ES2251832T3 - Mimotopos de la region 1 hipervariable de la glicoproteina e2 de vhc y uso de los mismos. - Google Patents
Mimotopos de la region 1 hipervariable de la glicoproteina e2 de vhc y uso de los mismos.Info
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Abstract
Mimotopos de la región 1 hipervariable de la glicoproteína E2 de VHC y uso de los mismos. La presente invención se refiere a péptidos, de forma específica a péptidos que son mimotopos de la región hipervariable 1 (HVR1) de la posible proteína E2 de la envoltura del virus de la hepatitis C (HCV). Empleando una combinación de técnicas, los presentes inventores han diseñado un gran número de péptidos con secuencias basadas en el análisis de las secuencias de consenso de HVR1 que aparecen de manera natural, y la determinación experimental de la reactividad cruzada de los anticuerpos frente a diferentes aislados, ninguno de los cuales aparece en la naturaleza. Los péptidos son útiles de forma individual para detectar y obtener anticuerpos, a efectos in vitro (por ejemplo, diagnóstico) e in vivo, y bibliotecas de péptidos que son útiles para identificar péptidos con una reactividad cruzada particular con anticuerpos capaces de enlazar una pluralidad de HVR1 procedentes de diferentes cepas de HCV.Los péptidos pueden usarse por sí mismos, como parte de proteínas de fusión, por ejemplo en polipéptidos recombinantes HCV E2, que se pueden incorporar a partículas HCV recombinantes.
Description
Mimotopos de la región 1 hipervariable de la
glicoproteína E2 de VHC y uso de los mismos.
La presente invención se refiere a péptidos, de
forma específica a péptidos que son mimotopos de la región
hipervariable 1 (HVR1) de la posible proteína E2 de la envoltura del
virus de la hepatitis C (HCV). Empleando una combinación de
técnicas, los presentes inventores han diseñado un gran número de
péptidos con secuencias basadas en el análisis de las secuencias de
consenso de HVR1 que aparecen de manera natural, y la determinación
experimental de la reactividad cruzada de los anticuerpos frente a
diferentes aislados, ninguno de los cuales aparece en la
naturaleza. Los péptidos son útiles de forma individual para
detectar y obtener anticuerpos, a efectos in vitro (por
ejemplo, diagnóstico) e in vivo, y bibliotecas de péptidos
que son útiles para identificar péptidos con una reactividad
cruzada particular con anticuerpos capaces de enlazar una
pluralidad de HVR1 procedentes de diferentes cepas de HCV. Los
péptidos pueden usarse por sí mismos, como parte de proteínas de
fusión, por ejemplo en polipéptidos recombinantes HCV E2, que se
pueden incorporar a partículas HCV recombinantes.
La región HVR1 del HCV es el fragmento antigénico
más variable de todo el genoma viral, y es el principal
responsable de la elevada heterogeneidad inter e intraindividual del
virus que infecta. Contiene un epítopo principal de
neutralización, y se ha propuesto como el principal actor del
mecanismo de escape a la respuesta inmune del huésped. Puesto que
los anticuerpos HVR1 son la única especie que ha demostrado que
posee actividad protectora, hasta la fecha, el desarrollo de una
terapia efectiva de prevención es una tarea muy difícil.
Al planear la presente invención, los inventores
resolvieron el problema de la variabilidad del HVR1 derivando un
perfil de consenso a partir de más de doscientas secuencias de HVR1
obtenidas a partir de diferentes aislados virales, y usaron este
consenso como modelo para generar un vasto repertorio de subrogados
sintéticos de HVR1. Estos se proporcionaron en forma de fusiones
con la principal proteína de recubrimiento VIII del bacteriófago
M13 para mostrar sobre la superficie de las partículas de
bacteriófago. Esta biblioteca se seleccionó por afinidad usando
muchos sueros diferentes procedentes de pacientes infectados. Se
identificaron los fagos que presentaban una frecuencia de
reactividad elevada con los sueros de los pacientes, pero no con
los sueros procedentes de controles no infectados. Se demostró que
las secuencias seleccionadas enlazaban anticuerpos del suero que
presentaban reactividad cruzada con un elevado panel de péptidos
que preproducían el HVR1 procedente de las variantes naturales de
HCV.
Se identificó en estos "mimotopos" un modelo
de secuencia responsable de la reactividad cruzada observada.
Cuando se inyectaba en los animales experimentales, los mimotopos
con la mayor reactividad cruzada indujeron anticuerpos capaces de
reconocer el mismo panel de variantes HVR1 naturales.
El Virus de la hepatitis C (HCV) el principal
agente etiológico de la hepatitis no A no B, tanto asociada a
transfusiones como esporádica en todo el mundo, con una incidencia
estimada comprendida entre 0,4 y 2% de la sangre de la población
de donantes (Choo y col., 1989). La infección con HCV lleva
a la persistencia del virus y enfermedad crónica en al menos el 70%
de los casos, entre los cuales una proporción significativa
desarrolla eventualmente cirrosis y carcinoma hepatocelular (para
una revisión, consultar H. Alter, 1995). A pesar de la
disponibilidad de ensayos serológicos fiables para el diagnóstico
de HCV, la infección adquirida en comunidad sigue siendo habitual,
y ocasiona una morbilidad y mortalidad significativa en todo el
mundo. (Mast y Alter, 1993). Además, el tratamiento con interferón,
que es la única terapia antiviral disponible en este momento, es
efectiva únicamente en el 20-30% de los pacientes
(Fried y Hoofnagle, 1995). De esta forma, el desarrollo de una
vacuna para el HCV representa un proyecto de alta prioridad en el
campo.
La elevada frecuencia con la que el virus
establece una infección persistente, a pesar de la amplia
pluralidad de respuestas inmunes mediadas por las células del
hueste, suscitó en el pasado algunas dudas acerca de la existencia
de una inmunidad protectora frente al HCV (Farci y col.,
1992). De hecho, la inmunidad protectora frente a los retos de los
virus homólogos inducida por la vacunación de chimpancés 8la otra
única especie susceptible de una infección por HCV) usando formas
recombinantes de las proteínas putativas de la cubierta E1 y E2
(Choo y col., 1994). Sin embargo, queda por establecer cuán
efectiva sería esta respuesta frente a inóculos de virus
heterólogos.
El HCV existe en la corriente sanguínea de los
pacientes infectados en forma de una quasi especie (Weiner y
col., 1991; Martell y col., 1992; Martell y col.,
1994; Kurosaki y col., 1994; Bukh y col., 1995) que
fluctúa en el curso de la enfermedad, principalmente como resultado
de la presión inmune. (Weiner y col., 1992; Kato y
col., 1993; Kojima y col., 1994; Shimizu y col.,
1994; van Doorn y col., 1995; Weiner y col., 1995). La
vista resultante es que la infección crónica por HCV no se debe a
una falta de respuesta humoral o celular, sino más bien que dichas
respuestas se vuelven inefectivas debido al elevado índice de
mutación del virus, que tiende a la producción de variantes de
escape.
Se ha documentado la existencia de anticuerpos
neutralizante y su papel en la protección de la infección viral
mediante la neutralización ex vivo de un inóculo viral de
linaje conocido antes de su inyección a chimpancés (Farci y
col., 1994). Estos anticuerpos neutralizantes y no permanentes
fueron específicos del aislado, y parecían ser capaces de bloquear
únicamente variantes virales que estaban presentes antes del inicio
de la correspondiente respuesta humoral (Farci y col.,
1994). Incluso aunque la especificidad de dichos anticuerpos
neutralizantes no estuviera bien definida, la evidencia tanto
inmunológica como molecular indican que los epitopos que reconocen
los anticuerpos neutralizantes se localizan en la región
hipervariable 1(HVR1) del genoma del HCV (Farci y
col., 1994). Esta consiste en el aminoácido número 27
N-terminal de la glicoproteína E2, la región más
variable de toda la poliproteína HCV (Weiner y col., 1991).
La prueba directa acerca del papel de los anticuerpos
anti-HVR1 en la rotura del virus vino recientemente
de experimentos de neutralización ex vivo. Un suero
hiperinmune conejo anti-HVR1 establecido frente a
la variante predominante de un inóculo infeccioso del HCV abolió su
capacidad de infección en un chimpancé, y protegió parcialmente un
segundo animal bloqueando la propagación de la variante principal
presente en el inóculo (Farci y col., 1996).
De esta forma, la evidencia es que el HVR1
contiene un determinante de neutralización principal para el HCV,
y que esto debería constituir un componente esencial de una vacuna
celular del HCV si se pudiera resolver el problema de su
variabilidad. Es relevante para este caso la observación que los
anticuerpos anti-HVR1 procedentes de sueros humanos
presentan cierto grado de reactividad cruzada para diferentes
variantes de HVR1 (Scarselli y col., 1995).
El Documento W094/26306 (Chiron Corporation)
describe un intente de identificar una secuencia de consenso entre
los HVR1 de HCV, basada en la comparación de secuencias procedentes
de 90 cepas que supuestamente se conocían como 12 May 1993. La
fórmula descrita es un péptido que incluye la siguiente secuencia:
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5aa6,
en la que aa1 es S, G, A, D, K, R o T; aa2 es L, F, I, M o W; aa3
es F o L; aa4 es cualquier aminoácido; aa5 es cualquier
aminoácido; y aa6 es G o A; con la condición que el modelo no está
contenido en la secuencia de 31 aminoácidos de la región E2HV
natural de un aislado de HCV conocido como May 12, 1993. En otra
forma de realización, aa7 está presente y ligado a aa6; siendo aa7
A, P o S. El modelo de 6 aminoácidos representa aproximadamente
55.000 secuencias diferentes. El modelo de 7 aminoácidos representa
aproximadamente 165.000 secuencias diferentes
Los aspectos de la presente invención están
basados en parte en una inspección estrecha de la variabilidad del
HVR1, que reveló que algunas posiciones del HVR1 son menos variantes
que las otras, sugiriendo que la variabilidad estructural e
inmunológica real está más limitada que la que sugiere la
heterogeneidad de la serie primaria. La invención trata en varios
aspectos de proporcionar "variantes sintéticas" del HCV HVR1
que sean inmunológicamente similares a una pluralidad, de forma
preferible a un gran número de variantes naturales del HVR1 y, por
tanto, se puedan usar para inducir anticuerpos neutralizantes que
puedan tener reactividad cruzada con variantes diferentes de HCV,
de forma preferible la mayor parte de ellas. Como se explica más
adelante con más claridad, las fórmulas a las que se llega con los
péptidos de la presente invención difieren de las que se
proporcionan en el Documento W094/26306, y se basan en puntuación
real de reactividad cruzada y no en la mera comparación de
secuencias.
Los fagos que presentan una librería de péptidos
ofrecen una oportunidad única de revisar rápidamente grandes
colecciones de secuencias peptídicas (10^{8} o más) mediante un
procedimiento cíclico de selección/rescate/amplificación. Esto
permite la identificación de ligandos para cualquier tipo de
ligando comprendido desde los péptidos lineales a regiones plegadas
de proteínas, e incluso hidratos de carbono (Cortese y col.,
1994, Cortese y col., 1996). Estos ligandos son mimotopos
verdaderos, ya que no comparten necesariamente la misma secuencia
de aminoácidos del epítopo original, sino que mimetizan sus
propiedades de enlace. Se ha informado anteriormente de una
estrategia para identificación de fagos específicos de enfermedades
que presentan mimotopos, que se aprovechan solo de sueros
clínicamente caracterizados procedentes de individuos inmunes y no
inmunes (Folgori y col., 1994). Además, los mimotopos
específicos de enfermedades han demostrado ser buenos mímicos
inmunogénicos del antígeno natural, ya que son capaces de inducir
una respuesta inmune específica frente al antígeno natural cuando
se inyecta en diferentes animales (Folgori y col., 1994, y
Meola y col., 1995, Prezzi y col., 1996, Mecchia y
col., 1996). De esta forma, se pueden usar las bibliotecas de
fagos como fuente de ligandos artificiales reconocidos por
anticuerpos específicos de enfermedades, con la ventaja que se
pueden introducir características deseables adicionales, siempre
que se puedan seleccionar durante el enriquecimiento de la
biblioteca.
En la fabricación de la presente invención, los
inventores resolvieron el problema de la variabilidad del HVR1
generando un vasto repertorio de subrogados de HVR1 en forma de
fusión con la proteína de recubrimiento principal (pVIII) del
bacteriófago M13. Usando la potencia de selección, y muchos sueros
de individuos infectados por HCV clínicamente caracterizados, se
aislaron péptidos que se revelaron como buenos mímicos antigénicos
e inmunogénicos de un gran número de variantes HCV que se producen
en la naturaleza.
Los detalles experimentales se proporcionan a
continuación.
De acuerdo con diferentes aspectos de la presente
invención se proporcionan bibliotecas de péptidos que contienen
gran número de péptidos diferentes, péptidos individuales que
contienen epitopos con reactividad cruzada respecto de una
pluralidad de epitopos HCV HVR1 y mezclas de dichos péptidos
diferentes.
Un aspecto de la presente invención proporciona
una biblioteca de péptidos conforme con el siguiente perfil de
consenso:
Este perfil representa un total de 9 x 10^{7}
secuencias individuales, es decir, un número muy cercano al límite
práctico superior (aproximadamente 10^{8}) de las técnicas
actuales de clonación y transformación del ADN. Como se describe
más adelante, este perfil de consenso se uso para la construcción
de una biblioteca del péptido 27aa clonando un oligonucleótido
sintético degenerado como fusión del extremo 5' del gen que
codifica la principal proteína de recubrimiento (pVIII) en un
vector fagémido de M13. Se selecciono extensamente la biblioteca
usando suero humano, y se seleccionaron más de cien clones
diferentes (mimotopos) por sus características para reconocer de
forma específica loa anticuerpos humanos anti
HCV-HVR1. Casi todos estos mimotopos tienen
diferentes secuencias de aminoácido, y ningún de ellos pudo
encontrarse correspondiente con un HVR1 natural publicado (hasta
enero de 1998).
En una forma de realización preferida de la
biblioteca del péptido de acuerdo con la presente invención hay al
menos 10^{5} péptidos diferentes presentes, de forma preferible al
menos 10^{6} péptidos diferentes, de forma más preferible al
menos 10^{7}, por ejemplo, 9 x 10^{7} péptidos diferentes.
Se puede mostrar una biblioteca de péptidos sobre
la superficie del bacteriófago, de manera particular bacteriófagos
filamentosos tales como fd o M13, por ejemplo como fusiones con la
proteína principal de la cubierta (pVIII) de dicho bacteriófago.
La presentación de péptidos en el fago es habitual en la técnica, y
su poder se basa en el hecho que las partículas de bacteriófago se
construyen de forma que empaquetado en el interior de cada
partícula hay un ácido nucleico que codifica el péptido mostrado en
su superficie. Tras la selección de las partículas de fago que
muestran un péptido de interés, tal como un péptido capaz de
enlazar con uno o más anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos capaces
de enlazar un número de epitopos de HVR1 de cepas diferentes de
HCV), se puede encontrar el ácido nucleico que codifica el péptido
mostrado, y se puede usar en la producción de más péptido con esa
secuencia de aminoácidos.
En el trabajo experimental que se describe más
adelante, los inventores ensayaron mimotopos en una biblioteca de
acuerdo con la presente invención con un panel de sueros humanos, y
se caracterizaron mimotopos individuales que tenían una frecuencia
global diferente de reactividad con los sueros. Los 24 clones que
únicamente habían reaccionado con menos de 3 sueros se definieron
como "débiles", mientras que los 27 que reaccionaron con más
de 11 sueros se definieron como "fuertes".
El análisis estadístico de las secuencias de
consenso de los clones "fuertes" y "débiles" llevó al
descubrimiento de una secuencia motivo en el HVR1 que se
correlacionada con la alta frecuencia de reacción con suero humano,
reactividad cruzada con anticuerpos anti HVR1 humanos e inducción
de suero con elevada reactividad cruzada en animales
experimentales.
Los péptidos de acuerdo con la presente
invención, y las mezclas de los mismos, se pueden definir como
sigue, proporcionándose más explicación de lo que sigue en la
sección experimental:
(1)-Una biblioteca de péptidos
que se describe completamente mediante la siguiente fórmula
("Fórmula I"):
que se puede escribir
como:
(aa1) T (aa3) (aa4) (aa5) GG (aa8) (aa9) (aa10)
(aa11) (aa12) (aa13) (aa14) (aa15) L (aa17) (aa18) LF (aa21) (aa22)
G (aa24) (aa25) Q (aa27)
en la que aa1 es Q o T; aa3 es H, T o R; aa4 es V
o T; aa5 es T o V; aa8 es S, V o Q; aa9 es A, Q o V; aa10 es A, G o
S; aa11 es R o H; aa12 es T, A o Q; aa13 es T, A o V; aa14 es S, H o
R; aa15 es G, S o R; aa17 es T o V; aa18 es S, G o R; aa21 es S o R;
aa22 es P, L, S o Q; aa24 es A, P o S; aa25 es S, K o Q; aa27 es N o
K.
(2) - 27 péptidos "fuertes", que se pueden
obtener a partir de dicha biblioteca son péptidos preferidos de
acuerdo con diferentes aspectos de la presente invención, teniendo
una secuencia de aminoácidos como la que sigue:
Otros péptidos descritos en el presente documento
tienen una de las siguientes secuencias:
Las letras en minúsculas se emplean para
identificar residuos de aminoácidos que varían de la fórmula 1,
mientras que los espacios subrayados se incluyen para significar
anulaciones, en comparación con la fórmula 1, encareciendo que los
aminoácidos laterales son obviamente contiguos en los péptidos
relevantes.
Existen variantes de los péptidos que se pueden
obtener a partir de una biblioteca de acuerdo con la presente
invención, sin que estén ellos mismos conformes con la Fórmula 1. Se
identificaron en el curso de los experimentos identificados más
adelantes, y se originaron por errores de PCR durante la
amplificación de la biblioteca. (Ver Materiales y Procedimientos,
"Construcción de la Biblioteca de HVR1")
(3) - Una secuencia "de consenso fuerte"
("Fórmula II") derivada del consenso de los péptidos con
elevada reactividad cruzada de (2), más arriba.
El análisis estadístico de las frecuencias de aa
en cualquier posición en 27 "fuerte" en comparación con la
frecuencia en 25 "débil" se muestra en la Tabla II, y se
discute más adelante en la sección experimental.
Fórmula
II
QT (aa3) TVGGQQS (aa11) QVHSLT (aa1 8) LF (aa21)
(aa22) G (aa24) SQN
en la que: aa3 es H o T; aa11 es H o R;
aa18 es G, S o R; aa21 es S; aa22 es P, L o Q;
aa24 es A, S o P; que se puede también escribir:
Los residuos en cursiva se incluyen porque aunque
tienen baja frecuencia, se encuentran en alguno de los mimotopos más
reactivos ensayados (destacados con un asterisco) entre los 27
péptidos "fuertes" en el II anterior.
Los 27 mimotopos usados para derivar la Fórmula
II no están en ella.
108 péptidos conforman la Fórmula II, y cada uno
es un aspecto de la invención. Las secuencias son:
Otra biblioteca de péptidos dentro de la
biblioteca de fórmula I, que incluye las secuencias de fórmula II,
definiendo 2,5 x 10^{6} secuencias, y conforme con la siguiente
Fórmula III:
Se puede proporcionar un péptido de acuerdo con
la presente invención como una fusión con otros aminoácidos. Los
aminoácidos adicionales se puede fusionar en uno o ambos
N-terminales y C-terminales del
péptido. Los aminoácidos adicionales puede ser una secuencia de
aminoácidos que no sea un fragmento de la proteína HCV E2, o puede
ser una secuencia de amino ácido que sea parte de dicha proteína.
Además, una fusión que incluye un péptido de acuerdo con la presente
invención puede incluir una proteína HCV E2/NS1 con la secuencia de
aminoácidos del péptido en la posición HVR1, es decir, tal que el
mimotopo del péptido HVR1 de la invención sustituya la secuencia
HVR1 natural. Otra forma de expresar esto es hacer referencia a una
"proteína HCV E2/NS1 recombinante en la que un péptido de la
invención sustituya el HVR1". Tal como se señala más adelante, se
proporciona el ácido nucleico que codifica los péptidos y
polipéptidos, incluyendo las fusiones, de acuerdo con la invención
como aspectos adicionales de la invención, en forma de un genoma HCV
recombinante que incluye una secuencia de nucleótidos que codifican
un péptido de la invención, por ejemplo en la secuencia de
codificación E2/NS1 para proporcionar la producción de una proteína
recombinante HCV E2/NS1 en la que se sustituye un péptido de la
invención por el HVR1 y la incorporación de una proteína
recombinante en una partícula HCV ensamblada. Una partícula
recombinante HVC que incluye uno o más péptidos se describe por
tanto en el presente documento.
Por lo general, un péptido de acuerdo con la
presente invención es inmunogénico, o capaz de despertar una
respuesta inmune tras la administración a un individuo o incluye un
epítopo que tiene una reactividad inmunológica cruzada con un
epítopo de varias cepas de HCV.
Otro aspecto de la presente invención proporciona
un procedimiento para obtener uno o más péptidos que contienen un
epítopo que tiene una reactividad inmunológica cruzada con un
epítopo de HVR1 de varias cepas de HCV, el procedimiento incluye
poner en contacto una biblioteca de péptidos como se ha descrito y
una molécula de anticuerpo capaz de ligar dicho HVR1 de una cepa
HCV, y seleccionar uno o más péptidos de la biblioteca capaces de
enlazar con dicha molécula de anticuerpo.
El péptido o péptidos seleccionados pueden
contener un epítopo que tiene una reactividad inmunológica cruzada
con el HVR1 o con varias cepas de HCV.
Dicho procedimiento puede incluir poner en
contacto una biblioteca de péptidos y una pluralidad de moléculas de
anticuerpo que sean capaces colectivamente de enlazar el HVR1 de
varias cepas de HCV. En una forma de realización, dicha pluralidad
de moléculas de anticuerpo se deriva de sueros de individuos
infectados con HCV.
Como se cita, dicha librería se puede mostrar
sobre la superficie del bacteriófago, cada partícula hay un ácido
nucleico que codifica el péptido mostrado en su superficie. Tras la
selección, se puede tomar el ácido nucleico de la partícula de fago
que codifica el péptido mostrado. El ácido nucleico con la secuencia
de ácido nucleico tomada de la partícula de bacteriófago que
presente dicho péptido seleccionado puede usarse en la producción de
dicho péptido mediante la expresión (usando la tecnología de ADN
recombinante habitual en la técnica y que se discute más ampliamente
a continuación).
Un péptido con la secuencia de aminoácidos de
dicho péptido seleccionado se puede proporcionar de manera aislada,
por ejemplo, tras su producción por expresión del ácido nucleico
codificante. Como se indica más ampliamente a continuación, se
pueden proporcionar uno o más péptidos de acuerdo con la presente
invención mediante síntesis de péptidos.
Se puede proporcionar de forma aislada una
pluralidad de péptidos, cada uno con la secuencia de aminoácidos de
un péptido diferente seleccionado, de forma individual o en una
mezcla.
Un péptido seleccionado o péptidos seleccionados
pueden cada uno tener una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la
Fórmula dos anteriormente proporcionada. Todos los 108 péptidos
diferentes de acuerdo con la Fórmula II se pueden proporcionar como
una mezcla, y además cada uno representa de forma individual un
aspecto de la presente invención. Cada péptido de estos 108 tiene
una elevada probabilidad de tener reactividad cruzada con epitopos
del HVR1 de la proteína E2/NS2 de varias cepas de HCV, y por tanto
son particularmente útiles para obtener anticuerpo que despertar de
cualquier otra forma una respuesta inmune.
Una composición de acuerdo con la presente
invención puede incluir una pluralidad de péptidos, que se pueden
obtener a partir de una mezcla de los 108 péptidos de Fórmula II.
Dicha composición puede incluir entre 2 y aproximadamente 20, 15,
10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 ó 3 péptidos diferentes que se pueden obtener a
partir de dicha mezcla.
Los péptidos preferidos que se pueden
proporcionar en una mezcla o de forma individual incluyen los
denominados G31, F78, R9, D6, M122 y H1, cuyas secuencias de
aminoácidos se muestran en la Figura 7(A). Las mezclas
preferidas incluyen los péptidos R9, F78, Hl y D6 ("MIX1"),
incluye los péptidos M122 y G31 ("MIX2"), o incluye los
péptidos G31, F78, R9, D6, M122 y H1 ("MIX3").
La reactividad cruzada inmunológica de cada
péptido de la invención con el HVR1 de cepas de HCV se puede evaluar
de forma experimental, como se ejemplifica más adelante. Se pueden
fabricar diferentes mezclas de estos péptidos, y ensayarse de forma
similar, de nuevo como se ejemplifica más delante de forma
experimental.
Los péptidos y polipéptidos lineales y
ramificados, (por ejemplo, MAP) (por ejemplo, moléculas de fusión
que incluyen un péptido, como se ha descrito) de acuerdo con la
presente invención se pueden fabricar usando cualquiera de las
diferentes técnicas a la disposición de una persona experta en la
técnica.
Los péptidos lineales y ramificados se pueden
sintetizar usando química de péptidos normalizada, tal como los
procedimientos habituales que emplean Fmoc
(Fluorenilmetil-ossicarbonil) t-Bu
(tert-butil), según se describe en Atherton y
Sheppard (1989), Solid Phase Peptide Synthesis, a
Practical Approach, IRL Press, Oxford.
Una forma conveniente de producir un péptido o
polipéptido de acuerdo con la presente invención es expresar un
ácido nucleico que lo codifique, usando el ácido nucleico en un
sistema de expresión.
De acuerdo con ello, la presente invención
también abarca un procedimiento para fabricar un péptido o
polipéptido (según se ha descrito), el procedimiento incluye la
expresión a partir de un ácido nucleico que codifica el péptido o
polipéptido (por lo general, ácido nucleico de acuerdo con la
invención). Esto se puede conseguir de forma conveniente haciendo
crecer un cultivo de células huésped que contienen dicho vector en
las condiciones apropiadas que den lugar o permitan la expresión del
polipéptido. Los péptidos y polipéptidos también se pueden expresar
en sistemas in vitro tales como un lisato de
reticulocito.
Los polinucleótidos que codifican péptidos y
polipéptidos de acuerdo con la presente invención se describen en el
presente documento.
De esta forma, se describe un polinucleótido que
codifica un péptido como el que se ha descrito. Se describe también
un polinucleótido que codifica una fusión como se ha descrito, de
forma particular una proteína HCV E2/NS1 que incluye una secuencia
de nucleótidos que codifica un péptido de la invención en la
posición HVR1. Se describe también un genoma HCV recombinante que
incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de
acuerdo con la invención o una fusión como se ha descrito, de manera
particular una proteína HCV E2/NS1 con la secuencia de aminoácidos
del péptido relevante en la posición HVR1.
Se describe también un polinucleótido que incluye
diferentes secuencias de nucleótidos que codifican péptidos o
polipéptidos de acuerdo con la invención. Esto permite la producción
de una mezcla de péptidos o polipéptidos en una reacción de
expresión.
El ácido nucleico que codifica un péptido o
polipéptido de acuerdo con la presente invención se puede usar en
inmunización con ácidos nucleicos con e objetivo de despertar una
respuesta inmune en un mamífero, tal como un individuo humano a
efectos terapéuticos o profilácticos, o un mamífero no humano para
el mismo objetivo o con el objetivo de producir anticuerpos para
posterior manipulación y/o uso (por ejemplo, para el diagnóstico de
en contextos terapéuticos, tal como se describe más ampliamente a
continuación).
El ácido nucleico que codifica un péptido o
polipéptido de acuerdo con la presente invención se puede usar en un
procedimiento de terapia génica para la prevención o tratamiento de
una infección de HCV. Esto requiere el uso de elementos regulatorios
adecuados para la expresión, y un vector adecuado para liberar la
unidad de expresión (secuencia de codificación y elementos de
regulación) a las células huésped. Se conocen en la técnica
diferentes vectores, tanto vectores virales como vectores de
plásmidos, consultar por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos
Nº. 5.252.479 y el Documento WO 93/07282. De manera particular, se
ha usado diferentes virus como vectores de transferencia genética,
entre los que se incluyen los papovavirus, tales como los SV40,
virus vaccinia, virus del herpes, incluyendo HSV y EBV, y los
retrovirus. Muchos protocolos de terapia génica de la técnica
anterior han usado retrovirus de murina desactivados. Se han
desarrollados numerosos adenovirus y vectores virales
adenoasociados. Entre las alternativas a los vectores virales se
incluye la transferencia mediada por liposomas y captación directa
de ADN y transferencia de ADN mediada por el receptor.
Las células huésped que contienen ácido nucleico
que codifica un péptido o polipéptido (o mezcla de los mismos) de
acuerdo con la presente invención pueden ellos mismos usarse en
tratamiento terapéutico o profiláctico de individuos para o contra
la infección por HCV (es decir, tratamiento terapéutico de un
individuo por una infección por HCV o un tratamiento profiláctico de
un individuo antes de la infección por HCV).
El ácido nucleico se proporciona por lo general
en forma de ADN o ARN, que puede incluir uno o más análogos de
nucleótidos, y que puede ser sintético en todo o en parte. Las
moléculas y vectores de ácido nucleico de acuerdo con la presente
invención pueden proporcionarse en forma en forma de aislados y/o
forma purificada, por ejemplo, en forma sustancialmente pura u
homogénea. El término "aislado" se puede usar para reflejar
todas estas posibilidades. Cuando se especifica una secuencia de
ADN, por ejemplo, con referencia a una figura, a no ser que el
contexto requiera otra cosa, se incluye el ARN equivalente, con U
sustituyendo la T donde se encuentre.
Cuando se desea expresar un péptido o polipéptido
a partir del ácido nucleico que codifica, el ácido nucleico incluye
las secuencias reguladoras de control apropiadas. Los vectores
adecuados se pueden elegir o construir, conteniendo las secuencias
de regulación apropiadas, incluyendo secuencias de promotor,
fragmentos de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias
de mejora, genes marcadores según sea apropiado. Los vectores pueden
ser plásmidos, por ejemplo fagos o fagémidos, según sea apropiado,
Para más detalles, consultar, por Ejemplo, Molecular Cloning: a
Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook y col., 1989, Cold
SpringHarbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos
conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, para
la preparación de constructos de ácido nucleico, mutagénesis,
secuenciación, introducción de ADN en células y expresión del gen, y
el análisis de proteínas, se describen con detalle en Current
Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col. eds., John
Wiley & Sons,
1992.
1992.
Se conocen los sistemas de clonación y expresión
de un polipéptido en una pluralidad de diferentes células huésped.
Entre las células huésped adecuadas se encuentran bacterias, células
eucariotas tales como células de mamífero, y sistemas de
baculovirus. Las líneas de células de mamífero disponibles en la
técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen
células de ovario de hámster chino, células HeLa, células de hígado
de cría de hámster, células COS y muchas otras. Una bacteria
preferida habitual es E. coli.
Otro aspecto de la presente invención proporciona
una célula huésped que contiene un ácido nucleico como el que se
describe en el presente documento. El ácido nucleico de la invención
se puede integran en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula
huésped. La integración se puede estimular por inclusión de
secuencias que estimulan la precombinación con el genoma, de acuerdo
con técnicas normalizadas. El ácido nucleico puede estar en un
vector extracromosómico contenido en la célula.
Otro aspecto adicional proporciona un
procedimiento que incluye la introducción de un ácido nucleico en
una célula huésped. La introducción, que se puede (de forma
particular para la introducción in vitro) denominar sin
limitación "transformación", puede emplear cualquier técnica
disponible. Para las células eucarióticas, las técnicas adecuadas
pueden incluir la transfección con fosfato de calcio,
DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada
por liposomas y transducción usando retrovirus u otros virus, por
ejemplo vaccinia, o para células de insecto, baculovirus. Para
células bacterianas, las técnicas adecuadas incluyen la
transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección
usando bacteriófagos. Como alternativa, se puede emplear la
inyección directa de ácido nucleico. Se pueden usar genes marcadores
tales como genes de resistencia a un antibiótico o genes de
sensibilidad para identificar los clones que contienen ácido
nucleico de interés, tal como se conoce bien en la técnica.
La introducción puede ir seguida de causar o
permitir la expresión a partir del ácido nucleico, por ejemplo,
cultivando células huésped (que puede incluir células realmente
transformadas aunque con más seguridad, las células serán
descendientes de las células transformadas) bajo condiciones que
expresan el gen, de forma que se produzca el péptido o polipéptido
codificado. Si el péptido o polipéptido se expresa acoplado con un
péptido líder señal apropiado, se puede secretar desde la célula al
medio de cultivo. Tras la producción por expresión, se puede aislar
un péptido o polipéptido y/o purificarse desde la célula huésped y/o
el medio de cultivo, como puede ser el caso, y posteriormente se
usa como se desee, por ejemplo, en la formulación de una composición
que puede incluir uno o más componentes adicionales, tal como una
composición farmacéutica que incluye uno o más excipientes o
vehículos farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, ver más
adelante).
Un péptido o polipéptido de acuerdo con la
presente invención se puede usar como inmunogeno o de otra forma
para obtener anticuerpos enlazantes. Los anticuerpos son útiles en
la purificación y otras manipulaciones de polipéptidos y péptidos,
selección en diagnóstico y contextos terapéuticos, incluyendo la
inmunización pasiva. Esto se describe más delante de manera más
amplia.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente
invención se proporciona un procedimiento para obtener una o más
moléculas de anticuerpo que contienen un emplazamiento de enlace
capaz de enlazar con un epítopo en el HVR1 o en varias cepas de HCV,
el procedimiento incluye poner en contacto una población de
moléculas de anticuerpo y un péptido de acuerdo con la presente
invención, y seleccionar una o más moléculas de anticuerpo entre la
población capaz de enlazar con dicho péptido.
El procedimiento puede implicar poner en contacto
la población de anticuerpos con una pluralidad de péptidos de
acuerdo con la invención.
Como se indica, los péptidos se puede
proporcionar un una fusión con más aminoácidos.
Los péptido o péptidos se pueden administrar a un
mamífero no humano para ponerlo en contacto con una población de
moléculas de anticuerpo producidas por el sistema inmunológico del
mamífero, seguidamente una o más moléculas de anticuerpo capaz de
enlazar con el péptido o péptidos se pueden extraer del mamífero, o
se pueden extraer del mamífero las células que producen dichas
moléculas de anticuerpo.
El mamífero puede ser sacrificado.
Si las células se extraen del mamífero, las
moléculas de anticuerpo se pueden extraer de dichas células, o de
descendientes de las mismas. Dichos descendientes en particular
pueden incluir células de hibridoma.
En lugar de, o así como para inmunizar un animal,
un procedimiento para obtener anticuerpos como el que se describe
puede implicar mostrar la población de anticuerpos sobre la
superficie de partículas de bacteriófago, cada partícula contiene un
ácido nucleico que codifica la molécula de anticuerpo mostrada en su
superficie. Se puede extraer el ácido nucleico de una partícula de
bacteriófago capaz de enlazar con un péptido o péptidos de interés,
para manipulación y/o uso en la producción de una molécula
codificada de anticuerpo o un derivado de la misma (por ejemplo, una
proteína de fusión, una molécula que incluye una región constante y
otro aminoácido, y así sucesivamente). En lugar de usar
bacteriófagos para mostrar, se pueden usar ribosomas o polisomas,
por ejemplo según se describe en los Documentos
US-A-5643768,
US-A-5658754, W095/11922.
Se pueden proporcionar las moléculas de
anticuerpo en forma aislada, ya sea de manera individual o en una
mezcla. Se pueden proporcionar en forma aislada varia moléculas de
anticuerpo.
Se aíslan los anticuerpos preferidos de acuerdo
con la invención, en el sentido de estar libre de contaminantes
tales como anticuerpos capaces de enlazar otro polipéptidos y/o
componentes libres del suero. Se prefieren los anticuerpos
monoclonales en algunos casos, aunque los anticuerpos policlonales
quedan comprendidos en el alcance de la presente invención. Por
ello, las mezcla policlonales capaces de enlazar con uno o más
péptidos o polipéptidos de acuerdo con la presente invención se
prefieren en algunas formas de realización, según se describe. Así,
se describe una mezcla de diferentes anticuerpos capaces de enlazar
con uno o más péptidos o polipéptido de acuerdo con la intención.
Dicha muestra se puede proporcionar en una composición, incluyendo
al menos un componente adicional, como un vehículo o excipiente
farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también se extiende a los
procedimiento para obtener y/o aumentar anticuerpo a uno o más
péptidos o polipéptidos de la invención. Dichos procedimientos
pueden incluir la administración de un péptido o polipéptido o
mezcla de péptidos o polipéptidos a un mamífero con el fin de
despertar una respuesta de anticuerpos. Para la producción de
anticuerpos o células productoras de anticuerpos que se van a aislar
y usar para cualquiera de diferentes objetivos, se puede incluir una
etapa de sacrificio del animal no humano. Dicho mamífero no humano
puede ser, por ejemplo, ratón, rata, conejo, perro, cerdo, caballo,
mono, cabra, oveja, camello, mono del Viejo Mundo, chimpancé u otro
primate. Los anticuerpos se pueden se pueden obtener a partir de
animales inmunizados usando una cualquiera de las diferentes
técnicas conocidas en el técnica, y seleccionarse, de forma
preferible usando en enlace un anticuerpo con el péptido o
polipéptido de interés, Por ejemplo, se pueden usar técnicas de
inmunoprecipitación o de Western blotting (Armitage et al,
Nature, 357: 80-82,1992).
La producción de anticuerpos policlonales y
monoclonales está bien establecida en la técnica. Los anticuerpos
monoclonales se pueden someter a las técnicas de tecnología del ADN
recombinante para producir otros antibióticos o moléculas
quiméricas que retienen la especificidad del anticuerpo original.
Dichas técnicas pueden implicar la introducción de ADN que codifica
la región variable de inmunoglobulina, o las regiones determinantes
complementarias (CDR), o un anticuerpo en las regiones constantes, o
regiones constantes más regiones marco, de una inmunoglobulina
diferente. Consultar, por ejemplo, los Documentos
EP-A-184187,
GB-A-2188638 o
EP-A-239400. Se describen también en
el presente documento los anticuerpos humanizados, en los que se
injertan CDR procedentes de una fuente no humana se las regiones
marco humanas, típicamente con alteración de parte de los residuos
de aminoácidos marco, para proporcionar anticuerpos que son menos
inmunogénicos que los anticuerpos no humanos parientes. Un hibridoma
que produce un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente
invención se puede someter a mutación genética u otros cambios, que
pueden alterar o no la especificidad de enlace de los anticuerpos
introducidos. La clonación y expresión de los anticuerpos genéricos
se describe en los Documentos A0120694 y
EP-A-0125023.
Como alternativa o complemento para inmunizar un
mamífero con un cuerpo, se puede obtener un anticuerpo específica
para una proteína a partir de una librería de regiones variables de
inmunoglobulina expresada que se produce de forma recombinante por
ejemplo, usando bacteriófagos que muestran regiones de enlace
funcionales con la inmunoglobulina sobre sus superficies, -por
ejemplo consultar el Documento W092/01047- o los ribosomas /
polisomas, tal como se ha definido anteriormente. La librería puede
ser no experimentada, esto es, construida a partir de secuencias que
se obtienen a partir de un organismo que no se ha inmunizado frente
a ninguna de la proteínas (o fragmentos), o puede ser una que se
construye usando secuencias obtenidas a partir de un organismo que
se ha expuesto al antígeno de interés.
Los anticuerpos de acuerdo con la presente
invención se pueden modificar de varias formas. Así, se debe
entender que el término "anticuerpo" comprende cualquier
sustancia enlazante que tiene una región de enlace con la necesaria
especificidad. De esta forma, la invención abarca fragmentos de
anticuerpos, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de
anticuerpos, incluyendo moléculas sintéticas y moléculas cuya forma
mimetiza la de un anticuerpo que permite enlazarla con un antígeno o
epítopo.
Entre los fragmentos de ejemplo de anticuerpo,
capaces de enlazar con un antígeno u otro compañero de enlace se
encuentra el fragmento Fab que consiste de las regiones VL, VH, Cl y
CH1, el fragmento Fd que consiste de las regiones VH y CH1, el
fragmento Fv que consiste de las regiones VL y VH de un único brazo
de un anticuerpo; el fragmento dAb que consiste de una región VH;
regiones CDR aisladas y fragmentos F(ab') 2, un fragmento
bivalente que incluye dos fragmentos Fab enlazados mediante un
puente disulfuro a la región impedida. También se incluyen
fragmentos sencillos de Fv.
Los hibridomas capaces de producir anticuerpos
con las características de enlace deseadas quedan dentro del alcance
de la presente invención, como células huésped, eucariotas o
procariotas, que contienen anticuerpos que codifican ácidos
nucleicos (incluyendo fragmentos de anticuerpo), y capaces de su
expresión. La invención también proporciona un procedimientos de
producción de los anticuerpos que incluye hacer crecer una célula
capaz de producir el anticuerpo en condiciones en los que se
produzca, y de forma preferible se secrete, el anticuerpo.
Las reactividades de los anticuerpos en una
muestra (por ejemplo, en un ensayo de diagnóstico) se pueden
determinar por medios apropiados. El marcado con moléculas
indicadoras individuales es una posibilidad. Las moléculas
indicadoras pueden generar, de forma directa o indirecta, señales
detectables, de forma preferible que se pueden medir. El enlace de
moléculas indicadoras puede ser directo o indirecto, covalente, por
ejemplo, mediante un enlace peptídico, o no covalente. El enlace
mediante un enlace peptídico puede ser el resultado de una expresión
recombinante de un gen de fusión que codifica el anticuerpo y la
molécula indicadora.
Un modo favorito es el enlace covalente de cada
anticuerpo con un tinte de fluorocromo, fósforo o láser individual
que aísle espectralmente las propiedades de absorción o emisión.
Entre los fluorocromos adecuados se incluyen fluoresceína, rodamina,
ficoeritrina y Rojo Texas. Entre los tintes cromogénicos adecuados
se incluye diaminobencidina.
Otros indicadores incluyen partículas
macromoleculares coloidales o material particulado tal como perlas
de látex coloreadas, magnéticas o paramagnéticas, y agentes activos
biológica o químicamente que pueden causar directa o indirectamente
señales que se pueden observar visualmente, detectarse
electrónicamente o registrarse de alguna otra forma. Estas moléculas
pueden ser enzimas que catalizan reacciones que desarrollan o
cambian colores, u originan cambios en las propiedades eléctricas,
por ejemplo. Pueden excitarse molecularmente, si las transiciones
electrónicas entre estados de energía dan como resultado absorciones
o emisiones espectrales características. Pueden incluir entidades
químicas usadas junto con biosensores. Se pueden emplear los
sistemas de detección biotina/avidina o biotina/estreptavidina y
fosfatasa alcalina.
El modo de determinar el enlace no es una
característica de la presente invención y los expertos en la técnica
son capaces de elegir el modo adecuado de acuerdo con sus
preferencias y conocimientos generales.
Los anticuerpos de acuerdo con la presente
invención se pueden usar en selección para la presencia de un
péptido o polipéptido, por ejemplo en una muestra de ensayo que
contienen células o un lisato de células como se ha descrito, y se
puede usar en la purificación o asilado de un péptido o polipéptido
de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, tras la
producción del polipéptido por expresión a partir de la expresión de
la secuencia de ácido nucleico que codifica la misma.
Los anticuerpos son también útiles en profilaxis,
mediante inmunización pasiva, y en terapia. Cuando se van a
administrar anticuerpos, puede ser preferible incluir una mezcla de
anticuerpos, tales como anticuerpos que tienen reactividad cruzada
colectiva con diferentes péptidos de acuerdo con la presente
invención.
Los anticuerpos que enlazan con un péptido de
acuerdo con la presente invención pueden usarse por sí mismos como
inmunógenos en la producción de anticuerpos
anti-idiotípicos. Se pueden usar para mimetizar un
epítopo de péptido para despertar una respuesta inmune en un
individuo, por ejemplo, con objetivos terapéuticos y/o
profilácti-
cos.
cos.
Se puede proporcionar una anticuerpo en forma de
kit, que puede incluir instrucciones para uso del anticuerpo, por
ejemplo, en la determinación de la presencia de una sustancia
concreta en una muestra de ensayo. se puede incluir uno o más
reactivos, tales como moléculas marcadoras, soluciones tampón,
eluyentes, y otros. Los reactivos se pueden proporcionar en el
interior de contenedores que los protejan del ambiente externo, tal
como un vial sellado.
Los procedimientos de diagnóstico hacen uso de
muestras biológicas procedentes de individuos que pueden contener
una o más cepas de HCV. Entre los ejemplos de muestras biológicas se
incluyen plasma, suero, orina y saliva, y muestras de tejido.
Existen diferentes procedimientos para determinar
la presencia o ausencia, en una muestra de ensayo, de un péptido o
polipéptido concreto, incluyendo procedimientos en los que el
polipéptido a detectar es un anticuerpo.
Se puede ensayar una muestra respecto de la
presencia de un miembro de enlace específico, tal como un anticuerpo
(o mezcla de anticuerpos), dirigido a uno o más péptidos de la
invención.
Los péptidos de acuerdo con la presente invención
se pueden usar para determinar la presencia o ausencia de
anticuerpos frente a cepas de HCV en muestras de ensayo, por
evaluación del enlace de los péptidos a anticuerpos
anti-HCV E2 HVR1, si están presentes en la
muestra.
En teoría es posible identificar la presencia en
una muestra de un compañero de enlace de un miembro específico de
enlace tal como un anticuerpo (o mezcla de anticuerpos) dirigido a
uno o más péptidos de la invención. Sin embargo, hasta la fecha
nadie ha tenido éxito en asilar viriones de HCV a partir de una
muestra humana. En el futuro, debería probarse como posible la
identificación de viriones de HCV en una muestra humana y/o detectar
dichos viriones de forma inmunológica, los péptidos de la invención
y de manera particular los anticuerpos dirigidos a los anteriores
será útiles en dicha detección.
Para la detección de anticuerpos a HCV, se puede
ensayas una muestra biológica o de otro tipo poniéndola en contacto
con uno o más péptidos de la invención en condiciones apropiadas
para una enlace específico, antes de que se determine en enlace, por
ejemplo usando un sistema indicador como se ha descrito. Cuando se
usa un panel de péptidos, se pueden emplear diferentes marcadores
indicadores para cada péptido, de forma que se puede determinar el
enlace de cada uno.
Se puede usar un miembro específico de enlace tal
como un péptido para asilar y/o purificar su anticuerpo compañero de
enlace a partir de una muestra de ensayo, para permitir el análisis
de la secuencia y/o bioquímico del anticuerpo. La secuenciación de
aminoácidos es rutinaria en la técnica usando equipos automáticos de
secuencia-
ción.
ción.
Un inmunoensayo típico puede implicar incubar una
muestra de ensayo con los péptidos de acuerdo con la invención en
condiciones que permitan la formación de inmunocomplejos, si está
presente en la muestra el anticuerpo apropiado, y detectar la
presencia o ausencia del inmunocomplejo.
Como se ha descrito, aunque no es técnicamente
factible en este momento, en principio se pueden usar los
anticuerpos de acuerdo con la presente invención para determinar
cepas de HCV en muestras de ensayo, por evaluación del enlace de
los anticuerpos con los epitopos de E2HVR1, si están presentes en
las muestras.
Un inmunoensayo típico puede implicar incubar una
muestra de ensayo con péptidos o anticuerpos
anti-idiotípico de acuerdo con la invención en
condiciones que permitan la formación de inmunocomplejos si está
presente en la muestra un anticuerpo apropiado, y detectar la
presencia o ausencia de inmunocomplejo.
Se puede ensayar una muestra para la presencia de
un anticuerpo dirigido a uno o más péptidos de la invención,
usando uno o más de dichos péptidos (o polipéptido que incluye dicho
péptido) o uno o más anticuerpos
anti-idiotípicos.
Se puede ensayar una muestra biológica o de otro
tipo poniéndola en contacto con un péptido o polipéptido o
anticuerpo anti-idiotípico en condiciones apropiadas
de enlace específico, antes de que el enlace se determine, por
ejemplo usando un sistema de marcadores como se ha descrito.
La detección de la formación de un complejo de
enlace en un inmunoensayo de acuerdo con la presente invención se
puede llevar a cabo usando cualquier técnica disponible sin
limitación para el alcance de la invención. Se han descrito
anteriormente varias técnicas adecuadas con referencia al marcado
de los anticuerpos. Los ensayos pueden implicar la inmovilización
del anticuerpo o péptido, según el caso, sobre una fase sólida
adecuada o soporte, tales como partículas de látex, perlas
magnéticas o no magnéticas, una membrana, oblea, superficie de
plástico, metal silicona o vidrio, o cualquier otro material a
disposición de la persona experta. Se pueden incluir uno o más
controles apropiados, de acuerdo con la práctica normalizada.
Como se ha descrito anteriormente, los péptidos,
polipéptidos, anticuerpos y ácido nucleico de acuerdo con la
presente invención se pueden formular en composiciones, y son útiles
en contextos farmacéuticos. Estas composiciones pueden incluir,
además de una de las sustancias anteriores, un vehículo, portador,
tampón, estabilizante u otros materiales farmacéuticamente
aceptables, bien conocidos de los expertos en la técnica. Dichos
materiales deberían no ser tóxicos, y no deberían interferir con la
eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del
vehículo u otro material dependerá de la ruta de administración, por
ejemplo ruta rutas oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal,
intramuscular, intraperitoneal.
Las composiciones para administración oral pueden
estar en forma de comprimidos, cápsulas, polvo o líquido. Un
comprimido puede incluir un vehículo sólido tal como gelatina o un
coadyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas incluyen por
lo general un vehículo líquido tal como agua, vaselina, aceites
animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Se pueden
incluir soluciones salinas fisiológicas, dextrosa u otra solución
de sacáridos, o glicoles como etilén glicol, propilén glicol o
polietilén glicol.
Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea,
el ingrediente activo estará en a forma de una solución acuosa
parenteralmente aceptable que esté libre de pirógenos y tenga un pH,
isotonicidad y estabilidad adecuadas. Aquellos especialmente
expertos en la técnica están bien capacitados para preparar
soluciones adecuadas usando, por ejemplo vehículos isotónicos tales
como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer inyección
de Ringer con lactato. También se pueden incluir si son necesarios
conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidante y/u otros
aditivos.
Los péptidos ramificados, tales como MAP (Tam, J.
P, 1988) se pueden usar en la preparación de inmunogenes, ya sea
solos o enlazados con un vehículo apropiado.
Un péptido linear usado para desencadenar una
respuesta inmune se puede también enlazar con un vehículo
apropiado. Se conocen en la técnica diferentes procedimiento para
acoplar pépticos a otras moléculas, entre los que se incluyen
reactivos que forman puentes disulfuro -o se añade cisteína al
péptido con este objetivo), agentes que forman pares tio-éter, y
otros. Entre los vehículos se incluye albúmina de suero humana
(HSA), toxoide del tétano, otras proteínas más bien grandes que
tengas vidas medias razonables en condiciones fisiológicas, y
moléculas no proteínicas estables tales como polisacáridos y
copolímeros de aminoácidos.
Se puede incluir un coadyuvante, tal como alud,
emulsiones de aceite en agua, o coadyuvante de Freund (completo o
incompleto). Se pueden usar citoquinas para potenciar la inmunogenia
de una composición de péptido o polipéptido.
Las secuencias de mimotopo se pueden clonar en el
contexto de la proteína (E2) de la cubierta del HCV con el fin de
usar en entorno plegado de forma natural para la presentación
correcta del epítopo o epitopos al sistema inmunológico.
Se puede usar ADN desnudo para inmunización
(consultar por ejemplo, Cohen, J, 1993), y se pueden clonar una o
más secuencias de mimotopo en los vectores adecuados (consultar por
ejemplo, Major y col., 1995).El ADN desnudo se puede
liberar usando inyección directa, o mediante el uso de pistolas de
genes (Yang y col., 1990) o cualquier técnica adecuada.
Ya sea un a polipéptido, anticuerpo, péptido,
molécula de ácido nucleico, molécula pequeña u otro compuesto
farmacéutico de acuerdo con la presente invención que se vaya a
proporcionar a un individuo, la administración puede ser en una
cantidad inmunogénica, esto es, en cantidad suficiente para
despertar una respuesta inmune (particularmente de anticuerpos) en
el individuo, o en una "cantidad profilácticamente efectiva"
(según sea el caso, aunque la profilaxis puede considerarse una
terapia). Un efecto profiláctico es suficiente para potenciar la
respuesta inmune de un individuo respecto de un desafío con HCV,
polipéptido de E2HV, o péptido de HVR1, o tras una infección con
HCV, de forma preferible en el último caso (infección por HCV)
suficiente para antagonizar dicha infección, en todo o en parte. De
forma más preferible, el efecto es suficiente para evitar que el
individuo padezca uno o más síntomas clínicos como resultado de la
consiguiente infección por HCV, y/o proteger el individuo de la
hepatitis C. Un efecto terapéutico es suficiente para potenciar la
respuesta inmune del individuo a una infección por HCV
preexistente, de forma preferible suficiente para antagonizar la
infección, en todo o en parte. LO más preferible, el efecto es
suficiente para mejorar uno o más síntomas clínicos, y/o curar la
hepatitis C y/o reducir el título vírico en el individuo- La
cantidad real administrada, y la tasa y calendario de
administración, dependerá de la naturaleza y gravedad de lo que se
esta tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las
decisiones acerca de la dosificación, etc., queda dentro de la
responsabilidad de los generalistas otros doctores, y normalmente
tiene en cuenta la enfermedad a tratar, el estado del paciente
individual, el punto de liberación, el procedimiento de
administración, y otros factores conocidos de los médicos a cargo
de los pacientes. Los ejemplos de las técnicas y protocolos
anteriormente mencionados se pueden encontrar en Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980.
Otros aspectos de la invención proporcionan
composiciones farmacéuticas que incluyen dicho péptido, mezcla de
péptidos, molécula de anticuerpo o mezcla de moléculas de
anticuerpo, y el uso de dicho péptido, mezcla de péptidos,
molécula de anticuerpo o mezcla de moléculas de anticuerpo en la
fabricación de un medicamento para administración, por ejemplo en
un procedimiento para fabricar un medicamento o composición
farmacéutica que incluye la formulación del miembro específico de
enlace con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Se puede administrar una composición sola o en
combinación con otros tratamientos, ya sea de forma simultánea o
secuencial dependiendo de la enfermedad a tratar y de la
disponibilidad de tratamientos adicionales o alternativos.
Un aspecto de la presente invención proporciona
el uso de un péptido como el que se describe en la fabricación de
un medicamento para producir anticuerpos de mamífero capaces de
enlazar con los epitopos de HCV HVR1.
Se describe un procedimiento para inmunizar de
forma pasiva un mamífero frente a una infección por HCV, el
procedimiento incluye la administración de un péptido o mezcla de
péptidos al mamífero.
Se describe también un procedimiento para
inmunizar un mamífero frente a la infección por HCV, el
procedimiento incluye administrar un anticuerpo de acuerdo con la
invención al mamífero, o una mezcla de anticuerpos.
De manera similar, se describe también un
procedimiento para tratar un mamífero con una infección por HCV,
el procedimiento incluye la administración de un péptido de acuerdo
con la invención, o de una mezcla de péptidos, o de un anticuerpo,
o de una mezcla de anticuerpos, al mamífero.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
anti-idiotípicos.
Los aspectos y formas de realización de la
presente invención quedarán ilustrados más ampliamente, y se
proporcionan ejemplos experimentales con referencia a varias
figuras. Otros aspectos y formas de realización de la presente
invención serán evidentes a personas normalmente expertas en la
técnica.
En las figuras.
La Figura 1 (A) ilustra la derivación del modelo
de consenso de las 234 variantes naturales de las secuencias de
HCV HVR1 usadas en este trabajo. Los residuos no sombreados en el
interior del recuadro producen ellos solos aproximadamente el 80%
de la variabilidad observada. Los residuos se listan en orden
decreciente de frecuencia observada, desde arriba abajo.
La Figura 1 (B) muestra una composición de la
biblioteca del péptido HVR1 inicial, que se muestra en el
bacteriófago.
La Figura 2 muestra la reactividad de la
combinación de fagos producida por la primera ronda de la selección
por afinidades respecto de los anticuerpos presentes en los sueros
seleccionados. Para cada muestra de suero (\sigmal, \sigma4R,
\sigma3, \sigma2P, \sigma2R, \sigma3R y \sigmaN) se midió
el reconocimiento de anticuerpo de la batería de fagos (batería 1,
4R 3,2P, 2R, 3R y N), fago tipo salvaje (wt) y la biblioteca no
seleccionada (HVR1 lib). Se han determinado los valores promedio
(A_{405 \ nm}) procedentes de dos experimentos
independientes.
La Figura 3 muestra la distribución de fagos HCV
específicos seleccionados a partir de la biblioteca de HVR1 en
función de su frecuencia de reactividad con sueros procedentes de
pacientes infectados. El enlace se muestra para los fagos
enriquecidos en una (panel superior) o dos (panel inferior) ciclos
de selección por afinidades respecto de los anticuerpos presentes
en veinte sueros humanos diferentes de los que se usaron para las
selecciones. Para cada suero han determinado los valores promedio
(A_{405 \ nm}) procedentes de dos experimentos independientes
sobre el fago seleccionado y el fago tipo salvaje. Los valores se
consideraron significativos desde el punto de vista estadístico
cuando diferían más de 3 \sigma_{max} (p < 0,003) de la
señal de fondo observada para el fago de tipo salvaje. Cada
histograma representa el número de fago (que se muestra en el eje
vertical) que reacciona con el número indicado de sueros, expresado
en forma de porcentaje sobre el número total de muestras ensayadas
(eje horizontal).
La Figura 4 muestra que los mimotopos
seleccionados se reconocen frecuentemente por los anticuerpos
presentes en el suero humano procedente de pacientes infectados por
HCV. El enlace de los mimotopos seleccionados con los anticuerpos
presentes en el suero humano se detectó mediante ELISA sobre el
fago inmovilizado. Los nombres de los mimotopos se indican en la
parte superior de cada columna. Para dada suero (indicado a la
izquierda de cada fila), se han determinado los valores promedio
(A_{405 \ nm}) procedentes de dos experimentos independientes.
Los resultados se expresan en forma de diferencia entre el valor
promedio del fagotopo ensayado y el del fago de tipo salvaje. Los
valores se consideraron significativos desde el punto de vista
estadístico cuando diferían más de 3 \sigma_{max} (p <
0,003) de la señal de fondo observada para el fago de tipo salvaje.
Se muestra en la parte inferior de cada panel la frecuencia de la
reactividad de cada mimotopo y la que resulta de la suma de las
reactividades observadas en los cuatro mimotopos.
La Figura 4 (A) muestra la reactividad de
mimotopos seleccionados con el panel de veinte sueros de pacientes
de HCV usados en la etapa de selección.
La Figura 4 (B) muestra la reactividad de
mimotopos seleccionados con una panel adicional de sueros
procedentes de pacientes virémicos infectados por HCV.
La Figura 4 (C) muestra la reactividad con suero
procedente de pacientes no virémicos que dieron positivo para
anticuerpos anti-HCV usando kits comercialmente
disponibles.
La Figura 5 muestra la correlación entre la
puntuación S y la frecuencia de reactividad de los mimotopos
seleccionados. La línea recta represente el ajuste lineal por
mínimos cuadrados de los datos. El coeficiente de correlación es
0,79.
La Figura 6 muestra que los mimotopos
seleccionados son mímicos antigénicos de un gran número de HVR1 que
se dan en la naturaleza. Los anticuerpos procedentes de una batería
de sueros procedentes de pacientes infectados con HCV se
inmunopurificaron respecto a MAP reproduciendo la secuencia de los
seleccionados (indicados en la parte superior de la figura) La
reactividad de cantidades iguales de anticuerpos inmunopurificados
se midió mediante ELISA sobre un panel representativo de secuencias
de HVR1 sintetizadas como MAP (indicado en la columna izquierda).
Se han determinado los valores promedio de dos experimentos
independientes. Los valores se consideraron significativos desde el
punto de vista estadístico cuando se cumplían a la vez dos
criterios: (1) los valores que diferían más de 3 \sigma_{max}
(p < 0,003) de la señal de fondo observada en dos péptidos no
relacionados; (2) los valores que diferían más de 3
\sigma_{max} (p < 0,003) de la señal promedio observada
usando diez sueros procedentes de individuos no infectados de cada
péptido representante de un HVR1 natural. Los recuadros grises
indican señales que diferían de las observadas en MAP no
relacionados entre 0,15 y 0,5 OD (405 nm); los recuadros negros
indican valores que se diferenciaban en más de 0,5 OD (405 nm). El
nivel de reactividad cruzada de cada batería de anticuerpos
inmunopurificados se indica en la parte inferior de cada
columna.
La Figura 7 muestra la correlación entre la
secuencia de mimotopo y la reactividad cruzada.
La Figura 7 (A) muestra las secuencias de
mimotopos usadas en el análisis.
La Figura 7 (B) muestra la correlación entre la
puntuación S de los mimotopos y la reactividad cruzada de los
anticuerpos humanos no purificados con un panel de 43 secuencias de
HVR1 naturales. La línea recta represente el ajuste lineal por
mínimos cuadrados de los datos. El coeficiente de correlación es
0,86.
La Figura 8 muestra que los mimotopos
seleccionados son mímicos inmunogénicos de un gran número de HVR1
que se producen de forma natural.
La reactividad de sueros procedentes de ratones
inmunizados con mimotopos HVR1 sencillos (Figura 8 (A)) y mezclas
de mimotopos (Figura 8 (B)) en forma de MAP se ensayo mediante ELISA
sobre el panel de secuencias de HVR1 naturales (indicadas en la
columna izquierda). Los mimotopos inmunizantes se muestran en la
primera fila. El MIX1 incluye los mimotopos R9, F78, H1 y D6; el
MIX2 contiene los péptidos M122 y G31; el MIX3 está compuesto por
los seis MAP. Los títulos (definido como la dilución necesaria para
obtener la mitad de la señal máxima en ELISA respecto de la del
péptido homólogo) se muestran en la segunda fila. Los sueros se
diluyeron a 1: 100. Se han determinado los valores promedio
(A_{405 \ nm}) procedentes de dos experimentos independientes.
Los valores se consideraron significativos desde el punto de vista
estadístico cuando diferían más de 3 \sigma_{max} (p <
0,003) de la señal de fondo observada para dos péptidos no
relacionados. Los recuadros grises indican señales que diferían de
las observadas en MAP no relacionados entre 0,15 y 0,5 OD (405 nm);
los recuadros negros indican valores que se diferenciaban en más de
0,5 OD (405 nm). El nivel de reactividad cruzada de cada batería
de anticuerpos inmunopurificados se indica en la parte inferior de
cada columna.
La Figura 9 ilustra plásmidos empleados en los
experimentos de inmunización in vivo con ácido nucleico,
descritos en el Ejemplo 6.
Se realizó un alineamiento de secuencias múltiple
de 234 secuencias únicas de HVR1 extraídas a partir de bases de
datos de frecuencias para caracterizar la variación en una
composición de los residuos en cada una de las 27 posiciones
N-terminar de la glicoproteína E2 del HCV. De este
análisis (Figura 1A) emergió un modelo de secuencia que permitía
la definición de una secuencia de consenso degenerada. Se diseño un
muestrario sintético de secuencias de HVR1 para contener dichas
restricciones conservadas, a la vez que reproducían la variabilidad
natural observada en el resto de posiciones.
Se derivó un "perfil de consenso" que
contenía aproximadamente el 80% de la variabilidad total de las
secuencias seleccionando los residuos más frecuentes en cada
posición. Cuando estaban presente aminoácidos similares en una
posición dada, solo se eligió uno como representativo de la
variabilidad, prefiriéndose aquellos residuos que pudieran formar
interacciones más efectivas. Por ejemplo, en la posición 5 están
presentes en el muestrario natural tanto Ser como Thr, pero solo se
seleccionó Thr par diseñar la biblioteca (Figura 1). En algunos
casos, se incluyo en la biblioteca un residuo no presente en el
consenso para mejor emular la variabilidad global. Por ejemplo, se
incluyó Thr en la posición 3 para tener en cuenta la presencia de
Ser, Thr, Asn en el muestrario natural de HVR1.
El perfil de consenso resultante final (Figura
1B) tiene una complejidad de 9 x10^{7}, muy cerca del límite
practico (aproximadamente 10^{8}) de las técnicas actuales de
clonación y transformación del ADN. Los aminoácidos más
frecuentemente observados en el muestrario natural se incluyeron
siempre, con la excepción de la posición 1 (en la que se
seleccionaron Gln y Thr a pesar que Glu es el aminoácido más
frecuentemente observado). Se mantuvieron constantes ocho
posiciones (2, 6, 7, 16, 19, 20, 23 y 26) dada la elevada
conservación de la secuencia local en las 234 variantes naturales
del HVR1. Notable es también la ausencia total de residuos con
carga negativa. Con la excepción de la posición 1, en la que se
eligió Gln para presentar el grupo His, Glu, Asp, Gln, no
estuvieron presentes residuos ácidos dentro de la fracción del 80%.
Cualitativamente, el perfil se puede describir como una región
central por lo general más variable flanqueada pro colas
N-terminal y C-terminal que
contenían elementos conservados.
La construcción de la biblioteca continuó
clonando un oligonucleótido sintético degenerado como fusión del
extremo 5' del gen que codifica la principal proteína de
recubrimiento (pVIII) del vector fagémido para mostrar M13 (ver
Materiales y Procedimientos). Se obtuvieron aproximadamente 2 x
10^{8} transformantes independientes. Para verificar la calidad y
complejidad de la biblioteca (biblioteca de HVR1) se secuenciaron
los insertos de cincuenta y seis clones individuales elegidos de
forma aleatoria. Este análisis llevó a los siguientes
resultados.
- (1)
- todos los clones mostraron secuencias diferentes;
- (2)
- el 63% de los clones contenían los insertos de cadena completa, mientras que el resto tenían pequeñas omisiones;
- (3)
- ninguno de los clones secuenciados codificó los péptidos correspondientes a los HVR1 conocidos a partir de aislados víricos, a fecha 15 de marzo de 1998.
De estos datos se infirió que la biblioteca tenía
una complejidad próxima al número de transformantes
individua-
les.
les.
Ejemplo
2
Cuanto más complejo y diverso sea el muestrario
de anticuerpos usados en la selección, mayor será la probabilidad
de enriquecer fagos reconocidos por muchos anticuerpos diferentes
frente a los epitopos de HVR1. El suero procedente de pacientes
virémicos crónicamente infectados parecía cumplir los requisitos,
ya que estos individuos mostraban un largo historial de
persistencia viral durante el cual se han generado un gran número
de variantes de HVC y se ha desafiado el sistema inmunológico,
llevando presumiblemente a la acumulación de una población muy
heteróloga de anticuerpos anti-HVR1.
Se usaron ocho sueros procedentes de pacientes
crónicos infectados por virus de cinco fenotipos diferentes 1a,
1b, 2a, 2b, 3a (Simmonds y col., 1993) de la biblioteca de
HVR1 (Tabla 1). Como control se usó también un suero procedente de
un individuo no infectado. La batería de fagos obtenida de las
siete selecciones se amplifico y ensayo respecto de su reactividad
para cada uno de los sueros seleccionados mediante ELISA. Los
resultados de esta experimento mostraron un enriquecimiento
significativo de los fagos reconocidos por los anticuerpos
selectores, evidenciado en el incremento de reactividad con
respecto a la biblioteca no seleccionada (Figura 2). En la mayor
parte de los casos, la batería de fagos seleccionadas con el suero
de control tuvo una reactividad más elevada con este suero que con
la biblioteca no seleccionada (Figura 2). Sin embargo, el suero de
los pacientes condujo la selección hacia mimotopos relacionados con
HVC ya que no se detectó reactividad de la batería de fagos
enriquecida con HCV usando suero procedente de individuos sanos
(Figura 2 y datos no mostrados).
Para conseguir más información acerca de la
frecuencia de la reactividad de los mimotopos seleccionados con el
suero de los diferentes pacientes, se eligieron de forma aleatoria
cuarenta clones individuales procedentes de dos baterías (4R y 2R,
Tabla 1), y se ensayó su reactividad en ELISA con un panel de
veinte sueros procedentes de pacientes infectados con HVC
diferentes de los empleados en la selección. Se usó un número
equivalente de sueros procedentes de controles sanos no infectados
para evaluar la especificidad de los anticuerpos
anti-HCV. veinticuatro clones resultaron ser
específicos de HCV. Se muestra en la Figura 3 (panel superior) su
distribución en función de su frecuencia de reactividad con el
suero de los pacientes. Entre ellos, se identificaron los fagos
que reaccionaban con más de un suero; algunos de estos fueron
reconocidos por hasta un 55% de los sueros de ensayo.
Para mejorar todavía más el aislamiento de
mimotopos que reaccionan con muchos anticuerpos
anti-HVR1, las baterías de fagos enriquecidas se
sometieron a una segunda ronda de selección por afinidad usando
sueros procedentes de pacientes diferentes de los empleados en la
primera ronda. De esta forma, se observó un incremento general en
la reactividad con los anticuerpos selectores. Además, todas las
baterías de fagos en la segunda ronda reaccionaron más
frecuentemente que los seleccionados en la primera ronda con un
panel de sueros procedentes de pacientes infectados con HVC
diferentes de los empleados en cualquiera de las selecciones,
reflejando una elevada frecuencia de reconocimiento de los péptidos
aislados. Esto se confirmó comparando la reactividad con suero de
HCV de los clones escogidos de forma aleatoria entre los eluídos
después de una ronda de selección por afinidad Figura 3 (panel
superior). No solamente la frecuencia, sino también la distribución
de la reactividad parcial se diferencian significativamente después
de la segunda etapa de selección. Aunque el reconocimiento de los
fagos procedentes de la primera selección parece estar bastante
dispersa, los clones aislados después de dos rondas de selección
mostraron una distribución en forma de campana de su frecuencia de
reacción, con un valor promedio del 60% Figura 3 (panel inferior),
indicando que la población completa de fagos había adquirido de
esta forma la mayor parte de las propiedades de enlace deseadas. Se
decidió no realizar más ciclos de selección para evitar la
introducción de sesgo respecto de los fagos favorecidos desde el
punto de vista biológico durante la ampliación.
Se identificaron un total de ciento setenta y un
clones que reaccionaban exclusivamente con suero HCV por selección
de todas las baterías de la segunda ronda. Su distribución en
función de la frecuencia de reconocimiento por suero HCV se
asemejó al conjunto que se muestra en la Figura 3 panel inferior,
reaccionando los mejores clones con el 81% de las muestras
ensayadas. De forma más importante, los perfiles de reactividad de
los mimotopos seleccionados revelan otra característica importante.
A pesar de su similar frecuencia cuantitativa global de
reconocimiento por los sueros HCV, los diferentes clones muestran un
modelo característico de reactividad con resultado neto que pocos
mimotopos puntúan para la presencia de anticuerpos
anti-HVR1 en todos los sueros ensayados (Figura
4A).
A continuación, se verificó si la frecuencia de
reconocimiento por los sueros HCV estaba limitada a la población
de pacientes ensayados, o si reflejaba una propiedad intrínseca de
los mimotopos seleccionados. Con este objetivo, se ensayó otro
conjunto de sueros procedentes de pacientes infectados con HVC
mediante ELISA, revelando que tanto la frecuencia de la reactividad
de cada fago individual como la cubierta total de los sueros
permaneció inalterada (Figura 4B).
Los individuos infectados por HCV que habían
resuelto rápidamente la infección entraron en contacto con un
número menor de variantes víricas, y de forma presumible
desarrollaron un espectro más estrecho de anticuerpos
anti-HVR1 específicos de la variante que los
pacientes afectados de forma crónica. Esto se soporta en el
hallazgo que los péptidos sintéticos reproducen el HVR1 de los
aislados naturales más ocasionalmente que los de los pacientes
virémicos infectados de forma crónica (Scarselli y col.,
1995). Por tanto, el suero no virémico podría constituir un ensayo
mejor y más restrictivo para ensayar la reactividad cruzada de los
mimotopos de HVR1 con diferentes anticuerpos
anti-HVR1. Algunos de los mimotopos seleccionados
fueron por tanto ensayados de nuevo frente a cuarenta y una
muestras procedentes de individuos HCV seropositivos que habían
dado negativo varias veces para la presencia de ARN viral en la
muestra. De nuevo, los mimotopos reaccionaron con muchos de estos
sueros, aunque con una frecuencia menor que la observada con los
sueros procedentes de pacientes virémico (comparar las Figuras 4
(A), 4 (B) y 4(C)). Estos datos proporcionan una indicación
de la capacidad de los mimotopos seleccionados para mostrar
reactividad cruzada con un gran número de anticuerpos
anti-HVR1 diferentes.
Ejemplo
3
Los inventores deseaban verificar si la secuencia
de aminoácidos de los clones seleccionado se correlacionaba con su
frecuencia de reactividad. No surge ningún modelo obvio de la
comparación visual de las secuencias, por lo que se decidió
analizar por separado los modelos de secuencia de los clones con
frecuencias de reacción más altas y más bajas.
Se definieron cono "débiles" los 24 clones
que únicamente reaccionaron con menos de 3 sueros, y se definieron
como "fuertes" los 27 que reaccionaron con más de 11 sueros.
Las frecuencias de aminoácido en cada posición de los clones
fuertes y débiles se relacionan en la sección siguiente de
Materiales y Procedimientos, y en la
Tabla II.
Tabla II.
\newpage
Existe una tendencia clara a que algunas
posiciones se ocupen por diferentes aminoácidos en los conjuntos
de clones fuertes y débiles, y esto nos permite definir
heurísticamente un sistema de puntuación basado en la posición que
se describe en Materiales y Procedimiento (ver más adelante).
Cuanto mayor es la puntuación de un clon (puntuación S), más
similar es su secuencia a la de los clones fuertes, y más diferente
es de la de los débiles. Como se muestra en la Figura 5, la
puntuación S se correlaciona razonablemente bien (coeficiente de
correlación = 0,75) con la frecuencia de reacción de cada clon
determinada de manera experimental. Debe enfatizarse que la
puntuación S se calculó usando únicamente las secuencias de los
clones "fuerte" y "débil" (51 de 171), pero se
correlaciona bien con la frecuencia de reactividad de todos los
clones. De manera interesante, se puede obtener un resultado casi
idéntico (coeficiente de correlación = 0,72) usando solamente 6
posiciones en los que la preferencia de los residuos de los
mimotopos fuerte y débil difieren más (posiciones 11, 18, 21, 22,
24).
Ejemplo
4
Los inventores midieron la reactividad cruzada de
los anticuerpos humanos que reconocían los mimotopos, con
secuencias que representaban los HVR1 que se producen de forma
natural.
Con este objetivo, se usaron los mimotopos como
inmunoabsorbentes para purificar los anticuerpos específicos del
conjunto de anti-HVR1 presentes en el suero de los
pacientes infectados. Se eligieron para estos experimentos los
mimotopos R9, F78, M122, R6, B14, G31, H1 y D6 (Figura 7), porque
estaban entre los que mostraban la mayor frecuencia de reacción
con el suero de HCV. También se usó el mimotopo N5 que fue
reconocido por un porcentaje significativamente inferior de sueros
HCV que los mimotopos "buenos" promedio (35% y
60-80%, respectivamente).
Aunque algunas líneas celulares de linfocitos
habían demostrado soportar una replicación limitada de los HCV
(Shimizu y col., 1992), estos sistemas no son adecuados para
la propagación vírica y para un estudio detallado de la
reactividad cruzada de los anticuerpos anti-HVR1.
Por tanto, se determinó la reactividad cruzada de los anticuerpos
inmunopurificados en un panel de péptidos sintéticos que reproduce
las variantes naturales de HVR1 cubriendo aproximadamente la
variabilidad observada de las secuencias.
Con este objetivo, se llevó a cabo un análisis en
cluster multi-dimensional (Casari y col.,
1995) sobre el mismo conjunto de 234 secuencias alineadas del HVR1
natural usadas para la construcción de la biblioteca. Además de
estas, se eligieron cuarenta y tres secuencias distribuidas de forma
casi homogénea en el "espacio de secuencia" del HVR1 (ver
Material y procedimientos, más adelante) y se sintetizaron en forma
de péptidos antigénicos múltiples (MAP; Tam, J. P, 1988; Pessi y
col., 1990). Se usó como fuente de anticuerpos una batería de
ocho sueros procedentes de pacientes infectados que reaccionaron
colectivamente con el panel completo de cuarenta y tres MAP. Los
anticuerpos inmunopurificados mostraron la misma reactividad
respecto del mimotopo usado para la purificación, en comparación
con el suero total. Por el contrario, no se retuvo ninguna
reactividad después de la purificación respecto de un núcleo de
antígeno HCV recombinante respecto del antígeno incluido en un kit
comercialmente disponible (ver más adelante en Materiales y
Procedimientos), testificando de esta forma la eficiencia y
especifidad de la purificación.
Todos los anticuerpos inmunopurificados
reaccionaron con un número significativo de secuencias naturales de
HVR1, produciendo el mimotopo R9 anticuerpos con una reactividad
cruzada del 79% de los HVR1 naturales (Figura 6). Puesto que la
mayor parte de los anticuerpos inmunopurificados mostraban también
alguna reactividad no solapante respecto de las secuencias
naturales, se puede incluso alcanzar un nivel más elevado de
reactividad cruzada global (88%) añadiendo las contribuciones
individuales de los anticuerpos purificados a partir de únicamente
tres mimotopos diferentes (R9, F78 y M122, Figura 6). A partir de
estos datos se concluyó que un conjunto limitado de mimotopos de
HVR1 pueden mimetizar antigénicamente un gran número de variantes
HVR1 HCV naturales.
Los anticuerpos inmunopurificados mediante
mimotopos con mayor puntuación S, y por tanto, con una mayor
frecuencia de reacción, también demostraron tener mayor reactividad
cruzada. Se usaron ocho mimotopos y, como se muestra en la Figura
7B, la correlación entre la puntuación relacionada con la secuencia
y la reactividad cruzada de los anticuerpos correspondientes es muy
buena (r = 0,86; Figura 7B).
Ejemplo
5
Un problema anterior al presente documento fue la
generación de inmunógenos capaces de inducir anticuerpos con
reactividad cruzada respecto del mayor número posible de variantes
naturales de HVR1 HCV. Se investigó el potencial inmunogénico de
algunos de los mejores mimotopos de HVR1 (R9, F78, M122, G31, H1 y
D6) inyectándolo en ratones, tanto en forma de fago completo
purificado y, fuera del contexto original en el que se
seleccionaron, como MAP.
Los MAP resultan ser inmunógenos mucho más
potentes, presumiblemente debido a la carga insuficiente de
péptidos HVR1 en cada fago según indica el análisis por
espectrometría de masas 8menos del 1% del contenido total en
pVIII). Se observó cierta variabilidad en la eficiencia de la
inmunización entre los mimotopos, como muestra la diferencia de
título, siendo el F78 capaz de inducir títulos de anticuerpo
mayores que 1/100.000 según se mide con ELISA sobre el mismo
péptido usado para la inmunización (Figura 8A). Los sueros con
mimotopo anti-HVR1 se ensayaron a continuación
respecto de su capacidad para reconocer las variantes HVR1
heterólogas según ELISA del panel de cuarenta y tres MAP que
preproducen las secuencias de HCV procedentes de aislados
naturales. La mayor parte de estos MPA fueron reconocidos por los
sueros inmunes (Figura 9ª9, mientras que no se observó reactividad
con los péptidos de control no relacionados.
Las reactividades cruzadas de los sueros de los
ratones inmunizados con mimotopos no se ordenaron como los de los
anticuerpos humanos inmunopurificados con los mismos mimotopos. Sin
embargo, el mimotopo N5, que mostró niveles significativamente
inferiores de reactividad en ambos tipos de ensayos, se reveló como
un inmunógeno mucho menos eficiente, llevando a una respuesta
anti-HVR1 capaz de reconocer solo una minoría de
las secuencias naturales de HVR1 (Figura 8A).
La extensión de la reactividad cruzada de los
sueros inmunes refleja por lo general la inmunogenidad de los MAP
individuales como, en la mayor parte de los casos, un título más
alto corresponde a un nivel más alto de reactividad cruzada
(Figura 8A). A pesar de lo anterior, el título solo no siempre
explica la diferencia de reactividad cruzada y el modelo de
reactividad que presentan los sueros inducidos por el mimotopo,
como se muestra claramente en le caso del suero
anti-G31 que tiene un título inferior al del
anti-F78, pero que reacciona con un mayor número de
péptidos naturales de HVR1. De forma similar, el suero
anti-D6 muestra el mismo nivel de reactividad
cruzada que el suero anti-R9 a pesar de tener un
título tres veces menor (Figura 8A).
El modelo de reactividad que presenta cada
antisuero solapa solo de manera parcial con el de los demás y, en
algunos casos, se observaron reactividades únicas. Como consecuencia
de esta característica el suero inducido, sumando todas las
reactividades, se reconocen casi todos los péptidos naturales de
HVR1 quedan reconocidos (91%, Figura 8A). Esta observación es una
mejora significativa respecto del fin de generar anticuerpos
ampliamente reactivos, siempre que se pueda obtener un incremento
similar en la reactividad cruzada con una sola inmunización con un
cocktail de mimotopos. Por tanto, se inmunizaron tres grupos de
ratones Balb/c con mezclas de mimotopos. La Mezcla 1 contenía los
mimotopos R9, F78, Hl y D6; la mezcla 2 estaba compuesta por los
mimotopos M122, y G31, mientras que la mezcla 3 comprendía los seis
mimotopos. Las tres mezclas resultaron ser inmunogénicas, e
indujeron un suero con una fuerte reactividad cruzada (Figura 8B).
Cada uno de los tres antisueros mostró la misma reactividad
cruzada o incluso superior que la medida sumando las actividades de
los antisueros inducidos por cada uno de los mimotopos incluidos en
la mezcla (84% vs 84% para el MIX1, 84% vs81% para el MIX2 y 95%
vs 91% para el MIX3, Figura 8B). Los títulos de estos sueros fueron
bastante elevados, pro no mejores que los obtenidos con los MAP
individuales. Se concluyó por tanto que la capacidad de inducir una
fuerte respuesta de reactividad cruzada no es simplemente una
consecuencia de la eficacia de la inmunización.
Se caracterizaron sueros humanos procedentes de
pacientes infectados con HCV y de pacientes sanos respecto de la
presencia de anticuerpos de HCV mediante en sistema de ensayo HCV
ELISA de segunda generación (Ortho-HCV ELISA,
Ortho Diagnostic Systems, Bersee, Bélgica) y mediante in
inmunoensayo dot blot de primera generación
(RIBA-HCV test, Chiron Co., Emeryville, CA). Se
detectó la presencia de ARN de HCV mediante transcripción inversa
PCR anidada usando cebadores conservados localizados en la región 5'
no codificante del genoma vírico, y el ARN total extraído a partir
de 100 \mul de suero, como se ha descrito previamente (Silini
y col., 1995).
Para retroceder la traducción del perfil de
consenso descrito anteriormente con referencia a la Figura 1B en
la correspondiente secuencia de nucleótidos, se usó la tabla de usos
del codon de E. coli seleccionando los codones más
frecuentes en la genes más expresados. Para facilitar la inserción
de la biblioteca en el vector fagémido, se añadieron dos secuencias
constantes adicionales que contenían los emplazamientos de
reconocimiento de los enzimas de restricción PacI y NotI en 5' y 3'
al segmento 81bp, respectivamente, dando un total de 116 bp. La
ausencia de los emplazamientos de restricción de NotI y PacI en la
retrotraducción del perfil de consenso se verificó mediante
análisis de secuencia asistido por ordenador. Para la síntesis
química se aplico un procedimiento de "separar y mezclar"
basado en un codon (Cormack y col., 1993) con el fin de
mantener tanto la composición de la biblioteca como la complejidad
en el nivel deseado. Los oligonucleidos de 116 bp se amplificaron
con cebadores complementarios de las secuencias laterales
constantes en un 9600 ADN Thermal Cycler
(Perkin-Elmer Cetus, Foster City CA). El producto
PCR se digirió con los enzimas PacI y NotI y se purificó en gel.
el fragmento de ADN recuperado se clonó entre los emplazamientos
PacI y NotI del vector fagémido pel8PN (un derivado de pc89;
Felici y col., 1991) aguas abajo del líder de secreción pe1B
y aguas arriba de la secuencia de codificación completa del gen
VIII. Los fagémidos recombinantes se electroporaron en células
DH10B competentes. Puesto que las células DH10B no se pueden
infectar por fagos filamentosos, y no permiten la selección
mediante azul/banco, se recogieron las células transformadas y se
preparó el plásmido de ADN. Se usó este ADN para transformar
mediante electroporación células XL1-blue
competentes. Se extrajeron de las placas las colonias resistentes a
la ampicilina, y se resuspendieron en LB/100 \mul ampicilina/ml y
glicerol al 10% (v/v). Una parte de esta suspensión bacteriana se
inoculó en seis litros de medio LB que contenía 100 mg de
ampicilina/ml a 0,05 O.D._{600 \ nm} y se hizo crecer con
agitación vigorosa hasta que se alcanzaron 0,25 O.D._{600 \ nm}.
A continuación se superinfectó el cultivo con el fago auxiliar
M13K07, y se hizo crecer durante cinco horas más para obtener las
partículas de fago en el sobrenadante. Los fagos se precipitaron
dos veces con polietilén glicol y se purificaron por centrifugación
equilibrada con CsCl, según se describe (Felici y col., 1991). El
secuenciamiento de ADN se llevó a cabo como se describe (Bartoli y
col., 1996), usando un secuenciador de ADN de Applied Biosystem
373.
Se recubrieron durante toda la noche placas ELISA
multipocillo (Nunc Maxisorp, Roskilde, Dinamarca) durante toda la
noche a 4ºC con 0,5 \mug/ml de Ab policlonal (IgG cabra
anti-humano inmunopuro Fc específico; Pierce,
Rockford, IL) anti-humano (Fc específico) en
NaHCO_{3} 50 mM y pH 9,6. Las placas se lavaron con PBS/Tween 20
al 0,1% (tampón de lavado) y se incubaron durante 1 h a 37ºC con 100
\mul/pocillo de tampón de bloqueo (leche en polvo no grasa al
5%, PBS/Tween 20 al 0,5%) Se añadió 1 \mul de suero humano
diluído a 1:100 en PBS/BSA al 0,1% a cada pocillo, y se incubó
durante toda la noche a 4ºC. Tras el lavado, se añadieron 10^{12}
partículas de M13k07 muertos por UV diluidos en PBS/Tween 20 al
0,1%, BSA al 0,01%, y se incubaron durante 4 h a 4ºC. Tras esta
preincubación, se añadieron 10^{12} partículas/pocillo de
biblioteca de HVR1 y se incubó durante toda la noche a 4ºC. Los
fagos no enlazados se eliminaron fluyendo con 200 ml de tampón de
elución (HCl 0,1 M ajustado a pH 2,5 con glicina, 1 mg/ml de BSA) y
se neutralizó con Tris-HCl 2 M y pH 9. Los fagos
eluídos se valoraron mediante infección de bacterias
XL1-blue, y el se determinó el porcentaje de clones
que contenía un inserto productivo plaqueando las bacterias
infectadas en placas indicadoras X-gal/IPTG (Felici
y col., 1991). Tras amplificación (ver más arriba), elfazo
enriquecido se sometió a un segundo ciclo de selección por
afinidad, siguiendo el mismo procedimiento.
De un total de 193 clones seleccionados, 171 no
mostraron mutaciones puntuales (con respecto al diseño original de
la biblioteca) u omisiones, y se dividieron en tres clases: 24
clones débiles (que reaccionaban con menos de 3 de los 20 sueros
ensayados), 27 clones fuertes (que reaccionaban al menos con 12
sueros) e intermedios (el resto de los clones).
Para cada aminoácido en posición i de la
secuencia de los 27-mer aminoácidos, se denominó
Fs(i, aa) y Fw(i, aa) a la frecuencia observada de los
mismos aminoácidos en posición i del conjunto de clones fuertes y
débiles, respectivamente.
Los valores de la frecuencia se muestran en la
Tabla II.
Se definió a continuación la puntuación
S(i) como la diferencia entre las raíces cuadradas de
Fs(i, aa) y Fw(i, aa). La suma de las puntuaciones
S8I9 de las 27-mer secuencias de aminoácido es
nuestra puntuación S basada en la secuencia. En la práctica:
Puntuación S =
\sum_{i} (\surdFs(i, aa) - \surdFw(i,
aa))
donde aa es el aminoácido observado
en posición i de la secuencia para la que se calcula la puntuación
S. La raíz cuadrada de las frecuencias se uso para amplificar las
diferencias. Para los clones que habías sufrido una mutación u
omisión puntual, la posición correspondiente se omitió en el
cálculo de la
puntuación.
Se usó la secuencia HVR1 de NS2 procedentes de la
cepa BK de HCV (residuos 384-411) para investigar
diferentes bases de datos (respecto de 13 de diciembre de 1995),
tanto proteicas (SwaaProt, PIR y Genpept, el último representa
marcos abiertos de lectura asignados procedentes de Genbank y EMBL)
y secuencias de nucleótidos (EMBJ, Genbank y EST). Se eliminaron
las secuencias duplicadas e incompletas de la lista de secuencias
emparejadas para obtener un único conjunto de 234 secuencias de
HVR1 naturales.
Se uso el análisis de los componentes principales
para seleccionar 40 secuencias distribuidas de forma homogénea en
el conjunto. En primer lugar se calcularon las distancias entre
pares de las 234 secuencias usando los primeros seis autovalores
calculados usando Sequecespace (Casari y col., 1995). Las
secuencias con las distancias más pequeñas respecto de las
secuencias vecinas se eliminaron en un procedimiento por etapas
hasta que quedaron únicamente 40 secuencias. La proyecciones en dos
dimensiones de todos los posibles pares de autovalores mostró que
el conjunto de 40 secuencias no era un cluster y estaba distribuido
de forma homogénea.
\newpage
Los números de acceso y las secuencias son:
\vskip1.000000\baselineskip
* La secuencia 13 corresponde a la secuencia de
aminoácidos traducida (aa190-aa216) recogida en la
característica CDS de la entrada S73387 de Genbank.
Se sintetizaron también tres secuencias
adicionales en forma de MAPS. dos secuencias se derivaron del
inóculo H77 conocido de HCV (Figura 2 de (Farci y col., 1994):
y uno procedente del aislado
principal de un paciente del que se había caracterizado la
inmunoreacción (Scarselli y col.,
1995).
Se prepararon los fagos sobrenadantes procedentes
de células XL-blue infectadas según se ha descrito
anteriormente (Folgori y col., 1994). Se llevó a cabo el ELISA de
acuerdo con Dentei y col., 1994, usando 25 \mul. de fago
sobrenadante/pocillo. Los sueros se diluyeron a 1:100 si no se
especifica otra cosa, y se reveló por adición de anticuerpos
secundarios fosfatasa alcalina conjugados anti-IgG
específicos de la especie (Fc-específico)
(Sigma
A-9544; dilución 1:5000 en tampón de bloqueo ELISA). Los resultados se registraron como diferencias entre O.D._{405 \ nm} y O.D._{620 \ nm} mediante un lector ELISA automatizado (Labsystems Multiskan Bichromatic, Helsinki, Finlandia).
A-9544; dilución 1:5000 en tampón de bloqueo ELISA). Los resultados se registraron como diferencias entre O.D._{405 \ nm} y O.D._{620 \ nm} mediante un lector ELISA automatizado (Labsystems Multiskan Bichromatic, Helsinki, Finlandia).
Se llevó a cabo el ELISA de los conjuntos de
fagos de la misma forma usando cantidades equivalentes (10^{10}
unidades de transducción de ampicilina) de fago amplificado tras la
purificación con CsCl (ver más arriba).
Se usaron 100 \mul de MAP que representaban
secuencias de HVR1 naturales para recubrir placas ELISA (Nunc
Maxisorp, Roskilde, Dinamarca) hasta una concentración final de 10
\mug/ml en tampón de recubrimiento (NaHCO_{3} 50 mM, pH 9,6).
Tras bloqueo de los emplazamientos de enlace libre, se añadieron
100 \mul/pocillo de suero o anticuerpos purificados por afinidad.
Se ensayaron los sueros de ratón y conejo a una dilución final de
1:100 en tampón de bloqueo; los anticuerpos purificados por
afinidad se ensayaron a una concentración final de 150 ng/ml. Las
placas se incubaron durante toda la noche a 4ºC. Tras el lavado, se
añadieron 100 \mul/pocillo de anticuerpos secundarios fosfatasa
alcalina conjugados (IgG cabra anti ratón Sigma
A-7434; dilución 1:2000; IgG cabra anti conejo
Sigma A-8025; dilución 1:5000; IgG cabra anti humano
Sigma A-9544; dilución 1:5000) y se incubaron
durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y
revelaron con fosfatasa alcalina como se ha descrito
anteriormente.
Se usaron péptidos antigénicos múltiples que
reproducían la secuencia de mimotopos diferentes, ya que
demostraron el mismo perfil de enlace con sueros HCV en ELISA que
el fago, pero demostraron ser mas eficientes en la selección por
afinidad de los anticuerpos. Se acopló una columna CH Sepharose 4B
activada (Pharmacia Biotech
17-0490-01) con el MAP de interés
en la relación de 1 g de Sepharose seca / 1 mg de MAP en tampón de
acoplamiento (NaHCO_{3} 0,1 M pH 8 / NaCl 0,5 M). El acoplamiento
vino seguido de bloqueo de los aminogrupos libres con Tris 0,1 M
-HCl pH 8. La muestra de cargó en forma de combinación de ocho
sueros HVC diluidos 1:5 en tampón de acoplamiento. Tras absorción
a temperatura ambiente, y lavado extensivo con PBS, los anticuerpos
enlazados se fluyeron con glicina 0,1 M - HCl pH 2,7 suplementado
con BSA a una concentración final de 10 \mul/ml, y se neutralizó
inmediatamente con Tris - HCl pH 9,4. La concentración de los
anticuerpos eluídos se determinó mediante ELISA, usando como
patrón IgG humana (Sigma I-2511). Se comprobó la
reactividad de los anticuerpos purificados por afinidad en un
ELISA, con el mimotopo usado en la purificación (tanto en la forma
de MAP como de fago) y, como control, con MAP no relacionados con
HCV. Se confirmo de forma adicional la especificidad de la
purificación ensayando los anticuerpos eluídos mediante ELISA en
una proteína recombínate del núcleo de ACH expresada de forma
bacteriana (Prezzi y col., 1996) y mediante un ensayo ELISA de
segunda generación con HCV (Ortho Diagnostic Systems, Bersee,
Bélgica). Las cantidades totales de inmunoglobulinas recuperadas en
cada purificación por afinidad procedente de una cantidad estándar
de 1 ml de batería de suero fueron comparables, oscilando entre 0,8
y 1,5 \mug. Para el ELISA del ensayo MAP, la concentración se
ajustó en cada caso a 150 ng/ml.
Se prepararon fagos inmunizantes a partir de
células XL1-blue infectadas y purificadas mediante
CsCl, como se ha descrito anteriormente (Felici y col., 1991).
Ratones hembra BALB/C de tres a cinco semanas de edad (Charles
River, Como, Italia) se inmunizaron mediante inyección
intraperitoneal de 100 \mul de solución de antígeno en los días
0, 21 y 42, y se les extrajo sangre en el día 52 (tercera
extracción) y el día 148 (cuarta extracción). Los fagos se
inyectaron como suspensiones al 0,9% en NaCl a concentraciones de
aproximadamente 0,3 mg/ml (2,5 x 10^{13}) sin añadir
coadyuvante.
Para inmunizaciones con péptidos, se disolvió el
MAP en PBS a una concentración final total de 400 \mul/ml, y se
inyectó en forma de dilución 1:2 tanto en Coadyuvante Completo de
Freund (primera inyección) o en Coadyuvante Incompleto de Freund
(segunda inyección). Se inmunizaron ratones hembra BALB/C de cuatro
a siete semanas de edad (Charles River, Como, Italia) mediante
inyección i.p. de 100 \mul de solución de antígeno en las semanas
0, 3 y 6, y se les extrajo sangre en el día 0 (pre extracción) 10
días después de cada inyección adicional. Cuando se uso más de un
péptido en la inmunización, se mezclaron cantidades iguales de cada
mimotopo, y se uso una solución de 100 \mul a 400 \mug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se explotaron las propiedades inmunogénicas de
algunos de los mimotopos de HVR1 seleccionados tanto en solitario
como en forma de fusión N-terminal de la exoregión
de la proteína E2.
El péptido vhc de E2 se identifica por lo general
mediante el péptido que procede de la expansión del aminoácido 384
al aminoácido 809 de la poliproteína HCV. La región HVR1 se
identifica por lo general como los aminoácidos 384 a 410. En el
siguiente ejemplo, \DeltaE2 identifica los péptidos que
corresponden a los aa411 a aa683 de la poliproteína de HCV.
Se produjeron tres tipos de plásmidos, y su
estructura se recoge en la Figura 9.
- (i)
- p\DeltaE2 - que dirige la síntesis de un fragmento de la proteína E2 (ceps N de HCV, Nishihara y col., Gene; 1993; 129 pp 207-214; procedente de la poliproteína de HCV aa411 a aa683) llevando a cabo el borrado tanto del HRV1 como de la región hidrófoba C-terminal;
- (ii)
- un segundo plásmido pF78, que expresa uno de los mimotopos HVR1;
- (iii)
- un conjunto de 11 constructos (pMimoE2) en los que las secuencias de ADN que codifican los once mimotopos diferentes de HVR1 se fusionan en el extremo 5' de la secuencia de codificación DE2 del plásmido p\DeltaE2.
Todos los recombinantes se clonaron en marcos
corriente debajo de la secuencia señal del activador del
plasminógeno tisular (TPA) para reforzar la secreción del
antígeno.
El gen \DeltaE2 (que codifica por tanto los
péptidos procedentes de la expansión de los aa411 a 683) se clonó
usando un modelo PCR en un vector que contenía la cepa N de E2
(Nishihara y col., Gene; 1993; 129 pp 207-214) Se
obtuvo un fragmento PCR usando cebadores de oligonucleótidos
sintéticos
Mediante el uso de los cebadores, el producto PCR
resultante comprende, además del gen \DeltaE2, los emplazamientos
de restricción BglII, PacI y EcoRV en el extremo 5', y una
secuencia que codifica seis residuos de histidina (His tag), y un
codon TAA de terminación, seguido por el emplazamiento de
restricción BamHI en el extremo 3'. Este producto de PCR se digirió
con BglII y BamHI y se ligó en el emplazamiento BglII del vector
V1JnsTPA (J.J. Donnelly y col., The Journal of Infect. Diseasses;
1996; 713; pp 314- 320) en el marco con la secuencia TPA líder para
obtener el plásmido V1JnsTPA-\DeltaE2 (designado
como p\DeltaE2 en la Figura 9).
Las secuencias del mimotopo HVR1 se subclonaron
en el extremo 5' del gen \DeltaE2 en p\DeltaE2. Los fragmentos
de HVR1 se amplificaron mediante PCR directamente a partir del
sobrenadante da fagos seleccionados. El cebador 5' contiene el
emplazamiento de restricción PacI, y era complementario de una
secuencia 5' (GGCGGCCGTTTAAT
TAAC) que es una parte constante de las secuencias del mimotopo HVR1; los cebadores 3' fueron complementarios de los últimos 15 nucleótidos, y fueron diferentes de acuerdo con la secuencia del mimotopo clonado. Los fragmentos amplificados por PCR se digirieron con PacI y se ligaron al plásmido p\DeltaE2. Se generaron un total de 11 plásmidos pMimoE2 (Figura 9).
TAAC) que es una parte constante de las secuencias del mimotopo HVR1; los cebadores 3' fueron complementarios de los últimos 15 nucleótidos, y fueron diferentes de acuerdo con la secuencia del mimotopo clonado. Los fragmentos amplificados por PCR se digirieron con PacI y se ligaron al plásmido p\DeltaE2. Se generaron un total de 11 plásmidos pMimoE2 (Figura 9).
Además, se construyó un plásmido pF78 (Figura 9)
por amplificación mediante PCR de la secuencia F78
(oligo fwd = GCGAGATCTTAATTAACCAGACCCATACCACC;
oligo rev = TCCGGATCCTTAGTGGTGGTGG
TGGTGGTGGTTCTGTTTCGCGCC) y clonación en el emplazamiento BglII del vector V1JnsTPA.
TGGTGGTGGTTCTGTTTCGCGCC) y clonación en el emplazamiento BglII del vector V1JnsTPA.
Las preparaciones de ADN a gran escala se
llevaron a cabo usando columnas Qiagen 2500-Tip,
siguiendo las instrucciones del fabricante (Qiagen, Hilden,
Alemania).
La capacidad de los plásmidos pF78, p\DeltaE2 y
pMimoE2 para consumir la expresión de las proteínas recombinantes
un sistema de mamífero se evaluó mediante transfección no
estacionaria de 293 células. Las células transfectadas con
p\DeltaE2 y pMimoE2 mostraron una tinción fuerte y específica
cuando se sondearon con un anticuerpo monoclonal
anti-E2 (mAb-185), reconociendo un
epítopo situado corriente abajo del HVR1. Igualmente, se demostró
la expresión de mF78 por inmunoquímica de las 293 células
transfectadas usando un antisuero de ratón obtenido por
inmunización con un MAP que reproducía la secuencia de aminoácidos
del mimotopo F78. Estos datos se confirmaron mediante ELISA sobre
extractos de células completas procedentes de las células
transfectadas. Se secretaron también en el medio cantidades
significativas de todas las proteínas recombinantes, según se midió
por ELISA en sobrenadantes de cultivo celular procedente de células
transfectadas.
Tanto las proteínas celulares como secretadas se
glicosaron de forma heterogénea según sugirió su apariencia en
forma de cluster de bandas de migración lenta en SDS PAGE. El peso
molecular más elevado mostrado por la fracción de proteína
extracelular es indicativo de una diferente extensión de la
glicosilación, y confirma que la proteína se secreta activamente y
no simplemente liberada por las células lisadas. En ambos casos,
el tratamiento con endoglicosidasa lleva a un aumento en el índice
de migración respecto del que se esperaría de una composición de
aminoácido.
Todas las proteínas de fusión recombinantes del
mimotopo/E2, así como del \DeltaDE2 mutante, se reconocieron de
manera eficiente por dos anticuerpos monoclonales diferentes
sensibles a la conformación. Además, no fue visible ningún
agregado multimérico enlazado con puentes de cisteína en el western
blot de un SDS PAGE no reductor, ni en cualquiera de las
fracciones celulares o segregadas de cada clon. Se obtuvieron
resultados similares transfectando células de rabdomiosarcoma,
proporcionando de esta forma la indicación que se conseguía una
expresión eficiente tras la traducción in vivo de las
células musculares de ratón.
Se usaron para la inmunización ratones hembra
Balb/c de cuatro semanas de edad (Charles River, Como, Italia).
Los ratones completamente anestesiados recibieron a partir de 100
\mug de plásmido de ADN disuelto en 100 \mul de tampón salino
(PBS). Se inyectaron cincuenta microlitros de ADN bilateralmente en
el músculo del cuadriceps mediante una jeringa de insulina
(B-D, aguja microfina U-100
28G_{1/2}). Se proporcionó a los ratones tres o cuatro
inyecciones a intervalos de 3 semanas, y se les extrajo sangre dos
semanas después de cada inyección. Se analizaron los sueros
respecto del título de anticuerpos y la reactividad cruzada.
Se recubrieron placas ELISA de 96 pocillos
(Inmunoplate Maxisorp, Nunc, Roskilde, Dinamarca) con 1
\mug/pocillo de GNA (Sigma L8272) en NaHCO_{3} 50 mM y pH 9,6 y
se incubaron durante toda la noche a 4ºC. Las placas se lavaron
(PBS/Tween 20 al 0,1%) y se incubaron durante 1 h a 37ºC con 250
\mul/pocillo de tampón de bloqueo (BSA al 2%, 1 X PBS, Tween 20
al 0,1%). Se produjeron las proteínas F78E2 o \DeltaE2 mediante
trasnfección no estacionaria de 293 células. Se usó sobrenadante
concentrado 10X como antígeno diana en ELISA. Cantidades saturantes
de cada proteína/pocillo se incubaron en tampón de bloqueo durante
3 h a temperatura ambiente en placas recubiertas con GNA. Las
diluciones en serie de los sueros inmunológicos (desde 1:100 hasta
1:72900) se preincubaron durante 2 h a temperatura ambiente con 1
\mul/pocillo se sobrenadante 10X procedente de las 293 células
falsamente transfectadas en tampón de bloqueo. La incubación del
suero se realizó a 4ºC. Después de 1 h a temperatura ambiente de
incubación IIAb (IgG \alpha-ratón Fc específico Ap
conjugado, Sigma 7434; dilución 1:2000 en tampón de bloqueo); las
placas se revelaron durante 37 minutos a 37ºC.
Los anticuerpos anti mimotopo de HVR1 se
valoraron (diluciones del suero comprendidas entre 1:100 y 1:72900)
mediante ensayo ELISA usando para cada suero la secuencia del
péptido homologo en forma de MAP.
En todos los casos, se definió el título del
suero como la mayor dilución del suero que da como resultado una
valor de la absorbancia 0,3 O.D. (a menos seis veces el valor del
fondo).
Se ensayó el suero respecto de su reactividad
cruzada en relación con las variantes de las secuencias de HVR1
naturales usando un conjunto de 43 MAP representativos, según se
describe en Materiales y Procedimientos
Se usaron los plásmidos p\DeltaE2 y pF78E2 para
ajustar las condiciones optimas de inducción de la respuesta
humoral. La inducción de anticuerpos frente a los epitopos situados
fuere de HVR1 se controlo mediante ELISA usando la proteína
\DeltaE2 expresada en las 2983 células transfectadas de forma no
estacionario. Se inmunizaron ratones Balb/C y C57black para ensayar
la inmunogenicidad de los constructos que codifican los mimotopos
en diferentes fondos genéticos. Tanto el número de inyecciones (de
una a cuatro) como la cantidad de ADN inyectado directamente se
correlacionan con la magnitud de la respuesta del anticuerpo. Se
obtuvieron los títulos de anticuerpo mayores frente a la proteína
\DeltaE2 después de tres inyecciones a intervalos de tres
semanas, usando cincuenta o cien microgramos de p\DeltaE2 de ADN
por ratón. Más inyecciones no mejoraron los títulos. se observó una
cinética similar de inducción de anticuerpos frente a la proteína
\DeltaE2 tras la inmunización de los ratones con el plásmido
pF78E2. La inducción de anticuerpos anti-HVR1 en
este último número de animales se ensayo mediante ELISA en MAPF78.
No se observaron diferencias significativas entre las dos cepas de
ratones bajo investigación, al menos respecto de las condiciones
óptimas de inmunización, pero los ratones C57black mostraron mejor
respuesta promedio.
El antisuero procedente de ratones inmunizados
con el constructo que únicamente expresaba el mimotopo F78 de HCV
(pF78) indujo también una respuesta específica, pero los títulos
fueron muy inferiores a los que se obtuvieron usando el constructo
relacionado pF78E2. Varios factores, tales como el nivel de
expresión el plegado de los productos recombinantes, o la presencia
de epitopos auxiliares T más fuertes pueden ser los responsables
de la respuesta más elevada observada por los constructos de fusión,
en comparación con el mimotopo F78 en solitario.
Se evaluó la capacidad de las fusiones
mimotopo/E2 para despertar una respuesta con reactividad cruzada
mediante inmunización basada en ADN, usando un panel de cuarenta y
tres péptidos sintéticos que reproducían las secuencias de HVR1
procedentes de aislados naturales en forma de antígenos recubiertos
mediante ELISA (ver materiales y procedimientos).
Se recogen en la Tabla III los títulos promedio
obtenidos mediante la inmunización de los ratones Balb/c (panel
superior) y ratones C57Black (panel inferior) usando diferentes
plásmidos individuales o mezclas de plásmidos. Se informa de la
reactividad cruzada como el número de péptidos que puntuaron
positivo de los 43 ensayados.
Los plásmidos pB14E2 y pB24E2 no indujeron
respuestas inmunes con reactividad cruzada, a pesar de la presencia
de niveles significativos de anticuerpos específicos de un péptido
que mostraba la secuencia del mimotopo homólogo en el suero inmune
relacionado (Tabla III). El resto de los constructor dieron lugar a
antisueros con reactividad cruzada frente a otras secuencias del
HVR1 natural, siendo el suero anti-F78 capaz de
reconocer hasta un 28% de los péptidos ensayados (Tabla III).
La extensión de la reactividad cruzada de los
sueros inmunes se reflejará por lo general un reflejo de la
inmunogenia de los plásmidos individuales, ya que, en la mayor parte
de los casos, un título más elevado se corresponde con un nivel
más elevado de reactividad cruzada (Tabla III). A pesar de ello, el
título sólo no puede siempre explicar las diferencias de
reactividad cruzada, como se muestra con los sueros procedentes de
los ratones inmunizados con el plásmido pR6E2, que indujo menores
títulos que los constructos pD6E2, pH1E2 y pM63E2, pero que
reaccionó con un gran número de péptidos de HVR1 naturales. De
manera similar, los sueros procedentes de ratones inmunizados con
pF7E2, pM122E2 y pRE2 mostraron una reactividad cruzada dos veces
superior a la observada con el suero inmune pG31E2, a pesar de su
título similar. (Tabla III).
En los ratones C57Black, la inyección del gen
quimérico pF78E2 llevó al desarrollo de una respuesta más fuerte
con una reactividad cruzada consiguientemente más elevada, en
comparación con la de los ratones Balb/C (49% vs. 28%).
Se inmunizaron tres grupos de ratones Balb/c con
mezclas de plásmidos que codificaban quimeras de mimotopo/E2, cada
ratón recibió una cantidad total de 100 \mug de ADB /
inyección.
La mezcla A contenía los plásmidos que
codificaban las fusiones de D6, F78, G31, H1, M122 Y R6 con E2. La
mezcla B incluyó también los otros tres constructos que inducían
anticuerpos con reactividad cruzada: pE19E2, pM63E2 u pR9E2,
mientras que la mezcla C comprendía los once plásmidos (las mezclas
de plásmidos, y los ácidos nucleicos que codifican los péptidos, de
acuerdo con cada una de las Mezclas A, B y C representan aspectos
adicionales de la presente invención).
Las tres muestras resultaron ser inmunogénicas, e
indujeron un suero con fuerte reactividad cruzada (Tabla III). Los
anticuerpos procedentes de animales inmunizados con la mezcla A no
mostraron una reactividad cruzada más elevada cuando se compararon
con la que se obtiene inyectando los plásmidos individuales
incluidos en los cocktails. Sin embargo, debe enfatizarse que en el
primer caso, los títulos fueros aproximadamente cincuenta veces
inferiores, sugiriendo que la Mezcla A tiene el potencial de inducir
una respuesta con reactividad cruzada más amplia siempre que se
incremente la eficiencia de la inmunización. Los resultados que se
obtienen con la Mezcla B dan más soporte a esa hipótesis. Los
ratones receptores de la segunda mezcla de plásmidos mostraron un
incremento neto de la reactividad cruzada puesto que desarrollaron
un antisuero capaz de reconocer aproximadamente el 50% de las
secuencias de HVR1 naturales ensayadas. Igualmente en este caso, os
títulos promedio fueron inferiores en un orden de magnitud a los
que presentaban la mayor parte de suero con reactividad cruzada
procedente de animales inmunizados con plásmidos individuales
(Tabla III).
La liberación intramuscular de la mayor parte de
la mezcla del compuesto que incluía todos los plásmidos que
codificaban las quimeras mimotopo/E2 no mejoraron el espectro de
reactividades del suero inmunológico resultante. Este resultado es
consistente con la falta de reactividad cruzada observada mostrada
por los animales inmunizados con los dos contractos adicionales
presente en este cocktail (pB14E2 y pB24E2).
Se obtuvieron datos similares inmunizando ratones
C57black.
Alter, H.J. (1995) Blood 85,
1681-1695
Bartoli, F y col., (1996)
Bio Techniques 20 554-558+
Bukh, J., (1995) Seminars in
Liver Disease 15, 41-63.
Casari, G., et al. (1995)
Nature Structural Biology. 2, 171-178.
Chao, Q.L., et al. (1989)
Science 244, 359-362.
Chao, Q.L., et al. (1994)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1294-1298.
Cohen, J, (1993) Science
259: 1691-1692.
Cormack, B.P. and Struhl, K.
(1993).Science 262 244-248.
Cortese, R., et al. (1994)
Tibtech 12, 262-266.
Cortese, R., et al. (1996)
Current Opinions in Biotechnology 7, 616- -621.
Dente, L., et al. (1994)
Gene 148, 7-13.
Farci, P., et al. (1992)
Science 258 135-140.
Farci, P., et al. (1994)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7792-7796.
Farci. P., et al. (1996)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 15394- -15399.
Felici, F., et al. (1996)
J. Mal. Biol. 222, 301-310.
Folgori, A., et al. (1991)
EMBO J. 13, 2236-2243.
Fried, M.W. and Hoofnagle, J.R.
(1995) Semin. Liver Dis. 15,
82-91.
Kato, N., et al. (1993)
J. Virol. 67, 3923-3930.
Kojima, M., et al. (1994)
Virology 204, 665 - 672.
Kurosaki, M., et al. (1994)
Virology 205, 161-169.
Major, r.1: E., et al.,
(1995) J. Virol. 69, 5798-5805.
Martell, M., et al., (1992)
J. Virol. 66, 3225-3229.
Martell, M., et al. (1994)
J. Virol. 68, 3425-3436.
Mast, E.E. and Alter, M.J.
(1993) Semi. Virola 4, 273-283
Mecchia, M., et al.
(1996).J. Irnmunol., 157,
3727-3736.
Meola, A., et al. (1995).
J. Irnmunol. 154, 3162-3172.
Pessi, A., et al. (1990).
J. Chern. Soc, Chemical Communications, 1,
8-9.
Prezzi, C., et al. (1996).
J. Immunol. 156, 4504-4513.
Scarselli, E.et al. (1995)
J. Viral. 69, 4407-4412.
Shimizu, Y.K., et al. (1992)
Prac. Natl. Acad. Sci. USA 89,
5477-5481.
Shimizu, Y.K., et al. (1994)
J. Virol. 65, 1494-1500.
Shimizu, Y.K., et al.,
(1997). J. Virol. 71, 5769-5773.
Silini, E., et al., (1995)
Hepatology 21, 285-290.
Simmonds, Po, et al. (1993).
J. Gen. Viro 74, 2391-2399.
Tam, J.P. (1988) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85:5409-5413.
van Doorn, L., et al. (1995)
J. Virol. 69; 773-778.
Weiner, A.J., et al.,
(1991). Virology 1-80,
842-848.
Weiner, A.J., et al. (1992).
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 3468-3472.
Weiner, A., et al. (1995).
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,
2755-27.59.
Winter, G. and Milstein, C.
(1991) Nature 349, 293-299.
Yang, N.S., et al. (1990).
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9568-9572.
Las rondas de enriquecimiento primera y segunda
de la biblioteca de HVR1 con suero procedente de pacientes
infectados se indican en la parte superior de la tabla. Los nombres
de los sueros y el genotipo del virus de infección correspondiente
(entre paréntesis) se muestran en la columna de la izquierda. En la
columna de la derecha se indican los nombres de las baterías de
fagos resultantes.
i indica la posición del aminoácido (1 a 27); aa
indica el aminoácido en un código normalizado de una sola letra;
Fs(i,aa) es la frecuencia en posición i del aminoácido aa en
los mimotopos "fuertes"; Fw(i,aa) es la frecuencia en
posición i del aminoácido aa en los mimotopos "débiles".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| 1ª Selección | 2ª Selección | ||||
| Suero / genotipo | Batería | Suero / genotipo | Batería | ||
| de fago | de fago | ||||
| \sigma4R | (1b) | 4R | \sigma2 | (1b) | B |
| \sigma3R | (3a) | 3R | \sigma1 | (1a) | D |
| \sigma3 | (2a) | 3 | \sigma2 | (1b) | E |
| \sigma2R | (3a) | 2R | \sigma3 | (2a) | R |
| \sigma1 | (1a) | 1 | \sigma4 | (2a) | F |
| \sigma2 | (1b) | H | |||
| \sigma2 | (1b) | G | |||
| \sigma2P | (2b) | 2P | \sigma1 | (1a) | L |
| \sigma4 | (2a) | M | |||
| \sigmaN | N |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Plásmido | Título | Nº de péptidos positivos |
| pB14E2 | 270 | 0 |
| pB24E2 | 189 | 0 |
| pD6E2 | 4222 | 3 |
| pE19E2 | 990 | 2 |
| pF78E2 | 31812 | 12 |
| pG31E2 | 31251 | 5 |
| pH1E2 | 2977 | 1 |
| pM63E2 | 3888 | 2 |
| pM122E2 | 41360 | 10 |
| pR6E2 | 1923 | 6 |
| pR9E2 | 21092 | 11 |
| mF78 | 110 | 2 |
| MIX | 684 | 11 |
| MIX | 1224 | 19 |
| MIX | 610 | 18 |
| pF78E2 | 41547 | 21 |
| MIX | 20381 | 24 |
<110> Istituto di Recerche di Biologia
Molecolare P Angeletti S.p.a.
\hskip1cmNicosia, Alfredo
\hskip1cmLahm, Armin
\hskip1cmTramontano, Anna
\hskip1cmCortese, Ricardo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Mimotopos de la región hipervariable
1 de la glicoproteína E2 de HCV, y usos de la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> SMW/PF5769302
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/EP99/03344
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
14-05-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 9810756.8
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
19-05-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 199
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Gln ó Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es His, Thr ó Arg.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Val ó Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Thr o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ser, Val ó Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ala, Gln ó Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ala, Gly ó Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Arg ó His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Thr, Ala o Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Thr, Ala o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ser, His ó Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Gly, Ser ó Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Thr ó Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ser, Gly ó Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ser ó Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Pro, Leu, Ser ó Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ala, Pro ó Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ser, Lys o Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Asn ó Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu}
\sac{Xaa Xaa Leu Phe Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gln
Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Thr His Thr Val Gly Gly Val Gln Gly Arg
Gin Arg His Ser Leu}
\sac{Thr Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ala Ser Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Thr Thr Thr Thr Gly Gly Gln Val Ser His
Ala Thr His Gly Leu}
\sac{Thr Gly Leu Phe Ser Leu Gly Pro Gln Gln
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Thr His Thr Thr Gly Gly Ser Ala Ser His
Gln Ala Ser Gly Leu}
\sac{Thr Arg Leu Phe Ser Gln Gly Pro Ser Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Thr His Val Val Gly Gly Gln Gln Gly Arg
Gln Val Ser Ser Leu}
\sac{Val Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ala Ser Gln
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Thr His Thr Val Gly Gly Ser Val Ala Arg
Gln Val His Ser Leu}
\sac{Thr Gly Leu Phe Ser Pro Gly Pro Gln Gln
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Thr His Thr Val Gly Gly Ser Gln Ala His
Ala Ala His Ser Leu}
\sac{Thr Arg Leu Phe Ser Pro Gly Ser Ser Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Thr Thr Val Val Gly Gly Ser Gln Ala Arg
Ala Ala His Gly Leu}
\sac{Val Ser Leu Phe Ser Leu Gly Ser Lys Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Thr His Val Val Gly Gly Val Gln Gly Arg
Gln Thr Ser Gly Leu}
\sac{Val Gly Leu Phe Ser Pro Gly Ser Lys Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Thr Thr Val Val Gly Gly Ser Gln Ser His
Thr Val Arg Gly Leu}
\sac{Thr Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ala Ser Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
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artificial: péptido sintético
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artificial: péptido sintético
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artificial: péptido sintético
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artificial: péptido sintético
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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artificial: péptido sintético
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artificial: péptido sintético
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artificial: péptido sintético
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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Leu Val Gly Leu Phe}
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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Thr Ser Arg Leu Val}
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Lys}
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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\sa{Thr Thr Thr Thr Val Gly Gly Gln Ala Ser His
Thr Thr Ser Ser Leu}
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Lys}
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<210> 38
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<211> 27
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Thr His Thr Thr Gly Gly Val Val Ser His
Gln Thr Arg Ser Leu}
\sac{Val Gly Leu Phe Ser Pro Gly Pro Gln Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 39
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<211> 27
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es His ó Thr
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
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<223> Xaa es His ó Arg
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<220>
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<221> EMPLAZAMIENTO
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<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Gly, Ser o Arg
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)
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<223> Xaa es Pro, Leu ó Gln
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<220>
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<221> EMPLAZAMIENTO
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<222> (24)
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<223> Xaa es Ala, Ser ó Pro
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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Gln Ala Ser Ser Leu}
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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artificial: péptido sintético
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artificial: péptido sintético
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artificial: péptido sintético
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Gln Ala Ser Ser Leu}
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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Gln Ala Ser Ser Leu}
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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artificial: péptido sintético
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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artificial: péptido sintético
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<223> Descripción de la secuencia
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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Gln Ala Ser Ser Leu}
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artificial: péptido sintético
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artificial: péptido sintético
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<223> Descripción de la secuencia
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<223> Descripción de la secuencia
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 146
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\sa{Gln Thr Thr Thr Val Gly Gly Gln Ala Ser Arg
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 147
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Thr Thr Thr Val Gly Gly Gln Ala Ser Arg
Gln Ala Ser Ser Leu}
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<210> 148
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<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Gln ó Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es His, o Thr.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Thr o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Thr ó Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Gln ó Ser, Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ala, Gln ó Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ser, Gly ó Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Gln, Ala o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ala, Thr o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ser, His ó Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ser, Gly, ó Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Thr ó Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ser, o Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ala, Ser ó Pro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Lys, Ser ó Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Asn ó Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 148
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Gly Gly Xaa Xaa Xaa His
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu}
\sac{Xaa Xaa Leu Phe Ser Pro Gly Xaa Xaa Gln
Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 149
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Thr Thr Thr Thr Gly Gly Val Gln Gly His
Thr Thr Arg Gly Leu}
\sac{Val Arg Leu Phe Ser Leu Gly Ser Lys Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 150
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Thr Arg Thr Val Gly Gly Gln Met Gly His
Gly Val Arg Gly Leu}
\sac{Thr Ser Leu Phe Ser Ala Gly Ser Ala Arg
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 151
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Thr His Val Thr Gly Ala Leu Gln Gly Arg
Ala Ala Tyr Gly Ile}
\sac{Thr Ser Phe Leu Ser His Gly Pro Ser Gln
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 152
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Thr Arg Val Thr Gly Gly Val Gln Gly His
Val Thr Ser Thr Leu}
\sac{Thr Ser Leu Phe Arg Pro Gly Ala Ser Gln
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 153
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Thr His Thr Ser Gly Gly Ser Val Ala Arg
Ala Ala Phe Gly Leu}
\sac{Thr Ser Ile Phe Ser Pro Gly Ala Lys Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 154
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 154
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Thr His Val Thr Gly Gly Ser Ala Gly Arg
Thr Thr Ala Gly Leu}
\sac{Val Gly Leu Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 155
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 155
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Thr Tyr Thr Thr Gly Gly Ser Ala Ala Lys
Thr Ala His Arg Leu}
\sac{Ala Ser Phe Phe Thr Val Gly Pro Lys Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 156
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr His Val Val Gly Gly Ala Thr Glu Arg
Thr Ala Tyr Ser Leu}
\sac{Thr Gly Leu Phe Thr Ala Gly Pro Lys Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 157
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Thr Thr Cys Gln Gly Gly Val Tyr Ala Arg
Gly Ala Gly Gly Ile}
\sac{Ala Ser Leu Phe Ser Val Gly Ala Asn Gln
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 158
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 158
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Thr Leu Ser Phe Gly Gly Leu Pro Glu His
Thr Thr His Gly Phe}
\sac{Ala Ser Leu Ser Ala Pro Gly Ala Lys Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 159
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Thr Ile Leu Met Ala Gly Arg Gln Ala Glu
Val Thr Gln Ser Phe}
\sac{Pro Gly Leu Phe Ser Leu Ala Pro Ser Gln
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 160
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 160
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr His Ala Met Gly Gly Val Val Ala Arg
Ser Ala Tyr Arg Ile}
\sac{Thr Ser Phe Leu Ser Pro Gly Ala Ala Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 161
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 161
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Thr Arg Ile Thr Gly Gly Ser Met Ala Arg
Asp Val Tyr Arg Phe}
\sac{Thr Gly Phe Phe Ala Arg Gly Pro Ser Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>162
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 162
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Thr His Thr Ile Gly Gly Ser Gln Ala Gln
Gln Ala Asn Arg Phe}
\sac{Val Ser Met Phe Ser Arg Gly Pro Ser Gln
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 163
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 163
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr Tyr Val Thr Gly Gly Ala Ala Ala Arg
Gly Ala Ser Gly Ile}
\sac{Thr Ser Leu Phe Ser Arg Gly Pro Ser Gln
Lys}
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 164
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 164
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr Tyr Ala Ser Gly Gly Ala Val Gly His
Gln Thr Ala Ser Phe}
\sac{Val Arg Leu Leu Ala Pro Gly Pro Gln Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 165
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Thr His Thr Thr Gly Gly Glu Ala Ala Arg
Thr Thr Leu Gly Ile}
\sac{Ala Ser Leu Phe Thr Ser Gly Ala Asn Gln
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 166
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Thr His Thr Thr Gly Gly Ser Ala Ala Arg
Ala Thr Phe Gly Ile}
\sac{Ala Asn Phe Phe Thr Pro Gly Ala Lys Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 167
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 167
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Thr Tyr Thr Ser Gly Gly Ser Ala Ala His
Thr Thr Ser Gly Phe}
\sac{Val Ser Phe Phe Ser Pro Gly Ala Lys Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 168
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Thr Thr Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg
Thr Thr Ser Ser Phe}
\sac{Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 169
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 169
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr His Thr Val Gly Ala Ala Ala Ser Arg
Ser Thr Ala Gly Leu}
\sac{Thr Ser Leu Phe Ser Ile Gly Arg Ser Gln
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 170
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 170
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr Arg Val Thr Gly Gly Val Gln Ser Arg
Thr Thr Gly Thr Phe}
\sac{Val Gly Leu Phe Thr Pro Gly Pro Ser Gln
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 171
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 171
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr His Val Ser Gly Gly Arg Val Gly His
Thr Thr Arg Ser Leu}
\sac{Thr Ser Phe Phe Thr Pro Gly Pro Gln Gln
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 172
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Thr Arg Val Ser Gly Gly Gln Gln Gly Arg
Ala Ala His Ser Leu}
\sac{Thr Ser Leu Phe Thr Leu Gly Ala Ser Gln
Asn}
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 173
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 173
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Thr Arg Ile Thr Ala Gln Ala Glu Gly Arg
Gly Ala Ser Thr Leu}
\sac{Thr Ser Leu Phe Thr Ser Gly Ala Ser Gln
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 174
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Thr Ile Val Ser Gly Gly Thr Val Ala Arg
Thr Thr His Ser Leu}
\sac{Ala Ser Leu Phe Thr Gln Gly Ala Ser Gln
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 175
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Thr Arg Val Thr Gly Gly Ala Ala Gly His
Thr Ala Phe Gly Phe}
\sac{Ala Ser Phe Leu Ala Pro Gly Ala Lys Gln
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 176
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr Tyr Val Thr Gly Gly Sar Ala Gly Arg
Ala Val Ala Gly Phe}
\sac{Ala Gly Leu Leu Gln Pro Gly Ala Lys Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 177
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 177
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Thr His Ser Val Gly Gly Ser Ala Ala His
Thr Thr Ser Arg Phe}
\sac{Thr Ser Leu Phe Ser Pro Gly Pro Gln Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 178
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Thr His Val Thr Gly Gly Ser Ala Ala Ser
Thr Thr Ser Thr Leu}
\sac{Thr Lys Leu Phe Met Pro Gly Ala Ser Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 179
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 179
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Thr Arg Thr Val Gly Gly Ala Asn Ala Arg
Asn Thr Tyr Gly Leu}
\sac{Thr Thr Leu Phe Thr Thr Gly Pro Lys Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 180
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 180
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Thr Thr Thr Val Gly Ser Ala Val Ser Ser
Thr Thr Tyr Arg Phe}
\sac{Ala Gly Met Phe Ser Gln Gly Ala Gln Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 181
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr His Thr Val Glu Gly Thr Gly Gly Phe
Ala Thr Gln Arg Leu}
\sac{Thr Ser Leu Phe Ala Leu Gly Pro Ser Gln
Lys}
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 182
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr His Val Thr Gly Gly Val Val Ala Arg
Asn Ala Tyr Arg Ile}
\sac{Thr Thr Phe Leu Asn Pro Gly Pro Ala Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 183
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Thr Tyr Thr Thr Gly Gly Thr Ala Ser Arg
His Thr Gln Ala Phe}
\sac{Ala Gly Leu Phe Asn Ile Gly Pro Gln Gln
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 184
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Thr His Val Thr Gly Met Val Ala Gly Lys
Asn Ala His Thr Leu}
\sac{Ser Ser Ile Phe Thr Ser Gly Pro Ser Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 185
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Thr His Val Thr Gly Gly Lys Val Ala Tyr
Thr Thr Gln Gly Phe}
\sac{Thr Ser Phe Phe Ser Arg Gly Pro Ser Gln
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 186
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 186
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Thr Tyr Thr Ser Gly Gly Asn Ala Gly His
Thr Met Thr Gly Ile}
\sac{Val Arg Phe Phe Ala Pro Gly Pro Lys Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 187
\vskip0.400000\baselineskip
<211>27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 187
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Thr Tyr Ser Met Gly Gly Ala Ala Ala His
Asn Ala Arg Gly Leu}
\sac{Thr Ser Leu Phe Ser Ser Gly Ala Ser Gln
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 188
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Thr His Val Thr Gly Gly Ser Ala Gly Arg
Ser Val Leu Gly Ile}
\sac{Ala Ser Phe Leu Thr Arg Gly Pro Lys Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 189
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 189
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Thr Tyr Ile Ile Gly Ala Ala Thr Gly Arg
Thr Thr Ala Gly Leu}
\sac{Thr Ser Leu Phe Ser Ser Gly Ser Gln Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 190
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 190
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Thr His Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg
Thr Thr Ala Gly Leu}
\sac{Val Gly Leu Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln
Asn}
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 191
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Thr His Val Thr Gly Gly Ser Ala Gly His
Thr Ala Ala Gly Ile}
\sac{Ala Ser Phe Phe Ala Pro Gly Pro Lys Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 192
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr Arg Val Thr Gly Gly Val Gln Ser His
Thr Thr Arg Gly Phe}
\sac{Val Gly Met Phe Ser Leu Gly Pro Ser Gln
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 193
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgagatctt aattaacgat atccagctta taaac
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 194
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica perdida
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n se describe como 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 194
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccggatcct tagtggtggt ggtggtggtg cggnag
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 195
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 195
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcggccgtt taattaac
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 196
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgagatctt aattaaccag acccatacca cc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 197
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccggatcct tagtggtggt ggtggtggtg gttctgtttc gcgcc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 198
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ser, Gly, Ala, Asn, Lys, Arg ó
Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Leu, Phe, Ile, Met ó Trp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Phe o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4) ... (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Gly o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de consenso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 198
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 199
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ser, Gly, Ala, Asn, Lys, Arg ó
Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Leu, Phe, Ile, Met ó Trp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Phe o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4) ... (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Gly o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> EMPLAZAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ala, Pro o Ser
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de consenso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 199
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (77)
1. Una biblioteca de al menos 10^{5} péptidos
diferentes, cada uno con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con
la siguiente fórmula ("Fórmula I"):
2. Una biblioteca de acuerdo con la
reivindicación 1 que incluye al menos 10^{6} péptidos diferentes
cada uno con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con dicha
fórmula.
3. Una biblioteca de acuerdo con la
reivindicación 2 que incluye al menos 10^{7} péptidos diferentes
cada uno con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con dicha
fórmula.
4. Una biblioteca de acuerdo con la
reivindicación 1 en la que los péptidos cada uno tiene una secuencia
de aminoácidos de la siguiente fórmula ("Fórmula III"):
5. Una biblioteca de acuerdo con la
reivindicación 4 con al menos 10^{6} péptidos diferentes con una
secuencia de aminoácidos de acuerdo con la Fórmula III.
6. Una biblioteca de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 5 mostradas sobre la superficie de
partículas de bacteriófago.
7. Un procedimiento para obtener uno o más
péptidos que contienen un epítopo con reactividad cruzada
inmunológica con un epitopo del HVR1 de una cepa de HCV, el
procedimiento incluye poner en contacto una biblioteca de péptidos
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y una
molécula de anticuerpo capaz de enlazar con dicho HVR1 de una cepa
de HCV, y seleccionar uno o más péptidos de la biblioteca capaz de
enlazar con dicho molécula de anticuerpo.
8. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7 en el que el péptido o péptidos seleccionados
contienen un epitopo con reactividad cruzada inmunológica con el
HVR1 de una pluralidad de cepas de HCV.
9. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8 que incluye poner en contacto una biblioteca de
péptidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5
y una pluralidad de moléculas de anticuerpos colectivamente capaces
de enlazar el HVR1 de una pluralidad de cepas de HCV.
10. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9 en el que dicha pluralidad de moléculas de
anticuerpos se deriva de suero procedente de individuos infectados
con HCV.
11. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 en el que dicha biblioteca
se muestra sobre la superficie de partículas de bacteriófago, cada
partícula contiene ácido nucleico que codifica el péptido mostrado
sobre la superficie.
12. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11 en el que el ácido nucleico se toma de una
partícula de bacteriófago que muestra dicho péptido
seleccionado.
13. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12 que incluye producir un péptido por expresión a
partir del ácido nucleico, tomando la secuencia de ácido nucleico de
una partícula de bacteriófago que muestra dicho péptido
seleccionado.
14. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13 en el que un péptido con
la secuencia de aminoácidos de dicho péptido seleccionado se
proporciona de forma aislada.
15. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13 en el que una pluralidad
de péptidos cada uno con la secuencia de aminoácidos de dicho
péptido seleccionado se proporciona de forma aislada.
16. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13 en el que se proporciona
de forma aislada una mezcla de dicha pluralidad de péptidos.
17. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 en el que dicho péptido
con la secuencia de aminoácidos de dicho péptido seleccionado, dicha
pluralidad de péptidos o dicha mezcla de varios péptidos en forma
aislada se proporciona por expresión a partir de ácido nucleico
codificante.
18. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 en la que dicho péptido
con la secuencia de aminoácidos de dicho péptido seleccionado, dicha
pluralidad de péptidos o dicha mezcla de una pluralidad de péptidos
en forma aislada se proporciona por síntesis de péptidos.
19. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18 en el que dicho péptido
con la secuencia de aminoácidos de dicho péptido seleccionado, dicha
pluralidad de péptidos o dicha mezcla de una pluralidad de péptidos
en forma aislada se fórmula en una composición que incluye al menos
un componente adicional.
20. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 19 en el que dicha composición incluye un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
21. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 19 en el que dicho composición incluye un
adyuvante.
22. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17 en el que la secuencia de
aminoácidos de dicho péptido seleccionado se proporciona en una
fusión con aminoácidos adicionales.
23. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 22 en el que dicha fusión incluye la proteína HCV
E2/NS1 con dicha secuencia de aminoácidos en la posición del
HVR1.
24. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 22 o la reivindicación 23 en el que dicha fusión se
formula en una composición que incluye al menos un componente
adicional.
25. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 24 en el que dicha composición incluye un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
26. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 24 en el que dicho composición incluye un
coadyuvante.
27. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 23 en el que dicha fusión se incluye en un HCV
recombinante.
28. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 27 en el que dicho HCV recombinante se formula en una
composición que incluye al menos un componente adicional.
29. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 28 en el que dicha composición incluye un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
30. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 28 en el que dicho composición incluyes un
coadyuvante.
31. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 30 en el que dicho péptido
seleccionado tiene, o cada uno de los seleccionados péptidos tiene,
una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la siguiente fórmula
("Fórmula II"):
32. Una mezcla de 108 péptidos diferentes que se
pueden obtener a partir de una biblioteca de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que cada uno de los
108 péptidos diferentes tiene una secuencia de aminoácidos de
acuerdo con la siguiente fórmula ("Fórmula II"):
33. Una composición que incluye una pluralidad de
péptidos de Fórmula II que se pueden obtener a partir de una mezcla
de acuerdo con la reivindicación 32.
34. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 33 que incluye entre 2 y aproximadamente 10 péptidos
diferentes que se pueden obtener a partir de dicha mezcla.
35. Una composición que incluye una pluralidad de
péptidos que se pueden obtener a partir de la biblioteca de la
reivindicación 1, que incluye uno o más de los siguientes
péptidos:
36. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 35 que incluye dichos péptidos:
37. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 35 que incluye dichos péptidos
38. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 35 que incluye dichos péptidos
39. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 33 a 38 en la que uno o más de dichos
péptidos es una fusión con aminoácidos adicionales.
40. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 39 en la que dicha fusión incluye la proteína
HCVE2/NS1 con el péptido en la posición HVR1.
41. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 40 en la que dicha fusión se incluye en un HCV
recombinante.
42. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 33 a 41 que incluye al menos un componente
adicional.
43. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 42 en la que dicha composición incluye un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
44. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 42 en la que dicha composición incluye un
coadyuvante.
45. Un péptido que se pueden obtener a partir de
una biblioteca de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5.
46. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
45 de Fórmula II que se pueden obtener a partir de una mezcla de
acuerdo con la reivindicación 32.
47. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
45 con una secuencia de aminoácidos seleccionados entre el grupo que
consiste de:
48. Una composición que incluye uno o más
péptidos de acuerdo con la reivindicación 45 o la reivindicación
47.
49. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 48 que incluye entre 2 y aproximadamente 10 péptidos
diferentes de acuerdo con la reivindicación 45 o la reivindicación
47.
50. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 48 o la reivindicación 49 en la que uno o más de
dicho péptidos está en una fusión con aminoácidos adicionales
51. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 50 en la que dicha fusión incluye la proteína
HCVE2/NS1 con un péptido en la posición HVR1.
52. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 51 en la que dicha fusión se incluye en un HCV
recombinante.
53. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 48 a 52 que incluye al menos un componente
adicional.
54. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 53 en la que dicha composición incluye un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
55. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 53 en la que dicha composición incluye un
coadyuvante.
56. Ácido nucleico que codifica uno o más
péptidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 45 a
47.
57. Ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 56 enlazado de forma operativa a secuencias de
regulación para la expresión del péptido o péptidos codificados.
58. Una célula huésped que contienen ácido
nucleico de acuerdo con la reivindicación 57.
59. Un procedimiento para la producción de un
péptido o péptidos de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 45 a 47, el procedimiento incluye producir la
expresión a partir del ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 57, o cultivar células huésped de acuerdo con la
reivindicación 58 en condiciones para la producción de dicho péptido
o péptidos.
60. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 59 que incluye el aislamiento y/o purificación de
dicho péptido o péptidos.
61. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 59 o 60 que incluye formular
dicho péptido o péptidos en una composición que incluye al menos un
componente adicional.
62. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 61 en la que dicha composición incluye un excipiente
farmacéuticamente aceptable o un coadyuvante.
63. Un procedimiento para obtener una o más
molécula de anticuerpos que contienen un emplazamiento de enlace
capaz de enlazar con el epitopo del HVR1 de una pluralidad de cepas
de HCV, el procedimiento incluye poner en contacto una población de
moléculas de anticuerpos y un péptido de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 45 a 47, y seleccionar una o más moléculas
de anticuerpos de la población capaz de enlazar con dicho
péptido.
64. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 63 que incluye poner en contacto la población de
anticuerpos con una pluralidad de péptidos de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 45 a 47.
65. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 63 o la reivindicación 64 en la que los péptidos se
proporcionan en una fusión con aminoácidos adicionales.
66. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 63 a 65 en el que dicho péptido o
pluralidad de péptidos se administra a un mamífero no humano para
ponerlo en contacto con una población de moléculas de anticuerpos
producidas por el sistema inmunológico del mamífero, a continuación,
se toma del mamífero una o más moléculas de anticuerpos capaz de
enlazar con dicho péptido o péptidos, o células que puedan producir
dichas moléculas de anticuerpo.
67. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 66 en el que se toman las moléculas de anticuerpos de
dichas células o de los descendientes de las mismas.
68. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 63 a 65 en la que la población de
moléculas de anticuerpos se muestra sobre la superficie de
partículas de bacteriófago, cada partícula contiene ácido nucleico
que codifica la molécula de anticuerpo mostrada sobre su
superficie.
69. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 68 en el que el ácido nucleico se toma de una
partícula de bacteriófago que muestra sobre la una molécula de
anticuerpo capaz de enlazar con dicho péptido o péptidos.
70. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 69 que incluye la producción de una molécula de
anticuerpo por expresión a partir del ácido nucleico con la
secuencia de ácido nucleico tomada de una partícula de bacteriófago
que muestra una molécula de anticuerpo capaz de enlazar con dicho
péptido o péptidos.
71. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 63 a 70 en el que se proporciona
en forma aislada una molécula de anticuerpo capaz de enlazar con
dicho péptido o péptidos.
72. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 71 en la que se proporciona en forma aislada una
pluralidad de moléculas de anticuerpos capaz de enlazar con dicho
péptido o péptidos.
73. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 72 en la que se proporciona en forma aislada una
mezcla de dicha pluralidad de moléculas de anticuerpos.
74. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 71 a 73 en el que dicha molécula
de anticuerpo, pluralidad de moléculas de anticuerpos o mezcla de
pluralidades de moléculas de anticuerpos en forma aislada se
proporciona por expresión a partir del ácido nucleico
codificante.
75. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 71 a 74 en el que dicha molécula
de anticuerpo, pluralidad de moléculas de anticuerpos o mezcla de
pluralidad de moléculas de anticuerpos en forma aislada se formula
en una composición que incluye al menos un componente adicional.
76. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 75 en el que dicha composición incluye un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
77. El uso de una composición de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 33 a 44 o las reivindicaciones 48
a 55 un péptido de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 45 a 47, o ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 56 o 57 en la fabricación de un medicamento para
producir anticuerpos en un mamífero capaces de enlazar con los
epitopos HCV HVR1.
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