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｆ６８７Ｃ、Ｎ６８８Ｃ。
配列番号３４は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｙ６９０Ｃ、Ｋ６９１Ｃ。
配列番号３５は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｋ６９５Ｃ、Ｋ７２４Ｃ。
配列番号３６は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｔ７４６Ｃ、Ｆ７４７Ｃ。
配列番号３７は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｋ７４９Ｃ、Ｎ７５０Ｃ。
配列番号３８は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｋ６７０Ｌ。
配列番号３９は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｋ６７０Ｆ。
配列番号４０は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｒ６７３Ｌ。
配列番号４１は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｒ６７３Ｆ。
配列番号４２は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｋ６９１Ｌ。
配列番号４３は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列を記載する：Ｋ６９１Ｆ。
配列番号４４は、発現された際に融合後のコンフォメーションへと折り畳まれるネイティブＨＣＭＶ ｇＢ（ＡＤ１６９、ＰＤＢ：５ＣＸＦ）のアミノ酸配列を記載する。
配列番号４５は、発現された際に融合後のコンフォメーションへと折り畳まれるＨＣＭＶ ｇＢバリアント（ｇＢ７０５）のアミノ酸配列を記載する。
配列番号４６は、発現された際に融合後のコンフォメーションへと折り畳まれるネイティブＨＣＭＶ ｇＢ（Ｍｅｒｌｉｎ株）のアミノ酸配列を記載する。
配列番号４７は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｍ９６ＣおよびＤ６６０Ｃ。
配列番号４８は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｑ９８ＣおよびＮ６５８Ｃ。
配列番号４９は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｔ１００ＣおよびＲ２５８Ｃ。
配列番号５０は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｔ１００ＣおよびＬ６５６Ｃ。
配列番号５１は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｔ１００ＣおよびＮ６５８Ｃ。
配列番号５２は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｉ１１７ＣおよびＴ４０６Ｃ。
配列番号５３は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｉ１１７ＣおよびＳ４０７Ｃ。
配列番号５４は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｙ１５３ＣおよびＬ７１２Ｃ。
配列番号５５は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｌ１６２ＣおよびＭ７１６Ｃ。
配列番号５６は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｄ２１７ＣおよびＳ５８７Ｃ。
配列番号５７は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｄ２１７ＣおよびＹ５８９Ｃ。
配列番号５８は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｓ２１９ＣおよびＦ５８４Ｃ。
配列番号５９は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｓ２１９ＣおよびＡ５８５Ｃ。
配列番号６０は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｓ２１９ＣおよびＮ５８６Ｃ。
配列番号６１は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｎ２２０ＣおよびＴ６５９Ｃ。
配列番号６２は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｓ２２３ＣおよびＴ６５９Ｃ。
配列番号６３は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｗ２４０ＣおよびＡ７３２Ａ。
配列番号６４は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｗ２４０ＣおよびＧ７３５Ｃ。
配列番号６５は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｙ２４２ＣおよびＶ７２８Ｃ。
配列番号６６は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｙ２４２ＣおよびＧ７３１Ｃ。
配列番号６７は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｒ２５８ＣおよびＬ６５６Ｃ。
配列番号６８は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｓ２６９ＣおよびＬ６５６Ｃ。
配列番号６９は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｓ２６９ＣおよびＮ６５８Ｃ。
配列番号７０は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｄ２７２ＣおよびＰ６１４Ｃ。
配列番号７１は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｖ２７３ＣおよびＶ６２９Ｃ。
配列番号７２は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｗ３４９ＣおよびＡ６５０Ｃ。
配列番号７３は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｓ３６７ＣおよびＡ５００Ｃ。
配列番号７４は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｓ３６７ＣおよびＡ５０３Ｃ。
配列番号７５は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｋ３７０ＣおよびＱ５０１Ｃ。
配列番号７６は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｋ５２２ＣおよびＩ６８３Ｃ。
配列番号７７は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｉ５２３ＣおよびＩ６８３Ｃ。
配列番号７８は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｉ５２３ＣおよびＭ６８４Ｃ。
配列番号７９は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｎ５２４ＣおよびＭ６８４Ｃ。
配列番号８０は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｐ５２５ＣおよびＥ６８１Ｃ。
配列番号８１は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｒ５４０ＣおよびＬ６８０Ｃ。
配列番号８２は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｆ５４１ＣおよびＬ６８０Ｃ。
配列番号８３は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｌ５４８ＣおよびＰ６５５Ｃ。
配列番号８４は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ａ５４９ＣおよびＮ６５８Ｃ。
配列番号８５は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｓ５５０ＣおよびＰ６５５Ｃ。
配列番号８６は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｓ５５０ＣおよびＥ６５７Ｃ。
配列番号８７は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｑ５９１ＣおよびＳ６６８Ｃ。
配列番号８８は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｌ６０３ＣおよびＹ６６７Ｃ。
配列番号８９は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｇ６０４ＣおよびＬ６７２Ｃ。
配列番号９０は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｒ６０７ＣおよびＮ６８８Ｃ。
配列番号９１は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｔ６０８ＣおよびＱ６９２Ｃ。
配列番号９２は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｅ６０９ＣおよびＫ６９１Ｃ。
配列番号９３は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｅ６１０ＣおよびＳ６７４Ｃ。
配列番号９４は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｅ６１０ＣおよびＳ６７５Ｃ。
配列番号９５は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｑ６１２ＣおよびＶ６６３Ｃ。
配列番号９６は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｖ７３７ＣおよびＦ７５５Ｃ。
配列番号９７は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｖ７４１ＣおよびＡ７５４Ｃ。
配列番号９８は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｖ７４１ＣおよびＦ７５５Ｃ。
配列番号９９は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｄ６７９Ｓ。
配列番号１００は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｄ６７９Ｎ。
配列番号１０１は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｅ６８２Ｓ。
配列番号１０２は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｅ６８２Ｑ。
配列番号１０３は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｅ６８６Ｓ。
配列番号１０４は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｅ６８６Ｑ。
配列番号１０５は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｎ１１８Ｐ。
配列番号１０６は、以下の突然変異を含む配列番号１のアミノ酸を記載する：Ｄ６４６Ｐ。
配列番号１０７は、図８の＞５ＣＸＦ：Ａ｜ＰＤＢＩＤ｜鎖｜配列のアミノ酸配列を記載する。
配列番号１０８は、図８の＞５ＣＸＦ：Ｂ｜ＰＤＢＩＤ｜鎖｜配列のアミノ酸配列を記載する。
配列番号１０９は、図８の＞５ＣＸＦ：Ｃ｜ＰＤＢＩＤ｜鎖｜配列のアミノ酸配列を記載する。
配列番号１１０は、図９の説明中に言及したＨＡＮ１３ ｇｉ｜２４２３４５６１４｜ｇｂ｜ＧＱ２２１９７３．１｜：８１９８８～８４７０５ヒトヘルペスウイルス５ ＨＡＮ１３株、完全ゲノム逆相補配列に由来するｇＢポリペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１１１は、図９の説明中に言及したＶＲ１８１４ ｇｉ｜２７０３５５７５９｜ｇｂ｜ＧＵ１７９２８９．１｜：８１９２５～８４６４２ヒトヘルペスウイルス５ ＶＲ１８１４株、完全ゲノム逆相補配列に由来するｇＢポリペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１１２～１４０は、図９に記載の様々なＣＭＶ ｇＢ株に由来するｇＢポリペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１４１～配列番号２１０は、例えばｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、ｇＢ、またはｐｐ６５などのＨＣＭＶに由来するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号２１１～配列番号２２３は、例えばｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、ｇＢ、またはｐｐ６５などのＨＣＭＶに由来するポリペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２２４は、ＨＣＭＶに由来するポリペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２２５～配列番号２５４は、ＨＣＭＶに由来するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号２５５～配列番号２５９は、表９に記載される種々のｇＢ細胞外ドメインタンパク質のＣ末端融合配列を記載する。
配列番号２６０～配列番号２８０は、種々の融合阻害ペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２８１は、ｇＢポリペプチド（Ｔｏｗｎｅ）のドメインＶのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２８２～配列番号２８４は、図２０Ａ～２０Ｂに示されるＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の相互作用領域のアミノ酸配列を記載する。
配列番号２８５～配列番号２８９は、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質のドメインＶのための結合ポケットを形成するアミノ酸残基（配列番号１のＲ２５８～Ｋ２６０、Ｒ３２７～Ｄ３２９、およびＷ３４９～Ｅ３５０に加えて）を記載する。
詳細な説明
本明細書に記載されるように、本発明者らは、融合後コンフォメーションとは異なり、本発明者らが融合前コンフォメーションと称するコンフォメーションにあるＨＣＭＶ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）ポリペプチドの三次元構造を解明した。ポリペプチドを融合前コンフォメーションにおいて安定化するための突然変異も発見した。この構造を使用して、以前のＨＣＭＶ ｇＢに基づく免疫原を用いて達成されるものよりも高いＨＣＭＶ中和抗体応答を生成することができる。本明細書に記載のポリペプチド、およびポリペプチドをコードする核酸を、例えば、いくつかある使用の中でも特に、ＨＣＭＶに対するワクチンにおける潜在的な免疫原として、および診断手段として使用することができる。
本明細書に記載されるように、本発明者らは、融合後コンフォメーションとは異なり、本発明者らが融合前コンフォメーションと称するコンフォメーションにあるＨＣＭＶ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）ポリペプチドの三次元構造を解明した。ポリペプチドを融合前コンフォメーションにおいて安定化するための突然変異も発見した。この構造を使用して、以前のＨＣＭＶ ｇＢに基づく免疫原を用いて達成されるものよりも高いＨＣＭＶ中和抗体応答を生成することができる。本明細書に記載のポリペプチド、およびポリペプチドをコードする核酸を、例えば、いくつかある使用の中でも特に、ＨＣＭＶに対するワクチンにおける潜在的な免疫原として、および診断手段として使用することができる。
本発明者らはさらに、特に、融合前コンフォメーションにおいて安定化されたｇＢ抗原の産生およびその後の精製を大きく促進することができる；融合前コンフォメーションにあるｇＢポリペプチドの産生の効率を有意に改善することができる；野生型ｇＢポリペプチドと比較して、ｇＢポリペプチドの抗原性を変更することができる；融合前ｇＢに対する集中的な免疫応答を促進することができる；ならびにｇＢの中和エピトープの立体閉塞を低減させる、および／または除去することができる、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ｇＢポリペプチド中に導入することができる突然変異を発見した。
融合は、ウイルス感染力における重要なステップであるため、ｇＢタンパク質内の創薬可能領域の同定はさらに、ＨＣＭＶによるウイルス感染を特異的に阻害することができる治療剤の開発を可能にするであろう。
Ａ．天然ＨＣＭＶ ｇＢ
天然ＨＣＭＶ ｇＢは、ＮおよびＯ結合部位でのグリコシル化ならびにアミノおよびカルボキシ末端断片への遍在性細胞性エンドプロテアーゼによる切断を含む、広範囲の翻訳後修飾を受ける９０６または９０７アミノ酸のポリペプチド（ＣＭＶの株に依存する）として合成される。ｇＢ、ｇｐ１１６およびｇｐ５５のＮおよびＣ末端断片は、それぞれ、ジスルフィド結合によって共有結合的に接続され、成熟したグリコシル化されたｇＢは、三量体構成を取る。ｇＢポリペプチドは、大きい細胞外ドメイン（ｇｐ１１６およびｇｐ５５の細胞外ドメインに切断される）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、およびウイルス内（または細胞質）ドメイン（細胞質ドメイン）を含有する。
天然ＨＣＭＶ ｇＢは、ＮおよびＯ結合部位でのグリコシル化ならびにアミノおよびカルボキシ末端断片への遍在性細胞性エンドプロテアーゼによる切断を含む、広範囲の翻訳後修飾を受ける９０６または９０７アミノ酸のポリペプチド（ＣＭＶの株に依存する）として合成される。ｇＢ、ｇｐ１１６およびｇｐ５５のＮおよびＣ末端断片は、それぞれ、ジスルフィド結合によって共有結合的に接続され、成熟したグリコシル化されたｇＢは、三量体構成を取る。ｇＢポリペプチドは、大きい細胞外ドメイン（ｇｐ１１６およびｇｐ５５の細胞外ドメインに切断される）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、およびウイルス内（または細胞質）ドメイン（細胞質ドメイン）を含有する。
種々の株に由来する天然ＨＣＭＶ ｇＢが公知である。例えば、臨床および実験室適合株に由来する少なくとも６０個のＨＣＭＶ ｇＢ配列が、ＮＣＢＩ’ｓ ＲｅｆＳｅｑデータベースから入手可能である。また、図９も参照されたい。
したがって、本明細書で使用される場合、用語「ＣＭＶ ｇＢ」ポリペプチドまたは「ＨＣＭＶ ｇＢ」ポリペプチドは、任意のヒトＨＣＭＶ株（Ｔｏｗｎｅ株に限定されない）に由来する天然ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドと理解されるべきである。実際の配列アラインメントに応じて、他のヒトＣＭＶ株に由来するｇＢについて、実際の残基位置番号を調整することが必要であり得る。
ＨＣＭＶ ｇＢは、ＨＣＭＶゲノムのＵＬ５５遺伝子によってコードされる。それは、ＨＣＭＶウイルス膜と、宿主細胞膜との融合を媒介するエンベロープ糖タンパク質である。タンパク質は、融合前形態から融合後形態への一連のコンフォメーション変化を起こす。融合後形態にあるｇＢの結晶構造が利用可能であり（ＰＤＢ受託コード５ＣＸＦ）、融合前コンフォメーションは本明細書で以下に記載される。
Ｂ．コンフォメーション
ＨＣＭＶ ｇＢ融合後コンフォメーションは、ウイルスエンベロープと宿主細胞膜との融合後にＨＣＭＶ ｇＢによって採用される構造的コンフォメーションを指す。天然ＨＣＭＶ ｇＢもまた、融合事象の状況外、例えば、熱への曝露、膜からの抽出、細胞外ドメインとしての発現または貯蔵などのストレス条件下では融合後コンフォメーションを採り得る。より具体的には、ｇＢ融合後コンフォメーションは、例えば、Ｂｕｒｋｅら、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ、ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．２０１５ Ｏｃｔ２０；１１（１０）：ｅ１００５２２７に記載されている。また、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＲＣＳＢ ＰＤＢ）：５ＣＸＦ、Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ， ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＡＤ１６９株）、２０１５－０７－２８寄託；ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ５ＣＸＦ／ｐｄｂ；および図９も参照されたい。発現された場合、融合後コンフォメーションにフォールディングされ得るタンパク質の配列は、配列番号４４として提供される。発現された場合、融合後コンフォメーションにフォールディングされるタンパク質の別の例は、配列番号４５として提供される。融合後コンフォメーションは、約１６５Åの高さおよび６５Åの幅である。
ＨＣＭＶ ｇＢ融合後コンフォメーションは、ウイルスエンベロープと宿主細胞膜との融合後にＨＣＭＶ ｇＢによって採用される構造的コンフォメーションを指す。天然ＨＣＭＶ ｇＢもまた、融合事象の状況外、例えば、熱への曝露、膜からの抽出、細胞外ドメインとしての発現または貯蔵などのストレス条件下では融合後コンフォメーションを採り得る。より具体的には、ｇＢ融合後コンフォメーションは、例えば、Ｂｕｒｋｅら、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ、ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．２０１５ Ｏｃｔ２０；１１（１０）：ｅ１００５２２７に記載されている。また、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＲＣＳＢ ＰＤＢ）：５ＣＸＦ、Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ， ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＡＤ１６９株）、２０１５－０７－２８寄託；ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ５ＣＸＦ／ｐｄｂ；および図９も参照されたい。発現された場合、融合後コンフォメーションにフォールディングされ得るタンパク質の配列は、配列番号４４として提供される。発現された場合、融合後コンフォメーションにフォールディングされるタンパク質の別の例は、配列番号４５として提供される。融合後コンフォメーションは、約１６５Åの高さおよび６５Åの幅である。
本明細書で使用される場合、「融合前コンフォメーション」は、少なくとも分子寸法または三次元座標に関してＨＣＭＶ ｇＢ融合後コンフォメーションとは異なる、ポリペプチドによって採用される構造的コンフォメーションを指す。融合前コンフォメーションは、ｇＢの融合後コンフォメーションへの遷移をもたらす融合事象の誘発前にＨＣＭＶ ｇＢによって採用される構造的コンフォメーションを指す。安定な融合前コンフォメーションにあるＨＣＭＶ ｇＢの単離は、サイトメガロウイルス感染の重要な公衆衛生問題に対処するためのワクチンおよび免疫原性組成物の改善の通知および方向付けにおいて有用であり得る。一部の実施形態では、融合前コンフォメーションは、融合前特異的抗体に結合することができるコンフォメーションを含む。一部の実施形態では、融合前コンフォメーションは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２１／２６０５１０に記載された表１Ａに記載された座標を特徴とするコンフォメーションを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２１／２６０５１０に記載された表１Ａの構造座標によって記載される骨格原子上に重ね合わせた場合、保存された残基骨格原子の平均２乗偏差（ＲＭＳＤ）を含む構造座標を特徴とする。一部の実施形態では、融合前コンフォメーションは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２１／２６０５１０に記載された表１Ｂに記載された座標を特徴とするコンフォメーションを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２１／２６０５１０に記載された表１Ｂの構造座標によって記載される骨格原子上に重ね合わせた場合、保存された残基骨格原子の平均２乗偏差（ＲＭＳＤ）を含む構造座標を特徴とする。一部の実施形態では、ＨＣＭＶ ｇＢ融合前コンフォメーションを有するポリペプチドは、三量体の３回軸上を中心とする、三量体ヘリックス束を含み、それぞれのプロトマーの残基Ｌ４７９～Ｋ５２２を含むポリペプチドを指し、３回軸に沿ってＮ末端からＣ末端に向かう束の方向（図４Ａおよび図４Ｂにおいて矢印で示される）は、三量体のそれぞれのドメインＩの先端近くの融合ループ中にある、それぞれのプロトマーの残基Ｗ２４０によって規定される平面と交差する３回軸上の点に向かう。一部の実施形態では、ヘリックス束は、配列番号１のナンバリングによる、Ｌ４７９とＫ５２２との間の残基を含む。
Ｃ．野生型ＨＣＭＶ ｇＢの突然変異体
本発明は、対応する野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較してアミノ酸突然変異を含むポリペプチドを含む。アミノ酸突然変異は、野生型ＨＣＭＶ ｇＢと比較してアミノ酸置換、欠失または付加を含む。したがって、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢの突然変異体である。
本発明は、対応する野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較してアミノ酸突然変異を含むポリペプチドを含む。アミノ酸突然変異は、野生型ＨＣＭＶ ｇＢと比較してアミノ酸置換、欠失または付加を含む。したがって、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢの突然変異体である。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、免疫原性であることなどの、ある特定の有益な特徴を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、対応する野生型ＨＣＭＶ ｇＢと比較して、融合前コンフォメーションにおける増大した免疫原性特性または改善された安定性を有する。安定性とは、融合前から融合後へのＨＣＭＶ ｇＢコンフォメーションの遷移が阻害または防止される程度を指す。さらに他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される１つまたは複数の導入された突然変異を示すポリペプチドであって、融合前コンフォメーションにおいて改善された安定性をもたらし得るポリペプチドを提供する。ＨＣＭＶ ｇＢ中の導入されるアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換、欠失、または付加を含む。一部の実施形態では、突然変異体のアミノ酸配列中の唯一の突然変異は、野生型ＨＣＭＶ ｇＢと比較したアミノ酸置換である。
ポリペプチドコンフォメーションを安定化するいくつかの様式は、天然ＨＣＭＶ ｇＢと比較して、ジスルフィド結合を導入する、静電突然変異を導入する、空洞を埋める、残基のパッキングを変更する、Ｎ結合グリコシル化部位を導入する、およびその組合せであるアミノ酸置換を含む。
一態様では、本発明は、融合後コンフォメーションではないコンフォメーションを示すポリペプチドに関する。すなわち、ポリペプチドは、上記の融合前コンフォメーションを示し、融合後コンフォメーションを示さない。例えば、図３Ｂに示される融合後コンフォメーションと比較した、図３Ａに示される融合前コンフォメーション；図４Ｂに示される融合後コンフォメーションと比較した、図４Ａ；および図６Ｃに示される融合後コンフォメーションと比較した、図６Ａを参照されたい。一部の実施形態では、ポリペプチドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２１／２６０５１０に記載された表１Ａの構造座標によって記載される骨格原子上に重ね合わせた場合、保存された残基骨格原子の平均２乗偏差（ＲＭＳＤ）を含む構造座標を特徴とする。一部の実施形態では、ポリペプチドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２１／２６０５１０に記載された表１Ｂの構造座標によって記載される骨格原子上に重ね合わせた場合、保存された残基骨格原子の平均２乗偏差（ＲＭＳＤ）を含む構造座標を特徴とする。
一部の実施形態では、ポリペプチドは単離される、すなわち、融合後コンフォメーションを有するＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドから分離される。かくして、ポリペプチドは、例えば、融合後コンフォメーションにあるＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドから少なくとも８０％単離、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、またはさらには９９．９％単離されていてもよい。一態様では、本発明は、ＨＣＭＶ ｇＢ融合前特異的抗体に特異的に結合するポリペプチドに関する。
特定のコンフォメーションにあるポリペプチドの均一な集団は、ポリペプチドのコンフォメーション状態を変更しない変形形態（ポリペプチド改変変形形態、例えば、グリコシル化状態など）を含んでもよいことが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの集団は、長期間均一なままである。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドは、水性溶液中に溶解した場合、少なくとも１２時間、例えば、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、またはそれ以上などにわたって融合前コンフォメーションで安定化されたポリペプチドの集団を形成する。
理論によって束縛されるものではないが、本明細書に開示されるポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの安定化された融合前コンフォメーションを促進すると考えられる。ポリペプチドは、対応する天然ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドと比較して少なくとも１つの突然変異を含む。当業者であれば、ポリペプチドが哺乳動物においてＣＭＶに対する免疫応答を惹起するのに有用であることを理解できるであろう。
天然ＨＣＭＶ ｇＢは、ＨＣＭＶ進入糖タンパク質間で保存されており、あらゆる細胞型への進入にとって必要である。ＨＣＭＶ ｇＢ配列の実質的な保存を考慮して、異なる天然ＨＣＭＶ ｇＢ配列間のアミノ酸位置を比較して、異なるＨＣＭＶ株間の対応するＨＣＭＶ ｇＢアミノ酸位置を同定することができる。かくして、株間にわたる天然ＨＣＭＶ ｇＢ配列の保存は、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチド中の特定の位置でのアミノ酸の比較のための参照ＨＣＭＶ ｇＢ配列の使用を可能にする。したがって、別途明示的に指摘しない限り、本明細書で提供されるポリペプチドアミノ酸位置は、配列番号１に記載のＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの参照配列を指す。
しかしながら、異なる天然ＨＣＭＶ ｇＢ配列が配列番号１とは異なるナンバリングシステムを有してもよく、例えば、Ｔｏｗｎｅ以外の株に由来する天然ＨＣＭＶ ｇＢ配列中に配列番号１と比較して付加または除去された追加のアミノ酸残基が存在してもよいことに留意すべきである。そのため、特定のアミノ酸残基がその番号によって参照される場合、その記載は、所与のアミノ酸配列の始まりから数えた場合、正確にその番号の位置に位置するアミノ酸のみに限定されず、むしろ、その残基が同じ正確な番号の位置にない場合であっても、例えば、ＨＣＭＶ配列が配列番号１よりも短い（例えば、断片）もしくは長い場合、または配列番号１と比較して挿入もしくは欠失を有する場合であっても、任意かつ全てのＨＣＭＶ ｇＢ配列中の同等の、または対応するアミノ酸残基が意図されることを理解すべきである。
一部の実施形態では、ポリペプチドが成熟完全長野生型ＨＣＭＶ ｇＢと同じ数のアミノ酸残基を含む場合、そのポリペプチドは完全長である。一部の実施形態では、ポリペプチドが成熟完全長野生型ＨＣＭＶ ｇＢの総数よりも少ないアミノ酸残基を含む場合、そのポリペプチドは断片である。一部の実施形態では、トランケートされたｇＢポリペプチドは、細胞外ドメイン配列のみを含む。
Ｃ．１．システイン（Ｃ）置換
一部の実施形態では、ポリペプチドは、天然ＨＣＭＶ ｇＢと比較して、導入されたシステイン置換を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のシステイン置換のいずれか１つを含む。理論またはメカニズムによって束縛されるものではないが、本明細書に記載のシステイン置換は、ＨＣＭＶ ｇＢ融合後コンフォメーションではないコンフォメーションにあるポリペプチドの安定性を促進すると考えられる。導入されるシステイン置換を、タンパク質工学によって、例えば、ジスルフィド結合を形成する１つまたは複数の置換されたシステイン残基を含有させることによって導入することができる。いくつかの実施形態では、システインのアミノ酸位置は、ＨＣＭＶ ｇＢの融合後ではなく、融合前のコンフォメーションにおけるジスルフィド結合の形成のための十分に近い距離内にある。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、天然ＨＣＭＶ ｇＢと比較して、導入されたシステイン置換を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のシステイン置換のいずれか１つを含む。理論またはメカニズムによって束縛されるものではないが、本明細書に記載のシステイン置換は、ＨＣＭＶ ｇＢ融合後コンフォメーションではないコンフォメーションにあるポリペプチドの安定性を促進すると考えられる。導入されるシステイン置換を、タンパク質工学によって、例えば、ジスルフィド結合を形成する１つまたは複数の置換されたシステイン残基を含有させることによって導入することができる。いくつかの実施形態では、システインのアミノ酸位置は、ＨＣＭＶ ｇＢの融合後ではなく、融合前のコンフォメーションにおけるジスルフィド結合の形成のための十分に近い距離内にある。
ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を、２個以上のアミノ酸置換によって天然ＨＣＭＶ ｇＢ配列中に導入することができる。例えば、一部の実施形態では、２個のシステイン残基を天然ＨＣＭＶ ｇＢ配列中に導入して、ジスルフィド結合を形成させる。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、融合前コンフォメーションでは互いに近く、融合後コンフォメーションではより遠くにある一対のアミノ酸位置に導入されるシステイン間のジスルフィド結合によって融合前コンフォメーションで安定化された組換えＨＣＭＶ ｇＢを含む。
天然ＨＣＭＶ ｇＢと比較した例示的なシステイン置換としては、表２から選択される任意の突然変異が挙げられ、そのナンバリングは配列番号１のナンバリングに基づく。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、表２の（ｉｉ）列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６行目の１つまたは複数に列挙された位置のいずれか１つに１つまたは複数（２、３、４、５、６、７、８、９または１０個など）のシステイン置換を含み、得られるポリペプチドは、ＨＣＭＶ融合後コンフォメーションを示さない。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、（ｉｉ）列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、または８８行目の１つまたは複数に列挙された位置のいずれか１つに１つまたは複数（２、３、４、５、６、７、８、９または１０個など）のシステイン置換を含み、得られるポリペプチドは、ＨＣＭＶ融合後コンフォメーションを示さない。
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる９８および６５３位（表２の２行目、（ｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる１００および２６９位（表２の５行目、（ｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。さらに好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２１７および５８４位（表２の７行目、（ｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２４２および７１０位（表２の１３行目、（ｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２４２および７１４位（表２の１４行目、（ｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。さらに好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる３６７および４９９位（表２の１７行目、（ｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる３７２および５０６位（表２の１８行目、（ｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる５５０および６５２位（表２の２２行目、（ｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。さらに好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる６０８および６７９位（表２の２６行目、（ｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる６９５および７２４位（表２の３４行目、（ｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、表２の（ｉｉ）列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、および８８行目の１つまたは複数に列挙された位置の対のいずれか１つで置換されたシステイン残基対間に１つまたは複数（２、３、４、５、６、７、８、９または１０個など）のジスルフィド結合を含む。
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる９８および６５３位（表２の２行目、（ｉｉ）列に列挙されている）で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる１００および２６９位（表２の５行目、（ｉｉ）列に列挙されている）で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。さらに好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２１７および５８４位（表２の７行目、（ｉｉ）列に列挙されている）で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２４２および７１０位（表２の１３行目、（ｉｉ）列に列挙されている）で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２４２および７１４位（表２の１４行目、（ｉｉ）列に列挙されている）で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。さらに好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる３６７および４９９位（表２の１７行目、（ｉｉ）列に列挙されている）で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる３７２および５０６位（表２の１８行目、（ｉｉ）列に列挙されている）で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる５５０および６５２位（表２の２２行目、（ｉｉ）列に列挙されている）で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。さらに好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる６０８および６７９位（表２の２６行目、（ｉｉ）列に列挙されている）で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる６９５および７２４位（表２の３４行目、（ｉｉ）列に列挙されている）で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、表２の（ｉｉｉ）列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６行目の１つまたは複数に列挙された位置の対のいずれか１つにシステインアミノ酸置換によって導入されるシステイン残基対の間に１つまたは複数（２、３、４、５、６、７、８、９または１０個など）のジスルフィド結合を含み、ポリペプチドは、ＨＣＭＶ融合後コンフォメーションを示さない。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、表２の（ｉｉｉ）列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、または８８行目の１つまたは複数に列挙された位置の対のいずれか１つにシステインアミノ酸置換によって導入されるシステイン残基対の間に１つまたは複数（２、３、４、５、６、７、８、９または１０個など）のジスルフィド結合を含み、ポリペプチドは、ＨＣＭＶ融合後コンフォメーションを示さない。
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによるＱ９８ＣおよびＩ６５３Ｃ位（表２の２行目、（ｉｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによるＴ１００ＣおよびＳ２６９Ｃ位（表２の５行目、（ｉｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。さらに好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによるＤ２１７ＣおよびＦ５８４Ｃ位（表２の７行目、（ｉｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによるＹ２４２ＣおよびＫ７１０Ｃ位（表２の１３行目、（ｉｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによるＹ２４２ＣおよびＤ７１４Ｃ位（表２の１４行目、（ｉｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。さらに好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによるＳ３６７ＣおよびＬ４９９Ｃ位（表２の１７行目、（ｉｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによるＴ３７２ＣおよびＷ５０６Ｃ位（表２の１８行目、（ｉｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによるＳ５５０ＣおよびＤ６５２Ｃ位（表２の２２行目、（ｉｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。さらに好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによるＴ６０８ＣおよびＤ６７９Ｃ位（表２の２６行目、（ｉｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによるＫ６９５ＣおよびＫ７２４Ｃ位（表２の３４行目、（ｉｉｉ）列に列挙されている）にシステイン置換を含む。
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる９６および６６０位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる９８および６５８位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。さらに好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる１００および２５８位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる１００および６５６位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる１００および６５８位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。さらに好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる１１７および４０６位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる１１７および４０７位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる１５３および７１２位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる１６２および７１６位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２１７および５８７位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２１７および５８９位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２１９および５８４位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２１９および５８５位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２１９および５８６位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２２０および６５９位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２２３および６５９位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２４０および７３２位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２４０および７３５位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２４２および７２８位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２４２および７３１位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２５８および６５６位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２６９および６５６位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２６９および６５８位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２７２および６１４位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる２７３および６２９位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる３４９および６５０位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる３６７および５００位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる３６７および５０３位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる３７０および５０１位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる５２２および６８３位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる５２３および６８３位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる５２３および６８４位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる５２４および６８４位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる５２５および６８１位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる５４０および６８０位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる５４１および６８０位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる５４８および６５５位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる５４９および６５８位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる５５０および６５５位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる５５０および６５７位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる５９１および６６８位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる６０３および６６７位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる６０４および６７２位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる６０７および６８８位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる６０８および６９２位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる６０９および６９１位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる６１０および６７４位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる６１０および６７５位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる６１２および６６３位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる７３７および７５５位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる７４１および７５４位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、配列番号１のナンバリングによる７４１および７５５位で置換された一対のシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、表２に列挙されたシステイン残基間の２個以上のジスルフィド結合の組合せを含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７から選択されるいずれかの配列に対する少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、および配列番号９８から選択されるいずれかの配列に対する少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％，９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、および配列番号６０から選択されるいずれかの配列に対する少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％，９７％、９８％、好ましくは９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５１、配列番号７３、配列番号７０、および配列番号７８から選択されるいずれかの配列に対する少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、組成物は、好ましくは、配列番号５９、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７１、配列番号５２、配列番号９６、および配列番号５０のいずれか１つに記載の配列を有するポリペプチドを含まない。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、表２の（ｉｖ）列に列挙された配列番号のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。すなわち、例示的なポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、および配列番号９８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有する。
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７、および配列番号３５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、アミノ酸を、天然ＨＣＭＶ ｇＢ配列から挿入して（または欠失させて）、特定の残基対が融合後ではなく、融合前のコンフォメーションにおいてジスルフィド結合を形成するのに十分に近い距離内にあるように、ポリペプチド構造中の残基のアラインメントを調整することができる。いくつかのそのような実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸挿入を含むことに加えて、表２の（ｉｉ）列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、または８８行目の１つまたは複数に列挙された位置の対のいずれかに位置するシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、天然ＨＣＭＶ ｇＢと比較してフェニルアラニン置換を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、天然ＨＣＭＶ ｇＢと比較してロイシン置換を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドを、融合後コンフォメーションにあるＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドと比較して、ポリペプチドのフォールディングされた構造中で互いに近接している残基間のイオン反発を減少させるアミノ酸突然変異（例えば、フェニルアラニン（Ｆ）およびロイシン（Ｌ）置換など）によって安定化することができる。一部の実施形態では、ポリペプチドを、融合後コンフォメーションにあるＨＣＭＶ ｇＢと比較して、ポリペプチドのフォールディングされた構造中で互いに近接している残基間のイオン引力を増加させるアミノ酸突然変異によって安定化することができる。
例示的な突然変異は、天然ＨＣＭＶ ｇＢと比較して、配列番号１のナンバリングによる、表３から選択される任意の突然変異を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、表３の（ｉｉ）列の１、２、３、４、５、または６行目の１つまたは複数に列挙された位置のいずれか１つで置換された１つまたは複数（２、３、４、５、６、７、８、９または１０個など）の残基を含み、ポリペプチドは、ＨＣＭＶ融合後コンフォメーションを示さない。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、表４の（ｉｉ）列の１、２、３、４、５、６、７、および８行目の１つまたは複数に列挙された位置のいずれか１つで置換された１つまたは複数（２、３、４、５、６、７、８、９または１０個など）の残基を含み、ポリペプチドは、ＨＣＭＶ融合後コンフォメーションを示さない。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる６７０位に突然変異（表３の（ｉｉ）列、１および２行目に列挙されている）を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる６７３位に突然変異（表３の（ｉｉ）列、３および４行目に列挙されている）を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる６９１位に突然変異（表３の（ｉｉ）列、５および６行目に列挙されている）を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる６７０位に突然変異を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる６８２位に突然変異を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる６８６位に突然変異を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる１１８位に突然変異を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる６４６位に突然変異を含む。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、表３の（ｉｉｉ）列の１、２、３、４、５、または６行目の１つまたは複数に列挙された位置のいずれか１つでの置換によって導入される静電突然変異を含み、ポリペプチドは、ＨＣＭＶ融合後コンフォメーションを示さない。
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる置換Ｋ６７０Ｌ（表３の１行目、（ｉｉｉ）列に列挙されている）を含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる置換Ｋ６７０Ｆ（表３の２行目、（ｉｉｉ）列に列挙されている）を含む。さらに好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる置換Ｒ６７３Ｌ（表３の３行目、（ｉｉｉ）列に列挙されている）を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる置換Ｒ６７３Ｆ（表３の４行目、（ｉｉｉ）列に列挙されている）を含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる置換Ｋ６９１Ｌ（表３の５行目、（ｉｉｉ）列に列挙されている）を含む。さらに好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる置換Ｋ６９１Ｆ（表３の６行目、（ｉｉｉ）列に列挙されている）を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、表３に列挙された２つ以上のフェニルアラニン（Ｆ）およびロイシン（Ｌ）置換の組合せを含む。
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる置換Ｄ６７９Ｓを含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる置換Ｄ６７９Ｎを含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる置換Ｅ６８２Ｓを含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる置換Ｅ６８２Ｑを含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる置換Ｅ６８６Ｓを含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる置換Ｅ６８６Ｑを含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる置換Ｎ１１８Ｐを含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のナンバリングによる置換Ｄ６４６Ｐを含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、表４に列挙された２つ以上のフェニルアラニン（Ｆ）およびロイシン（Ｌ）置換の組合せを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号４３から選択されるいずれかの配列に対する少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、および配列番号１０６から選択されるいずれかの配列に対する少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、表３の（ｉｖ）列に列挙された配列番号のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。すなわち、例示的なポリペプチドは、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号４３のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、および配列番号１０６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、アミノ酸を、天然ＨＣＭＶ ｇＢ配列から挿入して（または欠失させて）、特定の残基対が融合後ではなく、融合前のコンフォメーションにおいて所望の静電相互作用を形成するのに十分に近い距離内にあるように、ポリペプチド構造中の残基のアラインメントを調整することができる。いくつかのそのような実施形態では、ポリペプチドは、表３の（ｉｉ）列の１、２、３、４、５、または６行目の１つまたは複数に列挙された位置のいずれかに所望の静電相互作用を含み、ポリペプチドは、ＨＣＭＶ融合後コンフォメーションを示さない。
Ｃ．２．ポリペプチドのさらなる実施形態
一部の実施形態では、ポリペプチドは、参照配列である配列番号４６のナンバリングによる、以下のアミノ酸位置：２８０、２８１、２８３、２８４、２８５、２８６、２９０、２９２、２９５、２９７、２９８、２９９、またはその任意の組合せのうちのいずれか１つに突然変異を含まない。一部の例示的な実施形態では、ポリペプチドは、参照配列である配列番号４６のナンバリングによる、以下の残基：Ｙ２８０；Ｎ２８１；Ｔ２８３；Ｎ２８４；Ｒ２８５；Ｎ２８６；Ｆ２９０；Ｅ２９２；Ｎ２９３；Ｆ２９７；Ｆ２９８；Ｉ２９９；Ｆ２９８；およびその任意の組合せのいずれか１つの置換を含まない。理論またはメカニズムによって束縛されるものではないが、中和抗体にとって重要な残基は、Ｙ２８０／Ｎ２８４およびＹ２８０／Ｎ２９３／Ｄ２９５を含んでもよい。したがって、好ましい実施形態では、ポリペプチドは、参照配列である配列番号４６と比較して、Ｙ２８０、Ｎ２９３、Ｎ２８４、およびＤ２９５に突然変異を含まない。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、参照配列である配列番号４６のナンバリングによる、以下のアミノ酸位置：２８０、２８１、２８３、２８４、２８５、２８６、２９０、２９２、２９５、２９７、２９８、２９９、またはその任意の組合せのうちのいずれか１つに突然変異を含まない。一部の例示的な実施形態では、ポリペプチドは、参照配列である配列番号４６のナンバリングによる、以下の残基：Ｙ２８０；Ｎ２８１；Ｔ２８３；Ｎ２８４；Ｒ２８５；Ｎ２８６；Ｆ２９０；Ｅ２９２；Ｎ２９３；Ｆ２９７；Ｆ２９８；Ｉ２９９；Ｆ２９８；およびその任意の組合せのいずれか１つの置換を含まない。理論またはメカニズムによって束縛されるものではないが、中和抗体にとって重要な残基は、Ｙ２８０／Ｎ２８４およびＹ２８０／Ｎ２９３／Ｄ２９５を含んでもよい。したがって、好ましい実施形態では、ポリペプチドは、参照配列である配列番号４６と比較して、Ｙ２８０、Ｎ２９３、Ｎ２８４、およびＤ２９５に突然変異を含まない。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、参照配列である配列番号４４のナンバリングによる、以下のアミノ酸位置：Ｒ５６２、Ｐ５７７、Ｓ５８７、Ｙ５８８、Ｇ５９２、Ｇ５９５、Ｌ６０１／Ｈ６０５、Ｃ６１０、Ｌ６１２、Ｐ６１３、Ｙ６２５、Ｙ６２７、Ｆ６３２、およびＫ６３３、ならびにその任意の組合せのいずれか１つに突然変異を含まない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、参照配列である配列番号４４のナンバリングによる、以下のアミノ酸突然変異：Ｒ５６２Ｃ、Ｐ５７７Ｌ、Ｓ５８７Ｌ、Ｙ５８８Ｃ、Ｇ５９２Ｓ、Ｇ５９５Ｄ、Ｌ６０１Ｐ／Ｈ６０５Ｎ、Ｃ６１０Ｙ、Ｌ６１２Ｆ、Ｐ６１３Ｙ、Ｙ６２５Ｃ、Ｙ６２７Ｃ、Ｆ６３２Ｌ、およびＫ６３３Ｔ、またはその任意の組合せのいずれか１つを含まない。理論またはメカニズムによって束縛されるものではないが、Ｐ５７７およびＹ６２７は、ドメインＩＶコア内で互いに隣に位置すると考えられるが、Ｃ６１０は保存されたジスルフィド結合に関与する。かくして、３つ全ての残基が、ドメインＩＶの位置を融合前構造において維持し、したがって、全体の抗原性部位ＡＤ－１の安定性を維持するのを助けることができる。さらに、理論またはメカニズムによって束縛されるものではないが、Ｆ６３２およびＧ５９５は、ｇＢの融合前形態の表面上に露出していると考えられる。したがって、好ましい実施形態では、ポリペプチドは、参照配列である配列番号４４のナンバリングによる、Ｐ５７７、Ｙ６２７、Ｃ６１０、Ｆ６３２、およびＧ５９５、またはその任意の組合せに突然変異を含まない。
Ｃ．３．空隙充填突然変異
さらに他の実施形態では、ポリペプチドは、１つまたは複数の空隙充填突然変異であるアミノ酸突然変異を含む。空隙充填のために置き換えることができるアミノ酸の例としては、小さい脂肪族アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、およびＶａｌ）または小さい極性アミノ酸（例えば、ＳｅｒおよびＴｈｒ）ならびに融合前コンフォメーションにおいては埋まっているが、融合後コンフォメーションにおいては溶媒に露出しているアミノ酸が挙げられる。置き換えアミノ酸の例としては、大きい脂肪族アミノ酸（Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＭｅｔ）または大きい芳香族アミノ酸（Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ）が挙げられる。
さらに他の実施形態では、ポリペプチドは、１つまたは複数の空隙充填突然変異であるアミノ酸突然変異を含む。空隙充填のために置き換えることができるアミノ酸の例としては、小さい脂肪族アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、およびＶａｌ）または小さい極性アミノ酸（例えば、ＳｅｒおよびＴｈｒ）ならびに融合前コンフォメーションにおいては埋まっているが、融合後コンフォメーションにおいては溶媒に露出しているアミノ酸が挙げられる。置き換えアミノ酸の例としては、大きい脂肪族アミノ酸（Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＭｅｔ）または大きい芳香族アミノ酸（Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ）が挙げられる。
Ｃ．４．突然変異の組合せ
別の態様では、本発明は、それぞれ、本明細書で上記された、遺伝子操作されたジスルフィド結合突然変異、空隙充填突然変異、および静電突然変異から選択される２つ以上の異なる型の突然変異の組合せを含むポリペプチドに関する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１個のジスルフィド結合突然変異および少なくとも静電突然変異を含む。より具体的には、一部の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１個のシステイン置換および少なくとも１個のフェニルアラニン置換を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１個のシステイン置換および少なくとも１個のロイシン置換を含む。
別の態様では、本発明は、それぞれ、本明細書で上記された、遺伝子操作されたジスルフィド結合突然変異、空隙充填突然変異、および静電突然変異から選択される２つ以上の異なる型の突然変異の組合せを含むポリペプチドに関する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１個のジスルフィド結合突然変異および少なくとも静電突然変異を含む。より具体的には、一部の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１個のシステイン置換および少なくとも１個のフェニルアラニン置換を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１個のシステイン置換および少なくとも１個のロイシン置換を含む。
一部のさらなる実施形態では、ポリペプチドは、表２中の突然変異のいずれか１つから選択される少なくとも１個の突然変異および表３中の突然変異のいずれか１つから選択される少なくとも１個の突然変異を含む。一部のさらなる実施形態では、ポリペプチドは、表２中の突然変異のいずれか１つから選択される少なくとも１個の突然変異および表４中の突然変異のいずれか１つから選択される少なくとも１個の突然変異を含む。一部のさらなる実施形態では、ポリペプチドは、表３中の突然変異のいずれか１つから選択される少なくとも１個の突然変異および表４中の突然変異のいずれか１つから選択される少なくとも１個の突然変異を含む。
Ｄ．ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの創薬可能領域
本発明は、部分的には、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質における新規創薬可能領域を提供する。薬物と、そのような領域との相互作用、または薬物を用いたそのような領域の活性のモジュレーションは、ウイルス融合、したがって、ウイルス感染力を阻害することができる。一態様では、本発明は、例えば、低分子ウイルス融合阻害剤などの、ｇＢタンパク質を有するＨＣＭＶによって引き起こされるＨＣＭＶ感染のための候補治療剤を探索するためにこれらの創薬可能領域に対する化合物をスクリーニングする方法を提供する。一実施形態では、ｇＢタンパク質を有するＨＣＭＶによって引き起こされるＨＣＭＶ感染のための候補治療剤を同定するための方法は、創薬可能領域を含むｇＢタンパク質と、化合物とを接触させることを含み、前記化合物の結合は、候補治療剤を示す。化合物は、ある特定の実施形態では、以下のクラス：ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、もしくは低分子から選択することができるか、または化合物のライブラリーから選択することができる。そのようなライブラリーを、コンビナトリアル合成法によって生成することができる。結合を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかでアッセイすることができる。この方法のある特定の実施形態では、タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質であり、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の創薬可能領域に由来する、少なくとも１個の残基、好ましくは、３個の残基を含む。そのような創薬可能領域を、構造決定、薬物スクリーニング、薬物設計、および本明細書に記載され、特許請求される他の方法において利用することもできる。
本発明は、部分的には、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質における新規創薬可能領域を提供する。薬物と、そのような領域との相互作用、または薬物を用いたそのような領域の活性のモジュレーションは、ウイルス融合、したがって、ウイルス感染力を阻害することができる。一態様では、本発明は、例えば、低分子ウイルス融合阻害剤などの、ｇＢタンパク質を有するＨＣＭＶによって引き起こされるＨＣＭＶ感染のための候補治療剤を探索するためにこれらの創薬可能領域に対する化合物をスクリーニングする方法を提供する。一実施形態では、ｇＢタンパク質を有するＨＣＭＶによって引き起こされるＨＣＭＶ感染のための候補治療剤を同定するための方法は、創薬可能領域を含むｇＢタンパク質と、化合物とを接触させることを含み、前記化合物の結合は、候補治療剤を示す。化合物は、ある特定の実施形態では、以下のクラス：ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、もしくは低分子から選択することができるか、または化合物のライブラリーから選択することができる。そのようなライブラリーを、コンビナトリアル合成法によって生成することができる。結合を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかでアッセイすることができる。この方法のある特定の実施形態では、タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質であり、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の創薬可能領域に由来する、少なくとも１個の残基、好ましくは、３個の残基を含む。そのような創薬可能領域を、構造決定、薬物スクリーニング、薬物設計、および本明細書に記載され、特許請求される他の方法において利用することもできる。
用語「創薬可能領域」は、ポリペプチド、核酸、複合体などを参照して使用される場合、ウイルス感染力を低減させる、または阻害する薬剤に結合するための標的である、または標的である可能性があるＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の領域を指す。ポリペプチドについて、創薬可能領域は一般に、ポリペプチドのいくつかのアミノ酸が薬剤と相互作用することができる領域を指す。ポリペプチドまたはその複合体について、例示的な創薬可能領域は、結合ポケットおよび部位、ポリペプチドまたは複合体のドメイン間の境界面、細胞膜などの、別の分子との相互作用に参画することができるポリペプチドまたは複合体の表面の溝または輪郭または表面を含む。
創薬可能領域は、いくつかの方法で記載し、特徴付けることができる。例えば、創薬可能領域は、領域を構成するアミノ酸、またはその骨格原子、またはその側鎖原子（Ｃａ原子を含んでも、または含まなくてもよい）の一部もしくは全部によって特徴付けることができる。あるいは、創薬可能領域は、同じか、または他の分子上の他の領域との比較によって特徴付けることもできる。例えば、用語「親和性領域」とは、同じ親和性領域の構造が、それらが同じか、または関連する構造アナログに結合すると予想されるように十分に同じであるという理由で、いくつかの他の分子中に存在する分子（ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質など）上の創薬可能領域を指す。親和性領域の例は、いくつかのタンパク質キナーゼ（同じ起源のものであっても、またはそうでなくても）中に見出されるタンパク質キナーゼのＡＴＰ結合部位である。用語「選択性領域」とは、異なる選択性領域の構造が、それらが同じか、または関連する構造アナログに結合すると予想されないように十分に異なるという理由で、他の分子上に見出されない分子の創薬可能領域を指す。例示的な選択性領域は、１つの基質に対する特異性を示すタンパク質キナーゼの触媒ドメインである。ある特定の例では、単一のモジュレーターは、実質的に類似する生物機能を有するいくつかのタンパク質にわたる同じ親和性領域に結合することができるが、同じモジュレーターは、これらのタンパク質の１つのただ１つの選択性領域に結合することができる。
異なる創薬可能領域の例を続けると、用語「望ましくない領域」とは、別の分子との相互作用の際に、望ましくない効果をもたらす分子の創薬可能領域を指す。例えば、相互作用分子（Ｐ－４５０活性など）を酸化し、それによって、酸化された分子に対する毒性の増加をもたらす結合部位は、「望ましくない領域」と見なすことができる。潜在的な望ましくない領域の他の例は、薬物との相互作用の際に、薬物の膜透過性を低下させる、薬物の排出を増加させる、または薬物の血液脳輸送を増加させる領域を含む。ある特定の環境では、望ましくない領域は、領域の影響が好ましい、例えば、脳の状態を処置することを意図される薬物が、血液脳輸送の増加をもたらした領域との相互作用から恩恵を受けるため、望ましくない領域とはもはや見なされないが、同じ領域を、脳に送達されることを意図されなかった薬物にとって望ましくないと見なすことができることもある。
創薬可能領域を参照して使用される場合、創薬可能領域に対するモジュレーターなどの分子の「選択性」または「特異性」を、分子と創薬可能領域との間の結合を記載するために使用することができる。例えば、創薬可能領域に関するモジュレーターの選択性を、Ｋｄ（すなわち、それぞれのモジュレーター－創薬可能領域複合体に関する解離定数）のそれぞれの値、または生物学的効果がＫｄより下で観察される場合、それぞれのＥＣ５０（すなわち、それぞれの創薬可能領域と相互作用するモジュレーターに関する最大応答の５０％をもたらす濃度）の比を使用して、別のモジュレーターとの比較によって表すことができる。
用語「モジュレーション」は、機能特性または生物活性もしくはプロセス（例えば、酵素活性または受容体結合）を参照して使用される場合、そのような特性、活性またはプロセスを上方調節する（例えば、活性化または刺激する）、下方調節する（例えば、阻害または抑制する）またはそうでなければ、その質を変化させる能力を指す。ある特定の例では、そのような調節は、シグナル伝達経路の活性化などの、特定の事象の発生を条件とする、および／または特定の細胞型においてのみ現れてもよい。
用語「モジュレーター」とは、モジュレーションを引き起こすことができる、ペプチド、ポリペプチド、核酸、高分子、複合体、分子、低分子、化合物、種など（天然に存在する、または天然に存在しない）、または細菌、植物、真菌、または動物細胞もしくは組織などの生体材料から作られた抽出物を指す。モジュレーターを、アッセイへの含有によって、機能特性、生物活性もしくはプロセス、またはそれらの組合せのモジュレーターまたはアクチベーター（例えば、アゴニスト、部分的アンタゴニスト、部分的アゴニスト、インバースアゴニスト、アンタゴニスト、抗微生物剤、微生物感染または増殖のモジュレーターなど）としての潜在的な活性について（直接的または間接的に）評価することができる。そのようなアッセイでは、多くのモジュレーターを、一時にスクリーニングすることができる。モジュレーターの活性は、公知、未知または部分公知であってもよい。用語「阻害剤」とは、機能特性または生物活性もしくはプロセスを下方調節する、または抑制することができる、ペプチド、ポリペプチド、核酸、高分子、複合体、分子、低分子、化合物、種など（天然に存在する、または天然に存在しない）、または細菌、植物、真菌、または動物細胞もしくは組織などの生体材料から作られた抽出物を指す。
用語「モチーフ」とは、特定の構造または機能のタンパク質中に一般的に見出されるアミノ酸配列を指す。典型的には、コンセンサス配列は、特定のモチーフを表すと定義されている。コンセンサス配列は、厳密に定義される必要はなく、可変的な位置、縮重性、可変的な長さなどを含有してもよい。コンセンサス配列を使用して、データベースを検索し、そのアミノ酸配列中のモチーフの存在に起因して類似する構造または機能を有し得る他のタンパク質を同定することができる。例えば、オンラインデータベースを、コンセンサス配列を用いて検索して、特定のモチーフを含有する他のタンパク質を同定することができる。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＥＮＴＲＥＺを含む、種々の検索アルゴリズムおよび／またはプログラムを使用することができる。ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列分析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）の一部として入手可能である。ＥＮＴＲＥＺは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．を介して入手可能である。
用語「低分子」とは、約５ｋＤ未満、約２．５ｋＤ未満、約１．５ｋＤ未満、または約０．９ｋＤ未満の分子量を有する化合物を指す。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ペプチド模倣体、炭水化物、脂質または他の有機（炭素含有）もしくは無機分子であってもよい。多くの製薬企業が、本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングすることができる、真菌、細菌、または藻類の抽出物であることが多い、化学的および／または生物学的混合物の大規模なライブラリーを有している。用語「有機低分子」とは、有機または医薬化合物であると同定されることが多く、専ら、核酸、ペプチドまたはポリペプチドである分子を含まない、低分子を指す。
一実施形態では、創薬可能領域は、配列番号１の残基Ｋ１３０～Ａ１３５、Ｄ２１６～Ｗ２３３、Ｒ２５８～Ｋ２６０、Ａ２６７～Ｖ２７３、Ｒ３２７～Ｄ３２９、Ｗ３４９～Ｅ３５０、Ｖ４８０～Ｋ５１８およびＮ６７６～Ｙ６９０を含み、それらの残基は、融合後コンフォメーションにおいてＨＣＭＶ ｇＢタンパク質のドメインＶのための結合ポケットを形成する。
さらに別の実施形態では、創薬可能領域は、融合ループまたはその一部を含む。
別の態様では、本発明は、ｇＢタンパク質を有するＨＣＭＶによって引き起こされる疾患のための候補治療剤を同定するための方法を対象とする。ある特定の実施形態では、そのような方法は、創薬可能領域を含むｇＢタンパク質と、化合物とを接触させることを含み、前記ｇＢタンパク質の活性のモジュレーションは、候補治療剤を示す。他の実施形態では、そのような方法は、創薬可能領域を含むｇＢタンパク質と、化合物とを接触させることを含み、前記創薬可能領域の移動または相互作用の妨害は、候補治療剤を示す。さらに他の実施形態では、前記ｇＢタンパク質の機能または活性のモジュレーションは、融合後コンフォメーション変化の完了を妨害することを含む。さらに別の実施形態では、前記ｇＢタンパク質の機能または活性のモジュレーションは、コンフォメーション変化の第１段階を妨げることを含む。別の実施形態では、ｇＢタンパク質を有するＨＣＭＶの感染によって引き起こされる疾患のための候補治療剤を同定するための方法は、創薬可能領域を含むｇＢタンパク質と、化合物とを接触させることを含み、前記ウイルス中での融合の阻害は、候補治療剤を示す。さらに別の実施形態では、ｇＢタンパク質を有するＨＣＭＶの感染によって引き起こされる疾患のための候補治療剤を同定するための方法は、創薬可能領域を含むｇＢタンパク質と、化合物とを接触させることを含み、前記ＨＣＭＶのウイルス感染力の阻害は、候補治療剤を示す。さらに別の実施形態では、ｇＢタンパク質を有するＨＣＭＶの感染によって引き起こされる疾患のための候補治療剤を同定するための方法は、創薬可能領域を含むｇＢタンパク質と、化合物とを接触させることを含み、対象における前記疾患の少なくとも１つの症状の低減は、候補治療剤を示す。
さらなる実施形態では、本発明は、ｇＢタンパク質を有するＨＣＭＶの感染によって引き起こされる疾患のための候補治療剤を同定するための方法であって、創薬可能領域を含むｇＢタンパク質と、化合物とを接触させることを含み、化合物が、ｇＢタンパク質のドメインＶまたはその断片がその結合ポケットにおいて結合するのを防止する、方法を提供する。一実施形態では、ｇＢタンパク質のドメインＶのための結合ポケットは、配列番号１の残基Ｋ１３０～Ａ１３５、Ｄ２１６～Ｗ２３３、Ｒ２５８～Ｋ２６０、Ａ２６７～Ｖ２７３、Ｒ３２７～Ｄ３２９、Ｗ３４９～Ｅ３５０、Ｖ４８０～Ｋ５１８およびＮ６７６～Ｙ６９０を含む。
別の態様では、ｇＢタンパク質に関する、本明細書で学習および記載される全ての情報を、１つまたは複数のその生物活性のモジュレーターを設計する方法において使用することができる。一実施形態では、ｇＢタンパク質を有するＨＣＭＶの感染によって引き起こされる疾患の防止または処置のためのモジュレーターを設計するための方法は、（ａ）ｇＢタンパク質の三次元構造を提供すること；（ｂ）三次元構造を参照することによって、ｇＢタンパク質を有するＨＣＭＶよって引き起こされる疾患の防止または処置のための潜在的なモジュレーターを同定すること；（ｃ）ｇＢタンパク質と、潜在的なモジュレーターとを接触させること；および（ｄ）モジュレーターとの接触後に、ｇＢタンパク質の活性をアッセイすること、または前記ｇＢタンパク質を有するウイルスの生存能力を決定することを含み、ポリペプチドの活性またはウイルスの生存能力の変化は、モジュレーターがウイルス関連疾患または障害の防止または処置にとって有用であり得ることを示す。ある特定の実施形態では、潜在的なモジュレーターは、ｇＢタンパク質を有するＨＣＭＶの三次元構造を参照することによって同定される。他の実施形態では、潜在的なモジュレーターは、ｇＢタンパク質の創薬可能領域または断片を含む三次元構造を参照することによって同定される。
さらに別の態様では、本発明は、ｇＢタンパク質活性のモジュレーター（ある特定の実施形態では、阻害剤）、ならびにそれを含む医薬組成物およびキットを提供する。そのようなモジュレーターは、ある特定の実施形態では、本発明の創薬可能領域と相互作用し得る。さらに別の態様では、本発明は、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の創薬可能領域の断片（またはそのような断片のホモログもしくはそのような断片の模倣体）であり、その創薬可能領域と競合するモジュレーターを対象とする。上記の創薬可能領域のいずれかのモジュレーターを、単独で、または相補的な手法において使用して、ＨＣＭＶによる感染を処置することができる。
最後に、本発明は、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの活性または結合部位と結合する、相互作用する、またはその機能もしくは活性をモジュレートするモジュレーターを同定および設計する方法を対象とする。
本明細書で使用される場合、用語「化合物」は、限定されるものではないが、モジュレーター、阻害剤、治療剤、治療薬、予防剤、薬物、または薬剤を含む。本明細書で使用される場合、用語「候補治療剤」（「候補薬剤」または「試験薬剤」としても知られる）は、限定されるものではないが、化合物、界面活性剤、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、核酸、低分子、サイトカイン、またはホルモンを含む。
当業者による本発明の実施にとって有用な薬物探索の態様が、以下に記載される。
Ｄ．１．創薬可能領域
一実施形態では、創薬可能領域は、配列番号１の残基Ｋ１３０～Ａ１３５、Ｄ２１６～Ｗ２３３、Ｒ２５８～Ｋ２６０、Ａ２６７～Ｖ２７３、Ｒ３２７～Ｄ３２９、Ｗ３４９～Ｅ３５０、Ｖ４８０～Ｋ５１８およびＮ６７６～Ｙ６９０またはその断片を含む。これらの残基は、融合後コンフォメーションにおけるｇＢタンパク質のドメインＶまたはその一部のための結合ポケットを形成する。本明細書で使用される場合、用語「結合ポケット」および「結合溝」は、同じ意味を有し、互換性である。
一実施形態では、創薬可能領域は、配列番号１の残基Ｋ１３０～Ａ１３５、Ｄ２１６～Ｗ２３３、Ｒ２５８～Ｋ２６０、Ａ２６７～Ｖ２７３、Ｒ３２７～Ｄ３２９、Ｗ３４９～Ｅ３５０、Ｖ４８０～Ｋ５１８およびＮ６７６～Ｙ６９０またはその断片を含む。これらの残基は、融合後コンフォメーションにおけるｇＢタンパク質のドメインＶまたはその一部のための結合ポケットを形成する。本明細書で使用される場合、用語「結合ポケット」および「結合溝」は、同じ意味を有し、互換性である。
別の実施形態では、創薬可能領域は、融合ループまたはその一部を含む。
さらに別の態様では、本発明は、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の活性または結合部位と結合する、相互作用する、またはその機能もしくは活性をモジュレートするモジュレーターを同定および設計する方法を対象とする。
Ｄ．２．対象の創薬可能領域を使用する、モジュレーター、モジュレーター設計およびスクリーニング
一態様では、本発明は、対象の創薬可能領域の潜在的なモジュレーターをスクリーニングする方法、およびそのようなモジュレーターを設計する方法を提供する。本発明のＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドおよび他の構造的に関連する分子に対するモジュレーター、ならびにそれを含有する複合体を、以下に記載されるように、そうでなければ、当業者には公知の技術および方法を使用して、同定および開発することができる。本発明のモジュレーターを使用して、例えば、ＨＣＭＶによって引き起こされる疾患を阻害し、処置することができる。
一態様では、本発明は、対象の創薬可能領域の潜在的なモジュレーターをスクリーニングする方法、およびそのようなモジュレーターを設計する方法を提供する。本発明のＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドおよび他の構造的に関連する分子に対するモジュレーター、ならびにそれを含有する複合体を、以下に記載されるように、そうでなければ、当業者には公知の技術および方法を使用して、同定および開発することができる。本発明のモジュレーターを使用して、例えば、ＨＣＭＶによって引き起こされる疾患を阻害し、処置することができる。
一態様では、本発明は、ＨＣＭＶの活性を低減させるための対象の創薬可能領域と相互作用するモジュレーターを対象とする。そのようなモジュレーターは、ある特定の実施形態では、ウイルスの創薬可能領域と相互作用し得る。ある特定の実施形態では、モジュレーターは、ｇＢポリペプチドのドメインＶのための結合ポケットと相互作用して、ドメインＶがポケットにおいて結合するのを妨害し、それによって、ＨＣＭＶの活性をモジュレートする。さらに別の態様では、本発明は、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質のドメインＶの断片（またはそのような断片のホモログもしくはそのような断片の模倣体）であり、創薬可能領域、すなわち、ドメインＶのための結合ポケットと競合するモジュレーターを対象とする。一態様では、モジュレーターは、配列番号１の残基（Ｔｏｗｎｅ株）Ｍ６４８～Ｋ７００、Ｍ６４８～Ｖ６９７、Ｓ６４７～Ｖ６９７、Ｓ６４７～Ｖ６６３、Ｉ６５３～Ｖ６９７、Ｉ６５３～Ｑ６９２、Ｉ６５３～Ｌ６８０、Ｉ６５３～Ｓ６７５、Ｉ６５３～Ｙ６６７、Ｒ６６２～Ｖ６９７、Ｒ６６２～Ｑ６９２、Ｒ６６２～Ｌ６８０、Ｒ６６２～Ｓ６７５、Ｌ６６４～Ｆ６７８、Ｓ６６８～Ｖ６９７、Ｓ６６８～Ｑ６９２、Ｓ６６８～Ｖ６７７、Ｄ６７９～Ｖ６９７、Ｌ６８０～Ｖ６９７、Ｌ６８０～Ｑ６９２、およびＲ６９３～Ｋ７００を有する断片からなる群から選択されるドメインＶの断片を含む。より具体的には、モジュレーターは、残基Ｍ６４８～Ｋ７００（配列番号２６０）、Ｍ６４８～Ｖ６９７（配列番号２６１）、Ｓ６４７～Ｖ６９７（配列番号２６２）、Ｓ６４７～Ｖ６６３（配列番号２６３）、Ｉ６５３～Ｖ６９７（配列番号２６４）、Ｉ６５３～Ｑ６９２（配列番号２６５）、Ｉ６５３～Ｌ６８０（配列番号２６６）、Ｉ６５３～Ｓ６７５（配列番号２６７）、Ｉ６５３～Ｙ６６７（配列番号２６８）、Ｒ６６２～Ｖ６９７（配列番号２６９）、Ｒ６６２～Ｑ６９２（配列番号２７０）、Ｒ６６２～Ｌ６８０（配列番号２７１）、Ｒ６６２～Ｓ６７５（配列番号２７２）、Ｌ６６４～Ｆ６７８（配列番号２７３）、Ｓ６６８～Ｖ６９７（配列番号２７４）、Ｓ６６８～Ｑ６９２（配列番号２７５）、Ｓ６６８～Ｖ６７７（配列番号２７６）、Ｄ６７９～Ｖ６９７（配列番号２７７）、Ｌ６８０～Ｖ６９７（配列番号２７８）、Ｌ６８０～Ｑ６９２（配列番号２７９）、およびＲ６９３～Ｋ７００（配列番号２８０）を有する配列番号１の断片である。
上記の創薬可能領域のいずれかのモジュレーターを、単独で、または相補的な手法において使用して、ＨＣＭＶ感染を処置または防止することができる。
モジュレーターを使用するＨＣＭＶの増殖または感染力を阻害するための様々な方法が、本発明によって企図される。例えば、例示的方法は、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質と、そのような病原体に対して有効であると考えられた、または示されたモジュレーターとを接触させることを含む。
例えば、一態様では、本発明は、ＨＣＭＶの感染に罹患している対象を処置するための方法であって、対象に、ＨＣＭＶの発現および／または活性をモジュレートするのに有効なモジュレーターの量を投与することを含む方法を企図する。本発明はさらに、ＨＣＭＶ感染に罹患している対象を処置するための方法であって、感染を有する対象に、本発明の方法の１つを使用して同定された治療有効量の分子を投与することを含む方法を企図する。
別の実施形態では、本発明は、ＨＣＭＶに対する免疫応答を刺激することによって、対象におけるＨＣＭＶの感染を防止するための方法を企図する。対象に、ＨＣＭＶの発現および／または活性をモジュレートするのに有効なモジュレーターの量を投与することによって、免疫応答を刺激することができる。一部の実施形態では、誘導される免疫応答は、防御免疫応答である、すなわち、応答は、ＣＭＶ感染のリスクもしくは重症度または臨床的帰結を低減させる。防御免疫応答の刺激は、特に、ＣＭＶ感染および疾患のリスクがある一部の集団において特に望ましい。例えば、リスクがある集団は、固形臓器移植（ＳＯＴ）患者、骨髄移植患者、および造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）患者を含む。モジュレーターを、移植前に移植ドナーに、または移植前および／もしくは移植後に移植レシピエントに投与することができる。母から子への垂直感染は幼児の一般的な感染源であるため、妊娠している女性または妊娠し得る女性へのモジュレーターの投与は特に有用である。
ある特定の例では、対象は、哺乳動物である。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。一部の実施形態では、ヒトは、小児、例えば、幼児である。一部の他の実施形態では、ヒトは、思春期の女性、妊娠可能年齢の女性、妊娠を計画している女性、妊娠女性、および最近出産した女性を含む女性である。一部の実施形態では、ヒトは、移植患者である。
アカゲザル、モルモット、またはマウスなどの非ヒト哺乳動物のＣＭＶについては、相同配列およびその模倣体は、これらの非ヒト哺乳動物において、同じ特性を有し、実験、予防、または治療目的で使用されると予想される。ＣＭＶは高度に種特異的であるため、ＨＣＭＶドメインＶの動物ＣＭＶ（限定されるものではないが、マウスＣＭＶ、モルモットＣＭＶ、およびアカゲザルＣＭＶ）ホモログの構築ならびにｇＢの動物ＣＭＶホモログの結合および活性の阻害に関する、ならびにＭＣＭＶ、ｇｐＣＭＶ、およびｒｈＣＭＶによる動物の感染の阻害に関するそれらの試験も、本発明において企図される。
別の実施形態では、ＨＣＭＶのモジュレーターもしくは阻害剤、またはそれらを含有する生物学的複合体を、例えば、対象（ヒトおよび動物を含む）の任意の疾患または他の処置可能な状態、特に、ＨＣＭＶ感染によって引き起こされる疾患を防止または処置することを含む、任意数の使用のための薬剤の製造において使用することができる。
（ｉ）モジュレーターの設計
いくつかの技術を使用して、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチド、構造的に相同な分子、および他の分子と会合することができる化学物質をスクリーニング、同定、選択および設計することができる。本明細書に記載の方法に従って決定される、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドに関する構造の知識は、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチド、またはより具体的には、その創薬可能領域のコンフォメーションと相補的な形状を有する分子および／または他のモジュレーターの設計および／または同定を可能にする。そのような技術および方法は、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドに関する正確な構造座標および他の情報に加えて、上記のその構造的等価物（例えば、上記のような創薬可能領域中に含有されるアミノ酸の構造座標に由来する構造座標を含む）を使用してもよいことが理解される。
いくつかの技術を使用して、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチド、構造的に相同な分子、および他の分子と会合することができる化学物質をスクリーニング、同定、選択および設計することができる。本明細書に記載の方法に従って決定される、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドに関する構造の知識は、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチド、またはより具体的には、その創薬可能領域のコンフォメーションと相補的な形状を有する分子および／または他のモジュレーターの設計および／または同定を可能にする。そのような技術および方法は、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドに関する正確な構造座標および他の情報に加えて、上記のその構造的等価物（例えば、上記のような創薬可能領域中に含有されるアミノ酸の構造座標に由来する構造座標を含む）を使用してもよいことが理解される。
本明細書で使用される場合、用語「化学物質」とは、化合物、２つ以上の化合物の複合体、およびそのような化合物または複合体の断片を指す。ある特定の例では、異なる形状を示す化合物（例えば、平坦な芳香環、しわのある脂肪環、単、二重、または三重結合を有する直鎖および分枝鎖脂肪族）および多様な官能基（例えば、カルボン酸、エステル、エーテル、アミン、アルデヒド、ケトン、および種々の複素環）などの、幅広い構造的および機能的多様性を示す化学物質を使用することが望ましい。
一態様では、薬物設計の方法は、一般に、本発明の分子または複合体（またはその一部）のいずれかと会合する、選択された化学物質の能力をコンピューターにより評価することを含む。例えば、この方法は、（ａ）コンピューター手段を使用して、選択された化学物質と、分子または複合体の創薬可能領域との間の適合操作を実行するステップ；および（ｂ）前記適合操作の結果を分析して、化学物質と創薬可能領域との会合を定量するステップを含んでもよい。
目視検査またはＧＲＡＭ、ＤＯＣＫ、もしくはＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｄｕｎｂｒａｃｋら、Ｆｏｌｄｉｎｇ ＆ Ｄｅｓｉｇｎ、２：２７～４２（１９９７））などのドッキングプログラムを使用するコンピューターモデリングの使用によって、化学物質を検査することができる。この手順は、それぞれの化学物質の形状および化学的構造が、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの構造をどれぐらいよく補完するか、またはそれと干渉するかを確認するための、標的に対する化学物質のコンピューターによる適合化を含んでもよい（Ｂｕｇｇら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ、Ｄｅｃｅｍｂｅｒ：９２～９８（１９９３）；Ｗｅｓｔら、ＴＩＰＳ、１６：６７～７４（１９９５））。コンピュータープログラムを用いて、例えば、創薬可能領域に対する化学物質の引力、反発力、および立体障害を見積もることもできる。これらの特性は、より厳密な結合定数と一致するため、一般に、適合が厳密になるほど（例えば、立体障害が低いほど、および／または引力が大きいほど）、化学物質はより強力になるであろう。さらに、化学物質の設計において特異性が高くなるほど、化学物質が関連するタンパク質と干渉しない可能性が高くなり、望ましくない相互作用に起因する潜在的な副作用を最小化し得る。
創薬可能領域の立体的および電気的特性を使用して、化学物質の設計を指導する、分子設計のための様々なコンピューター法が公知である：Ｃｏｈｅｎら（１９９０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃａｍ．３３：８８３～８９４；Ｋｕｎｔｚら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１：２６９～２８８；ＤｅｓＪａｒｌａｉｓ（１９８８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃａｍ．３１：７２２～７２９；Ｂａｒｔｌｅｔｔら（１９８９）Ｓｐｅｃ．Ｐｕｂｌ．、Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．７８：１８２～１９６；Ｇｏｏｄｆｏｒｄら（１９８５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃａｍ．２８：８４９～８５７；およびＤｅｓＪａｒｌａｉｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃａｍ．２９：２１４９～２１５３。指向性方法は一般に、２つのカテゴリーに分類される：（１）公知の化学物質の３Ｄ構造（結晶データベースなどに由来する）が創薬可能領域にドッキングされ、適合度についてスコア化される、類似性による設計；および（２）化学物質が創薬可能領域中で区分的に構築される、ｄｅ ｎｏｖｏ設計。化学物質を、分子のライブラリーまたはデータベースの一部としてスクリーニングすることができる。使用することができるデータベースとしては、ＡＣＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）、ＮＣＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＣＣＤＣ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄａｔａ Ｃｅｎｔｅｒ）、ＣＡＳＴ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｓｅｒｖｉｃｅ）、Ｄｅｒｗｅｎｔ（Ｄｅｒｗｅｎｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ（Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ＤＯＣＫ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｉｎ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、およびＤｉｒｅｃｔｏｒｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ）が挙げられる。ＣＯＮＣＯＲＤ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）またはＤＢ－Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）などのコンピュータープログラムを使用して、二次元で表示されたデータセットを、三次元で表示されたものに変換することができる。
化学物質を、標的タンパク質の創薬可能領域または他の部分と空間的に適合するその能力について試験することができる。本明細書で使用される場合、用語「空間的に適合する」とは、化学物質の三次元構造が創薬可能領域によって幾何学的に収容されることを意味する。好ましい幾何学的適合は、化学物質の表面領域が、好ましくない相互作用を形成することなく、創薬可能領域の表面領域とごく接近している場合に生じる。好ましい相補的相互作用は、化学物質が、疎水性、芳香性、イオン性、双極性、または水素供与および受容力によって相互作用する場合に生じる。好ましくない相互作用は、化学物質中の原子と、創薬可能領域中の原子との間の立体障害であり得る。
本発明のモデルがコンピューターモデルである場合、化学物質は、コンピューターによるドッキングを介して創薬可能領域中に配置されてもよい。他方で、本発明のモデルが構造モデルである場合、化学物質は、例えば、手動によるドッキングによって創薬可能領域中に配置されてもよい。本明細書で使用される場合、用語「ドッキング」とは、化学物質を、創薬可能領域のごく近くに置くプロセス、または化学物質／創薬可能領域複合体の低エネルギーコンフォメーションを発見するプロセスを指す。
例示的実施形態では、潜在的なモジュレーターの設計は、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの創薬可能領域に対して相補的な形状の一般的見地から始まり、標的創薬可能領域と幾何学的に適合する化学物質の公知の三次元構造の低分子のデータベースを走査することができる検索アルゴリズムが用いられる。この型の多くのアルゴリズムが、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの創薬可能領域の形状と相補的である化学物質の広い類別を見出すための方法を提供する。Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＣＣＤＢ）（Ａｌｌｅｎら（１９７３）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｄｏｃ．１３：１１９）などの、特定のデータベースに由来する化学物質のセットのそれぞれを、ドッキングアルゴリズムを使用して、いくつかの幾何学的に許容される向きでＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの創薬可能領域に個別にドッキングする。ある特定の実施形態では、ＤＯＣＫと呼ばれるコンピューターアルゴリズムのセットを使用して、創薬可能領域の活性部位および認識表面を形成する陥入および溝の形状を特徴付けることができる（Ｋｕｎｔｚら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１：２６９～２８８）。プログラムは、形状がＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの特定の結合部位と相補的である鋳型のための低分子のデータベースを検索することもできる（ＤｅｓＪａｒｌａｉｓら（１９８８）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３１：７２２～７２９）。
向きを、適合度について評価し、最良のものを、ＡＭＢＥＲまたはＣＨＡＲＭＭなどの分子メカニクスプログラムを使用するさらなる検査のために保持する。そのようなアルゴリズムは、創薬可能領域と形状において相補的である様々な化学物質の発見において以前に成功が示された。
Ｇｏｏｄｆｏｒｄ（１９８５、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２８：８４９～８５７）およびＢｏｏｂｂｙｅｒら（１９８９、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３２：１０８３～１０９４）は、創薬可能領域の異なる化学基（プローブと呼ばれる）に対する領域または高い親和性を決定することを求めるコンピュータープログラム（ＧＲＩＤ）を作成した。したがって、ＧＲＩＤは、結合を増強し得る公知の化学物質に対する改変を提言するための手段を提供する。高親和性の領域としてＧＲＩＤによって判別される一部の部位は、一連の公知のリガンドから、干渉を用いて決定された「ファーマコフォアのパターン」に一致すると予測され得る。本明細書で使用される場合、「ファーマコフォアのパターン」は、結合にとって重要であると考えられる化学物質の特性の幾何学的配置である。新規リガンドのための検索スクリーニングとしてファーマコフォアのパターンを使用する試みが行われている（Ｊａｋｅｓら（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ Ｇｒａｐｈ ５：４１～４８；Ｂｒｉｎｔら（１９８７）Ｊ Ｇｒａｐｈ ５：４９～５６；Ｊａｋｅｓら（１９８６）Ｊ Ｍｏｌ Ｇｒａｐｈ ４：１２～２０）。
本発明のなおさらなる実施形態は、立体的に許容され、かつ化学物質と周囲のアミノ酸残基との間の好ましい化学的相互作用を達成する高い可能性を有するように、創薬可能領域に対して方向を合わせることができる化学物質についてＣＣＤＢのようなデータベースを検索するＣＬＩＸなどのコンピューターアルゴリズムを利用する。この方法は、異なる化学基のための好ましい結合位置の集合体に関して領域を特徴付けた後、個々の候補化学基と、集合体のメンバーとの最大の空間的合致を引き起こす化学物質の方向について検索することに基づく。ＣＬＩＸのアルゴリズムの詳細は、Ｌａｗｒｅｎｃｅら（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １２：３１～４１に記載されている。
このように、化学物質が創薬可能領域に結合するか、またはそれと干渉する効率を、コンピューター評価によって試験し、最適化することができる。例えば、創薬可能領域との好ましい会合について、化学物質は、好ましくは、その結合状態と、微細状態との間の比較的小さいエネルギー差（すなわち、結合の小さい変形エネルギー）を示さなければならない。かくして、ある特定の、より望ましい化学物質は、約１０ｋｃａｌ／モル以下、より好ましくは、７ｋｃａｌ／モル以下の結合の変形エネルギーを用いて設計されるであろう。化学物質は、全体の結合エネルギーにおいて類似する１つより多いコンフォメーションで創薬可能領域と相互作用してもよい。これらの場合、結合の変形エネルギーは、自由な実体のエネルギーと、化学物質が標的に結合する時に観察されるコンフォメーションの平均エネルギーとの差異であると取られる。
このように、本発明は、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの活性の潜在的なモジュレーターを同定または設計するためのコンピューターを援用した方法であって、コンピューターモデリングアプリケーションに、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドに由来する創薬可能領域の少なくとも一部を含む分子または複合体の構造座標のセットを供給すること；コンピューターモデリングアプリケーションに、化学物質の構造座標のセットを供給すること；および化学物質が分子または複合体に結合すると予想されるかどうかを決定することを含み、分子または複合体への結合が、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの活性の潜在的なモジュレーションを示す、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドに対する潜在的なモジュレーターを同定または設計するためのコンピューターを援用した方法であって、コンピューターモデリングアプリケーションに、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの創薬可能領域の少なくとも一部を含む分子または複合体の構造座標のセットを供給すること；コンピューターモデリングアプリケーションに、化学物質の構造座標のセットを供給すること；化学物質と、分子または分子複合体の活性部位との間の潜在的な結合相互作用を評価すること；化学物質を構造的に改変して、改変された化学物質の構造座標のセットを得ること；および改変された化学物質が分子または複合体に結合すると予想されるかどうかを決定することを含み、分子または複合体への結合が、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの活性の潜在的なモジュレーションを示す、方法を提供する。
一実施形態では、ペプチドまたは他の化合物または化学的ライブラリーをスクリーニングすることによって、潜在的なモジュレーターを取得することができる（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６～３９０（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８７：６３７８～６３８２（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：４０４～４０６（１９９０））。次いで、この様式で選択された潜在的なモジュレーターを、１つまたは複数の有望な潜在的な薬物が同定されるまで、コンピューターモデリングプログラムによって体系的に改変することができる。そのような分析は、ＨＩＶプロテアーゼモジュレーターの開発において有効であることが示されている（Ｌａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：３８０～３８４（１９９４）；Ｗｌｏｄａｗｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：５４３～５８５（１９９３）；Ａｐｐｅｌｔ、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ １：２３～４８（１９９３）；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ １：１０９～１２８（１９９３））。あるいは、化学会社および製薬会社などの、サードパーティーからライセンス供与され得るものなどの、化学薬品のライブラリーから、潜在的なモジュレーターを選択することができる。第３の代替手段は、ｄｅ ｎｏｖｏで潜在的なモジュレーターを合成することである。
例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの潜在的なモジュレーターを作製するための方法であって、コンピューターモデリングアプリケーションに、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドに由来する少なくとも１つの創薬可能領域を含む分子または複合体の構造座標のセットを供給すること；コンピューターモデリングアプリケーションに、化学物質の構造座標のセットを供給すること；および化学物質が、活性部位、例えば、創薬可能領域で分子または複合体に結合すると予想されるかどうかを決定することを含む、コンピューターを援用したプロセスの間に同定された、化学物質または化学物質を含有する分子を合成して、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの潜在的なモジュレーターを得ることを含み、分子または複合体への結合が、潜在的なモジュレーションを示す、方法を提供する。この方法は、化学物質と、分子または分子複合体の、活性部位、例えば、創薬可能領域との間の潜在的な結合相互作用を評価するステップおよび化学物質を構造的に改変して、改変された化学物質の構造座標のセットを得るステップをさらに含んでもよく、ステップを１回または複数回反復してもよい。
潜在的なモジュレーターが同定されたら、次いで、高分子のための任意の標準的なアッセイにおいて、勿論、高分子に応じて、高効率アッセイなどにおいて、それを試験することができる。一般的には、モジュレーターの構造のさらなる改良が必要であり、特定のスクリーニングアッセイ、特に、例えば、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドに結合したモジュレーターを用いた１５Ｎ ＮＭＲ緩和率決定またはｘ線結晶解析によるさらなる構造分析によって提供される任意のおよび／または全てのステップの連続的反復によって行うことができる。これらの試験を、生化学的アッセイと同時に実施することができる。
同定されたら、潜在的なモジュレーターを、モデル構造として使用し、化合物のアナログを取得することができる。次いで、アナログを、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドに結合するその能力についてスクリーニングする。潜在的なモジュレーターのアナログを、それが先行のモジュレーターよりも高い結合親和性でＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドに会合する場合、モジュレーターとして選択することができる。
関連する手法では、反復的薬物設計が、標的タンパク質のモジュレーターを同定するために使用される。反復的薬物設計は、タンパク質／モジュレーター複合体の連続セットの三次元構造を決定および評価することによって、タンパク質とモジュレーターとの間の会合を最適化するための方法である。反復的薬物設計では、一連のタンパク質／モジュレーター複合体の結晶を取得した後、それぞれの複合体の三次元構造を解明する。そのような手法は、タンパク質と、各複合体のモジュレーターとの間の会合における洞察を提供する。例えば、調節活性を有するモジュレーターを選択すること、この新しいタンパク質／モジュレーター複合体の結晶を取得すること、複合体の三次元構造を解明すること、および新しいタンパク質／モジュレーター複合体と、以前に解明されたタンパク質／モジュレーター複合体との間の会合を比較することによって、この手法を達成することができる。モジュレーターの変化が、どれぐらいタンパク質／モジュレーター会合に影響したかを観察することによって、これらの会合を最適化することができる。
上記のように、創薬可能領域と会合する化学物質を設計および／または同定することに加えて、同じ技術および方法を使用して、タンパク質標的の親和性領域、選択性領域または望ましくない領域と会合する、または会合しない化学物質を設計および／または同定することができる。そのような方法により、同じ種に由来する、または複数の種に由来する、１個もしくは数個の標的に対する、またはあるいは、複数の標的に対する選択性を達成することができる。
例えば、１つの創薬可能領域、例えば、親和性領域または選択性領域に関する結合エネルギーが、別の領域、例えば、望ましくない領域に関するものよりも、約２０％、３０％、５０％～約６０％以上好ましい化学物質を設計および／または同定することができる。（ａ）３つ以上の領域の間、（ｂ）同じ標的に由来する異なる領域（選択性、親和性または望ましくない領域）の間、（ｃ）異なる標的の領域の間、（ｄ）異なる種に由来するホモログの領域の間、または（ｅ）他の組合せの間で、差異が観察されることもある。あるいは、問題の２つ以上の領域を有する前記化学物質のＫｄ、通常は、見かけのＫｄを参照することによって、比較を行うことができる。
別の態様では、有望なモジュレーターを、標的タンパク質上の２つの近隣の創薬可能領域への結合についてスクリーニングする。例えば、標的ポリペプチドの第１の領域に結合するモジュレーターは、第２の近隣領域には結合しない。第２の領域への結合を、元のスクリーニングまたは第１の領域のためのモジュレーター（または潜在的なモジュレーター）の存在下で行われた第２のスクリーニングのいずれかにおいて異なるセットのアミド化学シフトの変化をモニタリングすることによって決定することができる。化学シフト変化の分析から、第２の領域のための潜在的なモジュレーターのおよその位置が同定される。次いで、領域への結合のための第２のモジュレーターの最適化を、構造的に関連する化合物（例えば、上記のアナログ）をスクリーニングすることによって実行する。第１の領域および第２の領域のためのモジュレーターが同定された場合、三重複合体中のその位置および向きを、実験的に決定することができる。この構造情報に基づいて、第１の領域のためのモジュレーターと、第２の領域のためのモジュレーターとが連結された、連結された化合物、例えば、強化されたモジュレーターを合成する。ある特定の実施形態では、２つのモジュレーターを、共有結合的に連結して、強化されたモジュレーターを形成させる。この強化されたモジュレーターを試験して、それが２つの個々のモジュレーターのいずれかよりも標的に対する高い結合親和性を有するかどうかを決定することができる。強化されたモジュレーターは、それが２つのモジュレーターのいずれかよりも標的に対する高い結合親和性を有する場合に、モジュレーターとして選択される。より大きい強化されたモジュレーターを、同様の様式で構築することができ、例えば、標的上の３つの近隣領域に結合する３つのモジュレーターを連結して、連結されたモジュレーターよりも標的に対するさらに高い親和性を有する多重連結された強化されたモジュレーターを形成させることができる。この例では、全ての創薬可能領域に結合するモジュレーターを有することが望ましいと考えられる。しかしながら、ある特定の創薬可能領域への結合は望ましくないこともあるため、同じ技術を使用して、標的の全てではないが、少なくとも１つの創薬可能領域への結合に基づいて増大した特異性を示す、モジュレーターおよび強化されたモジュレーターを同定することができる。
本発明は、上記の薬物設計を使用するいくつかの方法を提供する。例えば、一態様では、本発明は、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドのモジュレーターをスクリーニングするための候補治療剤を設計するための方法であって、（ａ）結晶化されたＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドまたはその断片の三次元構造を決定すること；および（ｂ）結晶化されたポリペプチドまたは断片の三次元構造に基づいて候補治療剤を設計することを含む方法を企図する。
（ｉｉ）モジュレーターライブラリー
コンビナトリアルライブラリーの合成およびスクリーニングは、目的の有機分子の同定および試験のための検証された戦略である。本発明によれば、対象の創薬可能領域に結合する、それと相互作用する、またはその活性／機能をモジュレートする分子を含有するライブラリーの合成を、液相、固相、または液相および固相合成技術の組合せのための確立されたコンビナトリアル方法を使用して実施することができる。コンビナトリアルライブラリーの合成は、当業界で周知であり、概説されている（例えば、「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ、Ｆｅｂ．２４、１９９７、ｐ．４３；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．（１９９６）９６：５５５を参照されたい）。多くのライブラリーが市販されている。当業者であれば、任意の特定の実施形態のための方法の選択が、合成しようとする分子の特定の数、特定の反応化学、ならびに本発明のライブラリーの調製および分析のためのロボット機器などの、特定の機器の利用可能性に依存することを知っているであろう。ある特定の実施形態では、ライブラリーを生成するために実施される反応は、妥当な場合、高収率で、また、立体選択的および位置選択的な様式で進行するその能力について選択される。
コンビナトリアルライブラリーの合成およびスクリーニングは、目的の有機分子の同定および試験のための検証された戦略である。本発明によれば、対象の創薬可能領域に結合する、それと相互作用する、またはその活性／機能をモジュレートする分子を含有するライブラリーの合成を、液相、固相、または液相および固相合成技術の組合せのための確立されたコンビナトリアル方法を使用して実施することができる。コンビナトリアルライブラリーの合成は、当業界で周知であり、概説されている（例えば、「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ、Ｆｅｂ．２４、１９９７、ｐ．４３；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．（１９９６）９６：５５５を参照されたい）。多くのライブラリーが市販されている。当業者であれば、任意の特定の実施形態のための方法の選択が、合成しようとする分子の特定の数、特定の反応化学、ならびに本発明のライブラリーの調製および分析のためのロボット機器などの、特定の機器の利用可能性に依存することを知っているであろう。ある特定の実施形態では、ライブラリーを生成するために実施される反応は、妥当な場合、高収率で、また、立体選択的および位置選択的な様式で進行するその能力について選択される。
本発明の一態様では、本発明のライブラリーは、液相技術を使用して生成される。コンビナトリアルライブラリーの合成のための液相技術の伝統的な利点としては、以下で考察されるように、はるかに広い範囲の反応の利用可能性、および生成物を特徴付けることができる相対的容易性、およびライブラリーメンバーの即時の同定が挙げられる。例えば、ある特定の実施形態では、液相コンビナトリアルライブラリーの生成のために、全ての生成物を、それ自身の反応容器中で別々に集合させる、同時合成技術が利用される。特定の同時合成手順においては、反応が起こる数ミリリットルの溶媒を保持することができる小さいウェルのｎ行およびｍ列を含有するマイクロタイタープレートが利用される。次いで、リガンドなどの反応物Ａのｎ個のバリアント、および第２のリガンドなどの反応物Ｂのｍ個のバリアントを使用して、ｎｘｍ個のウェル中に、ｎｘｍ個のバリアントを得ることができる。当業者であれば、この特定の手順が、より小さいライブラリーが望ましい場合に最も有用であり、特定のウェルが特定のウェル中のライブラリーメンバーを同定するための即時の手段を提供し得ることを知っているであろう。
本発明の他の実施形態では、固相合成技術が利用される。過剰の試薬を利用し、未反応の試薬を洗浄除去することができるため、固相技術は、反応を完了まで駆動させることができる。固相合成はまた、同時合成技術に加えて、Ｆｕｒｋａによって開発された、「スプリットアンドプール」と呼ばれる技術の使用も可能にする。例えば、Ｆｕｒｋａら、Ａｂｓｔｒ．１４ｔｈ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｇｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、（Ｐｒａｇｕｅ、Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａ）（１９８８）５：４７；Ｆｕｒｋａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．（１９９１）３７：４８７；Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（１９９３）３：４１３を参照されたい。この技術では、関連分子の混合物を、同じ反応容器中で作製し、かくして、１００万もの、または１００万を超えるライブラリーメンバーを含有するものなどの、非常に大きいライブラリーの合成にとって必要とされるコンテナの数を実質的に減少させることができる。例として、出発材料が結合した固相支持体を、ｎ個の容器に分割してもよく、ここで、ｎは、そのような出発材料と反応させようとする試薬Ａの種の数を表す。反応後、ｎ個の容器に由来する内容物を合わせた後、ｍ個の容器に分割し、ここで、ｍは、ここで改変された出発材料と反応させようとする試薬Ｂの種の数を表す。所望の数の試薬が出発材料と反応して、本発明のライブラリーが得られるまで、この手順を繰り返す。
本発明における固相技術の使用はまた、特定のエンコーディング技術の使用を含んでもよい。特定のエンコーディング技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）１：６０においてＣｚａｒｎｉｋによって概説されている。また、当業者であれば、９６ウェルプレートなどの特定の反応ウェル中で、またはプラスチックピン上で、より小さい固相ライブラリーを生成する場合、これらのライブラリーメンバーの反応歴を、特定のプレートにおけるその空間座標によって同定し、かくして、空間的にエンコードすることもできることを知っているであろう。他の実施形態では、エンコーディング技術は、固相支持体に結合した特定の「識別因子」の使用を含み、その空間座標を参照することなく、特定のライブラリーメンバーの構造の決定を可能にする。そのようなエンコーディング技術の例としては、限定されるものではないが、空間エンコーディング技術、「ティーバッグ」法、化学エンコーディング法、および分光測光コーディング法を含むグラフィックエンコーディング技術が挙げられる。当業者であれば、本発明において使用される特定のエンコーディング法を、所望のライブラリーメンバーの数、および用いられる反応化学に基づいて選択する必要があることを知っているであろう。
ある特定の実施形態では、本発明の分子を、当業界で公知の固相支持体化学を使用して調製することができる。例えば、最大で２０個またはそれより多いアミノ酸を有するポリペプチドを、市販の装備（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈのマルチ有機合成装置など）上での標準的な固相技術を使用して生成することができる。ある特定の実施形態では、出発材料または後の反応物を、連結ユニットを介して、または直接的に、固相に結合させた後、所望の分子の合成において使用することができる。連結の選択は、分子の反応性および固相支持体ユニットならびにこれらの連結の安定性に依存するであろう。リンカー分子による固相支持体への直接結合は、固相支持体からライブラリーメンバーを分離しないようにすることが望ましい場合に有用であり得る。例えば、生物活性の直接オンビーズ分析のためには、ライブラリーメンバーと固相支持体との間のより強力な相互作用が望ましい場合がある。あるいは、固相支持体からの本発明のライブラリーメンバーのより容易な切断が望ましい場合、連結試薬の使用が有用であり得る。
対象の本発明の方法の自動化に関しては、様々な機器を使用して、本発明の化学ライブラリーの容易かつ効率的な調製、およびそのようなライブラリーのメンバーをアッセイする方法を可能にすることができる。一般に、対象の化学ライブラリーの合成および調製を参照して使用される場合の自動化は、単一の分子の代わりにライブラリーが調製されるため、多数回繰り返す必要がある１つまたは複数の運転ステップを完了する機器を有することを含む。自動化の例は、限定されるものではないが、試薬の添加、混合およびそれらの反応、反応混合物の濾過、溶媒を用いた固体の洗浄、溶媒の除去および添加などを完了する機器を有することを含む。自動化を、本発明の組成物における使用のための分子を調製、精製およびアッセイするためのものなどの反応スキームにおける任意のステップに適用することができる。
可能な自動化の範囲がある。例えば、対象のライブラリーの合成を、全て自動化するか、または一部のみ自動化することができる。全て自動化する場合、必要に応じて、試薬ボトルを再充填するか、または機器をモニタリングもしくはプログラミングする以外に、合成プロセスを開始した後にはいかなるヒトの介入もなしに機器によって対象のライブラリーを調製することができる。対象のライブラリーの合成を全て自動化することができるが、ライブラリーメンバーの精製、同定などのためにヒトの介入が必要であってもよい。
対照的に、対象のライブラリーの合成の部分的自動化は、混合、撹拌、濾過などの、ライブラリーを生じさせる反応スキームの物理的ステップに関するいくつかのロボット支援を含むが、ただ試薬ボトルを再充填するか、または機器をモニタリングもしくはプログラミングする以外に、いくらかのヒトの介入を依然として必要とする。部分的自動化においては、分子のライブラリーが調製されるため、機器は、多数回完了することが必要とされる任意のスキームの１つまたは複数のステップを依然として完了するため、この型のロボット自動化は、従来の有機合成および生物学的技術によって提供される支援とは区別される。
ある特定の実施形態では、対象のライブラリーを、複数の反応容器（例えば、マイクロタイタープレートなど）中で調製し、ライブラリーの特定のメンバーのアイデンティティーを、各容器の位置によって決定することができる。他の実施形態では、対象のライブラリーを、溶液中で合成し、解析技術の使用によって、特定のメンバーのアイデンティティーを決定することができる。
本発明の一態様では、対象のスクリーニング方法を、固定化されたライブラリーを利用して実行することができる。ある特定の実施形態では、固定化されたライブラリーは、上記のように微生物に結合する能力を有するであろう。好適な支持体の選択は、当業者にとっては日常的なものであろう。重要な基準は、支持体の反応性が、ライブラリーを調製するのに必要とされる反応を阻害しないことを含んでもよい。不溶性ポリマー支持体は、本明細書に記載の粒子のいずれかを含む、ポリスチレン、ポリスチレン／ジビニルベンゼンコポリマーなどに基づく機能性ポリマーを含む。ポリマー支持体をコーティングする、移植する、またはそうでなければ他の固相支持体に結合することができることが理解されるであろう。
別の実施形態では、ポリマー支持体を、可逆的に可溶性のポリマーによって提供することができる。そのようなポリマー支持体は、ポリビニルアルコールまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に基づく機能性ポリマーを含む。可溶性支持体を、好適な不活性非溶媒の添加によって不溶性にすることができる（例えば、沈降物にすることができる）。可溶性ポリマー支持体を使用して実施される反応の１つの利点は、溶液中での反応が、不溶性ポリマー支持体上で実施される反応よりも、迅速であり、高収率であり、より完全であり得るということである。
所望の液相または固相支持体に結合した鋳型の合成が完了したら、鋳型はさらなる反応のために利用可能となり、所望の液相または固相支持体に結合した構造を得る。固相支持体に結合した鋳型の使用は、より迅速なスプリットアンドプール技術の使用を可能にする。
ライブラリーメンバーの特性評価を、質量分析、１９５Ｐｔおよび１Ｈ ＮＭＲクロマトグラフィー（例えば、液体など）を含む核磁気共鳴分光学ならびに赤外分光学などの標準的な分析技術を使用して実施することができる。当業者であれば、特定の分析技術の選択が、本発明のライブラリーメンバーが液相中または固相上にあるかどうかに依存することを知っているであろう。そのような特性評価に加えて、ライブラリーメンバーを別々に合成して、より即時の同定を可能にすることができる。
（ｉｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
任意の形態のＨＣＭＶ ｇＢポリペプチド、例えば、標的創薬可能領域を含む完全長ポリペプチドまたはその断片を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて候補治療剤の活性を評価することができる。そのようなアッセイの一実施形態では、創薬可能領域の生物活性、目的のタンパク質間相互作用または対象の創薬可能領域を含むタンパク質複合体の形成をモジュレートする薬剤が同定される。そのようなアッセイの別の実施形態では、対象の創薬可能領域に結合する、またはそれと相互作用する薬剤が同定される。ある特定の実施形態では、試験薬剤は、小さい有機分子である。候補薬剤を、例えば、以下のクラスの化合物：界面活性剤、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、低分子、サイトカイン、またはホルモンから選択することができる。一部の実施形態では、候補治療剤（「候補薬剤」または「試験薬剤」としても知られる）は、化合物のライブラリー中にあってもよい。これらのライブラリーを、上記のようなコンビナトリアル合成法を使用して生成することができる。本発明のある特定の実施形態では、前記候補治療剤が標的創薬可能領域に結合する能力を、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって評価することができる。次のセクションで考察される、いずれかの実施形態では、結合アッセイはｉｎ ｖｉｖｏであってもよい。
任意の形態のＨＣＭＶ ｇＢポリペプチド、例えば、標的創薬可能領域を含む完全長ポリペプチドまたはその断片を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて候補治療剤の活性を評価することができる。そのようなアッセイの一実施形態では、創薬可能領域の生物活性、目的のタンパク質間相互作用または対象の創薬可能領域を含むタンパク質複合体の形成をモジュレートする薬剤が同定される。そのようなアッセイの別の実施形態では、対象の創薬可能領域に結合する、またはそれと相互作用する薬剤が同定される。ある特定の実施形態では、試験薬剤は、小さい有機分子である。候補薬剤を、例えば、以下のクラスの化合物：界面活性剤、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、低分子、サイトカイン、またはホルモンから選択することができる。一部の実施形態では、候補治療剤（「候補薬剤」または「試験薬剤」としても知られる）は、化合物のライブラリー中にあってもよい。これらのライブラリーを、上記のようなコンビナトリアル合成法を使用して生成することができる。本発明のある特定の実施形態では、前記候補治療剤が標的創薬可能領域に結合する能力を、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって評価することができる。次のセクションで考察される、いずれかの実施形態では、結合アッセイはｉｎ ｖｉｖｏであってもよい。
本発明はまた、本発明のペプチドもしくはポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチドの作用をモジュレートするものを同定するために複数の化合物をスクリーニングする方法も提供する。スクリーニングの方法は、高効率技術を含んでもよい。例えば、モジュレーター、合成反応混合物、膜、細胞エンベロープもしくは細胞壁などの細胞コンパートメント、またはそのいずれかの調製物をスクリーニングするために、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドおよびそのようなポリペプチドの標識された基質またはリガンドを含む、全細胞もしくは組織、またはさらには、全生物を、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドのモジュレーターであってもよい候補治療剤の非存在下または存在下でインキュベートする。候補治療剤が、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドをモジュレートする能力は、標識されたリガンドの結合の低下またはそのような基質からの生成物の生産の低下に反映される。基質からの生成物の生産の速度またはレベルの検出を、リポーター系を使用することによって増強することができる。これに関して有用であり得るリポーター系としては、限定されるものではないが、生成物に変換された比色標識された基質、本発明の核酸またはポリペプチド活性の変化に応答するリポーター遺伝子、および当業界で公知の結合アッセイが挙げられる。例えば、一実施形態では、モジュレーターまたは阻害剤ペプチドは、ＦＩＴＣにコンジュゲートされ、標的結合ポケットに対するＦＩＴＣ標識されたペプチドの親和性は、蛍光偏光アッセイを使用して測定される。標的結合ポケットに対するモジュレーターまたは阻害剤の特異性を、Ｓｃｈｍｉｄｔら（（２０１０）ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ６（４）：ｅ１０００８５１）に記載の「プルダウン」法を使用するモジュレーターまたは阻害剤のビオチン化された誘導体を使用することによって示すことができる。ビリオンとのモジュレーターまたは阻害剤の会合を検出するために、ビオチン標識されたモジュレーターまたは阻害剤をビリオンと共にインキュベートし、ストレプトアビジン樹脂を添加して、イムノブロッティングによって検出する。ビリオンとのモジュレーターまたは阻害剤の会合をさらに確認するために、モジュレーターまたは阻害剤の存在下でピレン標識されたビリオンを使用し、エキシマー強度をチェックする。好ましい実施形態では、蛍光偏光およびＦＲＥＴは、ドメインＶペプチドの結合およびその結合の阻害を検出する方法である。さらなる実施形態では、表面プラズモン共鳴を使用して、創薬可能領域へのモジュレーターまたは阻害剤の結合についてスクリーニングする。
ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドのモジュレーターに関するアッセイの別の例は、競合阻害アッセイのための適切な条件下で、ＨＣＭＶ ｇＢペプチドまたはポリペプチドおよび潜在的なモジュレーターを、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドに結合する分子、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドに結合する組換え分子、天然の基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド模倣体と組み合わせる競合アッセイである。結合分子に結合した、または生成物に変換されたＨＣＭＶ ｇＢペプチドまたはポリペプチドの分子数を、正確に決定して、潜在的なモジュレーターの有効性を評価することができるように、放射活性または比色化合物などによって、本発明のペプチドまたはポリペプチドを標識することができる。一態様では、ＨＣＭＶ ｇＢペプチドは、残基Ｍ６４８～Ｋ７００（配列番号２６０）、Ｍ６４８～Ｖ６９７（配列番号２６１）、Ｓ６４７～Ｖ６９７（配列番号２６２）、Ｓ６４７～Ｖ６６３（配列番号２６３）、Ｉ６５３～Ｖ６９７（配列番号２６４）、Ｉ６５３～Ｑ６９２（配列番号２６５）、Ｉ６５３～Ｌ６８０（配列番号２６６）、Ｉ６５３～Ｓ６７５（配列番号２６７）、Ｉ６５３～Ｙ６６７（配列番号２６８）、Ｒ６６２～Ｖ６９７（配列番号２６９）、Ｒ６６２～Ｑ６９２（配列番号２７０）、Ｒ６６２～Ｌ６８０（配列番号２７１）、Ｒ６６２～Ｓ６７５（配列番号２７２）、Ｌ６６４～Ｆ６７８（配列番号２７３）、Ｓ６６８～Ｖ６９７（配列番号２７４）、Ｓ６６８～Ｑ６９２（配列番号２７５）、Ｓ６６８～Ｖ６７７（配列番号２７６）、Ｄ６７９～Ｖ６９７（配列番号２７７）、Ｌ６８０～Ｖ６９７（配列番号２７８）、Ｌ６８０～Ｑ６９２（配列番号２７９）、およびＲ６９３～Ｋ７００（配列番号２８０）を有する配列番号１の断片である。
ポリペプチドの活性をモジュレートする分子を同定するためのいくつかの方法が、当業界で公知である。例えば、１つのそのような方法では、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドを、試験化合物と接触させ、試験化合物の存在下でのＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの活性を決定し、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの活性の変化は、試験化合物が、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの活性をモジュレートすることを示す。ある特定の例では、試験化合物は、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの活性を刺激し、他の例では、試験化合物は、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの活性を中和する。
別の例では、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチド依存的増殖またはＨＣＭＶの感染力をモジュレートする化合物を、（ａ）ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドと、試験化合物とを接触させること；および（ｂ）試験化合物の存在下でポリペプチドの活性を決定することによって同定することができ、ポリペプチドの活性の変化は、試験化合物がＨＣＭＶの増殖または感染力をモジュレートすることができることを示す。
ある特定の対象のアッセイでは、対象の組成物を使用して結果を評価するために、標的に対する既知の結合親和性を有するものなどの、既知の分子に対して比較を行うことができる。例えば、既知の分子および目的の新規分子をアッセイすることができる。対象の複合体に関するアッセイの結果は、既知の分子に関する結果と比較することができる型および規模のものであろう。対象の複合体が既知の分子のものとは量的に異なるアッセイにおける応答の型を示す限りにおいて、そのアッセイにおけるそのような複合体に関する結果は、陽性または陰性の結果と見なされる。ある特定のアッセイでは、応答の規模を、既知の分子の結果に関する応答パーセンテージとして、例えば、それらが同じである場合は既知の結果の１００％として表すことができる。
当業者であれば理解できるように、本明細書に基づいて、結合アッセイを使用して、ポリペプチドに結合する薬剤を検出することができる。無細胞アッセイを使用して、ポリペプチドと相互作用することができる分子を同定することができる。好ましい実施形態では、そのような分子を同定するための無細胞アッセイは、本質的に標的および試験分子または試験分子のライブラリーを含有する反応混合物を含む。試験分子は、例えば、標的の既知の結合パートナーの誘導体、例えば、生物学的に不活性なペプチド、または低分子であってもよい。結合する能力について試験される薬剤を、例えば、細菌、酵母または他の生物（例えば、天然生成物）によって生産させる、化学的に生産する（例えば、ペプチド模倣体を含む低分子）、または組換え的に生産することができる。ある特定の実施形態では、試験分子は、脂質、炭水化物、ペプチド、ペプチド模倣体、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、タンパク質（抗体を含む）、低分子、天然生成物、アプタマーおよびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。本発明の他の実施形態では、結合アッセイは、無細胞ではない。好ましい実施形態では、標的に結合する分子を同定するためのそのようなアッセイは、標的微生物と、試験分子または試験分子のライブラリーとを含有する反応混合物を含む。
分子のライブラリーおよび天然抽出物を試験する多くの候補スクリーニングプログラムでは、所与の期間において調査される分子数を最大化するために、高効率アッセイが望ましい。精製もしくは半精製されたタンパク質または溶解物を用いて誘導することができるものなどの無細胞系において実施される本発明のアッセイは、それらを、迅速な開発および標的と試験分子との間の結合の比較的容易な検出を可能にするように生成することができるという点で、「一次」スクリーニングとして好ましいことが多い。さらに、試験分子の細胞毒性および／またはバイオアベイラビリティの効果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系では一般に無視してもよく、その代わりに、アッセイは標的に結合する分子の能力に主に焦点を当てる。したがって、潜在的な結合分子を、細胞溶解物中での目的の機能的相互作用の構成によって生成される無細胞アッセイにおいて検出することができる。別の形式では、アッセイを、以下に記載されるように、溶解物に基づくアッセイを超えるいくつかの利益を提供する、再構成されたタンパク質混合物として誘導することができる。
一態様では、本発明は、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの創薬可能領域に結合する分子についてスクリーニングするために使用することができるアッセイを提供する。例示的な結合アッセイでは、目的の分子を、標的細胞表面ポリペプチドから生成される混合物と接触させる。標的ポリペプチドへの予想される結合の検出および定量化は、標的に結合する時の分子の有効性を決定するための手段を提供する。分子の有効性を、種々の濃度の試験分子を使用して得られたデータから用量応答曲線を生成することによって評価することができる。さらに、対照アッセイを実施して、比較のためのベースラインを提供することもできる。対照アッセイでは、複合体の形成を、試験分子の非存在下で定量する。
分子と、標的ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドまたはＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドを含有する微生物との間の複合体形成を、様々な技術によって検出することができ、その多くは、上に効率的に記載されている。例えば、複合体の形成におけるモジュレーションを、例えば、イムノアッセイによって、またはクロマトグラフィー検出によって、検出可能に標識されたタンパク質（例えば、放射標識、蛍光標識、または酵素標識された）を使用して定量することができる。
したがって、本発明の１つの例示的なスクリーニングアッセイは、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドまたはその機能性断片と、試験分子または試験分子のライブラリーとを接触させるステップおよび複合体の形成を検出するステップを含む。検出目的で、例えば、分子を特異的マーカーで標識し、試験分子または試験分子のライブラリーを異なるマーカーで標識することができる。次いで、試験化合物と、ポリペプチドまたはその断片との相互作用を、インキュベーションステップおよび洗浄ステップの後に２つの標識のレベルを決定することによって検出することができる。洗浄ステップ後の２つの標識の存在は、相互作用を示す。そのようなアッセイを、全標的細胞と連携するように改変することもできる。
ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチド標的と分子との相互作用を、光学的現象である表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を検出するリアルタイムＢＩＡ（生体分子相互作用分析、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ）を使用することによって同定することもできる。検出は、生物特異的インターフェースでの高分子の質量濃度の変化に依存し、反応体の標識化を必要としない。一実施形態では、試験分子のライブラリーを、例えば、マイクロフローセルの１つの壁を形成する、センサー表面上に固定することができる。次いで、標的を含有する溶液を、センサー表面上に継続的に流動させる。シグナル記録上に示されるような共鳴角の変化は、相互作用が起こったことを示す。この技術は、例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａによるＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋにさらに記載されている。
好ましい実施形態では、標的を固定して、非複合体形態からの複合体の分離を容易にする、ならびにアッセイの自動化を提供することが望ましいであろう。試験分子へのポリペプチドの結合を、反応物を含有するのに好適な任意の容器中で達成することができる。例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管が挙げられる。一実施形態では、標的をマトリックスに結合させるドメインが付加されている融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ／ポリペプチド（ＧＳＴ／ポリペプチド）融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させた後、標識された試験分子（例えば、Ｓ３５標識、Ｐ３３標識されたものなど）と混ぜ合わせ、混合物を、複合体形成を促す条件下で、例えば、塩およびｐＨに関する生理的条件でインキュベートすることができるが、わずかによりストリンジェントな条件が望ましい場合がある。インキュベーション後、ビーズを洗浄して、あらゆる未結合の標識を除去し、混合物を固定し、放射標識を、直接的に（例えば、シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）に入れたビーズ）、または続いて複合体を解離させた後に上清中で決定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ビーズ画分中に見出されたポリペプチドまたは結合パートナーのレベルを、添付の実施例に記載されるものなどの標準的な電気泳動技術を使用して、ゲルから定量することができる。試験分子を固定し、標識された標的を固定された試験分子と共にインキュベートする上記の技術を改変することもできる。本発明の一実施形態では、試験分子を、必要に応じてリンカーを介して、本発明の粒子に固定して、例えば、最終的な組成物を創出する。
マトリックス上に標的または分子を固定するための他の技術を、対象のアッセイにおいて使用することができる。例えば、標的または分子を、ビオチンおよびストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定することができる。例えば、ビオチン化されたポリペプチド分子を、当業界で周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）を使用してビオチン－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中で固定することができる。あるいは、標的または分子と反応する抗体を、プレートのウェルに誘導して、標的または分子を、抗体コンジュゲーションによってウェル中に捕捉することができる。上記のように、試験分子の調製物を、プレートのポリペプチド提示ウェル中でインキュベートし、ウェル中に捕捉された複合体の量を定量することができる。ＧＳＴ固定された複合体について上に記載されたものに加えて、そのような複合体を検出するための例示的な方法は、複合体と反応するか、または複合体成分の１つと反応する抗体を使用した複合体の免疫検出；および内在性または外因性の活性のいずれかである、標的または分子と関連する酵素活性の検出に依拠する酵素結合アッセイを含む。後者の例では、酵素を、標的または分子との融合タンパク質として化学的にコンジュゲートするか、または提供することができる。例示すると、標的ポリペプチドを化学的に架橋するか、または西洋わさびペルオキシダーゼと遺伝的に融合し、分子との複合体中に捕捉されたポリペプチドの量を、酵素の発色基質、例えば、３，３’－ジアミノ－ベンザジンテトラヒドロクロリドまたは４－クロロ－１－ナフトールを用いて評価することができる。同様に、ポリペプチドおよびグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼを含む融合タンパク質を提供し、１－クロロ－２，４－ジニトロベンゼンを使用してＧＳＴ活性を検出することによって、複合体形成を定量することができる（Ｈａｂｉｇら（１９７４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４９：７１３０）。
複合体中に捕捉された成分の１つを定量するために免疫検出に依拠するプロセスのために、抗ポリペプチド抗体などの、成分に対する抗体を使用することができる。あるいは、複合体中で検出しようとする成分を、ポリペプチド配列に加えて、抗体が容易に入手可能である（例えば、商業的供給源から）第２のポリペプチドを含む融合タンパク質の形態で「エピトープタグ化」することができる。例えば、上記のＧＳＴ融合タンパク質を、ＧＳＴ部分に対する抗体を使用する結合の定量化のために使用することもできる。他の有用なエピトープタグとしては、ｃ－ｍｙｃに由来する１０残基の配列を含むｍｙｃ－エピトープ（例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９９１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６：２１１５０～２１１５７）、およびｐＦＬＡＧシステム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）またはｐＥＺＺ－プロテインＡシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＮＪ）が挙げられる。
本アッセイのある特定のｉｎ ｖｉｔｒｏでの実施形態では、標的を含有する溶液は、少なくとも半精製されたタンパク質の再構成されたタンパク質混合物を含む。半精製されたとは、再構成された混合物中で利用される成分が、他の細胞またはウイルスタンパク質から予め分離されていることを意味する。例えば、細胞溶解物とは対照的に、標的タンパク質は、混合物中の他の全てのタンパク質と比較して、少なくとも５０％の純度で混合物中に存在し、より好ましくは、９０～９５％の純度で存在する。対象の方法のある特定の実施形態では、再構成されたタンパク質混合物は、再構成された混合物が、結合活性を測定する能力を阻害するか、またはそうでなければ変更し得る他のタンパク質（細胞またはウイルス起源のものなど）を実質的に含まないように、高度に精製されたタンパク質を混合することによって誘導される。一実施形態では、再構成されたタンパク質混合物の使用は、標的：分子相互作用条件のより慎重な制御を可能にする。
本発明のさらに他の実施形態では、ウイルス融合またはウイルス感染力アッセイの変形形態を利用して、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドを発現するウイルスが、細胞に結合する、細胞と融合する、または細胞に感染するのを防止する試験分子の能力を決定することができる。融合、結合、または感染が防止される場合、分子または組成物は、治療剤として有用であり得る。
全てのスクリーニング法を、様々なアッセイ形式を使用することによって達成することができる。本開示に照らせば、本明細書に明示的に記載されないものは、それにも拘わらず、公知であり、当業者によって理解されるであろう。当業者であれば、本説明に基づいて理解できるように、タンパク質複合体またはタンパク質－核酸複合体の形成、および酵素活性としてそのような条件を近似するアッセイ形式は、多くの異なる形式で生成することができ、限定されるものではないが、無細胞系、例えば、精製されたタンパク質または細胞溶解物に基づくアッセイ、ならびに無傷の細胞を利用する細胞に基づくアッセイが挙げられる。所与の標的：分子相互作用の結果得られる結合のアッセイを、反応物を含有するのに好適な任意の容器中で達成することができる。例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管が挙げられる。任意のアッセイを、キット形式で提供し、自動化することができる。以下の特定のアッセイの多くは、融合の遮断または防止などの、一般原理に依拠し、他の特定のアッセイにも適用することができる。
（ｉｖ）ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ
ウイルス感染および／または疾患の動物モデルを、ＨＣＭＶ感染の処置または防止における潜在的な薬物標的の有効性を評価するためのｉｎ ｖｉｖｏアッセイとして使用することができる。いくつかの好適な動物モデルが以下で簡単に説明されるが、これらのモデルは、例に過ぎず、改変、または完全に異なる動物モデルを、本発明の方法に従って使用することができる。当業界で公知の方法によって、例えば、動物にＨＣＭＶを感染させることによって、またはそのような感染に罹りやすい素因を有するように動物を遺伝子操作することによって、動物モデルを開発することができる（例えば、Ｍａｉｄｊｉ，Ｅ．ら、Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ａｌｅｖｅｏｌａｒ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ＳＣＩＤ－ｈｕ Ｌｕｎｇ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１２ Ｄｅｃ；８６（２３）：１２７９５～１２８０５；Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｌ．Ｂ．ら、Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｄ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１５ Ａｕｇ；１３：８６～９２）。
ウイルス感染および／または疾患の動物モデルを、ＨＣＭＶ感染の処置または防止における潜在的な薬物標的の有効性を評価するためのｉｎ ｖｉｖｏアッセイとして使用することができる。いくつかの好適な動物モデルが以下で簡単に説明されるが、これらのモデルは、例に過ぎず、改変、または完全に異なる動物モデルを、本発明の方法に従って使用することができる。当業界で公知の方法によって、例えば、動物にＨＣＭＶを感染させることによって、またはそのような感染に罹りやすい素因を有するように動物を遺伝子操作することによって、動物モデルを開発することができる（例えば、Ｍａｉｄｊｉ，Ｅ．ら、Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ａｌｅｖｅｏｌａｒ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ＳＣＩＤ－ｈｕ Ｌｕｎｇ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１２ Ｄｅｃ；８６（２３）：１２７９５～１２８０５；Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｌ．Ｂ．ら、Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｄ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１５ Ａｕｇ；１３：８６～９２）。
さらに、ウイルス感染力アッセイを、ＨＣＭＶ感染の処置または防止における潜在的な薬物標的の有効性を評価するためのｉｎ ｖｉｖｏアッセイとして使用することができる。例えば、競合的非対称性逆転写酵素媒介性ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）アッセイおよびウイルス抗原を測定するフローサイトメトリーアッセイ、およびプラークアッセイなどを使用して、潜在的な薬物標的の有効性を評価することができる。
なおさらに、細胞間融合アッセイを、ＨＣＭＶ感染の処置または防止における潜在的な薬物標的の有効性を評価するためのｉｎ ｖｉｖｏアッセイとして使用することができる。
様々な他のｉｎ ｖｉｖｏモデルが利用可能であり、特定の病原体または特定の試験薬剤にとって適切である場合に使用することができる。
また、感染モデルのために使用される動物の種、およびその動物の特定の遺伝子構成が、特定の試験薬剤の効果の有効な評価に寄与し得ることに留意することも適切である。例えば、免疫能力がない動物は、一部の例では、免疫能力がある動物よりも好ましい場合がある。例えば、能力がある免疫系の作用は、ある程度まで、免疫能力がない動物における同様の感染と比較して、試験薬剤の効果を隠すことができる。さらに、多くの日和見感染は、事実、免疫障害のある患者において生じるので、類似する免疫環境における感染をモデリングすることが適切である。
Ｅ．医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本発明に従って同定された任意のモジュレーター、またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルを含む。用語「薬学的に許容される担体」とは、組成物の他の成分と適合し、そのレシピエントにとって有害ではないという意味で「許容される」担体を指す。
本発明の医薬組成物は、本発明に従って同定された任意のモジュレーター、またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルを含む。用語「薬学的に許容される担体」とは、組成物の他の成分と適合し、そのレシピエントにとって有害ではないという意味で「許容される」担体を指す。
そのような医薬組成物を作製および使用する方法も、本発明に含まれる。本発明の医薬組成物を、経口、非経口、吸入スプレー、局所、直腸、経鼻、経頬、経膣、または埋め込み型リザーバーにより投与することができる。本明細書で使用される用語非経口は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病変内、および頭蓋内注射または輸注技術を含む。
本明細書に記載のモジュレーターの、１日あたり約０．０１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１日あたり約０．５～約７５ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量レベルは、本発明のポリペプチドの起源の病原種によって媒介される疾患および状態を含む、ＨＣＭＶ感染によって引き起こされる疾患および状態の防止および処置にとって有用である。単一の剤形を生産するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される宿主および特定の投与様式に応じて変化するであろう。典型的な調製物は、約５％～約９５％の活性化合物（ｗ／ｗ）を含有するであろう。あるいは、そのような調製物は、約２０％～約８０％の活性化合物を含有する。
Ｆ．キット
本発明は、ＨＣＭＶ感染を処置または防止するためのキットを提供する。例えば、キットは、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドのモジュレーターとして、本明細書で同定される化合物を含む組成物を含んでもよい。組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物であってもよい。キットを含む他の実施形態では、本発明は、本発明の組成物、および必要に応じて、その使用のための使用説明書を含むキットを企図する。キットの成分を、前述の方法の手動による、または部分的もしくは完全に自動化された実施のために包装することができる。そのようなキットは、例えば、イメージング、診断、治療、および他の適用を含む、様々な用途を有してもよい。
本発明は、ＨＣＭＶ感染を処置または防止するためのキットを提供する。例えば、キットは、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドのモジュレーターとして、本明細書で同定される化合物を含む組成物を含んでもよい。組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物であってもよい。キットを含む他の実施形態では、本発明は、本発明の組成物、および必要に応じて、その使用のための使用説明書を含むキットを企図する。キットの成分を、前述の方法の手動による、または部分的もしくは完全に自動化された実施のために包装することができる。そのようなキットは、例えば、イメージング、診断、治療、および他の適用を含む、様々な用途を有してもよい。
Ｇ．ポリペプチドの調製
本明細書に記載のポリペプチドを、好適なベクターを使用する組換え宿主系中での発現などの当業界で公知の日常的な方法によって調製することができる。好適な組換え宿主細胞としては、例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、細菌、および酵母細胞が挙げられる。好適な昆虫細胞の例としては、例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎ５細胞、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｓ２細胞、およびＨＩＧＨ ＦＩＶＥ細胞（親イラクサキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）のＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞系に由来するクローン単離物）が挙げられる。好適な哺乳動物細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎臓細胞（典型的には、断片化アデノウイルス５型ＤＮＡによって形質転換された、ＨＥＫ２９３またはＥｘｐｉ２９３細胞）、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、２９３－Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、およびＨｅＬａ細胞が挙げられる。好適な鳥類細胞としては、例えば、ニワトリ胚性幹細胞（例えば、ＥＢｘ．ＲＴＭ．細胞）、ニワトリ胚性線維芽細胞、ニワトリ胚性生殖細胞、ウズラ線維芽細胞（例えば、ＥＬＬ－Ｏ）、およびアヒル細胞が挙げられる。バキュロウイルスベクター系などの好適な昆虫細胞発現系は、当業者には公知である。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、キット形態で市販されている。鳥類細胞発現系も、当業者には公知である。同様に、細菌および哺乳動物細胞発現系も、当業界で公知である。
本明細書に記載のポリペプチドを、好適なベクターを使用する組換え宿主系中での発現などの当業界で公知の日常的な方法によって調製することができる。好適な組換え宿主細胞としては、例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、細菌、および酵母細胞が挙げられる。好適な昆虫細胞の例としては、例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎ５細胞、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｓ２細胞、およびＨＩＧＨ ＦＩＶＥ細胞（親イラクサキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）のＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞系に由来するクローン単離物）が挙げられる。好適な哺乳動物細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎臓細胞（典型的には、断片化アデノウイルス５型ＤＮＡによって形質転換された、ＨＥＫ２９３またはＥｘｐｉ２９３細胞）、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、２９３－Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、およびＨｅＬａ細胞が挙げられる。好適な鳥類細胞としては、例えば、ニワトリ胚性幹細胞（例えば、ＥＢｘ．ＲＴＭ．細胞）、ニワトリ胚性線維芽細胞、ニワトリ胚性生殖細胞、ウズラ線維芽細胞（例えば、ＥＬＬ－Ｏ）、およびアヒル細胞が挙げられる。バキュロウイルスベクター系などの好適な昆虫細胞発現系は、当業者には公知である。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、キット形態で市販されている。鳥類細胞発現系も、当業者には公知である。同様に、細菌および哺乳動物細胞発現系も、当業界で公知である。
昆虫または哺乳動物細胞中での組換えタンパク質の発現のためのいくつかの好適なベクターが、当業界で周知であり、慣用的である。好適なベクターは、限定されるものではないが、以下：複製起点；選択マーカー遺伝子；１つまたは複数の発現制御エレメント、例えば、転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）、および／または１つもしくは複数の翻訳シグナルなど；ならびに選択された宿主細胞における分泌経路に標的化するためのシグナル配列またはリーダー配列（例えば、哺乳動物起源の、または異種哺乳動物もしくは非哺乳動物種に由来する）のうちの１つまたは複数を含む、いくつかの成分を含有してもよい。例えば、昆虫細胞中での発現のために、ＰＦＡＳＴＢＡＣなどの好適なバキュロウイルス発現ベクターを使用して、組換えバキュロウイルス粒子を産生する。バキュロウイルス粒子を増幅させ、これを使用して、昆虫細胞に感染させて、組換えタンパク質を発現させる。哺乳動物細胞中での発現のために、所望の哺乳動物宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）中で構築物の発現を駆動するであろうベクターが使用される。
ポリペプチドを、任意の好適な方法を使用して精製することができる。例えば、免疫親和性クロマトグラフィーによってポリペプチドを精製するための方法が、当業界で公知である。沈降ならびに様々な型のクロマトグラフィー、例えば、疎水性相互作用、イオン交換、親和性、キレートおよびサイズ排除などを含む、所望のポリペプチドを精製するための好適な方法が当業界で公知である。好適な精製スキームを、これらのものの２つ以上または他の好適な方法を使用して作出することができる。必要に応じて、ポリペプチドは、エピトープタグまたはヒスチジンタグなどの、精製を容易にする「タグ」を含んでもよい。そのようなタグ付きポリペプチドを、例えば、キレートクロマトグラフィーまたは親和性クロマトグラフィーによって、条件培地から精製することができる。
１．ポリペプチドをコードする核酸
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸分子に関する。これらの核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡ配列を含む。核酸分子を、発現ベクターなどのベクター中に組み込むことができる。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸分子に関する。これらの核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡ配列を含む。核酸分子を、発現ベクターなどのベクター中に組み込むことができる。
一部の実施形態では、核酸は、自己複製性ＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、核酸は、改変ＲＮＡ分子を含む。別の態様では、本発明は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる核酸を含む組成物に関する。
２．化合物安定化ポリペプチド
本発明者らは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２１／２６０５１０に記載されたＨＣＭＶ ｇＢへのビス（アリール）チオウレア化合物の結合によって同定することができる融合前コンフォメーションで安定化されたポリペプチドを発見した。構造式１ａ、ｂ（式Ｉ）によって例示されるような、ビス（アリール）チオウレア化合物は、ＣＭＶの非常に強力かつ特異的な阻害剤である。一態様では、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドは、ビス（アリール）チオウレア化合物に結合することができる。好ましい実施形態では、化合物は、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの融合後コンフォメーションに結合しない。
本発明者らは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２１／２６０５１０に記載されたＨＣＭＶ ｇＢへのビス（アリール）チオウレア化合物の結合によって同定することができる融合前コンフォメーションで安定化されたポリペプチドを発見した。構造式１ａ、ｂ（式Ｉ）によって例示されるような、ビス（アリール）チオウレア化合物は、ＣＭＶの非常に強力かつ特異的な阻害剤である。一態様では、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドは、ビス（アリール）チオウレア化合物に結合することができる。好ましい実施形態では、化合物は、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの融合後コンフォメーションに結合しない。
好ましい実施形態では、化合物は、そのビス（アリール）チオウレアチオジオールアナログである。最も好ましくは、一部の実施形態では、化合物は、以下の構造：
別の実施形態では、化合物は、以下の構造：
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然ＨＣＭＶ ｇＢ融合後コンフォメーション中に存在しない、ＨＣＭＶ ｇＢ融合前エピトープを含む。
一部の実施形態では、均一な集団中の少なくとも約９０％のポリペプチド（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％のポリペプチドなど）に、ビス（アリール）チオウレア化合物（例えば、ビス（アリール）チオウレア化合物のチアゾールアナログなど、より好ましくは、Ｎ－｛４－［（｛（１Ｓ）－１－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］エチル｝カルバモチオイル）アミノ］フェニル｝－１，３－チアゾール－４－カルボキサミド）が結合している。
一部の実施形態では、ビス（アリール）チオウレア化合物に結合することができるポリペプチドは、融合後コンフォメーションを有しない。むしろ、ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＮ融合前コンフォメーションなどの、融合前コンフォメーションを有する。
別の実施形態では、ポリペプチドを、ビス（アリール）チオウレア化合物が特異的に結合していないＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドから少なくとも８０％単離する、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または好ましくは９９．９％単離することができる。
３．ポリペプチドを含む組成物およびその使用方法
本発明は、本明細書に記載のモジュレーターを使用する組成物および方法に関する。例えば、本発明のモジュレーターを、免疫原性組成物の成分として直接送達することができる。あるいは、モジュレーターがアミノ酸を含む場合、本発明のアミノ酸配列をコードする核酸を投与して、ｉｎ ｖｉｖｏでペプチド、ポリペプチドまたは免疫原性断片を生産することができる。ある特定の好ましい実施形態、例えば、ポリペプチドをコードする配列を含有する、タンパク質製剤、組換え核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、自己複製性ＲＮＡ、またはその任意の変形形態）およびウイルスベクター（例えば、生きた、１ラウンドの非複製アセンブリービリオン、またはそうでなければ、ウイルス様粒子、またはアルファウイルスＶＲＰ）が、本明細書にさらに記載され、組成物中に含有させることができる。
本発明は、本明細書に記載のモジュレーターを使用する組成物および方法に関する。例えば、本発明のモジュレーターを、免疫原性組成物の成分として直接送達することができる。あるいは、モジュレーターがアミノ酸を含む場合、本発明のアミノ酸配列をコードする核酸を投与して、ｉｎ ｖｉｖｏでペプチド、ポリペプチドまたは免疫原性断片を生産することができる。ある特定の好ましい実施形態、例えば、ポリペプチドをコードする配列を含有する、タンパク質製剤、組換え核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、自己複製性ＲＮＡ、またはその任意の変形形態）およびウイルスベクター（例えば、生きた、１ラウンドの非複製アセンブリービリオン、またはそうでなければ、ウイルス様粒子、またはアルファウイルスＶＲＰ）が、本明細書にさらに記載され、組成物中に含有させることができる。
一態様では、本発明は、本明細書に記載のモジュレーターを含む免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物は、ｇＯ、ｇＨ、ｇＬ、ｐＵＬ１２８、ｐＵＬ１３０、ｐｕＬ１３１、ｐｐ６５、その免疫原性断片、またはその組合せなどの、追加のＣＭＶタンパク質を含んでもよい。例えば、モジュレーターを、ｇＨまたはその五量体形成断片、ｇＬまたはその五量体形成断片、ｐＵＬ１２８またはその五量体形成断片、ｐＵＬ１３０またはその五量体形成断片、およびｐＵＬ１３１またはその五量体形成断片を含むＣＭＶ五量体複合体と組み合わせることができる。本発明のモジュレーターを、ｇＨまたはその三量体形成断片、ｇＬまたはその三量体形成断片、およびｇＯまたはその三量体形成断片を含むＣＭＶ三量体複合体と組み合わせることもできる。
別の態様では、本発明は、哺乳動物における免疫応答を惹起することができるポリヌクレオチドを含む組成物に関する。ポリヌクレオチドは、目的の少なくとも１つのポリペプチド、例えば、抗原をコードする。本明細書に開示される抗原は、野生型であってもよい（すなわち、感染性因子に由来する）か、または好ましくは、改変されていてもよい（例えば、遺伝子操作された、設計された、もしくは人工）。本明細書に記載の核酸分子、具体的には、ポリヌクレオチドは、一部の実施形態では、１つまたは複数の目的のペプチドまたはポリペプチドをコードする。そのようなペプチドまたはポリペプチドは、抗原または抗原性分子として働くことができる。用語「核酸」は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物を含む。これらのポリマーは、「ポリヌクレオチド」と称される。例示的な本発明の核酸またはポリヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、ｍＲＮＡを含むリボ核酸（ＲＮＡ）、およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が挙げられる。
一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載のポリペプチドまたはその断片をコードするＤＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載のポリペプチドまたはその断片をコードするＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載のポリペプチドまたはその断片をコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。そのような組成物は、翻訳時に適切なタンパク質コンフォメーションをもたらしてもよい。
一態様では、本発明は、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１個のアミノ酸突然変異を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物に関する。
一態様では、本発明は、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１個のアミノ酸突然変異を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つのＤＮＡポリヌクレオチドを含む組成物に関する。
一態様では、本発明は、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１個のアミノ酸突然変異を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物に関する。
一部の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのｈＣＭＶ ｇＢポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物に関する。
一部の実施形態では、組成物は、２つ以上の抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、２つ以上の抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含む。１つまたは複数の抗原性ポリペプチドを、単一のポリヌクレオチド上にコードさせるか、または複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチド上に個別にコードさせることができる。
別の態様では、本発明は、（ａ）野生型ＨＣＭＶ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）のアミノ酸配列と比較して少なくとも１個の導入されたアミノ酸突然変異を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｂ）追加のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物に関する。
別の態様では、本発明は、（ａ）野生型ＨＣＭＶ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）のアミノ酸配列と比較して少なくとも１個の導入されたアミノ酸突然変異を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｂ）追加のポリペプチド、好ましくは、ＨＣＭＶ抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物に関する。追加のポリペプチドを、ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＮ、およびｇＭならびにその免疫原性断片もしくはエピトープから選択することができる。一部の実施形態では、追加のポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｐｐ６５である。一部の実施形態では、追加のポリペプチドを、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａ、ならびにその断片から選択することができる。一部の実施形態では、追加のポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＨポリペプチドである。一部の実施形態では、追加のポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＬポリペプチドである。一部の実施形態では、追加のポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドである。一部の実施形態では、追加のポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＯポリペプチドである。一部の実施形態では、追加のポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＮポリペプチドである。一部の実施形態では、追加のポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＭポリペプチドである。一部の実施形態では、追加のポリペプチドは、バリアントｇＨポリペプチド、バリアントｇＬポリペプチド、またはバリアントｇＢポリペプチドである。一部の実施形態では、バリアントＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、またはｇＢポリペプチドは、以下のドメイン配列：（１）疎水性膜近位ドメイン、（２）膜貫通ドメイン、および（３）細胞質ドメインのうちの１つまたは複数を欠くトランケートされたポリペプチドである。一部の実施形態では、トランケートされたＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、またはｇＢポリペプチドは、疎水性膜近位ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを欠く。一部の実施形態では、トランケートされたＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、またはｇＢポリペプチドは、細胞外ドメイン配列のみを含む。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａから選択されるＨＣＭＶタンパク質またはその免疫原性断片もしくはエピトープである。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ＵＬ８３ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ＵＬ１２３ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ＵＬ１２８ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ＵＬ１３０ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ＵＬ１３１ポリペプチドである。
別の態様では、本発明は、（ａ）野生型ＨＣＭＶ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）のアミノ酸配列と比較して少なくとも１個の導入されたアミノ酸突然変異を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｂ）アミノ酸配列配列番号２１１～２２３のいずれか１つを有する追加のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、（ａ）野生型ＨＣＭＶ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）のアミノ酸配列と比較して少なくとも１個の導入されたアミノ酸突然変異を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｂ）配列番号１４１～２１０から選択される配列のいずれか１つを有するポリヌクレオチドを含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、（ａ）野生型ＨＣＭＶ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）のアミノ酸配列と比較して少なくとも１個の導入されたアミノ酸突然変異を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｂ）配列番号２１１～２２３から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを有する追加のポリペプチドを含む組成物に関する。一部の実施形態では、追加のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２２４～２５４のいずれかから選択される少なくとも１つの核酸配列を含む。一部の実施形態では、追加のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４１～１４７のいずれかから選択される少なくとも１つの核酸配列を含む。一部の実施形態では、追加のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２２０～２２３のいずれかから選択される少なくとも１つの配列を有する。
一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、２つ以上のＨＣＭＶタンパク質、その断片、またはエピトープを含む。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、２つ以上の糖タンパク質、その断片、またはエピトープを含む。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、少なくとも１つのＨＣＭＶポリペプチド、その断片またはエピトープおよび少なくとも１つの他のＨＣＭＶタンパク質、その断片またはエピトープを含む。一部の実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、単一のＲＮＡポリヌクレオチドによってコードされる。一部の実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、２つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドによってコードされ、例えば、それぞれのＨＣＭＶポリペプチドは、別々のＲＮＡポリヌクレオチドによってコードされる。一部の実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＮ、およびｇＭポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープの任意の組合せであってもよい。一部の実施形態では、２つ以上の糖タンパク質は、ｐｐ６５またはその免疫原性断片もしくはエピトープ；ならびにＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＮ、およびｇＭポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、２つ以上の糖タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＢと、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＮ、およびｇＭポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択される１つまたは複数のＨＣＭＶポリペプチドとの任意の組合せであってもよい。一部の実施形態では、２つ以上の糖タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＨと、ｇＬ、ｇＯ、ｇＮ、およびｇＭポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択される１つまたは複数のＨＣＭＶポリペプチドとの任意の組合せであってもよい。一部の実施形態では、２つ以上の糖タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＬと、ｇＢ、ｇＨ、ｇＯ、ｇＮ、およびｇＭポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択される１つまたは複数のＨＣＭＶポリペプチドとの任意の組合せであってもよい。一部の実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ｇＢおよびｇＨである。一部の実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ｇＢおよびｇＬである。一部の実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ｇＨおよびｇＬである。一部の実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ｇＢ、ｇＬ、およびｇＨである。一部の実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶタンパク質は、ＨＣＭＶ ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープの任意の組合せであってもよい。一部の実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ＵＬ１２３およびＵＬ１３０である。一部の実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ＵＬ１２３および１３１Ａである。一部の実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ＵＬ１３０および１３１Ａである。一部の実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０および１３１Ａである。一部の実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶタンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープの任意の組合せであってもよい。一部の実施形態では、２つ以上の糖タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＨと、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択される１つまたは複数のＨＣＭＶポリペプチドとの任意の組合せであってもよい。一部の実施形態では、２つ以上の糖タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＬと、ｇＨ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択される１つまたは複数のＨＣＭＶポリペプチドとの任意の組合せであってもよい。一部の実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ｇＬ、ｇＨ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０および１３１Ａである。組成物が２つ以上のＨＣＭＶタンパク質を含むこれらの実施形態のいずれかでは、ＨＣＭＶ ｇＨは、本明細書に開示されるバリアントＨＣＭＶ ｇＨ糖タンパク質のいずれかなどのバリアントｇＨ、例えば、本明細書に開示されるバリアントＨＣＭＶ ｇＨのいずれかであってもよい。組成物が２つ以上のＨＣＭＶタンパク質を含むこれらの実施形態のいずれかでは、ＨＣＭＶ ｇＢは、本明細書に開示されるバリアントＨＣＭＶ ｇＢ糖タンパク質のいずれかなどのバリアントｇＢ、例えば、本明細書に開示されるバリアントＨＣＭＶ ｇＢのいずれかであってもよい。組成物が２つ以上のＨＣＭＶ ｇＬタンパク質を含むこれらの実施形態のいずれかでは、ＨＣＭＶ ｇＬは、本明細書に開示されるバリアントＨＣＭＶ ｇＬ糖タンパク質のいずれかなどのバリアントｇＬ、例えば、本明細書に開示されるバリアントＨＣＭＶ ｇＬのいずれかであってもよい。
組成物が２つ以上のＨＣＭＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープ（単一のＲＮＡポリヌクレオチドによってコードされるか、または２つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドによってコードされる、例えば、それぞれのタンパク質が別々のＲＮＡポリヌクレオチドによってコードされる）をコードする２つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含むある特定の実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶタンパク質は、バリアントｇＢ、例えば、本明細書に開示されるバリアントｇＢポリペプチドのいずれか、およびｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択されるＨＣＭＶタンパク質である。一部の実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶタンパク質は、バリアントｇＨ、例えば、本明細書に開示されるバリアントｇＨポリペプチドのいずれか、およびｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択されるＨＣＭＶタンパク質である。一部の実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶタンパク質は、バリアントｇＨ、例えば、本明細書に開示されるバリアントｇＨポリペプチドのいずれか、およびｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択されるＨＣＭＶタンパク質である。バリアントＨＣＭＶタンパク質がバリアントＨＣＭＶ ｇＢ、バリアントＨＣＭＶ ｇＬ、およびバリアントＨＣＭＶ ｇＨである一部の実施形態では、バリアントＨＣＭＶポリペプチドは、以下のトランケートされたポリペプチド；疎水性膜近位ドメインを欠く；膜貫通ドメインを欠く；細胞質ドメインを欠く；疎水性膜近位ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインのうちの２つ以上を欠く；ならびに細胞外ドメインのみを含む、から選択されるトランケートされたポリペプチドである。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードする多量体ＲＮＡポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードする少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドであって、ＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲがパターン化されたＵＴＲを含む、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、パターン化されたＵＴＲは、ＡＢＡＢＡＢまたはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたは１回、２回、もしくは３回より多く反復したそのバリアントなどの、反復または交互パターンを有する。これらのパターンでは、それぞれの文字、Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＵＴＲを表す。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、第１の核酸）の５’ＵＴＲは、別のＲＮＡポリヌクレオチド（第２の核酸）のＵＴＲと相補的な領域を有する。例えば、連結しようとする２つのポリヌクレオチドのＵＴＲヌクレオチド配列（例えば、多量体分子中の）を、２つのＵＴＲがハイブリダイズして、多量体分子を形成するような相補的な領域を含むように改変することができる。一部の実施形態では、ＨＣＭＶ抗原性ポリペプチドをコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、多量体配列の形成を可能にするように改変される。一部の実施形態では、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１から選択されるＨＣＭＶタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、多量体配列の形成を可能にするように改変される。一部の実施形態では、ＨＣＭＶポリペプチドをコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、多量体配列の形成を可能にするように改変される。一部の実施形態では、ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＭ、およびｇＮから選択されるＨＣＭＶポリペプチドをコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、多量体配列の形成を可能にするように改変される。これらの実施形態のいずれかでは、多量体は、二量体、三量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体であってもよい。かくして、一部の実施形態では、ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１から選択されるＨＣＭＶタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、二量体の形成を可能にするように改変される。一部の実施形態では、ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａから選択されるＨＣＭＶタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、三量体の形成を可能にするように改変される。一部の実施形態では、ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１から選択されるＨＣＭＶタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、五量体の形成を可能にするように改変される。一部の実施形態では、組成物は、２つ以上（例えば、２、３、４、５つ以上）のＨＣＭＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードする単一のオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、２、３、４、５つ以上のＨＣＭＶ抗原性ポリペプチドをコードする、１つより多いオープンリーディングフレーム、例えば、２、３、４、５つ以上のオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ｇＨ、ｇＢ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、およびその断片またはエピトープから選択される２つ以上のＨＣＭＶ抗原性ポリペプチドをコードしてもよい。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ＵＬ８３およびＵＬ１２３をコードする。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ｇＨおよびｇＬをコードする。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする。少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドが、２つ以上（例えば、２、３、４、５つ以上）のＨＣＭＶ抗原性ポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフレームを有する一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、追加の配列、例えば、リンカー配列またはＨＣＭＶ ＲＮＡ転写物もしくはポリペプチドのプロセシングを補助する配列、例えば、切断部位配列をさらに含む。一部の実施形態では、追加の配列は、フューリン配列などのプロテアーゼ配列であってもよい。一部の実施形態では、追加の配列は、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、およびＴ２Ａ配列などの自己切断性２Ａペプチドであってもよい。一部の実施形態では、リンカー配列および切断部位配列は、ＨＣＭＶポリペプチドをコードする配列間に散在している。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、本明細書に開示される核酸配列のいずれか１つから選択される任意の核酸配列、または本明細書に開示される核酸配列との少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）の同一性を有するそのホモログを含む。一部の実施形態では、オープンリーディングフレームは、コードされ、コドン最適化される。一部の実施形態は、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドおよび少なくとも１つの５’末端キャップを含む組成物を含む。一部の実施形態では、５’末端キャップは、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐである。
一部の実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、配列番号１４１～２１０のいずれか１つから選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、配列番号２１１～２２３のアミノ酸配列のいずれか１つに対する少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一部の好ましい実施形態では、組成物は、配列番号２１６のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない。一部の好ましい実施形態では、組成物は、配列番号２１６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含まない。一部の好ましい実施形態では、組成物は、配列番号１５２の配列を有するポリヌクレオチドを含まない。
一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学的改変を有する。一部の実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、第２の化学的改変をさらに含む。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ＲＡＮである。一部の実施形態では、少なくとも１つの化学的改変を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドは、５’末端キャップを有する。一部の実施形態では、少なくとも１つの化学的改変は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、Ｎ１－エチルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メトキシウリジンおよび２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、ここで、オープンリーディングフレーム中のウラシルの少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％）が、化学的改変を有し、必要に応じて、組成物は、脂質ナノ粒子中で製剤化される。一部の実施形態では、オープンリーディングフレーム中のウラシルの１００％が、化学的改変を有する。一部の実施形態では、化学的改変は、ウラシルの５位にある。一部の実施形態では、化学的改変は、Ｎ１－メチルプソイドウリジンである。
一部の実施形態では、追加のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ組成物中の）によってコードされる免疫原性断片は、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｐｐ６５およびＩＥ１抗原から選択される。
一部の実施形態では、第１の組成物および第２の組成物は、哺乳動物に投与される。一部の実施形態では、第１の組成物は、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して少なくとも１個の導入されたアミノ酸突然変異を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む；および第２の組成物は、ＨＣＭＶ ｐｐ６５またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第１の組成物は、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのアミノ酸配列と比較して少なくとも１個の導入されたアミノ酸突然変異を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む；および第２の組成物は、ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１、またはその抗原性断片もしくはエピトープから選択される追加のポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
別の態様では、本発明は、哺乳動物における免疫応答を誘導する方法であって、哺乳動物に、免疫応答を誘導するための有効量の組成物を投与することを含み、組成物が、野生型ＨＣＭＶ ｇＢのモジュレーターをコードするポリヌクレオチドを含む、方法に関する。
一部の実施形態では、免疫応答は、Ｔ細胞応答またはＢ細胞応答を含む。一部の実施形態では、免疫応答は、Ｔ細胞応答およびＢ細胞応答を含む。一部の実施形態では、方法は、組成物の単回投与を含む。一部の実施形態では、方法は、対象に、ブースター用量の組成物を投与することをさらに含む。本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含む組成物を、哺乳動物における抗原特異的免疫応答を生じさせるための有効量で製剤化することができる。
免疫原性組成物は、アジュバントを含んでもよい。組成物の有効性を増強するための例示的なアジュバントとしては、（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；（２）水中油エマルジョン製剤（ムラミルペプチド（以下を参照）または細菌細胞壁成分などの他の特定のアジュバントを含む、または含まない）、例えば、（ａ）マイクロフルイダイザーを使用してマイクロメートル未満の粒子に製剤化された、５％スクアレン、０．５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５を含有するＭＦ５９（ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１４８３７号）、（ｂ）マイクロメートル未満のエマルジョンにマイクロ流体化された、またはより大きい粒径のエマルジョンを生成するためにボルテックスされた、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、５％プルロニック（登録商標）ロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ－ＭＤＰを含有するＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標）からなる群から選択される１つまたは複数の細菌細胞壁成分を含有する、ＲＩＢＩ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）；（３）使用することができるサポニンアジュバント、例えば、ＱＳ－２１、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．）など、またはそれから生成される粒子、例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）、ＡＬＦＱなど；（４）完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）および不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ－１、ＩＬ－２など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；ならびに（６）組成物の有効性を増強するためのアジュバントとして作用する他の物質が挙げられる。好ましい実施形態では、アジュバントは、すなわち、ＱＳ－２１を含むサポニンアジュバントである。一部の実施形態では、組成物は、アジュバントを含まない。一部の実施形態では、組成物は、脂質ナノ粒子をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ナノ粒子中で製剤化される。一部の実施形態では、組成物は、プロタミンまたは他のカチオン性ペプチドもしくはタンパク質、例えば、ポリ－Ｌ－リシン（ＰＬＬ）を含む、カチオン性またはポリカチオン性化合物をさらに含む。
本明細書で考察される免疫原性組成物はそれぞれ、単独で、または１つもしくは他の抗原と組み合わせて使用することができ、後者は同じウイルス病原体に由来するか、または別の病原性起源もしくは複数の起源に由来する。これらの組成物を、予防（感染を防止するため）または治療（感染後の疾患を処置するため）目的で使用することができる。
一実施形態では、組成物は、組成物を受ける個体に対して有害な抗体の産生をそれ自身は誘導しない任意の担体を含む「薬学的に許容される担体」を含んでもよい。好適な担体は、典型的には、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（油滴またはリポソームなど）、および不活性ウイルス粒子などの大きく、ゆっくりと代謝される高分子である。そのような担体は、当業者には周知である。さらに、これらの担体は、アジュバントとして機能し得る。さらに、抗原を、細菌トキソイド、例えば、ジフテリア、破傷風、コレラ、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）などの病原体に由来するトキソイドにコンジュゲートすることができる。
一実施形態では、組成物は、水、食塩水、グリセロール、エタノールなどの希釈剤を含む。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質がそのようなビヒクル中に存在してもよい。
本明細書に記載される組成物は、必要に応じて、免疫学的有効量のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、ならびに任意の他の上記の成分を含んでもよい。「免疫学的有効量」とは、単回用量での、または一連の用量の一部としての、個体へのその量の投与が、免疫応答の惹起にとって有効であることを意味する。惹起される免疫応答は、例えば、病気、感染または疾患の処置および／または防止および／または発生の低減にとって十分なものであってよい。この量は、処置しようとする個体の健康および身体状態、処置しようとする個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、望ましい防御の程度、ワクチンの製剤、医学的状況の処置する医師による評価、ならびに他の関連する因子に応じて変化する。量は、日常的な試験によって決定することができる比較的広範囲に入ると予想される。
組成物を、非経口的に、例えば、注射により、皮下的または筋肉内的に投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、皮内または筋肉内注射によって哺乳動物に投与される。他の投与様式にとって好適なさらなる製剤としては、経口および経肺製剤、経鼻製剤、坐剤、および経皮適用が挙げられる。経口製剤は、ある特定のウイルスタンパク質にとって好ましいことがある。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであってもよい。免疫原性組成物を、他の免疫調節剤と共に投与することができる。
別の態様では、本発明は、サイトメガロウイルスに対する免疫応答を惹起する方法であって、それを必要とする対象に、上記のタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子（例えば、自己複製性ＲＮＡ分子）、またはＶＲＰを含む、免疫学的有効量の本明細書に記載のポリペプチドおよび／または免疫原性組成物を投与することを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、免疫応答は、ＣＭＶに対する中和抗体の産生を含む。
免疫応答は、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、またはその両方を含んでもよい。一部の実施形態では、免疫応答は、それぞれの送達されたＣＭＶタンパク質に対して誘導される。細胞性免疫応答は、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）応答、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答、またはその両方を含んでもよい。一部の実施形態では、免疫応答は体液性免疫応答を含み、抗体は中和抗体である。
中和抗体は、細胞のウイルス感染を遮断する。ＣＭＶは上皮細胞に感染し、また、線維芽細胞にも感染する。一部の実施形態では、免疫応答は、両方の細胞型の感染を低減させるか、または防止する。中和抗体応答は、補体依存性または補体非依存性であってもよい。一部の実施形態では、中和抗体応答は、補体非依存性である。一部の実施形態では、中和抗体応答は、交差中和性である；すなわち、投与される組成物に対して生成される抗体は、組成物中で使用される株以外の株のＣＭＶウイルスを中和する。
本明細書に記載のポリペプチドおよび／または免疫原性組成物はまた、非感染哺乳動物のＣＭＶ感染の可能性を低減させるため、または感染哺乳動物における症状を低減させるため、例えば、大流行の回数、ＣＭＶ排出、およびウイルスを他の哺乳動物に拡散させるリスクを低減させるための有効な免疫応答を惹起することもできる。
一態様では、本発明は、哺乳動物におけるＣＭＶのウイルス排出を低減させるための方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、哺乳動物における尿中へのＣＭＶのウイルス排出を低減させるための方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、哺乳動物における唾液中へのＣＭＶのウイルス排出を低減させるための方法に関する。別の態様では、本発明は、哺乳動物におけるＣＭＶのウイルス力価を低減させるための方法に関する。一態様では、本発明は、哺乳動物における血清中のＣＭＶ核酸を低減させるための方法に関する。用語「ウイルス排出」は、医学およびウイルス学におけるその明白な通常の意味に従って本明細書で使用され、感染細胞からのウイルスの産生および放出を指す。一部の実施形態では、ウイルスは、哺乳動物の細胞から放出される。一部の実施形態では、ウイルスは、感染哺乳動物から環境中へ放出される。一部の実施形態では、ウイルスは、哺乳動物内の細胞から放出される。
一態様では、本発明は、哺乳動物におけるＣＭＶのウイルス排出を低減させるための方法に関する。方法は、本明細書に記載の改変されたＣＭＶ ｇＢポリペプチドおよび／または免疫原性組成物を、ＣＭＶに感染している、または感染するリスクがある哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、哺乳動物におけるＣＭＶウイルス排出の低減は、改変されたＣＭＶ ｇＢを投与されなかった哺乳動物におけるウイルス排出と比較した場合のものである。別の実施形態では、哺乳動物におけるＣＭＶウイルス排出の低減は、ＣＭＶ五量体のみの投与後またはポリペプチドの非存在下でのＣＭＶ五量体の投与後のウイルス排出と比較した場合のものである。
一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。一部の実施形態では、ヒトは、小児、例えば、幼児である。一部の他の実施形態では、ヒトは、思春期の女性、妊娠可能年齢の女性、妊娠を計画している女性、妊娠女性、および最近出産した女性を含む女性である。一部の実施形態では、ヒトは、移植患者である。
一実施形態では、チャレンジサイトメガロウイルス株は、ヒトＣＭＶ株である。一実施形態では、チャレンジサイトメガロウイルス株は、ポリペプチドが由来するＣＭＶ株と同種である。別の実施形態では、チャレンジサイトメガロウイルス株は、ＣＭＶ株ＶＲ１８１４と同種である。別の実施形態では、チャレンジサイトメガロウイルス株は、ＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅと同種である。
一実施形態では、チャレンジサイトメガロウイルス株は、改変されたＣＭＶ ｇＢポリペプチドが由来するＣＭＶ株と異種であるヒトＣＭＶ株である。別の実施形態では、チャレンジサイトメガロウイルス株は、ＶＲ１８１４ ＣＭＶ株と異種であるヒトＣＭＶ株である。別の実施形態では、チャレンジサイトメガロウイルス株は、ＶＲ１８１４ ＣＭＶ株である。別の実施形態では、チャレンジサイトメガロウイルス株は、ＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅと異種であるヒトＣＭＶ株である。別の実施形態では、チャレンジサイトメガロウイルス株は、ＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅである。
別の実施形態では、チャレンジサイトメガロウイルス株は、マカク属ヘルペスウイルス３単離物２１２５２ ＣＭＶ株と同種であるアカゲザルＣＭＶ株である。別の実施形態では、チャレンジサイトメガロウイルス株は、マカク属ヘルペスウイルス３単離物２１２５２ ＣＭＶ株である。
当業界における抗体効力の有用な尺度は、「５０％中和力価」である。抗体効力の別の有用な尺度は、以下のもの：「６０％中和力価」；「７０％中和力価」；「８０％中和力価」；および「９０％中和力価」のうちのいずれか１つである。例えば、５０％中和力価を決定するためには、免疫した動物に由来する血清を希釈して、どれぐらい薄い血清が感染性ウイルスの５０％の細胞中への進入を遮断する能力を保持するかを評価する。例えば、７００の力価は、血清が、７００倍希釈した後に感染性ウイルスの５０％を中和する能力を保持していたことを意味する。かくして、より高い力価は、より強力な中和抗体応答を示す。一部の実施形態では、この力価は、約２００、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、約５０００、約５５００、約６０００、約６５００、または約７０００の下限を有する範囲にある。５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の中和力価範囲は、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、約５０００、約５５００、約６０００、約６５００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約１１０００、約１２０００、約１３０００、約１４０００、約１５０００、約１６０００、約１７０００、約１８０００、約１９０００、約２００００、約２１０００、約２２０００、約２３０００、約２４０００、約２５０００、約２６０００、約２７０００、約２８０００、約２９０００、または約３００００の上限を有してもよい。例えば、５０％中和力価は、約３０００～約６５００であってもよい。「約」は、記載される値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。中和力価を、以下の特定例に記載されるように測定することができる。
タンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子（例えば、自己複製性ＲＮＡ分子もしくはヌクレオシド改変ＲＮＡ分子）、またはＶＲＰを個体、典型的には、ヒトを含む哺乳動物に投与することによって、免疫応答を刺激することができる。一部の実施形態では、誘導される免疫応答は、防御免疫応答である、すなわち、応答は、ＣＭＶ感染のリスクもしくは重症度または臨床的帰結を低減させる。防御免疫応答の刺激は、特に、ＣＭＶ感染および疾患のリスクがある一部の集団において特に望ましい。例えば、リスクがある集団は、固形臓器移植（ＳＯＴ）患者、骨髄移植患者、および造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）患者を含む。ＶＲＰを、移植前に移植ドナーに、または移植前および／もしくは移植後に移植レシピエントに投与することができる。母から子への垂直感染は幼児の一般的な感染源であるため、妊娠している女性または妊娠し得る女性へのＶＲＰの投与は特に有用である。
任意の好適な投与経路を使用することができる。例えば、組成物を、筋肉内、腹腔内、皮下、または経皮投与することができる。一部の実施形態は、口腔内、鼻内、膣内、および直腸内などの粘膜内経路によって投与されるであろう。組成物を、任意の好適なスケジュールに従って投与することができる。
また、細胞中へのサイトメガロウイルスの進入を阻害する方法であって、細胞と、本明細書に記載の組成物とを接触させることを含む方法も本明細書に提供される。
一態様では、本発明は、上記のモジュレーターを含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、そのようなモジュレーターをコードする核酸分子またはベクターを含む組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、上記のモジュレーターおよびそのようなモジュレーターをコードする核酸分子またはベクターを含む組成物に関する。
一部の実施形態では、組成物は、対象におけるＣＭＶに対する免疫応答を惹起することができる免疫原性組成物である。一部の特定の実施形態では、免疫原性組成物は、本開示によって提供されるモジュレーターと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、ワクチンである。
一部の実施形態では、免疫原性組成物またはワクチンなどの組成物は、上記の２つ以上の異なるモジュレーターを含む。２つ以上の異なるモジュレーターは、同じ導入されたアミノ酸突然変異を含んでもよいが、異なるＨＣＭＶ株またはサブタイプに由来するｇＢに由来してもよい。別の実施形態では、２つ以上の異なるモジュレーターは、互いに異なる天然ＨＣＭＶ ｇＢと比較して、アミノ酸突然変異を含んでもよい。
好ましい実施形態では、モジュレーターは、水性溶液中で可溶性である。一部の実施形態では、モジュレーターは、界面活性剤を欠く溶液中で可溶性である。
４．抗体および診断的使用
上記のモジュレーターを使用して、ポリクローナルとモノクローナルとの両方である抗体を産生することができる。ポリクローナル抗体が望ましい場合、選択される哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ウマなど）は、免疫原性モジュレーターで免疫される。免疫した動物に由来する血清を、公知の手順に従って収集し、処理する。ＣＭＶエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有する場合、ポリクローナル抗体を、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。ポリクローナル抗血清を産生し、プロセシングするための技術は、当業界で公知である。
上記のモジュレーターを使用して、ポリクローナルとモノクローナルとの両方である抗体を産生することができる。ポリクローナル抗体が望ましい場合、選択される哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ウマなど）は、免疫原性モジュレーターで免疫される。免疫した動物に由来する血清を、公知の手順に従って収集し、処理する。ＣＭＶエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有する場合、ポリクローナル抗体を、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。ポリクローナル抗血清を産生し、プロセシングするための技術は、当業界で公知である。
当業者であれば、ＣＭＶエピトープに対するモノクローナル抗体を容易に生産することもできる。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法が公知である。不死抗体産生細胞系を、細胞融合によって、また、Ｂリンパ球の発がん性ＤＮＡによる直接形質転換、またはエプスタイン・バーウイルスによるトランスフェクションなどの他の技術によって作出することができる。ＣＭＶエピトープに対して産生されるモノクローナル抗体のパネルを、種々の特性、すなわち、アイソタイプ、エピトープ親和性などについてスクリーニングすることができる。
ＣＭＶエピトープに対する、モノクローナルとポリクローナルとの両方の抗体は、診断において特に有用であり、中和性であるものは受動免疫療法において有用である。特に、モノクローナル抗体を使用して、抗イディオタイプ抗体を生じさせることができる。
ＣＭＶ抗体を含有する血清と免疫学的に反応するモジュレーターと、これらのモジュレーターに対して生じた抗体との両方が、例えば、血液または血清試料を含む生体試料中の、ＣＭＶ抗体の存在、またはウイルスの存在を検出するためのイムノアッセイにおいて有用であり得る。イムノアッセイの設計は、多数の変形形態の対象であり、様々なこれらのものが当業界で公知である。例えば、イムノアッセイは、配列番号２～４３のいずれか１つに記載の配列を有するポリペプチドを利用してもよい。
あるいは、イムノアッセイは、本明細書に記載のポリペプチドに由来するウイルス抗原の組合せを使用してもよい。それは、例えば、本明細書に記載の少なくとも１つのポリペプチドに対するモノクローナル抗体、本明細書に記載のポリペプチドに対するモノクローナル抗体の組合せ、異なるウイルス抗原に対するモノクローナル抗体、本明細書に記載のポリペプチドに対するポリクローナル抗体、または異なるウイルス抗原に対するポリクローナル抗体を使用してもよい。プロトコールは、例えば、競合、もしくは直接反応に基づくものであってよいか、またはサンドイッチ型アッセイであってもよい。プロトコールはまた、例えば、固相支持体を使用してもよいか、または免疫沈降によるものであってもよい。多くのアッセイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含む；標識は、例えば、蛍光、化学発光、放射性、または色素分子であってもよい。プローブからのシグナルを増幅するアッセイも公知である；その例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、ならびに酵素標識および酵素媒介性イムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイである。
免疫診断にとって好適であり、適切な標識試薬を含有するキットは、好適な容器中に、ＣＭＶエピトープを含有する本発明のポリペプチドまたはエピトープに対する抗体を含む適切な材料を、アッセイの実行にとって必要とされる残りの試薬および材料、ならびにアッセイの使用説明書の好適なセットと共に包装することによって構築される。
ポリヌクレオチドプローブを、診断キット中に包装することもできる。診断キットは、標識されていてもよいプローブＤＮＡを含む；あるいは、プローブＤＮＡは標識されていなくてもよく、標識化のための成分をキット中に含有させることができる。キットはまた、特定のハイブリダイゼーションプロトコールにとって必要とされる他の好適に包装された試薬および材料、例えば、標準物、ならびに試験を行うための使用説明書を含有してもよい。
本開示の一部の実施形態は、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームおよび少なくとも１つの５’末端キャップを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶワクチンを提供する。一部の実施形態では、５’末端キャップは、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐである。
本開示の一部の実施形態は、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの化学的改変を有する、少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶワクチンを提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、第２の化学的改変をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの化学的改変を有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、５’末端キャップを有する。一部の実施形態では、少なくとも１つの化学的改変は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、Ｎ１－エチルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メトキシウリジンおよび２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される。
一部の実施形態では、化学的改変は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、Ｎ１－エチルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メトキシウリジン、および２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される。
本開示の一部の実施形態は、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶワクチンであって、オープンリーディングフレーム中のウラシルの少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％）が化学的改変を有し、必要に応じて、ワクチンが脂質ナノ粒子中で製剤化される、ＨＣＭＶワクチンを提供する。一部の実施形態では、オープンリーディングフレーム中のウラシルの１００％が、化学的改変を有する。一部の実施形態では、化学的改変は、ウラシルの５位にある。一部の実施形態では、化学的改変は、Ｎ１－メチルプソイドウリジンである。
本開示の一部の実施形態は、本明細書では、互換的に使用される、イオン化可能カチオン性脂質ナノ粒子、イオン化可能脂質ナノ粒子および脂質ナノ粒子とも称される、カチオン性脂質ナノ粒子内で製剤化されるＨＣＭＶワクチンを提供する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ改変脂質、ステロールおよび非カチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、カチオン性脂質はイオン化可能カチオン性脂質であり、非カチオン性脂質は中性脂質であり、ステロールはコレステロールである。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノ酪酸（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、およびジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）からなる群から選択される。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約２０～６０％のカチオン性脂質、約５～２５％の非カチオン性脂質、約２５～５５％のステロール、および約０．５～１５％のＰＥＧ改変脂質のモル比を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、０．４未満の多様度（ｐｏｌｙｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）値を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、中性ｐＨで正味の中性電荷を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、５０～２００ｎｍの平均直径を有する。
一部の実施形態では、オープンリーディングフレーム中のウラシルの８０％が、化学的改変を有する。一部の実施形態では、オープンリーディングフレーム中のウラシルの１００％が、化学的改変を有する。一部の実施形態では、化学的改変は、ウラシルの５位にある。一部の実施形態では、化学的改変は、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、Ｎ１－エチルプソイドウリジンである。一部の実施形態では、ワクチンは、脂質ナノ粒子内で製剤化される。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ改変脂質、ステロールおよび非カチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、カチオン性脂質はイオン化可能カチオン性脂質であり、非カチオン性脂質は中性脂質であり、ステロールはコレステロールである。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノ酪酸（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、およびジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）からなる群から選択される。
本開示の一部の実施形態は、対象における抗原特異的免疫応答を誘導する方法であって、対象に、抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量のＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンを投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、抗原特異的免疫応答は、Ｔ細胞応答またはＢ細胞応答を含む。一部の実施形態では、抗原特異的免疫応答は、Ｔ細胞応答およびＢ細胞応答を含む。一部の実施形態では、抗原特異的免疫応答を生じさせる方法は、ワクチンの単回投与を含む。一部の実施形態では、方法は、対象に、ブースター用量のワクチンを投与することをさらに含む。一部の実施形態では、ワクチンは、皮内または筋肉内注射によって対象に投与される。
また、対象における抗原特異的免疫応答を誘導する方法であって、抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量のワクチンを対象に投与することを含む方法における使用のためのＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンも、本明細書に提供される。
さらに、対象における抗原特異的免疫応答を誘導する方法であって、抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量のワクチンを対象に投与することを含む方法における使用のための医薬の製造におけるＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンの使用が、本明細書に提供される。
さらに、対象に、本開示のワクチンを投与することを含む、ＨＣＭＶ感染を防止または処置する方法が、本明細書に提供される。本明細書に開示されるＨＣＭＶワクチンを、対象における抗原特異的免疫応答を生じさせるための有効量で製剤化することができる。
用語「ポリペプチドバリアント」とは、天然または参照配列とそのアミノ酸配列において異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、欠失、および／または挿入を有してもよい。通常、バリアントは、天然または参照配列に対する少なくとも５０％の同一性を有する。一部の実施形態では、バリアントは、天然または参照配列との少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する。
一部の実施形態では、「バリアント模倣体」が提供される。本明細書で使用される場合、用語「バリアント模倣体」は、活性化された配列を模倣する少なくとも１個のアミノ酸を含有するものである。例えば、グルタミン酸は、ホスホロ－トレオニンおよび／またはホスホロ－セリンの模倣体として働くことができる。あるいは、バリアント模倣体は、失活をもたらす、または模倣体を含有する不活化生成物をもたらすことができ、例えば、フェニルアラニンは、チロシンのための不活化置換として作用することができる；またはアラニンは、セリンのための不活化置換として作用することができる。「オルソログ」は、共通の祖先遺伝子から種形成によって進化した異なる種の遺伝子を指す。通常、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持する。オルソログの同定は、新しく配列決定されたゲノム中で遺伝子機能の信頼できる予測にとって重要である。「アナログ」は、１つまたは複数のアミノ酸変化、例えば、親または出発ポリペプチドの１つまたは複数の特性を依然として維持するアミノ酸残基の置換、付加または欠失によって異なるポリペプチドバリアントを含むことを意味する。
本開示は、バリアントおよび誘導体を含む、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドベースであるいくつかの型の組成物を提供する。これらのものは、例えば、置換、挿入、欠失および共有バリアントおよび誘導体を含む。用語「誘導体」は、用語「バリアント」と同義的に使用されるが、一般的には、どのような様式であっても、参照分子または出発分子と比較して改変および／または変化している分子を指す。
そのため、参照配列に関して、置換、挿入ならびに／または付加、欠失および共有改変を含有するペプチドまたはポリペプチド、特に、本明細書に開示されるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば、１つまたは複数のリシンを、ペプチド配列に付加することができる（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）。配列タグを、ペプチドの検出、精製または位置確認のために使用することができる。リシンを使用して、ペプチドの溶解度を増大させるか、またはビオチン化を可能にすることができる。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシおよびアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を、必要に応じて、欠失させ、トランケートされた配列を提供することができる。あるいは、例えば、可溶性であるか、または固相支持体に連結された、より大きい配列の一部としての配列の発現に関して、ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）を、配列の使用に応じて欠失させることができる。ポリペプチドを指す場合の「置換バリアント」は、天然または出発配列中の少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、その代わりに同じ位置に異なるアミノ酸が挿入されたものである。分子中の１個のアミノ酸のみが置換されている場合、置換は単一であってよいか、または２個以上のアミノ酸が同じ分子中で置換されている場合、置換は複数であってもよい。
本発明を以下の例示的な実施例によってさらに記載する。実施例は、いかなる様式でも本発明を限定しない。これらは本発明を明確にするためだけの役割を果たす。
（実施例１）
融合阻害剤を用いた架橋結合およびネイティブＨＣＭＶ ｇＢ（Ｔｏｗｎｅ株）の単離および精製
ＨＣＭＶの試料調製中、ｇＢの融合後の形態への変換を阻害するために、融合阻害剤（Ｂｌｏｏｍら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１４（２００４）３４０１～３４０６に記載の化合物２８、図５Ｄも参照）をウイルスの濃縮、加工、抽出、および精製中のそれぞれのステップに加えた。
融合阻害剤を用いた架橋結合およびネイティブＨＣＭＶ ｇＢ（Ｔｏｗｎｅ株）の単離および精製
ＨＣＭＶの試料調製中、ｇＢの融合後の形態への変換を阻害するために、融合阻害剤（Ｂｌｏｏｍら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１４（２００４）３４０１～３４０６に記載の化合物２８、図５Ｄも参照）をウイルスの濃縮、加工、抽出、および精製中のそれぞれのステップに加えた。
ビリオン表面上のタンパク質をビス（スルホスクシンイミジル）グルタレート（ＢＳ２Ｇ）で架橋結合させ、ｇＢをビリオンから界面活性剤を用いて抽出した後、電子低温顕微鏡観察によるｇＢの精製および同定を支援するためにＳＭ５－１ Ｈｉｓ／Ｓｔｒｅｐタグ付けしたＦａｂ（Ｐｏｔｚｓｃｈら、ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、７（８）：ｅ１００２１７２、２０１１）を加えた。Ｆａｂ－ｇＢ複合体を親和性カラムによって精製した。
その後、これらの抽出および精製タンパク質を、電子低温顕微鏡観察によって融合前ｇＢの存在について分析し、融合前の形態の構造を解くために使用した。
（実施例２）
電子顕微鏡観察
酸化グラフェンフィルムに担持された電子顕微鏡観察グリッドを調製した。Ｖｉｔｒｏｂｏｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用したｇＢ試料溶液をガラス化した。凍結したグリッドを３００ｋＶで稼働するＦＥＩ Ｔｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ透過型電子顕微鏡に移した。標的位置をＳｅｒｉａｌＥＭプログラムで設定し、高拡大率（１８０００×）の画像を、超解像度の動画モードを使用したＫ２直接検出カメラ（Ｇａｔａｎ）を使用して、プログラムで自動収集した。非ビニングピクセルサイズは０．６３８Åであり、ビーム強度は約８ｅ／ウンビンピクセル（ｕｎｂｉｎ ｐｉｘｅｌ）／秒であった。それぞれの動画について試料に対する総電子用量は約４０ｅ／Å２であった。それぞれ２８個のフレームを有する合計７，７７１個の動画を３回のセッションで収集した。
電子顕微鏡観察
酸化グラフェンフィルムに担持された電子顕微鏡観察グリッドを調製した。Ｖｉｔｒｏｂｏｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用したｇＢ試料溶液をガラス化した。凍結したグリッドを３００ｋＶで稼働するＦＥＩ Ｔｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ透過型電子顕微鏡に移した。標的位置をＳｅｒｉａｌＥＭプログラムで設定し、高拡大率（１８０００×）の画像を、超解像度の動画モードを使用したＫ２直接検出カメラ（Ｇａｔａｎ）を使用して、プログラムで自動収集した。非ビニングピクセルサイズは０．６３８Åであり、ビーム強度は約８ｅ／ウンビンピクセル（ｕｎｂｉｎ ｐｉｘｅｌ）／秒であった。それぞれの動画について試料に対する総電子用量は約４０ｅ／Å２であった。それぞれ２８個のフレームを有する合計７，７７１個の動画を３回のセッションで収集した。
画像処理
ＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２プログラムを使用してドリフト補正を行い（Ｚｈｅｎｇ Ｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４、３３１～３３２（２０１７））、最終顕微鏡写真を２×でビニングし、全フレームから平均をとった。コントラスト伝達関数パラメーターをＧｃｔｆで計算した（Ｋａｉ Ｚｈａｎｇ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９３（１）、１～１２（２０１６））。粒子選抜には、融合後のコンフォメーションのＨＣＭＶ ｇＢの公開構造（ＰＤＢ：５ＣＸＦ）を使用して、ｐｄｂ２ｍｒｃ（ＥＭＡＮ）を使用して３０Åの密度地図を作成した（Ｌｕｄｔｋｅ，Ｓ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１２８（１）、８２～９７（１９９９））。この密度地図からの投影図をｐｒｏｊｅｃｔ３ｄ（ＥＭＡＮ）で作成し（図１）、Ｇａｕｔｏｍａｔｃｈプログラムを使用した自動粒子選抜のテンプレートとして使用した（Ｕｒｎａｖｉｃｉｕｓ Ｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４７（６２２９）：１４４１～１４４６（２０１５））。Ｒｅｌｉｏｎ ｖ２．１－ベータ（Ｓｃｈｅｒｅｓ，Ｓ．Ｈ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１８０（３）：５１９～５３０（２０１２））を使用して、生じる約１９０万個の粒子を抽出し、２Ｄ分類、３Ｄ分類、自動精緻化、および後処理を含む全ての続く画像処理ステップを実施した。２Ｄクラスを画像特長に基づいて３つの群へと分けた。第１の群は、結晶学的に決定された融合後ｇＢ構造に似ている特長を示した２Ｄクラスからなっており（＞５０％）、第２の群は、融合後ｇＢからの構造特徴に似ていない、十分に解像されたタンパク質特長を有する２Ｄクラスを含有しており（＜１０％）、第３の群は、明確に規定されたタンパク質を含有していなかった２Ｄクラスを含有していた（約４０％）（図１）。第１および第２の群は、Ｒｅｌｉｏｎを用いた３Ｄ分類、自動精緻化、および後処理の手順でさらに処理した。この処理の後、融合後のコンフォメーション構造を示す約３．５Åの解像度の電子密度マップが第１の群から再構築され、融合前のコンフォメーション構造を示す約３．６Åの解像度の電子密度マップが第２の群から再構築された。これらの密度地図および既知のＨＣＭＶ ｇＢアミノ酸配列（Ｔｏｗｎｅ株Ｐ１３２０１、配列番号１）に基づいて、融合前および融合後のコンフォメーション構造について、Ｃｏｏｔプログラムを用いて原子モデルを構築した（Ｅｍｓｌｅｙ Ｐ．ら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ、６６（Ｐｔ４）：４８６～５０１（２０１０））。融合後ｇＢ結晶構造（ＰＤＢ受託コード５ＣＸＦ）およびＳＭ５－１ ｆａｂとｇＢドメインＩＩとの間の複合体の結晶構造（ＰＤＢ受託コード４ＯＴ１）を、両方の構造の初期モデルとして使用した。融合後の構造モデルでは、電子密度への良好な当て嵌めを得るためには微調整で十分であった。融合前のコンフォメーションモデルでは、出発点として、参照ＰＤＢモデルからのドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶを強固な本体として電子密度マップ内にドッキングすることができる。その後、最適な当て嵌めのために個々の残基の調整を行った。ドメインＶ、ＭＰＲ、およびＴＭのモデルをｄｅ ｎｏｖｏで構築した。これらのモデルをＰｈｅｎｉｘ．ｒｅａｌ＿ｓｐａｃｅ＿ｒｅｆｉｎｅツール（Ａｆｏｎｉｎｅ ＰＶら Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ、７４（Ｐｔ６）：５３１～５４４（２０１８））で繰り返し精緻化し、続いて局所的な手動調整を数ラウンド行った。
ＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２プログラムを使用してドリフト補正を行い（Ｚｈｅｎｇ Ｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４、３３１～３３２（２０１７））、最終顕微鏡写真を２×でビニングし、全フレームから平均をとった。コントラスト伝達関数パラメーターをＧｃｔｆで計算した（Ｋａｉ Ｚｈａｎｇ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９３（１）、１～１２（２０１６））。粒子選抜には、融合後のコンフォメーションのＨＣＭＶ ｇＢの公開構造（ＰＤＢ：５ＣＸＦ）を使用して、ｐｄｂ２ｍｒｃ（ＥＭＡＮ）を使用して３０Åの密度地図を作成した（Ｌｕｄｔｋｅ，Ｓ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１２８（１）、８２～９７（１９９９））。この密度地図からの投影図をｐｒｏｊｅｃｔ３ｄ（ＥＭＡＮ）で作成し（図１）、Ｇａｕｔｏｍａｔｃｈプログラムを使用した自動粒子選抜のテンプレートとして使用した（Ｕｒｎａｖｉｃｉｕｓ Ｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４７（６２２９）：１４４１～１４４６（２０１５））。Ｒｅｌｉｏｎ ｖ２．１－ベータ（Ｓｃｈｅｒｅｓ，Ｓ．Ｈ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１８０（３）：５１９～５３０（２０１２））を使用して、生じる約１９０万個の粒子を抽出し、２Ｄ分類、３Ｄ分類、自動精緻化、および後処理を含む全ての続く画像処理ステップを実施した。２Ｄクラスを画像特長に基づいて３つの群へと分けた。第１の群は、結晶学的に決定された融合後ｇＢ構造に似ている特長を示した２Ｄクラスからなっており（＞５０％）、第２の群は、融合後ｇＢからの構造特徴に似ていない、十分に解像されたタンパク質特長を有する２Ｄクラスを含有しており（＜１０％）、第３の群は、明確に規定されたタンパク質を含有していなかった２Ｄクラスを含有していた（約４０％）（図１）。第１および第２の群は、Ｒｅｌｉｏｎを用いた３Ｄ分類、自動精緻化、および後処理の手順でさらに処理した。この処理の後、融合後のコンフォメーション構造を示す約３．５Åの解像度の電子密度マップが第１の群から再構築され、融合前のコンフォメーション構造を示す約３．６Åの解像度の電子密度マップが第２の群から再構築された。これらの密度地図および既知のＨＣＭＶ ｇＢアミノ酸配列（Ｔｏｗｎｅ株Ｐ１３２０１、配列番号１）に基づいて、融合前および融合後のコンフォメーション構造について、Ｃｏｏｔプログラムを用いて原子モデルを構築した（Ｅｍｓｌｅｙ Ｐ．ら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ、６６（Ｐｔ４）：４８６～５０１（２０１０））。融合後ｇＢ結晶構造（ＰＤＢ受託コード５ＣＸＦ）およびＳＭ５－１ ｆａｂとｇＢドメインＩＩとの間の複合体の結晶構造（ＰＤＢ受託コード４ＯＴ１）を、両方の構造の初期モデルとして使用した。融合後の構造モデルでは、電子密度への良好な当て嵌めを得るためには微調整で十分であった。融合前のコンフォメーションモデルでは、出発点として、参照ＰＤＢモデルからのドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶを強固な本体として電子密度マップ内にドッキングすることができる。その後、最適な当て嵌めのために個々の残基の調整を行った。ドメインＶ、ＭＰＲ、およびＴＭのモデルをｄｅ ｎｏｖｏで構築した。これらのモデルをＰｈｅｎｉｘ．ｒｅａｌ＿ｓｐａｃｅ＿ｒｅｆｉｎｅツール（Ａｆｏｎｉｎｅ ＰＶら Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ、７４（Ｐｔ６）：５３１～５４４（２０１８））で繰り返し精緻化し、続いて局所的な手動調整を数ラウンド行った。
結果
低温ＥＭによる試料スクリーニング
ｇＢの融合前のコンフォメーションは不安定であり、試料の取扱い中を含めて、融合後の状態へと再編成される性質を有する。したがって、研究した試料はｇＢ配座異性体の混合物を含有しており、構造決定を複雑にしていた。さらに、融合前ｇＢのドメインの配置またはユニークな構造特徴に関する事前の信頼性のある情報はなかった。本発明者らは、電子顕微鏡観察および画像処理による直接可視化を使用して、異なる試料調製状態をスクリーニングした。２Ｄおよび３Ｄ分類による画像選別は、不均一な試料から複数の構造を決定することを可能にする。しかし、これには、それぞれの構造について十分な粒子を組み合わせて良好なシグナルを有するクラス平均を生じることができるように、大きなデータセットを必要とする。このことは、融合前ｇＢは混合物中の小集団であったため、ｇＢ試料の事例において特にそうであった。したがって、本発明者らは、それぞれの状態について約１，０００個の動画を収集し、同じ試料からのより多くのデータを用いた画像処理を続行するか、または２Ｄ分類の段階で別のものに切り替えるかどうかを決定した。抗体Ｆａｂと結合した融合後のコンフォメーションのｇＢの構造は、多くのデータセットから容易に得られた。これらのＦａｂと結合した融合後のコンフォメーション構造からの投影図を、融合前の画像の再構築の画像を選択することを回避するための参照として使用した。本発明者らは、融合後ｇＢの投影図のいずれにも似ていないタンパク質特長を有する全ての良好なクラス平均を、さらなる画像処理のために選択した。本発明者らは、この戦略を用いて数十個の状態を試料調製のためにスクリーニングし、最終的に、ある程度の代替２Ｄクラスを粒子集団中の少数種として生じた試料を見出した（図１Ｂ、丸で囲む）。その後、合計７，７７１個の動画をその試料から収集し、融合前ｇＢ構造の決定に使用した。
低温ＥＭによる試料スクリーニング
ｇＢの融合前のコンフォメーションは不安定であり、試料の取扱い中を含めて、融合後の状態へと再編成される性質を有する。したがって、研究した試料はｇＢ配座異性体の混合物を含有しており、構造決定を複雑にしていた。さらに、融合前ｇＢのドメインの配置またはユニークな構造特徴に関する事前の信頼性のある情報はなかった。本発明者らは、電子顕微鏡観察および画像処理による直接可視化を使用して、異なる試料調製状態をスクリーニングした。２Ｄおよび３Ｄ分類による画像選別は、不均一な試料から複数の構造を決定することを可能にする。しかし、これには、それぞれの構造について十分な粒子を組み合わせて良好なシグナルを有するクラス平均を生じることができるように、大きなデータセットを必要とする。このことは、融合前ｇＢは混合物中の小集団であったため、ｇＢ試料の事例において特にそうであった。したがって、本発明者らは、それぞれの状態について約１，０００個の動画を収集し、同じ試料からのより多くのデータを用いた画像処理を続行するか、または２Ｄ分類の段階で別のものに切り替えるかどうかを決定した。抗体Ｆａｂと結合した融合後のコンフォメーションのｇＢの構造は、多くのデータセットから容易に得られた。これらのＦａｂと結合した融合後のコンフォメーション構造からの投影図を、融合前の画像の再構築の画像を選択することを回避するための参照として使用した。本発明者らは、融合後ｇＢの投影図のいずれにも似ていないタンパク質特長を有する全ての良好なクラス平均を、さらなる画像処理のために選択した。本発明者らは、この戦略を用いて数十個の状態を試料調製のためにスクリーニングし、最終的に、ある程度の代替２Ｄクラスを粒子集団中の少数種として生じた試料を見出した（図１Ｂ、丸で囲む）。その後、合計７，７７１個の動画をその試料から収集し、融合前ｇＢ構造の決定に使用した。
抗体Ｆａｂと結合した融合後ｇＢ構造の投影図を図１Ａに示す。収集したデータセットからの２Ｄクラス平均を図１Ｂに示す。融合後ｇＢ参照２Ｄ投影のどれにも似ていない一部のクラスを丸で囲む。
融合前のコンフォメーション構造の獲得
およそ１９０万個の生粒子画像がデータセットから自動的に選択された。２Ｄ分類後、画像を融合後のクラス（粒子集団の５５％）および融合前のクラス（粒子集団の１０％）へと群分けした。２つの群を、３ＤでＣ３対称性を適用してさらに処理して、ＳＭ５－１ Ｆａｂと結合した融合後ｇＢの密度地図を３．５Åの解像度で、およびＳＭ５－１ Ｆａｂと結合した融合前ｇＢの密度地図を３．６Åの解像度で得た。
およそ１９０万個の生粒子画像がデータセットから自動的に選択された。２Ｄ分類後、画像を融合後のクラス（粒子集団の５５％）および融合前のクラス（粒子集団の１０％）へと群分けした。２つの群を、３ＤでＣ３対称性を適用してさらに処理して、ＳＭ５－１ Ｆａｂと結合した融合後ｇＢの密度地図を３．５Åの解像度で、およびＳＭ５－１ Ｆａｂと結合した融合前ｇＢの密度地図を３．６Åの解像度で得た。
ＳＭ５－１ Ｆａｂ、および融合後ｇＢの外部ドメインのＸ線結晶構造解析に基づくモデルを、強固な本体のドッキングを用いて融合後の密度地図に当て嵌めた。Ｆａｂの定常ドメイン（これは強力な電子密度を生じるには柔軟すぎる可能性が高い）以外は、融合後ｇＢ－Ｆａｂ複合体の密度地図とモデルとは互いに良好に一致していた（図３Ａ）。膜近位領域、膜貫通領域、および細胞質ドメインは本発明者らの最終的な融合後ｇＢの密度地図では解像されておらず、これは、融合後ｇＢのこれらの領域が本質的にまたは試料調製物中での界面活性剤可溶化を通じてのどちらかで、柔軟であることを示唆している（図２、下列）。電子低温顕微鏡観察に基づくモデルにおけるＦａｂと融合後ｇＢのＤＩＩとの相互作用は、複合体の以前に決定された結晶構造（ＰＤＢ受託コード４ＯＴ１）と良好に一致している。
既知のＦａｂ結合位置によって導かれた融合前ｇＢモデルを構築するために、融合後ｇＢ結晶構造からのドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ、ならびにドメインＩＶの一部を融合前ｇＢ－Ｆａｂ複合体の密度地図内に個々にドッキングし、電子密度の最適な当て嵌めのために、必要に応じて個々の残基を手動で調整した。融合前ｇＢ構造の残りはｄｅ ｎｏｖｏで構築した。融合前の構造においてモデリングしたｇＢのアミノ酸を図２の上列に示す。融合前ｇＢ－Ｆａｂ複合体のモデルは融合前の密度地図のほとんどの部分に当て嵌まり、Ｆａｂ密度の存在が新規構造中におけるｇＢのアイデンティティーを確認している（図３Ｂ）。
本発明の実施例と関連する融合前ｇＢのモデルに関する座標および構造因子を、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２１／２６０５１０に記載された表１Ａに提供する。
融合前のコンフォメーションのｇＢの構造および融合後ｇＢとの比較
融合前ｇＢとＳＭ５－１ Ｆａｂとの複合体の電子密度により、ｇＢ外部ドメイン、膜近位領域（ＭＰＲ－ウイルス膜に平行に配向されているヘリックス領域）、および単スパン膜貫通ヘリックス（ＴＭ）を含む融合前ｇＢモデルの構築が可能となった（図３Ｂおよび図４Ｂ）。ＭＰＲおよびＴＭ領域は、融合後ｇＢの構造データ中で解像されておらず、融合後ｇＢモデルに含まれてもいなかった。
融合前ｇＢとＳＭ５－１ Ｆａｂとの複合体の電子密度により、ｇＢ外部ドメイン、膜近位領域（ＭＰＲ－ウイルス膜に平行に配向されているヘリックス領域）、および単スパン膜貫通ヘリックス（ＴＭ）を含む融合前ｇＢモデルの構築が可能となった（図３Ｂおよび図４Ｂ）。ＭＰＲおよびＴＭ領域は、融合後ｇＢの構造データ中で解像されておらず、融合後ｇＢモデルに含まれてもいなかった。
融合前および融合後ｇＢの全体的な寸法は異なる（図４Ａ対図４Ｂ）。融合後ｇＢ三量体外部ドメインはロッド形状を有しており、おおよその高さが１６５Åである（膜遠位末端でのそれぞれのプロトマーのプロリン５７０と膜近位末端でのそれぞれのプロトマーのトリプトファン２４０とによって形成される平面間の距離、図４Ａ）。これの幅はおよそ６５Åである（隣接プロトマー上のアラニン３１５間の距離）。ここに記載する構造は、ＨＣＭＶ Ｔｏｗｎｅ株のｇＢに由来するものであった。ｇＢアミノ酸配列のある程度の天然の変異は存在するものの、Ｔｏｗｎｅ ｇＢの全体的な融合後の構造は、ＡＤ１６９株に由来するｇＢの融合後の構造（ＰＤＢ受託コード５ＣＸＦ）とほぼ同一である。したがって、融合後ｇＢ構造の説明は、配列アラインメントからの等価なアミノ酸からの測定値を用いて両方の株に適用される。
融合前ｇＢ三量体は融合後ｇＢ三量体よりもずんぐりとした形状を有する（図４Ａ対図４Ｂ）。それぞれのプロトマーのＷ２４０と融合前の構造中の最も膜遠位のモデリングした残基であるＱ４８３とによって形成された平面間の距離は、およそ１１５Åである。融合前のモデルの幅は９５Åである（異なるプロトマーからの任意の２つのＡ３１５間の距離によって測定）。
ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの個々のサブユニット構造は融合前および融合後のコンフォメーションにおいて類似である。しかし、これらのドメインの全体的な配置は２つのコンフォメーションにおいて非常に異なっている（図４Ａ～４Ｂおよび図６Ａ～６Ｃ）。融合前のコンフォメーションでは、ＤＩの先端にある融合ループおよびドメインＩＩＩ中の中心ヘリックス束のＣ末端は、ＴＭ領域の位置によって同定されるように、全てビリオンエンベロープに向かった同じ方向を指している（図４Ａおよび図６Ａ）。対照的に、融合後のコンフォメーションでは、融合ループおよび中心ヘリックス束のＣ末端は逆の方向を指している（図４Ｂおよび図６Ｃ）。
融合前の構造では、融合ループ中の疎水性残基（残基Ｙ１５５、Ｉ１５６、Ｈ１５７、およびＷ２４０、Ｌ２４１）はＭＰＲと近接近しており、界面活性剤によって取り囲まれている可能性が高い（図４Ａおよび図６Ａ）。
融合前から融合後への遷移中、ドメインＩＩは、ドメインＩＩＩの中心のコイルドコイルの中間まで上がった位置からコイルドコイルの膜近位末端の位置および融合ループの反対側のドメインＩの近末端までシフトする（図４Ａおよび図４Ｂ）。
ＤＩＩＩの構造（図４Ａ～４Ｂおよび図６Ａ～６Ｃ）は融合前および融合後のコンフォメーションと非常に類似している。どちらのコンフォメーション中の中心ヘリックスも、Ｌ４７９からＰ５２５までをスパンする、融合前から融合後への遷移中における最小限の再編成を示している。しかし、他のドメインは、上述のように、ＤＩＩＩヘリックス束の方向（Ｎ末端からＣ末端）が融合ループから離れて、融合後のコンフォメーション中の三量体の遠位末端に向かって、およびウイルス膜に向かって、融合前のコンフォメーション中の融合ループと同じ方向を指すように、ドメインＩＩＩの中心ヘリックスと相対的にその位置を変える。
融合前の構造では、ドメインＩＶ（図４Ａおよび図６Ａ）は、三量体の外部上のドメインＩと三量体の中心のドメインＩＩＩおよびＶとの間の境界に埋もれている。対照的に、融合後の構造では、ドメインＩＶは、三量体の膜遠位先端で高度に曝露された「冠」を形成する。
ドメインＶは、融合前ｇＢ（図４Ａおよび図６Ａ）および融合後ｇＢ（図４Ｂおよび図６Ｃ）において異なる構造を有する。融合前ｇＢでは、ドメインのＮ末端半分（約残基６４２～６６０）は隣接プロトマーのドメインＩとドメインＩＶとの間に挟まれており、溶媒から隔離されている。ドメインＶの残基６８３～７０４の領域は、他のプロトマー中のその対応物と共に三量体ヘリックス束を形成する。このヘリックス束は、ドメインＩＶによって形成される「冠」のポケット内にほとんどが抱擁されている。ドメインＶからのヘリックス束をＭＰＲ領域と連結させる、追加の短いヘリックス（およそ残基７１０～７１９）が存在する。対照的に、融合後のコンフォメーション（図４Ｂおよび図６Ｃ）では、ドメインＶは溶媒曝露されており、ドメインＩＩＩヘリックス束の外側かつドメインＩと隣接プロトマーの境界によって形成された溝に沿って伸びている。
融合前および融合後ｇＢ構造の比較は、他の十分に研究されている融合タンパク質からよく知られているコンフォメーション変化の進行を示唆している（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、０：４９８～５０７（２０１５））。この比較は、本発明中に記載されている構造が実際に融合前のコンフォメーションにあるという確証を提供する。融合前の状態（図６Ａ）では、ドメインＩの融合ループは、ＭＰＲ、および潜在的にはウイルス膜の相互作用によって埋もれている。遠いｇＢホモログである水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質の融合前の構造では、融合ループはまた、ウイルス膜にも向かって指している（この構造中では見られない、ＭＰＲ領域の予測される位置にも）（Ｒｏｃｈｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１５：８４３～８（２００７））。
他の融合タンパク質との類似性に基づいて、中心ヘリックスの伸長が、融合前および融合後の状態間での提案された伸びた中間体（図６Ｂ）への遷移の一部として、再編成が進む可能性が高い。提案された伸びた中間体の状態では、ＴＭ領域は、依然としてウイルス膜中に繋留され、今では回転かつ位置変更したドメインＩの先端でウイルス膜から離れて伸びた融合ループは、細胞膜と相互作用するであろう。提案された伸びた中間体から融合後のコンフォメーションへの遷移は、膜貫通領域および融合ループが分子の同じ末端で再度互いに近接するような折り畳みが関与し、今回は、両方が融合したウイルスおよび細胞膜と相互作用するであろう（図６Ｃ）。
本発明者らは、融合前ｇＢでは、中心ヘリックスの長さに動的な変化があり可能性があり、本発明者らが決定した融合前の構造が、融合阻害剤によって、および電子低温顕微鏡観察によって研究した試料を調製するために使用した架橋結合剤によって、電子密度中において見られるコンフォメーションにロックされた、「呼吸する（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）」分子の「スナップショット」を表すと推測した。
観察された融合前のコンフォメーションの安定化因子
ｇＢアミノ酸を電子密度マップへとモデリングした後、ＭＰＲとドメインＶと融合ループを含有していたドメインＩの先端との間に、アミノ酸残基によって満たされていない密度領域が残った（図５Ａ）。満たされていない密度の大きさおよび形状は、電子低温顕微鏡観察によって研究した試料の生成全体にわたって存在していた、ＨＣＭＶ融合阻害剤、Ｎ－｛４－［（｛（１Ｓ）－１－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］エチル｝カルバモチオイル）アミノ］フェニル｝－１，３－チアゾール－４－カルボキサミド（図５Ｄ）の化学構造に当て嵌まる（図５Ｂ）。化合物は、トリフルオロメチルフェニル部分と化合物の残りの部分との間に捻じれを有するポーズを採用していた。チアゾールは、隣接プロトマーからのＬ７１２、Ａ７３８、およびＹ１５３、Ｙ１５５の疎水性残基との接触を形成する。フェニルは、Ｌ７１５の残基、ドメインＶからのＤ７１４の脂肪族炭化水素、ＭＰＲからのＧ７３４およびＩ７３０、ならびに隣接プロトマーのＴＭドメインからのＦ７５２によって形成された疎水性環境によって取り囲まれている。トリフルオロメチルフェニルは、別のプロトマーからのＭＰＲとＴＭヘリックスとの間のヒンジ付近の疎水性環境中に存在する。これは、ＭＰＲおよびＴＭドメインの外向きの動きを防止するためのフックとして作用し得る。阻害化合物によってコーディネートされた相互作用に加えて、他の融合ループからのＷ２４０、Ｙ２４２は、それぞれＭＰＲ領域およびドメインＶ中のＬ７１５からの疎水性パッチとファンデルワールス相互作用を形成している（図５Ｃ）。融合阻害剤の周りのこれらの特異的相互作用は、ドメインＩ、ドメインＶ、およびＭＰＲを一緒に保ち、融合プロセス中のドメインＩ、ドメインＶ、およびＭＰＲ間の動きを制限することであると予測されるであろう（図６Ａ～６Ｃ）。
ｇＢアミノ酸を電子密度マップへとモデリングした後、ＭＰＲとドメインＶと融合ループを含有していたドメインＩの先端との間に、アミノ酸残基によって満たされていない密度領域が残った（図５Ａ）。満たされていない密度の大きさおよび形状は、電子低温顕微鏡観察によって研究した試料の生成全体にわたって存在していた、ＨＣＭＶ融合阻害剤、Ｎ－｛４－［（｛（１Ｓ）－１－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］エチル｝カルバモチオイル）アミノ］フェニル｝－１，３－チアゾール－４－カルボキサミド（図５Ｄ）の化学構造に当て嵌まる（図５Ｂ）。化合物は、トリフルオロメチルフェニル部分と化合物の残りの部分との間に捻じれを有するポーズを採用していた。チアゾールは、隣接プロトマーからのＬ７１２、Ａ７３８、およびＹ１５３、Ｙ１５５の疎水性残基との接触を形成する。フェニルは、Ｌ７１５の残基、ドメインＶからのＤ７１４の脂肪族炭化水素、ＭＰＲからのＧ７３４およびＩ７３０、ならびに隣接プロトマーのＴＭドメインからのＦ７５２によって形成された疎水性環境によって取り囲まれている。トリフルオロメチルフェニルは、別のプロトマーからのＭＰＲとＴＭヘリックスとの間のヒンジ付近の疎水性環境中に存在する。これは、ＭＰＲおよびＴＭドメインの外向きの動きを防止するためのフックとして作用し得る。阻害化合物によってコーディネートされた相互作用に加えて、他の融合ループからのＷ２４０、Ｙ２４２は、それぞれＭＰＲ領域およびドメインＶ中のＬ７１５からの疎水性パッチとファンデルワールス相互作用を形成している（図５Ｃ）。融合阻害剤の周りのこれらの特異的相互作用は、ドメインＩ、ドメインＶ、およびＭＰＲを一緒に保ち、融合プロセス中のドメインＩ、ドメインＶ、およびＭＰＲ間の動きを制限することであると予測されるであろう（図６Ａ～６Ｃ）。
融合前のコンフォメーションの安定性に対する架橋結合の効果も試験した。試料調製ステップ中、ＢＳ２Ｇ架橋結合試薬を加えたまたは加えなかった。架橋結合剤の非存在下では、融合前対融合後のコンフォメーションにおける粒子の比は１：１００であった一方で、ＢＳ２Ｇ試薬によって架橋結合した試料中では、比は１：４であった。架橋結合剤は電子密度において同定されなかった。
本明細書中に記載した図に記載したＣＭＶ ｇＢの融合前の構造ならびに融合前および融合後の構造のカラーバージョンは、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれているＬｉｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ、７（１０）：ｅａｂｆ３１７８（２０２１）中にも見つけ得る。
（実施例３）
ｇＢ１６６６の発現および精製
ｇＢ１６６６の生成には、構築したＰＳＢ１６６６をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内に一過的にトランスフェクションさせた。細胞ペレットをトランスフェクションの９６時間後に回収した。ＰＳＢ１６６６タンパク質を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＤＤＭ、０．００２％のＣＨＳ、３μｇ／ｍｌのＷＡＹ－１７４８６５（阻害剤、図５Ｄを参照）中、可溶化、親和性カラム、およびサイズ排除クロマトグラフィーのシリーズまたはプロセスを通じて精製した。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ上および陰性染色を用いたＥＭによって分析して、タンパク質の少なくとも５０％が融合前のコンフォメーションを示すことを確実にした。ＰＳＢ１６６６タンパク質はＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞のトランスフェクションにおいて効率的に発現され、１Ｌの発現で約０．１ｍｇの精製ＰＳＢ１６６６を高品質で生じるであろう。
ｇＢ１６６６の発現および精製
ｇＢ１６６６の生成には、構築したＰＳＢ１６６６をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞内に一過的にトランスフェクションさせた。細胞ペレットをトランスフェクションの９６時間後に回収した。ＰＳＢ１６６６タンパク質を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＤＤＭ、０．００２％のＣＨＳ、３μｇ／ｍｌのＷＡＹ－１７４８６５（阻害剤、図５Ｄを参照）中、可溶化、親和性カラム、およびサイズ排除クロマトグラフィーのシリーズまたはプロセスを通じて精製した。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ上および陰性染色を用いたＥＭによって分析して、タンパク質の少なくとも５０％が融合前のコンフォメーションを示すことを確実にした。ＰＳＢ１６６６タンパク質はＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞のトランスフェクションにおいて効率的に発現され、１Ｌの発現で約０．１ｍｇの精製ＰＳＢ１６６６を高品質で生じるであろう。
ポリペプチドｇＢ１６６６（ＰＳＢ１６６６）（配列番号５７）は、ドメインＩおよびＩＶ中の突然変異を含む。このポリペプチドは、配列番号１に記載の対応する野生型ｇＢ（Ｔｏｗｎｅ）と比較して以下の突然変異、Ｄ２１７ＣおよびＹ５８９Ｃを含む。
（実施例４）
ＤＮＡによって発現させたｇＢ１６６６はＢａｌｂ／ｃマウスにおいて免疫原性である
提案された安定化させた完全長の融合前ｇＢ構築物のうちの１個であるｇＢ１６６６（配列番号５７）は、トランスフェクションさせた哺乳動物細胞からの精製後、融合阻害剤（ＷＡＹ－１７４８６５、図５Ｄを参照）の存在下で、Ｔｏｗｎｅ株の野生型ｇＢと比較して融合前のコンフォメーションの分子の割合が増加していることが、ＥＭによって示されている。この分子がｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を誘発できるかどうかを評価するために、ｇＢ１６６６および野生型ｇＢに対応するＤＮＡ配列をインハウスの哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。１０匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、１００ｕｇのｇＢ１６６６をコードしているＤＮＡを用いて、２回、３週間間隔で電気穿孔した（Ｄ０およびＤ２１）。追加の１０匹のマウスを、同じプロトコールによって、野生型ｇＢをコードしているＤＮＡを用いて電気穿孔し、第３の群を、リン酸緩衝食塩水からなるプラセボを用いて電気穿孔した。血清試料を２８日目に収集した。Ｔｏｗｎｅ株の野生型配列に基づくが膜貫通ドメインが除去された（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）哺乳動物細胞から生成した組換えｇＢタンパク質に対してＥＬＩＳＡを行って、標準のプロトコールに従って抗ｇＢ ＩｇＧ応答を決定した。野生型ｇＢ ＤＮＡで免疫化したマウスからの１０匹中１０匹の動物および１０匹中９匹のｇＢ１６６６ ＤＮＡで免疫化したマウスが、検出可能な抗ｇＢ ＩｇＧ力価を生じた（図１１、平均±ＳＤ、ＬＬＯＱ＝２５を示す）。この研究は、ｇＢ１６６６がＢａｌｂ／ｃマウスにおいて免疫原性であることを実証している。
ＤＮＡによって発現させたｇＢ１６６６はＢａｌｂ／ｃマウスにおいて免疫原性である
提案された安定化させた完全長の融合前ｇＢ構築物のうちの１個であるｇＢ１６６６（配列番号５７）は、トランスフェクションさせた哺乳動物細胞からの精製後、融合阻害剤（ＷＡＹ－１７４８６５、図５Ｄを参照）の存在下で、Ｔｏｗｎｅ株の野生型ｇＢと比較して融合前のコンフォメーションの分子の割合が増加していることが、ＥＭによって示されている。この分子がｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を誘発できるかどうかを評価するために、ｇＢ１６６６および野生型ｇＢに対応するＤＮＡ配列をインハウスの哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。１０匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、１００ｕｇのｇＢ１６６６をコードしているＤＮＡを用いて、２回、３週間間隔で電気穿孔した（Ｄ０およびＤ２１）。追加の１０匹のマウスを、同じプロトコールによって、野生型ｇＢをコードしているＤＮＡを用いて電気穿孔し、第３の群を、リン酸緩衝食塩水からなるプラセボを用いて電気穿孔した。血清試料を２８日目に収集した。Ｔｏｗｎｅ株の野生型配列に基づくが膜貫通ドメインが除去された（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）哺乳動物細胞から生成した組換えｇＢタンパク質に対してＥＬＩＳＡを行って、標準のプロトコールに従って抗ｇＢ ＩｇＧ応答を決定した。野生型ｇＢ ＤＮＡで免疫化したマウスからの１０匹中１０匹の動物および１０匹中９匹のｇＢ１６６６ ＤＮＡで免疫化したマウスが、検出可能な抗ｇＢ ＩｇＧ力価を生じた（図１１、平均±ＳＤ、ＬＬＯＱ＝２５を示す）。この研究は、ｇＢ１６６６がＢａｌｂ／ｃマウスにおいて免疫原性であることを実証している。
（実施例５）
安定化された融合前ｇＢ１６６６タンパク質の免疫原性試験マウスにおけるｇＢ１６６６の免疫原性試験
マウスにおける抗体応答を評価するために、以下の免疫化スキームに従う。８週目に、マウスを全採血し、免疫化した動物の血清からの中和力価を決定し、ｇＢ７０５（融合後）および／またはｇＢ野生型タンパク質で免疫化したものと比較する。
安定化された融合前ｇＢ１６６６タンパク質の免疫原性試験マウスにおけるｇＢ１６６６の免疫原性試験
マウスにおける抗体応答を評価するために、以下の免疫化スキームに従う。８週目に、マウスを全採血し、免疫化した動物の血清からの中和力価を決定し、ｇＢ７０５（融合後）および／またはｇＢ野生型タンパク質で免疫化したものと比較する。
（実施例６）
実施例２では、本発明者らは、抗体断片と複合体形成した、融合前のヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）Ｔｏｗｎｅ株糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）の電子低温顕微鏡観察（低温ＥＭ）構造を開示した。構造決定に使用したｇＢは、低分子融合阻害剤ＷＡＹ－１７４８６５を哺乳動物細胞培養物中の真のＨＣＭＶの発酵物に加え、ｇＢの生成および分析の全体にわたって阻害剤の存在を維持することと、ウイルスを精製することと、ウイルスを化学的架橋結合剤、ビス（スルホスクシンイミジル）グルタレート（ＢＳ２Ｇ、７．７Åのスペーサーアーム）で処理することと、界面活性剤を用いてｇＢをウイルスから抽出することと、ビリオン上のｇＢを親和性タグ付けした抗体断片と結合させることと、親和性およびサイジングカラムによってｇＢを精製することとによって得た。本発明者らはまた、融合前の状態のｇＢを安定化させる突然変異を遺伝子操作するための、融合前ｇＢの低温ＥＭ構造の使用も開示した。具体的には、本発明者らは、２つの残基をシステインに突然変異させた（Ｄ２１７Ｃ、Ｙ５８９Ｃ）組換えｇＢタンパク質ｇＢ１６６６を開示した。生じたＣ２１７とＣ５８９との間の遺伝子操作したジスルフィド結合の形成は、融合前の状態の組換えｇＢのコンフォメーションの安定性を増加させる。ｇＢ１６６６は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞中で発現させ、融合阻害剤である化合物ＷＡＹ－１７４８６５の存在下で精製した場合に、融合前の構造特徴を維持していた。阻害剤の非存在下では、ｇＢ１６６６はコンフォメーション変化を受け、その融合前の構造状態を失う傾向がある。阻害剤の非存在下における融合前のコンフォメーションの安定性の損失は、組換え糖タンパク質を免疫化のための抗原として使用するために望ましい特徴ではない。ｇＢ１６６６を、阻害剤を用いて製剤化した場合でも、人または動物内に注射した際に、ｉｎ ｖｉｖｏでの阻害剤の希釈がｇＢ１６６６からのその解離およびｇＢ１６６６の融合前のコンフォメーションの損失をもたらすリスクが存在する。したがって、ＷＡＹ－１７４８６５の非存在下で融合前の状態に保つために、ＨＣＭＶ ｇＢを融合前のコンフォメーションに十分に安定化させることが望ましい。また、製造可能性を改善させるため、溶解度を改善させるため、均一性を改善させるため、および、ｇＢ膜貫通領域によって媒介される凝集または沈殿を防止するために界面活性剤または他の賦形剤を用いて製剤化する必要性を低減させるまたは排除するために、融合前ｇＢ免疫原が可溶性外部ドメインを含むことも好ましい。
実施例２では、本発明者らは、抗体断片と複合体形成した、融合前のヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）Ｔｏｗｎｅ株糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）の電子低温顕微鏡観察（低温ＥＭ）構造を開示した。構造決定に使用したｇＢは、低分子融合阻害剤ＷＡＹ－１７４８６５を哺乳動物細胞培養物中の真のＨＣＭＶの発酵物に加え、ｇＢの生成および分析の全体にわたって阻害剤の存在を維持することと、ウイルスを精製することと、ウイルスを化学的架橋結合剤、ビス（スルホスクシンイミジル）グルタレート（ＢＳ２Ｇ、７．７Åのスペーサーアーム）で処理することと、界面活性剤を用いてｇＢをウイルスから抽出することと、ビリオン上のｇＢを親和性タグ付けした抗体断片と結合させることと、親和性およびサイジングカラムによってｇＢを精製することとによって得た。本発明者らはまた、融合前の状態のｇＢを安定化させる突然変異を遺伝子操作するための、融合前ｇＢの低温ＥＭ構造の使用も開示した。具体的には、本発明者らは、２つの残基をシステインに突然変異させた（Ｄ２１７Ｃ、Ｙ５８９Ｃ）組換えｇＢタンパク質ｇＢ１６６６を開示した。生じたＣ２１７とＣ５８９との間の遺伝子操作したジスルフィド結合の形成は、融合前の状態の組換えｇＢのコンフォメーションの安定性を増加させる。ｇＢ１６６６は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞中で発現させ、融合阻害剤である化合物ＷＡＹ－１７４８６５の存在下で精製した場合に、融合前の構造特徴を維持していた。阻害剤の非存在下では、ｇＢ１６６６はコンフォメーション変化を受け、その融合前の構造状態を失う傾向がある。阻害剤の非存在下における融合前のコンフォメーションの安定性の損失は、組換え糖タンパク質を免疫化のための抗原として使用するために望ましい特徴ではない。ｇＢ１６６６を、阻害剤を用いて製剤化した場合でも、人または動物内に注射した際に、ｉｎ ｖｉｖｏでの阻害剤の希釈がｇＢ１６６６からのその解離およびｇＢ１６６６の融合前のコンフォメーションの損失をもたらすリスクが存在する。したがって、ＷＡＹ－１７４８６５の非存在下で融合前の状態に保つために、ＨＣＭＶ ｇＢを融合前のコンフォメーションに十分に安定化させることが望ましい。また、製造可能性を改善させるため、溶解度を改善させるため、均一性を改善させるため、および、ｇＢ膜貫通領域によって媒介される凝集または沈殿を防止するために界面活性剤または他の賦形剤を用いて製剤化する必要性を低減させるまたは排除するために、融合前ｇＢ免疫原が可溶性外部ドメインを含むことも好ましい。
本発明者らは今回、融合前ｇＢを免疫原として使用するためのこれらの改善された特徴を与える、ＨＣＭＶ ｇＢ中の新しい突然変異の構造に基づく遺伝子操作する手法を通じて、本発明を報告する。第１に、本発明者らは、ナノディスク中に繋留させることによって可溶化し、ＷＡＹ－１７４８６５の存在によって融合前のコンフォメーションに安定化させた、ｇＢ１６６６の低温ＥＭによって構造を決定した（図１２）。組換え、Ｄ２１７Ｃ、およびＹ５８９Ｃの突然変異ｇＢの新しい構造のほとんどは、本発明者らが以前に決定したビリオン由来の、化学的に架橋結合した、抗体断片と結合したＨＣＭＶ Ｔｏｗｎｅの融合前ｇＢの構造に類似しているが、２つの構造間には特定の局所領域中にわずかな違いが存在する。構造の相違は、調製物の、以下のいくつかの相違を反映している可能性がある：第１に、糖タンパク質の呼吸運動を制限するはずであるｇＢ１６６６中の遺伝子操作したジスルフィド結合の存在、第２に、以前の構造決定のためにｇＢを抽出し、溶液中に維持するために使用した界面活性剤よりも、膜貫通ドメインにとってより天然の局所的脂質環境を提供する、ナノディスク中におけるｇＢ１６６６の繋留、第３に、ｇＢ１６６６の化学的架橋結合の不在、第４に、アミノ酸側鎖のより正確なモデリングを可能にする、以前の構造の３．６Åの解像度と比較した、３．３Åでの新しい構造のより高い解像度。
新しい構造情報に基づいて、本発明者らは、完全長ｇＢ構築物ｐＳＢ１６６６の背景上に追加の安定化させる突然変異を設計した（表６および表７）。本発明者らは、これらの追加の突然変異をｐＳＢ１６６６背景に追加することで、融合前の状態のｇＢがさらに安定化するであろうという仮説を立てた（図１３）。例えば、残基Ｍ３７１およびＷ５０６でのシステイン突然変異は、ドメインＩＩとＩＩＩとの間のジスルフィド結合を導入する場合があり、（Ｆ５４１、Ｅ６８１）および（Ｎ５２４、Ｍ６８４）の対でのシステイン突然変異は、ドメインＩＶとＶとの間のジスルフィド結合を導入する場合があり、残基Ｅ６８６、Ｄ６７９の疎水性残基への突然変異は、局所的に不安定化させる同電荷反発パッチを除去し、タンパク質の安定性を増加させることができる。新しい追加した突然変異の選集を有する組換え糖タンパク質を発現させ、融合阻害剤の非存在下かつ化学的架橋結合なしで精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる発現させた糖タンパク質の電気泳動移動度は、グリコシル化と整合した、予想された見かけの分子量および不均一性を示した（図１４）。試料を４℃で保存し、アリコートを１日目および７日目の陰性染色電子顕微鏡観察分析のために取った。２Ｄクラス平均画像では、ｇＢの融合前のコンフォメーションの「上面図」に似ている三角形形状の特長が明白であった。融合前および融合後のクラスに属する集団中の粒子の比は、１日目では５：１であり、７日目では３：１であった（図１５）。
新しい構造情報に基づいて、本発明者らは、図１６Ａ～１６Ｄに例示した融合前の安定化させる突然変異を用いて、いくつかの可溶性の界面活性剤なしのｇＢ外部ドメインを設計した（表８）。ＨＣＭＶ ｇＢの精製した外部ドメイン、残基１～７０７は、ｇＢタンパク質がその曝露された融合ループを通じて会合した、ロゼット様の凝集体を形成した。凝集を排除し、馴化培地へのタンパク質分泌を増加させるために、本発明者らは、融合ループ内の４つの曝露された疎水性残基を、単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－１）ｇＢからの対応するより親水性のアミノ酸、例えば、ＹＩＨ（１５５～１５７）→ＧＨＲ、Ｗ２４０→Ａで置き換えた。本発明者らはまた、曝露されたＣｙｓ２４６をＳｅｒへと突然変異させて（Ｃ２４６→Ｓ）、疑似ジスルフィド結合の形成を防止した。抗原の融合前の三量体状態をさらに安定化させるために、本発明者ら、プロトマー間ジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基、または付加されたＣ末端三量体化モチーフ、例えば、Ｔ４－バクテリオファージフィブリチンからのＧＣＮ４またはフォールドンのいずれかを導入した。ジスルフィド突然変異、例えば、Ｄ２１７Ｃ－Ｙ５８９Ｃ、Ｍ３１７Ｃ－Ｗ５０６Ｃ、Ｎ５２４Ｃ－Ｍ６８４Ｃを、タンパク質を融合前の状態にロックするためにさらに導入した。組換え糖タンパク質を発現させ、馴化培地に分泌させ、融合阻害剤の非存在下かつ化学界面活性剤なしで精製した。注目すべきは、ＧＣＮ４三量体化モチーフと融合させた組換えバリアントが最適なサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを示したことである（図１７）。陰性染色電子顕微鏡観察は、組換えタンパク質ｇＢ２５５５およびｇＢ２５５６を、阻害剤および界面活性剤の非存在下において単分散のタンパク質として示した。予想されたｇＢタンパク質特長が２Ｄクラス平均画像において観察された（図１８および図１９）。これらの結果は、これらの遺伝子操作した構築物が、必要に応じて、阻害剤および界面活性剤の非存在下で、融合前の形態のｇＢに対してより安定化させる突然変異を付加するフレームワークとして使用するために適していることを確証している。
本発明の実施例と関連する融合前ｇＢのモデルに関する座標および構造因子を、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２１／２６０５１０に記載された表１Ｂに提供する。
（実施例７）
ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの創薬可能領域の決定
ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの融合前および融合後の構造は、上記の実施例に記載されている。ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドが融合後構造に再配置する場合、三量体に集合し、それらの間に溝を残す融合ループを先端に有する長いベータシートに富む球状ドメインが形成される。タンパク質の膜アンカーにより近いところから、長く伸長したコイル／アルファヘリックス構造は、これらの溝を辿っていき、膜アンカーと融合ループとを一緒にし、ウイルスの細胞進入を行う融合反応を完了させる。
ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの創薬可能領域の決定
ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの融合前および融合後の構造は、上記の実施例に記載されている。ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドが融合後構造に再配置する場合、三量体に集合し、それらの間に溝を残す融合ループを先端に有する長いベータシートに富む球状ドメインが形成される。タンパク質の膜アンカーにより近いところから、長く伸長したコイル／アルファヘリックス構造は、これらの溝を辿っていき、膜アンカーと融合ループとを一緒にし、ウイルスの細胞進入を行う融合反応を完了させる。
図２０Ａおよび２０Ｂは、融合前（図２０Ａ）および融合後（図２０Ｂ）構造におけるＨＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ株）ドメインＶ（残基Ｉ６４２～Ｖ６９７（配列番号２８１））の空間充填モデルを描写する。疎水性残基は標識されている。融合前コンフォメーションにおいては、これらの疎水性残基は無秩序であるが、それらは両親媒性の伸長したコンフォメーションに再配置して、融合後構造の他の部分の疎水性表面を補完する。例えば、図２０Ｂに示されるように、Ｉ６４２～Ｆ６６１（配列番号２８２）の間の領域は、他の２つのプロトマーに由来するＱ４８５～Ｌ５２０（配列番号２８３）によって形成される表面と相互作用する；Ｌ６７２～Ｖ６９７（配列番号２８４）の間の領域は、他の２つのプロトマーに由来する同じ領域と相互作用する。この構造再配置は、ウイルスと宿主細胞膜との融合を駆動するのに必須である。
このコンフォメーション変化は、融合後形態のドメインＩとＩＩとの間の溝の上でＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドドメインＶ中の創薬可能領域を創出する。
図２１Ａ～図２１Ｃは、（図２１Ａ）融合後コンフォメーションのＨＣＭＶ ｇＢ（Ｔｏｗｎｅ株）ドメインＶ（明灰色）およびその結合ポケット（暗灰色）を示し、（図２１Ｂ）ドメインＶを含まないポケットの空間充填モデルが示される。図２１Ｃは、ある特定の残基が標識された、図２１Ａと同じ構造のリボン表示を示す。
一実施形態では、溝を辿る長く伸びたコイル／ａ－ヘリックスの部分に対応するペプチドは、ウイルスに加えて、溝の占有をめぐってその真の対応物と競合し、再配置の完了を防止し、それによって、膜融合、ウイルス進入、およびウイルス感染力を遮断する。別の実施形態では、溝へのペプチドの結合の遮断を使用して、低分子のライブラリーをスクリーニングし、低分子ＣＭＶ融合阻害剤の探索をもたらすことができる。
本発明は、Ｍ６４８～Ｋ７００（配列番号２６０）、Ｍ６４８～Ｖ６９７（配列番号２６１）、Ｓ６４７～Ｖ６９７（配列番号２６２）、Ｓ６４７～Ｖ６６３（配列番号２６３）、Ｉ６５３～Ｖ６９７（配列番号２６４）、Ｉ６５３～Ｑ６９２（配列番号２６５）、Ｉ６５３～Ｌ６８０（配列番号２６６）、Ｉ６５３～Ｓ６７５（配列番号２６７）、Ｉ６５３～Ｙ６６７（配列番号２６８）、Ｒ６６２～Ｖ６９７（配列番号２６９）、Ｒ６６２～Ｑ６９２（配列番号２７０）、Ｒ６６２～Ｌ６８０（配列番号２７１）、Ｒ６６２～Ｓ６７５（配列番号２７２）、Ｌ６６４～Ｆ６７８（配列番号２７３）、Ｓ６６８～Ｖ６９７（配列番号２７４）、Ｓ６６８～Ｑ６９２（配列番号２７５）、Ｓ６６８～Ｖ６７７（配列番号２７６）、Ｄ６７９～Ｖ６９７（配列番号２７７）、Ｌ６８０～Ｖ６９７（配列番号２７８）、Ｌ６８０～Ｑ６９２（配列番号２７９）、およびＲ６９３～Ｋ７００（配列番号２８０）からなる群から選択される配列番号１の残基（Ｔｏｗｎｅ株）を含むペプチドを提供する。
ペプチド活性の検証実験
上記のペプチド（表１０も参照されたい）を合成し、ウイルス細胞感染阻害活性において試験する。このペプチドは、デングウイルスにおける同様の機能を有するペプチドと同様、約１０μＭ以下の濃度で感染を５０％低減させる効力（ＩＣ５０）を有すると予想される（Ａ．Ｇ．Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｐ．Ｌ．Ｙａｎｇ、Ｓ．Ｃ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ、Ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ－ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ｔａｒｇｅｔ ａ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ６、ｅ１０００８５１（２０１０））。ｇＢの創薬可能領域での選択されたペプチドの係合を、結合アッセイを用いて検証することができる。これらのものは、約１０μＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を示すためのＳＰＲによる結合親和性の測定およびｇＢの創薬可能領域中のペプチドの密度を示すためのｃｒｙｏＥＭ構造を含む。ＨＣＭＶ ｇＢの創薬可能領域は、配列番号１の残基Ｋ１３０～Ａ１３５、Ｄ２１６～Ｗ２３３、Ｒ２５８～Ｋ２６０、Ａ２６７～Ｖ２７３、Ｒ３２７～Ｄ３２９、Ｗ３４９～Ｅ３５０、Ｖ４８０～Ｋ５１８およびＮ６７６～Ｙ６９０を含む。創薬可能領域の残基は、融合後コンフォメーション中にある。
上記のペプチド（表１０も参照されたい）を合成し、ウイルス細胞感染阻害活性において試験する。このペプチドは、デングウイルスにおける同様の機能を有するペプチドと同様、約１０μＭ以下の濃度で感染を５０％低減させる効力（ＩＣ５０）を有すると予想される（Ａ．Ｇ．Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｐ．Ｌ．Ｙａｎｇ、Ｓ．Ｃ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ、Ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ－ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ｔａｒｇｅｔ ａ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ６、ｅ１０００８５１（２０１０））。ｇＢの創薬可能領域での選択されたペプチドの係合を、結合アッセイを用いて検証することができる。これらのものは、約１０μＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を示すためのＳＰＲによる結合親和性の測定およびｇＢの創薬可能領域中のペプチドの密度を示すためのｃｒｙｏＥＭ構造を含む。ＨＣＭＶ ｇＢの創薬可能領域は、配列番号１の残基Ｋ１３０～Ａ１３５、Ｄ２１６～Ｗ２３３、Ｒ２５８～Ｋ２６０、Ａ２６７～Ｖ２７３、Ｒ３２７～Ｄ３２９、Ｗ３４９～Ｅ３５０、Ｖ４８０～Ｋ５１８およびＮ６７６～Ｙ６９０を含む。創薬可能領域の残基は、融合後コンフォメーション中にある。
これらの方法は、当業者には周知であり、以下により詳細に記載される。
１．ウイルス感染阻害アッセイ
ＨＣＭＶ感染を、マイクロ中和アッセイによって、ＭＲＣ－５線維芽細胞およびＡＲＰＥ－１９上皮細胞中で試験する。簡単に述べると、３７℃、５％ＣＯ２で一晩、９６ウェルプレートに細胞を播種する。連続希釈したペプチドを、およそ５００ｐｆｕ／ウェルでＨＣＭＶ Ｔｏｗｎｅ株またはＶＲ１８１４と合わせ、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、混合物をＭＲＣ－５またはＡＲＰＥ－１９細胞に移し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間感染させる。メタノールを用いて固定した後、ＨＣＭＶ感染細胞を、マウスモノクローナル抗ＨＣＭＶ極初期タンパク質ＩＥ１抗体（社内で開発した）を使用する免疫染色によって検出する。次いで、二次抗体であるＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）抗体を、ＣＴＬ－ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用する感染細胞の計測のために使用する。試料の感染力の５０％を阻害する力価（ＩＣ５０）を、４パラメーターの非線形回帰を使用する内挿によって決定する。
ＨＣＭＶ感染を、マイクロ中和アッセイによって、ＭＲＣ－５線維芽細胞およびＡＲＰＥ－１９上皮細胞中で試験する。簡単に述べると、３７℃、５％ＣＯ２で一晩、９６ウェルプレートに細胞を播種する。連続希釈したペプチドを、およそ５００ｐｆｕ／ウェルでＨＣＭＶ Ｔｏｗｎｅ株またはＶＲ１８１４と合わせ、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、混合物をＭＲＣ－５またはＡＲＰＥ－１９細胞に移し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間感染させる。メタノールを用いて固定した後、ＨＣＭＶ感染細胞を、マウスモノクローナル抗ＨＣＭＶ極初期タンパク質ＩＥ１抗体（社内で開発した）を使用する免疫染色によって検出する。次いで、二次抗体であるＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）抗体を、ＣＴＬ－ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用する感染細胞の計測のために使用する。試料の感染力の５０％を阻害する力価（ＩＣ５０）を、４パラメーターの非線形回帰を使用する内挿によって決定する。
２．ＳＰＲによる結合親和性
ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質およびペプチドの結合を測定するために、ＳＰＲ ＣＭ５センサーチップ表面を、１ｘＨＢＳＰ＋（０．０１Ｍ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）ランニング緩衝剤を用いて調製する。全てのフローセルを、０．４Ｍ ＥＤＣ＋０．１Ｍ ＮＨＳを用いて活性化し、１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ４．５中の抗Ａｖｉ ｐＡｂでアミンカップリングする。次いで、表面を、０．２Ｍホウ酸緩衝剤ｐＨ８．５中の０．１Ｍ ＥＤＡでブロックした後、７５ｍＭリン酸で３回再生する。
ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質およびペプチドの結合を測定するために、ＳＰＲ ＣＭ５センサーチップ表面を、１ｘＨＢＳＰ＋（０．０１Ｍ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）ランニング緩衝剤を用いて調製する。全てのフローセルを、０．４Ｍ ＥＤＣ＋０．１Ｍ ＮＨＳを用いて活性化し、１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ４．５中の抗Ａｖｉ ｐＡｂでアミンカップリングする。次いで、表面を、０．２Ｍホウ酸緩衝剤ｐＨ８．５中の０．１Ｍ ＥＤＡでブロックした後、７５ｍＭリン酸で３回再生する。
ランニング緩衝剤として１ｇ／ＬのＢＳＡを補充した１ｘＨＢＳＰ＋を用いて、室温でマルチサイクル動力学アッセイを実施する。捕捉のために、精製されたＨＣＭＶ ｇＢタンパク質を、０．２μｇ／ｍＬに希釈し、各チャネルのフローセル２上にロードする。次いで、設計されたｇＢペプチドを、初期の結合スクリーニングのために１００μＭの濃度で注入する。陽性結合ペプチドが同定された場合、陽性ペプチドを、結合動力学を測定するために、０、５、１０、２０、５０、および１００μＭの濃度で注入する。全てのサイクルの終わりに、７５ｍＭリン酸で３回、表面を再生する。
３．ｃｒｙｏＥＭによる創薬可能部位への結合
ドメインＶ、ＭＰＲ、ＴＭおよび細胞質ドメインを欠く精製されたｇＢタンパク質（大まかに、配列番号１の残基６４２で終わる）およびその融合後形態を、この実験において使用する。タンパク質を、約２倍モル過剰のペプチドで、室温で４時間、設計されたペプチドと共にインキュベートする。次いで、試料をクライオグリッド調製にかけ、低温条件でイメージングする。再構築された構造を、ＣｒｙｏＳｐａｒｃ（Ａ．Ｐｕｎｊａｎｉ、Ｊ．Ｌ．Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ、Ｄ．Ｊ．Ｆｌｅｅｔ、Ｍ．Ａ．Ｂｒｕｂａｋｅｒ、ｃｒｙｏＳＰＡＲＣ：ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４、２９０～２９６（２０１７））またはＲｅｌｉｏｎ（Ｓ．Ｈ．Ｓｃｈｅｒｅｓ、ＲＥＬＩＯＮ：ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｂａｙｅｓｉａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １８０、５１９～５３０（２０１２））などのポピュラーな画像処理ソフトウェアによって得る。特定の創薬可能部位の結合を、融合後構造にあるような対応する位置でペプチド密度の存在によって検証する。
ドメインＶ、ＭＰＲ、ＴＭおよび細胞質ドメインを欠く精製されたｇＢタンパク質（大まかに、配列番号１の残基６４２で終わる）およびその融合後形態を、この実験において使用する。タンパク質を、約２倍モル過剰のペプチドで、室温で４時間、設計されたペプチドと共にインキュベートする。次いで、試料をクライオグリッド調製にかけ、低温条件でイメージングする。再構築された構造を、ＣｒｙｏＳｐａｒｃ（Ａ．Ｐｕｎｊａｎｉ、Ｊ．Ｌ．Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ、Ｄ．Ｊ．Ｆｌｅｅｔ、Ｍ．Ａ．Ｂｒｕｂａｋｅｒ、ｃｒｙｏＳＰＡＲＣ：ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４、２９０～２９６（２０１７））またはＲｅｌｉｏｎ（Ｓ．Ｈ．Ｓｃｈｅｒｅｓ、ＲＥＬＩＯＮ：ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｂａｙｅｓｉａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １８０、５１９～５３０（２０１２））などのポピュラーな画像処理ソフトウェアによって得る。特定の創薬可能部位の結合を、融合後構造にあるような対応する位置でペプチド密度の存在によって検証する。
他のウイルスと違って、ＣＭＶは、生涯続く感染を引き起こす。したがって、これらのＣＭＶモジュレーターまたは阻害剤を使用して、ＣＭＶ感染に罹患している対象を処置するか、または移植患者もしくは免疫不全を有する患者における感染を防止することができる。別の実施形態では、モジュレーターまたは阻害剤を使用して、ＣＭＶ感染を有する新生児を処置して、先天性ＣＭＶの兆候を防止または低減することができる。新生児における防止の処置は、妊娠女性への投与を含んでもよい。
本発明の実施形態は、以下の番号付き項目に記載される：
Ｃ１．ヒトサイトメガロウイルス(ＨＣＭＶ)感染によって引き起こされる疾患を処置または防止するための候補治療剤を同定するための方法であって、創薬可能領域を含む糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）ポリペプチドを有するＨＣＭＶと、化合物とを接触させることを含み、前記化合物の結合が、候補治療剤を示す、方法。
Ｃ２．ＨＣＭＶ感染によって引き起こされる疾患を処置または防止するための候補治療剤を同定するための方法であって、創薬可能領域を含むＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドと、化合物とを接触させることを含み、前記ｇＢポリペプチドの機能または活性のモジュレーションが、候補治療剤を示す、方法。
Ｃ３．前記ｇＢポリペプチドの活性の前記モジュレーションが、融合後コンフォメーションにあるドメインＶ結合溝へのドメインＶの結合を妨害することを含む、項目Ｃ２に記載の方法。
Ｃ４．ｇＢポリペプチドを有するＨＣＭＶの感染によって引き起こされる疾患を処置または防止するための候補治療剤を同定するための方法であって、創薬可能領域を含むｇＢポリペプチドと、化合物とを接触させることを含み、前記ウイルスの融合の阻害が、候補治療剤を示す、方法。
Ｃ５．ｇＢポリペプチドを有するＨＣＭＶの感染によって引き起こされる疾患のための候補治療剤を同定するための方法であって、創薬可能領域を含むｇＢポリペプチドと、化合物とを接触させることを含み、前記ウイルスのウイルス感染力の阻害が、候補治療剤を示す、方法。
Ｃ６．ｇＢポリペプチドを有するＨＣＭＶの感染によって引き起こされる疾患のための候補治療剤を同定するための方法であって、創薬可能領域を含むｇＢポリペプチドと、化合物とを接触させることを含み、対象における前記疾患の少なくとも１つの症状の低減が、候補治療剤を示す、方法。
Ｃ７．前記化合物が、以下のクラスの化合物：タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、抗体、核酸、および低分子から選択される、項目Ｃ１～Ｃ６のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ８．結合が、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して決定される、項目Ｃ７に記載の方法。
Ｃ９．結合が、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用して決定される、項目Ｃ７に記載の方法。
Ｃ１０．創薬可能領域が、配列番号１の残基Ｋ１３０～Ａ１３５、Ｄ２１６～Ｗ２３３、Ｒ２５８～Ｋ２６０、Ａ２６７～Ｖ２７３、Ｒ３２７～Ｄ３２９、Ｗ３４９～Ｅ３５０、Ｖ４８０～Ｋ５１８またはＮ６７６～Ｙ６９０に由来する少なくとも１個の残基を含む、項目Ｃ７に記載の方法。
Ｃ１１．創薬可能領域の残基が、融合後コンフォメーションにある、項目Ｃ１０に記載の方法。
Ｃ１２．化合物が、Ｍ６４８～Ｋ７００（配列番号２６０）、Ｍ６４８～Ｖ６９７（配列番号２６１）、Ｓ６４７～Ｖ６９７（配列番号２６２）、Ｓ６４７～Ｖ６６３（配列番号２６３）、Ｉ６５３～Ｖ６９７（配列番号２６４）、Ｉ６５３～Ｑ６９２（配列番号２６５）、Ｉ６５３～Ｌ６８０（配列番号２６６）、Ｉ６５３～Ｓ６７５（配列番号２６７）、Ｉ６５３～Ｙ６６７（配列番号２６８）、Ｒ６６２～Ｖ６９７（配列番号２６９）、Ｒ６６２～Ｑ６９２（配列番号２７０）、Ｒ６６２～Ｌ６８０（配列番号２７１）、Ｒ６６２～Ｓ６７５（配列番号２７２）、Ｌ６６４～Ｆ６７８（配列番号２７３）、Ｓ６６８～Ｖ６９７（配列番号２７４）、Ｓ６６８～Ｑ６９２（配列番号２７５）、Ｓ６６８～Ｖ６７７（配列番号２７６）、Ｄ６７９～Ｖ６９７（配列番号２７７）、Ｌ６８０～Ｖ６９７（配列番号２７８）、Ｌ６８０～Ｑ６９２（配列番号２７９）、およびＲ６９３～Ｋ７００（配列番号２８０）からなる群から選択される配列番号１の残基（Ｔｏｗｎｅ株）を含むペプチドである、項目Ｃ１～Ｃ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１３．前記化合物が、化合物のライブラリー中にある、項目Ｃ１～Ｃ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１４．前記ライブラリーが、コンビナトリアル合成法を使用して生成される、項目Ｃ１３に記載の方法。
Ｃ１５．ＨＣＭＶの糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）のドメインＶ領域と相互作用するＨＣＭＶ活性のモジュレーターである候補治療剤。
Ｃ１６．ＨＣＭＶの糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）のドメインＶの移動を妨害するＨＣＭＶ活性のモジュレーターである候補治療剤。
Ｃ１７．融合後三量体中のいずれかのサブユニットによって形成される三量体境界面のドメインＶ残基に由来する少なくとも１つの残基と相互作用することによってコンフォメーション変化の完了を妨害するＨＣＭＶ活性のモジュレーターである候補治療剤。
Ｃ１８．配列番号１に対する少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチド配列を含むＨＣＭＶ活性の阻害剤である候補治療剤。
Ｃ１９．候補阻害剤が、Ｍ６４８～Ｋ７００（配列番号２６０）、Ｍ６４８～Ｖ６９７（配列番号２６１）、Ｓ６４７～Ｖ６９７（配列番号２６２）、Ｓ６４７～Ｖ６６３（配列番号２６３）、Ｉ６５３～Ｖ６９７（配列番号２６４）、Ｉ６５３～Ｑ６９２（配列番号２６５）、Ｉ６５３～Ｌ６８０（配列番号２６６）、Ｉ６５３～Ｓ６７５（配列番号２６７）、Ｉ６５３～Ｙ６６７（配列番号２６８）、Ｒ６６２～Ｖ６９７（配列番号２６９）、Ｒ６６２～Ｑ６９２（配列番号２７０）、Ｒ６６２～Ｌ６８０（配列番号２７１）、Ｒ６６２～Ｓ６７５（配列番号２７２）、Ｌ６６４～Ｆ６７８（配列番号２７３）、Ｓ６６８～Ｖ６９７（配列番号２７４）、Ｓ６６８～Ｑ６９２（配列番号２７５）、Ｓ６６８～Ｖ６７７（配列番号２７６）、Ｄ６７９～Ｖ６９７（配列番号２７７）、Ｌ６８０～Ｖ６９７（配列番号２７８）、Ｌ６８０～Ｑ６９２（配列番号２７９）、およびＲ６９３～Ｋ７００（配列番号２８０）からなる群から選択される配列番号１の残基（Ｔｏｗｎｅ株）を含むペプチドである、項目Ｃ１５～Ｃ１８に記載の候補治療剤。
Ｃ２０．核酸である、項目Ｃ１５～Ｃ１９に記載の候補治療剤。
Ｃ２１．項目Ｃ１５～Ｃ２０のいずれかに記載の候補治療剤を含む医薬組成物。
Ｃ２２．ＨＣＭＶ感染と関連する疾患または障害を有する対象を処置する方法であって、前記対象に、項目Ｃ２１に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
Ｃ２３．対象におけるＨＣＭＶ感染と関連する疾患または障害を防止する方法であって、前記対象に、項目Ｃ２１に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
Ｃ２４．ＨＣＭＶ感染と関連する疾患または障害を処置または防止するためのキットであって、項目Ｃ２１に記載の医薬組成物と、必要に応じて、使用のための使用説明書とを含むキット。
Ｃ２５．配列番号１の残基Ｋ１３０～Ａ１３５、Ｄ２１６～Ｗ２３３、Ｒ２５８～Ｋ２６０、Ａ２６７～Ｖ２７３、Ｒ３２７～Ｄ３２９、Ｗ３４９～Ｅ３５０、Ｖ４８０～Ｋ５１８およびＮ６７６～Ｙ６９０を含む、ＨＣＭＶ ｇＢの創薬可能領域。
Ｃ２６．創薬可能領域の残基が、融合後コンフォメーションにある、項目Ｃ２５に記載のＨＣＭＶ ｇＢの創薬可能領域。
Claims (26)
- ヒトサイトメガロウイルス(ＨＣＭＶ)感染によって引き起こされる疾患を処置または防止するための候補治療剤を同定するための方法であって、創薬可能領域を含む糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）ポリペプチドを有するＨＣＭＶと、化合物とを接触させることを含み、前記化合物の結合が、候補治療剤を示す、方法。
- ＨＣＭＶ感染によって引き起こされる疾患を処置または防止するための候補治療剤を同定するための方法であって、創薬可能領域を含むＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドと、化合物とを接触させることを含み、前記ｇＢポリペプチドの機能または活性のモジュレーションが、候補治療剤を示す、方法。
- 前記ｇＢポリペプチドの活性の前記モジュレーションが、融合後コンフォメーションにあるドメインＶ結合溝へのドメインＶの結合を妨害することを含む、請求項２に記載の方法。
- ｇＢポリペプチドを有するＨＣＭＶの感染によって引き起こされる疾患を処置または防止するための候補治療剤を同定するための方法であって、創薬可能領域を含むｇＢポリペプチドと、化合物とを接触させることを含み、前記ウイルスの融合の阻害が、候補治療剤を示す、方法。
- ｇＢポリペプチドを有するＨＣＭＶの感染によって引き起こされる疾患のための候補治療剤を同定するための方法であって、創薬可能領域を含むｇＢポリペプチドと、化合物とを接触させることを含み、前記ウイルスのウイルス感染力の阻害が、候補治療剤を示す、方法。
- ｇＢポリペプチドを有するＨＣＭＶの感染によって引き起こされる疾患のための候補治療剤を同定するための方法であって、創薬可能領域を含むｇＢポリペプチドと、化合物とを接触させることを含み、対象における前記疾患の少なくとも１つの症状の低減が、候補治療剤を示す、方法。
- 前記化合物が、以下のクラスの化合物：タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、抗体、核酸、および低分子から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
- 結合が、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して決定される、請求項７に記載の方法。
- 結合が、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用して決定される、請求項７に記載の方法。
- 創薬可能領域が、配列番号１の残基Ｋ１３０～Ａ１３５、Ｄ２１６～Ｗ２３３、Ｒ２５８～Ｋ２６０、Ａ２６７～Ｖ２７３、Ｒ３２７～Ｄ３２９、Ｗ３４９～Ｅ３５０、Ｖ４８０～Ｋ５１８またはＮ６７６～Ｙ６９０に由来する少なくとも１個の残基を含む、請求項７に記載の方法。
- 創薬可能領域の残基が、融合後コンフォメーションにある、請求項１０に記載の方法。
- 化合物が、Ｍ６４８～Ｋ７００（配列番号２６０）、Ｍ６４８～Ｖ６９７（配列番号２６１）、Ｓ６４７～Ｖ６９７（配列番号２６２）、Ｓ６４７～Ｖ６６３（配列番号２６３）、Ｉ６５３～Ｖ６９７（配列番号２６４）、Ｉ６５３～Ｑ６９２（配列番号２６５）、Ｉ６５３～Ｌ６８０（配列番号２６６）、Ｉ６５３～Ｓ６７５（配列番号２６７）、Ｉ６５３～Ｙ６６７（配列番号２６８）、Ｒ６６２～Ｖ６９７（配列番号２６９）、Ｒ６６２～Ｑ６９２（配列番号２７０）、Ｒ６６２～Ｌ６８０（配列番号２７１）、Ｒ６６２～Ｓ６７５（配列番号２７２）、Ｌ６６４～Ｆ６７８（配列番号２７３）、Ｓ６６８～Ｖ６９７（配列番号２７４）、Ｓ６６８～Ｑ６９２（配列番号２７５）、Ｓ６６８～Ｖ６７７（配列番号２７６）、Ｄ６７９～Ｖ６９７（配列番号２７７）、Ｌ６８０～Ｖ６９７（配列番号２７８）、Ｌ６８０～Ｑ６９２（配列番号２７９）、およびＲ６９３～Ｋ７００（配列番号２８０）からなる群から選択される配列番号１の残基（Ｔｏｗｎｅ株）を含むペプチドである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記化合物が、化合物のライブラリー中にある、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ライブラリーが、コンビナトリアル合成法を使用して生成される、請求項１３に記載の方法。
- ＨＣＭＶの糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）のドメインＶ領域と相互作用するＨＣＭＶ活性のモジュレーターである候補治療剤。
- ＨＣＭＶの糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）のドメインＶの移動を妨害するＨＣＭＶ活性のモジュレーターである候補治療剤。
- 融合後三量体中のいずれかのサブユニットによって形成される三量体境界面のドメインＶ残基に由来する少なくとも１つの残基と相互作用することによってコンフォメーション変化の完了を妨害するＨＣＭＶ活性のモジュレーターである候補治療剤。
- 配列番号１に対する少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチド配列を含むＨＣＭＶ活性の阻害剤である候補治療剤。
- 候補阻害剤が、Ｍ６４８～Ｋ７００（配列番号２６０）、Ｍ６４８～Ｖ６９７（配列番号２６１）、Ｓ６４７～Ｖ６９７（配列番号２６２）、Ｓ６４７～Ｖ６６３（配列番号２６３）、Ｉ６５３～Ｖ６９７（配列番号２６４）、Ｉ６５３～Ｑ６９２（配列番号２６５）、Ｉ６５３～Ｌ６８０（配列番号２６６）、Ｉ６５３～Ｓ６７５（配列番号２６７）、Ｉ６５３～Ｙ６６７（配列番号２６８）、Ｒ６６２～Ｖ６９７（配列番号２６９）、Ｒ６６２～Ｑ６９２（配列番号２７０）、Ｒ６６２～Ｌ６８０（配列番号２７１）、Ｒ６６２～Ｓ６７５（配列番号２７２）、Ｌ６６４～Ｆ６７８（配列番号２７３）、Ｓ６６８～Ｖ６９７（配列番号２７４）、Ｓ６６８～Ｑ６９２（配列番号２７５）、Ｓ６６８～Ｖ６７７（配列番号２７６）、Ｄ６７９～Ｖ６９７（配列番号２７７）、Ｌ６８０～Ｖ６９７（配列番号２７８）、Ｌ６８０～Ｑ６９２（配列番号２７９）、およびＲ６９３～Ｋ７００（配列番号２８０）からなる群から選択される配列番号１の残基（Ｔｏｗｎｅ株）を含むペプチドである、請求項１５から１８に記載の候補治療剤。
- 核酸である、請求項１５から１９に記載の候補治療剤。
- 請求項１５から２０のいずれかに記載の候補治療剤を含む医薬組成物。
- ＨＣＭＶ感染と関連する疾患または障害を有する対象を処置する方法であって、前記対象に、請求項２１に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
- 対象におけるＨＣＭＶ感染と関連する疾患または障害を防止する方法であって、前記対象に、請求項２１に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
- ＨＣＭＶ感染と関連する疾患または障害を処置または防止するためのキットであって、請求項２１に記載の医薬組成物と、必要に応じて、使用のための使用説明書とを含むキット。
- 配列番号１の残基Ｋ１３０～Ａ１３５、Ｄ２１６～Ｗ２３３、Ｒ２５８～Ｋ２６０、Ａ２６７～Ｖ２７３、Ｒ３２７～Ｄ３２９、Ｗ３４９～Ｅ３５０、Ｖ４８０～Ｋ５１８およびＮ６７６～Ｙ６９０を含む、ＨＣＭＶ ｇＢの創薬可能領域。
- 創薬可能領域の残基が、融合後コンフォメーションにある、請求項２５に記載のＨＣＭＶ ｇＢの創薬可能領域。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202163153164P | 2021-02-24 | 2021-02-24 | |
| US63/153,164 | 2021-02-24 | ||
| US202263306669P | 2022-02-04 | 2022-02-04 | |
| US63/306,669 | 2022-02-04 | ||
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