CN1274387A - Hcve2糖蛋白高变区1的拟表位及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及是C型肝炎病毒(HCV)的推断的包膜蛋白E2的高变区1(HVR1)的拟表位的肽,其在获得抗不同HCV株的抗体和产生免疫应答交叉—反应中的用途。

Description

HCV E2糖蛋白高变区1的拟表位及其用途

本发明是关于多肽，尤其是关于丙型肝炎病毒(HCV)的推定外壳糖蛋白E2高变区1(HVR1)拟表位(mimotopes)的多肽。本发明的发明者综合应用了许多技术，在天然存在的HVR1序列的共有序列分析以及通过实验确定与抗不同分离群的抗体的交叉反应性的基础上设计了大量多肽，这些多肽中没有一个在自然界中被发现过。这些多肽可彼此独立用于免疫和制备抗体，用于体外用途(如诊断)和体内用途，而这些多肽的肽库则可用于鉴别与能结合大量不同HCV株HVR1的抗体具有特殊交叉反应性的多肽。这些多肽可以独立使用或作为融合蛋白的一部分，如作为重组HCV E2多肽的一部分，使用。上述重组HCV E2多肽可被结合入重组的HCV病毒颗粒中。

HCV HVR1区是整个病毒基因组中最为可变的抗原片段，其主要负责感染病毒的大的个体间和个体内异体性。其包含一个主要的中和表位，该中和表位被认为是病毒逃避宿主免疫应答机制的主要因素。因为由于抗HVR1抗体是目前为止证明具有保护性效应唯一抗体，所以发展有效的防治疗法非常困难。

在设计本发明时，发明者从源自不同病毒分离物的两百多个HVR1序列中得到了一个共有分布型(consensus profile)并用此作为模板得到了一个大的完整的合成HVR1代用品库，借此解决了HVR1的可变性的问题。上述代用品库是以M13噬菌体主要外壳蛋白III融合蛋白的形式提供的，以使其位于噬菌体颗粒表面。这个库利用源自不同感染病人的血清进行亲和选择。这样就可鉴别出与病人血清反应频率高但与未感染的对照血清不反应的噬菌体。上述选出的表现出与大量从天然HCV变株重复产生HVR1的多肽具有交叉反应的血清抗体结合。

从这些“拟表位”中鉴定出了一种引起上述观察到的交叉反应性序列模式。当注射到实验动物内时，具有最高交叉反应性的拟表位诱导出能识别同一系列天然HVR1变型的抗体。丙型肝炎病毒(HCV)是全世界范围内输血相关的以及零星的非甲非乙型肝炎的主要致病因，估计在输出血人群中流行率为0.4％-2％(Choo et al.，1989)。在至少70％的病例中HCV感染导致持久的病毒性和慢性疾病，其中相当大一部分最终发展成肝硬化和肝癌。(综述见H.Alter，1995)。尽管可以对HCV诊断进行可靠的血清学测定，在世界范围内由于群落传染导致的感染仍然很普遍并导致严重的发病率和死亡率(Mast and Alter，1993)。并且，干扰素治疗，目前唯一可行的抗病毒疗法，仅对20-30％的病人有效(Fried and Hoofnagle，1995)。因此，发展HCV疫苗是此领域中高度优先考虑的项目。

尽管宿主产生了一系列体液和细胞介导的免疫应答，这种病毒仍然经常导致永久感染，这种现象过去引起了对存在抗HCV的保护性免疫力的关注(Farci et al.，1992)。事实上，可通过用推定的包膜蛋白E1和E2的重组形式免疫黑猩猩(除人外唯一的受HCV感染的物种)，诱导得到抗同源性病毒攻击的保护性免疫力(Choo et al.，1994)。但是这种反应对异源病毒感染具有多大效力还有待深入研究。

在受感染病人的血液中，HCV以准种的形式存在(Weiner等，1991；Martell等，1992；Martell等，1994；Kurosaki等，1994；Bukh等，1995)，其在主要作为免疫压力结果的病期中变动(Weiner et al.，1992；Kato et al.，1993；Kojima et al.，1994；Shimizu et al.，1994；van Doorn et al.，1995 Weiner et al.，1995).目前逐渐形成的观点是HCV慢性感染并不是因为缺少体液反应或细胞反应，而是因为该病毒的高突变率使得这些反应不起作用，因为高突变率导致一些变株幸存。

通过在注射到黑猩猩体内之前对来源清楚的病毒接种体的来自体内的中和作用证明中和抗体的存在以及它们在保护宿主不受病毒感染中的作用(Farci et al.，1994)。尽管如此，中和抗体是隔离种群特异性的，并且似乎只能阻止在相应体液反应开始之前已经出现的病毒变株(Farciet al.，1994)。尽管这种中和抗体的特异性尚未被很好地界定，免疫学和分子生物学证据都表明被中和抗体识别的表位位于HCV基因组的高变区1(HVR1)区(Farci et al.，1994)。该区由E2糖蛋白N末端的27个氨基酸组成，是整个HCV多蛋白中可变性最大的区域(Weiner et al.，1991)。抗-HVR1抗体在清除病毒中作用的直接证据来自最近的来自体内的中和实验。制备兔抗HVR1超免疫血清以抗一种具感染性的HCV接种体的特优种变种，从而在一只黑猩猩中废除了其感染性，并且通过阻断接种物中存在的主要变株的繁殖而部分保护了第二只动物(Farci etal.，1996)。

因此，证据表明HVR1含有HCV的主要中和决定簇，并且如果能克服变异性问题，那么它还应组成无细胞HCV疫苗的一个重要成分。与此相关，有人观察到来自人血清的抗HVR1抗体表现出对不同HVR1变型具有一定程度的交叉反应性(Scarselli et al.，1995)。

WO94/26306(Chiron Corporation)在比较了90多株据称在1993年5月12日已知病毒株序列的基础上公布了鉴定HCV HVR1区共有序列的尝试。公布的式是一包括以下序列的多肽：aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6，其中aa1是S，G，A，D，K，R或T；aa2是L，F，I，M，或W；aa3是F或L；aa4是任何氨基酸；aa5是任何氨基酸；aa6是G或A。上述式的前提是1993年五月12日之前的已知HCV分离物的天然存在的E2HV域的31个氨基酸序列中不得含有以上序列。在更深入的实施例中，存在aa7并且紧连aa6，aa7是A，P，或S。这6个氨基酸的序列代表约55,000个不同序列，而所述7个氨基酸的序列代表165,000个不同序列。

本发明的特点部分基于对HVR1可变性的细致研究。我们的研究表明HVR1的一些部位相对另一些部位可变性要小一些，这意味着真实的结构可变性以及免疫学可变性要比一级序列所暗示的异源性更要有限。本发明在多个方面涉及提供一种HCV HVR1的“合成变型”，该变型在免疫学上与许多，优选地，非常大量的天然HVR1变型相似，从而可以利用上述合成变型诱导与不同HCV变型，优选地，大部分或全部变株，交叉反应的中和抗体。本发明得到的多肽式与WO94/26306中提供的不同，本发明提供的是基于真正的交叉反应性比数，而不仅仅是基于序列比较，这一点还将在以下进一步解释。

噬菌体多肽库独一无二地为利用循环筛选/rescue/扩增程序快速调查大量多肽序列(10⁸或更多)提供了可能。它们允许鉴定任何类型的连接物，包括从线性多肽到折叠蛋白域，甚至碳水化合物，的配基(Cortese et al.，1994，Cortese et al.，1996)。这些配基是真正的拟表位，因为它们不一定和初始表位具有相同的氨基酸序列，但它们模仿了原始表位的结合特性。一种用于鉴定疾病特异的噬菌体表达拟表位的策略已有报道，这种策略只能利用源自免疫以及未免疫个体的已经过临床鉴定的血清。(Folgori et al.，1994，在此作为参考文献结合于本发明中)。进而，疾病特异的拟表位已被证明是天然抗原的良好免疫原性模拟物，因为注射入不同动物中时它们能诱导针对天然抗原的特异性免疫应答(Folgori et al.，1994；和Meola et al.，1995；(都作为参考文献结合于本发明中)Prezzi et al.，1996；Mecchia et al.，1996)。因此，噬菌体库可用作疾病特异抗体所识别的人工配基源，其优点是如果在库的富集过程中能被筛选出的话，可另外引入的合乎需要的特性。

在本发明的发明过程中，发明者通过与M13噬菌体主要外壳蛋白(pVIII)融合的方法得到一个很大的完整的HVR1代用品库来解决HVR1的可变性问题。利用选择和许多经临床鉴定的感染HCV病人的血清分离得到了显示出是具有良好抗原性和免疫原性的大量天然存在的HCV变株的模拟物的多肽。

以下是实验细节：

根据本发明的不同方面，本方面提供了含有大量不同多肽的多肽库、含有与许多HCV HVR1表位交叉反应的表位的单一多肽、以及这些不同的多肽的混合物。

本发明的一个方面提供了与下列共有分布型一致的多肽库：

Q T H V T G G S A A R T T S G L T S L F S P G A S Q N

T   T T V     V Q G H A A H S   V G     R L   P K   K

    R         Q V S   Q V R R     R       S   S Q

                                          Q

此分布型代表了总共9×10⁷个独立的序列，这个数字与目前的DNA克隆和转化技术实践上的上限大约10⁸非常接近。如以下所描述，通过克隆简并合成寡聚核苷酸并在M13的噬粒载体上与编码主要外壳蛋白(pVIII)的基因的5’-末端融合，此共有分布型被用于构建一个27氨基酸的多肽库。用人血清对该多肽库进行了充分的筛选并得到了一百个多个能特定识别人类抗HCV-HVR1抗体的不同克隆(拟表位)。几乎所有的这些拟表位都具有不同的氨基酸序列并且发现没有一个与已发表的天然HVR1序列(截至1998一月)相应。

在根据本发明的多肽库的一个优选实施方案中存在至少具有约10⁵个不同的多肽，优选地至少约10⁶个不同的多肽，更为优选地至少约10⁷个不同的多肽，例如约9×10⁷个不同的多肽。

多肽库可在噬菌体表面，尤其是线状噬菌体如fd或M13的表面，例如以与这些噬菌体的主要外壳蛋白(pVIII)融合的形式表达。表达多肽的噬菌体在本领域中是常规技术，其效力取决于噬菌体颗粒的构建。噬菌体颗粒应被构建为在每个包装好的病毒颗粒内是编码噬菌体表面表达的多肽的核酸。在选出表达感兴趣的多肽，如能结合一种或多种抗体(例如能结合许多不同HCV株的HVR1表位的抗体)，的噬菌体颗粒后能重新找到编码该多肽的核酸并用该核酸进一步生产具有那种氨基酸序列的多肽。

在以下描述的实验工作中，发明者用一系列人血清测试了一个根据本发明的多肽库中的拟表位。各个拟表位的特性用和血清反应的整体频率上的差异来描述。24个仅能与3种以下血清反应的克隆被定义为“弱”，而27个能与11种以上的血清反应的克隆被定义为“强”。

通过对“强”和“弱”克隆的共有序列的统计分析发现了HVR1中与人血清高频反应性、与人抗HVR1抗体的交叉反应性以及与在实验动物中诱导高交叉反应性血清相关的序列基序。

根据本发明的多肽和它们的混合物可如下定义，进一步的解释将在以下的实验部分给出：

(1)-完全由以下式(“式I”)定义的多肽库：

Q T H V T G G S A A R T T S G L T S L F S P G A S Q N

T   T T V     V Q G H A A H S   V G     R L   P K   K

    R         Q V S   Q V R R     R       S   S Q

                                          Q

也可写成

(aa1)T (aa3) (aa4) (aa5)GG (aa8) (aa9) (aa10) (aa11) (aa12)(aa13) (aa14) (aa15)L(aa17) (aa18)LF (aa21) (aa22)G (aa24)(aa25)Q (aa27)

其中aa1是Q或T；aa3是H，T或R；aa4是V或T；aa5是T或V；aa8是S、V或Q；aa9是A、Q或V；aa10是A，G或S；aa11是R或H；aa12是T、A或Q；aa13是T、A或V；aa14是S、H或R；aa15是G、S或R；aa17是T或V；aa18是S、G或R；aa21是S或R；aa22是P、L、S或Q；aa24是A、P或S；aa25是S、K或Q；aa27是N或K。

(2)-27种可从此多肽库得到的“强”多肽是根据本发明的多个方面的优选多肽，其氨基酸序列如下：

2.11 QT H TVGGVQG R QAHSLT S LF S P G A SQN

D6   QT T TTGGQVS H ATHGLT G LF S L G P QQK

D18  QT H TTGGSAS H QASGLT R LF S Q G P SQN

F63  QT H VVGGQQG R QVSSLV S LF S P G A SQK

G31  TT H TVGGSVA R QVHSLT G LF S P G P QQK

L13  QT H TVGGSQA H AAHSLT R LF S P G S SQN

M69  QT T VVGGSQA R AAHGLV S LF S L G S KQN

Z61  QT H VVGGVQG R QTSGLV G LF S P G S KQN

R9   QT T VVGGSQS H TVRGLT S LF S P G A SQN

B26  TT T TTGGQAG H QAHSLT S LF S P G A SQK

B22  QT H VVGGVQS H QTSGLT S LF S P G A SQK

B35  QT H TTGGVQG H QTSRLT S LF S P G P SQN

D29  TT T VVGGQAA H QTHSLT S LF S P G A KQN

D33  TT T TTGGQQS H TVHGLV G LF S P G S KQN

E26  QT H TVGGVQA H TVRGLT S LF S P G S SQN

F80  QT H TTGGQAG H TASSLT G LF S P G A KQN

F19  QT T TVGGVAS H QAHSLT G LF S P G A KQK

F78  QT H TTGGQAG H QAHSLT G LF S P G A KQN

H1   QT H TTGGVVG H ATSGLT S LF S P G P SQK

L76  TT T TVGGQAS H QTSSLT G LF S P G S KQN

M27  QT T TTGGVAS H AAHRLT S LF S P G P QQK

M122 QT T TTGGSAS H AVSSLT G LF S P G S KQN

M129 QT T VVGGSAG H TASSLV G LF S P G S KQN

M119 TT T TVGGQAS H TTSSLT G LF S P G S QQN

R5   QT H TTGGQAS H QVSSLV S LF S P G A KQK

R6   TT T TTGGQVG H QTSGLT G LF S P G A QQN

R27  TT H VVGGSAS H AVRGLT S LF S P G S SQN

根据本发明进而优选的多肽具有以下序列中的任何一个：

B14  QT T VTG_QAS H TTSSLT G LF S P G A SQK

B33  aT H aTGGQAA H STHSLT S LF S P G A SQK

F81  QT H VTGGSAA H QTgGLT G LF S P G P KQN

B18  QT T VVGGQAS H _VSRLT G LF S P G S SQK

L72  QT T T____AA H TTSGLT G LF S P G A KQN

D20  QT H VTG_VAG R QTSGLV S LF S P G S SQN

D30  Q_ _ __GGVQG H TTSSLV G LF S P G S QQN

E19  TT H T_GGQQA H TTSRLV S LF S P G A SQK

B24  TT T TVGGQAS H TTSSLT G LF S P G A SQK

M63  QT H TTGGVVS H QTRSLV G LF S P G P QQN

小写字母表示与式I不同的氨基酸残基，而下划线则强调表示从式I中缺失的氨基酸，当然，在相应多肽中侧翼的氨基酸是连续的。

这些是可从根据本发明的多肽库得到的多肽的变体，它们本身与式I不一致。它们在多肽库的扩增过程中由于PCR错误而产生并在实验过程中得到鉴定(见材料与方法，“构建HVR1多肽库)。

(3)-源自以上(2)的高交叉反应性多肽共有序列的一段“强共有序列”(“式II”)。

对27个“强”多肽的任何位置氨基酸出现频率的统计分析以及与25个“弱”多肽频率的比较见表II，并且在下面的实验部分进一步讨论。

式II

QT(aa3)TVGGQQS(aa11)QVHSLT(aa18)LF(aa21)(aa22)G(aa24)SQN

其中：aa3是H或T；aa11是H或R；aa18是G、S或R；aa21是S；aa22是P、L或Q；aa24是A、S或P。

也可写成：

         QT H TVGGQAS H QASSLT S LF S P G A KQN

            T         R        G      L   S

                               R      Q   P

斜体字表示的残基也包括在内。因为尽管这些残基出现的频率较小，但它们出现在一些测试中反应性最好的拟表位中(在以上的II的27个“强”多肽中用星号强调)。

27个用于得到式II的拟表位不包括在其中。

108种多肽与式II一致，每种多肽都是本发明的一个方面。这些序列是：

  1 QTHTV GGQAS HQASS LTSLF SPGAK QN

  2 QTHTV GGQAS HQASS LTSLF SPGSK QN

  3 QTHTV GGQAS HQASS LTSLF SPGPK QN

  4 QTHTV GGQAS HQASS LTSLF SLGAK QN

  5 QTHTV GGQAS HQASS LTSLF SLGSK QN

  6 QTHTV GGQAS HQASS LTSLF SLGPK QN

  7 QTHTV GGQAS HQASS LTSLF SQGAK QN 8  QTHTV GGQAS HQASS LTSLF SQGSK QN9  QTHTV GGQAS HQASS LTSLF SQGPK QN10  QTHTV GGQAS HQASS LTGLF SPGAK QN11  QTHTV GGQAS HQASS LTGLF SPGSK QN12  QTHTV GGQAS HQASS LTGLF SPGPK QN13  QTHTV GGQAS HQASS LTGLF SLGAK QN14  QTHTV GGQAS HQASS LTGLF SLGSK QN15  QTHTV GGQAS HQASS LTGLF SLGPK QN16  QTHTV GGQAS HQASS LTGLF SQGAK QN17  QTHTV GGQAS HQASS LTGLF SQGSK QN18  QTHTV GGQAS HQASS LTGLF SQGPK QN19  QTHTV GGQAS HQASS LTRLF SPGAK QN20  QTHTV GGQAS HQASS LTRLF SPGSK QN21  QTHTV GGQAS HQASS LTRLF SPGPK QN22  QTHTV GGQAS HQASS LTRLF SLGAK QN23  QTHTV GGQAS HQASS LTRLF SLGSK QN24  QTHTV GGQAS HQASS LTRLF SLGPK QN25  QTHTV GGQAS HQASS LTRLF SQGAK QN26  QTHTV GGQAS HQASS LTRLF SQGSK QN27  QTHTV GGQAS HQASS LTRLF SQGPK QN28  QTHTV GGQAS RQASS LTSLF SPGAK QN29  QTHTV GGQAS RQASS LTSLF SPGSK QN30  QTHTV GGQAS RQASS LTSLF SPGPK QN31  QTHTV GGQAS RQASS LTSLF SLGAK QN32  QTHTV GGQAS RQASS LTSLF SLGSK QN33  QTHTV GGQAS RQASS LTSLF SLGPK QN34  QTHTV GGQAS RQASS LTSLF SQGAK QN35  QTHTV GGQAS RQASS LTSLF SQGSK QN36  QTHTV GGQAS RQASS LTSLF SQGPK QN37  QTHTV GGQAS RQASS LTGLF SPGAK QN38  QTHTV GGQAS RQASS LTGLF SPGSK QN39  QTHTV GGQAS RQASS LTGLF SPGPK QN40  QTHTV GGQAS RQASS LTGLF SLGAK QN41  QTHTV GGQAS RQASS LTGLF SLGSK QN42  QTHTV GGQAS RQASS LTGLF SLGPK QN43  QTHTV GGQAS RQASS LTGLF SQGAK QN44  QTHTV GGQAS RQASS LTGLF SQGSK QN45  QTHTV GGQAS RQASS LTGLF SQGPK QN46  QTHTV GGQAS RQASS LTRLF SPGAK QN47  QTHTV GGQAS RQASS LTRLF SPGSK QN48  QTHTV GGQAS RQASS LTRLF SPGPK QN49  QTHTV GGQAS RQASS LTRLF SLGAK QN50  QTHTV GGQAS RQASS LTRLF SLGSK QN51  QTHTV GGQAS RQASS LTRLF SLGPK QN52  QTHTV GGQAS RQASS LTRLF SQGAK QN53  QTHTV GGQAS RQASS LTRLF SQGSK QN54  QTHTV GGQAS RQASS LTRLF SQGPK QN55  QTTTV GGQAS HQASS LTSLF SPGAK QN56  QTTTV GGQAS HQASS LTSLF SPGSK QN57  QTTTV GGQAS HQASS LTSLF SPGPK QN58  QTTTV GGQAS HQASS LTSLF SLGAK QN59  QTTTV GGQAS HQASS LTSLF SLGSK QN60  QTTTV GGQAS HQASS LTSLF SLGPK QN61  QTTTV GGQAS HQASS LTSLF SQGAK QN62  QTTTV GGQAS HQASS LTSLF SQGSK QN63  QTTTV GGQAS HQASS LTSLF SQGPK QN64  QTTTV GGQAS HQASS LTGLF SPGAK QN65  QTTTV GGQAS HQASS LTGLF SPGSK QN66  QTTTV GGQAS HQASS LTGLF SPGPK QN67  QTTTV GGQAS HQASS LTGLF SLGAK QN68  QTTTV GGQAS HQASS LTGLF SLGSK QN69  QTTTV GGQAS HQASS LTGLF SLGPK QN70  QTTTV GGQAS HQASS LTGLF SQGAK QN71  QTTTV GGQAS HQASS LTGLF SQGSK QN72  QTTTV GGQAS HQASS LTGLF SQGPK QN73  QTTTV GGQAS HQASS LTRLF SPGAK QN74  QTTTV GGQAS HQASS LTRLF SPGSK QN75  QTTTV GGQAS HQASS LTRLF SPGPK QN76  QTTTV GGQAS HQASS LTRLF SLGAK QN77  QTTTV GGQAS HQASS LTRLF SLGSK QN78  QTTTV GGQAS HQASS LTRLF SLGPK QN79  QTTTV GGQAS HQASS LTRLF SQGAK QN80  QTTTV GGQAS HQASS LTRLF SQGSK QN81  QTTTV GGQAS HQASS LTRLF SQGPK QN82  QTTTV GGQAS RQASS LTSLF SPGAK QN 83 QTTTV GGQAS RQASS LTSLF SPGSK QN84 QTTTV GGQAS RQASS LTSLF SPGPK QN85 QTTTV GGQAS RQASS LTSLF SLGAK QN86 QTTTV GGQAS RQASS LTSLF SLGSK QN87 QTTTV GGQAS RQASS LTSLF SLGPK QN88 QTTTV GGQAS RQASS LTSLF SQGAK QN89 QTTTV GGQAS RQASS LTSLF SQGSK QN90 QTTTV GGQAS RQASS LTSLF SQGPK QN91 QTTTV GGQAS RQASS LTGLF SPGAK QN92 QTTTV GGQAS RQASS LTGLF SPGSK QN93 QTTTV GGQAS RQASS LTGLF SPGPK QN94 QTTTV GGQAS RQASS LTGLF SLGAK QN95 QTTTV GGQAS RQASS LTGLF SLGSK QN96 QTTTV GGQAS RQASS LTGLF SLGPK QN97 QTTTV GGQAS RQASS LTGLF SQGAK QN98 QTTTV GGQAS RQASS LTGLF SQGSK QN99 QTTTV GGQAS RQASS LTGLF SQGPK QN100 QTTTV GGQAS RQASS LTRLF SPGAK QN101 QTTTV GGQAS RQASS LTRLF SPGSK QN102 QTTTV GGQAS RQASS LTRLF SPGPK QN103 QTTTV GGQAS RQASS LTRLF SLGAK QN104 QTTTV GGQAS RQASS LTRLF SLGSK QN105 QTTTV GGQAS RQASS LTRLF SLGPK QN106 QTTTV GGQAS RQASS LTRLF SQGAK QN107 QTTTV GGQAS RQASS LTRLF SQGSK QN108 QTTTV GGQAS RQASS LTRLF SQGPK QN

(4)-比式I肽库中多肽更进一步的肽库，它包括了式II中的序列，定义了2.5×10⁶个序列并且与以下的式III一致：

Q T H T V G G Q A S H Q A S S L T S L F S P G A K Q N

T   T V T     S Q G   A T H G   V G           S S   K

              V V A   T V R R                 P Q

根据本发明的多肽可以与其它氨基酸融合的形式提供。其它氨基酸可融合到多肽的N末端或C末端中的一端或两端。上述其它氨基酸可是非HCV E2蛋白质片段的氨基酸序列或也可是该蛋白的一部分氨基酸序列。进而，包含根据本发明的多肽的融合肽可以包括具有处于HVR1位置的多肽的氨基酸的HCV E2/NS1蛋白，即根据本发明的HVR1拟表位多肽取代了天然HVR1序列。这种方式的另一种表达方式是“HVR1为根据本发明的多肽所取代的HCV E2/NS1重组蛋白”。如下文所述，编码根据本发明的肽、多肽和融合蛋白的核酸将被作为本发明的一些方面进一步给出。同样也将给出重组的HCV基因组，该基因组包括了编码根据本发明多肽的核苷酸序列。例如E2/NS1编码序列之内包括了上述核苷酸序列以产生重组HCV E2/NS1蛋白，其中本发明的肽取代3HVR1，并且将重组的蛋白结合入组装的HCV病毒颗粒中。此处公布的包含一种或多种肽或多肽的重组HCV病毒颗粒将作为本发明的一个方面进一步加以说明。

总体而言，根据本发明的多肽是具有免疫原性或者在对个体施用后能引起免疫应答或者含有与许多株HCV的表位具有免疫交叉反应的表位。

本发明另一方面提供了一种得到一种或多种多肽的方法。上述多肽含有免疫学上与HCV株的HVR1上的表位发生交叉反应的表位。该方法包括使一个公布的多肽库与一种能结合HCV株的上述HVR1的抗体分子接触，然后从多肽库中选出能结合上述抗体分子的一种或多种多肽。上述选出的多肽可能含有免疫学上与多株HCV HVR1发生交叉反应的表位。

这样的方法包括使一个多肽库与多种都能结合多株HCV的HVR1的抗体分子接触，在一个实施方案中，上述多种抗体分子源自感染HCV的个体的血清。

如上所述，上述多肽库可表达在噬菌体颗粒的表面上，每一颗粒含有编码在其表面表达的多肽的核酸。进行选择之后，核酸可被从表达上述被选多肽的噬菌体颗粒中得到。具有从表达上述选出多肽的噬菌体颗粒中得到的核酸序列的核酸可用于通过表达的方法生产(使用本领域中常规的重组DNA技术，下文还将进一步讨论)这样的多肽。

具有上述选出多肽氨基酸序列的多肽可以分离的形式提供，例如在通过表达编码核酸生产之后。如下文所进一步描述，可通过多肽合成的方式提供一种或多种根据本发明的多肽。

可以分离的形式单独提供或以混合物提供多种多肽。上述多种多肽分别具有不同的选出的多肽的氨基酸序列。

选出的一种或多种多肽可分别具有上文式II的氨基酸序列。式II中所有108种不同多肽可以混合物的形式提供，并且它们分别独立地代表了本发明的一个方面。这108种多肽中每一种与许多HCV株的E2/NS2蛋白HVR1的表位发生交叉反应的可能性都很高，因此对于得到抗体或引起免疫反应尤为有用。

根据本发明的组合物可包括多种可由式II的108种肽混合物得到的多肽。这样的组合物可包含有从2至约20，15，10，9，8，7，6，5，4，或3种不同的可由上述混合物得到的多肽。

可以混合物形式提供或单独提供的优选多肽包括G31，F78，R9，D6，M122和H1，它们的氨基酸序列如图7(A)所示。优选混合物包括多肽R9，F78，H1和D6(MIX1)，包括多肽M122和G31(MIX32)，或包括多肽G31，F78，R9，D6，M122，和H1(MIX3)。

如以下所举的例子所表明，本发明的每种多肽与HCV株HVR1的免疫学交叉反应性可由实验测量。这些多肽的不同混合物也可制备并进行类似测量，这一点也将在下文中实验性例示。

根据本发明的线性的或分支(如MAP)的肽和多肽(如上文讨论的包含一段肽的融合分子)可在本领域技术人员的布置下利用多种技术手段得到。

线性的或分支的肽可利用常规多肽化学的方法合成，如可通过使用Fmoc(芴甲氧羰基)t-Bu(叔丁基)的通用方法，如文献Atherton andSheppard(1989)，Solid Phase Peptide Synthesis，a practicalApproach，IRL PressOxford中所描述。

生产根据本发明的肽或多肽的简便方法是在表达系统中利用核酸表达编码该肽或多肽的核酸。

相应地，本发明还涉及制造肽或多肽的方法(如所公开的)。该方法包括从编码肽或多肽的核酸(通常是根据本发明的核酸)表达。这可简便地通过在导致或允许表达多肽的适当条件下在培养基中培养含有这样的载体的宿主细胞而完成。肽和多肽也可在体外系统-如网织红细胞裂解液中-表达。

编码根据本发明的肽或多肽的多聚核苷酸进而代表本发明的一些方面。

在一个方面中，提供了编码如所公开的肽的多聚核苷酸。进而在一个方面中提供了编码如所公开的融合蛋白-尤其是在HVR1位置包含有本发明的肽的氨基酸序列的HCV E2/NS1蛋白-的多聚核苷酸。进而在一个方面中提供了包含有编码如所公布的本发明肽或融合蛋白-尤其是在HVR1的位置含有相应氨基酸序列的肽的HCV E2/NS1蛋白-的核苷酸序列的重组HCV基因组。

进而在更进一步的一个方面中提供的多聚核苷酸包括多个编码根据本发明的肽或多肽的核苷酸序列。这允许在一个单一表达反应中产生肽或多肽的混合物。

编码根据本发明的肽或多肽的核酸可用于免疫动物以在动物体内引起免疫应答，如免疫人以达到治疗或预防的目的，或用于免疫非人哺乳动物以达到同样的目的或以产生抗体进行后续操作或应用(例如在诊断或治疗的背景下，如下文所进一步讨论)。

编码根据本发明的肽或多肽的核酸可用于基因治疗，防止和/或治疗HCV感染的方法中。这要求应用适当的表达调节元件以及适当载体将表达单位(编码序列和调控元件)运送到宿主细胞。在本领域中已知有很多载体，包括病毒载体和质粒载体，例子见US Patent No.5,252,479和WO 93/07282。尤其值得一提的是很多病毒已被用作基因转染载体，包括乳多空病毒(如SV40)，牛痘病毒，疱疹病毒(包括HSV和EBV)以及逆转录病毒。在先前工艺中许多基因治疗方法使用无致病能力的鼠科逆转录病毒。目前已发展了许多腺病毒以及腺病毒相关病毒载体。可替代病毒载体的包括脂质体介导的转移、DNA的直接吸收以及受体介导的DNA转移。

含有编码根据本发明的肽或多肽(或其混合物)的核酸的宿主细胞可直接用于治疗或预防个体的HCV感染(即治疗感染了HCV的个体或在感染HCV之前对个体进行预防性治疗)。

核酸通常是以DNA或RNA的形式提供的，但可能包括一个或多个核苷酸类似物，并可能整个或部分是合成的。根据本发明的核酸分子和载体可以分离和/或纯化的形式(例如相当纯或均一的形式)提供。术语“分离”可用于反应所有的这些可能性。当DNA序列是特定时(例见图)除非上下文要求，否则以U代替T的对应的RNA等价物也包含在其中。

当需要从编码核酸表达肽或多肽时，核酸包括适当的调控序列。可以选择或构建包含有适当调控序列，包括启动子序列、终止序列、poly-A序列、增强子序列、标记基因序列、和其它适当序列的合适的载体。载体可以是适当的质粒、病毒如噬菌体或噬菌体质粒。更详细的细节可参考，如，Molecular cloning：a Laboratory Manual：2^nd edition，Sambrooket al.，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press.核酸操作的很多已知的技术和方法，如构建核酸的制备，突变，测序，将DNA导入细胞和基因表达，以及蛋白分析，在Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel et al.Eds.，John Wiley & Sons，1992中都有描述。

在多种不同的宿主细胞中克隆表达多肽的系统是众所周知的。适当的宿主细胞包括细菌、真核细胞如哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域中可用来表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中华仓鼠卵巢细胞、Hela细胞、婴儿仓鼠肾脏细胞、COS细胞和许多其它细胞。一种常见优选的细菌宿主是E.Coli。

如此处所公开的，本发明的一个方面进而提供了含有核酸的宿主细胞。本发明的核酸可被整合到宿主细胞的基因组中(例如，染色体)。与常规技术一致，整合可通过促进与基因组重组的序列的内含物而得以促进。核酸也可处于细胞内染色体外的载体中。

更进一步的一个方面提供了包括将核酸导入宿主细胞的方法。上述导入可应用任何可行技术，并且上述导入(尤其是体外导入)一般不受限制地被称为“转化”。对真核细胞而言，适合的技术包括磷酸钙转染、DEAE-Dextran、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其它病毒、如牛痘病毒、进行转导，对昆虫细胞而言可用杆状病毒。对细菌细胞而言，适当的技术包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体转染。直接注入核酸也可作为一种替代手段。可使用标记基因如抗生素抗性或敏感基因以鉴定含有感兴趣核酸的克隆，这在本领域中是广为人知的。

导入之后可通过诱导或允许核酸的表达而产生其所编码的肽或多肽，例如通过在该基因的表达条件下培养宿主细胞(宿主细胞可以包括真正的转化细胞，但更可能是转化细胞的后代)。如果肽或多肽被偶联到适当的信号前导肽上一起表达，那么它可从细胞中分泌到培养基中。在通过表达生产后，肽或多肽可从宿主细胞和/或培养基中分离和/或纯化，然后根据需要随后使用，如配制可含有一种或多种另加成分的组合物，如包含一种或多种药用赋形剂、媒介或载体(例子见下文)的药物组合物。

根据本发明的肽或多肽可用作免疫原或用于得到结合抗体。抗体可用于肽或多肽的纯化和其它操作、诊断筛选和药用、包括被动免疫。这将在下文进一步讨论。

根据本发明的一个方面进而提供了得到一种或多种抗体分子的方法，上述抗体分子含有一个能结合多种HCV株HVR1上一个表位的结合位点。该方法包括将一系列抗体分子和根据本发明的多肽接触，然后从该系列中选出能结合上述肽的一种或多种抗体分子。

该方法可能涉及使该系列抗体与许多根据本发明的肽接触。

如所述，肽可以与另外的氨基酸融合的形式提供。

肽或多肽可施用到非人类的哺乳动物上以使它们与该哺乳动物免疫系统产生的一系列抗体分子接触，然后可从该哺乳动物中得到一种或多种能结合肽或多肽的抗体分子或从该哺乳动物中得到能产生这样抗体分子的细胞。

该动物可被杀死。

如果从该动物中取出的是细胞，可从上述细胞或其后代得到抗体分子。这样的后代尤其应包括杂交瘤细胞。

如所公布的一种得到抗体的方法可包括在噬菌体颗粒表面表达抗体种群，每个颗粒含有编码其表面所表达的抗体分子的核酸，上述方法可用于取代免疫动物或与之并存。可从表达能结合感兴趣的肽或多肽的抗体分子的噬菌体颗粒中得到核酸，该核酸可用于操作或用于生产所编码的抗体分子或其衍生物(如融合蛋白、包括不变区或其它氨基酸的分子，等等)。可用核糖体或多聚核糖体代替噬菌体表达，例子如US-A-5643768，US-A-5658754，WO95/11922中所公开的。

抗体分子可以分离的形式分别提供或以混合物提供。多种抗体分子可以分离形式提供。

根据本发明的优选抗体在不含有其它污染物如能与其它多肽结合的抗体和/或不含其它血清成分的意义上被分离。对一些目的而言单克隆抗体是优选的，但多克隆抗体也包括在本发明的范围之内。如下文所讨论，事实上能结合一种或多种根据本发明的肽或多肽的多克隆混合物在一些实施方案中是优选的。因此本发明的一个方面进而针对能结合一种或多种根据本发明的肽或多肽的不同抗体的混合物。这样的混合物可以含有至少一种附加成分，如药用上可接受的赋形剂或载体的组合物来提供。

本发明还扩展到得到和/或引起针对一种或多种根据本发明的肽或多肽的抗体的方法。这样的方法可包括对一哺乳动物施用肽或多肽或肽或多肽的混合物以引起抗体应答。在治疗或预防的意义上哺乳动物可以是人类或非人类。在生产抗体或要分离抗体的细胞或在多种目的的任何应用中可包括一步杀死非人类哺乳动物的步骤。这样的非人类哺乳动物可以是，如，小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、猪、马、驴、山羊、绵羊、骆驼、 old world monkey、黑猩猩或其它灵长类动物。可用任何本领域中已知的多种技术从已免疫的哺乳动物中得到抗体，抗体的筛选优选使用抗体与感兴趣的肽或多肽的结合。例如，可使用Western blotting技术或免疫沉淀技术(Armitage et al，Nature，357：80-82，1992)。

本领域中生产单抗和多抗的技术已经很好地建立起来了。单抗可用重组DNA技术生产保留初始抗体特异性的其它抗体和嵌合分子。这样的技术可能涉及将编码抗体的免疫球蛋白的可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA结合到另一不同免疫球蛋白的不变区或不变区加构架区。例子见EP-A-184187、GB-A-2188638、或EP-A-239400。本发明还包括将源自非人类的CDRs区嫁接到人的构架区的人源化抗体，这样通常改变了构架区的一些氨基酸残基，从而得到了免疫原性比初始的非人类抗体小的抗体。产生根据本发明的单克隆抗体的杂交瘤可进行基因突变或其它变化，这可能改变也可能不改变产生的抗体的结合特异性。克隆与表达嵌合抗体的技术在EP-A-0120694和EP-A-0125023中有描述。

作为用肽免疫哺乳动物的替代或补充方法，对蛋白特异的抗体可由表达免疫球蛋白可变区的重组产生的文库得到，例如使用在表面上表达免疫球蛋白的功能性结合片段的噬菌体-例子见WO92/01047-或如上所述的核糖体/多聚核糖体。该文库可以是天然的，即由未经任何该蛋白(或片段)免疫的有机体得到的序列构建的文库，或也可以是由已用感兴趣的抗原免疫的有机体得到的序列构建的文库。

根据本发明的抗体可用很多方法进行修饰。事实上术语“抗体”应被解释为包括任何具有要求的特异性的结合域的结合物质。这样本发明覆盖了抗体片段、衍生物、功能性对等物和同源抗体，包括合成分子和模拟抗体使其能结合抗原或表位的分子。

能结合抗原或其它结合配对的抗体片段的例子是由VL、VH、C1和CH1域组成的Fab片段；VH和CH1域组成的Fd片段；由抗体一条臂的VL和VH域组成的Fv片段；由VH域组成的dAb片段；分离的CDR区域和F(ab’)2片段，在铰链区由二硫键连接两个Fab片段的二价片段。单链Fv片段也包括在内。

能产生具有所需的结合特性的抗体的杂交瘤也包括在本发明的范围之内，这是含有编码抗体(包括抗体片段)的核酸并能表达的真核的或原核的宿主细胞。

本发明还提供产生抗体的方法，包括在产生抗体的条件下培养能产生抗体的细胞，优选地上述抗体是分泌的。

样品中(如在诊断测试中的样品)抗体的反应性可用任何适当的方法测试。其中一种可能的方法是用单个的报告分子标记。报告分子可以直接或间接地产生可探测的，优选地是可测量的信号。报告分子的连接可以是直接的或间接的，共价的，例如通过肽键，或非共价的。通过肽键的连接可以是编码抗体与报告分子的融合基因重组表达的结果。

一种优选的方式是单个抗体与单一的荧光生色基，磷或激光染料共价连接。上述报告基团具有光谱学上独立的吸收或发射特征。适合的荧光生色基包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白、和德克萨斯红。合适的颜色染料包括二氨基联苯胺。

其它报告基团包括大分子胶体颗粒或特殊材料如带颜色的乳胶颗粒、或带磁性或顺磁性的乳胶颗粒，以及生物学上或化学上具有活性的物质，上述物质能直接或间接产生可探测信号，上述信号可通过视觉观察到或可通过电子手段探测到或者其它方法记录到。比如，上述分子可以是能催化反应的酶，所述反应例如能显影或改变颜色或引起电子性质改变。它们可以是可激活的分子，在能量状态之间发生电子跃迁之后导致特征性光谱吸收或发射。它们可以包括与生物传感器联合使用的化学实体。可以使用生物素/亲和素或生物素/链亲和素以及碱性磷酸酶检测系统。

探测结合的方式并不是本发明的特征，本领域技术人员可根据他们的喜好和常规知识选择适当的方式。

根据本发明的抗体可用于探测肽或多肽的存在，例如在含所讨论的细胞或细胞裂解物的样品中，也可用于纯化和/或分离根据本发明的肽或多肽，如在从编码核酸表达多肽进行生产之后的分离纯化。

在治疗中抗体也可通过被动免疫用于预防。当抗体被施用时，优选地包括抗体-如整体上能与许多根据本发明的肽交叉反应的抗体-的混合物。

能与根据本发明的肽结合的抗体本身可作为抗原生产抗独特型抗体。上述抗独特型抗体可用于模拟肽表位在个体中引起免疫应答，从而达到例如治疗和/或预防目的。

抗体可在试剂盒中提供，试剂盒中可含有抗体使用(例如探测样品中特定物质的存在)的说明。试剂盒中可含有一种或几种其它的试剂，如标记分子、缓冲液、洗脱液等等。提供的试剂可装在保护试剂不受外界环境影响的容器(如密封的小瓶)中。

诊断方法使用源自可能含有一种或多种HCV株的个体的生物样品。生物样品的例子包括液体如血液、原生质、血清、尿液和唾液，以及组织样品。

检测测试样品中是否存在特定肽或多肽有多种方法，包括其中待探测的多肽为抗体时的方法。

可探测样品中是否存在特定的结合单位，如针对一种或多种根据本发明的肽的抗体或抗体混合物。

根据本发明的肽可用于探测测试样品中是否存在抗HCV株的抗体。如果样品中存在抗体的话，上述探测可通过分析肽与抗HCV E2 HVR1抗体的结合而实现。

理论上可鉴定样品中是否存在特定结合单位-如针对根据本发明的一种或多种肽的抗体或抗体混合物-的结合配对体。然而，目前还没有人成功地从人类样品中分离出HCV病毒粒体。将来应该能证明可能从人类样品中鉴定HCV病毒粒体和/或在免疫学上探测这样的HCV病毒粒体，则根据本发明的肽以及针对它们的特定抗体可用于这样的探测。

在已由，如，上文所讨论的报告系统确定结合之前先将生物样品或其它样品与一种或多种根据本发明的肽在适合于特异性结合的条件下接触以探测抗HCV样品的存在。当使用一系列肽时，可使用不同的报告标记每个肽，从而使每个肽的结合都能被探测到。

特异性的结合单位如肽可用于分离和/或纯化测试样品中的配对物结合抗体，从而对该抗体进行序列和/或生化分析。用自动化序列分析仪进行氨基酸序列分析是本领域中的常规技术。

典型的免疫分析包括将测试样品与根据本发明的肽或抗独特型抗体在适当的条件下温育以使免疫复合物形成(如果样品中存在适合的抗体)，以及探测免疫复合物是否存在。

如上文所述，尽管目前技术上还不可行，通过分析抗体与可能存在的E2HVR1表位的结合，原理上可用根据本发明的抗体测定待测样品中是否存在HCV株。

典型的免疫分析包括将待测样品与根据本发明的肽或抗独特型抗体在适当的条件下温育以使免疫复合物形成(如果样品中存在适合的抗体)，以及探测免疫复合物的存在。

可应用一种或多种根据本发明的肽(或含有这样的肽的多肽)，或一种或多种抗独特型抗体测试样品中是否存在针对本发明的一种或多种肽的抗体。

通过在测定结合之前，例如使用所讨论的报告体系，在适合特异性结合的条件下，用一种肽或多肽或抗独特型抗体接触，可以测定生物样品或其它样品。

免疫分析中可应用任何可行的技术探测结合复合物的形成而不必限于本发明的范围。关于标记抗体的一些合适的技术在上文已有描述。分析测试可能涉及将抗体或多肽交联到例如适当的固相或支持物上(如乳胶颗粒、磁性或非磁性的小珠、膜、芯片、塑料、金属、硅胶或玻璃表面，或任何熟练人士认为适当的其它材料)。测定可以是定性或定量的。根据常规实践，应设置一个或几个合适的对照。

如上文所述，根据本发明的肽、多肽、抗体和核酸可配制成组合物并用于药物治疗。这些组合物可以除了上述物质外还另外包括药物上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其它本领域技术人员众所周知的物质。这些物质应无毒并且不影响上述活性物质的效力。载体或其它材料的具体性质取决于施用途径，如口服、静脉注射、皮肤施用、皮下施用、鼻腔施用、肌肉注射或腹腔内施用。

口服的组合物可以是药片、胶囊、粉末或液体。药片可含有固体载体如明胶或一种辅剂。液体药用组合物通常包括液体载体如水、源自石油，动物或植物的油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水、葡萄糖或其它糖溶液、或二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

对于静脉皮肤或皮下注射，活性成分可以是非肠道施用可接受的含水溶液，上述溶液应无热原并具有合适的pH值，等渗性和稳定性。本领域中具有相关技术的人士能制备适当溶液，使用如等渗载体(如氯化钠注射液、Ringer注射液、乳酸盐Ringer注射液)。如果需要，还可含有防腐剂、稳定剂、缓冲剂抗氧化剂和/或其它添加剂。

分支多肽如MAP(Tam，J.P.1988)可单独或与载体连接在一起用于制备免疫原。

用于引起免疫应答的线性多肽也可与适当的载体连接在一起。将肽与其它分子偶联在一起的多种方法在本领域中是已知的，包括二硫键形成试剂(如果肽含有半胱氨酸-或为此目的对肽加入半胱氨酸的话)、硫醚键形成偶联试剂等等。载体包括人血清白蛋白(HSA)、破伤风类毒素、其它在生理条件下具有合理的半衰期的大蛋白和稳定的非蛋白分子如多糖和氨基酸的共聚物。

可含有佐剂如矾、水包油乳剂或Freund佐剂(完全或不完全)。可使用细胞因子增强肽或多肽组合物的免疫原性。

可在HCV包膜(E2)蛋白中克隆镶嵌拟表位序列以使用天然的折叠环境从而正确地递呈给免疫系统以一个表位或多表位。

裸DNA(Naked DNA)可用于免疫接种(例子见Cohen，J，1993)并且一个或多个拟表位序列可被克隆到合适载体中(例子见Major etal.，1995)。可利用直接注射或基因枪(Yang等，1990)或任何其它合适的技术送达。

不管给予个体的是多肽、抗体、肽、核酸分子、小分子还是其它根据本发明在药用上有用的化合物，施用剂量都可以是免疫原性剂量，即足以在个体中引起免疫(尤其是抗体)应答的剂量，或者是“预防效应剂量”或“治疗效应剂量”(根据具体情况，但预防可以被认为是治疗)。预防效应足以增强个体对随后的HCV、E2HV多肽、或HVR1肽刺激或对随后的HCV感染的免疫应答，优选地在后一种情况中(HCV感染)足以完全或部分抵抗感染。最优选地，该效应足以防止个体由于随后的HCV感染而出现一种或多种临床症状和/或保护个体不得丙型肝炎。治疗效应足以增强个体对预先存在的HCV感染的免疫应答，优选地足以部分或全部抵抗该感染。最优选地，该效应足以减轻个体的一种或几种临床症状，和/或治愈丙型肝炎和/或减小病毒质。真正的施用剂量以及施用的速率和时间过程取决于所治疗对象的性质和严重性。治疗处方，如剂量的决定等等，是一般实践者和其它医生的责任，通常应考虑待治疗的病情、病人个体的情况、施用的部位、施用的方法和其它实践者已知的因素。上述技术和步骤的例子可参见Remington’s PharmaceuticalSciences，16^th edition，Osol，A.(ed)，1980。

本发明的一些方面进而提供了治疗方法，包括肽、肽混合物、抗体分子或抗体分子混合物、包括这样的肽、肽混合物、抗体分子或抗体分子混合物的药用组合物以及用这样的肽、肽混合物、抗体分子或抗体分子混合物制造施用药剂的用途，例如在一种制造药剂或药用组合物的方法中包括用特异的结合单位与制药上可接受的赋形剂配制。

组合物可单独施用或与其它疗法联合使用，根据待治疗条件和替代或另加的疗法的可用性，上述联合使用可以是同时进行或先后进行。

本发明的一个方面提供了使用公开的肽制造药物以在哺乳动物中产生能结合HCV HVR1表位的抗体。

本发明的另一方面提供了对哺乳动物进行免疫使之抗HCV感染的方法，该方法包括对哺乳动物施用肽或肽混合物。

本发明的一个方面进而提供了(被动)免疫哺乳动物使之抗HCV的方法，该方法包括对该哺乳动物施用根据本发明的抗体或抗体混合物。

类似地，本发明的一些方面进而提供了治疗已感染了HCV的哺乳动物的方法，该方法包括对该哺乳动物施用根据本发明的肽、肽混合物、抗体或抗体混合物。

上述抗体可以是抗独特型抗体。

现在进一步阐明本发明的这些方面和实施方案并参照各种图用实验举例说明。本发明更进一步的方面和实施方案对于本领域中具有普通技术的人士是显而易见的。

在图中：

图1(A)示明从本研究所用的234种天然变株的HCV HVR1序列得到共有分布型。框中无阴影的残基大约占80％观察到的可变性。残基按观察到的频率减小的顺序从上到下排列。

图1(2)示明噬菌体中表达的初始HVR1肽库的成分。

图2示明第一轮亲和筛选得到的噬菌体库与选用的血清中存在的抗体发生反应的反应性。对每个血清样品(σ1、σ4R、σ3、σ2P、σ2R、σ3R、σN)测量了抗体识别的噬菌体库(噬菌体库1、4R、3、2P、2R、3R和N)、野生型噬菌体和未选中的库(HVR1 lib)。测量了两次独立实验的平均值(A_405nm)。

图3示明从HVR1库选出的HCV特异的噬菌体作为与感染病人血清发生反应的频率的函数的分布。示明了经过一轮(上图)或两轮(下图)亲和筛选富集的噬菌体与20种人类血清(与筛选所用的血清不同)中抗体的结合。对每种血清测量了对选出的噬菌体和野生型噬菌体的两次独立实验的平均值(A_405nm)。与野生型噬菌体中观察到的背景信号的差别超过3σ_max(p＜0.003)的值被认为具有统计学意义。每个柱状图代表与所示数量的血清(横坐标，用总测试样品数的百分数表示)反应的噬菌体的数量(纵坐标)。

图4示明经常为HCV感染病人人类血清中存在的抗体所识别的选择的拟表位。选出的拟表位与人血清中抗体的结合用固定化噬菌体的ELISA测试。拟表位的名称在每列顶端标明。对每种血清(在每行的左边标明)测试了两次独立实验的平均值(A405nm)。结果用测试噬菌体表位的平均值与野生型噬菌体的值之间的差异表示。阳性值用黑体表示。与在野生型噬菌体上观察到的背景信号的差异大于3σ_max(p＜0.003)时的值被认为具有统计学意义。每个拟表位的反应性频率以及从所有的四个拟表位观察到的反应性的总和在每个表的下端标明。

图4(A)示明选出的拟表位与一系列20种用于筛选步骤的HCV病人血清的反应性。

图4(B)示明选出的拟表位与另一系列源自HCV感染病毒血症病人的血清的反应性。

图4(C)示明与来自非病毒血症病人血清的反应性。用可由商业途径购得的试剂盒检测表明上述非病毒血症病人抗HCV抗体阳性。

图5表明S-值与选出的拟表位的反应性频率之间的相关性。直线表示数据的线性最小方差拟合。相关性系数为0.79。

图6示明选中的拟表位是对大量天然存在的HVR1的抗原性模拟物。用复制选中的拟表位(在图的顶端标明)序列的MAP免疫纯化了源自HCV感染病人血清库的抗体。用以MAP形式合成的有代表性的一系列HVR1序列(在左边标明)，通过ELISA测试了等量的免疫纯化的抗体的反应性。得到了两次独立实验的平均值。当同时满足两个条件时数值被认为具有统计学意义：(1)数值与两种非相关多肽上观察到的背景信号的差别大于3σ_max(p＜0.003)；(2)数值与用10种未感染个体血清与每个代表天然HVR1的肽反应而观察到的平均信号的差别大于3σ_max(p＜0.003)。灰色框代表与不相关MAP多肽上观察到的信号的差别在0.15到0.5OD(405nm)之间；黑框代表值的差别大于0.5OD(405nm)。免疫纯化的抗体每个库的交叉反应性水平在每列底部表示。

图7示明拟表位序列和交叉反应性之间的相关性。

图7(A)示明分析中所用的拟表位的序列。

图7(B)示明免疫纯化的人抗体与一系列43种天然HVR1序列的交叉反应性与拟表位S-值之间的相关性。直线表示数据的线性最小方差拟合。相关性系数为0.86。

图8示明选出的拟表位是对大量天然存在的HVR1的免疫原性模拟物。通过对天然HVR1序列系列(在左边标明)的ELISA实验测试了源自用单一HVR1形式的拟表位(图8(A))和拟表位混合物(图8(B))免疫的小鼠的血清的反应性。免疫的拟表位在第一行标出。MIX1包括拟表位R9、F78、H1和D6；MIX2包含M122和G31肽；MIX3由所有的6种MAP组成。滴定度(定义为ELISA中达到最大信号的一半所需的均一多肽的稀释倍数)在第二行标出。血清按1∶100稀释。测定了两次独立实验的平均值。与在两种不相关多肽上观察到的背景信号差异大于3σ_max(p＜0.003)时，数值被认为具有统计学意义。灰色框代表与不相关MAP多肽上观察到的信号的差别在0.15到0.5OD(405nm)之间；黑框代表值的差别大于0.5OD(405nm)。每种血清的交叉反应性在每列的底部标明。

图9示明例子6中描述的体内核酸免疫实验中所用的质粒。

例1-设计与构建模拟HVR1可变性的特定噬菌体库

利用从序列数据库得到的234种独特HVR1序列进行多次序列比较(sequence alignment)以表征每个HCV E2糖蛋白的N末端27个位置的残基组分的变化。利用此分析得到的序列模式(图1A)可定义简并共有序列。在其它位置重复产生观察到的天然可变性时设计了HVR1序列的合成库以保留这些保守残基。

通过选择每个位置最经常出现的残基得到了大约占总序列可变性80％的“共有分布型”。当一个给定位置出现类似氨基酸时，每个位置仅选择一个作为可变性的代表。优选地，被选中的残基能更有效地形成相互作用。例如天然库中Ser和Thr都出现在位置5，但设计文库时仅选择Thr(图1)。在一些情况下，未出现在共有序列中的残基也被包括在文库中以更好地反应整体可变性。例如位置3中包括了Thr以反应天然HVR1库中Ser、Thr、Asn的存在。最终得到的共有分布型(图18)的复杂性为9×10⁷，与目前DNA克隆和转化技术的实践上限(大约10⁸)非常接近。除了位置1外总是包含了天然库中最经常观察到的氨基酸。虽然最经常观察到的氨基酸是Glu，但却选择了Gln和Thr。八个位置(2、6、7、16、19、20、23和26)保持恒定，因为在234种天然HVR1变型中它们具有高的局部序列保守性。值得注意的是几乎没有带负电荷的残基。例外的是位置1上选择了Gln代表His、Glu、Asp、Gln、Asn。在80％的部分没有酸性残基存在。该分布型可描述为镶嵌在含有保守元素的N末端和C末端之间的总体上更为可变的中心区域。

通过克隆了合成的简并寡核苷酸来构建文库，上述克隆是与用于M13表达的噬菌体质粒载体中编码主要外壳蛋白(pVIII)基因的5’端融合物(见材料与方法)。可以得到大约2×10⁸个独立转化体。为了确证文库(HVR1文库)质量和复杂性，随机选取了56个插入的独立克隆进行测序。此分析得到了以下结果：(1)所有的克隆表达不同的序列；(2)63％的克隆含有全长的插入序列而剩下的具有一些小缺失；(3)根据1998年3月15日的检索，没有一个编码肽的克隆序列与已知病毒分离物的HVR1相对应。

根据这些数据可推论文库具有与独立转化体数目相近的复杂性。

例2-鉴别与HCV病人血清经常反应的HVR1拟表位

用于筛选的抗体库越复杂越多变，富集为多种抗HVR1表位的不同抗体所识别的噬菌体的可能越大。源自长期感染的病毒血症病人的血清似乎符合上述条件，因为这些个体具有较长的病毒存在史，在此时间内产生了大量HCV变株并刺激免疫系统，这可能导致大量异源抗HVR1抗体种群的积累。

利用源自感染了五种不同基因型：1a、1b、2a、2b、3a(Simmonds etal.，1993)病毒的慢性病人的八种血清对HVR1文库进行6次亲和筛选(表1)。使用了源自未感染个体的血清作为对照。扩增了所有七次筛选得到的噬菌体库并测试了它们与ELISA中每种筛选血清的反应性。此实验的结果表明为选择抗体识别的噬菌体被大大富集了，证据是与未选择的文库相比反应性升高了(图2)。在大多数情况下，HCV血清富集的噬菌体库与一种以上的病人血清反应。文库中为与HCV感染不相关的抗体所识别的肽也得到了富集。事实上由对照血清选出的噬菌体库比未选择的文库具有更高的与该血清的反应性(图2)。但是病人血清使选择趋向HCV相关的拟表位，因为用健康个体的血清未探测到对HCV血清富集的噬菌体库的反应性(图2以及未列出的数据)。

为了深入理解选出的拟表位与不同病人血清反应性的频率，从两个库(4R和2R，表1)中随机选出了40个独立克隆并用ELISA测定了它们与一系列20种源自HCV感染病人的血清的反应性。上述血清与用于筛选的血清不同。同样数量的源自未感染健康对照的血清被用于测试抗HCV抗体的特异性。最终24个克隆是HCV特异的。它们作为与它们病人血清反应频率的函数的分布见图3(上图)。从它们中鉴定了与一种以上的血清反应的噬菌体；一些噬菌体被高达55％的测试血清识别。

为了进一步改进与多种不同的抗HVR1抗体反应的拟表位的分离，用与第一轮不同的病人血清对富集的噬菌体库进行了第二轮亲和筛选。用这种方法产生了9个新库(表1)并用ELISA进行了分析。与前一轮相同，观察到了与选择抗体反应性的整体上升。并且所有的第二轮噬菌体库与源自感染HCV病人的一系列血清的反应比第一轮选出的噬菌体库更为频繁。上述血清与筛选中所用的血清不同。这反映了分离的肽具有更高的认别频率。比较了从第一轮亲和筛选得到的噬菌体中随机筛选后得到的克隆的HCV血清的反应性(图3，上图)与这些利用第二种不同的血清重筛选后得到的噬菌体(图3，下图)与HCV血清的反应性，结果证实了上述结论。进行第二筛选步骤后不仅反应频率而且反应性分布都发生了显著变化。从第一轮筛选得到的噬菌体的识别较为分散，而通过两轮分离得到的克隆的反应频率分布呈钟型，平均值为60％(图3，下图)，这表明整个噬菌体群确实获得了更多的合乎需要的结合特性。为了避免在生物学上优选的噬菌体在扩增中引入偏差，决定省略进一步筛选周期。

通过筛选所有第二轮噬菌体库鉴定总共171个与HCV血清专一反应的克隆。它们作为与HCV血清认别频率的函数的分布图类似于图3下图，最好的克隆与80％待测样品反应。更为重要的是，选出拟表位反应性的分布图突出了另一相关特性。尽管它们在HCV血清识别的整体频率上相似，不同的克隆显示出特征反应模式，结果是少数拟表位能鉴别所有待测血清中抗HVR1抗体的存在(图4A)。

下一步是确证观察到的HCV血清的高识别频率否限于测试的病人群体还是反应了选出的拟表位的内在特性。为此用ELISA测试了另一组源自感染病人的血清，结果表明每个噬菌体个体的反应频率和血清的总平均值都未改变(图4B)。

与长期感染的病人相比，感染已消除的HCV感染个体最可能接触病毒变株的数量较少，并且可能产生的变株特异的抗HVR1抗体谱较窄。源自后一种群的血清与重复产生天然分离物HVR1的合成肽的反应要比源自长期感染病毒血症病人的血清稀少得多，此发现支持了上述推论(Scarselli et al.，1995)。因此，非病毒血症病人的血清在检测HVR1拟表位与不同抗HVR1抗体的交叉反应性上是更好和更严谨的实验。HCV血清阳性但血液中病毒RNA经重复测试均为阴性的个体的41种样品被用于测试一些选出的拟表位。同样，这些拟表位与这些血清中的多数发生反应，但反应频率比和源自病毒血症病人的血清低(比较图4(A)、4(B)和4(C))。

这些数据意味着选出的拟表位具有与大量不同抗HVR1抗体交叉反应的能力。

例3-测定选出的HVR1拟表位序列与其HCV血清反应频率之间的关系

本发明者希望证实选出克隆的氨基酸序列是否与其反应频率相关。由于对序列的目测比较并未得到明显的模式，所以决定分别分析反应频率最小的克隆与最大的克隆的序列模式。

定义为“弱”的24个克隆只与3种以下的血清发生反应而定义为“强”的27个克隆与11种以上的血清发生反应。弱和强克隆的各个位置的氨基酸频率见以下的材料和方法部分和表II。

在强系列和弱系列克隆的一些位置被不同的氨基酸占据具有明显的趋势，这使得我们可以启发性地定义材料与方法中所描述的以位置为基础的评分系统(见下文)。克隆的分数(S值)越高，其序列与强克隆的序列的越相近，并且与弱序列的差别越大。如图5所示明，S值与实验测定的各个克隆的反应频率较为相关(相关性系数＝0.75)。应强调的是S值的计算只用了“弱”和“强”克隆的序列(171个中的51个)，但它与所有克隆的反应频率很好地相关。有趣的是，可仅用弱和强拟表位差别最大的6个位置(位置3、11、18、21、22、24)即可得到类似的鉴定结果(相关性系数＝0.72)。

例4-HVR1拟表位在抗原性上模拟源自HCV分离物的大量HVR1变型

本发明者开始测量识别拟表位的人抗体与代表天然存在的HVR1的序列的交叉反应性。为此目的拟表位被用作免疫吸附剂以从感染病人血清中的大量抗HVR1中纯化特定抗体。拟表位R9、F78、M122、R6、B14、G31、H1和D6(图7)被选用于此实验，因为它们属于与HCV血清具有最高反应性频率的那些拟表位。与平均的“好”拟表位相比为明显低得多的百分比的HCV血清认别的百分比拟表位N5也被选用(反应频率分别为60-80％和35％)。

尽管有报道显示一些淋巴细胞系支持HCV的限制性复制(Shimizu etal.，1992)，这些系统不适于病毒增殖和细致研究抗HVR1抗体的交叉反应性。因此测定了免疫纯化的抗体与一系列复制了天然HVR1变型的合成多肽的交叉反应性。上述HVR1变型几乎覆盖了所有观察到的序列可变性。

至此，对234种用于构建本文库的经过序列对比的同一系列天然HVR1序列进行了多维簇分析(Casari et al.，1995)。从这些序列中选择并合成了(见下文的材料与方法)43个几乎均一地分布在HVR1“序列空间”的多抗原性肽段(MAP；Tam，J.P，1988；Pessi et al.，1990)。源自感染病人含八种血清并与整个系列的43种MAP集体反应的血清库被用作抗体源。免疫纯化的抗体与用于纯化的拟表位的反应性与总血清相同。与此相反，纯化后不再保留有与重组HCV核心抗原或者与商业试剂盒中的抗原的反应性，这证实了纯化的效率和特异性。

所有免疫纯化的抗体与大量天然HVR1序列发生反应，其中拟表位R9产生的抗体与79％的天然HVR1交叉反应(图6)。由于大多数免疫纯化的抗体都表现出与天然序列的一些不重叠的反应性，加入仅由三种不同的拟表位(R9、F78和M122，图6)纯化的抗体的个体贡献后可达到甚至更高的整体交叉反应性(88％)。从这些数据可以得出以下结论：有限的一系列HVR1拟表位可以在抗原性上模拟大量天然HCV HVR1变型。

由具有较高S值的拟表位免疫纯化得到的从而具有更高反应频率的抗体也表现出更高的交叉反应性。如图7B所示，使用了八种拟表位，序列相关的S值与相应抗体的交叉反应性之间的关联很好(r＝0.86，图7B)。

例5-HVR1拟表位诱导产生识别多种天然HVR1变型的抗体

在本工作之前的一个问题是得到能诱导出与最大数量的HCV HVR1天然变型交叉反应的抗体的免疫原。通过将纯化的整个噬菌体和位于所选出的初始环境之外的MAP注射入小鼠中研究了一些最好的HVR1拟表位(R9、F78、M122、G31、H1和D6)的免疫原性。

结果表明MAP是更有效的免疫原，这可能是由于各噬菌体上HVR1肽表达不够充分，如质谱分析所表明(小于总pVIII含量的1％)，的缘故。滴定度不同表明拟表位之间在免疫效率上具有差异。用于免疫的同一多肽的ELISA测量表明F78能诱导出滴定度大于1/100,00的抗体(图8A)。然后利用一系列43种复制来自天然分离物的HCV序列的MAP通过ELISA测试了抗HVR1拟表位血清识别异源HVR1变型的能力。大多数MAP都为这些免疫血清所识别(图8A)，而在不相关的对照肽上没有观察到反应性。

拟表位免疫小鼠的血清的交叉反应性与用同种拟表位免疫纯化得到的人类抗体的交叉反应性并不对应。然而拟表位N5在两种测试类型中都表现出明显较低的反应性，这些结果表明该抗原是相当低效的免疫原，该拟表位导致的抗HVR1应答只能识别少量天然HVR1序列(图8A)。

免疫血清的交叉反应程度通常反映了MAP个体的免疫原性。大多数情况下高滴定度对应高交叉反应性(图8A)。但是仅凭滴定度并不总是能解释所有交叉反应性以及拟表位诱导的血清表现出的反应模式上的差异，这在抗G31血清的情况下表现得尤为明显。G31抗血清的滴定度比F78抗血清低，但它与更多的天然HVR1肽发生反应。类似地，D6抗血清的滴定度是R9抗血清的三倍但交叉反应性与之处于同一水平(图8A)。

每种抗血清表现出的反应性模式仅与其它抗血清部分重叠，并且在一些情况下观察到了独特的反应性。诱导血清的这种性质的结果是将所有的反应性相加后几乎所有的天然HVR1多肽都能被识别(91％，图8A)。如果用拟表位混合物进行一次免疫也能类似地得到交叉反应性的提高，那么此发现是朝向得到广反应谱抗体的目标前进了一大步。因此用拟表位混合物对三组Balb/c小鼠进行免疫。混合物1含有拟表位R9、F78、H1和D6；混合物2由拟表位M122和G31组成；而混合物3含有所有的六种拟表位。所有的这三种混合物都是免疫原性的并且诱导具有高交叉反应性的抗血清(图8B)。与包含在混合物中的每种拟表位诱导的抗血清的反应性相加得到的交叉反应性相比，所有的三种抗血清的每一种表现出相同或更高的交叉反应性(混合物1：84％对84％；混合物2：84％对81％；混合物3：95％对91％，图8B)。这些血清的滴定度虽然很高，但并不比单独的MAP得到的血清的滴定度更高。因此得到以下结论：诱导高交叉反应性应答的能力并不仅仅是免疫效率的结果。

材料与方法

人血清

用第二代的HCV ELISA检测系统(Ortho-HCV ELISA，OrthoDiagnostic Systems，Bersee，Belgium)和第一代的点印迹免疫分析(RIBA-HCV test，Chiron Co.，Emeryville，CA)检测了源自感染HCV个体和健康个体的人血清中抗HCV抗体的存在。如先前描述(Silini etal.，1995)用位于病毒基因组5’非编码区的保守引物和从100μl血清提取得到的总RNA作为模板进行嵌套反转录PCR探测了HCV RNA的存在。

HVR1文库的建立

为了将上文参照图1B描述的共有分布型反翻译成相应的核苷酸序列，利用E.coli密码子使用表选择了在高表达基因中最经常出现的密码子。为了便于将该文库插入噬菌体质粒载体，在81bp片段的5’端和3’端分别加入了含有PacI和NotI限制性内切酶识别位点的两个另外的恒定序列，分别得到了总长116bp的片段。计算机辅助序列分析证实了共有分布型反翻译得到的序列中不含有NotI和PacI识别位点。在化学合成中应用了以密码子为基础的“split-and-pool”方法(Cormack etal.，1993)以保持文库组成和复杂度处于需要的水平。用与侧翼恒定序列互补的引物在9600 DNA Thermal Cycler(Perkin-Elmer Cetus，Foster City CA)上对116bp的寡聚核苷酸进行了扩增。PCR产物用PacI和NotI消化后用凝胶电泳纯化。回收得到的DNA片段被克隆到pel8PN噬菌体质粒载体(pc89的衍生物；Felici et al.，1991)的PacI和NotI位点之间。上述位点位于pelB分泌前导序列的下游和VIII全基因编码序列的上游。重组噬菌体质粒用电穿孔转化入DH10B感受态细胞中。由于DH10B细胞不能为丝状噬菌体所感染，所以不能进行蓝/白斑筛选，所以收集转化的细胞并提取质粒DNA。这些DNA被用于电穿孔转化XL1-蓝感受态细胞。氨苄青霉素抗性的菌落被从平板上刮下并悬浮于LB/100μg氨苄青霉素/ml与10％(v/v)甘油中。在O.D._600nm为0.05时该细菌悬浮液的一部分被用于接种6升LB/100μg氨苄青霉素/ml并剧烈摇晃培养至O.D._600nm达到0.25。然后用M13K07辅助噬菌体对该培养物进行超级感染(superinfect)并且再培养5小时以在上清中得到噬菌体颗粒。如所描述，噬菌体用聚乙二醇沉淀两次并用CsCl平衡离心纯化(Felici et al.，1991)。DNA测序按文献描述用Applied Biosystem373 DNA测序仪进行(Bartoli et al.，1996)。

文库亲和筛选

用0.5μg/ml抗人(Fc片段特异)多克隆抗体(Immunopure goatanti-human IgG Fc-specific；Pierce，Rockford，IL)50mM NaHCO3 pH9.6在4℃过夜包被ELISA多孔板(Nunc Maxisorp，Roskilde，Denmark)。上述板用PBS/0.1％ Tween 20(洗涤液)洗涤后与100μl/孔封闭液(5％脱脂无水牛奶，PBS/0.05％ Tween 20)37℃保温1小时。每孔加入1μl用PBS/0.1％ BSA 1∶100稀释的人血清并4℃保温过夜。洗澡之后，向每个孔中加入用PBS/0.1％ Tween 20，0.01％ BSA稀释的10¹²个U.V.killedM13K07颗粒，并且在4℃保温4小时。此预保温之后，按10¹²颗粒/孔加入HVR1文库并4℃保温过夜。未结合的噬菌体被除去并进行几次洗涤。结合的噬菌体用200μl洗脱液(0.1MHCl用甘氨酸调pH至2.5，1mg/mlBSA)洗脱然后用2M Tris-HCl pH9中和。洗脱的噬菌体通过感染XL1-蓝细菌进行滴定，含有有效插入序列的克隆的百分比通过将感染的细菌涂布到X-gal/IPTG指示平板上确定(Felice et al.，1991)。在扩增之后(见上文)富集的噬菌体以相同的步骤进行第二轮亲和筛选。

拟表位的序列分析和S值的确定

总共193个选出的克隆中171个没有点突变(相对最初的文库设计而言)或缺失，并被分成三组：24个弱克隆(与20种测试血清中的3种以下反应)，27个强克隆(与至少12种血清反应)和中等克隆(其它克隆)。

对位于27单体氨基酸序列的位置i的每个氨基酸我们称Fs(i，aa)和Fw(i，aa)分别为观察到的同一氨基酸在强克隆组或弱克隆组的i位置出现的频率。

频率值见表II。

S值(i)被定义为Fs(i，aa)和Fw(i，aa)平方根之间的差异。序列的所有27单体序列的S值(i)的总和为序列的S值。实践中：

S值＝∑_i(Fs(i，aa)^1/2-Fw(i，aa)^1/2)

其中aa是所计算S值的序列处于位置i的观察到的氨基酸。使用了频率的平方根以放大差异。对于发生了点突变或缺失的克隆，在计算S值时相应位置被省略。

选择天然HVR1序列的代表

源自HCV BK株的NS1 HVR1序列(残基384-411)，包括蛋白序列和核酸序列，被用于检索不同的数据库(1995年12月13日)。蛋白序列搜索了SwissProt、Pir和Genpept，后者代表源自Genbank和EMBL的开放阅读框；核酸序列搜索了EMBL、Genbank和EST。从匹配的序列中除去重复的和不完全的序列，得到了由234种天然HVR1序列组成的一组独特的序列。

用主要成分分析选出了均一地分步在整个组中的40个序列。首先用Sequencespace(Casari et al.，1995)计算了最初的六个本征值，利用这些本征值成对计算了234个序列之间的距离。逐步除去与相邻序列之间距离最小的序列，最后只剩下40种序列。沿着所有可能的本征载体(Eigenvector)对的二维映射表明该系列的40个序列均一分布并不成簇。

序列和检索号如下：

1 Genbank：D12967  QTRTVGGQMGHGVRGLTSLFSAGSARN bp  46-bp 126

2 PIR：PC1193      STHVTGALQGRAAYGITSFLSHGPSQK aa  16-aa  42

3 Genbank：D00574  HTRVTGGVQGHVTSTLTSLFRPGASQK bp1240-bp1320

4 Genbank：L19383  ETHTSGGSVARAAFGLTSIFSPGAKQN bp  46-bp 126

5 Genbank：M62381  ETHVTGGSAGRTTAGLVGLLTPGAKQN bp1426-bp1506

6 Genbank：U24616  ATYTTGGSAAKTAHRLASFFTVGPKQD bp  22-bp 102

7 PIR：C48776      DTHVVGGATERTAYSLTGLFTAGPKQN aa  13-aa  39

8 Genbank：U24607  GTTCQGGVYARGAGGIASLFSVGANQK bp  22-bp 102

9 PIR：D48766      RTLSFGGLPGHTTHGFASLSAPGAKQN aa  13-aa  39

10 Genbank：X60573 RTILMAGRQAEVTQSFPGLFSLAPSQK bp  46-bp 126

11 Genbank：D43650 NTHAMGGVVARSAYRITSFLSPGAAQN bp   1-bp  81

12 PIR：PQ0835     STRITGGSMARDVYRFTGFFARGPSQN aa   6-aa  32

13^*Genbank：S73387 GTHTIGGSQAQQANRFVSMFSRGPSQK aa 190-aa 216

14 Genbank：D10934 NTYVTGGAAARGASGITSLFSRGPSQK bp1491-bp1571

15 Genbank：D31972 NTYASGGAVGHQTASFVRLLAPGPQQN bp1409-bp1489

16 Genbank：U14231 ETHTTGGEAARTTLGIASLFTSGANQK bp 103-bp 183

17 Genbank：U24602 ETHTTGGSAARATFGIANFFTPGAKQN bp  22-bp 102

18 Genbank：L19380 ETYTSGGSAAHTTSGFVSFFSPGAKQN bp  46-bp 126

19 Genbank：M74888 GTTRVGGAAARTTSSFASLLTHGPSQN bp1147-bp1227

20 Genbank：L12354 NTHTVGAAASRSTAGLTSLFSIGRSQK bp1468-bp1548

21 Genbank：X79672 NTRVTGGVQSRTTGTFVGLFTPGPSQR bp   1-bp  81

22 PIR：A48776     NTHVSGGRVGHTTRSLTSFFTPGPQQK aa  13-aa  39

23 Genbank：D12952 STRVSGGQQGRAAHSLTSLFTLGASQN bp  46-bp 126

24 Genbank：D16566 STRITAQAEGRGASTLTSLFTSGASQK bp   8-bp  88

25 Genbank：M84754 STIVSGGTVARTTHSLASLFTQGASQK bp1491-bp1571

26 Genbank：D14853 ETRVTGGAAGHTAFGFASFLAPGAKQK bp1491-bp1571

27 Genbank：S24080 NTYVTGGSAGRAVAGFAGLLQPGAKQN bp  46-bp 126

28 Genbank：S35631 ETHSVGGSAAHTTSRFTSLFSPGPQQN bp 580-bp 660

29 Genbank：S62395 ETHVTGGSAASTTSTLTKLFMPGASQN bp  43-bp 123

30 Genbank：S70291 QTRTVGGANARNTYGLTTLFTTGPKQN bp   1-bp  81

31 Genbank：D88472 GTTTVGSAVSSTTYRFAGMFSQGAQQN bp1485-bp1565

32 Genbank：D10687 NTHTVGGTEGFATQRLTSLFALGPSQK bp1180-bp1260

33 Genbank：D43651 NTHVTGGVVARNAYRITTFLNPGPAQN bp  39-bp 119

34 Genbank：D14305 HTYTTGGTASRHTQAFAGLFDIGPQQK bp1427-bp1507

35 Genbank：X60590 KTHVTGMVAGKNAHTLSSIFTSGPSQN bp  46-bp 126

36 Genbank：D30613 GTHVTGGKVAYTTQGFTSFFSRGPSQK bp1491-bp1571

37 Genbank：X53131 ETYTSGGNAGHTMTGIVRFFAPGPKQN bp 802-bp 882

38 Genbank：U24619 STYSMGGAAAHNARGLTSLFSSGASQR bp  22-bp 102

39 Genbank：M62382 ETHVTGGSAGRSVLGIASFLTRGPKQN bp1426-bp1506

40 Genbank：D88474 ETYIIGAATGRTTAGLTSLFSSGSQQN bp1488-bp1568

*序列13对应于Genbank entry s73387的CDS feature所报道的翻译的氨基酸序列(aa190-aa216)。

还另外合成了三种序列作为MAP：两个序列源自HCV家族的H77接种体(Faci et al.，1994中的图2)：

41(H77-1)  ETHVTGGNAGRTTAGLVGLLTPGAKQN bp 1-bp 81

42(H79)    ETHVTGGSAGHTAAGIASFFAPGPKQN bp 1-bp 81

另一序列源自免疫反应已鉴定的病人的主要分离物(Scarselli etal.，1995)；

43 Genbank：x79669 NTRVTGGVQSHTTRGFVGMFSLGPSQR bp 1-bp81

噬菌体制备与ELISA

如文献先前所描述(Folgori et al.，1994)，噬菌体上清制备自XL-1蓝感染细胞。ELISA用每孔25μl噬菌体上清根据Dente et al.，(1994)的方法进行。如果没有特别说明，血清按1∶100稀释并加入碱性磷酸酶标记的种属特异的抗IgG(Fc特异)二抗(Sigma A-9544；用ELISA封闭液1∶5000稀释)显示。结果用自动化的ELISA读数器(LabsystemsMultiskan Bichromatic，Helsinki，Finland)记录O.D._405nm和O.D._620nm之间的差异。

噬菌体库的ELISA用相同量的(10¹⁰氨苄青霉素转导单位)CsCl纯化之后的扩增噬菌体按同样的方法进行(见上文)。

100μl溶于包被液(50mM NaHCO₃，pH9.6)终浓度为10mg/ml的代表天然HVR1序列的MAP被用于包被ELISA板(Nunc Maxisorp，Roskilde，Denmark)。封闭自由结合位点之后加入100μl/孔血清或亲和纯化的抗体。鼠和兔血清的测量以封闭液1∶100最终稀释；亲和纯化抗体的测量在150ng/ml最终浓度下进行。平板4℃保温过夜。洗涤后加入100μl/孔碱性磷酸酶标记的二抗(山羊抗鼠IgG Sigma A-74341∶2000倍稀释；山羊抗兔IgG Sigma A-8025 1∶5000倍稀释；山羊抗人IgG Sigma A-9544 1∶5000倍稀释)并在室温温育一小时。板洗涤后碱性磷酸酶如上文所描述揭示结果。

从人血清中亲和纯化抗体

使用了重复产生不同拟表位序列多抗原性肽，因为含上述肽在ELISA中表现出的HCV结合谱与噬菌体相同，但在抗体的亲和筛选上却更为有效。以1g干Sepharose比1mg溶于交联缓冲液(0.1M NaHCO₃ pH8/0.5MNaCl)的MAP的比例将感兴趣的MAP偶联到激活的CH Sepharose4B柱(pharmacia Biotech 17-0490-01)上。交联之后用0.1M Tris-HCl，pH8封闭自由氨基。含8种HCV血清的血清库的样品按1∶5用交联缓冲液稀释后上样。在室温吸附用PBS充分洗涤后结合的抗体用补充了终浓度10μg/ml的BSA的0.1M甘氨酸-HCl pH2.7洗脱下来。然后立即用2M Tris pH9.4中和。洗脱下的抗体的浓度用标准人IgG(Sigma I-2511)通过ELISA测定。使用用于纯化的拟表位(MAP形式以及噬菌体形式)和作为对照的HCV不相关的MAP通过ELISA确认亲和纯化的抗体的反应性。利用洗脱的抗体和细菌表达的重组HCV核心蛋白(Prezzi et al.，1996)以及第二代的HCV ELISA检测(Ortho Diagnostic Systems，BerseeBelgium)通过ELISA进一步证实了纯化的特异性。从血清库的1ml标准量的血清中各亲和纯化得到的免疫球蛋白的总量是可比的，大约在0.8到1.5μg之间。每次ELISA中测试MAP的浓度都调成150ng/ml。

动物免疫

免疫用噬菌体制备自XL1-蓝感染细胞并经CsCl纯化，如上文所述(Felici et al.，1991)。在0、21和42天对三至五星期大的Balb/c雌性小鼠(Charles River，Como，Italy)腹膜内注射100μl抗原溶液进行免疫，并于52天(三次)和148天(四次)放血。注射的噬菌体为0.9％ NaCl悬浮液，浓度为约0.3mg/ml(2.5×10¹³噬菌体颗粒/ml)，没有另加佐剂。

对于肽免疫，MAP溶于PBS，总的终浓度为400μg/ml并用完全Freund佐剂(第一次注射)或不完全Freund佐剂(加强注射)1∶2稀释后注射。在0、3和6星期对四至七星期大的Balb/c雌性小鼠(Charles River，Como，Italy)腹膜内注射100μl抗原溶液进行免疫并于0天(放血前)和其它每次注射10天后放血。当用一种以上肽进行免疫时，将等量的每种拟表位混合并使用100μl 400μg/ml的溶液。

例6-肽和E2重组蛋白的免疫原性特性。体内DNA免疫

研究了一些选出的HVR1拟表位或其与E2蛋白外域N末端融合蛋白的免疫原性特性。

hcv/E2肽的鉴定通常用HCV多蛋白从384至809位氨基酸的肽段。HVR1区域通常认为是从384位至410位的氨基酸。下文例子中ΔE2鉴定肽相应于HCV多蛋白的aa411至aa683。

重组质粒的构建

构建了三种类型的质粒，其结构见图9：

(i)pΔE2-用于HVR1和C-末端疏水区缺失的E2蛋白片段(HCVstain N，Nishihara et al.，Gene；1993；129pp207-214；从HCV多蛋白的aa411到aa683)的合成。

(ii)  第二种质粒pF78表达HVR1拟表位中的一种。

(iii) 构建的一系列11种构建物(pMim.E2)，在质粒pΔE2中编码11种不同的HVR1拟表位的DNA序列融合于ΔE2编码序列的5’端。

所有的重组体都克隆在组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(TPA)信号序列框的下游以加强抗原的分泌。

以含载体的E2 N株(Nishihara et al.；Gene；1993；129 pp207-214)作为PCR模板克隆了ΔE2基因(编码从aa411到aa683的肽段)。以合成的寡聚核苷酸：

(oligo fwd＝GCGAGATCTTAATTAACGATATCCAGCTTATAAAC

 oligo rev＝TCCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCGGLAG)为引物得到PCR片段。

利用此引物，得到的PCR产物除了ΔE2基因、5’端的BglII、PacI和EcoRV限制性酶切位点外还包括编码六个组氨酸残基的序列(His标记)以及TAA终止密码子和随后的3’端BamHI限制性酶切位点。此PCR产物然后用BglII和BamHI消化并连接到V1JnsTPA载体(J.J.Donnellyet al.The Journal of Infect.Di seases；1996；713；pp314-320)的BglII位点处的TPA前导框以得到质粒V1JnsTPA-ΔE2(图9中称为pΔE2)。

HVR1拟表位序列被亚克隆到pΔE2的ΔE2基因的5’端。HVR1片段直接由PCR扩增自选出的噬菌体上清。5’引物含有PacI限制性位点并与HVR1拟表位序列的恒定部分的5’序列(GGCGGCCGTTTAATTAAC)互补；3’引物与最后的15个核苷酸互补并根据待克隆的拟表位序列而不尽相同。PCR-扩增的片段被PacI消化并连接到pΔE2质粒中。这样就得到了总共11种pMimoE2质粒(图9)。

进而通过对F78序列的PCR扩增构建F78(图9)质粒

(oligo fwd＝GCGAGATCTTAATTAACCAGACCCATACCACC；oligorev＝TCCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTCTGTTTCGCGCC)并克隆到V1JnsTPA载体的BglII位点。得到了pF78(图9)质粒。大批量DNA的制备用Qiagen 2500-Tip columns按照生产商的说明进行(Qiagen，Hilden，Germeny)。

拟表位/E2重组蛋白特性的鉴定

在哺乳动物中系体中通过对293细胞的瞬时转染研究了pF78、pΔE2和pMimoE2质粒使重组蛋白表达的能力。用识别HVR1下游表位的抗E2单克隆抗体(mAb-185)探测时，pΔE2和pMimoE2转染的细胞表现出强且特异的染色。mF78的表达也为转染的293细胞的免疫细胞化学所证明。上述免疫细胞化学用的是以复制拟表位F78氨基酸序列的MAP免疫的小鼠血清。转染细胞的全细胞抽提物的ELISA确认了以上结果。转染细胞细胞培养物的上清的ELISA表明所有的重组蛋白也大量分泌到培养基中。

细胞内的和分泌的蛋白在SDS PAGE上都呈现为一簇迁移较慢的带，这表明它们都有不均一的糖基化。细胞外蛋白级分呈现较高的分子量，这意味着不同程度的糖基化并证实了蛋白是活性分泌的而不仅仅是细胞裂解释放的。在两种情况下，内切糖苷酶处理都随迁移率升高到从氨基酸组合物估计的迁移率。

所有的重组拟表位/E2融合蛋白及ΔE2突变蛋白都为两种不同的构象敏感的单克隆抗体所有效识别。并且各种克隆的细胞部分或分泌部分的非还原SDS PAGE的Western blot结果表明没有产生通过半胱氨酸桥连接的多聚体聚合物。对小鼠的棒状肌肉瘤(rabdomyosarcoma)细胞的转染得到类似的结果，这表明对小鼠肌肉细胞的体内转染可得到有效的表达。

质粒DNA免疫

免疫用4星期大的雌性Balb/c小鼠(Charles River，Como，Italy)。完全麻醉的小鼠接受了100μg溶于100μl盐溶液(PBS)的质粒DNA。用胰岛素注射器(B-D，U-100 28 G1/2微细针头(microfine needle))在四头肌的两边注入59微升DNA。小鼠进行三或四次注射，每次间隔3个星期，并在每次注射后两个星期放血。血清进行抗体滴定度和交叉反应性分析。

αΔE2和αHVR1抗体的血清学

用溶于50mM NaHCO3 pH9.6的GNA(Sigma L8275)1μg/孔包被ELISA96孔板(Immunoplate Maxisorp；Nunc，Roskilde，Denmark)并4℃保温过夜。板洗涤(PBS/0.1％Tween 20)后与250μl/孔封闭液(2％BSA，1×PBS，0.1％ Tween 20)在37℃保温1小时。通过瞬时转染293细胞产生F78E2和ΔE2蛋白。ELISA中用10×浓缩的上清作为目标抗原。在GNA包被的板上每孔加入饱和量的溶于封闭液的蛋白在室温温育3小时。连续稀释的免疫血清(从1∶100到1∶72900)与1μl/孔的源自封闭液中模拟转染的293细胞的10×上清室温预保温2小时。血清温育在4℃进行。与二抗(α小鼠IgG Fc-特异AP标记，Sigma 7434，封闭液1∶2000稀释)室温温育1小时后，板在37℃显色30min。

用MAP形式的同源肽序列通过ELISA滴定了抗HVR1拟表位抗体(血清从1∶100到1∶72900稀释)

在所有的情况下血清滴定度定义为吸收值为0.3O.D.时的最高血清稀释倍数(大约为背景值的6倍)。

交叉反应性实验

用材料与方法中描述的一组43种代表性MAP测定了血清对不同HVR1天然变型的交叉反应性。

肌肉注射编码拟表位的构建载体诱导出强体液应答

质粒pΔE2和pF78E2被用于建立诱导体液应答的最佳条件。用瞬时转染的293细胞表达的ΔE2蛋白通过ELISA监测了抗HVR1外表位抗体的诱导。免疫了Balb/C和C57black小鼠以测试编码拟表位的构建载体在不同的遗传环境的免疫原性。注射的次数(1至4次)和注射的DNA的量直接与抗体应答的强度相关。每只小鼠用50或100微克pΔE2 DNA，分三次注射，间隔3星期，这样在3次注射后得到对ΔE2蛋白的抗体滴定度最高。进一步的注射并不提高滴定度。在用pF78E2质粒免疫小鼠后观察到了类似的诱导抗ΔE2蛋白抗体的时间过程。用MAPF78通过ELISA测试了后一组动物的抗HVR1抗体的诱导。在最佳免疫条件下进行研究的两株小鼠之间并无明显的不同。但C57black小鼠的平均应答更好。

用仅表达F78 HVR1拟表位(pF78)的构建载体免疫的小鼠的抗血清也能产生特异性反应，但滴定度要比源自用相关的pF78E2构建载体得到的血清低得多。几个因素，如表达水平、重组产物的折叠、强T辅助表位的存在，可能解释融合构建载体得到的应答比单一F78拟表位载体得到的高这一现象。

抗拟表位血清与不同的天然HVR1变型交叉反应

在ELISA中利用复制天然分离物HVR1序列的一系列43种合成肽段作为包被抗原(见材料与方法)测试了在以DNA免疫为基础的拟表位/E2融合蛋白诱导交叉免疫应答的能力。

表III列出了用不同的各个质粒和质粒混合物免疫Balb/c小鼠(上图)和C57Black小鼠(下图)后得到的平均滴定度。交叉反应性用43种测试多肽中表现阳性的数目表示。

尽管在相应的免疫血清中存在大量针对具有同源拟表位序列的肽的特异性抗体，pB14E2和pB24E2质粒并不诱导产生交叉反应的免疫应答(表III)。所有的其它构建载体引起与一些天然HVR1序列发生交叉反应的抗血清，其中抗F78血清能识别高达28％的测试多肽(表III)。

免疫血清的交叉反应程度通常反映了质粒个体的免疫原性，因为在大多数情况下高滴定度与高交叉反应性水平相对应(表III)。但是仅凭滴定度并不总能解释所有的交叉反应性上的差异，如表所示，从用pR6E2质粒免疫的小鼠得到的血清的滴定度比构建载体pD6E2、PH1E2和pM63E2得到的低但，pR6E2血清与更多天然HVR1肽段反应。类似地从用pF7E2、pM122E2和pR9E2免疫的小鼠得到的血清的交叉反应性比pG31E2免疫血清的高两倍，但它们的滴定度相似(表III)。

对C57Black小鼠注射pF78E2嵌合基因导致比Balb/c小鼠强的应答从而导致更大的交叉反应性(49％对28％)。

用质粒混合物免疫提高应答的交叉反应性

用编码拟表位/E2嵌合蛋白的质粒的混合物免疫3组Balb/c小鼠，每只小鼠每次注射接受总量100μg DNA。

混合物A含有编码D6、F78、G31、H1、M122和R6的E2融合蛋白的质粒。混合物B还包括其它三种诱导交叉反应抗体的构建载体：pE19E2、pM63E2和pR9E2。而混合物C含有所有的11种质粒。(肽的混合物、根据混合物A、混合物B、混合物C编码肽的核酸代表本发明的进一步的方面。)

所有的3种混合物都是免疫原性的并诱导高交叉反应性的抗血清(表III)。源自用混合物A免疫的动物的抗体的交叉反应性并不比通过单独注射混合物中所包含的各个质粒得到的更高。然而，应强调的是前者的滴定度比后者低约50倍，这暗示着如果免疫效率提高的话混合物A有诱导出交叉反应应答更广泛的抗体的潜力。从混合物B得到的结果进一步证实了这个假说。接受第二种质粒混合物的小鼠表现出交叉反应性的净提高，它们产生的抗血清能识别约50％的用于测试的天然HVR1序列。在此例中平均滴定度仍然比从质粒个体单独免疫的动物中得到的交叉反应性最强的血清的滴定度低一个数量级(表III)。

含有编码拟表位/E2嵌合蛋白的所有质粒的最复杂的混合物的肌肉注射并未进一步提高所产生的免疫血清的交叉反应性。用上述混合物中两种另加的构建载体(pB14E2和pB24E2)免疫动物并未观察到交叉反应性，这与上述结果相一致。

对C57black小鼠的免疫得到类似的数据。

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表I-筛选图解

表的顶部表示用HCV感染病人的血清对HVRl文库的第一轮和第二轮富集。血清的名称与相应的感染病毒的基因型(括号中)在左边标明。右边表示得到的噬菌体库的名称。

表II-在“强”和“弱”交叉反应性系列拟表位中观察到的氨基酸频率

i表示氨基酸位置(1到27)；aa表示氨基酸的标准单字母代码；Fs(i，aa)是“强”拟表位中氨基酸aa在位置i出现的频率；Fw(i，aa)是“弱”拟表位中氨基酸aa在位置i出现的频率。

                          表I

初次筛选血渍/基因型  噬菌体库	第二次筛选血渍/基因型  噬菌体库
		σ4R  (1b)    4R	σ2    (1b)    B
σ3R  (3a)    3R	σ1    (1a)    D
		σ3   (2a)    3	σ2    (1b)    E
σ2R  (3a)    2R	σ3    (2a)    R
		σ1   (1a)    1	σ4    (2a)    Fσ2    (1b)    H
σ2P  (2b)    2P	σ2    (1b)    Gσ1    (1a)    Lσ4    (2a)    M
		σN           N

表II

                 Fs        Fw                        Fs         Fwi    aa                             i      aa

              (i，aa)    (i，aa)                    (i，aa)    (i，aa)

              表III质粒               滴定度       阳性肽段数pB14E2             270          0pB24E2             189          0pD6E2              4222         3pE19E2             990          2pF78E2             31812        12pG31E2             31251        5pH1E2              2977         1pM63E2             3888         2pM122E2            41360        10pR6E2              1923         6pR9E2              21092        11mF78               110          2MIX                684          11MIX                1224         19MIX                610          18质粒               滴定度       阳性肽段数pF78E2             41547        21MIX                20381        24

Claims (96)

1.由至少10⁵种不同的肽组成的文库，每种肽都具有与下式(“式I”)相符的氨基酸序列：

Q T H V T G G S A A R T T S G L T S L F S P G A S Q N

T   T T V     V Q G H A A H S   V G     R L   P K   K

    R         Q V S   Q V R R     R       S   S Q

                                          Q

2.根据权利要求1的文库，包括至少10⁶种不同的肽，每种肽具有与上述式相符的氨基酸序列。

3.根据权利要求2的文库，包括至少10⁷种不同的肽，每种肽具有与上述式相符的氨基酸序列。

4.根据权利要求1的文库，其中的每种肽具有下式(“式III”)的氨基酸序列：

Q T H T V G G Q A S H Q A S S L T S L F S P G A K Q N

T   T V T     S Q G   A T H G   V G           S S   K

              V V A   T V R R                 P Q

5.根据权利要求4的文库，包括至少10⁶种不同的肽，每种肽具有与式III相符的氨基酸序列。

6.根据权利要求1至5中任何一项的在噬菌体颗粒的表面表达的文库。

7.获得一种或多种肽的方法，上述肽含有与HCV株HVR1表位发生免疫交叉反应的表位，该方法包括使根据权利要求1到5中任何一项的肽文库与能结合上述HCV株HVR1的抗体分子相接触，并从上述文库中选出一种或多种能结合上述抗体分子的肽。

8.根据权利要求7的方法，其中选出的肽或多肽含有免疫学上与许多株HCV的HVR1发生交叉反应的表位。

9.根据权利要求8的方法，包括使根据权利要求1至5中任何一项的肽文库与许多抗体分子相接触，上述抗体分子整体上能与大量HCV株的HVR1结合。

10.根据权利要求9的方法，其中所述的许多抗体分子源自感染了HCV个体的血清。

11.根据权利要求7至10中任何一项的方法，其中所述的文库是表达在噬菌体颗粒的表面的，每个颗粒含有编码其表面表达的肽的核酸。

12.根据权利要求11的方法，其中的核酸来自表达上述选出的肽的噬菌体颗粒。

13.根据权利要求12的方法，包括通过从核酸表达生产肽，上述核酸的序列来自表达选出的肽的噬菌体颗粒的核酸序列。

14.根据权利要求7至13中任何一项的方法，其中具有上述选出肽的氨基酸序列的肽是以分离形式提供的。

15.根据权利要求7至13中任何一项的方法，其中各自具有上述选出肽的氨基酸序列的许多肽是以分离形式提供的。

16.根据权利要求7至13中任何一项的方法，其中上述许多肽的混合物是以分离形式提供的。

17.根据权利要求14至16中任何一项的方法，其中所述具有上述选出肽的氨基酸序列的肽，所述的以分离形式提供的许多肽或许多肽的混合物是通过从编码核酸表达而提供的。

18.根据权利要求14至16中任何一项的方法，其中所述具有上述选出肽的氨基酸序列的肽，所述的分离形式的许多肽或许多肽的混合物是通过肽合成而提供的。

19.根据权利要求14至18中任何一项的方法，其中所述具有上述选出肽的氨基酸序列的肽，所述的分离形式的许多肽或许多肽的混合物被配制成含有至少一种另加成分的组合物。

20.根据权利要求19的一种方法，其中所述的组合物包括制药上可接受的赋形剂。

21.根据权利要求19的一种方法，其中所述的组合物包括佐剂。

22.根据权利要求7至17中任何一项的方法，其中所述选出肽的氨基酸序列是以与其它另加氨基酸形成融合物的形式提供的。

23.根据权利要求22的一种方法，其中所述的融合物包括在HVR1部位具有所述氨基酸序列的HCV E2/NS1蛋白。

24.根据权利要求22或23的一种方法，其中所述的融合物被配制成至少含有一种另加成分的组合物。

25.根据权利要求24的一种方法，其中所述的组合物包括制药上可接受的赋形剂。

26.根据权利要求24的一种方法，其中所述的组合物包括佐剂。

27.根据权利要求23的一种方法，其中所述的融合物包括在重组的HCV中。

28.根据权利要求27的一种方法，其中所述的重组HCV被配制成至少含有一种另加成分的组合物。

29.根据权利要求28的一种方法，其中所述的组合物包括制药上可接受的赋形剂。

30.根据权利要求28的一种方法，其中所述的组合物包括佐剂。

31.根据权利要求7至30中任何一项的方法，其中所述的选出的那个肽具有或选出的那些肽每个具有根据下式(“式II”)的氨基酸序列：

Q T H T V G G Q A S H Q A S S L T S L F S P G A K Q N

    T               R             G       L   S

                                  R       Q   P

32.可从根据权利要求1至6中任何一项的肽文库得到的108种不同肽的混合物，其中108种不同肽中每种都具有与下式(“式II”)相符的氨基酸序列：

Q T H T V G G Q A S H Q A S S L T S L F S P G A K Q N

    T               R             G       L   S

                                  R       Q   P

33.一种组合物，包括可从根据权利要求32的混合物中得到的式II的多种肽。

34.根据权利要求33的一种组合物，包含2至约10种可从上述混合物中得到的不同的肽。

35.根据权利要求33或34的一种组合物，包含肽G31、F78、R9、D6、M122和H1中的一种或多种，上述肽的氨基酸序列在图7(A)中列出。

36.根据权利要求35的一种组合物，包含上述肽R9、F78、H1和D6(“MIX1”)。

37.根据权利要求35的一种组合物，包含上述肽M122和G31(“MIX2”)。

38.根据权利要求35的一种组合物，包含上述肽G31、F78、R9、D6、M122和H1(“MIX3”)。

39.根据权利要求33到38中任何一项的一种组合物，其中一种或多种上述肽与另加的氨基酸形成融合物。

40.根据权利要求39的一种组合物，其中所述的融合物包括在HVR1位置具有上述肽的HCV E2/NS1蛋白。

41.根据权利要求40的一种组合物，其中所述的融合物包括在重组HCV中。

42.根据权利要求33至41中任何一项的一种组合物，包含至少一种另加成分。

43.根据权利要求42的一种组合物，其中所述的组合物包含制药上可接受的赋形剂。

44.根据权利要求42的一种组合物，其中所述的组合物包含佐剂。

45.式II中的一种肽，可从根据权利要求32的混合物得到。

46.可从根据权利要求1至5中任何一项的文库得到的一种肽。

47.根据权利要求46的肽，其氨基酸序列选自包含下列序列的一组序列：2.11      QTHTVGGVQGRQAHSLTSLFSPGASQND6        QTTTTGGQVSHATHGLTGLFSLGPQQKD18       QTHTTGGSASHQASGLTRLFSQGPSQNF63       QTHVVGGQQGRQVSSLVSLFSPGASQKG31       TTHTVGGSVARQVHSLTGLFSPGPQQKL13       QTHTVGGSQAHAAHSLTRLFSPGSSQNM69       QTTVVGGSQARAAHGLVSLFSLGSKQNZ61       QTHVVGGVQGRQTSGLVGLFSPGSKQNR9        QTTVVGGSQSHTVRGLTSLFSPGASQNB26       TTTTTGGQAGHQAHSLTSLFSPGASQKB22       QTHVVGGVQSHQTSGLTSLFSPGASQKB35       QTHTTGGVQGHQTSRLTSLFSPGPSQND29       TTTVVGGQAAHQTHSLTSLFSPGAKQND33       TTTTTGGQQSHTVHGLVGLFSPGSKQNE26       QTHTVGGVQAHTVRGLTSLFSPGSSQNF80       QTHTTGGQAGHTASSLTGLFSPGAKQNF19       QTTTVGGVASHQAHSLTGLFSPGAKQKF78       QTHTTGGQAGHQAHSLTGLFSPGAKQNH1        QTHTTGGVVGHATSGLTSLFSPGPSQKL76       TTTTVGGQASHQTSSLTGLFSPGSKQNB24       TTTTVGGQASHTTSSLTGLFSPGASQKM63       QTHTTGGVVSHQTRSLVGLFSPGPQQNM27       QTTTTGGVASHAAHRLTSLFSPGPQQK

M122       QTTTTGGSASHAVSSLTGLFSPGSKQN

M129       QTTVVGGSAGHTASSLVGLFSPGSKQN

M119       TTTTVGGQASHTTSSLTGLFSPGSQQN

R5         QTHTTGGQASHQVSSLVSLFSPGAKQK

R6         TTTTTGGQVGHQTSGLTGLFSPGAQQN

R27        TTHVVGGSASHAVRGLTSLFSPGSSQN

48.具有任何下列氨基酸序列的肽：

B14        QTTVTGQASHTTSSLTGLFSPGASQK

B33        ATHATGGQAAHSTHSLTSLFSPGASQK

F81        QTHVTGGSAAHQTGGLTGLFSPGPKQN

B18        QTTVVGGQASHVSRLTGLFSPGSSQK

E19        TTHTGGQQAHTTSRLVSLFSPGASQK

L72        QTTTAAHTTSGLTGLFSPGAKQN

D20        QTHVTGVAGRQTSGLVSLFSPGSSQN

D30        QGGVQGHTTSSLVGLFSPGSQQN

49.一种组合物，含有根据46至48中任何一项的一种肽。

50.一种组合物，含有根据46至48中任何一项的多种肽。

51.根据权利要求50的组合物，含有2至约10种根据权利要求46至48中任何一项的不同的肽。

52.根据权利要求49至51的组合物，其中所述的一种或多种肽与另加的氨基酸形成融合物。

53.根据权利要求52的组合物，其中所述的融合物包括在HVR1位置具有上述肽的HCV E2/NS1蛋白。

54.根据权利要求53的组合物，其中所述的融合物包括在重组HCV中。

55.根据权利要求49至54的组合物，包含至少一种另加成分。

56.根据权利要求55的组合物，其中所述的组合物包括制药上可接受的赋形剂。

57.根据权利要求55的组合物，其中所述的其中所述的组合物包括佐剂。

58.编码根据权利要求45至48中任何一项的一种肽的核酸。

59.编码根据权利要求45至48中任何一项的多种肽的核酸。

60.根据权利要求58或59的核酸可操作地与调节编码一种或多种肽表达的调控序列连接。

61.含有根据权利要求60的核酸的宿主细胞。

62.生产根据权利要求45至48中任何一项的一种或多种肽的方法，该方法包括使根据权利要求60的核酸表达。

63.生产根据权利要求45至48中任何一项的一种或多种肽的方法，该方法包括在使上述肽或多肽表达的条件下培养根据权利要求61的宿主细胞。

64.根据权利要求62或63的方法，包括分离和/或纯化所述的一种或多种肽。

65.根据权利要求62至64中任何一项的方法，包括将所述一种或多种肽配制成含有至少一种附加成分的组合物。

66.根据权利要求65的方法，其中所述的组合物包括制药上可接受的赋形剂。

67.根据权利要求65的方法，其中所述的组合物包括佐剂。

68.得到一种或多种抗体分子的方法，上述抗体分子含有能结合大量HCV株HVR1上的表位的结合位点，该方法包括使一系列抗体分子与根据权利要求45至48中任何一项的一种肽接触，并从该系列中选出能与上述肽结合的一种或多种抗体分子。

69.根据权利要求68的方法，包括使一系列抗体与根据权利要求45至48中任何一项的多种肽接触。

70.根据权利要求68或69的方法，其中所述的肽以与另加氨基酸形成融合物的形式提供。

71.根据权利要求68至70中任何一项的方法，其中的一种或多种肽被施用到非人类哺乳动物上并使它或它们与由上述哺乳动物免疫系统产生的一系列抗体分子接触，然后从上述哺乳动物中得到能结合上述一种或多种肽的一种或多种抗体分子。

72.根据权利要求68至70中任何一项的方法，其中的一种或多种肽被施用到非人类哺乳动物上并使它们与由上述哺乳动物免疫系统产生的一系列抗体分子接触，然后从上述哺乳动物中得到能产生结合上述一种或多种肽的抗体分子的细胞。

73.根据权利要求72的方法，其中所述的抗体分子是从上述细胞或其后代得到的。

74.根据权利要求71至73任一项的方法，其中杀死所述的哺乳动物。

75.根据权利要求68至70中任何一项的方法，其中的一系列抗体分子在噬菌体颗粒的表面表达，每种噬菌体颗粒含有编码其表面表达的抗体分子的核酸。

76.根据权利要求75的方法，其中的核酸是从表达能结合上述一种或多种肽的抗体分子的噬菌体颗粒中得到的。

77.根据权利要求76的方法，包括通过从核酸表达产生抗体分子，上述核酸具有从噬菌体颗粒中得到的核酸的序列，上述噬菌体颗粒表达能结合上述一种或多种肽的抗体。

78.根据权利要求68至77中任何一项的方法，其中能结合一种或多种上述肽的一种抗体分子以分离的形式提供。

79.根据权利要求78的方法，其中能结合一种或多种上述肽的多种抗体分子以分离的形式提供。

80.根据权利要求79的方法，其中所述的多种抗体分子的混合物以分离的形式提供。

81.根据权利要求78至80中任何一项的方法，其中所述的分离形式的抗体分子、多种抗体分子或多种抗体分子的混合物是通过从编码核酸表达而提供的。

82.根据权利要求78至81中任何一项的方法，其中所述的分离形式的抗体分子、多种抗体分子或多种抗体分子的混合物被配制成至少含有一种另加成分的组合物。

83.根据权利要求82的方法，其中所述的组合物包括制药上可接受的赋形剂。

84.根据权利要求68至83中任何一项的方法得到的抗体分子。

85.根据权利要求33至44中任何一项的组合物在用于制备能结合HCV HVR1表位的哺乳动物抗体的药物生产中的用途。

86.根据权利要求45至48中任何一项的肽在用于制备能结合HCVHVR1表位的哺乳动物抗体的药物生产中的用途。

87.根据权利要求49至57中任何一项的组合物在用于制备能结合HCV HVR1表位的哺乳动物抗体的药物生产中的用途。

88.根据权利要求58至60中任何一项的核酸在用于制备能结合HCVHVR1表位的哺乳动物抗体的药物生产中的用途。

89.根据权利要求84的抗体分子在用于提高哺乳动物中能结合HCVHVR1表位的抗体水平的药物生产中的用途。

90.在哺乳动物中制备能结合HCV HVR1表位的抗体的方法，该方法包括对哺乳动物施用根据权利要求33至44中任何一项的组合物。

91.在哺乳动物中制备能结合HCV HVR1表位的抗体的方法，该方法包括对哺乳动物施用根据权利要求45至48中任何一项的肽。

92.在哺乳动物中制备能结合HGV HVR1表位的抗体的方法，该方法包括对哺乳动物施用根据权利要求49至57中任何一项的组合物。

93.在哺乳动物中能结合HCV HVR1表位的抗体的方法，该方法包括对哺乳动物施用根据权利要求58至60的任一项的核酸。

94.提高哺乳动物中能结合HCV HVR1表位的抗体水平的方法，该方法包括对哺乳动物施用根据权利要求84的一种抗体。

95.根据权利要求90至94中任何一项的方法，其是预防性的。

96.根据权利要求90至94中任何一项的方法，其中的哺乳动物具有HCV感染。

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