PT1436397E - Vacina de v�rus da hepatite c - Google Patents

Description

ΕΡ 1 436 397/ΡΤ DESCRIÇÃO "Vacina de vírus da hepatite C"

ANTECEDENTES DO INVENTO

As referências citadas no presente pedido não foram reconhecidas como sendo arte anterior ao invento reivindicado.

Cerca de 3% da população mundial está infectada com o vírus da Hepatite C (VHC) . (Wasley et al., Semin. Liver Dis. 20: 1-16, 2000) . A exposição a VHC resulta numa doença aguda manifesta numa pequena percentagem de casos, enquanto na maioria dos casos o vírus estabelece uma infecção crónica causando inflamação do fígado que progride lentamente para insuficiência hepática e cirrose. (Iwarson, FEMS Microbiol. Rev. 14: 201-204, 1994). Adicionalmente, levantamentos epidemiológicos indicam um papel importante do VHC na patogénese do carcinoma hepatocelular. (Kew, FEMS Microbiol. Rev. 14: 211-220, 1994; Alter, Blood 85: 1681-1695, 1995).

Antes da implementação em 1992 da pesquisa de rotina de VHC no sangue, a maioria das infecções era contraída através de exposição inadvertida a sangue contaminado, produtos sanguíneos ou órgãos transplantados. Nas áreas em que a pesquisa de VHC no sangue é realizada, o VHC é principalmente contraído por exposição percutânea directa a sangue infectado, i.e.f utilização de fármacos intravenosos. Métodos de transmissão menos frequentes incluem exposição perinatal, hemodiálise e contacto sexual com uma pessoa infectada com VHC. (Alter et al., N. Engl. J. Med. 341 (8): 556-562, 1999; Alter, J. Hepatol. 31, Supl. 88-91, 1999; Semin. Liver. Dis. 201: 1-16, 2000) . O genoma de VHC consiste num ARN de cadeia simples com cerca de 9,5 kb codificando uma poliproteína percursora de cerca de 3000 aminoácidos. (Choo et al., Science 244: 362-364, 1989; Choo et al., Science 244: 359-362, 1989; Takamizawa et al., J. Virol. 65: 1105-1113, 1991). A poliproteína de VHC contém as proteínas virais na ordem: C-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B. 2 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Proteínas virais individuais são produzidas através de proteólise da poliproteína de VHC. As proteases das células hospedeiras libertam as putativas proteínas estruturais C, El, E2 e p7, e criam o terminal N de NS2 no aminoácido 810. (Mizushima et al., J. Virol. 68: 2731-2734, 1994; Hijikata et al., P.N.A.S. USA 90 : 1073-10777, 1993).

As proteínas não estruturais NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B formam presumivelmente a maquinaria de replicação do vírus e são libertadas a partir da poliproteína. Uma protease dependente de zinco associada a NS2 e ao terminal N de NS3 é responsável pela clivagem entre NS2 e NS3. (Grakoui et al., J. Virol. 67: 1385-1395, 1993; Hijikata et al., P.N.A.S. USA 90: 10773-10777, 1993). Uma serina-protease distinta situada no domínio N-terminal de NS3 é responsável pelas clivagens proteolíticas nas junções NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A e NS5A/NS5B. (Bartenschlager et al., J. Virol. 67: 3835-3844, 1993; Grakoui et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 10583- 10587, 1993; Tomei et al., J. Virol. 67: 4017-4026, 1993). NS4A proporciona um cofactor para a actividade de NS3. (Failla et al., J. Virol. 68: 3753-3760, 1994; De Francesco et al.,

Patente U.S. 5739002). NS5A é uma proteína altamente fosforilada conferindo resistência ao interferão. (De Francesco et al., Semin. Liver Dis. 20(1): 69-83, 2000; Pawlotsky, Virai Hepat. Supl. 1: 47-48, 1999) . NS5B proporciona uma ARN-polimerase dependente de ARN. (De Francesco et al., Publicação Internacional Número WO 96/37619; Behrens et al., EMBO 15: 12-22, 1996; Lohmann et al., Virology 249: 108-118, 1998).

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento engloba um ácido nucleico compreendendo: (a) uma sequência nucleotídica codificando um polipéptido Met-NS3-NS 4A-NS4B-NS5A-NS5B possuindo uma identidade de aminoácidos com SEQ ID NO:l de pelo menos 85%, desde que o referido polipéptido tenha suficiente actividade 3 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ proteásica para se processar a si mesmo para produzir uma proteína NS5B e a referida proteína NS5B seja enzimaticamente inactiva, em que o referido ácido nucleico é um vector de expressão capaz de expressar o referido polipéptido a partir da referida sequência nucleotídica numa célula humana; ou (b) uma cassete de expressão génica capaz de expressar um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B possuindo uma identidade de aminoácidos com SEQ ID N0:1 de pelo menos 85% numa célula humana, desde que o referido polipéptido se possa processar a si mesmo para produzir uma proteína NS5B e a referida proteína NS5B seja enzimaticamente inactiva, compreendendo a referida cassete de expressão: a) um promotor transcricionalmente ligado a uma sequência nucleotídica codificando o referido polipéptido; b) um local de ligação ao ribossoma a 5' funcionalmente ligado à referida sequência nucleotídica, c) um terminador unido à extremidade 3' da referida sequência nucleotídica, e d) um sinal de poliadenilação a 3' funcionalmente unido à referida sequência nucleotídica. 0 ácido nucleico é particularmente útil como componente de uma vacina de adenovector ou ADN plasmídico proporcionando uma ampla variedade de antigénios para a geração de uma resposta imunitária mediada por células (CMI) específica de VHC contra VHC.

Uma resposta CMI específica de VHC refere-se à produção de linfócitos T citotóxicos e células T ajudantes que reconhecem um antigénio de VHC. A resposta CMI pode também incluir efeitos imunitários não específicos de VHC.

Referência a uma “sequência substancialmente semelhante" indica uma identidade de pelo menos cerca de 85% com uma sequência de referência. Assim, por exemplo, polipéptidos possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente semelhante a SEQ ID N0:1 têm uma identidade de aminoácidos global de pelo menos cerca de 85% com SEQ ID N0:1. 4 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Os polipéptidos correspondendo a NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B têm uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 85% com a região correspondente em SEQ ID N0:1. Tais polipéptidos correspondentes são também aqui referidos como polipéptidos NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B. A expressão dentro de uma célula humana tem aplicações terapêuticas para tratar activamente uma infecção de VHC e para tratar profilacticamente contra uma infecção de VHC.

Um vector de expressão contém uma sequência nucleotidica codificando um polipéptido juntamente com elementos reguladores para transcrição e processamento correctos. Os elementos reguladores que podem estar presentes incluem aqueles naturalmente associados à sequência nucleotidica codificando o polipéptido e elementos reguladores exógenos não naturalmente associados à sequência nucleotidica. Elementos reguladores exógenos tais como um promotor exógeno podem ser úteis para expressão num determinado hospedeiro, tal como numa célula humana. Elementos reguladores úteis para expressão incluem um promotor, um terminador, um local de ligação ao ribossoma e um sinal de poliadenilação. A referência a "transcricionalmente ligado" indica que o promotor está posicionado de modo a que a transcrição da sequência nucleotidica possa ser alcançada através da ligação da ARN-polimerase ao promotor. Transcricionalmente ligado não requer que a sequência a transcrever esteja adjacente ao promotor. A referência a "funcionalmente ligado" indica a capacidade para mediar um efeito na sequência nucleotidica. Funcionalmente ligado não requer que as sequências ligadas estejam adjacentes uma à outra. Um sinal de poliadenilação a 3' funcionalmente ligado à sequência nucleotidica facilita a clivagem e poliadenilação do ARN transcrito. Um local de ligação ao ribossoma a 5' funcionalmente ligado à sequência nucleotidica facilita a ligação ao ribossoma. 0 ácido nucleico é um vector de ADN plasmídico ou um adenovector adequado para aplicação terapêutica no tratamento de VHC ou como um intermediário na produção de um vector 5 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ terapêutico. 0 tratamento de VHC inclui tratar activamente uma infecção de VHC e tratar profilacticamente contra uma infecção de VHC.

Outro aspecto da presente divulgação descreve um adenovector compreendendo um ácido nucleico tal como descrito acima que é produzido através de um processo envolvendo (a) recombinação homóloga e (b) recuperação do adenovector. 0 passo de recombinação homóloga produz um plasmídeo de genoma adenoviral. 0 passo de recuperação do adenovector produz o adenovector a partir do plasmídeo de adenogenoma.

Os plasmídeos de genoma adenoviral aqui descritos contêm um genoma adenoviral recombinante possuindo uma deleção na região EI e opcionalmente na região E3 e uma cassete de expressão génica inserida numa das regiões suprimidas. 0 genoma adenoviral recombinante é constituído por regiões substancialmente semelhantes a um ou mais dos serotipos adenovirais.

Outro aspecto do presente invento descreve um adenovector consistindo numa sequência de ácido nucleico possuindo um identidade de sequência com SEQ ID NO:4 de pelo menos 65%, ou um derivado desta, em que o referido derivado desta possui a sequência codificando a poliproteína de VHC presente em SEQ ID NO:4 substituída pela sequência codificando a poliproteína de VHC de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:10 OU SEQ ID N0:11. É também divulgada uma célula recombinante cultivada compreendendo um ácido nucleico do presente invento descrito acima. A célula recombinante possui uma variedade de utilizações tais como ser utilizada para replicar ácido nucleico codificando o polipéptido em métodos de construção de vectores.

Outro aspecto da presente divulgação descreve um método de produção de um adenovector compreendendo um ácido nucleico do presente invento descrito acima. 0 método envolve os passos de (a) produção de um plasmídeo de genoma adenoviral contendo um genoma adenoviral recombinante com deleções nas regiões EI e E3 e uma cassete de expressão génica inserida numa das 6 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ regiões suprimidas e (b) recuperação do adenovector a partir do plasmídeo de genoma adenoviral.

Outro aspecto do presente invento descreve uma composição farmacêutica compreendendo um vector para expressão de um ácido nucleico do presente invento tal como descrito acima e um transportador farmaceuticamente aceitável. 0 vector é adequado para administração e expressão do polipéptido num paciente.

Um "paciente" refere-se a um mamífero susceptível de ser infectado com VHC. Um paciente pode ou não estar infectado com VHC. Exemplos de pacientes são seres humanos e chimpanzés. É também divulgado um método de tratamento de um paciente compreendendo o passo de administração ao paciente de uma quantidade eficaz de um vector expressando um ácido nucleico do presente invento tal como descrito acima. 0 vector é adequado para administração e expressão do polipéptido no paciente. 0 paciente sujeito a tratamento pode ou não estar infectado com VHC. Para um paciente infectado com VHC, uma quantidade eficaz é suficiente para alcançar um ou mais dos seguintes efeitos: reduzir a capacidade do VHC para se replicar, reduzir a carga de VHC, aumentar a eliminação virai e aumentar uma ou mais respostas CMI específicas de VHC. Para um paciente não infectado com VHC, uma quantidade eficaz é suficiente para alcançar um ou mais dos seguintes: uma maior capacidade para produzir um ou mais componentes de uma resposta CMI específica de VHC para uma infecção de VHC, uma menor susceptibilidade a infecção por VHC e uma capacidade reduzida do vírus infectante para estabelecer infecção persistente para doença crónica.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras IA e 1B ilustram SEQ ID N0:1.

As Figuras 2A, 2B, 2C e 2D ilustram SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 2 proporciona uma sequência nucleotídica codificando para SEQ ID N0:1 juntamente com um local interno de entrada no 7 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ ribossoma optimizado e uma terminação TAAA. Os nucleótidos 1-6 proporcionam um local interno de entrada no ribossoma optimizado. Os nucleótidos 7-5961 codificam para um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de VHC com nucleótidos nas posições 5137 a 5145 proporcionando uma sequência AlaAlaGly nas posições de aminoácidos 1711 a 1713 que tornam NS5B inactiva. Os nucleótidos 5962-5965 proporcionam uma terminação TAAA.

As Figuras 3A, 3B, 3C e 3D ilustram SEQ ID NO: 3 . SEQ ID NO: 3 é uma versão de codões optimizados de SEQ ID NO: 2. Os nucleótidos 7-5961 codificam um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de VHC.

As Figuras 4A-4M ilustram MRKAdô-NSmut (SEQ ID N0:4). SEQ ID NO: 4 é um adenovector contendo uma cassete de expressão onde o polipéptido de SEQ ID N0:1 é codificado por SEQ ID NO: 2. Os pares de bases 1-450 correspondem aos pb 1 a 450 de Ad5; os pares de bases 462 a 1252 correspondem ao promotor de CMV humano; os pares de bases 1258 a 1267 correspondem à sequência de Kozak; os pares de bases 1264 a 7222 correspondem aos genes NS; os pares de bases 7231 a 7451 correspondem ao sinal de poliadenilação de BGH; os pares de bases 7469 a 9506 correspondem aos pares de bases 3511 a 5548 de Ad5; os pares de bases 9507 a 32121 correspondem aos pares de bases 5542 a 28156 de Ad6; os pares de bases 32122 a 35117 correspondem aos pares de bases 30789 a 33784 de Ad6; e os pares de bases 35118 a 37089 correspondem aos pares de bases 33967 a 35935 de Ad5.

As Figuras 5A-50 ilustram SEQ ID NO:5 e 6. SEQ ID NO:5 codifica um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de VHC com uma ARN-polimerase dependente de ARN activa. SEQ ID NO: 6 proporciona a sequência de aminoácidos para o polipéptido.

As Figuras 6A-6C proporcionam a sequência de ácido nucleico para pVIJnSA (SEQ ID NO:7).

As Figuras 7A-7N proporcionam a sequência de ácido nucleico para o genoma de Ad6 (SEQ ID NO:8).

As Figuras 8A-8K proporcionam a sequência de ácido nucleico para o genoma de Ad5 (SEQ ID NO:9). 8 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ A Figura 9 ilustra diferentes regiões do genoma de Ad6. 0 genoma de ADN cd linear (35759 pb) é indicado através de duas linhas paralelas e está dividido em 100 unidades-mapa. As unidades de transcrição são mostradas relativamente à sua posição e orientação no genoma. Os genes iniciais (EIA, E1B, E2A/B, E3 e E4) são indicados por setas cinzentas. Os genes tardios (Ll a L5), indicados por setas negras, são produzidos através de processamento alternativo de um transcrito produzido a partir do promotor tardio principal (MLP) e todos contêm o líder tripartido (1, 2, 3) nas suas extremidades 5'. A região EI situa-se aproximadamente de 1,0 a 11,5 unidades-mapa, a região E2 de 75,0 a 11,5 unidades-mapa, E3 de 76,1 a 86,7 unidades-mapa, e E4 de 99,5 a 91,2 unidades-mapa. A principal unidade de transcrição tardia está situada entre 16,0 e 91,2 unidades-mapa. A Figura 10 ilustra recombinação homóloga para recuperar pAdEl-E3+ contendo regiões de Ad6 e Ad5. A Figura 11 ilustra o recombinante homólogo para recuperar pAdEl-E3+ contendo regiões de Ad6. A Figura 12 ilustra um Western blot em extractos de células inteiras de células 293 transfectadas com ADN plasmídico expressando diferentes cassetes de NS de VHC. Os produtos maduros NS3 e NS5A foram detectados com anticorpos específicos. "pVIJns-NS" refere-se a um plasmídeo pVIJnsA onde está codificado um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B por SEQ ID NO:5, e SEQ ID NO:5 está inserida entre as bases 1881 e 1912 de SEQ ID NO:7. "pVlJns-NSmut" refere-se a um plasmídeo pVIJnsA onde SEQ ID NO: 2 está inserida entre as bases 1882 e 1925 de SEQ ID NO:7. "pVlJns-NSOPT mut" refere-se a um plasmídeo pVIJnsA onde SEQ ID NO:3 está inserida entre as bases 1881 e 1905 de SEQ ID NO:7.

As Figuras 13A e 13B ilustram respostas de células T através de ELIspot de IFNy induzidas em ratinhos C57black6 (A) e ratinhos BalbC (B) através de duas injecções de 25 pg e 50 pg respectivamente, de ADN plasmídico codificando as diferentes cassetes de NS de VHC com Electro-Transferência de Genes (GET). 9 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ A Figura 14 ilustra a expressão proteica de diferentes adenovectores após infecção de células HeLa. MRKAd5-NSmut é um adenovector baseado numa sequência de Ad5 (SEQ ID NO:9), onde o genoma de Ad5 tem uma deleção em EI dos pares de bases 451 a 3510, uma deleção em E3 dos pares de bases 28134 a 30817, e possui a cassete de expressão de NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B tal como proporcionada nos pares de bases 451 a 7468 de SEQ ID NO:4 inserida entre as posições 450 e 3511. Ad5-NS é um adenovector baseado na estrutura de Ad5 com uma deleção em EI dos pares de bases 342 a 3523, e deleção em E3 dos pares de bases 28134 a 30817 e contendo uma cassete de expressão codificando um NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de SEQ ID NO: 5. "MRKAd6-NSOPTmut" refere-se a um adenovector possuindo uma sequência SEQ ID NO: 4 modificada, em que os pares de bases 1258 a 7222 de SEQ ID NO:4 são substituídos por SEQ ID NO:3. A Figura 15 ilustra respostas de células T através de ELIspot de IFNy induzidas em ratinhos C57black6 através de duas injecções de 109 pv de adenovectores contendo diferentes cassetes de genes não estruturais de VHC.

As Figuras 16A-16D ilustram respostas de células T através de ELIspot de IFNy induzidas em macacos Rhesus através de uma ou duas injecções de IO10 pv (A) ou 1011 pv (B) de adenovectores contendo diferentes cassetes de genes não estruturais de VHC.

As Figuras 17A e 17B ilustram respostas de células T CD8+ através de IFNy ICS induzidas em macacos Rhesus através de duas injecções de IO10 pv (A) ou 1011 pv (B) de adenovectores codificando as diferentes cassetes de genes não estruturais de VHC.

As Figuras 18A-18F ilustram respostas de células T através de ensaio de CTL em massa induzidas em macacos Rhesus através de duas injecções de 1011 pv de Ad5-NS (A) , MRKAd5-NSmut (B), ou MRKAd6-NSmut (C). A Figura 19 ilustra o plasmídeo pE2. 10 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ A Figura 20A-D ilustra a sequência parcial com codões optimizados NSsuboptmut (SEQ ID NO:10). A sequência codificando para o polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B é da base 7 à 5961.

BREVE DESCRIÇÃO DO INVENTO O presente invento engloba vectores Ad6 e um ácido nucleico codificando um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B tal como descrito acima que contém uma região NS5B inactiva. Ao proporcionar uma região NS5B inactiva fornece-se antigénios de NS5B ao mesmo tempo que se reduz a possibilidade de efeitos secundários adversos devido a uma ARN-polimerase virai activa. As utilizações do ácido nucleico apresentado incluem a utilização como componente de vacina para introduzir numa célula um polipéptido de VHC que proporcione uma ampla variedade de antigénios para gerar uma resposta CMI contra VHC, e como intermediário para produzir um tal componente de vacina. A resposta imunitária celular adaptativa pode funcionar para reconhecer antigénios virais em células infectadas com VHC ao longo do corpo devido à distribuição ubíqua da expressão do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I e II, para induzir memória imunológica e para manter a memória imunológica. Estas funções são atribuídas às células T ajudantes (Th) CD4+ e T citotóxicas (CTL) CD8+ específicas do antigénio.

Após activação através dos seus receptores de células T específicos, as células Th específicas de VHC cumprem uma variedade de funções imuno-reguladoras, a maioria das quais mediada por citoquinas Thl e Th2. As células Th específicas de VHC ajudam na activação e diferenciação de células B e na indução e estimulação de células T citotóxicas específicas do vírus. Juntamente com as CTL, as células Th podem também segregar lFN-γ e TNF-α que inibem a replicação e a expressão génica de vários vírus. Adicionalmente, as células Th e CTL, as principais células efectoras, podem induzir apoptose e lise das células infectadas com vírus. 11 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

As CTL específicas de VHC são geradas a partir de antigénios processados por células de apresentação do antigénio profissionais (pAPC). Os antigénios podem ser sintetizados dentro ou introduzidos nas pAPC. A síntese do antigénio numa pAPC pode ser alcançada através da introdução na célula de uma cassete de expressão codificando o antigénio.

Uma via preferida de administração da vacina de ácido nucleico é uma via intramuscular. A administração intramuscular parece resultar na introdução e expressão de ácido nucleico em células somáticas e pAPC. Os antigénios de VHC produzidos nas células somáticas podem ser transferidos para pAPC para apresentação no contexto das moléculas de MHC de classe I. (Donnelly et al., Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648, 1997) .

As pAPC processam antigénios mais compridos em antigénios peptídicos menores no complexo do proteassoma. 0 antigénio é translocado para a via de secreção do retículo endoplasmático/complexo de Golgi para associação com proteínas de MHC de classe I. Os linfócitos T CD8+ reconhecem o antigénio associado ao MHC de classe I através do receptor de células T (TCR) e a proteína da superfície celular CD8. A utilização de um ácido nucleico codificando um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B como componente de vacina permite a produção de uma ampla variedade de antigénios capazes de gerar respostas CMI a partir de um único vector. 0 polipéptido deve ser capaz de se processar a si próprio o suficiente para produzir pelo menos uma região correspondente a NS5B.

Um polipéptido substancialmente semelhante a SEQ ID N0:1 com suficiente actividade proteásica para se processar a si próprio numa célula proporciona à célula epítopos de células T que estão presentes em várias estirpes de VHC diferentes. A actividade proteásica é proporcionada pelas proteínas NS3 e NS3/NS4A que digerem o polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B nos locais de clivagem apropriados para libertar polipéptidos correspondendo a NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B. 0 auto-processamento do Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B gera polipéptidos 12 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ que se aproximam dos polipéptidos de VHC de ocorrência natural.

Com base na orientação aqui proporcionada pode ser gerada uma resposta imunitária suficientemente forte para se alcançar efeitos benéficos num paciente. A orientação proporcionada inclui informação referente à selecção da sequência de VHC, selecção do vector, produção do vector, tratamento de combinação e administração.

I. SEQUÊNCIAS DE VHC

Uma variedade de diferentes sequências de ácido nucleico pode ser utilizada como componente de vacina para fornecer um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de VHC a uma célula ou como intermediário para produzir componentes de vacina. 0 ponto de partida para obter sequências de ácido nucleico adequadas é de preferência sequências polipeptídicas NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de ocorrência natural modificadas para produzirem uma NS5B inactiva. A utilização de uma sequência de ácido nucleico de VHC proporcionando antigénios não estruturais de VHC para gerar uma resposta CMI é mencionada por Cho et al., Vaccine 17: 1136-1144, 1999, Paliard et al., Publicação Internacional Número WO 01/30812 (não reconhecido como anterioridade relativamente ao invento reivindicado), e Coit et al., Publicação Internacional Número WO 01/38360 (não reconhecido como anterioridade relativamente ao invento reivindicado). Tais referências não descrevem, por exemplo, um polipéptido que se processe a si próprio para produzir uma NS5B inactiva nem as combinações particulares de sequências de VHC nem os veículos de distribuição aqui empregues.

Modificações a uma sequência polipeptídica Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de VHC podem ser produzidas através de alteração do ácido nucleico codificador. As alterações podem ser efectuadas para criar deleções, inserções e substituições.

Podem ser feitas pequenas modificações em NS5B para produzir uma polimerase inactiva atingindo motivos essencialmente para replicação. Exemplos de motivos críticos 13 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ para a actividade de NS5B e modificações que podem ser feitas para produzir uma NS5B inactiva são descritos por Lohmann et al., Journal of Virology 71: 8416-8426, 1997 e Kolykhalov et al. , Journal of Virology 74: 2046-2051, 2000.

Factores adicionais a ter em conta quando se produzem modificações num polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de VHC incluem a manutenção da capacidade para se auto-processar e a manutenção de antigénios de células T. A capacidade do polipéptido de VHC para se processar a si próprio é determinada em grande medida através de uma protease NS3 funcional. Modificações que mantenham activa a actividade proteásica de NS3 podem ser obtidas tendo em conta a proteína NS3, NS4A que serve como cofactor para NS3 e os locais de reconhecimento da protease NS3 presentes dentro do polipéptido NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B.

Podem ser feitas diferentes modificações às sequências polipeptídicas NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de ocorrência natural para produzir polipéptidos capazes de desencadear um amplo espectro de respostas de células T. Factores que influenciam a capacidade de um polipéptido para desencadear uma ampla resposta de células T incluem a conservação ou introdução de regiões de antigénios de células T específicas de VHC e prevalência de diferentes regiões de antigénios de células T em diferentes isolados de VHC.

Numerosos exemplos de isolados de VHC de ocorrência natural são bem conhecidos na especialidade. Os isolados de VHC podem ser classificados nos seguintes seis genótipos principais compreendendo um ou mais subtipos: VHC-1/(la,lb,lc), VHC-2/(2a,2b,2c), VHC-3/(3a,3b,10a), VHC-4/(4a), VHC-5/(5a) e VHC-6/(6a,6b,7b,8b,9a,11a). (Simmonds, J. Gen. Virol. 693-712, 2001). Exemplos de determinadas sequências de VHC tais como HCV-BK, HCV-J, HCV-N, HCV-H foram depositados em GenBank e descritos em várias publicações. (Ver, por exemplo, Chamberlain et al., J. Gen. Virol. 1341-1347, 1997) .

Os antigénios de células T de VHC podem ser identificados através, por exemplo, de experimentação empírica. Um modo de identificar antigénios de células T envolve a geração de uma 14 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ série de péptidos curtos sobreponíveis a partir de um polipéptido mais comprido e depois pesquisa das populações de células T de pacientes infectados quanto a clones positivos. Os clones positivos são activados/iniciados por um determinado péptido. Técnicas tais como ELISPOT-IFNy, Coloração intracelular-IFNY e ensaios de CTL em massa podem ser utilizadas para medir a actividade peptídica. Os péptidos assim identificados podem ser considerados como representando epitopos de células T do respectivo patogénio.

Regiões de antigénios de células T de VHC de diferentes isolados de VHC podem ser introduzidas numa única sequência através, por exemplo, da produção de um polipéptido NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B híbrido contendo regiões de duas ou mais sequências de ocorrência natural. Um tal híbrido pode conter modificações adicionais, que de preferência não reduzem a capacidade do polipéptido para produzir uma resposta CMI de VHC. A capacidade de um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B modificado para se processar a si próprio e produzir uma resposta CMI pode ser determinada utilizando técnicas aqui descritas ou bem conhecidas na especialidade. Tais técnicas incluem a utilização de ELISPOT-IFNy, de Coloração intracelular-IFNY e ensaios de CTL em massa para medir uma resposta CMI específica de VHC.

A. Sequências Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B SEQ ID N0:1 proporciona uma sequência preferida de Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B. SEQ ID NO:1 contém um grande número de antigénios de células T específicos de VHC que estão presentes em vários isolados diferentes de VHC. SEQ ID N0:1 é semelhante à porção NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B da sequência nucleotídica da estirpe BK de VHC (número de entrada GenBank M58335).

Em SEQ ID N0:1 as posições âncora importantes para o reconhecimento por moléculas de MHC de classe I são conservadas ou representam substituições conservativas para 18 dos 20 epitopos de células T conhecidos na porção NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B das poliproteínas de VHC. Em relação aos 15 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ restantes dois epítopos de células T conhecidos, um tem uma substituição não conservativa da âncora em SEQ ID N0:1 que pode ainda ser reconhecida por um super-tipo de HLA diferente e um epitopo tem um resíduo de âncora não conservado. Os epítopos de células T de VHC estão descritos em Chisari et al. , Curr. Top. Microbiol. Immunol. 242: 299-325, 2000, e Lechner et al. J. Exp. Med. 9: 1499-1512, 2000.

Diferenças entre a sequência nucleotídica de NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de HCV-BK e SEQ ID NO:l incluem a introdução de uma metionina na extremidade 5' e a presença de resíduos do local activo de NS5B modificados em SEQ ID NO:l. A modificação substitui GlyAspAsp por AlaAlaGly (resíduos 1711-1713) para inactivar NS5B. O polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de VHC codificado tem de preferência uma sequência de aminoácidos substancialmente semelhante a SEQ ID NO:l com uma identidade de aminoácidos com SEQ ID NO:l de pelo menos 85%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou 100%; ou difere de SEQ ID NO:l em 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19 ou 1-20 aminoácidos.

As diferenças de aminoácidos entre um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B e SEQ ID NO:1 são calculadas através da determinação do número mínimo de modificações de aminoácidos em que as duas sequências diferem. As modificações de aminoácidos podem ser deleções, adições, substituições ou qualquer combinação destas. A identidade da sequência de aminoácidos é determinada através de métodos bem conhecidos na especialidade que comparam a sequência de aminoácidos de um polipéptido com a sequência de aminoácidos de um segundo polipéptido e geram um alinhamento das sequências. A identidade de aminoácidos é calculada a partir do alinhamento através da contagem do número de pares de resíduos alinhados que têm aminoácidos idênticos. Métodos para determinação da identidade de sequência incluem os descritos por Schuler, G.D. em "Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins", 16 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Baxevanis, A.D. e Ouelette, B.F.F., eds., John Wiley & Sons, Inc., 2001; Yona, et al., em "Bioinformatics: Sequence, structure and databanks", Higgins, D. e Taylor, W. eds, Oxford University Press, 2000; e "Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis", Mount, D.W., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. Os métodos para determinar a identidade de sequência de aminoácidos são codificados em programas de computador disponíveis ao público tais como GAP (Wisconsin Package Versão 10.2, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc), BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3): 403-10, 1990), e FASTA (Pearson, Methods in Enzymology 183: 63-98, 1990, R.F. Doolittle, ed).

A identidade de sequência entre dois polipéptidos é determinada utilizando o programa GAP (Wisconsin Package Versão 10.2, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc). GAP utiliza o método de alinhamento de Needleman e Wunsch. (Needleman, et al., J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970). GAP considera todos os possíveis alinhamentos e posições de intervalos entre duas sequências e cria um alinhamento global que maximiza o número de resíduos coincidentes e minimiza o número e tamanho dos intervalos. É utilizada uma matriz de registos para atribuir valores para a coincidência de símbolos. Adicionalmente, é necessária uma penalidade de criação de intervalo e uma penalidade de prolongamento do intervalo para limitar a inserção de intervalos no alinhamento. Os parâmetros por defeito do programa para comparação de polipéptidos utilizando GAP são a matriz de registo de aminoácidos BLOSUM62 (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 : 10915-10919, 1992) (MATrix=blosum62. emp) , um parâmetro de criação de intervalo (GAPweight=8) e um parâmetro de prolongamento de intervalo (LENgthweight=2).

Os polipéptidos Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de VHC mais preferidos, para além de serem substancialmente semelhantes a SEQ ID NO:l ao longo de todo o seu comprimento, produzem regiões NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B individuais que são substancialmente semelhantes às regiões correspondentes presentes em SEQ ID NO:l. As regiões correspondentes em SEQ ID NO:l são proporcionadas como se segue: Met-NS3 aminoácidos 1-632; NS4A aminoácidos 633-686; NS4B aminoácidos 687-947; NS5A aminoácidos 948-1394; e NS5B aminoácidos 1395-1985. 17 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Uma região NS3, NS4A, NS4B, NS5A e/ou NS5B tem uma identidade de aminoácidos com a região correspondente em SEQ ID N0:1 de pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou 100%; ou uma diferença de aminoácidos de 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, ou 1-20 aminoácidos desde que a identidade global da sequência seja de pelo menos 85% com SEQ ID NO:l.

As modificações de aminoácidos a SEQ ID NO:l mantêm de preferência todas ou a maioria das regiões de antigénios de células T. As diferenças nos aminoácidos de ocorrência natural são devidas a diferentes cadeias laterais de aminoácidos (grupos R). Um grupo R afecta diferentes propriedades do aminoácido tais como o tamanho físico, a carga e a hidrofobicidade. Os aminoácidos podem ser divididos em diferentes grupos como se segue: neutros e hidrófobos (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, triptofano, fenilalanina e metionina); neutros e polares (glicina, serina, treonina, tirosina, cisterna, asparagina e glutamina); básicos (lisina, arginina e histidina); e ácidos (ácido aspártico e ácido glutâmico).

Geralmente, na substituição de diferentes aminoácidos é preferível mudar aminoácidos possuindo propriedades semelhantes. A substituição de aminoácidos diferentes dentro de um determinado grupo, tal como a substituição de leucina por valina, lisina por arginina e glutamina por asparagina são boas candidatas por não causarem uma mudança na estrutura terciária do polipéptido.

Partindo com uma determinada sequência de aminoácidos e a conhecida degenerescência do código genético, pode ser obtido um grande número de sequências de ácido nucleico codificadoras diferentes. A degenerescência do código genético surge porque quase todos os aminoácidos são codificados por diferentes combinações de tripletos de nucleótidos ou "codões". A tradução de um determinado codão num determinado aminoácido é bem conhecida na especialidade (ver, p.ex., Lewin "GENES IV", pág. 119, Oxford University Press, 1990). Os aminoácidos são codificados por codões como se segue: 18 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

A=Ala=Alanina: codões GCA, GCC, GCG, GCU C=Cys=Cisteína: codões UGC, UGU D=Asp=Ácido aspártico: codões GAC, GAU E=Glu=Ácido glutâmico: codões GAA, GAG F=Phe=Fenilalanina: codões UUC, UUU G=Gly=Glicina: codões GGA, GGC, GGG, GGU H=His=Histidina: codões CAC, CAU I=Ile=Isoleucina: codões AUA, AUC, AUU K=Lys=Lisina: codões AAA, AAG

L=Leu=Leucina: codões UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU M=Met=Metionina: codão AUG N=Asn=Asparagina: codões AAC, AAU P=Pro=Prolina: codões CCA, CCC, CCG, CCU Q=Gln=Glutamina: codões CAA, CAG R=Arg=Arginina: codões AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU S=Ser=Serina: codões AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU T=Thr=Treonina: codões ACA, ACC, ACG, ACU V=Val=Valina: codões GUA, GUC, GUG, GUU W=Trp=Triptofano: codão UGG Y=Tyr=Tirosina: codões UAC, UAU.

As sequências de ácido nucleico podem ser optimizadas num esforço para aumentar a expressão num hospedeiro. Factores a considerar incluem o teor de C:G, codões preferidos e o evitar uma estrutura secundária inibidora. Estes factores podem ser combinados de diferentes modos numa tentativa para obter sequências de ácido nucleico possuindo maior expressão num determinado hospedeiro. (Ver, por exemplo, Donnelly et al., Publicação Internacional Número WO 97/47358). A capacidade de uma determinada sequência para ter maior expressão num determinado hospedeiro envolve alguma experimentação empírica. Tal experimentação envolve medição da expressão de uma sequência de ácido nucleico prospectiva e, se necessário, alteração da sequência. 19 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ Β. Sequências Nucleotídicas Codificadoras

As SEQ ID NO:2 e 3 proporcionam dois exemplos de sequências nucleotídicas codificando uma sequência de Met-NS3-NS 4A-NS 4B-NS5A-NS5B. A sequência de codificação de SEQ ID N0:2 é semelhante (99,4% de identidade de sequência nucleotídica) à região NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B da sequência de ocorrência natural de HCV-BK (número de entrada GenBank M58335). SEQ ID NO:3 é uma versão de codões optimizados de SEQ ID NO:2. As SEQ ID NO: 2 e 3 têm uma identidade de sequência nucleotídica de 78,3%.

As diferenças entre a sequência nucleotídica de NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de HCV-BK (número de entrada GenBank M58335) e SEQ ID NO: 2 incluem SEQ ID NO: 2 ter um local de ligação ao ribossoma, um codão de metionina ATG, uma região codificando para um domínio catalítico NS5B modificado, um sinal de terminação TAAA e mais 30 diferenças de nucleótidos. O domínio catalítico modificado codifica para AlaAlaGly (resíduos 1711-1713) em vez de GlyAspAsp para inactivar NS5B.

Uma sequência nucleotídica codificando um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS 4B-NS5A-NS5B de VHC é de preferência substancialmente semelhante à região de codificação de SEQ ID NO:2. A sequência nucleotídica codificando um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de VHC tem uma identidade de sequência nucleotídica com a região de codificação de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou 100%; ou difere de SEQ ID NO:2 em 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, 1-20, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45 ou 1-50 nucleótidos.

As diferenças nucleotídicas entre uma sequência codificando Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B e a região de codificação de SEQ ID NO: 2 são calculadas através da determinação do número mínimo de modificações nucleotídicas em que as duas sequências diferem. As modificações nucleotídicas podem ser deleções, adições, substituições ou qualquer combinação destas. 20 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ A identidade de sequência nucleotidica é determinada através de métodos bem conhecidos na especialidade que comparam a sequência nucleotidica de uma sequência com a sequência nucleotidica de uma segunda sequência e geram um alinhamento de sequências. A identidade de sequência é determinada a partir do alinhamento através da contagem do número de posições alinhadas possuindo nucleótidos idênticos.

Os métodos para determinação da identidade de sequência nucleotidica entre dois polinucleótidos incluem os descritos por Schuler, em "Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins", Baxevanis, A.D. e Ouelette, B.F.F., eds., John Wiley & Sons, Inc, 2001; Yona et al., em "Bioinformatics: Sequence, structure and databanks", Higgins, D. e Taylor, W. eds, Oxford University Press, 2000; e "Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis", Mount, D.W., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). Os métodos para determinar a identidade de sequência nucleotidica são codificados em programas de computador disponíveis ao público tais como GAP (Wisconsin Package Versão 10.2, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc), BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3): 403-10, 1990), e FASTA (Pearson, Methods in Enzymology 183: 63-98, 1990, R.F. Doolittle, ed). A identidade de sequência entre dois polipéptidos é

determinada através da aplicação de GAP (Wisconsin Package Versão 10.2, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc). GAP utiliza o método de alinhamento de Needleman e Wunsch. (Needleman, et al., J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970). GAP considera todos os possíveis alinhamentos e posições de intervalos entre duas sequências e cria um alinhamento global que maximiza o número de resíduos coincidentes e minimiza o número e tamanho dos intervalos. É utilizada uma matriz de registos para atribuir valores para as coincidências de símbolos. Adicionalmente, é necessária uma penalidade de criação de intervalo e uma penalidade de prolongamento do intervalo para limitar a inserção de intervalos no alinhamento. Os parâmetros por defeito do programa para comparações de polinucleótidos utilizando GAP são a matriz de registo nwsgapdna.cmp (MATrix=nwsgapdna.cmp) , um parâmetro de criação de intervalo (GAPweight=50) e um parâmetro de prolongamento de intervalo (LENgthweight=3). 21 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

As sequências nucleotídicas de Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de VHC mais preferidas, para além de serem substancialmente semelhantes ao longo de todo o seu comprimento, produzem regiões NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B individuais que são substancialmente semelhantes às regiões correspondentes presentes em SEQ ID NO:2. As regiões de codificação correspondentes em SEQ ID NO:2 são proporcionadas como se segue: Met-NS3, nucleótidos 7-1902; NS4A nucleótidos 1903-2064; NS4B nucleótidos 2065-2847; NS5A nucleótidos 2848-4188; NS5B nucleótidos 4189-5661.

Uma região codificando NS3, NS4A, NS4B, NS5A e/ou NS5B tem uma identidade de sequência nucleotidica com a região correspondente em SEQ ID NO: 2 de pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou 100%; ou uma diferença de nucleótidos com SEQ ID NO: 2 de 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, 1-20, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45 ou 1-50 nucleótidos desde que a identidade de sequência global com SEQ ID NO:2 seja de pelo menos 65%. C. Cassetes de Expressão Génica

Uma cassete de expressão génica contém os elementos necessários para expressão do polipéptido. A referência a "polipéptido" não proporciona uma limitação do tamanho e inclui proteína. Elementos reguladores presentes numa cassete de expressão génica incluem: (a) um promotor transcricionalmente ligado a uma sequência nucleotidica codificando o polipéptido, (b) um local de ligação ao ribossoma a 5' funcionalmente ligado à sequência nucleotidica, (c) um terminador unido à extremidade 3' da sequência nucleotidica e (d) um sinal de poliadenilação a 3' funcionalmente ligado à sequência nucleotidica. Elementos reguladores adicionais úteis para aumentar ou regular a expressão génica ou o processamento polipeptídico podem também estar presentes.

Os promotores são elementos genéticos que são reconhecidos por uma ARN-polimerase e medeiam a transcrição de regiões a jusante. Promotores preferidos são promotores fortes 22 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ que proporcionam níveis de transcrição aumentados. Exemplos de promotores fortes são o promotor precoce imediato do citomegalovírus humano (CMV), e CMV com intrão A. (Chapman et ai., Nucl. Acids Res. 19 : 3979-3986, 1991). Exemplos adicionais de promotores incluem promotores de ocorrência natural tais como o promotor EF1 alfa, o promotor de CMV de murídeo, promotor do vírus do sarcoma de Rous, e os promotores precoce/tardio de SV40 e o promotor da β-actina; e promotores artificiais tais como o promotor sintético específico de músculo e um promotor quimérico específico de músculo/CMV (Li et ai., Nat. Biotechnol. 17: 241-245, 1999; Hagstrom et ai., Blood 95: 2536-2542, 2000) . O local de ligação ao ribossoma situa-se no codão de iniciação ou próximo deste. Exemplos de locais de ligação ao ribossoma preferidos incluem CCACCAUGG, CCGCCAUGG e ACCAUGG, onde AUG é o codão de iniciação. (Kozak, Cell 44: 283-292, 1986) . Outro exemplo de um local de ligação ao ribossoma é GCCACCAUGG (SEQ ID NO:12). O sinal de poliadenilação é responsável pela clivagem do ARN transcrito e pela adição de uma cauda poli (A) ao ARN. O sinal de poliadenilação em eucariotas superiores contém uma sequência AAUAAA a cerca de 11-30 nucleótidos do local de adição de poliadenilação. A sequência AAUAAA está envolvida na sinalização de clivagem do ARN. (Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, NY, 1990). A cauda poli(A) é importante para o processamento do ARNm.

Sinais de poliadenilação que podem ser utilizados como parte de uma cassete de expressão génica incluem o sinal de poliadenilação da β-globina de coelho mínimo e de poliadenilação da hormona do crescimento bovina (BGH). (Xu et al., Gene 272: 149-156, 2001; Post et al., Patente U.S. 5122458). Exemplos adicionais incluem o Sinal de Poliadenilação Sintético (SPA) e o sinal de poliadenilação de SV40. A sequência de SPA é como se segue: AAUAAAAGAUCUUUAUUUUC AUUAGAUCUGUGUGUUGGUUUUUUGUGUG (SEQ ID NO:13). um

Exemplos de elementos reguladores adicionais úteis para aumentar ou regular a expressão génica ou o processamento polipeptídico que podem estar presentes incluem 23 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ estimulador, uma sequência líder e um operador. Uma região estimuladora aumenta a transcrição. Exemplos de regiões estimuladoras incluem o estimulador de CMV e o estimulador de SV40. (Hitt et al., Methods in Molecular Genetics 7: 13-30, 1995; Xu, et al., Gene 272: 149-156, 2001). Uma região estimuladora pode estar associada a um promotor.

Uma sequência líder é uma região de aminoácidos num polipéptido que dirige o polipéptido para o proteossoma. Ácido nucleico codificando a sequência líder está a 5' de um gene estrutural e é transcrito juntamente com o gene estrutural. Um exemplo de uma sequência líder é tPA.

Pode ser utilizada uma sequência operadora para regular a expressão génica. Por exemplo, pode ser utilizada a sequência operadora Tet para reprimir a expressão génica.

II. VECTORES TERAPÊUTICOS Ácido nucleico codificando um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS53 de acordo com o presente invento pode ser introduzido num paciente utilizando vectores adequados para administração terapêutica. Vectores adequados podem distribuir o ácido nucleico a uma célula alvo sem causarem um efeito secundário inaceitável. A expressão celular é alcançada utilizando uma cassete de expressão génica codificando um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B do presente invento. A cassete de expressão génica contém elementos reguladores para produção e processamento de uma quantidade suficiente de ácido nucleico dentro de uma célula alvo para alcançar um efeito benéfico.

Exemplos de vectores que podem ser utilizados para aplicações terapêuticas incluem adenovectores de primeira e segunda geração, adenovectores dependentes de ajudantes, vectores virais adeno-associados, vectores retrovirais, vector de vírus alfa, vector do vírus da Encefalite Equina Venezuelana e vectores plasmídicos. (Hitt, et al., Advances in Pharmacology 40: 137-206, 1997; Johnston et al., Patente U.S. 6156588, e Johnston et al., Publicação Internacional Número WO 95/32733). Os vectores preferidos para introdução de 24 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B do presente invento num indivíduo são vectores adenovirais de primeira geração e vectores de ADN plasmídico. A. Adenovectores de Primeira Geração 0 adenovector de primeira geração para expressar uma cassete de expressão génica contém a cassete de expressão num genoma adenoviral recombinante com EI e opcionalmente E3 suprimidas. A deleção na região EI é suficientemente grande para remover elementos necessários para a replicação adenoviral.

Os adenovectores de primeira geração para expressão de um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B do presente invento contêm um genoma adenoviral recombinante com EI e E3 suprimidas. A deleção na região EI é suficientemente grande para remover elementos necessários para a replicação adenoviral. As combinações de deleções das regiões EI e E3 são suficientemente grandes para acomodar uma cassete de expressão génica codificando um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B do presente invento. 0 adenovírus tem um genoma linear de cadeia dupla com repetições terminais invertidas em ambas as extremidades. Durante a replicação virai, o genoma é empacotado dentro de uma cápside virai para formar um virião. 0 vírus entra na sua célula alvo através de adesão virai seguida de internalização. (Hitt et al.r Advances in Pharmacology 40:137-206, 1997).

Os adenovectores podem ser baseados em diferentes serotipos de adenovírus tais como os verificados em seres humanos ou animais. Exemplos de adenovírus animais incluem os bovinos, suínos, de chimpanzé, de murídeo, caninos, e aviários (CELO). Os adenovectores preferidos são baseados em serotipos humanos, de preferência serotipos do Grupo B, C ou D. Exemplos de serotipos do Grupo B, C, D ou E de adenovírus humanos incluem os tipos 2 ("Ad2"), 4 ("Ad4"), 5 ("Ad5"), 6 ("Ad6"), 24 ("Ad2 4") , 26 ("Ad26"), 34 ("Ad34") e 35 ("Ad35") . Os adenovectores podem conter regiões de um único adenovírus ou de dois ou mais adenovírus. 25 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Os adenovectores são baseados em Ad5, Ad6 ou numa combinação destes. 0 Ad5 é descrito por Chroboczek, et al., J. Virology 186: 280-285, 1992. O Ad6 é descrito nas Figuras 7A-7N. Um vector baseado em Ad6 contendo regiões de Ad5 é descrito na secção Exemplos proporcionada abaixo.

Os adenovectores não necessitam de ter as suas regiões EI e E3 completamente removidas. Em vez disso, é removida uma quantidade suficiente da região EI para tornar o vector incompetente na replicação na ausência das proteinas EI a fornecer em trans; e a deleção de EI ou a combinação das deleções de EI e E3 são suficientemente grandes para acomodar uma cassete de expressão génica.

As deleções de EI podem ser obtidas começando cerca do par de bases 342 até cerca do par de bases 3523 de Ad5, ou uma região correspondente de outros adenovírus. De preferência, a região suprimida envolve a remoção de uma região de cerca do par de bases 450 a cerca do par de bases 3511 de Ad5 ou uma região correspondente de outros adenovírus. Deleções da região EI maiores começando cerca do par de bases 341 removem elementos que facilitam o empacotamento do vírus.

Podem ser obtidas deleções de E3 começando cerca do par de bases 27865 a cerca do par de bases 30995 de Ad5, ou da região correspondente de outros adenovectores. De preferência, a região de deleção envolve a remoção de uma região desde cerca do par de bases 28134 até cerca do par de bases 30817 de Ad5, ou a região correspondente de outros adenovectores. A combinação de deleções na região EI e opcionalmente na região E3 deve ser suficientemente grande para que o tamanho global do genoma recombinante contendo a cassete de expressão génica não exceda cerca de 105% do genoma do adenovírus de tipo selvagem. Por exemplo, à medida que os genomas de adenovírus Ad5 recombinantes aumentam de tamanho acima de 105% o genoma torna-se instável. (Bett et al., Journal of Virology 67: 5911-5921, 1993) .

De preferência, o tamanho do genoma do adenovírus recombinante contendo a cassete de expressão génica é de cerca de 85% a cerca de 105% o tamanho do genoma do adenovírus de 26 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ tipo selvagem. 0 tamanho do genoma de adenovírus recombinante contendo a cassete de expressão é de cerca de 100% a cerca de 105,2%, ou de cerca de 100%, o tamanho do genoma de tipo selvagem.

Aproximadamente, podem ser inseridos 7500 kb num genoma adenoviral com uma deleção de EI e E3. Sem qualquer deleção, o genoma de Ad5 tem 35935 pares de bases e o genoma de Ad6 tem 35759 pares de bases. A replicação dos adenovectores de primeira geração pode ser efectuada através do fornecimento dos produtos do gene EI em trans. O produto do gene EI pode ser fornecido em trans, por exemplo, através da utilização de linhas celulares que foram transformadas com a região EI adenoviral. Exemplos de células e linhas celulares transformadas com a região EI adenoviral são células HEK 293, células 911, células PERC.6™, e amniócitos primários humanos transfectados. (Graham et ai., Journal of Virology 36: 59-72, 1977; Schiedner et ai., Human

Gene Therapy 11: 2105-2116, 2000; Fallaux et ai., Human Gene

Therapy 9: 1909-1917, 1998; Bout et ai., Patente U.S. 6033908) .

Uma cassete de expressão de Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B deve ser inserida num genoma adenoviral recombinante na região correspondente à região EI suprimida ou à região E3 suprimida. A cassete de expressão pode ter uma orientação paralela ou antiparalela. Numa orientação paralela a direcção da transcrição do gene inserido é a mesma direcção que do gene EI ou E3 suprimido. Numa transcrição de orientação antiparalela a cadeia oposta serve de molde e a direcção da transcrição está na direcção oposta.

Numa concretização do presente invento o adenovector tem uma cassete de expressão génica inserida na região EI suprimida. O vector contém: a) uma primeira região adenoviral desde cerca do par de bases 1 até cerca do par de bases 450 correspondente a Ad5 ou Ad6 ; b) uma cassete de expressão génica numa orientação paralela a EI ou antiparalela a EI unida à primeira região; 27 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ c) uma segunda região adenoviral desde cerca do par de bases 3511 até cerca do par de bases 5548 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 3508 até cerca do par de bases 5541 correspondente a Ad6, unida à cassete de expressão; d) uma terceira região adenoviral desde cerca do par de bases 5549 até cerca do par de bases 28133 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 5542 até cerca do par de bases 28156 correspondente a Ad6, unida à segunda região; e) uma quarta região adenoviral desde cerca do par de bases 30818 até cerca do par de bases 33966 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 30789 até cerca do par de bases 33784 correspondente a Ad6, unida à terceira região; e f) uma quinta região adenoviral desde cerca do par de bases 33967 até cerca do par de bases 35935 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 33785 até cerca do par de bases 35759 correspondente a Ad6 unida à quarta região.

Noutra concretização do presente invento o adenovector tem uma cassete de expressão inserida na região E3 suprimida. O vector contém: a) uma primeira região adenoviral desde cerca do par de bases 1 até cerca do par de bases 450 correspondente a Ad5 ou Ad6; b) uma segunda região adenoviral desde cerca do par de bases 3511 até cerca do par de bases 5548 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 3508 até cerca do par de bases 5541 correspondente a Ad6, unida à primeira região; c) uma terceira região adenoviral desde cerca do par de bases 5549 até cerca do par de bases 28133 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 5542 até cerca do par de bases 28156 correspondente a Ad6, unida à segunda região; d) uma cassete de expressão génica numa orientação paralela a E3 ou antiparalela a E3 unida à terceira região; e) uma quarta região adenoviral desde cerca do par de bases 30818 até cerca do par de bases 33966 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 30789 até cerca do par de 28 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ bases 33784 correspondente a Ad6, unida à cassete de expressão génica; e f) uma quinta região adenoviral desde cerca do par de bases 33967 até cerca do par de bases 35935 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 33785 até cerca do par de bases 35759 correspondente a Ad6, unida à quarta região.

Em concretizações diferentes preferidas relativas às regiões adenovirais que estão presentes: (1) a primeira, segunda, terceira, quarta e quinta regiões correspondem a Ad5; (2) a primeira, segunda, terceira, quarta e quinta regiões correspondem a Ad6; e (3) a primeira região corresponde a Ad5, a segunda região corresponde a Ad5, a terceira região corresponde a Ad6, a quarta região corresponde a Ad6 e a quinta região corresponde a Ad5. B. Vectores de ADN Plasmidico

Os vectores de ADN plasmidico de vacina contêm uma cassete de expressão génica juntamente com elementos que facilitam a replicação e de preferência a selecção do vector. Os elementos preferidos proporcionam replicação em células não de mamífero e um marcador seleccionável. Os vectores não devem conter elementos que proporcionem replicação em células humanas ou para integração num ácido nucleico humano. 0 marcador seleccionável facilita a selecção de ácidos nucleicos contendo o marcador. Marcadores seleccionáveis preferidos são os que conferem resistência a antibióticos. Exemplos de genes de selecção por antibióticos incluem um ácido nucleico codificando resistência a ampicilina, neomicina e canamicina.

Vectores de ADN de vacina adequados podem ser produzidos começando com um plasmídeo contendo uma origem de replicação bacteriana e um marcador seleccionável. Exemplos de origens de replicação bacterianas proporcionando produções mais elevadas incluem a origem de replicação bacteriana derivada de plasmídeo ColEl. (Donnelly et al., Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648, 1997). 29 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ A presença da origem de replicação bacteriana e do marcador seleccionável permite a produção do vector de ADN numa estirpe bacteriana tal como E. coli. 0 marcador seleccionável é utilizado para eliminar bactérias não contendo o vector de ADN. III. Ácido Nucleico Recombinante de AD6 0 ácido nucleico recombinante de Ad6 compreende uma região de Ad6 substancialmente semelhante a uma região de Ad6 verificada em SEQ ID NO:8, e uma região não presente no ácido nucleico de Ad6. 0 ácido nucleico recombinante compreendendo regiões de Ad6 tem diferentes utilizações tais como na produção de diferentes regiões de Ad6, como intermediário na produção de vectores baseados em Ad6, e como um vector para distribuição de um gene recombinante.

Tal como representado na Figura 9, a organização genómica de Ad6 é muito semelhante à organização genómica de Ad5. A homologia entre Ad5 e Ad6 é de aproximadamente 98%. 0 ácido nucleico recombinante de Ad6 compreende uma região nucleotídica substancialmente semelhante a EIA, E1B, E2B, E2A, E3, E4, Ll, L2, L3, ou L4 ou qualquer combinação destas. Uma região de ácido nucleico substancialmente semelhante a uma região de Ad6 tem uma identidade de sequência nucleotídica de pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou 100%; ou uma diferença de nucleótidos de 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, 1-20, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45 ou 1-50 nucleótidos. Técnicas para determinação de sequências de ácido nucleico substancialmente semelhantes são descritas na Secção I.B. supra. O ácido nucleico de Ad6 recombinante contém uma cassete de expressão codificando para um polipéptido do presente invento.

Diferentes tipos de vectores adenovirais podem ser produzidos incorporando diferentes quantidades de Ad6, tais como adenovectores de primeira e segunda geração. Tal como 30 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ observado na Secção II.A. supra, os adenovectores de primeira geração são deficientes em EI e podem replicar-se quando EI é fornecida em trans.

Os adenovectores de segunda geração contêm menos genoma adenoviral que os vectores de primeira geração e podem ser utilizados em conjugação com linhas celulares complementares e/ou vectores ajudantes fornecendo proteínas adenovirais. Os adenovectores de segunda geração são descritos em diferentes referências tais como Russell, Journal of General Virology 81: 2573-2604, 2000; Hitt et al., 1997, "Human Ad vectors for Gene Transfer", Advances In Pharmacology, Vol. 40 Academic Press. O ácido nucleico recombinante de Ad6 é um vector adenoviral deficiente em EI que é capaz de se replicar quando EI é fornecida em trans. As cassetes de expressão podem ser inseridas numa região EI suprimida e/ou numa região E3 suprimida.

Um exemplo de um vector adenoviral baseado em Ad6 com uma cassete de expressão proporcionada numa região EI suprimida compreende ou consiste em: a) uma primeira região adenoviral desde cerca do par de bases 1 até cerca do par de bases 450 correspondente a Ad5 ou Ad6 ; b) uma cassete de expressão génica numa orientação paralela a EI ou antiparalela a EI unida à primeira região; c) uma segunda região adenoviral desde cerca do par de bases 3511 até cerca do par de bases 5548 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 3508 até cerca do par de bases 5541 correspondente a Ad6, unida à cassete de expressão; d) uma terceira região adenoviral desde cerca do par de bases 5549 até cerca do par de bases 28133 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 5542 até cerca do par de bases 28156 correspondente a Ad6, unida à segunda região; e) uma quarta região opcionalmente presente desde cerca do par de bases 28134 até cerca do par de bases 30817 correspondente a Ad5, ou desde cerca do par de bases 28157 até cerca do par de bases 30788 correspondente a Ad6, unida à terceira região; 31 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ f) uma quinta região adenoviral desde cerca do par de bases 30818 até cerca do par de bases 33966 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 30789 até cerca do par de bases 33784 correspondente a Ad6, em que a quinta região é unida à quarta região se a quarta região estiver presente, ou a quinta é unida à terceira região se a quarta região não estiver presente; e g) uma sexta região adenoviral desde cerca do par de bases 33967 até cerca do par de bases 35935 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 33785 até cerca do par de bases 35759 correspondente a Ad6, unida à quinta região; em que está presente pelo menos uma região de Ad6.

Em diferentes concretizações do presente invento, todas as regiões são de Ad6; todas as regiões excepto? a primeira e a segunda são de Ad6; e 1, 2, 3 ou 4 regiões seleccionadas a partir da segunda, terceira, quarta e quinta regiões são de Ad6 .

Um exemplo de um vector adenoviral baseado em Ad6 com uma cassete de expressão proporcionada na região E3 suprimida compreende ou consiste em: a) uma primeira região adenoviral desde cerca do par de bases 1 até cerca do par de bases 450 correspondente a Ad5 ou

Ad6 ; b) uma segunda região adenoviral desde cerca do par de bases 3511 até cerca do par de bases 5548 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 3508 até cerca do par de bases 5541 correspondente a Ad6, unida à primeira região; c) uma terceira região adenoviral desde cerca do par de bases 5549 até cerca do par de bases 28133 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 5542 até cerca do par de bases 28156 correspondente a Ad6, unida à segunda região; d) uma cassete de expressão génica numa orientação paralela a E3 ou antiparalela a E3 unida à terceira região; e) uma quarta região adenoviral desde cerca do par de bases 30818 até cerca do par de bases 33966 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 30789 até cerca do par de bases 33784 correspondente a Ad6, unida à cassete de expressão génica; e 32 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ f) uma quinta região adenoviral desde cerca do par de bases 33967 até cerca do par de bases 35935 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 33785 até cerca do par de bases 35759 correspondente a Ad6, unida à quarta região; em que está presente pelo menos uma região de Ad6.

Numa diferente concretização do presente invento, todas as regiões são de Ad6; todas as regiões excepto a primeira e a segunda são de Ad6; e 1, 2, 3 ou 4 regiões seleccionadas a partir da segunda, terceira, quarta e quinta regiões são de Ad6 .

IV. PRODUÇÃO DO VECTOR

Os vectores podem ser produzidos utilizando técnicas de ácido nucleico recombinante tais como aquelas envolvendo a utilização de enzimas de restrição, ligação de ácidos nucleicos e recombinação homóloga. As técnicas de ácidos nucleicos recombinantes são bem conhecidas na especialidade. (Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley, 1987-1998 e Sambrook et al. , “Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 19 8 9) .

Vectores intermediários são utilizados para obter um vector terapêutico ou para transferir uma cassete de expressão ou porção desta de um vector para outro vector. Exemplos de vectores intermediários incluem plasmídeos de genomas adenovirais e vectores vaivém.

Elementos úteis num vector intermediário incluem uma origem de replicação, um marcador seleccionável, regiões de recombinação homóloga e locais de restrição convenientes. Os locais de restrição convenientes podem ser utilizados para facilitar a clonagem ou libertação de uma sequência de ácido nucleico.

As regiões de recombinação homóloga proporcionam regiões da sequência de ácido nucleico que são homólogas a uma região alvo noutra molécula de ácido nucleico. As regiões homólogas flanqueiam a sequência de ácido nucleico que está a ser inserida na região alvo. Em diferentes concretizações as 33 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ regiões homólogas têm de preferência cerca de 150 a 600 nucleótidos de comprimento ou cerca de 100 a 500 nucleótidos de comprimento.

Um vector vaivém contém um ácido nucleico de Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B, um marcador seleccionável, uma origem de replicação bacteriana, uma primeira região de homologia adenoviral e uma segunda região homóloga adenoviral que direcciona a cassete de expressão para se inserir ou substituir uma região El. A primeira e segunda regiões de homologia flanqueiam a cassete de expressão. A primeira região de homologia contém pelo menos cerca de 100 pares de bases substancialmente homólogos pelo menos à extremidade direita (extremidade 3') de uma região de adenovírus de tipo selvagem de cerca dos pares de bases 4-450. A segunda homologia contém pelo menos cerca de 100 pares de bases substancialmente homólogos pelo menos à extremidade esquerda (extremidade 5') de Ad5 de cerca dos pares de bases 3511-5792, ou a região correspondente de outro adenovírus. A referência a "substancialmente homólogo" indica um grau suficiente de homologia para se recombinar especificamente com uma região alvo. Substancialmente homólogo refere-se a pelo menos 85%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequência. A identidade de sequência pode ser calculada tal como descrito na Secção I.B. supra.

Um método de produção de adenovectores é através da criação de um plasmídeo de genoma adenoviral contendo uma cassete de expressão. O plasmídeo pré-Adenovírus contém todas as sequências adenovirais necessárias para replicação na linha celular complementar desejada. O plasmídeo pré-Adenovírus é então digerido com uma enzima de restrição para libertar as ITR virais e transfectado para a linha celular complementar para recuperação do vírus. As ITR têm de ser libertadas das sequências plasmídicas para permitir que a replicação ocorra. A recuperação do adenovector resulta na produção de um adenovector contendo a cassete de expressão. 34 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ A. Plasmídeos de Genoma Adenoviral

Os plasmídeos de genoma adenoviral contêm uma sequência do adenovector dentro de um plasmídeo mais comprido (que pode ser um cosmídeo). 0 plasmídeo mais comprido pode conter elementos adicionais tais como os que facilitam o crescimento e a selecção em células eucarióticas ou bacterianas dependendo dos procedimentos empregues para produzir e manter o plasmídeo. Técnicas para produção de plasmídeos de genoma adenoviral incluem aquelas envolvendo a utilização de vectores vaivém e recombinação homóloga e aquelas envolvendo a inserção de uma cassete de expressão génica num cosmídeo adenoviral. (Hitt et al., Methods in Molecular Genetics 7: 13-30, 1995;

Danthinne et al., Gene Therapy 7: 1707-1714, 2000).

Os plasmídeos de genoma adenoviral têm de preferência uma cassete de expressão génica inserida numa região EI ou E3 suprimida. O plasmídeo de genoma adenoviral contém uma cassete de expressão génica inserida na região EI suprimida, uma origem de replicação, um marcador seleccionável, e a região adenoviral recombinante é constituída por: a) uma primeira região adenoviral desde cerca do par de bases 1 até cerca da base 450 correspondente a Ad5 ou Ad6; b) a cassete de expressão génica numa orientação paralela a EI ou antiparalela a EI unida à primeira região; c) uma segunda região adenoviral desde cerca do par de bases 3511 até cerca do par de bases 5548 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 3508 até cerca do par de bases 5541 correspondente a Ad6, unida à cassete de expressão; d) uma terceira região adenoviral desde cerca do par de bases 5549 até cerca do par de bases 28133 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 5542 até cerca do par de bases 28156 correspondente a Ad6, unida à segunda região; e) uma quarta região adenoviral desde cerca do par de bases 30818 até cerca do par de bases 33966 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 30789 até cerca do par de bases 33784 correspondente a Ad6, unida à terceira região; f) uma quinta região adenoviral desde cerca do par de bases 33967 até cerca do par de bases 35935 correspondente a Ad5 35 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ ou desde cerca do par de bases 33785 até cerca do par de bases 35759 correspondente a Ad6, unida à quarta região, e g) uma região E3 opcionalmente presente correspondendo a toda ou parte da região E3 em Ad5 ou Ad6, que pode estar presente para inserções menores tendo em conta o tamanho global do adenovector desejado.

Noutro exemplo o plasmideo de genoma adenoviral recombinante tem a cassete de expressão génica inserida na região E3 suprimida. 0 vector contém uma origem de replicação, um marcador seleccionável e o seguinte: a) uma primeira região adenoviral desde cerca do par de bases 1 até cerca do par de bases 450 correspondente a Ad5 ou Ad6; b) uma segunda região adenoviral desde cerca do par de bases 3511 até cerca do par de bases 5548 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 3508 até cerca do par de bases 5541 correspondente a Ad6, unida à cassete de expressão; c) uma terceira região adenoviral desde cerca do par de bases 5549 até cerca do par de bases 28133 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 5542 até cerca do par de bases 28156 correspondente a Ad6, unida à segunda região; d) a cassete de expressão génica numa orientação paralela a E3 ou antiparalela a E3 unida à terceira região; e) uma quarta região adenoviral desde cerca do par de bases 30818 até cerca do par de bases 33966 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 30789 até cerca do par de bases 33784 correspondente a Ad6, unida à cassete de expressão génica; e f) uma quinta região adenoviral desde cerca do par de bases 33967 até cerca do par de bases 35935 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 33785 até cerca do par de bases 35759 correspondente a Ad6, unida à quarta região.

Em diferentes exemplos referentes às regiões adenovirais que estão presentes: (1) a primeira, segunda, terceira, quarta e quinta região correspondem a Ad5; (2) a primeira, segunda, terceira, quarta e quinta região correspondem a Ad6; e (3) a primeira região corresponde a Ad5, a segunda região 36 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ corresponde a Ad5, a terceira região corresponde a Ad6, a quarta região corresponde a Ad6, e a quinta região corresponde a Ad5.

Um exemplo descreve um método de produzir um adenovector envolvendo um passo de recombinação homóloga para produzir um plasmideo de genoma adenoviral e um passo de recuperação do adenovirus. 0 passo de recombinação homóloga envolve a utilização de um vector vaivém contendo um ácido nucleico de Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B do presente invento flanqueado por regiões de homologia do adenovirus. As regiões de homologia do adenovirus direccionam a cassete de expressão para a região suprimida EI ou E3.

Num exemplo referente à produção de um plasmideo de genoma adenoviral, o ácido nucleico do presente invento é inserido num vector compreendendo: uma primeira região adenoviral desde cerca do par de bases 1 até cerca do par de bases 450 correspondente a Ad5 ou Ad6; uma segunda região adenoviral desde cerca do par de bases 3511 até cerca do par de bases 5548 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 3508 até cerca do par de bases 5541 correspondente a Ad6, unida à segunda região; uma terceira região adenoviral desde cerca do par de bases 5549 até cerca do par de bases 28133 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 5542 até cerca do par de bases 28156 correspondente a Ad6, unida à segunda região; uma quarta região adenoviral desde cerca do par de bases 30818 até cerca do par de bases 33966 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 30789 até cerca do par de bases 33784 correspondente a Ad6, unida à terceira região; e uma quinta região adenoviral desde cerca de 33967 até cerca de 35935 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 33785 até cerca do par de bases 35759 correspondente a Ad6, unida à quarta região. O plasmideo de genoma adenoviral deve conter uma origem de replicação e um marcador seleccionável, e pode conter toda ou parte da região E3 de Ad5 ou Ad6.

Em diferentes exemplos referentes às regiões adenovirais que estão presentes: (1) a primeira, segunda, terceira, quarta, e quinta região correspondem to Ad5; (2) a primeira, segunda, terceira, quarta, e quinta região correspondem a Ad6; 37 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ e (3) a primeira região corresponde a Ad5, a segunda região corresponde a Ad5, a terceira região corresponde a Ad6, a quarta região corresponde a Ad6 e a quinta região corresponde a Ad5. B. Recuperação do Adenovector

Um adenovector pode ser recuperado a partir de um plasmideo de genoma adenoviral recombinante utilizando técnicas conhecidas na especialidade ou aqui descritas. Exemplos de técnicas para recuperação de adenovirus bem conhecidas na especialidade são proporcionados por Hitt et al., Methods In Molecular Genetics 7: 13-30, 1995, e Danthinne et al., Gene Therapy 7: 1707-1714, 2000.

Um método preferido de recuperação de um adenovector aqui descrito envolve o reforço da replicação adenoviral. O reforço da replicação adenoviral pode ser efectuado, por exemplo, através do fornecimento de funções adenovirais tais como proteínas E2 (polimerase, proteína pré-terminal e proteína de ligação ao ADN) bem como orf6 de E4 num plasmideo separado. O Exemplo 10 infra ilustra o reforço da replicação adenoviral para recuperar um adenovector contendo um ácido nucleico de Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B com codões optimizados do presente invento.

V. SEQUÊNCIAS CODIFICANDO VHC PARCIALMENTE OPITIMIZADAS A optimização parcial do ácido nucleico codificando a poliproteína de VHC proporciona uma menor quantidade de codões optimizados para expressão num ser humano que a optimização completa. O objectivo global é proporcionar os benefícios de uma maior expressão devido à optimização de codões, ao mesmo tempo que se facilita a produção de um adenovector contendo ácido nucleico codificando a poliproteína de VHC possuindo codões optimizados. A optimização completa de uma sequência codificando a poliproteína de VHC proporciona o codão humano mais frequentemente observado para cada aminoácido. A optimização completa pode ser efectuada utilizando tabelas de frequência de codões bem conhecidas na especialidade e utilizando 38 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ programas tais como o programa BACKTRANSLATE (Wisconsin Package versão 10, Genetics Computer Group, GCG, Madison, Wisc). A optimização parcial pode ser efectuada numa sequência codificando a poliproteína de VHC inteira que esteja presente (p.ex., NS3-NS5B) ou numa ou mais regiões locais que estejam presentes. Em diferentes concretizações o teor de GC para a poliproteína codificada de VHC inteira que esteja presente não é maior que pelo menos cerca de 65%; e o teor de GC para uma ou mais regiões locais não é maior que cerca de 70%.

As regiões locais são regiões presentes no ácido nucleico codificando VHC e podem variar de tamanho. Por exemplo, as regiões locais podem ter cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90 ou cerca de 100 nucleótidos de comprimento. A optimização parcial pode ser alcançada inicialmente através da construção de uma sequência de poliproteína codificando VHC para ser parcialmente optimizada com base numa sequência de ocorrência natural. Alternativamente, uma sequência codificando VHC optimizada pode ser utilizada como base de comparação para produzir uma sequência optimizada parcial.

VI. TRATAMENTO DE COMBINAÇÃO DE VHC A vacina de Met-NS3-NS4A-NS4B-NSSA-NSSB de VHC pode ser utilizada por si só para tratar um paciente, pode ser utilizada em conjunto com outros agentes terapêuticos de VHC e pode ser utilizada com agentes que direccionados para outros tipos de doenças. Agentes terapêuticos adicionais incluem agentes terapêuticos adicionais para tratar VHC e doenças possuindo uma elevada prevalência em pessoas infectadas com VHC. Agentes direccionados para outros tipos de doenças incluem vacinas dirigidas contra VIH e VHB.

Agentes terapêuticos adicionais para tratamento de VHC incluem vacinas e agentes que não vacinas. (Zein, Expert Opin. Investig. Drugs 10: 1457-1469, 2001). Exemplos de vacinas de VHC adicionais incluem vacinas desenhadas para desencadear uma resposta imunitária contra um antigénio central de VHC e a 39 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ região El, Ε2 ou p7 de VHC. Os componentes de vacina podem ser polipéptidos de VHC de ocorrência natural, polipéptidos mimotopo de VHC ou ácido nucleico codificando tais polipéptidos.

Os polipéptidos mimotopo de VHC contêm epítopos de VHC, mas têm uma sequência diferente de um antigénio de VHC de ocorrência natural. Um mimotopo de VHC pode ser fundido com um antigénio de VHC de ocorrência natural. Referências descrevendo técnicas para produção de mimotopos em geral e descrevendo diferentes mimotopos de VHC são proporcionadas em Felici et al. Patente U.S. 5994083 e Nicosia et al., Pedido Internacional Número WO 99/60132.

VII. ADMINISTRAÇÃO FARMACÊUTICA

As vacinas de VHC podem ser formuladas e administradas a um paciente utilizando a orientação aqui proporcionada juntamente com técnicas bem conhecidas na especialidade. As linhas directrizes para administração farmacêutica em geral são proporcionadas, por exemplo, em "Modern Vaccinology", Ed. Kurstak, Plenum Med. Co. 1994; "Remington's Pharmaceutical Sciences" 18° Edição, Ed. Gennaro, Mack Publishing, 1990; e "Modern Pharmaceutics" 2° Edição, Eds. Banker and Rhodes, Mareei Dekker, Inc., 1990, cada uma das quais é aqui incorporada por referência.

As vacinas de VHC podem ser administradas através de diferentes vias tais como a intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intradérmica, impressão através da pele ou nasal. Uma via preferida é a intramuscular. A administração intramuscular pode ser efectuada utilizando diferentes técnicas tais como através de injecção com ou sem um ou mais pulsos eléctricos. A transferência eléctrica pode auxiliar a imunização genética através da estimulação de respostas imunitárias tanto humorais como celulares. A injecção da vacina pode ser efectuada utilizando diferentes técnicas, tais como através da utilização de um sistema de injecção com agulha ou sem agulha. Um exemplo de um 40 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ sistema de injecção sem agulha é um dispositivo de injecção a jacto. (Donnelly et al., Publicação Internacional Número WO 99/52463). A. Transferência Mediada Electricamente A transferência mediada electricamente ou Electro-Transferência de Genes (GET) pode ser efectuada através da distribuição de pulsos eléctricos adequados após injecção de ácido nucleico. (Ver Mathiesen, Publicação Internacional Número WO 98/43702). A injecção do plasmideo e electroporação podem ser efectuadas utilizando agulhas de aço inoxidável. As agulhas podem ser utilizadas aos pares, tripletos ou padrões mais complexos. Numa configuração as agulhas são soldadas numa placa de circuitos impressos que é um suporte mecânico e liga as agulhas ao gerador de campo eléctrico por meio de cabos adequados. O estimulo eléctrico é dado na forma de pulsos eléctricos. Os pulsos podem ser de diferentes formas (quadrados, sinusoidais, triangulares, decaimento exponencial) e diferente polaridade (monopolar de polaridade positiva ou negativa, bipolar). Os pulsos podem ser distribuídos na modalidade de voltagem constante ou corrente constante.

Podem ser utilizados diferentes padrões de tratamento eléctrico para introduzir vacinas de ácido nucleico incluindo vacinas de ácido nucleico de VHC e outras num paciente. Possíveis padrões de tratamento eléctrico incluem os seguintes:

Tratamento 1: 10 séries de 1000 pulsos bipolares quadrados distribuídos de dois em dois segundos, comprimento do pulso de 0,2 ms/fase, frequência de 1000 Hz, modo de voltagem constante, 45 volts/fase, corrente variável.

Tratamento 2: 2 séries de 100 pulsos bipolares quadrados distribuídos de dois em dois segundos, comprimento do pulso de 2 ms/fase, frequência de 100 Hz, modo de corrente constante, 100 mA/fase, voltagem variável.

Tratamento 3: 2 séries de pulsos bipolares, a um comprimento de pulso de cerca de 2 ms/fase, durante uma 41 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ duração total de cerca de 3 segundos, onde a corrente real que atravessa o tecido é fixada a cerca de 50 mA.

Os pulsos eléctricos são distribuídos através de um gerador de campo eléctrico. Um gerador adequado pode ser composto por três elementos físicos independentes montados num chassis comum e comandados por um PC portátil que corre o programa de comando. 0 suporte lógico gere as funções básicas e acessórias. Os elementos do dispositivo são: (1) gerador de sinal comandado por um microprocessador, (2) amplificador de potência e (3) osciloscópio digital. O gerador de sinal distribui sinais possuindo uma frequência e forma arbitrárias num dado intervalo sob controlo do suporte lógico. O mesmo suporte lógico tem um editor interactivo para a forma de onda a distribuir. O gerador engloba um dispositivo limitador de corrente controlado digitalmente (uma característica de segurança para controlar a saída máxima de corrente). O amplificador de potência pode amplificar o sinal gerado até ± 150 V. O osciloscópio é digital e é capaz de amostrar tanto a voltagem como a corrente a distribuir pelo amplificador. B. Transportadores Farmacêuticos

Transportadores farmaceuticamente aceitáveis facilitam o armazenamento e a administração de uma vacina a um indivíduo. São aqui descritos exemplos de transportadores farmaceuticamente aceitáveis. São bem conhecidos na especialidade transportadores farmaceuticamente aceitáveis adicionais.

Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis podem conter diferentes componentes tais como um tampão, solução salina normal ou solução salina tamponada com fosfato, sacarose, sais e polissorbato. Segue-se um exemplo de um transportador farmaceuticamente aceitável: tampão TRIS 2,5-10 mM, de preferência tampão TRIS cerca de 5 mM; NaCl 25-100 mM, de preferência NaCl cerca de 75 mM; sacarose a 2,5-10%, de preferência sacarose a cerca de 5%; MgCl2 0,01-2 mM; e polissorbato 80 a 0,001%-0,01% (derivado de plantas). 0 pH é de preferência de cerca de 7,0-9,0, de maior preferência cerca 42 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ de 8,0. Um exemplo específico de um transportador contém TRIS 5 mM, NaCl 75 mM, sacarose a 5%, MgCl2 1 mM, polissorbato 80 a 0,005% a pH 8,0. C. Regimes de Dosagem

Regimes de dosagem adequados podem ser determinados tendo em conta a eficácia de uma determinada vacina e factores tais como idade, peso e condição médica de um paciente; a via de administração; o efeito desejado; e o número de doses. A eficácia de uma vacina depende de diferentes factores tais como a capacidade de uma determinada vacina para produzir o polipéptido que é expresso e processado numa célula e apresentado no contexto de complexos de MHC de classe I e II. O ácido nucleico codificando VHC administrado a um paciente pode fazer parte de diferentes tipos de vectores incluindo vectores virais tais como adenovector, e vacinas de ADN plasmídico. Em diferentes exemplos referentes à administração de um ADN plasmídico, são administrados a um paciente cerca de 0,1 a 10 mg de plasmídeo, e são administrados a um paciente cerca de 1 a 5 mg de plasmídeo. Em diferentes exemplos referentes à administração de um vector virai, de preferência um vector adenoviral, são administradas a um paciente cerca de 105 a 1011 partículas virais, e são administradas a um paciente cerca de 107 a 1010 partículas virais.

As vacinas de vectores virais e as vacinas de ADN plasmídico podem ser administradas sozinhas ou podem fazer parte de um regime de administração de dose inicial e reforço. Uma inoculação de modalidade mista de dose inicial e reforço envolve uma dose inicial com uma vacina de ADN e reforço com uma vacina de vector virai, ou dose inicial com uma vacina de vector virai e reforço com uma vacina de ADN.

Podem ser utilizada múltiplas doses iniciais, por exemplo, cerca de 2-4 ou mais. A duração de tempo entre a dose inicial e o reforço pode variar tipicamente de cerca de quatro meses a um ano, mas podem ser utilizadas outras molduras temporais. A utilização de um regime de dose inicial com uma 43 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ vacina de ADN pode ser preferida em situações onde uma pessoa tenha uma resposta imunitária anti-adenovirus preexistente. São administradas lxlO7 a lxlO12 partículas e de preferência cerca de lxlO10 a lxlO11 partículas de adenovector directamente no tecido muscular. Após vacinação inicial é efectuado um reforço com uma vacina de adenovector ou ADN.

Alternativamente, a vacinação inicial é efectuada com uma vacina de ADN directamente no tecido muscular. Após a vacinação inicial é efectuado um reforço com uma vacina de adenovector ou ADN.

Agentes tais como interleucina-12, GM-CSF, B7-1, B7-2, IP10, Mig-1 podem ser co-administrados para reforçar a resposta imunitária. Os agentes podem ser co-administrados como proteínas ou através da utilização de vectores de ácido nucleico. D. Dose inicial-Reforço (prime-boost) Heteróloga A modalidade de dose inicial-reforço heteróloga é uma modalidade mista envolvendo a utilização de um tipo de vector virai para a dose inicial e de outro tipo de vector virai para reforço. A dose inicial-reforço heteróloga pode envolver vectores aparentados tais como vectores baseados em diferentes serotipos de adenovírus e vírus mais distantemente aparentados tais como adenovírus e poxvírus. A utilização de vectores poxvírus e adenovírus para proteger ratinhos contra malária é ilustrada por Gilbert et al., Vaccine 20: 1039-1045, 2002.

Diferentes exemplos referentes a dose inicial e reforço envolvem os seguintes tipos de vectores que expressam Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B do presente invento: vector Ad5 seguido de vector Ad6; vector Ad6 seguido de vector Ad5; vector Ad5 seguido de vector poxvírus; vector poxvírus seguido de vector Ad5; vector Ad6 seguido de vector poxvírus; e vector poxvírus seguido de vector Ad6. A duração de tempo entre a dose inicial e o reforço varia tipicamente de cerca de quatro meses a um ano, mas podem ser utilizadas outras molduras temporais. A moldura temporal 44 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ mínima deve ser suficiente para permitir um repouso imunológico. Este repouso é durante um período de pelo menos 6 meses. A dose inicial pode envolver múltiplas doses iniciais com um tipo de vector, tal como 2-4 doses iniciais.

As cassetes de expressão presentes num vector poxvírus devem conter um promotor nativo ou derivado do poxvírus de interesse ou outro membro dos poxvírus. Diferentes estratégias para construção e emprego de diferentes tipos de vectores baseados em poxvírus incluindo os baseados em vírus vacínia, vírus vacínia modificado, avipoxvírus, poxvírus do guaxinim, vírus vacínia modificado Ankara, poxvírus dos canários (tais como ALVAC), poxvírus aviários, poxvírus das vacas e NYVAC, são bem conhecidas na especialidade. (Moss, "Current Topics in Microbiology and Immunology" 158: 25-38, 1982; Earl et al., Em "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al. eds., New York: Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, 1991: 16.16.1-16.16.7; Child et al., Virology 174(2): 625-9, 1990; Tartaglia et al., Virology 188: 217-232, 1992; Patentes U.S. 4603112, 4722848, 4769330, 5110587, 5174993, 5185146, 5266313, 5505941, 5863542, e 5942235. E. Adjuvantes

As vacinas de VHC podem ser formuladas com um adjuvante. Os adjuvantes são particularmente úteis para vacinas de ADN plasmídico. Exemplos de adjuvantes são o alúmen, AIPO4, Alhydrogel, Lípido-A e derivados ou variantes destes, adjuvante incompleto de Freund, lipossomas neutros, lipossomas contendo a vacina e citoquinas, copolímeros de blocos não iónicos e quimioquinas.

Podem ser utilizados como adjuvante polímeros de blocos não iónicos contendo polioxietileno (POE) e polioxipropileno (POP), tais como copolímeros de blocos POE-POP-POE. (Newman et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15: 89-142, 1998) . A resposta imunitária de um ácido nucleico pode ser aumentada utilizando um copolímero de blocos não iónico combinado com um tensioactivo aniónico.

Um exemplo específico de uma formulação de adjuvante é um contendo CRL-1005 (CytRx Research Laboratories), ADN e cloreto 45 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ de benzilalcónio (ΒΑΚ). A formulação pode ser preparada através da adição de polímero puro a uma solução fria (<5°C) de ADN plasmídico em PBS utilizando uma pipeta de deslocamento positivo. A solução é então sujeita a vórtice para solubilizar o polímero. Após completa solubilização do polímero obtém-se uma solução transparente a temperaturas abaixo do ponto de turvação do polímero (~6-7°C). É então adicionado aproximadamente BAK 4 mM à solução de ADN/CRL-1005 em PBS, através da adição lenta de uma solução diluída de BAK dissolvido em PBS. A concentração inicial de ADN é de aproximadamente 6 mg/ml antes da adição do polímero e de BAK, e a concentração final de ADN é de cerca de 5 mg/ml. Após a adição de BAK a formulação é extensivamente sujeita a vórtice, ao mesmo tempo que se deixa que a temperatura aumente de »2°C até acima do ponto de turvação. A formulação é então colocada em gelo para diminuir a temperatura abaixo do ponto de turvação. Depois, a formulação é sujeita a vórtice ao mesmo tempo que se deixa que a temperatura aumente de «2°C até acima do ponto de turvação. 0 arrefecimento e mistura ao mesmo tempo que se deixa que a temperatura aumente de «2°C até acima do ponto de turvação é repetido várias vezes, até o tamanho de partícula da formulação ser de cerca de 200-500 nm, tal como medido através de dispersão dinâmica de luz. A formulação é então armazenada em gelo até a solução ficar transparente, depois é armazenada a -70°C. Antes da utilização, a formulação é deixada descongelar à temperatura ambiente. F. Armazenamento da Vacina

As vacinas de adenovector e ADN podem ser armazenadas utilizando diferentes tipos de tampões. Por exemplo, o tampão A105 descrito no Exemplo 9 infra pode ser utilizado para armazenamento do vector. O armazenamento de ADN pode ser aumentado através de remoção ou quelação de iões metálicos vestigiais. Reagentes tais como ácido succínico ou málico e quelantes podem ser utilizados para aumentar a estabilidade da vacina de ADN. Exemplos de quelantes incluem múltiplos ligandos de fosfato e EDTA. A inclusão de sequestrantes de radicais livres não redutores, tais como etanol ou glicerol, pode também ser útil para impedir danos no ADN plasmídico devido à produção de 46 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ radicais livres. Para além disso, o tipo de tampão, pH, concentração salina, exposição à luz, bem como o tipo de processo de esterilização utilizados para preparar os frascos, podem ser controlados na formulação para optimizar a estabilidade da vacina de ADN.

VII. EXEMPLOS São proporcionados abaixo exemplos para melhor ilustrar diferentes caracteristicas do presente invento. Os exemplos ilustram também metodologia útil para a prática do presente invento.

Exemplo 1: Cassetes de Expressão de Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B

Foram construídas diferentes cassetes de expressão génica codificando NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de VHC com base numa estirpe BK de VHC de subtipo lb. As sequências codificadas tinham (1) uma sequência NS5B activa ("NS"), (2) uma sequência NS5B inactiva ("NSmut"), (3) uma sequência de codões optimizados com uma sequência NS5B inactiva ("NSOPTmut"). As cassetes de expressão continham também um promotor/estimulador de CMV e o sinal de poliadenilação de BGH. A sequência nucleotídica de NS (SEQ ID NO:5) difere da estirpe BK de VHC número de entrada no GenBank M58335 em 30 dos 5952 nucleótidos. A sequência de aminoácidos de NS (SEQ ID NO:6) difere da estirpe correspondente BK de VHC genótipo lb em 7 dos 1984 aminoácidos. Para permitir a iniciação da tradução está presente um codão ATG na extremidade 5' da sequência de NS. Uma sequência de terminação TGA está presente na extremidade 3' da sequência de NS. A sequência nucleotídica de NSmut (SEQ ID NO:2, Figura 2), é semelhante à sequência de NS. As diferenças entre NSmut e NS incluem NSmut ter um local catalítico de NS5B alterado; um local de ligação ao ribossoma óptimo na extremidade 5'; e uma sequência de terminação TAAA na extremidade 3'. Alterações em NS5B compreendem as bases 5138 a 5146, que codificam os aminoácidos 1711 a 1713. As alterações resultam numa alteração dos aminoácidos GlyAspAsp para 47 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

AlaAlaGly e criam uma forma inactiva da ARN-polimerase NS5B dependente de ARN de NS5B. A sequência de NSOPTmut (SEQ ID NO:3, Figura 3) foi desenhada com base na sequência de aminoácidos codificada por NSmut. A sequência de aminoácidos de NSmut foi retrotraduzida numa sequência nucleotídica com o programa BACKTRANSLATE de GCG (Wisconsin Package versão 10, Genetics Computer Group, GCG, Madison, Wisc). Para gerar uma sequência nucleotídica de NSOPTmut onde cada aminoácido é codificado pelo correspondente codão humano mais frequentemente observado, o programa foi corrido escolhendo como parâmetros a geração da sequência nucleotídica mais provável e especificando a tabela de frequência de codões de genes humanos altamente expressos (human_high.cod) disponível no Pacote GCG como esquema de tradução.

Exemplo 2: Geração do Plasmídeo pVlJns com as Sequências de NS, NSmut ou NSOPTmut

Plasmídeos pVIJns, contendo a sequência de NS, a sequência de NSmut ou sequências de NSOPTmut foram gerados e caracterizados como se segue:

Plasmídeo pVIJns com a Sequência de NS A região de codificação de Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A e a região de codificação de Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de uma estirpe de tipo BK de VHC (Tomei et al., J. Virol. 67: 4017-4026, 1993) foram clonadas no plasmídeo pcDNA3 (Invitrogen), gerando os vectores pcD3-5a e pcD3-5b, respectivamente. O pcD3-5A foi digerido com HindIII, tornado de extremidades cegas com preenchimento por Klenow e subsequentemente digerido com Xfoal, para gerar um fragmento correspondente à região de codificação de Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A. O fragmento foi clonado em pVIJns-poly, digerido com BglII, tornado de extremidades cegas com preenchimento por Klenow e subsequentemente digerido com XbaI, gerando pVlJnsNS3-5A. O pVIJns-poly é um derivado do plasmídeo pVIJnsA (Montgomery et al., DNA and Cell Biol. 12: 777-783, 1993), modificado através da inserção de um poliligante contendo 48 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ locais de reconhecimento para XbaI, Pmel, PacI nos locais de restrição únicos BglII e NotI. 0 plasmídeo pVIJns com a sequência de NS (pVlJnsNS3-5B) foi obtido através de recombinação homóloga na estirpe bacteriana BJ5183, co-transformando pVlJNS3-5A linearizado com digestão com Xfoal e NotI e um fragmento de PCR contendo aproximadamente 200 pb da sequência de codificação de NS5A, NS5B e aproximadamente 60 pb do sinal de poliadenilação de BGH. O plasmídeo resultante representa pVIJns-NS. O pVIJns-NS pode ser resumido como se segue:

Bases uma adicional depois a depois a uma adicional Bases

1 a 1881 de pVIJnsA AGCTT sequência de Met-NS3-Ns5B (SEQ ID NO:5) terminação TGA wt

TCTAGAGCGTTTAAACCCTTAATTAAGG (SEQ ID NO:14) 1912 a 4909 de pVIJnsA

Plasmídeo pVIJns com a Sequência de NSmut O plasmídeo VlJnsNS3-5A foi modificado a 5' da sequência de codificação de NS3 através da adição de uma sequência de Kozak inteira. O plasmídeo (VIJNS3-5Akozak) foi obtido através de recombinação homóloga na estirpe bacteriana BJ5183, co-transformando V1JNS3-5A linearizado através de digestão com Afl II e um fragmento de PCR contendo a parte proximal do Intrão A, o local de restrição BglII, uma sequência de iniciação da tradução de Kozak inteira e parte da sequência de codificação de NS3. O plasmídeo resultante (VIJNS3-5Akozak) foi linearizado com digestão com Xbal e co-transformado na estirpe bacteriana BJ5183 com um fragmento de PCR, contendo aproximadamente 200 pb de NS5A, a sequência mutada de NS5B, a forte terminação da tradução TAAA e aproximadamente 60 pb do sinal de poliadenilação de BGH. O fragmento de PCR foi obtido através de montagem de dois fragmentos sobreponíveis de 22 pb onde foram introduzidas mutações através dos oligonucleótidos utilizados para a sua amplificação. O plasmídeo resultante representa pVlJns-NSmut. 49 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ Ο pVIJns-NSmut pode ser resumido como se segue:

Bases depois a uma adicional

Bases

1 a 1882 de pVlJnsA sequência TAAA de Kozak de met-NS3-NS5N(mut) (SEQ ID NO:2) TCTAGA 1925 a 4909 de pVlJnsA

Plasmideo pVlJns com a Sequência NSOPTmut O gene sintético com codões optimizados humanos (NSOPTmut) com NS5B mutada para abolir a actividade enzimática, a sequência de iniciação da tradução de Kozak inteira e uma forte terminação da tradução foi digerido com os locais de restrição BamHI e SalI presentes na extremidade 5' e 3' do gene. O gene foi então clonado nos locais de restrição BglII e Sal I presentes no poliligante do plasmideo pVlJnsA, gerando pVlJns-NSOPTmut. O pVlJns-NSOPTmut pode ser resumido como se segue:

Bases 1 a 1881 de pVlJnsA

uma adicional C depois a sequência TAAA de Kozak de met-NS3- uma adicional Bases

NS5N(optmut) (SEQ ID NO:3) TTTAAATGTTTAAAC (SEQ ID NO:15) 1905 a 4909 de pVlJnsA

Caracterização dos Plasmideos A expressão das proteínas NS de VHC foi testada através de transfecção de células HEK 293, criadas em FCS/DMEM a 10% suplementado com L-glutamina (4 mM final). Vinte e quatro horas antes da transfecção, as células foram plaqueadas em 6 poços com 35 mm de diâmetro, para alcançar 90-95% de confluência no dia da transfecção. Quarenta nanogramas de ADN plasmídico (previamente ensaiado como uma quantidade de ADN não saturante) foram co-transfectados com 100 ng de plasmideo pRSV-Luc contendo o gene repórter de luciferase sob controlo do promotor do vírus de sarcoma de Rous, utilizando o reagente LIPOFECTAMINE 2000. As células foram mantidas numa incubadora com CO2 durante 48 horas a 37°C. 50 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Foram preparados extractos celulares em tampão Triton a 1%/TEN. Os extractos foram normalizados quanto à actividade de Luciferase e corridos numa diluição em série em gel de SDS-acrilamida a 10%. As proteínas foram transferidas para nitrocelulose e ensaiadas com anticorpos dirigidos contra NS3, NS5A e NS5B para avaliar a força da expressão e a correcta clivagem proteolítica. Foram utilizadas células falsamente transfectadas como controlo negativo. Os resultados de experiências representativas testando pVIJnsNS, pVIJnsNSmut e pVlJnsNSOPTmut são mostrados na Figura 12.

Exemplo 3: Imunização de Ratinhos com Vectores de ADN Plasmídico

Os plasmídeos de ADN pVIJns-NS, pVIJns-NSmut e pVUns-NSOPTmut foram injectados em diferentes estirpes de ratinhos para avaliar o seu potencial para desencadear respostas imunitárias anti-VHC. Duas estirpes diferentes (Balb/C e C57Black6, N=9-10) foram injectadas intramuscularmente com 25 ou 50 pg de ADN seguido de pulsos eléctricos. Cada animal recebeu duas doses com três semanas de intervalo. A resposta imunitária humoral desencadeada em ratinhos C57Black6 contra a proteína NS3 foi medida em dois soros pós-dose através de ELISA sobre o domínio protease de NS3 expresso em bactérias. Anticorpos específicos para o antigénio testado foram detectados em animais imunizados com todos os três vectores com uma média geométrica dos títulos (MGT) a variar de 94 000 a 133 000 (Tabelas 1-3).

Tabela 1: pVljns-NS GMT Ratinho n.° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Título 105466 891980 78799 39496 543542 182139 32351 95028 67800 94553

Tabela 2: pVljns-NSmut GMT Ratinho n.° 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Título 202981 55670 130786 49748 17672 174958 44304 37337 78182 193695 75083 51 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Tabela 3: pVljns-NSOPTmut GMT Ratinho n.° 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Título 310349 43654 63496 82174 630778 297259 66861 146735 173506 77732 133165

Foi medida uma resposta de células T em ratinhos C57Black6 imunizados com duas injecções intramusculares com intervalos de três semanas com 25 pg de ADN plasmidico. Foi efectuado um ensaio ELIspot quantitativo para determinar o número células T secretoras de IFN-γ em resposta a cinco bancos de péptidos 20-meros sobreponíveis em dez resíduos englobando a sequência de NS3-NS5B. A resposta específica CD8+ foi analisada através do mesmo ensaio utilizando um péptido 20-mero englobando um epítopo CD8+ para ratinhos C57Black6 (pepl480).

As células secretoras de IFN-γ de um modo específico do antigénio foram detectadas utilizando um ensaio ELIspot padrão. A resposta de células T em ratinhos C57Black6 imunizados com duas injecções intramusculares com intervalos de três semanas com 50 pg de ADN plasmidico, foi analisada através do mesmo ensaio ELIspot medindo o número de células T secretoras de IFN-γ em resposta a cinco bancos de péptidos 20-mero sobreponíveis em dez resíduos englobando a sequência NS3-NS5B.

Foram preparadas células de baço de ratinhos imunizados que foram ressuspensas em meio RIO (RPMI 1640 suplementado com FCS a 10%, L-Glutamina 2 mM, Penicilina/Estreptomicina a 50 U/ml-50pg/ml, Hepes 10 mM, 2-mercaptoetanol 50 pM) . Placas de Filtração Multiscreen de 96 poços (Millipore, N.° de Cat. MAIPS4510, Millipore Corporation, 80 Ashby Road Bedford, MA) foram revestidas com anticorpo de rato anti-INF-γ de ratinho purificado (PharMingen, N.° de Cat. 18181D, PharmiMingen, 10975 Torreyana Road, San Diego, Califórnia 92121-1111 USA) . Após incubação de um dia para o outro, as placas foram lavadas com PBS Ιχ/Tween a 0,005% e bloqueadas com 250 pl/poço de meio R10. 52 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Foram preparados esplenócitos de ratinhos imunizados que foram incubados durante vinte e quatro horas na presença ou ausência de péptido 10 μΜ a uma densidade de 2,5xl05/poço ou 5xl0s/poço. Após lavagem extensiva (PBS Ιχ/Tween a 0,005%), foi adicionado anticorpo de rato anti-IFN-γ de ratinho biotinilado (PharMingen, N.° de Cat. 18112D, PharMingen, 10975 Torreyana Road, San Diego, Califórnia 92121-1111 USA) e incubou-se de um dia para o outro a 4°C. Para a revelação, foi adicionado estreptavidina-AKP (PharMingen, N.° de Cat. 13043E, PharMingen, 10975 Torreyana Road, San Diego, Califórnia 92121-1111 USA) e solução de revelação 1-Step™ NBT-BCIP (Pierce, N.° de Cat. 34042, Pierce, P.O. Box 117, Rockford, IL 61105 USA) .

Os bancos de péptidos 20-meros sobreponíveis englobando a sequência inteira de NS3 a NS5B da estirpe BK de VHC foram utilizados para revelar células T secretoras de IFN-γ específicas de VHC. Semelhantemente foi utilizado um péptido 20-mero englobando um epítopo CD8+ para ratinhos C57Black6 para detectar a resposta a CD8. Os dados representativos de grupos de ratinhos C57Black6 e Balb/C (N=9-10) imunizados com duas injecções de 25 ou 50 pg de vectores plasmídicos pVlJns-NS, pVIJns-NSmut e pVlJns-NSOPTmut são mostrados nas Figuras 13A e 13B.

Exemplo 4: Imunização de Macacos Rhesus

Foram imunizados macacos Rhesus (N=3) através de injecção intramuscular com 5 mg de plasmideo pVlJns-NSOPTmut em 7,5 mg/ml de CRL1005, cloreto de Benzalcónio 0,6 mM. Cada animal recebeu duas doses no músculo deltoide nas semanas 0 e 4. A CMI foi medida a diferentes momentos através de ELISPOT de IFN—γ. Este ensaio mede respostas de linfócitos T CD8+ e CD4+ específicas de antigénios de VHC, e pode ser utilizado para uma variedade de mamíferos, tais como seres humanos, macacos Rhesus, ratinhos e ratos. A utilização de um péptido específico ou um banco de péptidos pode simplificar a apresentação do antigénio em ensaios de citotoxicidade de CTL, ensaios ELISPOT de 53 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ interferão-gama e ensaios de coloração intracelular de interferão-gama. Foram preparados péptidos baseados na seguência de aminoácidos de várias proteínas de VHC (central, E2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) para utilizar nestes ensaios para medir respostas imunitárias em macacos Rhesus vacinados com ADN de VHC e vector adenoviral, bem como em seres humanos infectados com VHC. Os péptidos individuais são 20-meros sobreponíveis, desfasados em 10 aminoácidos. Grandes bancos de péptidos podem ser utilizados para detectar uma resposta global a proteínas de VHC enquanto bancos menores e péptidos individuais podem ser utilizados para definir a especificidade de epítopo de uma resposta. ELISPOT de IFNy O ensaio ELISPOT-IFN-γ proporciona uma determinação quantitativa de respostas de linfócitos T específicos de VHC. PBMC são diluídas em série e colocados em poços de microplacas revestidos com anticorpo anti-IFN-γ de Rhesus (MD-1 U-Cytech). São cultivados com um banco de péptidos de VHC durante 20 horas, resultando na re-estimulação das células precursoras e secreção de IFN-γ. As células são lavadas, deixando o IFN segregado ligado aos poços revestidos com anticorpo em áreas concentradas onde as células assentaram. O IFN capturado é detectado com anticorpo anti-IFN de Rhesus biotinilado (Ab detector U-Cytech) seguido de estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina (Pharmingen 13043E). A adição de substrato de fosfatase alcalina insolúvel resulta em pontos negros nos poços nos locais onde as células se localizavam, deixando um ponto para cada célula T que segregou IFN-γ. O número de pontos por poço está directamente relacionado com a frequência de precursor de células T específicas do antigénio. O interferão gama foi seleccionado como a citoquina visualizada neste ensaio (utilizando anticorpos monoclonais anti-interferão gama específicos da espécie) porque é a citoquina mais vulgar e uma das mais abundantes sintetizada e segregada por linfócitos T activados. Para este ensaio, o número de células formadoras de pontos (SFC) por milhão de PBMC é determinado para amostras na presença e ausência (controlo de meio) de antigénios peptídicos. Os dados de 54 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ macacos Rhesus sobre PBMC de dois materiais pós-dose sao mostrados na Tabela 4.

Tabela 4 PV1J-NSOPTmut Bancos de pep 21G 99C161 99C166 F (NS3p) 8 10 170 G (NS3h) 7 592 229 H (NS4) 3 14 16 I (NS5a) 5 71 36 L (NS5b) 14 23 11 M (NS5b) 3 35 8 DMSO 2 4 5 ELISPOT-INFy em PBMC de macacos Rhesus imunizados com duas injecções de 5 mg de ADN/dose em OPTIVAX/BAK de plasmideo pVlJns-NSOPTmut. Os dados são expressos como SFC7 106 PBMC.

Exemplo 5: Construção de Plasmídeos Pré-adenovírus de Ad6

Os plasmídeos pré-adenovírus de Ad6 foram obtidos como se segue:

Construção do Plasmideo Pré-adenovírus pAd6El-E3+

Um plasmideo pré-adenovírus baseado em Ad6 que pode ser utilizado para gerar vectores Ad6 de primeira geração foi construído tirando vantagem da extensa identidade de sequência (aprox. 98%) entre Ad5 e Ad6 ou contendo apenas regiões de Ad6. Foi utilizada recombinação homóloga para clonar sequências de Ad6 wt (de tipo selvagem) num plasmideo bacteriano.

Uma estratégia geral utilizada para recuperar pAd6El-E3+ como plasmideo bacteriano contendo regiões de Ad5 e Ad6 é ilustrada na Figura 10. A co-transformação de bactérias BJ 5183 com ADN virai de Ad6 wt purificado e um segundo fragmento de ADN designado a cassete ITR de Ad5 resultou na circularização do genoma virai através de recombinação homóloga. A cassete ITR contém sequências da extremidade 55 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ direita (pb 33798 a 35935) e esquerda (pb 1 a 341 e pb 3525 a 5767) do genoma de Ad5 separadas por sequências plasmídicas contendo uma origem de replicação bacteriana e um gene de resistência a ampicilina. A cassete ITR contém uma deleção de sequências de EI de 342 a 3524 de Ad5. As sequências de Ad5 na cassete ITR proporcionam regiões de homologia com o ADN virai de Ad6 purificado nas quais pode ocorrer recombinação.

Potenciais clones foram pesquisados através de análise de restrição e foi seleccionado um clone como pAd6El-E3+. Este clone foi então sequenciado na sua totalidade. pAd6El-E3+ contém sequências de Ad5 do pb 1 a 341 e do pb 3525 a 5548, Ad6 do pb 5542 a 33784, e Ad5 do pb 33967 a 35935 (o número dos pb referem-se à sequência wt tanto para Ad5 como para Ad6). pAd6El-E3+ contém as sequências de codificação para todas as proteínas estruturais do virião de Ad6 que constituem a sua especificidade do serotipo.

Uma estratégia geral utilizada para recuperar pAd6El-E3+ como plasmídeo bacteriano contendo regiões de Ad6 é ilustrada na Figura 11. A co-transformação de bactérias BJ 5183 com ADN virai de Ad6 wt purificado e um segundo fragmento de ADN designado a cassete ITR de Ad6 resultou na circularização do genoma virai através de recombinação homóloga. A cassete ITR contém sequências da extremidade direita (pb 35460 a 35759) e esquerda (pb 1 a 450 e pb 3508 a 3807) do genoma de Ad6 separadas por sequências plasmídicas contendo uma origem de replicação bacteriana e um gene de resistência a ampicilina. Estes três segmentos foram gerados por PCR e clonados sequencialmente em pNEB193, gerando pNEBAd6-3 (a cassete ITR). A cassete ITR contém uma deleção de sequências de EI de 451 a 3507 de Ad5. As sequências de Ad6 na cassete de ITR proporcionam regiões de homologia com o ADN virai de Ad6 purificado nas quais pode ocorrer recombinação.

Construção de plasmideos pré-adenovirus pAd6El-E3-

Foram construídos vectores baseados em Ad6 contendo regiões de Ad5 e com deleções na região E3 começando com pAd6El-E3+ contendo regiões de Ad5. Um subfragmento de 5322 pb de pAd6El-E3+ contendo a região E3 (pb 25871 a 31192 de Ad6) foi subclonado em pABS.3 gerando pABSAd6E3. Foram então feitas 56 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ três deleções de E3 neste plasmídeo gerando três novos plasmídeos pABSAd6E3(1,8 Kb) (suprimido para pb 28602 a 30440 de Ad6), pABSAd6E3(2,3 Kb) (suprimido para pb 28157 a 30437 de Ad6) e pABSAd6E3 (2,6 Kb) (suprimido para pb 28157 a 30788 de Ad6) . Foi então utilizada recombinação bacteriana para substituir as três deleções de E3 novamente em pAd6El-E3+ gerando os plasmídeos de genoma de Ad6 pAd6El-E3-l,8 Kb, pAd6El-E3-2,3 Kb e pAd6El-E3-2,6Kb.

Exemplo 6: Geração do Plasmídeo de Genoma de Ad5 com a Sequência de NS

Um plasmídeo pcDNA3 (Invitrogen) contendo a região de codificação de NS3-NS4A-NS4B-NS5A foi digerido com os locais de restrição Xmnl e NruI e o fragmento de ADN contendo o promotor de CMV, a sequência de codificação de NS3-NS4A-NS4B-NS5A e o sinal de poliadenilação da Hormona de Crescimento Bovina (BGH) foi clonado no local de restrição único XcoRV do vector vaivém pDelEISpa, gerando o vector Sva3-5A.

Um plasmídeo pcDNA3 contendo a região de codificação de NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B foi digerido com Xmnl e EcoRI (digestão parcial), e o fragmento de ADN contendo parte do gene NS5A, NS5B e o sinal de poliadenilação de BGH foi clonado no vector Sva3-5A, digerido com EcoRI e BglII, tornado de extremidades cegas com Klenow, gerando o vector Sva3-5B. O vector Sva3-5B foi finalmente digerido com os locais de restrição Ssp I e Bstll07I e o fragmento de ADN contendo a cassete de expressão (promotor de CMV, sequência de codificação de NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B e o sinal de poliadenilação de BGH) flanqueado por sequências adenovirais foi co-transformado com o plasmídeo de genoma pAd5HVO (El-, E3-) linearizado com Ciai na estirpe bacteriana BJ5183, para gerar pAd5HVONS. O pAd5HVO contém pb 1 a 341, pb 3525 a 28133 e pb 30818 a 35935 de Ad5.

Exemplo 7: Geração de Plasmídeos de Genoma Adenoviral com a Sequência de NSmut

Plasmídeos de genoma adenoviral contendo uma sequência de NS-mut foram gerados num fundo de Ad5 ou Ad6. O fundo de Ad6 57 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ continha regiões de Ad5 nas bases 1 a 450, 3511 a 5548 e 33967 a 35935. O pVlJNS3-5Akozak foi digerido com as enzimas de restrição BglII e Xba I e o fragmento de ADN contendo a sequência de Kozak e a sequência codificando NS3-NS4A-NS4B-NS5A foi clonado num vector vaivém polypMRKpdelEl digerido com BglII e Xbal. 0 vector resultante foi designado shNS3-5Akozak. O polypMRKpdelEl é um derivado de RKpdelEl(Pac/pIX/ pack450)+CMVmin+BGHpA(str.) modificado através da inserção de um poliligante contendo locais de reconhecimento para Bglll, Pme I, SwaI, Xbal, Sall, no local de restrição único Bgl II presente a jusante do promotor de CMV. MRKpdelEl(Pac/pIX/ pack450)+CMVmin+BGHpA(str.) contém sequências de Ad5 desde pb 1 a 5792 com uma deleção de sequências de EI do pb 451 a 3510. O promotor de CMV humano e o sinal de poliadenilação de BGH foram inseridos na deleção de El numa orientação paralela a El com um local único BglII separando-os. O fragmento NS5B, mutado para abolir a actividade enzimática e com uma forte terminação da tradução na extremidade 3' , foi obtido por PCR de montagem e inserido no vector shNS3-5Akozak através de recombinação homóloga, gerando polypMRKpdelEINSmut. Em polypMRKpdelEINSmut a sequência de codificação de NS-mut está sob o controlo do promotor de CMV e o sinal de poliadenilação de BGH está presente a jusante. A cassete de expressão génica e as regiões flanqueadoras que contêm sequências adenovirais permitindo a recombinação homóloga foram excisadas através de digestão com as enzimas de restrição PacI e Bstll07I e co-transformadas com os plasmídeos de genoma pAd5HVO (E1-,E3-) ou pAd6El-E3-2,6Kb linearizados com Ciai na estirpe bacteriana BJ5183, para gerar pAd5HV0NSmut e pAdôEl-,E3-NSmut, respectivamente. O pAd6El-E3-2,6Kb contém pb 1 a 341 e pb 3525 a 5548 de Ad5, pb 5542 a 28157 e pb 30788 a 33784 de Ad6, e pb 33967 a 35935 de Ad5 (o número dos pb refere-se à sequência wt tanto para Ad5 como para Ad6). Em ambos os plasmídeos as ITR virais são unidas por sequências plasmídicas que contêm a origem de replicação bacteriana e um gene de resistência à ampicilina. 58 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Exemplo 8: Geraçao de Plasmídeos de Genoma Adenoviral com o NSOPTmut 0 gene sintético humano de codões optimizados (NSOPTmut) proporcionado pela SEQ ID NO:3 clonado num vector pCRBlunt (Invitrogen) foi digerido com as enzimas de restrição BamHl e SalI e clonado nos locais de restrição BglII e Sall presentes no vector vaivém polypMRKpdelEl. 0 clone resultante (polypMRKpdelEINSOPTmut) foi digerido com as enzimas de restrição PacI e Pstll07I e co-transformado com os plasmídeos de genoma linearizados com Ciai pAdãHVO (E1-,E3-) ou pAdôEl-E3-2,6Kb, na estirpe bacteriana BJ5183, para gerar pAd5HV0NS0PTmut e pAdôEl-,E3-NS0PTmut, respectivamente.

Exemplo 9: Recuperação e Amplificação de Vectores Adenovirais

Os adenovectores foram recuperados em células Per.6. Per.C6 foram criadas em FCS a 10%/DMEM suplementado com L-glutamina (4 mM final), penicilina/estreptomicina (100 IU/ml final) e MgCl2 10 mM. Após infecção, as células foram mantidas no mesmo meio suplementado com soro de cavalo (HS) a 5%. Para recuperação virai, foram plaqueadas 2,5xl06 Per.C6 em caixas de Petri de 6 cm 0.

Vinte quatro horas após o plaqueamento, as células foram transfectadas através do método de fosfato de cálcio com 10 pg do ADN adenoviral linearizado com PacI. O precipitado de ADN foi deixado nas células durante 4 horas. O meio foi removido e foi adicionado HS a 5%/DMEM.

As células foram mantidas numa incubadora com CO2 até ser visível um efeito citopático (1 semana). As células e o sobrenadante foram recuperados e sujeitos a ciclos de congelação/descongelação 3x (azoto líquido/banho-maria a 37°C) . 0 lisado foi centrifugado a 3000 rpm a -4°C durante 20 minutos e o sobrenadante recuperado (correspondendo a um lisado celular contendo vírus passado nas células apenas uma vez; Pl) foi utilizado, na quantidade de 1 ml/caixa, para infectar Per.Cô 80-90% confluentes em caixas de Petri de 10 cm 0. As células infectadas foram incubadas até ser visível um efeito citopático, as células e o sobrenadante foram 59 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ recuperados e ο lisado foi preparado tal como descrito acima (P2) . 0 lisado P2 (4 ml) foi utilizado para infectar caixas de Petri 2x15 cm 0. 0 lisado recuperado a partir desta infecção (P3) foi mantido em aliquotas a -80°C como reserva de virus a utilizar como ponto de partida para grandes preparações virais. Neste caso, 1 ml da reserva foi suficiente para infectar caixas de Petri 2x15 cm 0 e o lisado resultante (P4) foi utilizado para a infecção das caixas de Petri destinadas à infecção em grande escala.

Mais amplificação foi obtida a partir do lisado P4 que foi diluído em meio sem FCS e utilizado para infectar caixas de Petri 30x15 cm 0 (com Per.Cô 80%-90% confluentes) numa quantidade de 10 ml/caixa. As células foram incubadas durante 1 hora na incubadora com CO2, agitando suavemente cada 20 minutos. Foram adicionados 12 ml/caixa de HS a 5%/DMEM e as células foram incubadas até ser visível um efeito citopático (cerca de 48 horas).

As células e o sobrenadante foram colhidos e centrifugados a 2000 rpm durante minutos a 4°C. O sedimento foi ressuspenso em 15 ml de Tris 0,1 M pH=8,0. As células foram lisadas através de ciclos de 3x congelação/descongelação (azoto líquido/banho-maria a 37°C). Foram adicionados 150 μΐ de MgCl2 2 M e 75 μΐ de ADNase (10 mg de desoxirribonuclease I pancreática bovina em 10 ml de Tris-HCl 20 mM pH=7,4, NaCl 50 mM, ditiotreitol 1 mM, 0,1 mg/ml de albumina de soro bovino, glicerol a 50%) . Após uma incubação de 1 hora a 37°C num banho-maria (vórtice cada 15 minutos) o lisado foi centrifugado a 4000 rpm durante 15 minutos a 4°C. O sobrenadante recuperado estava pronto a ser aplicado num gradiente de CsCl.

Os gradientes de CsCl foram preparados em tubos SW40 ultra-clear como se segue: 0,5 ml de CsCl 1,5 d 3 ml de CsCl 1,35 d 3 ml de CsCl 1,25 d foram aplicados 5 ml/tubo de sobrenadante virai. 60 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Se necessário, os tubos eram perfeitos com Tris-Cl 0,1 M pH=8,0. Os tubos foram centrifugados a 35000 rpm durante 1 hora a -10°C com rotor SW40. As bandas virais (localizadas na interface 1,25/1,35) foram colhidas utilizando uma seringa. O virus foi transferido para um novo tubo SW40 ultraclear e foi adicionado CsCl 1,35 d para perfazer o tubo. Após centrifugação a 35000 rpm durante 24 horas a 10°C no rotor SW40, o virus foi colhido no menor volume possível e dialisado extensivamente contra tampão A105 (Tris 5 mM, sacarose a 5%, NaCl 75 mM, MgCl2 1 mM, polissorbato 80 a 0,005% pH=8,0). Após diálise, foi adicionado glicerol até 10% final e o vírus foi armazenado em alíquotas a -80°C.

Exemplo 10: Recuperação Aumentada do Adenovector

Verificou-se que os vectores Ad5 e Ad6 de primeira geração possuindo o transgene NSOPTmut de VHC eram difíceis de recuperar. Um possível bloqueio no processo de recuperação pode ser atribuído a uma replicação ineficiente do ADN plasmídico que é um molde sub-óptimo para a maquinaria de replicação do adenovírus. A ausência da proteína terminal ligada às extremidades 5' do ADN (normalmente presente no ADN virai), associada ao teor de G-C muito elevado do transgene inserido na região EI do vector, pode causar uma substancial redução na taxa de replicação do adenovírus derivado do plasmídeo.

Para montar um procedimento mais eficiente e reprodutível para recuperação de vectores Ad, foi empregue um vector de expressão (pE2; Figura 19) contendo todas as proteínas E2 (polimerase, proteína pré-terminal e proteína de ligação ao ADN) bem como o orfô de E4 sob o controlo do promotor indutível por tet. A transfecção de pE2 em combinação com um plasmídeo pré-adeno normal em PerC6 e em 293 conduz a um forte aumento da replicação de ADN de Ad e a uma produção mais eficiente de partículas adenovirais infecciosas completas.

Construção do Plasmídeo

O pE2 baseia-se no vector de clonagem pBI (CLONTECH) com a adição de dois elementos para permitir replicação epissómica e selecção em cultura celular: (1) a região EBV-OriP 61 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ ( [nt] 7421-8042 de EBV) permitindo a replicação do plasmídeo em sincronia com o ciclo celular quando EBNA-1 é expressa e (2) o gene de resistência a higromicina-B-fosfotransferase (HPH) permitindo uma selecção positiva das células transformadas. As duas unidades transcricionais para os genes adenovirais E2 a e b e E4-Orf6 foram construídas e montadas em pE2 tal como descrito abaixo. O fragmento Clal/Sphl da Polimerase de Ad5 e o fragmento Acc65/.EcoRV de pTP de Ad5 foram obtidos a partir de pVac-Pol e pVac-pTP (Stunnemberg et al., NAR 16: 2431-2444, 1988). Ambos os fragmentos foram preenchidos com Klenow e clonados nos locais Sal I (preenchido) e EcoRV de pBI, obtendo-se, respectivamente, pBI-Pol/pTP. O elemento EBV-OriP de pCEP4 (Invitrogen) foi primeiro inserido dentro de dois dímeros isolantes da β-globina de galinha através da sua clonagem no local BamHI de pJC13-l (Chung et al., Cell 74(3): 505-14, 1993). O fragmento HS4-OriP de pJC13-OriP foi então clonado dentro de pSAlmv (um plasmídeo contendo a cassete de expressão génica de resistência a tk-Hygro-B bem como a origem de replicação de Ad5), as ITR dispostas como junção cabeça-com-cauda, obtidas através de PCR de pFGl40 (Graham, EMBO J. 3: 2917-2922, 1984) utilizando os seguintes iniciadores: 5'-TCGAATCGATACGCGAACCTACGC-3' (SEQ ID NO:16) e 5'-TCGACGTGTCGACTTCGAAGCGCACACCAAAAACGTC-3' (SEQ ID NO:17), gerando assim pMVHS40rip. Um fragmento de ADN de pMVHS40rip, contendo a OriP isolada, a junção das ITR de Ad5 e a cassete tk-HygroB, foi então inserido no vector pBI-Pol/pTP restringido com Asei/Aatll gerando pBI-Pol/pTPHS4.

Para construir a segunda unidade transcricional expressando Ad5-Orf6 bem como Ad5-DBP, E4orf6 ([nt] 33193-34077 de Ad5) obtido por PCR foi primeiro inserido no vector pBI, gerando pBI-Orfô. Subsequentemente, a sequência de ADN codificando DBP ([nt] 22443-24032 de Ad5) foi inserida em pBI-Orf6 obtendo-se o segundo vector de expressão bidireccional regulado por Tet (pBI-DBP/E4orf6). Os sinais poliA originais presentes em pBI foram substituídos por poliA de BGH e SV40. O pBI-DBP/E4orf6 foi então purificado através da inserção de um fragmento de ADN contendo as ITR de Adeno5 dispostas em 62 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ junção cabeça-com-cauda mais o gene de resistência a higromicina B obtido a partir do plasmídeo pSA-lmv. 0 novo plasmideo pBI-DBP/E4orfôshuttle foi então utilizado como plasmídeo dador para inserir a segunda unidade transcricional regulada por tet em pBI-Pol/pTPHS4 através de recombinação homóloga utilizando a estirpe BJ5183 de E. coli obtendo-se pE2.

Linhas celulares, Transfecções e Amplificação do vírus Células PerC6 foram cultivadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) mais soro fetal bovino (FBS) a 10%, MgCl2 10 mM, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 pg/ml) e glutamina 2 mM.

Todas as transfecções transientes foram efectuadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) tal como descrito pelo fabricante. PERC.6™ 90% confluentes plantadas em placas de 6 cm foram transfectadas com 3,5 pg de plasmídeos pré-adeno Ad5/6NSOPTmut, digeridos com PacI, sozinhos ou em combinação com 5 pg de pE2 mais 1 pg de pUHD52.1. O pUHD52.1 é o vector de expressão para o transactivator 2 de tet reverso (rtTA2) (Urlinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97 (14): 7963-7968, 2000). Após transfecção, as células foram cultivadas na presença de 1 pg/ml de doxiciclina para activar a expressão de pE2. Sete dias após a transfecção as células foram colhidas e o lisado celular foi obtido através de três ciclos de congelação-descongelação. Foram utilizados 2 ml de lisado celular para infectar uma segunda caixa de 6 cm de PerC6. As células infectadas foram cultivadas até ser observado um CPE completo e depois colhidas. O vírus foi passado em série cinco vezes tal como descrito acima, depois purificado em gradiente de CsCl. A estrutura de ADN do vírus purificado foi controlada através de digestão com endonucleases e análise por electroforese em gel de agarose e comparada com o padrão de restrição do plasmídeo pré-adeno original.

Exemplo 11: Optimização Parcial do Ácido Nucleico Codificando a Poliproteína de VHC A optimização parcial do ácido nucleico codificando a poliproteína de VHC foi efectuada para facilitar a produção de 63 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ adenovectores contendo codões optimizados para expressão num hospedeiro humano. 0 objectivo global foi proporcionar maior expressão devido a optimização dos codões, ao mesmo tempo que se facilita a produção de um adenovector codificando a poliproteina de VHC.

Foram encontradas várias dificuldades na produção de um adenovector codificando a poliproteina de VHC com codões optimizados para expressão num hospedeiro humano. Verificou-se que um adenovector contendo uma sequência optimizada (SEQ ID N0:3) era mais difícil de sintetizar e recuperar que um adenovector contendo uma sequência não optimizada (SEQ ID NO:2).

As dificuldades na produção de um adenovector contendo SEQ ID NO:3 foram atribuídas ao elevado teor de GC. Uma região particularmente problemática foi a região cerca da posição 3900 de NSOPTmut (SEQ ID NO:3).

Foram desenhadas versões alternativas da sequência de ácido nucleico codificando VHC optimizada para facilitar a sua utilização num adenovector. As versões alternativas, comparadas com NSOPTmut, foram desenhadas para terem um menor teor global de GC, para reduzir/evitar a presença de motivos potencialmente problemáticos de G ou C consecutivos, mantendo ao mesmo tempo um elevado nível de optimização de codões para permitir uma melhor expressão da poliproteina codificada e dos produtos de clivagem individuais.

Um ponto de partida para a geração de uma sequência com codões optimizados de forma sub-óptima é a região de codificação da sequência nucleotídica de NSOPTmut (bases 7 a 5961 de SEQ ID NO:3). Os valores para as frequências de utilização dos codões (normalizados para um total de 1,0 para cada aminoácido) foram tomados a partir de um ficheiro human_high.cod disponível no Pacote Wisconsin Versão 10.3 (Accelrys Inc., uma subsidiária totalmente detida por Pharmacopeia, Inc).

Para reduzir o teor local e global de GC foi manualmente gerada uma tabela definindo as substituições de codões preferidas para cada aminoácido. Para cada aminoácido foi ΕΡ 1 436 397/ΡΤ 6 4 escolhido como codão de substituição o codão possuindo 1) um menor teor de GC em comparação com o codão mais frequente e 2) uma frequência de utilização dos codões observada relativamente elevada (tal como definido em human_high.cod). Por exemplo para Arg o codão com a frequência mais elevada é CGC. Dos outros cinco codões alternativos codificando Arg (CGG, AGG, AGA, CGT, CGA) três (AGG, CGT, CGA) reduzem o teor de GC em 1 base, um (AGA) em duas bases e um (CGG) em 0 bases. Uma vez que o codão AGA está listado em human_high. cod como possuindo uma frequência de utilização relativamente baixa (0,1), o codão substituindo CGC foi portanto escolhido ser AGG com uma frequência relativa de 0,18. Foram aplicados critérios semelhantes para estabelecer substituições de codões para ou outros aminoácidos resultando na lista mostrada na Tabela 5. Os parâmetros aplicados no seguinte procedimento de optimização foram determinados empiricamente para que a sequência resultante mantivesse uma utilização de codões consideravelmente melhorada (para cada aminoácido) e o teor de GC (global e na forma de trechos locais de G e/ou C consecutivos) fosse reduzido.

Dois exemplos de sequências codificando VHC parcialmente optimizadas são proporcionados por SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO:11. SEQ ID NO:10 proporciona uma sequência codificando VHC que é parcialmente optimizada no todo. SEQ ID NO: 11 proporciona uma sequência codificando VHC completamente optimizada para utilização de codões com a excepção de uma região que foi parcialmente optimizada. A optimização de codões foi efectuada utilizando o seguinte procedimento:

Passo 1) A região de codificação da sequência introduzida NSOPTmut completamente optimizada foi analisada utilizando uma janela deslizante de 3 codões (9 bases) movendo a janela um codão após cada ciclo. Sempre que era detectado na janela um trecho contendo 5 ou mais C e/ou G consecutivos era aplicada a regra de substituição seguinte: Deixar N indicar o número de substituições de codões anteriormente efectuada. Se N for impar substitui-se o codão do meio na janela pelo codão especificado na Tabela 5, se N for par substitui-se o terceiro codão terminal na janela pelo codão especificado numa tabela 65 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ de optimização de codões tal como human_high.cod. Se Leu ou Vai estiverem presentes no segundo ou terceiro codão não se aplica qualguer substituição para não introduzir codões Leu ou Vai com uma frequência relativa de utilização de codões muito baixa (ver, por exemplo, human_high.cod). No ciclo seguinte foi então aplicada análise da janela deslocada a uma sequência contendo as substituições do ciclo anterior.

Verificou-se empiricamente que a substituição alternada do codão do meio e terminal na janela de 3 codões dá uma manutenção global mais satisfatória da utilização de codões optimizada ao mesmo tempo que reduz o teor de GC (tal como julgado a partir da sequência final após o procedimento). Em geral, no entanto, a estratégia exacta de substituição depende da sequência de aminoácidos codificada pela sequência nucleotidica sob análise e terá de ser determinada empiricamente.

Passo 2) A sequência contendo todas as substituições de codões efectuadas durante o passo 1) foi então sujeita a uma análise adicional utilizando uma janela deslizante de 21 codões (63 bases) de comprimento: de acordo com um parâmetro ajustável foi determinado o teor de GC global na janela. Se o teor de GC na janela fosse superior a 70% era aplicada a seguinte estratégia de substituição de codões: Na janela substituir os codões para os aminoácidos Asn, Asp, Cys, Glu, His, Ile, Lys, Phe, Tyr pelo codões dados na Tabela 5. A restrição da substituição a este conjunto de aminoácidos era motivada pelo facto de que a) o codão de substituição ter ainda uma frequência de utilização aceitavelmente elevada em human_high.cod e b) a média global de utilização de codões humanos em CUTG para o codão de substituição ser quase tão elevada como a do codão mais frequente. No ciclo seguinte análise da janela deslocada é então aplicada a uma sequência contendo as substituições do ciclo anterior. O limiar de 70% foi determinado empiricamente através de compromisso entre uma redução global no teor de GC e a manutenção de uma elevada optimização de codões para os aminoácidos individuais. Tal como no passo 1) a estratégia exacta de substituição (escolha dos aminoácidos e valor do limiar de teor de GC) dependerá novamente da sequência de 66 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ aminoácidos codificada pela sequência nucleotidica sob análise e terá de ser determinada empiricamente.

Passo 3) A sequência gerada pelos passos 1) e 2) foi então manualmente editada e codões adicionais foram mudados de acordo com os seguintes critérios: As regiões possuindo ainda um teor de GC superior a 70% ao longo de uma janela de 21 codões foram examinadas manualmente e foram novamente substituídos alguns codões seguindo o esquema dado na Tabela 5.

Foram efectuados passos subsequentes para proporcionar locais de restrição úteis, remover possíveis enquadramentos de leitura abertos na cadeia complementar, para adicionar regiões de recombinação homóloga, para adicionar um sinal de Kozak e para adicionar um terminador. Estes passos são numerados 4-7.

Passo 4) A sequência gerada no passo 3 foi examinada quanto à ausência de certos locais de restrição (BglII, PmeI e Xba I) e presença de apenas 1 local StuI para permitir uma subsequente estratégia de clonagem utilizando um subconjunto de enzimas de restrição. Dois locais (um para BglII e um para StuI) foram removidos da sequência através de substituição de codões que faziam parte dos respectivos locais de reconhecimento.

Passo 5) A sequência gerada pelos passos 1) a 4) foi então modificada para permitir a subsequente geração de uma sequência NSOPTmut modificada (através de recombinação homóloga). Na sequência obtida a partir dos passos 1) a 4) o segmento compreendendo as bases 3556 a 3755 e o segmento compreendendo as bases 4456 a 4656 foram substituídos pelos segmentos correspondentes de NSOPTmut. O segmento compreendendo as bases 3556 a 4656 de SEQ ID NO: 10 pode ser utilizado para substituir a região problemática em NSOPTmut (em torno da posição 3900) através de recombinação homóloga criando assim a variante de NSOPTmut possuindo a sequência de SEQ ID NO:11.

Passo 6) A análise da sequência gerada através dos passos 1) a 5) revelou um potencial enquadramento de leitura aberto abrangendo quase o fragmento completo na cadeia 67 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ complementar. A remoção de todos os codões CTA e TTA (Leu) e TCA (Ser) da cadeia com sentido removeu eficazmente todos os codões de terminação num dos enquadramentos de leitura na cadeia complementar. Embora a probabilidade de transcrição deste enquadramento de leitura aberto da cadeia complementar e subsequente tradução em proteína seja muito pequena, para excluir uma potencial interferência com a transcrição e subsequente tradução da sequência codificada na cadeia com sentido, foram introduzidos codões TCA para Ser naquela com sentido a aproximadamente cada 500 bases. Não foram introduzidas alterações nos segmentos introduzidos durante o passo 5) para permitir recombinação homóloga. Foi preferido o codão TCA para Ser em relação aos codões CTA e TTA para Leu devido à frequência relativa mais elevada de TCA (0,05) em comparação com CTA (0,02) e TTA (0,03) em human_high.cod. Adicionalmente, a média de utilização de codões humanos de CUTG favoreceu TCA (0,14 contra 0,07 para CTA e TTA).

Passo 7) Num passo final GCCACC foi adicionada à extremidade 5' da sequência para gerar um local interno de entrada no ribossoma optimizado (sinal de Kozak) e foi adicionado um sinal de terminação TAAA na extremidade 3'. Para manter as propriedades da iniciação da tradução de NSsuboptmut, os primeiros 8 codões da região de codificação foram mantidos idênticos à sequência NSOPTmut. A sequência resultante foi novamente verificada quanto à ausência de locais de reconhecimento BglII, PmeI e Xbal e à presença de apenas 1 local Stul. A sequência NSsuboptmut (SEQ ID NO:10) tem um teor global de GC reduzido (63,5%) em comparação com NSOPTmut (70,3%) e mantém um nível bem optimizado de optimização de utilização de codões. A identidade da sequência nucleotídica de NSsuboptmut é de 77,2% em relação a NSmut. 68 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Tabela 5: Definição das substituições de codões efectuadas durante os passos 1) e 2).

Aminoácido Codão mais frequente Frequência relativa Redução no teor de GC (bases) Codao de substituição Frequência relativa Aminoácidos onde o codao de substituição reduz o teor de GC do codão em 1 base Ala GCG 0,51 1 GCT 0,17 Arg CGC 0,37 1 AGG 0,18 Asn AAC 0, 78 1 AAT 0,22 Asp GAC 0, 75 1 GAT 0,25 Cys TGC 0,68 1 TGT 0,32 Glu GAG 0, 75 1 GAA 0,25 Gin CAG 0,88 1 CAA 0, 12 Gly GGC 0,50 1 GGA 0, 14 His CAC 0, 79 1 CAT 0,21 Ile ATC 0, 77 1 ATT 0, 18 Lys AAG 0,82 1 AAA 0, 18 Phe ETC 0, 80 1 TTT 0,20 Pro CCC 0, 48 1 CCT 0,19 Ser AGC 0,34 1 TCT 0, 13 Thr ACC 0,51 1 ACA 0, 14 Tyr TAC 0, 74 1 TAT 0,26 Aminoácidos sem codao alternativo Met ATG 1,00 0 ATG 1, 00 Trp TGG 1,00 0 TGG 1, 00 Aminoácidos onde o codão de substituição tem uma frequência relativa muito baixa. Estes aminoácidos foram excluídos do procedimento de substituição Leu CTG 0,58 1 TTG 0, 06 Vai GTG 0,64 1 GTT 0, 07

Exemplo 12: Caracterizaçao do Vírus

Os adenovectores foram caracterizados através de: (a) medição das partículas físicas/ml; (b) realização de um ensaio de PCR TaqMan; e (c) verificação da expressão proteica após infecção de células HeLa. 69 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ a) Determinação das Partículas Físicas 0 vírus purificado em CsCl foi diluído 1/10 e 1/100 em SDS/PBS a 0,1%. Como controlo, foi utilizado tampão A105. Estas diluições foram incubadas 10 minutos a 55°C. Após centrifugação breve dos tubos, foi medida a D.O. a 260 nm. A quantidade de partículas virais foi calculada como se segue: 1 D O 2 6 o nm = Ι,ΙχΙΟ12 partículas fisicas/ml. Os resultados estiveram tipicamente entre 5xl0n e lxlO12 partículas físicas/ml. b) Ensaio de PCR TaqMan O ensaio de PCR TaqMan foi utilizado para quantificação do genoma dos adenovectores (partículas Q-PCR/ml). O ensaio de PCR de TaqMan foi efectuado utilizando o detector de sequências ABI Prism 7700. A reacção foi efectuada num volume final de 50 μΐ na presença de oligonucleót idos (a 200 nM final) e sonda (a 200 μΜ final) específicos para a estrutura adenoviral. O vírus foi diluído 1/10 em SDS a 0,1%/PBS e incubado 10 minutos a 55°C. Após centrifugação breve dos tubos, foram preparadas diluições 1/10 em série (em água). Foram utilizados 10 μΐ das diluições 10~3, 10~5 e 10^7 como moldes no ensaio de PCR. A quantidade de partículas presente em cada amostra foi calculada com base numa curva padrão corrida na mesma experiência. Tipicamente os resultados estiveram entre lxlO12 e 3xl012 partículas Q-PCR/ml.

c) Expressão de Proteínas Não estruturais de VHC A expressão de proteínas NS de VHC foi testada através de infecção de células HeLa. As células foram plaqueadas no dia anterior à infecção a 1,5χ106 células/caixa (caixas de Petri de 10 cm 0) . Quantidades diferentes de vírus purificado em CsCl correspondendo a uma m.o.i. de 50, 250 e 1250 pv/célula foram diluídas em meio (sem FCS) até um volume final de 5 ml. 0 vírus diluído foi adicionado às células e incubado durante 1 hora a 37°C numa incubadora com CO2 (agitando suavemente 70 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ cada 20 minutos). Foram adicionados 5 ml de HS a 5%-DMEM e as células foram incubadas a 37°C durante 48 horas.

Foram preparados extractos celulares em Triton a 1%/tampão TEN. Os extractos foram corridos em gel de SDS-acrilamida a 10%, transferidos para nitrocelulose e ensaiados com anticorpos dirigidos contra NS3, NS5a e NS5b para verificar a clivagem correcta da poliproteina. Foram utilizadas células falsamente infectadas como controlo negativo. Os resultados de experiências representativas testando Ad5-NS, MRKAd5-NSmut, MRKAdô-NSmut e MRKAdô-NSOPTmut são mostrados na Figura 14.

Exemplo 13: Imunização de Ratinhos com Adenovectores

Codificando Diferentes Cassetes de NS

Os adenovectores Ad5-NS, MRKAd5-NSmut, MRKAd6-NSmut e MRKAdô-NSOPTmut foram injectados em estirpes de ratinhos C57Black6 para avaliar o seu potencial para desencadear respostas imunitárias anti-VHC. Foram injectados intramuscularmente grupos de animais (N=9-10) com 109 pv de vírus purificado em CsCl. Cada animal recebeu duas doses com um intervalo de três semanas. A resposta imunitária humoral contra a proteína NS3 foi medida em dois soros pós-dose de ratinhos C57Black6 imunizados através de ELISA no domínio protease de NS3 expresso em bactérias. Anticorpos específicos para o antigénio testado foram detectados com uma média geométrica dos títulos (GMT) variando de 100 a 46000 (Tabelas 6, 7, 8 e 9).

Tabela 6: Ad5-NS GMT Ratinho n.° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Título 50 253 50 50 50 2257 504 50 50 50 108

Tabela 7: Ad5-NSmut GMT Ratinho n.° 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Título 3162 78850 87241 6796 12134 3340 18473 13093 76167 49593 23645 71 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Tabela 8: MRKAdô-NSmut GMT Ratinho n.° 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Título 125626 39751 40187 65834 60619 69933 21555 49348 29290 26859 46461

Tabela 9: MRKAd6-NS0PTmut GMT Ratinho n.° 31 32 33 34 35 36 37 Título 25430 3657 893 175 10442 49540 173 2785 A resposta de células T em ratinhos C57Black6 foi analisada através do ensaio ELISPOT quantitativo medindo o número de células T secretoras de IFN-γ em resposta a cinco bancos (designados F a L+M) de péptidos 20-meros sobreponíveis em dez resíduos englobando a sequência de NS3-NS5B. A resposta CD8+ específica induzida em ratinhos C57Black6 foi analisada através do mesmo ensaio utilizando um péptido 20-mero englobando um epítopo CD8+ para ratinhos C57Black6 (pepl480). Células segregando IFN-γ de um modo específico do antigénio foram detectadas utilizando um ensaio ELIspot padrão.

Foram produzidas e tratadas células de baço, esplenócitos e péptidos tal como descrito no Exemplo 3, supra. Dados representativos dos grupos de ratinhos C57Black6 (N=9-10) imunizados com duas injecções de 109 partículas virais dos vectores Ad5-NS, MRKAd5-NSmut e MRKAdô-NSmut são mostrados na Figura 15.

Exemplo 14: Imunização de Macacos Rhesus com Adenovectores

Macacos Rhesus (N=3-4) foram imunizados através de injecção intramuscular de vírus Ad5-NS, MRKAd5-NSmut, MRKAdô-NSmut ou MRKAdô-NSOPTmut purificados em CsCl. Cada animal recebeu duas doses de 1011 ou IO10 pv no músculo deltoide às 0 e 4 semanas. A CMI foi medida a diferentes momentos através de a) ELISPOT de IFN-γ (ver Exemplo 3, supra) , b) ICS de IFN-γ e c) ensaios de CTL em massa. Estes ensaios medem as respostas de linfócitos T CD8+ e CD4+ específicos de VHC, e podem ser 72 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ utilizados para uma variedade de mamíferos, tais como seres humanos, macacos Rhesus, ratinhos e ratos. A utilização de um péptido específico ou um banco de péptidos pode simplificar a apresentação do antigénio em ensaios de citotoxicidade de CTL, ensaios ELISPOT de interferão-gama e ensaios de coloração intracelular de interferão-gama. Péptidos baseados na sequência de aminoácidos de várias proteínas de VHC (central, E2, NS3, NS4A, NS4B, NS5a, NS5b) foram preparados para utilizar nestes ensaios para medir respostas imunitárias em macacos Rhesus vacinados com vectores de ADN e adenovirais de VHC, bem como em seres humanos infectados com VHC. Os péptidos individuais são 20-meros sobreponíveis, desfasados em 10 aminoácidos. Bancos grandes de péptidos podem ser utilizados para detectar uma resposta global a proteínas de VHC enquanto bancos menores e péptidos individuais podem ser utilizados para definir a especificidade de epítopo de uma resposta. ICS de IFN-y

Para ICS de IFN-γ, 2xl06 PBMC em 1 ml de RIO (meio RPMI, suplementado com FCS a 10%) foram estimulados com antigénios do banco de péptidos. A concentração final de cada péptido foi de 2 pg/ml. As células foram incubadas durante 1 hora numa incubadora com CO2 a 37°C e depois foi adicionada Brefeldina A a uma concentração final de 10 yg/ml para inibir a secreção de citoquinas solúveis. As células foram incubadas durante mais 14-16 horas a 37°C. A estimulação foi feita na presença de anticorpos co-estimuladores: CD28 e CD49d (BD340975 anti-CD28 humana e BD340976 anti-CD49d humana). Após incubação, as células foram coradas com anticorpos conjugados com fluorócromos para antigénios da superfície: anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 (CD3-APC Biosource APS0301, CD4-PE BD345769, CD8-PerCP BD345774).

Para detectar citoquinas intracelulares, as células foram tratadas com tampão 2 de permeabilização de FACS (BD340973), concentração final de 2x. Uma vez fixadas e permeabilizadas, as células foram incubadas com um anticorpo contra IFN-γ humano, IFN-y-FITC (Biosource AHC4338). 73 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

As células foram ressuspensas em formaldeído a 1% em PBS e analisadas em FACS dentro de 24 horas. Foi efectuada análise FACS de quatro cores num instrumento FACSCalibur (Becton Dickinson) equipado com dois lasers. A aquisição foi feita capturando a população de linfócitos no qráfico de dispersão Frontal versus Lateral acoplada às populações positivas para CD3 e CD8. Foram tomados pelo menos 30000 eventos de captura. As células positivas são expressas como o número de células que expressam IFN-γ sobre 106 linfócitos.

Os dados de ELISPOT de IFN-γ e ICS de IFN-γ de macacos imunizados após uma ou duas injecções de IO10 ou 1011 pv dos diferentes adenovectores são relatados nas Figuras 16A-16D, 17A e 17B.

Ensaios de CTL em Massa

Uma função efectora distintiva dos linfócitos T é a capacidade de subconjuntos desta população celular para lisar directamente células exibindo péptidos antigénicos apropriados associados a MHC. Esta actividade citotóxica está mais frequentemente associada a linfócitos T CD8+.

Amostras de PBMC foram infectadas com virus de vacina recombinantes expressando antigénios de VHC in vitro durante aproximadamente 14 dias para proporcionar re-estimulação do antigénio e expansão de células T de memória. A citotoxicidade contra linhas de células B autólogas tratadas com bancos de antigénios peptídicos foi testada. A função litica da cultura é medida como percentagem de lise especifica que resultou da libertação de crómio de células alvo durante uma incubação de 4 horas com células efectoras CTL. A citotoxicidade especifica é medida e comparada com linhas de células B tratadas com antigénio irrelevante ou excipiente. Este ensaio é semi-quantitativo e é o meio preferido para determinar se as respostas de CTL foram desencadeadas pela vacina. Os dados após duas injecções de macacos imunizados com 1011 pv/dose com adenovectores Ad5-NS, MRKAdó-NSmut e MRKAdô-NSmut são relatados nas Figuras 18A-18F. 74 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Merck & Co. Inc.,

Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P. Angeletti S.p.A.

<120> VACINA DE VÍRUS DA HEPATITE C

<130> ITR0015Y PCT <140> PCT/US02/32512 <141> 2002-10-10 <150> 60/363,774 <151> 2002-03-13 <150> 60/328,655 <151> 2001-10-11 <160> 17 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1

<211> 1985 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

<223> polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B <400> 1

Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser Gin Gin Thr Arg Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gin Vai Glu Gly 20 25 30 Glu Vai Gin Vai Vai Ser Thr Ala Thr Gin Ser Phe Leu Ala Thr Cys 35 40 45 Vai Asn Gly Vai Cys Trp Thr Vai Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr 50 55 60 Leu Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gin Met Tyr Thr Asn Vai Asp 65 70 75 80 Gin Asp Leu Vai Gly Trp Gin Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Leu Thr 85 90 95 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Vai Thr Arg His Ala 100 105 110 Asp Vai Ile Pro Vai Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu 115 120 125 Ser Pro Arg Pro Vai Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu 130 135 140 Leu Cys Pro Ser Gly His Ala Vai Gly Ile Phe Arg Ala Ala Vai Cys 145 150 155 160 Thr Arg Gly Vai Ala Lys Ala Vai Asp Phe Vai Pro Vai Glu Ser Met 165 170 175 Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Vai Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro 180 185 190 Ala Vai Pro Gin Ser Phe Gin Vai Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly 195 200 205 Ser Gly Lys Ser Thr Lys Vai Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gin Gly Tyr 210 215 220 Lys Vai Leu Vai Leu Asn Pro Ser Vai Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly 225 230 235 240 75 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Ala Tyr Met Ser Vai Arg Thr Ile 260 Lys Phe Leu 275 Ala Ile Cys 290 Asp Glu Gly 305 Thr Vai Leu Leu Ala Thr Ala Ile Glu Glu Vai 340 Lys Ala Ile 355 Pro Cys His 370 Ser Lys Leu 385 Gly Ile Asn Ile Pro Thr Ile Thr Gly Tyr Thr 420 Vai Thr Gin 435 Thr Thr Thr 450 Thr Vai Arg 465 Thr Gly Arg Glu Arg Pro Ser Asp Ala Gly Cys 500 Arg Leu Arg 515 Ala His Leu 530 Glu Phe Ala 545 His Phe Leu Leu Vai Ala Tyr Pro Ser Trp Asp 580 Leu His Gly 595 Pro Glu Vai 610 Thr Leu Ser 625 Ala Asp Leu Vai Leu Ala Ala Ile Vai Gly Arg 660 Arg Glu Phe 675 Leu His Leu 690 Pro Tyr Gin 705 Lys Ala Leu

Lys 245 Ala His Gly Thr Thr Gly Ala Asp Gly Gly Cys 280 Cys His Ser 295 Thr Asp Gin 310 Ala Glu Thr 325 Pro Pro Gly Ala Leu Ser Asn Ile Glu Ala Ile 360 Lys Lys Cys 375 Asp Ala Vai 390 Ala Tyr Gly 405 Asp Vai Vai Gly Asp Phe Asp Vai Asp Phe Ser 440 Pro Gin Asp 455 Ala Gly Arg 470 Arg Gly Gly 485 Met Phe Asp Ala Trp Tyr Glu Tyr Leu Asn Thr 520 Trp Glu Ser 535 Vai Ser Gin 550 Thr Lys Gin 565 Ala Thr Vai Gin Met Trp Lys Thr Pro Leu Leu 600 Thr His Pro 615 Ile Glu Vai 630 Vai Thr Leu 645 Ala Ala Tyr Ile Ile Leu Ser Tyr Gin Glu Phe 680 Ile Glu Gin 695 Gly Gly Leu 710 Leu Gin

Ile Asp 250 Pro Asn Pro 265 Vai Thr Tyr Ser Gly Gly Ala Asp Ser Thr Thr 300 Thr Ala Gly 315 Ala Ser Vai 330 Thr Vai Thr 345 Gly Glu Ile Arg Gly Gly Arg Glu Leu Ala Ala 380 Tyr Arg Gly 395 Leu Vai Vai 410 Ala Thr Ser 425 Vai Ile Asp Leu Asp Pro Thr Vai Ser Arg Ser 460 Ile Tyr Arg 475 Phe Ser Ser 490 Vai Leu Leu 505 Thr Pro Ala Pro Gly Leu Pro Phe Thr Gly Leu 540 Gin Ala Gly 555 Asp Cys Ala 570 Arg Ala Cys 585 Leu Ile Arg Tyr Arg Leu Gly Thr Lys Tyr Ile 620 Ser Thr Trp 635 Vai Cys Leu 650 Thr Thr Gly 665 Arg Pro Ala Asp Glu Met Glu Met Gin Leu Ala 700 Thr Ala Thr 715 Lys

Ile Arg Thr 255 Gly Ser Thr 270 Tyr Gly Tyr 285 Asp Ile Ile Ile Leu Gly Ile Arg Leu Vai Vai 320 Pro His Pro 335 Asn Pro Phe 350 Tyr Gly His 365 Leu Ile Phe Lys Leu Ser Gly Asp Vai Ser Vai 400 Asp Ala Leu 415 Met Cys Asn 430 Thr Cys Phe 445 Thr Ile Glu Gin Arg Arg Gly Vai Thr Pro Gly 480 Cys Glu Cys 495 Tyr Glu Thr 510 Ser Vai Vai 525 Cys Gin Asp Thr His Ile Asp Asn Phe Pro Tyr 560 Gin Ala Pro 575 Pro Leu Lys 590 Pro Thr Ala 605 Vai Gin Asn Met Ala Cys Met Leu Vai Gly Gly 640 Gly Ser Vai 655 Vai Ile Vai 670 Pro Asp Glu 685 Cys Ala Ser Glu Gin Phe Lys Gin Ala Glu Ala 720 76 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Ala Ala Pro Vai Vai Glu Ser Lys Trp Arg Ala Leu Glu Thr Phe Trp 725 730 735 Ala Lys His Met Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gin Tyr Leu Ala Gly 740 745 750 Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met Ala Phe 755 760 765 Thr Ala Ser Ile Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gin Ser Thr Leu Leu Phe 770 775 780 Asn Ile Leu Gly Gly Trp Vai Ala Ala Gin Leu Ala Pro Pro Ser Ala 785 790 795 800 Ala Ser Ala Phe Vai Gly Ala Gly Ile Ala Gly Ala Ala Vai Gly Ser 805 810 815 Ile Gly Leu Gly Lys Vai Leu Vai Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala 820 825 830 Gly Vai Ala Gly Ala Leu Vai Ala Phe Lys Vai Met Ser Gly Glu Met 835 840 845 Pro Ser Thr Glu Asp Leu Vai Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro 850 855 860 Gly Ala Leu Vai Vai Gly Vai Vai Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His 865 870 875 880 Vai Gly Pro Gly Glu Gly Ala Vai Gin Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala 885 890 895 Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Vai Ser Pro Thr His Tyr Vai Pro Glu 900 905 910 Ser Asp Ala Ala Ala Arg Vai Thr Gin Ile Leu Ser Ser Leu Thr Ile 915 920 925 Thr Gin Leu Leu Lys Arg Leu His Gin Trp Ile Asn Glu Asp Cys Ser 930 935 940 Thr Pro Cys Ser Gly Ser Trp Leu Arg Asp Vai Trp Asp Trp Ile Cys 945 950 955 960 Thr Vai Leu Thr Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gin Ser Lys Leu Leu Pro 965 970 975 Gin Leu Pro Gly Vai Pro Phe Phe Ser Cys Gin Arg Gly Tyr Lys Gly 980 985 990 Vai Trp Arg Gly Asp Gly Ile Met Gin Thr Thr Cys Pro Cys Gly Ala 995 1000 1005 Gin Ile Thr Gly His Vai Lys Asn Gly Ser Met Arg Ile Vai Gly Pro 1010 1015 1020 Lys Thr Cys Ser Asn Thr Trp His Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr 1025 1030 1035 1040 Thr Thr Gly Pro Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Ser Arg Ala 1045 1050 1055 Leu Trp Arg Vai Ala Ala Glu Glu Tyr Vai Glu Vai Thr Arg Vai Gly 1060 1065 1070 Asp Phe His Tyr Vai Thr Gly Met Thr Thr Asp Asn Vai Lys Cys Pro 1075 1080 1085 Cys Gin Vai Pro Ala Pro Glu Phe Phe Thr Glu Vai Asp Gly Vai Arg 1090 1095 1100 Leu His Arg Tyr Ala Pro Ala Cys Arg Pro Leu Leu Arg Glu Glu Vai 1105 1110 1115 1120 Thr Phe Gin Vai Gly Leu Asn Gin Tyr Leu Vai Gly Ser Gin Leu Pro 1125 1130 1135 Cys Glu Pro Glu Pro Asp Vai Ala Vai Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp 1140 1145 1150 Pro Ser His Ile Thr Ala Glu Thr Ala Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly 1155 1160 1165 Ser Pro Pro Ser Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gin Leu Ser Ala Pro 1170 1175 1180 Ser Leu Lys Ala Thr Cys Thr Thr His His Vai Ser Pro Asp Ala Asp 1185 1190 1195 1200 77 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Met Gly Gly Asn Ile 1215 Leu Asp Ser Phe Asp 1230 Ser Vai Pro Ala Glu 1245 Met Pro Ile Trp Ala 1260

Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Gin Glu 1205 1210

Thr Arg Vai Glu Ser Glu Asn Lys Vai Vai Vai 1220 1225

Pro Leu Arg Ala Glu Glu Asp Glu Arg Glu Vai 1235 1240

Ile Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ala Ala 1250 1255

Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Leu Glu Ser Trp Lys Asp Pro Asp 1265 1270 1275 1280

Tyr Vai Pro Pro Vai Vai His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Ile Lys Ala 1285 1290 1295

Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg Lys Arg Thr Vai Vai Leu Thr Glu 1300 1305 1310

Ser Ser Vai Ser Ser Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Thr Phe Gly 1315 1320 1325

Ser Ser Glu Ser Ser Ala Vai Asp Ser Gly Thr Ala Thr Ala Leu Pro 1330 1335 1340

Asp Gin Ala Ser Asp Asp Gly Asp Lys Gly Ser Asp Vai Glu Ser Tyr 1345 1350 1355 1360

Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser 1365 1370 1375

Asp Gly Ser Trp Ser Thr Vai Ser Glu Glu Ala Ser Glu Asp Vai Vai 1380 1385 1390

Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys 1395 1400 1405

Ala Ala Glu Glu Ser Lys Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu 1410 1415 1420

Leu Arg His His Asn Met Vai Tyr Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Gly 1425 1430 1435 1440

Leu Arg Gin Lys Lys Vai Thr Phe Asp Arg Leu Gin Vai Leu Asp Asp 1445 1450 1455

His Tyr Arg Asp Vai Leu Lys Glu Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Vai 1460 1465 1470

Lys Ala Lys Leu Leu Ser Vai Glu Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro 1475 1480 1485

His Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Vai Arg Asn 1490 1495 1500

Leu Ser Ser Lys Ala Vai Asn His Ile His Ser Vai Trp Lys Asp Leu 1505 1510 1515 1520

Leu Glu Asp Thr Vai Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn 1525 1530 1535

Glu Vai Phe Cys Vai Gin Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg 1540 1545 1550

Leu Ile Vai Phe Pro Asp Leu Gly Vai Arg Vai Cys Glu Lys Met Ala 1555 1560 1565

Leu Tyr Asp Vai Vai Ser Thr Leu Pro Gin Vai Vai Met Gly Ser Ser 1570 1575 1580

Tyr Gly Phe Gin Tyr Ser Pro Gly Gin Arg Vai Glu Phe Leu Vai Asn 1585 1590 1595 1600

Thr Trp Lys Ser Lys Lys Asn Pro Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg 1605 1610 1615

Cys Phe Asp Ser Thr Vai Thr Glu Asn Asp Ile Arg Vai Glu Glu Ser 1620 1625 1630

He Tyr Gin Cys Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Arg Gin Ala Ile Lys 1635 1640 1645

Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr Ile Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys 1650 1655 1660

Gly Gin Asn Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Vai Leu Thr 1665 1670 1675 1680 78 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Thr Ser Cys Gly Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Ser Ala Ala 1685 1690 1695

Cys Arg Ala Ala Lys Leu Gin Asp Cys Thr Met Leu Vai Asn Ala Ala 1700 1705 1710

Gly Leu Vai Vai Ile Cys Glu Ser Ala Gly Thr Gin Glu Asp Ala Ala 1715 1720 1725

Ser Leu Arg Vai Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro 1730 1735 1740

Gly Asp Pro Pro Gin Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys 1745 1750 1755 1760

Ser Ser Asn Vai Ser Vai Ala His Asp Ala Ser Gly Lys Arg Vai Tyr 1765 1770 1775

Tyr Leu Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu 1780 1785 1790

Thr Ala Arg His Thr Pro Vai Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Met 1795 1800 1805

Tyr Ala Pro Thr Leu Trp Ala Arg Met Ile Leu Met Thr His Phe Phe 1810 1815 1820

Ser Ile Leu Leu Ala Gin Glu Gin Leu Glu Lys Ala Leu Asp Cys Gin 1825 1830 1835 1840

Ile Tyr Gly Ala Cys Tyr Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro Gin Ile 1845 1850 1855

Ile Glu Arg Leu His Gly Leu Ser Ala Phe Ser Leu His Ser Tyr Ser 1860 1865 1870

Pro Gly Glu Ile Asn Arg Vai Ala Ser Cys Leu Arg Lys Leu Gly Vai 1875 1880 1885

Pro Pro Leu Arg Vai Trp Arg His Arg Ala Arg Ser Vai Arg Ala Arg 1890 1895 1900

Leu Leu Ser Gin Gly Gly Arg Ala Ala Thr Cys Gly Lys Tyr Leu Phe 1905 1910 1915 1920

Asn Trp Ala Vai Lys Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Ile Pro Ala Ala 1925 1930 1935

Ser Gin Leu Asp Leu Ser Gly Trp Phe Vai Ala Gly Tyr Ser Gly Gly 1940 1945 1950

Asp Ile Tyr His Ser Leu Ser Arg Ala Arg Pro Arg Trp Phe Met Leu 1955 1960 1965

Cys Leu Leu Leu Leu Ser Vai Gly Vai Gly Ile Tyr Leu Leu Pro Asn 1970 1975 1980

Arg 1985 <210> 2

<211> 5965 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de ADNc não optimizada que codifica SEQ. ID. NO. 1 <400> 2 gccaccatgg atcactagcc accgcaacac ggtgctggct gtggaccagg acctgtggca cggcggggcg tcttcgggtg gtatgcaccc actatgcggt cgcccatcac ttacaggccg aatccttcct caaagacctt acctcgtcgg gctcagacct acagtagggg gtccactgct ggggggttgc ctccggtctt ggcctactcc ggacaagaac ggcgacctgc agccggccca ctggcaggcg ttacttggtc gagcctgctc ctgcccttcg gaaggcggtg cacggacaac caacagacgc caggtcgagg gtcaacggcg aaggggccaa ccccccgggg acgagacatg tcccccaggc gggcacgctg gactttgtgc tcatcccccc ggggcctact gagaggttca tgtgttggac tcacccagat cgcgttcctt ctgacgtcat ctgtctccta tgggcatctt ccgtagagtc cggccgtacc tggttgcatc ggtggtttcc cgtttaccat gtacactaat gacaccatgc tccggtgcgc cttgaagggc ccgggctgcc catggaaact gcagtcattt 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 79 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ caagtggccc tatgcagccc tttggggcgt accattacca ggttgctctg actacaatct gtcgtgctcg gaggtggccc gccatcaggg gccgcaaagc tccgtcatac tatacgggcg ttcagcttgg cgctcgcagc ccgggagaac ggctgtgctt aacacaccag ggcctcaccc ccctacctgg tgggatcaaa ttgctgtaca tacatcatgg ggcggagtcc ggtaggatta gagttcgatg ctcgccgagc gaggctgctg cacatgtgga aaccccgcaa caaagtaccc agcgccgctt cttgggaagg gtggccttca cctgccatcc cgacacgtgg tcgcggggta gttactcaga attaatgaag atatgcacgg ccgggagtcc atcatgcaaa atgaggatcg gcatacacca cgggtggccg ggcatgacca gaggtggacg gaggttacat cccgaaccgg gaaacggcta agccagttgt gctgacctca gtggagtcgg gatgagaggg gcgatgccca ccggactacg ataccacctc ttagcggagc acggcgaccg tcgtactcct tcttggtcta acatggacag acctacacgc aagggtacaa atatgtctaa caggcgcccc ggggcgctta tgggcatcgg ccaccgctac tgtctaatac ggggaaggca tgtcaggcct caactatcgg actttgactc atcccacctt ggcggggtag ggccctcggg ggtacgagct ggttgcccgt acatagatgc tagcatacca tgtggaagtg ggctgggagc catgcatgtc ttgcagctct tcttgtccgg aaatggaaga aattcaagca ctcccgtggt atttcatcag tagcatcatt tcctgtttaa cggctttcgt tgcttgtgga aggtcatgag tctctcctgg gtccgggaga atcatgtttc tcctctccag actgctccac tgttgactga cttttttctc ccacctgccc tcgggcctaa cgggcccctg ctgaggagta ctgacaacgt gagtgcggtt tccaggtcgg atgtagcagt agcgtaggtt ctgcgccttc tcgaggccaa agaacaaggt aagtatccgt tctgggcgcg tccctccggt cacggagaaa tcgctactaa cccttcctga ccatgccccc ccgtgagcga gcgccttgat tcccactggc ggtgctcgtc ggcacacggt cgtcacatac tgacatcata cacagtcctg gcctccggga tggagagatc tctcattttc cggaatcaac agacgtcgtt agtgatcgac caccattgag gactggcagg catgttcgat cacccccgcc ttgccaggac acacttcttg agccacggtg tctcatacgg cgtccaaaat ggctgacctg ggccgcgtat gaggccggct gtgcgcctcg gaaagcgctc ggagtccaag cgggatacag gatggcattc catcttgggg gggcgccggc cattctggcg cggcgagatg cgccctggtc gggggctgtg ccccacgcac ccttaccatc accgtgttcc cttcaagacc gtgccaacgc atgtggagca gacctgcagc cacaccctct cgtggaggtc aaagtgccca gcacaggtac gctcaaccaa gctcacttcc ggccaggggg cttgaaggcg cctcctgtgg ggtagtcctg tccggcggag cccggattac ggtgcacggg gaggacggtt gaccttcggc ccaggcctcc ccttgagggg ggaagctagt cacgccatgc agcggcaaga ctcaatccgt attgacccca tctacctatg atatgtgatg gaccaagcgg tcggtcaccg cccttctatg tgtcattcca gctgtggcgt gtcgtggcaa tgtaacacat acgacgaccg ggtaggagag tcctcggtcc gagacctcgg cacctggagt tcccagacca tgcgccaggg ctgaaaccta gaggtcaccc gaggtcgtca tgcctgacaa attgttcccg cacctccctt gggttactgc tggcgagccc tacttagcag acagcctcta gggtgggtgg atcgccggtg ggttatggag ccctccaccg gtcggggtcg cagtggatga tatgtgcctg actcagctgc ggctcgtggc tggctccagt gggtacaagg cagatcaccg aacacgtggc ccagcgccaa acgcgggtgg tgccaggttc gctccggcgt tacctggttg atgctcaccg tctcccccct acatgcacta cggcaggaga gactctttcg atcctgcgga aaccctccac tgcccgttgc gtcctaacag agctccgaat gacgacggtg gaaccggggg gaggatgtcg gctgcggagg gtactaaagt ccgttgccgc acatcagaac gcaagtttct agtgccattc agacggctgg tgccacaccc gcaaagccat agaagaagtg attaccgggg cagacgctct gtgtcaccca tgcctcaaga gcatctacag tgtgtgagtg ttaggttgcg tctgggagag agcaggcagg ctcaggcccc cgctgcacgg tcacccaccc ctagcacctg caggcagtgt acagggagtt acatcgagca aaacagccac ttgagacatt gcttatccac tcaccagccc ctgcccaact cggctgttgg caggagtggc aggacctggt tgtgtgcagc accggctgat agagcgacgc tgaaaaggct taagggatgt ccaagctcct gagtctggcg gacatgtcaa atggaacatt actattctag gggatttcca cggctcctga gcaggcctct ggtcacagct acccctccca ccttggccag cccaccatgt tgggcgggaa acccgcttcg aatccaagaa tgttagagtc cacctatcaa agtcctccgt catcggccgt acaaaggatc accccgatct tctgctgctc aaagcaagct gccggctgca taccttaggg tggggtaagg tgccgatggt aactgactcg agcgcggctt aaacatcgag ccccattgaa cgacgagctc gctcgatgtg gatgacgggc gacagtcgac cgcagtgtcg gtttgtgact ctatgacgcg ggcctacctg tgtcttcaca agacaacttc acctccatca gccaacaccc cataaccaaa ggtgctggtg ggtcattgtg tctctaccag gggaatgcag caaacaagcg ctgggcgaag tctgcctggg gctcaccacc cgcccccccc cagcataggc cggcgcgctc caatctactt aatactgcgt agcgttcgcc cgcagcgcgt ccaccagtgg ttgggactgg gccgcagcta gggagacggc aaacggttcc ccccatcaac ggcgctgtgg ctacgtgacg attcttcacg cctacgggag accatgcgag catcacagca ctcttcagct ctctccggac catcacccgc agcggaggag gttccccgca ctggaaggac ggcccctcca gtcttctgcc cgacagcggc cgacgttgag cagtgacggg aatgtcctac gcccatcaac 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 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<210> 3 <211> 5965 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> ADNc optimizado que codifica SEQ ID NO: 1 <400> 3 gccaccatgg cccccatcac cgcctacagc cagcagaccc gcggcctgct gggctgcatc 60 atcaccagcc tgaccggccg cgacaagaac caggtggagg gcgaggtgca ggtggtgagc 120 accgccaccc agagcttcct ggccacctgc gtgaacggcg tgtgctggac cgtgtaccac 180 ggcgccggca gcaagaccct ggccggcccc aagggcccca tcacccagat gtacaccaac 240 gtggaccagg acctggtggg ctggcaggcc ccccccggcg cccgcagcct gaccccctgc 300 acctgcggca gcagcgacct gtacctggtg acccgccacg ccgacgtgat ccccgtgcgc 360 cgccgcggcg acagccgcgg cagcctgctg agcccccgcc ccgtgagcta cctgaagggc 420 agcagcggcg gccccctgct gtgccccagc ggccacgccg tgggcatctt ccgcgccgcc 480 gtgtgcaccc gcggcgtggc caaggccgtg gacttcgtgc ccgtggagag catggagacc 540 accatgcgca gccccgtgtt caccgacaac agcagccccc ccgccgtgcc ccagagcttc 600 caggtggccc acctgcacgc ccccaccggc agcggcaaga gcaccaaggt gcccgccgcc 660 tacgccgccc agggctacaa ggtgctggtg ctgaacccca gcgtggccgc caccctgggc 720 ttcggcgcct acatgagcaa ggcccacggc atcgacccca acatccgcac cggcgtgcgc 780 accatcacca ccggcgcccc cgtgacctac agcacctacg gcaagttcct ggccgacggc 840 ggctgcagcg gcggcgccta cgacatcatc atctgcgacg agtgccacag caccgacagc 900 accaccatcc tgggcatcgg caccgtgctg gaccaggccg agaccgccgg cgcccgcctg 960 gtggtgctgg ccaccgccac cccccccggc agcgtgaccg tgccccaccc caacatcgag 1020 gaggtggccc tgagcaacac cggcgagatc cccttctacg gcaaggccat ccccatcgag 1080 gccatccgcg gcggccgcca cctgatcttc tgccacagca agaagaagtg cgacgagctg 1140 gccgccaagc tgagcggcct gggcatcaac gccgtggcct actaccgcgg cctggacgtg 1200 81 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ agcgtgatcc tacaccggcg ttcagcctgg cgcagccagc cccggcgagc ggctgcgcct aacacccccg ggcctgaccc ccctacctgg tgggaccaga ctgctgtacc tacatcatgg ggcggcgtgc ggccgcatca gagttcgacg ctggccgagc gaggccgccg cacatgtgga aaccccgcca cagagcaccc agcgccgcca ctgggcaagg gtggccttca cccgccatcc cgccacgtgg agccgcggca gtgacccaga atcaacgagg atctgcaccg cccggcgtgc atcatgcaga atgcgcatcg gcctacacca cgcgtggccg ggcatgacca gaggtggacg gaggtgacct cccgagcccg gagaccgcca agccagctga gccgacctga gtggagagcg gacgagcgcg gccatgccca cccgactacg atcccccccc ctggccgagc accgccaccg agctacagca agctggagca acctggaccg gccctgagca gccggcctgc cgcgacgtgc gtggaggagg gccaaggacg gacctgctgg ttctgcgtgc ctgggcgtgc gtggtgatgg gtgaacacct ccaccatcgg acttcgacag accccacctt gccgcggccg gccccagcgg ggtacgagct gcctgcccgt acatcgacgc tggcctacca tgtggaagtg gcctgggcgc cctgcatgag tggccgccct tcctgagcgg agatggagga agttcaagca cccccgtggt acttcatcag tcgccagcct tgctgttcaa gcgccttcgt tgctggtgga aggtgatgag tgagccccgg gccccggcga accacgtgag tcctgagcag actgcagcac tgctgaccga ccttcttcag ccacctgccc tgggccccaa ccggcccctg ccgaggagta ccgacaacgt gcgtgcgcct tccaggtggg acgtggccgt agcgccgcct gcgcccccag tcgaggccaa agaacaaggt aggtgagcgt tctgggcccg tgccccccgt cccgccgcaa tggccaccaa ccctgcccga gcatgccccc ccgtgagcga gcgccctgat acagcctgct gccagaagaa tgaaggagat cctgcaagct tgcgcaacct aggacaccgt agcccgagaa gcgtgtgcga gcagcagcta ggaagagcaa cgacgtggtg cgtgatcgac caccatcgag caccggccgc catgttcgac gacccccgcc gtgccaggac ccacttcctg ggccaccgtg cctgatccgc cgtgcagaac cgccgacctg ggccgcctac ccgccccgcc gtgcgccagc gaaggccctg ggagagcaag cggcatccag gatggccttc catcctgggc gggcgccggc catcctggcc cggcgagatg cgccctggtg gggcgccgtg ccccacccac cctgaccatc cccctgcagc cttcaagacc ctgccagcgc ctgcggcgcc gacctgcagc cacccccagc cgtggaggtg gaagtgcccc gcaccgctac cctgaaccag gctgaccagc ggcccgcggc cctgaaggcc cctgctgtgg ggtggtgctg gcccgccgag ccccgactac ggtgcacggc gcgcaccgtg gaccttcggc ccaggccagc cctggagggc ggaggccagc caccccctgc gcgccaccac ggtgaccttc gaaggccaag gacccccccc gagcagcaag gacccccatc gggcggccgc gaagatggcc cggcttccag gaagaacccc gtggtggcca tgcaacacct accaccaccg ggccgccgcg agcagcgtgc gagaccagcg cacctggagt agccagacca tgcgcccgcg ctgaagccca gaggtgaccc gaggtggtga tgcctgacca atcgtgcccg cacctgccct ggcctgctgc tggcgcgccc tacctggccg accgccagca ggctgggtgg atcgccggcg ggctacggcg cccagcaccg gtgggcgtgg cagtggatga tacgtgcccg acccagctgc ggcagctggc tggctgcaga ggctacaagg cagatcaccg aacacctggc cccgccccca acccgcgtgg tgccaggtgc gcccccgcct tacctggtgg atgctgaccg agccccccca acctgcacca cgccaggaga gacagcttcg atcctgcgca aacccccccc tgccccctgc gtgctgaccg agcagcgaga gacgacggcg gagcccggcg gaggacgtgg gccgccgagg aacatggtgt gaccgcctgc gccagcaccg cacagcgcca gccgtgaacc gacaccacca aagcccgccc ctgtacgacg tacagccccg atgggcttca ccgacgccct gcgtgaccca tgccccagga gcatctaccg tgtgcgagtg tgcgcctgcg tctgggagag agcaggccgg cccaggcccc ccctgcacgg tgacccaccc ccagcacctg ccggcagcgt accgcgagtt acatcgagca agaccgccac tggagacctt gcctgagcac tcaccagccc ccgcccagct ccgccgtggg ccggcgtggc aggacctggt tgtgcgccgc accgcctgat agagcgacgc tgaagcgcct tgcgcgacgt gcaagctgct gcgtgtggcg gccacgtgaa acggcacctt actacagccg gcgacttcca ccgcccccga gccgccccct gcagccagct accccagcca gcctggccag cccaccacgt tgggcggcaa accccctgcg agagcaagaa tgctggagag cccccatcaa agagcagcgt gcagcgccgt acaagggcag accccgacct tgtgctgcag agagcaagct acgccaccac aggtgctgga tgaaggccaa agagcaagtt acatccacag tcatggccaa gcctgatcgt tggtgagcac gccagcgcgt gctacgacac gatgaccggc gaccgtggac cgccgtgagc cttcgtgacc ctacgacgcc cgcctacctg cgtgttcacc cgacaacttc cccccccagc ccccaccccc catcaccaag ggtgctggtg ggtgatcgtg cctgtaccag gggcatgcag caagcaggcc ctgggccaag cctgcccggc cctgaccacc ggcccccccc cagcatcggc cggcgccctg gaacctgctg catcctgcgc cgccttcgcc cgccgcccgc gcaccagtgg gtgggactgg gccccagctg cggcgacggc gaacggcagc ccccatcaac cgccctgtgg ctacgtgacc gttcttcacc gctgcgcgag gccctgcgag catcaccgcc cagcagcgcc gagccccgac catcacccgc cgccgaggag gttccccgcc ctggaaggac ggcccccccc gagcagcgcc ggacagcggc cgacgtggag gagcgacggc catgagctac gcccatcaac cagccgcagc cgaccactac gctgctgagc cggctacggc cgtgtggaag gaacgaggtg gttccccgac cctgccccag ggagttcctg ccgctgcttc 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 82 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ gacagcaccg ctggcccccg cccctgacca ctgaccacca gccgccaagc gagagcgccg cgctacagcg agctgcagca acccgcgacc gtgaacagct 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ccacaccccc ccgcatgatc ggccctggac gatcatcgag gatcaaccgc ccaccgcgcc cggcaagtac cgccagccag ccacagcctg gggcgtgggc 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 5965

<210> 4 <211> 37090 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> ácido nucleico MRKAd6-NSmut <400> 4 catcatcaat ttgtgacgtg gatgttgcaa gtgtgcgccg taaatttggg agtgaaatct gactttgacc cgggtcaaag catatcataa gattattgac tggagttccg cccgcccatt attgacgtca atcatatgcc atgcccagta tcgctattac actcacgggg aaaatcaacg gtaggcgtgt cctggagacg tccgcggccg accatggcgc actagcctta gcaacacaat gctggctcaa gaccaggacc tgtggcagct cggggcgaca tcgggtggtc tgcacccggg aatatacctt gcgcggggcg gtgtggcgga gtgtacacag cgtaaccgag gaataatttt gtttacgtgg ttggcgtttt tatgtacatt tagttattaa cgttacataa gacgtcaata atgggtggag aagtacgccc catgacctta catggtgatg atttccaagt ggactttcca acggtgggag ccatccacgc ggaacggtgc ccatcacggc caggccggga ccttcctggc agaccttagc tcgtcggctg cagaccttta gtagggggag cactgctctg gggttgcgaa attttggatt tgggaacggg acacatgtaa gaagtgacaa taagatttgg gtgttactca agactcgccc attattatag tatattggct tagtaatcaa cttacggtaa atgacgtatg tatttacggt cctattgacg tgggactttc cggttttggc ctccacccca aaatgtcgta gtctatataa tgttttgacc attggaacgc ctactcccaa caagaaccag gacctgcgtc cggcccaaag gcaggcgccc cttggtcacg cctgctctcc cccttcgggg ggcggtggac gaagccaata gcgggtgacg gcgacggatg ttttcgcgcg ccattttcgc tagcgcgtaa aggtgttttt gcggccgcga catgtccaac ttacggggtc atggcccgcc ttcccatagt aaactgccca tcaatgacgg ctacttggca agtacatcaa ttgacgtcaa acaactccgc gcagagctcg tccatagaag ggattccccg cagacgcggg gtcgagggag aacggcgtgt gggccaatca cccggggcgc agacatgctg cccaggcctg cacgctgtgg tttgtgcccg tgataatgag tagtagtgtg tggcaaaagt gttttaggcg gggaaaactg tatttgtcta ctcaggtgtt tccattgcat attaccgcca attagttcat tggctgaccg aacgccaata cttggcagta taaatggccc gtacatctac tgggcgtgga tgggagtttg cccattgacg tttagtgaac acaccgggac tgccaagagt gcctacttgg aggttcaggt gttggaccgt cccagatgta gttccttgac acgtcattcc tctcctactt gcatcttccg tagagtccat ggggtggagt gcggaagtgt gacgtttttg gatgttgtag aataagagga gggccgcggg ttccgcgttc acgttgtatc tgttgacatt agcccatata cccaacgacc gggactttcc catcaagtgt gcctggcatt gtattagtca tagcggtttg ttttggcacc caaatgggcg cgtcagatcg cgatccagcc gagatctgcc ttgcatcatc 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gac aag aac cag gtc gag gga 96 Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gin Vai Glu Gly 20 25 30 gag gtt cag gtg gtt tcc acc gea aca caa tcc ttc ctg gcg acc tgc 144 Glu Vai Gin Vai Vai Ser Thr Ala Thr Gin Ser Phe Leu Ala Thr Cys 35 40 45 gtc aac ggc gtg tgt tgg acc gtt tac cat ggt gct ggc tea aag acc 192 Vai Asn Gly Vai Cys Trp Thr Vai Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr 50 55 60 tta gcc ggc cca aag ggg cca ate acc cag atg tac act aat gtg gac 240 Leu Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gin Met Tyr Thr Asn Vai Asp 65 70 75 80 cag gac ctc gtc ggc tgg cag gcg ccc ccc ggg gcg cgt tcc ttg aca 288 Gin Asp Leu Vai Gly Trp Gin Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Leu Thr 85 90 95 cca tgc acc tgt ggc age tea gac ctt tac ttg gtc acg aga cat gct 336 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Vai Thr Arg His Ala 100 105 110 gac gtc att ccg gtg ege cgg cgg ggc gac agt agg ggg age ctg ctc 384 Asp Vai Ile Pro Vai Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu 115 120 125 tcc ccc agg cct gtc tcc tac ttg aag ggc tet teg ggt ggt cca ctg 432 Ser Pro Arg Pro Vai Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu 130 135 140 ctc tgc cct teg ggg cac gct gtg ggc ate ttc cgg gct gcc gta tgc 480 Leu Cys Pro Ser Gly His Ala Vai Gly Ile Phe Arg Ala Ala Vai Cys 145 150 155 160 acc cgg ggg gtt gcg aag gcg gtg gac ttt gtg ccc gta gag tcc atg 528 Thr Arg Gly Vai Ala Lys Ala Vai Asp Phe Vai Pro Vai Glu Ser Met 165 170 175 gaa act act atg cgg tet ccg gtc ttc acg gac aac tea tcc ccc ccg 576 Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Vai Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro 180 185 190 gcc gta ccg cag tea ttt caa gtg gcc cac cta cac gct ccc act ggc 624 Ala Vai Pro Gin Ser Phe Gin Vai Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly 195 200 205 age ggc aag agt act aaa gtg ccg gct gea tat gea gcc caa ggg tac 672 Ser Gly Lys Ser Thr Lys Vai Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gin Gly Tyr 210 215 220 aag gtg ctc gtc ctc aat ccg tcc gtt gcc gct acc tta ggg ttt ggg 720 Lys Vai Leu Vai Leu Asn Pro Ser Vai Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly 225 230 235 240 gcg tat atg tet aag gea cac ggt att gac ccc aac ate aga act ggg 768 Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly 245 250 255 94 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ gta agg acc att acc aca ggc gee ccc gtc aca tac tet acc tat ggc 816 Vai Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ala Pro Vai Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly 260 265 270 aag ttt ctt gee gat ggt ggt tgc tet ggg ggc gct tat gac ate ata 864 Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile 275 280 285 ata tgt gat gag tgc cat tea act gac teg act aca ate ttg ggc ate 912 Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ser Thr Thr Ile Leu Gly Ile 290 295 300 ggc aca gtc ctg gac caa gcg gag acg gct gga gcg cgg ctt gtc gtg 960 Gly Thr Vai Leu Asp Gin Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Vai Vai 305 310 315 320 ctc gee acc gct acg cct ccg gga teg gtc acc gtg cca cac cca aac 1008 Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Vai Thr Vai Pro His Pro Asn 325 330 335 ate gag gag gtg gee ctg tet aat act gga gag ate ccc ttc tat ggc 1056 Ile Glu Glu Vai Ala Leu Ser Asn Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly 340 345 350 aaa gee ate ccc att gaa gee ate agg ggg gga agg cat ctc att ttc 1104 Lys Ala Ile Pro Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gly Arg His Leu Ile Phe 355 360 365 tgt cat tcc aag aag aag tgc gac gag ctc gee gea aag ctg tea ggc 1152 Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Ser Gly 370 375 380 ctc gga ate aac gct gtg gcg tat tac cgg ggg ctc gat gtg tcc gtc 1200 Leu Gly Ile Asn Ala Vai Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Vai Ser Vai 385 390 395 400 ata cca act ate gga gac gtc gtt gtc gtg gea aca gac gct ctg atg 1248 Ile Pro Thr Ile Gly Asp Vai Vai Vai Vai Ala Thr Asp Ala Leu Met 405 410 415 acg ggc tat acg ggc gac ttt gac tea gtg ate gac tgt aac aca tgt 1296 Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Vai Ile Asp Cys Asn Thr Cys 420 425 430 gtc acc cag aca gtc gac ttc age ttg gat ccc acc ttc acc att gag 1344 Vai Thr Gin Thr Vai Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu 435 440 445 acg acg acc gtg cct caa gac gea gtg teg ege teg cag cgg cgg ggt 1392 Thr Thr Thr Vai Pro Gin Asp Ala Vai Ser Arg Ser Gin Arg Arg Gly 450 455 460 agg act ggc agg ggt agg aga ggc ate tac agg ttt gtg act ccg gga 1440 Arg Thr Gly Arg Gly Arg Arg Gly Ile Tyr Arg Phe Vai Thr Pro Gly 465 470 475 480 gaa cgg ccc teg ggc atg ttc gat tcc teg gtc ctg tgt gag tgc tat 1488 Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Vai Leu Cys Glu Cys Tyr 485 490 495 95 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ gac gcg ggc tgt gct tgg tac gag ctc acc ccc gcc gag acc tcg gtt Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Ser Val 500 505 510 agg ttg cgg gcc tac ctg aac aca cca ggg ttg ccc gtt tgc cag gac Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gin Asp 515 520 525 cac ctg gag ttc tgg gag agt gtc ttc aca ggc ctc acc cac ata gat His Leu Glu Phe Trp Glu Ser Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp 530 535 540 gca cac ttc ttg tcc cag acc aag cag gca gga gac aac ttc ccc tac Ala His Phe Leu Ser Gin Thr Lys Gin Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr 545 550 555 560 ctg gta gca tac caa gcc acg gtg tgc gcc agg gct cag gcc cca cct Leu Vai Ala Tyr Gin Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gin Ala Pro Pro 565 570 575 cca tca tgg gat caa atg tgg aag tgt ctc ata cgg ctg aaa cct acg Pro Ser Trp Asp Gin Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr 580 585 590 ctg cac ggg cca aca ccc ttg ctg tac agg ctg gga gcc gtc caa aat Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gin Asn 595 600 605 gag gtc acc ctc acc cac ccc ata acc aaa tac ate atg gca tgc atg Glu Vai Thr Leu Thr His Pro Ile Thr Lys Tyr Ile Met Ala Cys Met 610 615 620 tcg gct gac ctg gag gtc gtc act age acc tgg gtg ctg gtg ggc gga Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly 625 630 635 640 gtc ctt gca gct ctg gcc gcg tat tgc ctg aca aca ggc agt gtg gtc Vai Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Thr Thr Gly Ser Val Val 645 650 655 att gtg ggt agg att ate ttg tcc ggg agg ccg gct att gtt ccc gac Ile Vai Gly Arg Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala Ile Val Pro Asp 660 665 670 agg gag ttt ctc tac cag gag ttc gat gaa atg gaa gag tgc gcc tcg Arg Glu Phe Leu Tyr Gin Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser 675 680 685 cac ctc cct tac ate gag cag gga atg cag ctc gcc gag caa ttc aag His Leu Pro Tyr Ile Glu Gin Gly Met Gin Leu Ala Glu Gin Phe Lys 690 695 700 cag aaa gcg ctc ggg tta ctg caa aca gcc acc aaa caa gcg gag gct Gin Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gin Thr Ala Thr Lys Gin Ala Glu Ala 705 710 715 720 gct gct ccc gtg gtg gag tcc aag tgg cga gcc ctt gag aca ttc tgg Ala Ala Pro Vai Val Glu Ser Lys Trp Arg Ala Leu Glu Thr Phe Trp 725 730 735 1536 1584 1632 1680 1728 1776 1824 1872 1920 1968 2016 2064 2112 2160 2208 96 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ gcg aag cac atg tgg aat ttc ate age ggg ata cag tac tta gea ggc 2256 Ala Lys His Met Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gin Tyr Leu Ala Gly 740 745 750 tta tcc act ctg cct ggg aac ccc gea ata gea tea ttg atg gea ttc 2304 Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met Ala Phe 755 760 765 aca gee tet ate acc age ccg etc acc acc caa agt acc etc ctg ttt 2352 Thr Ala Ser Ile Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gin Ser Thr Leu Leu Phe 770 775 780 aac ate ttg ggg ggg tgg gtg gct gee caa etc gee ccc ccc age gee 2400 Asn Ile Leu Gly Gly Trp Vai Ala Ala Gin Leu Ala Pro Pro Ser Ala 785 790 795 800 gct teg gct ttc gtg ggc gee ggc ate gee ggt gcg gct gtt ggc age 2448 Ala Ser Ala Phe Vai Gly Ala Gly Ile Ala Gly Ala Ala Vai Gly Ser 805 810 815 ata ggc ctt ggg aag gtg ctt gtg gac att ctg gcg ggt tat gga gea 2496 Ile Gly Leu Gly Lys Vai Leu Vai Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala 820 825 830 gga gtg gee ggc gcg etc gtg gee ttc aag gtc atg age ggc gag atg 2544 Gly Vai Ala Gly Ala Leu Vai Ala Phe Lys Vai Met Ser Gly Glu Met 835 840 845 ccc tcc acc gag gac ctg gtc aat cta ctt cct gee ate etc tet cct 2592 Pro Ser Thr Glu Asp Leu Vai Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro 850 855 860 ggc gee ctg gtc gtc ggg gtc gtg tgt gea gea ata ctg cgt cga cac 2640 Gly Ala Leu Vai Vai Gly Vai Vai Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His 865 870 875 880 gtg ggt ccg gga gag ggg gct gtg cag tgg atg aac cgg ctg ata gcg 2688 Vai Gly Pro Gly Glu Gly Ala Vai Gin Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala 885 890 895 ttc gee teg cgg ggt aat cat gtt tcc ccc acg cac tat gtg cct gag 2736 Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Vai Ser Pro Thr His Tyr Vai Pro Glu 900 905 910 age gac gee gea gcg cgt gtt act cag ate etc tcc age ctt acc ate 2784 Ser Asp Ala Ala Ala Arg Vai Thr Gin Ile Leu Ser Ser Leu Thr Ile 915 920 925 act cag ctg ctg aaa agg etc cac cag tgg att aat gaa gac tgc tcc 2832 Thr Gin Leu Leu Lys Arg Leu His Gin Trp Ile Asn Glu Asp Cys Ser 930 935 940 aca ccg tgt tcc ggc teg tgg cta agg gat gtt tgg gac tgg ata tgc 2880 Thr Pro Cys Ser Gly Ser Trp Leu Arg Asp Vai Trp Asp Trp Ile Cys 945 950 955 960 acg gtg ttg act gac ttc aag acc tgg etc cag tcc aag etc ctg ccg 2928 Thr Vai Leu Thr Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gin Ser Lys Leu Leu Pro 965 970 975 97 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ cag cta ccg gga gtc cct ttt ttc teg tgc caa ege ggg tac aag gga 2976 Gin Leu Pro Gly Vai Pro Phe Phe Ser Cys Gin Arg Gly Tyr Lys Gly 980 985 990 gtc tgg cgg gga gac ggc ate atg caa acc acc tgc cca tgt gga gea 3024 Vai Trp Arg Gly Asp Gly Ile Met Gin Thr Thr Cys Pro Cys Gly Ala 995 1000 1005 cag ate acc gga cat gtc aaa aac ggt tcc atg agg ate gtc ggg cct 3072 Gin Ile Thr Gly His Vai Lys Asn Gly Ser Met Arg Ile Vai Gly Pro 1010 1015 1020 aag acc tgc age aac acg tgg cat gga aca ttc CCC ate aac gea tac 3120 Lys Thr Cys Ser Asn Thr Trp His Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr 1025 1030 1035 1040 acc acg ggc ccc tgc aca ccc tct cca gcg cca aac tat tct agg gcg 3168 Thr Thr Gly Pro Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Ser Arg Ala 1045 1050 1055 ctg tgg cgg gtg gee gct gag gag tac gtg gag gtc acg cgg gtg ggg 3216 Leu Trp Arg Vai Ala Ala Glu Glu Tyr Vai Glu Vai Thr Arg Vai Gly 1060 1065 1070 gat ttc cac tac gtg acg ggc atg acc act gac aac gta aag tgc cca 3264 Asp Phe His Tyr Vai Thr Gly Met Thr Thr Asp Asn Vai Lys Cys Pro 1075 1080 1085 tgc cag gtt ccg gct cct gaa ttc ttc acg gag gtg gac gga gtg cgg 3312 Cys Gin Vai Pro Ala Pro Glu Phe Phe Thr Glu Vai Asp Gly Val Arg 1090 1095 1100 ttg cac agg tac gct ccg gcg tgc agg cct ctc cta cgg gag gag gtt 3360 Leu His Arg Tyr Ala Pro Ala Cys Arg Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val 1105 1110 1115 1120 aca ttc cag gtc ggg ctc aac caa tac ctg gtt ggg tea cag cta cca 3408 Thr Phe Gin Vai Gly Leu Asn Gin Tyr Leu Vai Gly Ser Gin Leu Pro 1125 1130 1135 tgc gag ccc gaa ccg gat gta gea gtg ctc act tcc atg ctc acc gac 3456 Cys Glu Pro Glu Pro Asp Vai Ala Vai Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp 1140 1145 1150 ccc tcc cac ate aca gea gaa acg gct aag cgt agg ttg gee agg ggg 3504 Pro Ser His Ile Thr Ala Glu Thr Ala Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly 1155 1160 1165 tct ccc CCC tcc ttg gee age tct tea gct age cag ttg tct gcg cct 3552 Ser Pro Pro Ser Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gin Leu Ser Ala Pro 1170 1175 1180 tcc ttg aag gcg aca tgc act acc cac cat gtc tct ccg gac gct gac 3600 Ser Leu Lys Ala Thr Cys Thr Thr His His Vai Ser Pro Asp Ala Asp 1185 1190 1195 1200 ctc ate gag gee aac ctc ctg tgg cgg cag gag atg ggc ggg aac ate 3648 Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Gin Glu Met Gly Gly Asn Ile 1205 1210 1215 98 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ acc ege gtg gag teg gag aac aag gtg gta gtc ctg gac tet ttc gac Thr Arg Vai Glu Ser Glu Asn Lys Vai Vai Vai Leu Asp Ser Phe Asp 1220 1225 1230 ccg ctt cga gcg gag gag gat gag agg gaa gta tcc gtt ccg gcg gag Pro Leu Arg Ala Glu Glu Asp Glu Arg Glu Vai Ser Vai Pro Ala Glu 1235 1240 1245 ate ctg cgg aaa tcc aag aag ttc ccc gea gcg atg CCC ate tgg gcg Ile Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ala Ala Met Pro Ile Trp Ala 1250 1255 1260 ege ccg gat tac aac cct cca ctg tta gag tcc tgg aag gac ccg gac Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Leu Glu Ser Trp Lys Asp Pro Asp 1265 1270 1275 1280 tac gtc cct ccg gtg gtg cac ggg tgc ccg ttg cca cct ate aag gee Tyr Vai Pro Pro Vai Vai His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Ile Lys Ala 1285 1290 1295 cct cca ata cca cct cca cgg aga aag agg acg gtt gtc cta aca gag Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg Lys Arg Thr Vai Vai Leu Thr Glu 1300 1305 1310 tcc tcc gtg tet tet gee tta gcg gag etc gct act aag acc ttc ggc Ser Ser Vai Ser Ser Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Thr Phe Gly 1315 1320 1325 age tcc gaa tea teg gee gtc gac age ggc acg gcg acc gee ctt cct Ser Ser Glu Ser Ser Ala Vai Asp Ser Gly Thr Ala Thr Ala Leu Pro 1330 1335 1340 gac cag gee tcc gac gac ggt gac aaa gga tcc gac gtt gag teg tac Asp Gin Ala Ser Asp Asp Gly Asp Lys Gly Ser Asp Vai Glu Ser Tyr 1345 1350 1355 1360 tcc tcc atg ccc ccc ctt gag ggg gaa ccg ggg gac ccc gat etc agt Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser 1365 1370 1375 gac ggg tet tgg tet acc gtg age gag gaa gct agt gag gat gtc gtc Asp Gly Ser Trp Ser Thr Vai Ser Glu Glu Ala Ser Glu Asp Vai Vai 1380 1385 1390 tgc tgc tea atg tcc tac aca tgg aca ggc gee ttg ate acg cca tgc Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys 1395 1400 1405 gct gcg gag gaa age aag ctg CCC ate aac gcg ttg age aac tet ttg Ala Ala Glu Glu Ser Lys Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu 1410 1415 1420 ctg ege cac cat aac atg gtt tat gee aca aca tet ege age gea ggc Leu Arg His His Asn Met Vai Tyr Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Gly 1425 1430 1435 1440 ctg cgg cag aag aag gtc acc ttt gac aga ctg caa gtc ctg gac gac Leu Arg Gin Lys Lys Vai Thr Phe Asp Arg Leu Gin Vai Leu Asp Asp 3696 3744 3792 3840 3888 3936 3984 4032 4080 4128 4176 4224 4272 4320 4368 1445 1450 1455 99 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ cac tac cgg gac gtg ctc aag gag atg aag gcg aag gcg tcc aca gtt 4416 His Tyr Arg Asp Vai Leu Lys Glu Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Vai 1460 1465 1470 aag gct aaa ctc cta tcc gta gag gaa gee tgc aag ctg acg ccc cca 4464 Lys Ala Lys Leu Leu Ser Vai Glu Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro 1475 1480 1485 cat tcg gee aaa tcc aag ttt ggc tat ggg gea aag gac gtc cgg aac 4512 His Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Vai Arg Asn 1490 1495 1500 cta tcc age aag gee gtt aac cac ate cac tcc gtg tgg aag gac ttg 4560 Leu Ser Ser Lys Ala Vai Asn His Ile His Ser Vai Trp Lys Asp Leu 1505 1510 1515 1520 ctg gaa gac act gtg aca cca att gac acc acc ate atg gea aaa aat 4608 Leu Glu Asp Thr Vai Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn 1525 1530 1535 gag gtt ttc tgt gtc caa cca gag aaa gga ggc cgt aag cca gee ege 4656 Glu Vai Phe Cys Vai Gin Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg 1540 1545 1550 ctt ate gta ttc cca gat ctg gga gtc cgt gta tgc gag aag atg gee 4704 Leu Ile Vai Phe Pro Asp Leu Gly Vai Arg Vai Cys Glu Lys Met Ala 1555 1560 1565 ctc tat gat gtg gtc tcc acc ctt cct cag gtc gtg atg ggc tcc tea 4752 Leu Tyr Asp Vai Vai Ser Thr Leu Pro Gin Vai Vai Met Gly Ser Ser 1570 1575 1580 tac gga ttc cag tac tet cct ggg cag cga gtc gag ttc ctg gtg aat 4800 Tyr Gly Phe Gin Tyr Ser Pro Gly Gin Arg Vai Glu Phe Leu Vai Asn 1585 1590 1595 1600 acc tgg aaa tea aag aaa aac ccc atg ggc ttt tea tat gac act ege 4848 Thr Trp Lys Ser Lys Lys Asn Pro Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg 1605 1610 1615 tgt ttc gac tea acg gtc acc gag aac gac ate cgt gtt gag gag tea 4896 Cys Phe Asp Ser Thr Vai Thr Glu Asn Asp Ile Arg Vai Glu Glu Ser 1620 1625 1630 att tac caa tgt tgt gac ttg gee CCC gaa gee aga cag gee ata aaa 4944 Ile Tyr Gin Cys Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Arg Gin Ala Ile Lys 1635 1640 1645 tcg ctc aca gag cgg ctt tat ate ggg ggt cct ctg act aat tea aaa 4992 Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr Ile Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys 1650 1655 1660 ggg cag aac tgc ggt tat ege cgg tgc ege gcg age ggc gtg ctg acg 5040 Gly Gin Asn Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Vai Leu Thr 1665 1670 1675 1680 act age tgc ggt aac acc ctc aca tgt tac ttg aag gee tet gea gee 5088 Thr Ser Cys Gly Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Ser Ala Ala 1685 1690 1695 100 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ tgt cga gct gcg aag ctc cag gac tgc acg atg ctc gtg aac gga gac 5136 Cys Arg Ala Ala Lys Leu Gin Asp Cys Thr Met Leu Vai Asn Gly Asp 1700 1705 1710 gac ctt gtc gtt ate tgt gaa age gcg gga acc caa gag gac gcg gcg 5184 Asp Leu Vai Vai Ile Cys Glu Ser Ala Gly Thr Gin Glu Asp Ala Ala 1715 1720 1725 age cta cga gtc ttc acg gag gct atg act agg tac tet gee ccc ccc 5232 Ser Leu Arg Vai Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro 1730 1735 1740 ggg gac ccg ccc caa cca gaa tac gac ttg gag ctg ata aca tea tgt 5280 Gly Asp Pro Pro Gin Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys 1745 1750 1755 1760 tcc tcc aat gtg teg gtc gee cac gat gea tea ggc aaa agg gtg tac 5328 Ser Ser Asn Vai Ser Vai Ala His Asp Ala Ser Gly Lys Arg Vai Tyr 1765 1770 1775 tac ctc acc cgt gat CCC acc acc ccc ctc gea cgg gct gcg tgg gaa 5376 Tyr Leu Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu 1780 1785 1790 aca gct aga cac act cca gtt aac tcc tgg cta ggc aac att ate atg 5424 Thr Ala Arg His Thr Pro Vai Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Met 1795 1800 1805 tat gcg CCC act ttg tgg gea agg atg att ctg atg act cac ttc ttc 5472 Tyr Ala Pro Thr Leu Trp Ala Arg Met Ile Leu Met Thr His Phe Phe 1810 1815 1820 tcc ate ctt cta gea cag gag caa ctt gaa aaa gee ctg gac tgc cag 5520 Ser Ile Leu Leu Ala Gin Glu Gin Leu Glu Lys Ala Leu Asp Cys Gin 1825 1830 1835 1840 ate tac ggg gee tgt tac tcc att gag cca ctt gac cta cct cag ate 5568 Ile Tyr Gly Ala Cys Tyr Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro Gin Ile 1845 1850 1855 att gaa cga ctc cat ggc ctt age gea ttt tea ctc cat agt tac tet 5616 Ile Glu Arg Leu His Gly Leu Ser Ala Phe Ser Leu His Ser Tyr Ser 1860 1865 1870 cca ggt gag ate aat agg gtg gct tea tgc ctc agg aaa ctt ggg gta 5664 Pro Gly Glu Ile Asn Arg Vai Ala Ser Cys Leu Arg Lys Leu Gly Vai 1875 1880 1885 cca ccc ttg cga gtc tgg aga cat cgg gee agg age gtc ege gct agg 5712 Pro Pro Leu Arg Vai Trp Arg His Arg Ala Arg Ser Vai Arg Ala Arg 1890 1895 1900 cta ctg tcc cag ggg ggg agg gee gee act tgt ggc aag tac ctc ttc 5760 Leu Leu Ser Gin Gly Gly Arg Ala Ala Thr Cys Gly Lys Tyr Leu Phe 1905 1910 1915 1920 aac tgg gea gtg aag acc aaa ctc aaa ctc act cca ate ccg gct gcg 5808 Asn Trp Ala Vai Lys Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Ile Pro Ala Ala 1925 1930 1935 101 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ tcc ggc tgg ttc gtt gct Ser Gly Trp Phe Vai Ala 1945 ctg tet cgt gee cga ccc Leu Ser Arg Ala Arg Pro 1960 tet gta ggg gta ggc ate Ser Vai Gly Vai Gly Ile 1975 ggt tac age ggg gga 5856 Gly Tyr Ser Gly Gly 1950 ege tgg ttc atg ctg 5904 Arg Trp Phe Met Leu 1965 tac ctg ctc ccc aac 5952 Tyr Leu Leu Pro Asn 1980 5955 tcc cag ctg gac ttg Ser Gin Leu Asp Leu 1940 gac ata tat cac age Asp Ile Tyr His Ser 1955 tgc cta ctc cta ctt Cys Leu Leu Leu Leu 1970 cga

Arg 1985

<210> 6 <211> 1985 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> sequência de NS < 4 0 0 > 6

Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser 1 5 Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly 20 Glu Vai Gin Vai Vai Ser Thr Ala 35 40 Vai Asn Gly Vai Cys Trp Thr Vai 50 55 Leu Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ile 65 70 Gin Asp Leu Vai Gly Trp Gin Ala 85 Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp 100 Asp Vai Ile Pro Vai Arg Arg Arg 115 120 Ser Pro Arg Pro Vai Ser Tyr Leu 130 135 Leu Cys Pro Ser Gly His Ala Vai 145 150 Thr Arg Gly Vai Ala Lys Ala Vai 165 Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Vai 180 Ala Vai Pro Gin Ser Phe Gin Vai 195 200 Ser Gly Lys Ser Thr Lys Vai Pro 210 215 Lys Vai Leu Vai Leu Asn Pro Ser 225 230 Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly 245 Vai Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ala 260

Gin Gin 10 Thr Arg Gly Leu Leu 15 Gly Arg 25 Asp Lys Asn Gin Vai 30 Glu Gly Thr Gin Ser Phe Leu 45 Ala Thr Cys Tyr His Gly Ala 60 Gly Ser Lys Thr Thr Gin Met 75 Tyr Thr Asn Vai Asp 80 Pro Pro 90 Gly Ala Arg Ser Leu 95 Thr Leu 105 Tyr Leu Vai Thr Arg 110 His Ala Gly Asp Ser Arg Gly 125 Ser Leu Leu Lys Gly Ser Ser 140 Gly Gly Pro Leu Gly Ile Phe 155 Arg Ala Ala Vai Cys 160 Asp Phe 170 Vai Pro Vai Glu Ser 175 Met Phe 185 Thr Asp Asn Ser Ser 190 Pro Pro Ala His Leu His Ala 205 Pro Thr Gly Ala Ala Tyr Ala 220 Ala Gin Gly Tyr Vai Ala Ala 235 Thr Leu Gly Phe Gly 240 Ile Asp 250 Pro Asn Ile Arg Thr 255 Gly Pro 265 Vai Thr Tyr Ser Thr 270 Tyr Gly 102 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Lys Phe Leu 275 Ala Ile Cys 290 Asp Glu Gly 305 Thr Vai Leu Leu Ala Thr Ala Ile Glu Glu Vai 340 Lys Ala Ile 355 Pro Cys His 370 Ser Lys Leu 385 Gly Ile Asn Ile Pro Thr Ile Thr Gly Tyr Thr 420 Vai Thr Gin 435 Thr Thr Thr 450 Thr Vai Arg 465 Thr Gly Arg Glu Arg Pro Ser Asp Ala Gly Cys 500 Arg Leu Arg 515 Ala His Leu 530 Glu Phe Ala 545 His Phe Leu Leu Vai Ala Tyr Pro Ser Trp Asp 580 Leu His Gly 595 Pro Glu Vai 610 Thr Leu Ser 625 Ala Asp Leu Vai Leu Ala Ala Ile Vai Gly Arg 660 Arg Glu Phe 675 Leu His Leu 690 Pro Tyr Gin 705 Lys Ala Leu Ala Ala Pro Vai Ala Lys His Met 740

Asp Gly Gly Cys Cys His Ser 280 Thr Asp Gin 295 Ala Glu Thr 310 Pro Pro Gly 325 Ala Leu Ser Asn Ile Glu Ala Ile Lys Lys Cys 360 Asp Ala Vai 375 Ala Tyr Gly 390 Asp Vai Vai 405 Gly Asp Phe Asp Vai Asp Phe Ser Pro Gin Asp 440 Ala Gly Arg 455 Arg Gly Gly 470 Met Phe Asp 485 Ala Trp Tyr Glu Tyr Leu Asn Thr Trp Glu Ser 520 Vai Ser Gin 535 Thr Lys Gin 550 Ala Thr Vai 565 Gin Met Trp Lys Thr Pro Leu Leu Thr His Pro 600 Ile Glu Vai 615 Vai Thr Leu 630 Ala Ala Tyr 645 Ile Ile Leu Ser Tyr Gin Glu Phe Ile Glu Gin 680 Gly Gly Leu 695 Leu Gin Vai 710 Glu Ser Lys 725 Trp Asn Phe Ile

Ser Gly Gly Ala Asp Ser Thr Thr 300 Thr Ala Gly 315 Ala Ser Vai 330 Thr Vai Thr 345 Gly Glu Ile Arg Gly Gly Arg Glu Leu Ala Ala 380 Tyr Arg Gly 395 Leu Vai Vai 410 Ala Thr Ser 425 Vai Ile Asp Leu Asp Pro Thr Vai Ser Arg Ser 460 Ile Tyr Arg 475 Phe Ser Ser 490 Vai Leu Leu 505 Thr Pro Ala Pro Gly Leu Pro Phe Thr Gly Leu 540 Gin Ala Gly 555 Asp Cys Ala 570 Arg Ala Cys 585 Leu Ile Arg Tyr Arg Leu Gly Thr Lys Tyr Ile 620 Ser Thr Trp 635 Vai Cys Leu 650 Thr Thr Gly 665 Arg Pro Ala Asp Glu Met Glu Met Gin Leu Ala 700 Thr Ala Thr 715 Lys Trp Arg 730 Ala Leu Ser 745 Gly Ile Gin

Tyr 285 Asp Ile Ile Ile Leu Gly Ile Arg Leu Vai Vai 320 Pro His Pro 335 Asn Pro Phe 350 Tyr Gly His 365 Leu Ile Phe Lys Leu Ser Gly Asp Vai Ser Vai 400 Asp Ala Leu 415 Met Cys Asn 430 Thr Cys Phe 445 Thr Ile Glu Gin Arg Arg Gly Vai Thr Pro Gly 480 Cys Glu Cys 495 Tyr Glu Thr 510 Ser Vai Vai 525 Cys Gin Asp Thr His Ile Asp Asn Phe Pro Tyr 560 Gin Ala Pro 575 Pro Leu Lys 590 Pro Thr Ala 605 Vai Gin Asn Met Ala Cys Met Leu Vai Gly Gly 640 Gly Ser Vai 655 Vai Ile Vai 670 Pro Asp Glu 685 Cys Ala Ser Glu Gin Phe Lys Gin Ala Glu Ala 720 Glu Thr Phe 735 Trp Tyr Leu 750 Ala Gly 103 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met Ala Phe 755 760 765 Thr Ala Ser Ile Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gin Ser Thr Leu Leu Phe 770 775 780 Asn Ile Leu Gly Gly Trp Vai Ala Ala Gin Leu Ala Pro Pro Ser Ala 785 790 795 800 Ala Ser Ala Phe Vai Gly Ala Gly Ile Ala Gly Ala Ala Vai Gly Ser 805 810 815 Ile Gly Leu Gly Lys Vai Leu Vai Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala 820 825 830 Gly Vai Ala Gly Ala Leu Vai Ala Phe Lys Vai Met Ser Gly Glu Met 835 840 845 Pro Ser Thr Glu Asp Leu Vai Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro 850 855 860 Gly Ala Leu Vai Vai Gly Vai Vai Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His 865 870 875 880 Vai Gly Pro Gly Glu Gly Ala Vai Gin Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala 885 890 895 Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Vai Ser Pro Thr His Tyr Vai Pro Glu 900 905 910 Ser Asp Ala Ala Ala Arg Vai Thr Gin Ile Leu Ser Ser Leu Thr Ile 915 920 925 Thr Gin Leu Leu Lys Arg Leu His Gin Trp Ile Asn Glu Asp Cys Ser 930 935 940 Thr Pro Cys Ser Gly Ser Trp Leu Arg Asp Vai Trp Asp Trp Ile Cys 945 950 955 960 Thr Vai Leu Thr Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gin Ser Lys Leu Leu Pro 965 970 975 Gin Leu Pro Gly Vai Pro Phe Phe Ser Cys Gin Arg Gly Tyr Lys Gly 980 985 990 Vai Trp Arg Gly Asp Gly Ile Met Gin Thr Thr Cys Pro Cys Gly Ala 995 1000 1005 Gin Ile Thr Gly His Vai Lys Asn Gly Ser Met Arg Ile Vai Gly Pro 1010 1015 1020 Lys Thr Cys Ser Asn Thr Trp His Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr 1025 1030 1035 1040 Thr Thr Gly Pro Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Ser Arg Ala 1045 1050 1055 Leu Trp Arg Vai Ala Ala Glu Glu Tyr Vai Glu Vai Thr Arg Vai Gly 1060 1065 1070 Asp Phe His Tyr Vai Thr Gly Met Thr Thr Asp Asn Vai Lys Cys Pro 1075 1080 1085 Cys Gin Vai Pro Ala Pro Glu Phe Phe Thr Glu Vai Asp Gly Vai Arg 1090 1095 1100 Leu His Arg Tyr Ala Pro Ala Cys Arg Pro Leu Leu Arg Glu Glu Vai 1105 1110 1115 1120 Thr Phe Gin Vai Gly Leu Asn Gin Tyr Leu Vai Gly Ser Gin Leu Pro 1125 1130 1135 Cys Glu Pro Glu Pro Asp Vai Ala Vai Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp 1140 1145 1150 Pro Ser His Ile Thr Ala Glu Thr Ala Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly 1155 1160 1165 Ser Pro Pro Ser Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gin Leu Ser Ala Pro 1170 1175 1180 Ser Leu Lys Ala Thr Cys Thr Thr His His Vai Ser Pro Asp Ala Asp 1185 1190 1195 1200 Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Gin Glu Met Gly Gly Asn Ile 1205 1210 1215 Thr Arg Vai Glu Ser Glu Asn Lys Vai Vai Vai Leu Asp Ser Phe Asp 1220 1225 1230 104 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Pro Leu Arg Ala Glu Glu Asp Glu Arg Glu Vai Ser Vai Pro Ala Glu 1235 1240 1245

Ile Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ala Ala Met Pro Ile Trp Ala 1250 1255 1260

Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Leu Glu Ser Trp Lys Asp Pro Asp 1265 1270 1275 1280

Tyr Vai Pro Pro Vai Vai His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Ile Lys Ala 1285 1290 1295

Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg Lys Arg Thr Vai Vai Leu Thr Glu 1300 1305 1310

Ser Ser Vai Ser Ser Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Thr Phe Gly 1315 1320 1325

Ser Ser Glu Ser Ser Ala Vai Asp Ser Gly Thr Ala Thr Ala Leu Pro 1330 1335 1340

Asp Gin Ala Ser Asp Asp Gly Asp Lys Gly Ser Asp Vai Glu Ser Tyr 1345 1350 1355 1360

Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser 1365 1370 1375

Asp Gly Ser Trp Ser Thr Vai Ser Glu Glu Ala Ser Glu Asp Vai Vai 1380 1385 1390

Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys 1395 1400 1405

Ala Ala Glu Glu Ser Lys Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu 1410 1415 1420

Leu Arg His His Asn Met Vai Tyr Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Gly 1425 1430 1435 1440

Leu Arg Gin Lys Lys Vai Thr Phe Asp Arg Leu Gin Vai Leu Asp Asp 1445 1450 1455

His Tyr Arg Asp Vai Leu Lys Glu Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Vai 1460 1465 1470

Lys Ala Lys Leu Leu Ser Vai Glu Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro 1475 1480 1485

His Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Vai Arg Asn 1490 1495 1500

Leu Ser Ser Lys Ala Vai Asn His Ile His Ser Vai Trp Lys Asp Leu 1505 1510 1515 1520

Leu Glu Asp Thr Vai Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn 1525 1530 1535

Glu Vai Phe Cys Vai Gin Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg 1540 1545 1550

Leu Ile Vai Phe Pro Asp Leu Gly Vai Arg Vai Cys Glu Lys Met Ala 1555 1560 1565

Leu Tyr Asp Vai Vai Ser Thr Leu Pro Gin Vai Vai Met Gly Ser Ser 1570 1575 1580

Tyr Gly Phe Gin Tyr Ser Pro Gly Gin Arg Vai Glu Phe Leu Vai Asn 1585 1590 1595 1600

Thr Trp Lys Ser Lys Lys Asn Pro Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg 1605 1610 1615

Cys Phe Asp Ser Thr Vai Thr Glu Asn Asp Ile Arg Vai Glu Glu Ser 1620 1625 1630

He Tyr Gin Cys Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Arg Gin Ala Ile Lys 1635 1640 1645

Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr Ile Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys 1650 1655 1660

Gly Gin Asn Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Vai Leu Thr 1665 1670 1675 1680

Thr Ser Cys Gly Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Ser Ala Ala 1685 1690 1695

Cys Arg Ala Ala Lys Leu Gin Asp Cys Thr Met Leu Vai Asn Gly Asp 1700 1705 1710 105 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ

Asp Leu Vai Vai Ile Cys Glu Ser Ala Gly Thr Gin Glu Asp Ala Ala 1715 1720 1725

Ser Leu Arg Vai Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro 1730 1735 1740

Gly Asp Pro Pro Gin Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys 1745 1750 1755 1760

Ser Ser Asn Vai Ser Vai Ala His Asp Ala Ser Gly Lys Arg Vai Tyr 1765 1770 1775

Tyr Leu Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu 1780 1785 1790

Thr Ala Arg His Thr Pro Vai Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Met 1795 1800 1805

Tyr Ala Pro Thr Leu Trp Ala Arg Met Ile Leu Met Thr His Phe Phe 1810 1815 1820

Ser Ile Leu Leu Ala Gin Glu Gin Leu Glu Lys Ala Leu Asp Cys Gin 1825 1830 1835 1840

Ile Tyr Gly Ala Cys Tyr Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro Gin Ile 1845 1850 1855

Ile Glu Arg Leu His Gly Leu Ser Ala Phe Ser Leu His Ser Tyr Ser 1860 1865 1870

Pro Gly Glu Ile Asn Arg Vai Ala Ser Cys Leu Arg Lys Leu Gly Vai 1875 1880 1885

Pro Pro Leu Arg Vai Trp Arg His Arg Ala Arg Ser Vai Arg Ala Arg 1890 1895 1900

Leu Leu Ser Gin Gly Gly Arg Ala Ala Thr Cys Gly Lys Tyr Leu Phe 1905 1910 1915 1920

Asn Trp Ala Vai Lys Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Ile Pro Ala Ala 1925 1930 1935

Ser Gin Leu Asp Leu Ser Gly Trp Phe Vai Ala Gly Tyr Ser Gly Gly 1940 1945 1950

Asp Ile Tyr His Ser Leu Ser Arg Ala Arg Pro Arg Trp Phe Met Leu 1955 1960 1965

Cys Leu Leu Leu Leu Ser Vai Gly Vai Gly Ile Tyr Leu Leu Pro Asn 1970 1975 1980

Arg 1985

<210> 7 <211> 4909 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> ácidi <400> 7 tcgcgcgttt cagcttgtct ttggcgggtg accatatgcg ctattggcca tccaacatta ggggtcatta cccgcctggc catagtaacg tgcccacttg tgacggtaaa ttggcagtac catcaatggg cgtcaatggg nucleico cggtgatgac gtaagcggat tcggggctgg gtgtgaaata ttgcatacgt ccgccatgtt gttcatagcc tgaccgccca ccaataggga gcagtacatc tggcccgcct atctacgtat cgtggatagc agtttgtttt

pVlJ ggtgaaaacc gccgggagca cttaactatg ccgcacagat tgtatccata gacattgatt catatatgga acgacccccg ctttccattg aagtgtatca ggcattatgc tagtcatcgc ggtttgactc ggcaccaaaa tctgacacat gacaagcccg cggcatcaga gcgtaaggag tcataatatg attgactagt gttccgcgtt cccattgacg acgtcaatgg tatgccaagt ccagtacatg tattaccatg acggggattt tcaacgggac gcagctcccg tcagggcgcg gcagattgta aaaataccgc tacatttata tattaatagt acataactta tcaataatga gtggagtatt acgcccccta accttatggg gtgatgcggt ccaagtctcc tttccaaaat gagacggtca 60 tcagcgggtg 120 ctgagagtgc 180 atcagattgg 240 ttggctcatg 300 aatcaattac 360 cggtaaatgg 420 cgtatgttcc 480 tacggtaaac 540 ttgacgtcaa 600 actttcctac 660 tttggcagta 720 accccattga 780 gtcgtaacaa 840 106 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ ctccgcccca agctcgttta tagaagacac tccccgtgcc tcttatgcat taggtgatgg tattggtgac tattggctat ggatggggtc cgcagttttt catgggctct agcggctcat agcacaatgc gaaaatgagc gcagaagaag gttgcggtgc cgcgccacca tgcagtcacc atctgctgtg gaccctggaa ttgtctgagt ggattgggaa caggtgctga ctctgtgaca tcatagctca ccctccctca aagataggct gagaaatcat gctgcggcga ggataacgca ggccgcgttg acgctcaagt tggaagctcc ctttctccct ggtgtaggtc ctgcgcctta actggcagca gttcttgaag tctgctgaag caccgctggt atctcaagaa acgttaaggg ttaaaaatga ccaatgctta tgcctgactc ataccaggcc agctttgttg tgcgttgtcg acaaagccgc aattctgatt ttatcaatac cagttccata atacaaccta gtgacgactg acaggccagc cgtgattgcg ggaatcgaat tcaggatatt catgcatcat agccagttta ttcagaaaca ttgacgcaaa gtgaaccgtc cgggaccgat aagagtgacg gctatactgt tatagcttag gatactttcc atgccaatac ccatttatta attaaacata tctccggtag ggtcgctcgg ccaccaccac gtggagattg atgcaggcag tgttaacggt gacataatag gtccttagat ccttctagtt ggtgccactc aggtgtcatt gacaatagca agaattgacc caccctgtcc ggagggctcc tcagcccacc attaagtgca agaatttctt gcggtatcag ggaaagaaca ctggcgtttt cagaggtggc ctcgtgcgct tcgggaagcg gttcgctcca tccggtaact gccactggta tggtggccta ccagttacct agcggtggtt gatcctttga attttggtca agttttaaat atcagtgagg gggggggggg tgaatcgccc taggtggacc ggaagatgcg cgtcccgtca agaaaaactc catatttttg ggatggcaag ttaatttccc aatccggtga cattacgctc cctgagcgag gcaaccggcg cttctaatac caggagtacg gtctgaccat actctggcgc tgggcggtag agatcgcctg ccagcctccg taagtaccgc ttttggcttg cctataggtg attactaatc tctgtccttc tttacaaatt gcgtgggatc cggcggagct cagctccttg cagtgtgccg ggctcgcacg ctgagttgtt ggagggcagt ctgacagact ctaggtacca gccagccatc ccactgtcct ctattctggg ggcatgctgg cggttcctcc acgcccctgg gccttcaatc aaaccaaacc gagggagaga ccgcttcctc ctcactcaaa tgtgagcaaa tccataggct gaaacccgac ctcctgttcc tggcgctttc agctgggctg atcgtcttga acaggattag actacggcta tcggaaaaag tttttgtttg tcttttctac tgagattatc caatctaaag cacctatctc ggcgctgagg catcatccag agttggtgat tgatctgatc agtcagcgta atcgagcatc aaaaagccgt atcctggtat ctcgtcaaaa gaatggcaaa gtcatcaaaa acgaaatacg caggaacact ctggaatgct gataaaatgc ctcatctgta atcgggcttc gcgtgtacgg gagacgccat cggccgggaa ctatagactc gggcctatac tgggttattg cataacatgg agagactgac cacatataca tccacgcgaa tccacatccg ctcctaacag cacaaggccg gctgacgcag gtattctgat gtagtctgag aacagactgt gatatcagaa tgttgtttgc ttcctaataa gggtggggtg ggatgcggtg tgggccagaa ttcttagttc ccacccgcta tagcctccaa aaatgcctcc gctcactgac ggcggtaata aggccagcaa ccgcccccct aggactataa gaccctgccg tcatagctca tgtgcacgaa gtccaacccg cagagcgagg cactagaaga agttggtagc caagcagcag ggggtctgac aaaaaggatc tatatatgag agcgatctgt tctgcctcgt ccagaaagtg tttgaacttt cttcaactca atgctctgcc aaatgaaact ttctgtaatg cggtctgcga ataaggttat agcttatgca tcactcgcat cgatcgctgt gccagcgcat gttttcccgg ttgatggtcg acatcattgg ccatacaatc tgggaggtct ccacgctgtt cggtgcattg tataggcaca acccccgctt accattattg ctctttgcca acggactctg acaacgccgt tctcgggtac agccctggtc tggaggccag tggcggtagg atggaagact aagagtcaga cagtactcgt tcctttccat ttcagtcgac ccctcccccg aatgaggaaa gggcaggaca ggctctatgg agaagcaggc cagccccact aagtacttgg gagtgggaag aacatgtgag tcgctgcgct cggttatcca aaggccagga gacgagcatc agataccagg cttaccggat cgctgtaggt ccccccgttc gtaagacacg tatgtaggcg acagtatttg tcttgatccg attacgcgca gctcagtgga ttcacctaga taaacttggt ctatttcgtt gaagaaggtg agggagccac tgctttgcca gcaaaagttc agtgttacaa gcaatttatt aaggagaaaa ttccgactcg caagtgagaa tttctttcca caaccaaacc taaaaggaca caacaatatt ggatcgcagt gaagaggcat caacgctacc gatagattgt atataagcag ttgacctcca gaacgcggat cccctttggc ccttatgcta accactcccc caactatctc tatttttaca cccccgtgcc gtgttccgga ccatgcctcc acttaggcac gtatgtgtct taaggcagcg ggtaactccc tgctgccgcg gggtcttttc agcggccgcg tgccttcctt ttgcatcgca gcaaggggga ccgctgcggc acatcccctt cataggacac agcggtctct aaattaaagc gaagtaatga cggtcgttcg cagaatcagg accgtaaaaa acaaaaatcg cgtttccccc acctgtccgc atctcagttc agcccgaccg acttatcgcc gtgctacaga gtatctgcgc gcaaacaaac gaaaaaaagg acgaaaactc tccttttaaa ctgacagtta catccatagt ttgctgactc ggttgatgag cggaacggtc gatttattca ccaattaacc catatcagga ctcaccgagg tccaacatca atcaccatga gacttgttca gttattcatt attacaaaca ttcacctgaa ggtgagtaac aaattccgtc tttgccatgt cgcacctgat 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 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<210> 8 <211> 35935 <212> ADN <213> Adenovírus serotipo 6 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4909 <400> 8 catcatcaat ttgtgacgtg gatgttgcaa gtgtgcgccg taaatttggg agtgaaatct gactttgacc cgggtcaaag tgagttcctc tccgacaccg aatggccgcc tcctagccat cgaagatccc gcaggaaggg cctttcccgg ccttgtaccg cgaggatgaa caggtcttgt ctatatgagg tagagtggtg gaattttgta ccagaaccgg cgcccgacat ccttctaaca gccgtgagag cctgggcaac ttgcgtgtgt gagataatgt cgccgtgggc ttttctgctg tttctgtggg gaatttgaag caggcgcttt gcggctgctg agcggggggt aagaatcgcc cagcagcagc gccggcctgg gacgcatttt gggcttgtga gtcctgagtg tggcgcagaa ttgaggaggc tcagcaaact agatagatac tgcttggcat gtacggtttt aatatacctt gcgcggggcg gtgtggcgga gtgtacacag cgtaaccgag gaataatttt gtttacgtgg ttggcgtttt aagaggccac ggactgaaaa agtcttttgg tttgaaccac aacgaggagg attgacttac cagcccgagc gaggtgatcg gagggtgagg cattatcacc acctgtggca ggtttggtgt ttgtgatttt agcctgcaag cacctgtgtc cacctcctga ttggtgggcg ctttggactt ggttaacgcc ttaacttgca taatcttggt tgcgtaactt gctcatccca agcttttgaa tccaagagaa ttgctttttt 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CfCfCfâCfclcÍcÍcÍCJ' accttgtcaa tcttattccc gcaaatttct gcagcttcct gttcctgtcc ctgaagatac cttttcttac tctctttgcg gcaacggcct gcccacctct ttacctcaga tcaccatgca aaggacccct ccaccgatag gcttgggcat acggggctcc gtgtgactat cacaaggcaa gccttatact gacagggccc tttacttgtt aggggttgat gttcacctaa gtgagcttag acaattcaag ttattctctg ccgcctgctg caagatgatt ccaaaaggtg gtgcaccact caaaattggc tgttacagtt aatgtgcgac tgtggaaaac ctgtacccta gccttaattt aaaacaaatt cctgctcaat accttgaagt atttgttcca ggccgccgct taactgggat tattatgtgg catcattgtg gttcttttct acccttgttg gactgcattc tgcagcctca tttgcatatc attctttaat tttgttcccc atattccaag tctctgttat ttggctggaa cactgcaaca ccacccccac ctagaaatgg gagcaacagc ggtatctttt cgccttagct cccattacca ggacctgagg tttaactaat gtccagttta cctggctgca atccgcaccc cttcaacccc tcctcccttt cctatccgaa ctctctggac caaaaaaacc agccctaact atcacaggcc cacagtgtca cagtaccctt tgacttgaaa tttgcatgta taataatact tatgcaactt tgatgttagt tctttttata tacagcttca gtttgacgct tgcaccaaac 28500 28560 28620 28680 28740 28800 28860 28920 28980 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<210> 9 <211> 35935 <212> ADN <213> Adenovírus serotipo 5 <400> 9 catcatcaat ttgtgacgtg gatgttgcaa gtgtgcgccg taaatttggg agtgaaatct gactttgacc cgggtcaaag tgagttcctc tccgacaccg aatggccgcc tcctagccat cgaagatccc gcaggaaggg cctttcccgg ccttgtaccg cgaggatgaa caggtcttgt ctatatgagg tagagtggtg gaattttgta ccagaaccgg cgcccgacat ccttctaaca gccgtgagag cctgggcaac ttgcgtgtgt gagataatgt cgccgtgggc ttttctgctg tttctgtggg gaatttgaag caggcgcttt gcggctgctg agcggggggt aagaatcgcc cagcagcagc gccggcctgg gacgcatttt gggcttgtga gtcctgagtg tggcgcagaa ttgaggaggc tcagcaaact agatagatac tgcttggcat gtacggtttt acaatacctg gctggaaggg aatatacctt gcgcggggcg gtgtggcgga gtgtacacag cgtaaccgag gaataatttt gtttacgtgg ttggcgtttt aagaggccac ggactgaaaa agtcttttgg tttgaaccac aacgaggagg attgacttac cagcccgagc gaggtgatcg gagggtgagg cattatcacc acctgtggca ggtttggtgt ttgtgatttt agcctgcaag cacctgtgtc cacctcctga ttggtgggcg ctttggactt ggttaacgcc ttaacttgca taatcttggt tgcgtaactt gctcatccca agcttttgaa tccaagagaa ttgctttttt acctgctgga tgctactgtt 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<210> 10 <211> 5965 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> NSsuboptmut <400> 10 gccaccatgg atcaccagcc accgctaccc ggagccggaa gtggatcagg acctgtggaa cgcaggggcg agcagcggag gtgtgtacca accatgcgca caggtggctc tacgccgctc ttcggcgctt accatcacca ggctgcagcg accaccatcc gtggtgctgg gaggtggccc gccatccgcg gctgccaagc tcagtgatcc tacaccggag ttcagcctgg aggagccaga cctggcgaaa ggctgcgctt aatacccctg ggactgaccc ccctatctgg tgggaccaga ctgctgtacc tacatcatgg ggaggcgtgc ggacgcatca gagttcgacg ctggccgaac gaagctgccg cacatgtgga aaccccgcta cagagcaccc tcagctgctt ctgggcaaag gtggccttca cctgccattc cgccatgtgg tctcgcggaa gtgacccaga cccccatcac tgaccggacg agagcttcct gcaagaccct atctggtggg gcagcgacct attctcgcgg gacccctgct ggggcgtggc gccctgtgtt acctgcacgc agggctacaa acatgagcaa ccggagctcc gaggagccta tgggcattgg ccacagctac tgagcaacac gaggcaggca tgagcggact ccaccatcgg acttcgacag accccacctt ggcgcggacg ggccctctgg ggtacgagct gcctgcccgt acatcgacgc tggcctatca tgtggaagtg gcctgggagc cctgcatgag tggccgctct tcctgagcgg agatggagga 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acagaactgc caccctgacc caccatgctg agatgctgcc agacccccct cgtggctcac tctggctcgc catcatcatg catcctgctg ctacagcatc cttcagcctg actgggcgtg gctgagccag gaccaagctg cgtggctggc gttcatgctg ctaaa ggaagctggc tggctgcaga ggatacaagg cagatcacag aacacctggc cctgctccca accagggtgg tgtcaggtgc gcccctgcct tacctggtgg atgctgaccg tctcctccaa acctgcacca cgccaggaga gacagcttcg atcctgcgca aaccctcccc tgtcctctgc gtgctgacag agcagcgaga gacgacggcg gaacctggcg gaggacgtgg gctgccgagg aacatggtgt gaccgcctgc gccagcaccg cacagcgcca gccgtgaacc gacaccacca aagcccgctc ctgtacgacg tacagccctg atgggcttca gtggaggaga agcctgaccg ggatacaggc tgctacctga gtgaacgccg agcctgcgcg cagcccgaat gacgccagcg gctgcctggg tacgccccta gctcaggagc gagcccctgg cacagctaca cctcctctgc ggaggcaggg aagctgaccc tacagcggag tgcctgctgc tgagggacgt gcaagctgct gcgtgtggag gccacgtgaa acggcacctt actacagcag gagacttcca ccgctcccga gtaggcccct gcagccagct accccagcca gcctggcctc cccaccacgt tgggcggcaa accccctgcg agagcaagaa tgctggagag ctcccattaa aaagcagcgt gctctgccgt ataagggcag atcccgatct tgtgttgcag agagcaagct acgccaccac aggtgctgga tgaaggccaa agagcaagtt acatccacag tcatggccaa gcctgatcgt tggtgagcac gccagcgcgt gctacgacac gcatctacca agcgcctgta gctgtagggc aggccagcgc ctggcctggt tgttcaccga acgacctgga gaaagcgcgt aaaccgctcg ccctgtgggc agctggagaa acctgcccca gccctggcga gcgtgtggag ccgctacctg ctatccctgc gcgacatcta tgctgagcgt gtgggactgg gccccaactg gggcgatggc gaacggcagc ccccatcaac ggccctgtgg ctacgtgacc attttttacc gctgcgcgaa gccctgcgag catcacagcc aagcagcgct gagccccgac catcacccgc cgccgaggag gttccccgct ctggaaggac agcccctcct gagctctgct ggacagcgga cgatgtggag gagcgatggc catgagctac gcccatcaac cagcaggtct cgaccactac gctgctgagc cggctacggc cgtgtggaag gaacgaggtg gttccccgat cctgcctcag ggagttcctg acgctgcttc gtgctgcgac catcggaggc ctctggcgtg tgcctgtcgc ggtgatttgt ggccatgacc gctgatcacc gtactacctg ccatacaccc tcgcatgatc ggccctggac aatcatcgag aattaatcgc gcatagggct tggaaagtac cgctagccag ccacagcctg gggcgtgggc 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 5965

<210> 11 <211> 5965 <212> ADN <213> Sequência Artificial 129 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ <220> <223> NSsuboptmut quimérico <400> 11 gccaccatgg cccccatcac cgcctacagc cagcagaccc gcggcctgct gggctgcatc 60 atcaccagcc tgaccggccg cgacaagaac caggtggagg gcgaggtgca ggtggtgagc 120 accgccaccc agagcttcct ggccacctgc gtgaacggcg tgtgctggac cgtgtaccac 180 ggcgccggca gcaagaccct ggccggcccc aagggcccca tcacccagat gtacaccaac 240 gtggaccagg acctggtggg ctggcaggcc ccccccggcg cccgcagcct gaccccctgc 300 acctgcggca gcagcgacct gtacctggtg acccgccacg ccgacgtgat ccccgtgcgc 360 cgccgcggcg acagccgcgg cagcctgctg agcccccgcc ccgtgagcta cctgaagggc 420 agcagcggcg gccccctgct gtgccccagc ggccacgccg tgggcatctt ccgcgccgcc 480 gtgtgcaccc gcggcgtggc caaggccgtg gacttcgtgc ccgtggagag catggagacc 540 accatgcgca gccccgtgtt caccgacaac agcagccccc ccgccgtgcc ccagagcttc 600 caggtggccc acctgcacgc ccccaccggc agcggcaaga gcaccaaggt gcccgccgcc 660 tacgccgccc agggctacaa ggtgctggtg ctgaacccca gcgtggccgc caccctgggc 720 ttcggcgcct acatgagcaa ggcccacggc atcgacccca acatccgcac cggcgtgcgc 780 accatcacca ccggcgcccc cgtgacctac agcacctacg gcaagttcct ggccgacggc 840 ggctgcagcg gcggcgccta cgacatcatc atctgcgacg agtgccacag caccgacagc 900 accaccatcc tgggcatcgg caccgtgctg gaccaggccg agaccgccgg cgcccgcctg 960 gtggtgctgg ccaccgccac cccccccggc agcgtgaccg tgccccaccc caacatcgag 1020 gaggtggccc tgagcaacac cggcgagatc cccttctacg gcaaggccat ccccatcgag 1080 gccatccgcg gcggccgcca cctgatcttc tgccacagca agaagaagtg cgacgagctg 1140 gccgccaagc tgagcggcct gggcatcaac gccgtggcct actaccgcgg cctggacgtg 1200 agcgtgatcc ccaccatcgg cgacgtggtg gtggtggcca ccgacgccct gatgaccggc 1260 tacaccggcg acttcgacag cgtgatcgac tgcaacacct gcgtgaccca gaccgtggac 1320 ttcagcctgg accccacctt caccatcgag accaccaccg tgccccagga cgccgtgagc 1380 cgcagccagc gccgcggccg caccggccgc ggccgccgcg gcatctaccg cttcgtgacc 1440 cccggcgagc gccccagcgg catgttcgac agcagcgtgc tgtgcgagtg ctacgacgcc 1500 ggctgcgcct ggtacgagct gacccccgcc gagaccagcg tgcgcctgcg cgcctacctg 1560 aacacccccg gcctgcccgt gtgccaggac cacctggagt tctgggagag cgtgttcacc 1620 ggcctgaccc acatcgacgc ccacttcctg agccagacca agcaggccgg cgacaacttc 1680 ccctacctgg tggcctacca ggccaccgtg tgcgcccgcg cccaggcccc cccccccagc 1740 tgggaccaga tgtggaagtg cctgatccgc ctgaagccca ccctgcacgg ccccaccccc 1800 ctgctgtacc gcctgggcgc cgtgcagaac gaggtgaccc tgacccaccc catcaccaag 1860 tacatcatgg cctgcatgag cgccgacctg gaggtggtga ccagcacctg ggtgctggtg 1920 ggcggcgtgc tggccgccct ggccgcctac tgcctgacca ccggcagcgt ggtgatcgtg 1980 ggccgcatca tcctgagcgg ccgccccgcc atcgtgcccg accgcgagtt cctgtaccag 2040 gagttcgacg agatggagga gtgcgccagc cacctgccct acatcgagca gggcatgcag 2100 ctggccgagc agttcaagca gaaggccctg ggcctgctgc agaccgccac caagcaggcc 2160 gaggccgccg cccccgtggt ggagagcaag tggcgcgccc tggagacctt ctgggccaag 2220 cacatgtgga acttcatcag cggcatccag tacctggccg gcctgagcac cctgcccggc 2280 aaccccgcca tcgccagcct gatggccttc accgccagca tcaccagccc cctgaccacc 2340 cagagcaccc tgctgttcaa catcctgggc ggctgggtgg ccgcccagct ggcccccccc 2400 agcgccgcca gcgccttcgt gggcgccggc atcgccggcg ccgccgtggg cagcatcggc 2460 ctgggcaagg tgctggtgga catcctggcc ggctacggcg ccggcgtggc cggcgccctg 2520 gtggccttca aggtgatgag cggcgagatg cccagcaccg aggacctggt gaacctgctg 2580 cccgccatcc tgagccccgg cgccctggtg gtgggcgtgg tgtgcgccgc catcctgcgc 2640 cgccacgtgg gccccggcga gggcgccgtg cagtggatga accgcctgat cgccttcgcc 2700 agccgcggca accacgtgag ccccacccac tacgtgcccg agagcgacgc cgccgcccgc 2760 gtgacccaga tcctgagcag cctgaccatc acccagctgc tgaagcgcct gcaccagtgg 2820 atcaacgagg actgcagcac cccctgcagc ggcagctggc tgcgcgacgt gtgggactgg 2880 atctgcaccg tgctgaccga cttcaagacc tggctgcaga gcaagctgct gccccagctg 2940 cccggcgtgc ccttcttcag ctgccagcgc ggctacaagg gcgtgtggcg cggcgacggc 3000 atcatgcaga ccacctgccc ctgcggcgcc cagatcaccg gccacgtgaa gaacggcagc 3060 atgcgcatcg tgggccccaa gacctgcagc aacacctggc acggcacctt ccccatcaac 3120 gcctacacca ccggcccctg cacccccagc cccgccccca actacagccg cgccctgtgg 3180 cgcgtggccg ccgaggagta cgtggaggtg acccgcgtgg gcgacttcca ctacgtgacc 3240 ggcatgacca ccgacaacgt gaagtgcccc tgccaggtgc ccgcccccga gttcttcacc 3300 gaggtggacg gcgtgcgcct gcaccgctac gcccccgcct gccgccccct gctgcgcgag 3360 gaggtgacct tccaggtggg cctgaaccag tacctggtgg gcagccagct gccctgcgag 3420 130 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ cccgagcccg gagaccgcca agccagctga gccgacctga gtggagagcg gacgagcgcg gccatgccca cctgattacg attccacctc ctggccgaac acagccaccg agctatagca agctggagca acctggacag gccctgagca gccggactga cgcgatgtgc gtggaggagg gccaaggacg gacctgctgg ttctgcgtgc ctgggcgtgc gtggtgatgg gtgaacacct gacagcaccg ctggcccccg cccctgacca ctgaccacca gccgccaagc gagagcgccg cgctacagcg agctgcagca acccgcgacc gtgaacagct ctgatgaccc tgccagatct cgcctgcacg gtggccagct cgcagcgtgc ctgttcaact ctggacctga agccgcgccc atctacctgc acgtggccgt agcgccgcct gcgcccccag tcgaggccaa agaacaaggt aggtgagcgt tctgggctag tgcctccagt ctaggcgcaa tggccaccaa ctctgcctga gcatgcctcc ccgtgagcga gcgctctgat acagcctgct ggcagaagaa tgaaggagat cctgcaagct tgcgcaacct aggacaccgt agcccgagaa gcgtgtgcga gcagcagcta ggaagagcaa tgaccgagaa aggcccgcca acagcaaggg gctgcggcaa tgcaggactg gcacccagga ccccccccgg gcaacgtgag ccaccacccc ggctgggcaa acttcttcag acggcgcctg gcctgagcgc gcctgcgcaa gcgcccgcct gggccgtgaa gcggctggtt gcccccgctg tgcccaaccg gctgaccagc ggcccgcggc cctgaaggcc cctgctgtgg ggtggtgctg gcccgccgag acctgattac ggtgcatggc aaggaccgtg gacctttggc ccaggccagc cctggaaggc agaggccagc cacaccctgc gaggcaccac ggtgaccttc gaaggccaag gacccccccc gagcagcaag gacccccatc gggcggccgc gaagatggcc cggcttccag gaagaacccc cgacatccgc ggccatcaag ccagaactgc caccctgacc caccatgctg ggacgccgcc cgaccccccc cgtggcccac cctggcccgc catcatcatg catcctgctg ctacagcatc cttcagcctg gctgggcgtg gctgagccag gaccaagctg cgtggccggc gttcatgctg ctaaa atgctgaccg agccccccca acctgcacca cgccaggaga gacagcttcg atcctgcgca aaccctcccc tgtcctctgc gtgctgacag agcagcgaga gacgacggcg gaacctggcg gaggacgtgg gctgccgagg aacatggtgt gaccgcctgc gccagcaccg cacagcgcca gccgtgaacc gacaccacca aagcccgccc ctgtacgacg tacagccccg atgggcttca gtggaggaga agcctgaccg ggctaccgcc tgctacctga gtgaacgccg agcctgcgcg cagcccgagt gacgccagcg gccgcctggg tacgccccca gcccaggagc gagcccctgg cacagctaca ccccccctgc ggcggccgcg aagctgaccc tacagcggcg tgcctgctgc accccagcca gcctggccag cccaccacgt tgggcggcaa accccctgcg agagcaagaa tgctggagag ctcccattaa aaagcagcgt gctctgccgt ataagggcag atcccgatct tgtgttgcag agagcaagct acgccaccac aggtgctgga tgaaggccaa agagcaagtt acatccacag tcatggccaa gcctgatcgt tggtgagcac gccagcgcgt gctacgacac gcatctacca agcgcctgta gctgccgcgc aggccagcgc ccggcctggt tgttcaccga acgacctgga gcaagcgcgt agaccgcccg ccctgtgggc agctggagaa acctgcccca gccccggcga gcgtgtggcg ccgccacctg ccatccccgc gcgacatcta tgctgagcgt catcaccgcc cagcagcgcc gagccccgac catcacccgc cgccgaggag gttccccgct ctggaaggac agcccctcct gagctctgct ggacagcgga cgatgtggag gagcgatggc catgagctac gcccatcaac cagcaggtct cgaccactac gctgctgagc cggctacggc cgtgtggaag gaacgaggtg gttccccgac cctgccccag ggagttcctg ccgctgcttc gtgctgcgac catcggcggc cagcggcgtg cgcctgccgc ggtgatctgc ggccatgacc gctgatcacc gtactacctg ccacaccccc ccgcatgatc ggccctggac gatcatcgag gatcaaccgc ccaccgcgcc cggcaagtac cgccagccag ccacagcctg gggcgtgggc 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 5965

<210> 12 <211> 10 <212> ARN <213> Sequência Artificial <220> <223> Local de ligação ao ribossoma <400> 12 gccaccaugg

<210> 13 <211> 49 <212> ARN <213> Sequência Artificial 10 ΕΡ 1 436 397/ΡΤ 131 <220> <223> Sinal de poliadenilaçao sintético <400> 13 aauaaaagau cuuuauuuuc auuagaucug uguguugguu uuuugugug 49 <210> <211> <212> <213> 14 28 ADN Sequência Artificial <220> <223> Nucleótidos adicionais presentes em pVIJns-NS <400> 14 tctagagcgt ttaaaccctt aattaagg 28 <210> <211> <212> <213> 15 15 ADN Sequência Artificial <220> <223> Nucleótidos adicionais presentes em pVlJns-NSOPTmut <400> 15 tttaaatgtt taaac 15 <210> <211> <212> <213> 16 24 ADN Sequência Artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico <400> 16 tcgaatcgat acgcgaacct acgc 24 <210> <211> <212> <213> 17 37 ADN Sequência Artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico <400> 17 tcgacgtgtc gacttcgaag cgcacaccaa aaacgtc 37

Lisboa, 2010-07-09

Claims (26)

1. ΕΡ 1 436 397/ΡΤ 1/6 REIVINDICAÇÕES 1. Ácido nucleico compreendendo: (a) uma sequência nucleotídica codificando um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B possuindo uma identidade de aminoácidos com SEQ ID N0:1 de pelo menos 85%, desde que o referido polipéptido tenha actividade proteásica suficiente para se processar a si próprio para produzir uma proteína NS5B e a referida proteína NS5B seja enzimaticamente inactiva, em que o referido ácido nucleico é um vector de expressão capaz de expressar o referido polipéptido a partir da referida sequência nucleotídica numa célula humana; ou (b) uma cassete de expressão génica capaz de expressar um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B possuindo uma identidade de aminoácidos com SEQ ID N0:1 de pelo menos 85% numa célula humana, desde que o referido polipéptido se possa processar a si próprio para produzir uma proteína NS5B e a referida proteína NS5B seja enzimaticamente inactiva, compreendendo a referida cassete de expressão: a) um promotor transcricionalmente ligado a uma sequência nucleotídica codificando o referido polipéptido; b) um local de ligação ao ribossoma a 5' funcionalmente ligado à referida sequência nucleotídica, c) um terminador unido à extremidade 3' da referida sequência nucleotídica, e d) um sinal de poliadenilação a 3' funcionalmente ligado à referida sequência nucleotídica.
2. 2. Ácido nucleico da reivindicação 1 que compreende: uma sequência nucleotídica codificando um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B possuindo uma identidade de aminoácidos com SEQ ID NO: 1 de pelo menos 85%, desde que o referido polipéptido tenha actividade proteásica suficiente para se processar a si próprio para produzir uma proteína NS5B e a referida proteína NS5B seja enzimaticamente inactiva, em que o referido ácido nucleico é um vector de expressão capaz de expressar o referido polipéptido a partir da referida sequência nucleotídica numa célula humana. ΕΡ 1 436 397/ΡΤ 2/6
3. 3. Ácido nucleico da reivindicação 1 que compreende: uma sequência nucleotidica codificando um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B possuindo uma identidade de aminoácidos com SEQ ID N0:1 de pelo menos 95%, em que a referida sequência polipeptidica mantém a maioria ou todas as regiões antigénicas de células T de SEQ ID N0:1 desde que o referido polipéptido tenha actividade proteásica suficiente para se processar a si próprio para produzir uma proteína NS5B e a referida proteína NS5B seja enzimaticamente inactiva, em que o referido ácido nucleico é um vector de expressão capaz de expressar o referido polipéptido a partir da referida sequência nucleotidica numa célula humana.
4. 4. Ácido nucleico da reivindicação 1 que compreende: um ácido nucleico compreendendo uma cassete de expressão génica capaz de expressar um polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B possuindo uma identidade de aminoácidos com SEQ ID N0:1 de pelo menos 95% numa célula humana, desde que o referido polipéptido possa processar-se a si próprio para produzir uma proteína NS5B e a referida proteína NS5B seja enzimaticamente inactiva, compreendendo a referida cassete de expressão: a) um promotor transcricionalmente ligado a uma sequência nucleotidica codificando o referido polipéptido; b) um local de ligação ao ribossoma a 5' funcionalmente ligado à referida sequência nucleotidica, c) um terminador ligado à extremidade 3' da referida sequência nucleotidica, e d) um sinal de poliadenilação a 3' funcionalmente ligado à referida sequência nucleotidica.
5. 5. Ácido nucleico da reivindicação 4, em que a referida sequência nucleotidica tem uma identidade com a sequência de codificação de SEQ ID NO:2 de pelo menos 65%.
6. 6. Ácido nucleico da reivindicação 4 ou 5, em que o referido ácido nucleico é um plasmídeo adequado para administração a um ser humano e compreende ainda uma origem de replicação procariótica e um gene codificando para um marcador seleccionável. ΕΡ 1 436 397/ΡΤ 3/6
7. 7. Ácido nucleico da reivindicação 4 ou 5, em que o referido ácido nucleico é um adenovector consistindo no seguinte: a) uma primeira região adenoviral desde cerca do par de bases 1 até cerca do par de bases 450 correspondente a Ad5 ou Ad6 ; b) a referida cassete de expressão génica numa orientação paralela a EI ou antiparalela a EI unida à referida primeira região; c) uma segunda região adenoviral desde cerca do par de bases 3511 até cerca do par de bases 5548 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 3508 até cerca do par de bases 5541 correspondente a Ad6, unida à referida cassete de expressão; d) uma terceira região adenoviral desde cerca do par de bases 5549 até cerca do par de bases 28133 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 5542 até cerca do par de bases 28156 correspondente a Ad6, unida à referida segunda região; e) uma quarta região adenoviral desde cerca do par de bases 30818 até cerca do par de bases 33966 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 30789 até cerca do par de bases 33784 correspondente a Ad6, unida à referida terceira região; e f) uma quinta região adenoviral desde cerca do par de bases 33967 até cerca do par de bases 35935 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 33785 até cerca do par de bases 35759 correspondente a Ad6, unida à referida quarta região.
8. 8. Ácido nucleico da reivindicação 7, em que a referida cassete de expressão está numa orientação antiparalela a El.
9. 9. Ácido nucleico das reivindicações 4 ou 5, em que o referido ácido nucleico é um adenovector consistindo no seguinte: a) uma primeira região adenoviral desde cerca do par de bases 1 até cerca do par de bases 450 correspondendo a Ad5 ou Ad6; ΕΡ 1 436 397/ΡΤ 4/6 b) uma segunda região adenoviral desde cerca do par de bases 3511 até cerca do par de bases 5548 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 3508 até cerca do par de bases 5541 correspondente a Ad6, unida à referida primeira região; c) uma terceira região adenoviral desde cerca do par de bases 5549 até cerca do par de bases 28133 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 5542 até cerca do par de bases 28156 correspondente a Ad6, unida à referida segunda região; d) a referida cassete de expressão génica numa orientação paralela a E3 ou antiparalela a E3 unida à referida terceira região; e) uma quarta região adenoviral desde cerca do par de bases 30818 até cerca do par de bases 33966 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 30789 até cerca do par de bases 33784 correspondente a Ad6, unida à referida cassete de expressão génica; e f) uma quinta região adenoviral desde cerca do par de bases 33967 até cerca do par de bases 35935 correspondente a Ad5 ou desde cerca do par de bases 33785 até cerca do par de bases 35759 correspondente a Ad6, unida à referida quarta região.
10. 10. Ácido nucleico da reivindicação 7, 8 ou 9, em que a referida primeira região corresponde a Ad5, a referida segunda região corresponde a Ad5, a referida terceira região corresponde a Ad5, a referida quarta região corresponde a Ad5, e a referida quinta região corresponde a Ad5.
11. 11. Ácido nucleico da reivindicação 7, 8 ou 9, em que a referida primeira região corresponde a Ad5 ou Ad6, a referida segunda região corresponde a Ad5 ou Ad6, a referida terceira região corresponde a Ad6, a referida quarta região corresponde a Ad6, e a referida quinta região corresponde a Ad5 ou Ad6.
12. 12. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 4 a 11, em que o referido promotor é o promotor precoce intermédio de citomegalovírus humano, o referido local de ligação ao ribossoma a 5' consiste em SEQ ID NO: 12, e o ΕΡ 1 436 397/ΡΤ 5/6 referido sinal de poliadenilação a 3' é o sinal de poliadenilação de BGH.
13. 13. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações anteriores que codifica o polipéptido de SEQ ID N0:1.
14. 14. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 a 12 em que o polipéptido difere de SEQ ID N0:1 em 1- 20 aminoácidos
15. 15. Ácido nucleico da reivindicação 14 em que o polipéptido difere de SEQ ID NO:l em 1-5 aminoácidos.
16. 16. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 a 12 em que a sequência nucleotidica é a sequência de codificação de SEQ ID NO:2.
17. 17. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 a 12 em que a sequência nucleotidica é a sequência de codificação de SEQ ID NO:3.
18. 18. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 a 12 em que a sequência nucleotidica é a sequência de codificação de SEQ ID NO:10.
19. 19. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 a 12 em que a sequência nucleotidica é a sequência de codificação de SEQ ID NO:11.
20. 20. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 a 12 em que a sequência nucleotidica é a sequência de codificação para SEQ ID NO: 2 ou difere de SEQ ID NO: 2 em 1 a 50 nucleótidos.
21. 21. Ácido nucleico da reivindicação 5, em que o referido ácido nucleico é um adenovector consistindo numa sequência nucleotidica possuindo uma identidade com SEQ ID NO:4 de pelo menos 65%, ou um seu derivado, em que o referido seu derivado tem a sequência codificadora da poliproteína de VHC presente em SEQ ID NO: 4 substituída pela sequência codificadora da poliproteína de VHC de SEQ ID NO:3, de SEQ ID NO: 10 ou de SEQ ID NO:11. ΕΡ 1 436 397/ΡΤ 6/6
22. 22. Adenovector consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:4 ou um seu derivado, em que o referido seu derivado tem a sequência codificadora da poliproteína de VHC presente em SEQ ID NO:4 substituída pela sequência codificadora da poliproteína de VHC de SEQ ID N0:3, de SEQ ID NO:10 ou de SEQ ID NO:11.
23. 23. Composição farmacêutica compreendendo o ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 2-3 e 6-22 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
24. 24. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 2-3 e 6-22 que é um adenovector para utilizar num método de tratamento de um ser humano através de terapia.
25. 25. Ácido nucleico da reivindicação 24 para utilizar em tratamento ou prevenção de VHC.
26. 26. Utilização de um ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 2-3 e 6-22 para o fabrico de um medicamento para tratamento ou prevenção de VHC num ser humano. Lisboa, 2010-07-09