JP2009183295A - C型肝炎ウイルスワクチン - Google Patents
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Abstract
【解決手段】Ad6ベクター及び、不活性NS5B−RNA依存性RNAポリメラーゼ領域を含むMet−NS3−NS4A−NS4B−NS5A−NS5Bポリペプチドをコードする核酸。1つ以上のAD6領域及びAD6中に存在しない領域を含む組換え核酸であって、少なくとも1つのAD6領域がE1A、E1B、E2B、E2A、E4、L1、L2、L4及びL5からなる群から選択される、前記組換え核酸。
【選択図】なし
Description
a)ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に転写的にカップリングしているプロモーター、
b)前記ヌクレオチド配列に機能的にカップリングしている5’リボソーム結合部位、
c)前記ヌクレオチド配列の3’末端に連結しているターミネーター、及び
d)前記ヌクレオチド配列に機能的にカップリングしている3’ポリアデニル化シグナル
を含む。
多種多様の核酸配列が細胞にHCV Met−NS3−NS4A−NS4B−NS5A−NS5Bポリペプチドを供給するためのワクチン成分として、またはワクチン成分を作成するための中間体として使用され得る。適当な核酸配列を得るための出発点としては、不活性NS5Bを産生するように修飾された天然NS3−NS4A−NS4B−NS5A−NS5Bポリペプチド配列が好ましい。
配列番号1は、好ましいMet−NS3−NS4A−NS4B−NS5A−NS5B配列を規定する。配列番号1は、数種のHCV単離物中に存在する多数のHCV特異的T細胞抗原を含む。配列番号1はHCV BK株ヌクレオチド配列(GenBank受託番号M58335)のNS3−NS4A−NS4B−NS5A−NS5B部分に類似している。
A=Ala=アラニン:コドン GCA,GCC,GCG,GCU;
C=Cys=システイン:コドン UGC,UGU;
D=Asp=アスパラギン酸:コドン GAC,GAU;
E=Glu=グルタミン酸:コドン GAA,GAG;
F=Phe=フェニルアラニン:コドン UUC,UUU;
G=Gly=グリシン:コドン GGA,GGC,GGG,GGU;
H=His=ヒスチジン:コドン CAC,CAU;
I=Ile=イソロイシン:コドン AUA,AUC,AUU;
K=Lys=リシン:コドン AAA,AAG;
L=Leu=ロイシン:コドン UUA,UUG,CUA,CUC,CUG,CUU;
M=Met=メチオニン:コドン AUG;
N=Asn=アスパラギン:コドン AAC,AAU;
P=Pro=プロリン:コドン CCA,CCC,CCG,CCU;
Q=Gln=グルタミン:コドン CAA,CAG;
R=Arg=アルギニン:コドン AGA,AGG,CGA,CGC,CGG,CGU;
S=Ser=セリン:コドン AGC,AGU,UCA,UCC,UCG,UCU;
T=Thr=スレオニン:コドン ACA,ACC,ACG,ACU;
V=Val=バリン:コドン GUA,GUC,GUG,GUU;
W=Trp=トリプトファン:コドン UCG;及び
Y=Tyr=チロシン:コドン UAC,UAU。
配列番号2及び3は、Met−NS3−NS4A−NS4B−NS5A−NS5B配列をコードするヌクレオチド配列の2つの例を規定する。配列番号2のコード配列は、天然に存在するHCV−BK配列(GenBank受託番号M58335)のNS3−NS4A−NS4B−NS5A−NS5B領域に類似している(99.4%ヌクレオチド配列同一性)。配列番号3は配列番号2のコドン最適化バージョンである。配列番号2及び3は78.3%のヌクレオチド配列同一性を有する。
遺伝子発現カセットはポリペプチド発現に必要な要素を含んでいる。「ポリペプチド」はサイズを限定せず、タンパク質も含む。遺伝子発現カセット中に存在する調節要素は、通常(a)ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に転写的にカップリングされているプロモーター、(b)ヌクレオチド配列に機能的にカップリングされている5’リボソーム結合部位、(c)ヌクレオチド配列の3’末端に結合されているターミネーター、及び(d)ヌクレオチド配列に機能的にカップリングされている3’ポリアデニル化シグナルを含む。遺伝子発現またはポリペプチドプロセシングを強化または調節するのに有用な追加の調節要素を存在させてもよい。
Met−NS3−NS4A−NS4B−NS5A−NS5Bポリペプチドをコードする核酸は、治療投与のために適したベクターを用いて患者に導入され得る。許容できない副作用を引き起こすことなく核酸を標的細胞にデリバーするベクターが適当であり得る。
遺伝子発現カセットを発現するための第1世代アデノベクターは、E1及び場合によりE3欠失組換えアデノウイルスゲノム中に発現カセットを含む。E1領域の欠失はアデノウイルスの複製に必要な要素を除去するのに十分に大きい。
a)Ad5またはAd6のいずれかに対応する塩基対約1〜塩基対約450の第1アデノウイルス領域、
b)前記第1領域に連結した、E1平行またはE1逆平行方位の遺伝子発現カセット、
c)前記発現カセットに連結した、Ad5に対応する塩基対約3511〜塩基対約5548またはAd6に対応する塩基対約3508〜塩基対約5541の第2アデノウイルス領域、
d)前記第2領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約5549〜塩基対約28133またはAd6に対応する塩基対約5542〜塩基対約28156の第3アデノウイルス領域、
e)前記第3領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約30818〜塩基対約33966またはAd6に対応する塩基対約30789〜塩基対約33784の第4アデノウイルス領域、及び
f)前記第4領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約33967〜塩基対約35935またはAd6に対応する塩基対約33785〜塩基対約35759の第5アデノウイルス領域
を含む。
a)Ad5またはAd6のいずれかに対応する塩基対約1〜塩基対約450の第1アデノウイルス領域、
b)前記第1領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約3511〜塩基対約5548またはAd6に対応する塩基対約3508〜塩基対約5541の第2アデノウイルス領域、
c)前記第2領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約5549〜塩基対約28133またはAd6に対応する塩基対約5542〜塩基対約28156の第3アデノウイルス領域、
d)前記第3領域に連結した、E3平行またはE3逆平行方位の遺伝子発現カセット、
e)前記遺伝子発現カセットに連結した、Ad5に対応する塩基対約30818〜塩基対約33966またはAd6に対応する塩基対約30789〜塩基対約33784の第4アデノウイルス領域、及び
f)前記第4領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約33967〜塩基対約35935またはAd6に対応する塩基対約33785〜塩基対約35759の第5アデノウイルス領域
を含む。
(1)第1、第2、第3、第4及び第5領域はAd5に対応する;
(2)第1、第2、第3、第4及び第5領域はAd6に対応する;
(3)第1領域はAd5に対応し、第2領域はAd5に対応し、第3領域はAd6に対応し、第4領域はAd6に対応し、第5領域はAd5に対応する。
DNAワクチンプラスミドは遺伝子発現カセットと共に複製及び好ましくはベクター選択を容易とする要素を含む。好ましい要素は非哺乳動物細胞における複製及び選択マーカーを与える。前記ベクターは、ヒト細胞における複製またはヒト核酸への組込みを与える要素を含むべきではない。
Ad6組換え核酸は、配列番号8中に存在するAd6領域に実質的に類似するAd6領域及びAd6核酸中に存在しない領域を含む。Ad6領域を含む組換え核酸は、別のAd6領域の産生において、Ad6ベースのベクターの作成における中間体として、または組換え遺伝子のデリバリー用ベクターとしてのように各種用途を有する。
Transfer)」,Advances in Pharmacology,Vol.40,Academic Press発行に記載されている。
a)Ad5またはAd6のいずれかに対応する塩基対約1〜塩基対約450の第1アデノウイルス領域、
b)前記第1領域に連結した、E1平行またはE1逆平行方位の遺伝子発現カセット、
c)前記発現カセットに連結した、Ad5に対応する塩基対約3511〜塩基対約5548またはAd6に対応する塩基対約3508〜塩基対約5541の第2アデノウイルス領域、
d)前記第2領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約5549〜塩基対約28133またはAd6に対応する塩基対約5542〜塩基対約28156の第3アデノウイルス領域、
e)場合によっては存在する、前記第3領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約28134〜塩基対約30817またはAd6に対応する塩基対約28157〜塩基対約30788の第4アデノウイルス領域、
f)第4領域が存在するときにはその第4領域に連結し、第4領域が存在しないときには第3領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約30818〜塩基対約33966またはAd6に対応する塩基対約30789〜塩基対約33784の第5アデノウイルス領域、及び
g)前記第5領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約33967〜塩基対約35935またはAd6に対応する塩基対約33785〜塩基対約35759の第6アデノウイルス領域
を含むかまたはこれらから構成されるが、少なくとも1つのAd6領域は存在する。
a)Ad5またはAd6のいずれかに対応する塩基対約1〜塩基対約450の第1アデノウイルス領域、
b)前記第1領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約3511〜塩基対約5548またはAd6に対応する塩基対約3508〜塩基対約5541の第2アデノウイルス領域、
c)前記第2領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約5549〜塩基対約28133またはAd6に対応する塩基対約5542〜塩基対約28156の第3アデノウイルス領域、
d)前記第3領域に連結した、E3平行またはE3逆平行方位の遺伝子発現カセット、
e)前記遺伝子発現カセットに連結した、Ad5に対応する塩基対約30818〜塩基対約33966またはAd6に対応する塩基対約30789〜塩基対約33784の第4アデノウイルス領域、及び
f)前記第4領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約33967〜塩基対約35935またはAd6に対応する塩基対約33785〜塩基対約35759の第5アデノウイルス領域、
を含むかまたはこれらから構成されるが、少なくとも1つのAd6領域は存在する。
ベクターは、制限酵素の使用、核酸ライゲーションや相同組換えを含むような組換え核酸方法を用いて作成され得る。組換え核酸方法は当業界で公知である(Ausubel,「分子生物学における現在のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」,John Wiley(1987−1998年)発行;Sambrookら,「分子クローニング,実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)」,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989年)発行)。
アデノウイルスゲノムプラスミドは、長いプラスミド(コスミドであってもよい)内にアデノベクター配列を含む。長いプラスミドは、プラスミドを産生及び維持するために使用される手順に応じて真核または細菌細胞における増殖及び選択を促進するような追加要素を含み得る。アデノウイルスゲノムプラスミドを産生するための方法には、シャトルベクター及び相同組換えの使用を含む技術及び遺伝子発現カセットのアデノウイルスコスミドへの挿入を含む技術が含まれる(Hittら,Methods in Molecular Genetics,7:13−30(1995);Danthinneら,Gene Therapy,7:1707−1714(2000))。
a)Ad5またはAd6のいずれかに対応する塩基対約1〜塩基対約450の第1アデノウイルス領域、
b)前記第1領域に連結した、E1平行またはE1逆平行方位の遺伝子発現カセット、
c)前記発現カセットに連結した、Ad5に対応する塩基対約3511〜塩基対約5548またはAd6に対応する塩基対約3508〜塩基対約5541の第2アデノウイルス領域、
d)前記第2領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約5549〜塩基対約28133またはAd6に対応する塩基対約5542〜塩基対約28156の第3アデノウイルス領域、
e)前記第3領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約30818〜塩基対約33966またはAd6に対応する塩基対約30789〜塩基対約33784の第4アデノウイルス領域、
f)前記第4領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約33967〜塩基対約35935またはAd6に対応する塩基対約33785〜塩基対約35759の第5アデノウイルス領域、及び
g)場合によっては存在する、所望アデノベクターの全サイズを考慮してより小さなインサートのために存在し得る、Ad5またはAd6中に存在するE3領域の全部または一部に対応するE3領域
から構成される。
a)Ad5またはAd6のいずれかに対応する塩基対約1〜塩基対約450の第1アデノウイルス領域、
b)前記第1領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約3511〜塩基対約5548またはAd6に対応する塩基対約3508〜塩基対約5541の第2アデノウイルス領域、
c)前記第2領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約5549〜塩基対約28133またはAd6に対応する塩基対約5542〜塩基対約28156の第3アデノウイルス領域、
d)前記第3領域に連結した、E3平行またはE3逆平行方位の前記遺伝子発現カセット、
e)前記遺伝子発現カセットに連結した、Ad5に対応する塩基対約30818〜塩基対約33966またはAd6に対応する塩基対約30789〜塩基対約33784の第4アデノウイルス領域、及び
f)前記第4領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約33967〜塩基対約35935またはAd6に対応する塩基対約33785〜塩基対約35759の第5アデノウイルス領域
を含む。
(1)第1、第2、第3、第4及び第5領域はAd5に対応する;
(2)第1、第2、第3、第4及び第5領域はAd6に対応する;
(3)第1領域はAd5に対応し、第2領域はAd5に対応し、第3領域はAd6に対応し、第4領域はAd6に対応し、第5領域はAd5に対応する。
(1)第1、第2、第3、第4及び第5領域はAd5に対応する;
(2)第1、第2、第3、第4及び第5領域はAd6に対応する;
(3)第1領域はAd5に対応し、第2領域はAd5に対応し、第3領域はAd6に対応し、第4領域はAd6に対応し、第5領域はAd5に対応する。
アデノベクターは、当業界で公知であるかまたは本明細書に記載されている方法を用いて組換えアデノウイルスゲノムプラスミドからレスキューされ得る。当業界で公知のアデノウイルスレスキューの方法の例は、Hittら,Methods in Molecular Genetics,7:13−30(1995)及びDanthinneら,Gene Therapy,7:1707−1714(2000)に記載されている。
HCVポリタンパク質コード化核酸の部分最適化により、ヒトでの発現のために最適化されるコドンの量は完全最適化に比して少なくなる。全目的は、最適化コドンを有するHCVポリタンパク質コード化核酸を含むアデノベクターの作成を促進しながら、コドン最適化のために高い発現という効果を与えることである。
HCV Met−NS3−NS4A−NS4B−NS5A−NS5Bワクチンは単独で患者を治療するために使用され得、他のHCV治療薬と一緒に使用され得、及び他のタイプの疾患を標的とする物質と一緒に使用され得る。追加の治療には、HCV及びHCV感染患者に広く蔓延している疾患を治療するための追加の治療薬が含まれる。他のタイプの疾患を標的とする物質にはHIV及びHBVに対するワクチンが含まれる。
HCVワクチンは、当業界で公知の方法を用い、本明細書に記載されているガイダンスを用いて処方、患者に投与される。医薬投与の一般的ガイドラインは、例えばいずれも援用により本明細書に含まれるとするModern Vaccinology,Kurstak編,Plenum Med.Co.(1994年)発行;Remington’s Pharmaceutical Science,第18版,Gennaro編,Mack Publishing(1990年)発行;及びModern Pharmaceutics,第2版,Banker及びRhodes編,Marcel Dekker,Inc.(1990年)発行に記載されている。
電気媒介導入、すなわち遺伝子エレクトロトランスファー(GET)は、核酸注射後適当な電気パルスをデリバリーすることにより実施され得る(Mathiesenの国際特許出願公開第98/43702号パンフレット参照)。プラスミド注射及びエレクトロポレーションはステンレス針を用いて実施され得る。針は2つ、3つまたはそれ以上の複雑なパターンで使用され得る。1つの構成では、針を、機械的支持体であり且つ適当なケーブルを用いて電場発生装置に針をつなげるプリント基板上にはんだ付けされている。
(治療1) パルス長0.2msec/フェーズ、周波数1000Hz、定電圧モード、45ボルト/フェーズ、浮動電流で1秒おきにデリバリーされる1000スクェア双極性パルス10列、
(治療2) パルス長2msec/フェーズ、周波数100Hz、定電流モード、100mA/フェーズ、浮動電圧で1秒おきにデリバリーされる1000スクェア双極性パルス2列、
(治療3) 約2msec/フェーズのパルス長で全部で3秒間の双極性パルス2列(組織に流れる実際の電流は約50mAに固定されている)
が含まれる。
医薬的に許容され得る担体により、ワクチンの貯蔵及びワクチンの被験者への投与が容易となる。医薬的に許容され得る担体の例は本明細書に記載されている。別の医薬的に許容され得る担体は当業界で公知である。
好適な投与レジメは、特定ワクチンの効力及び諸要因(例えば、患者の年齢、体重、性別及び医学的状態;投与ルート;所望効果;及び投与回数)を考慮して決定され得る。特定ワクチンの効力は各種因子、例えば細胞において発現、プロセシングされ、MHCクラスI及びII複合体の関係で提示されるポリペプチドを産生する特定ワクチンの能力に依存する。
非相同初回−追加接種は、初回接種のために1タイプのウイルスベクター、追加接種のために別のタイプのウイルスベクターを使用することを含む混合方式である。非相同初回−追加接種では、異なるアデノウイルス血清型をベースとするベクターのような関連ベクター及びより遠縁のウイルス(例えば、アデノウイルス及びポックスウイルス)を使用し得る。マウスをマラリアから防御するためにポックスウイルス及びアデノウイルスベクターを使用することはGilbertら,Vaccine,20:1039−1045(2002)に記載されている。
HCVワクチンはアジュバントと一緒に処方され得る。アジュバントはDNAプラスミドワクチンのために特に有用である。アジュバントの例はミョウバン、AlPO4、アルヒドロゲル、リピド−A及びその誘導体または変異体、フロインド不完全アジュバント、中性レポソーム、ワクチン及びサイトカインを含むリポソーム、ノニオン性ブロックコポリマー及びケモカインである。
アデノベクター及びDNAワクチンは各種タイプの緩衝液を用いて貯蔵され得る。例えば、以下の実施例9に記載の緩衝液A105をベクター貯蔵のために使用し得る。
Met−NS3−NS4A−NS4B−NS5A−NS5B発現カセット
HCV NS3−NS4A−NS4B−NS5A−NS5Bをコードする各種遺伝子発現カセットを1bサブタイプHCV BK株をベースとして構築した。コードされる配列は、(1)活性NS5B配列(“NS”)、(2)不活性NS5B配列(“NSmut”)、または(3)不活性NS5B配列を有するコドン最適化配列(“NSOPTmut”)を有していた。前記発現カセットはCMVプロモーター/エンハンサー及びBGHポリアデニル化シグナルも含んでいた。
NS、NSmutまたはNSOPTmut配列を有するpV1Jnsプラスミドの作成
NS配列、NSmut配列またはNSOPTmut配列のいずれかを含むpV1Jnsプラスミドを以下のように作成し、特徴づけた。
HCV BKタイプ株由来のコード領域Met−NS3−NS4A−NS4B−NS5A及びコード領域Met−NS3−NS4A−NS4B−NS5A−NS5B(Tomeiら,J.Virol.,67:4017−4026(1993))をpcDNA3プラスミド(Invitrogen)にクローン化して、それぞれpcD3−5a及びpcD3−5bを作成した。PcD3−5AをHindIIIで消化し、クレノウ充填で平滑末端化し、その後XbaIで消化して、Met−NS3−NS4A−NS4B−NS5Aのコード領域に対応する断片を作成した。この断片をpV1Jns−polyにクローン化し、BglIIで消化し、クレノウ充填で平滑末端化し、その後XbaIで消化して、pV1JnsNS3−5Aを作成した。
塩基 pV1JnsAの1〜1881、
追加 AGCTT、
次に Met−NS3−NS5B配列(配列番号5)、
次に wt TGAストップ、
追加 TCTAGAGCGTTTAAACCCTTAATTAAGG(配列番号14)、
塩基 pV1JnsAの1912〜4909。
V1JnsNS3−5Aを、完全コザック配列の付加によりNS3コード配列の5’において修飾した。プラスミド(V1JNS3−5Aコザック)は、AflII消化により直線化したV1JNS3−5Aと、イントロンAの近位部分、制限部位BglII、完全コザック翻訳開始配列及びNS3コード配列の一部を含むPCR断片とを同時形質転換させる細菌株BJ5183への相同組換えにより得られた。
塩基 pV1JnsAの1〜1882、
次に コザックMet−NS3−NS5B(mut)TAAA配列(配列番号2)、
追加 TCTAGA、
塩基 pV1JnsAの1925〜4909。
酵素活性を阻害するための変異NS5B、完全コザック翻訳開始配列及び強翻訳停止を有するヒトコドン最適化合成遺伝子(NSOPTmut)を遺伝子の5’及び3’末端に存在するBamHI及びSalI制限部位で消化した。次いで、遺伝子をpV1JnsAプラスミドのポリリンカー中に存在するBglII及びSalI制限部位にクローン化して、pV1Jns−NSOPTmutを作成した。
塩基 pV1JnsAの1〜1881、
追加 C、
次に コザックMet−NS3−NS5B(optmut)TAAA配列(配列番号3)、
追加 TTTAAATGTTTAAAC(配列番号15)、
塩基 pV1JnsAの1905〜4909。
L−グルタミン(最終4mM)を補充した10% FCS/DMEMにおいて増殖させたHEK293細胞のトランスフェクションによりHCV NSタンパク質の発現を試験した。トランスフェクションの24時間前に、トランスフェクション日に90〜95%集密度に達するまで細胞を直径35mmの6ウェルにおいて平板培養した。LIPOFECTAMINE 2000試薬を用いて、ラウス肉腫ウイルスプロモーターの制御下で40ngのプラスミドDNA(非飽和DNA量として前もって測定)を100ngのルシフェラーゼリポーター遺伝子を含むpRSV−Lucプラスミドと同時トランスフェクトした。細胞をCO2インキュベーター中37℃において48時間保持した。
プラスミドDNAベクターを用いるマウス免疫化
抗−HCV免疫応答を誘発する可能性を評価するために、各種マウス株にDNAプラスミドpV1Jns−NS、pV1Jns−NSmut及びpV1Jns−NSOPTmutを注射した。2種の株(Balb/C及びC57Black6,N=9−10)に対してDNA(25または50μg)を筋肉内注射した後電気パルスを加えた。各動物に対して3週間間隔で2回投与した。
アカゲサルの免疫化
7.5mg/mlのCRL1005、0.6mM ベンザルコニウムクロリド中のプラスミドpV1Jns−NSOPTmut(5mg)を筋肉内注射することによりアカゲザル(N=3)を免疫化した。各動物の三角筋に0及び4週目に2回注射した。
IFNγ ELISPOTアッセイによりHCV特異的Tリンパ球応答が定量測定される。PBMCを連続希釈し、抗−アカゲザルIFN−γ抗体(MD−1 U−Cytech)を被覆したマイクロプレートウェルに置く。これらをHCVペプチドプールと20時間培養すると、前駆体細胞の再刺激及びIFN−γの分泌が生じる。細胞を洗浄すると、細胞が存在している濃厚域に抗体被覆ウェルに結合した分泌IFNが残る。捕捉IFNはビオチニル化抗−アカゲザルIFN抗体(デテクターAb U−Cytech)及びアルカリホスファターゼコンジュゲートストレプトアビジン(Pharmingen 13043E)を順次用いて検出する。不溶性アルカリホスファターゼ基質を添加すると、ウェル中の細胞が存在する場所に暗いスポットが生じ、IFN−γを分泌したT細胞毎に1つのスポットが残る。
Ad6プリアデノウイルスプラスミドの構築
Ad6プレアデノウイルスプラスミドを以下のように得た。
第1世代Ad6ベクターを作成するために使用され得るAd6ベースのプレアデノウイルスプラスミドを、Ad5とAd6間の広い配列同一性(約98%)を利用するかまたはAd6領域のみを含めて構築した。wtAd6配列を細菌プラスミドにクローン化するために相同組換えを使用した。
A5領域を含み、E3領域が欠失しているAd6ベースのベクターを、Ad5領域を含むpAd6E1−E3+から始めて構築した。E3領域(Ad6 bp25871〜31192)を含むpAd6E1−E3+のA 5322bpサブ断片をpABS.3にサブクローン化して、pABSAd6E3を作成した。その後、このプラスミドにおいて3つのE3を欠失させて、3つの新しいプラスミドpABSAd6E3(1.8Kb)(Ad6 bp28602〜30440欠失)、pABSAd6E3(2.3Kb)(Ad6 bp28157〜30437欠失)及びpABSAd6E3(2.6Kb)(Ad6 bp28157〜30788欠失)を作成した。次いで、pAd6E1−E3+に3つのE3欠失部を逆置換するために細菌組換えを使用して、Ad6ゲノムプラスミドpAd6E1−E3−1.8Kb、pAd6E1−E3−2.3Kb及びpAd6E1−E3−2.6Kbを作成した。
NS配列を有するAd5ゲノムプラスミドの作成
コード領域NS3−NS4A−NS4B−NS5Aを含むpcDNA3プラスミド(Invitrogen)をXmuI及びNruI制限部位で消化し、CMVプロモーター、NS3−NS4A−NS4B−NS5Aコード領域及びウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナルを含むDNA断片をシャトルベクターpDelE1 SpaのユニークEcorV制限部位にクローン化して、Sva3−5Aベクターを作成した。
NSmut配列を有するアデノウイルスゲノムプラスミドの作成
NS−mut配列を含むアデノウイルスゲノムプラスミドをAd5またはAd6バックグラウンドで作成した。Ad6バックグラウンドは塩基1〜450、3511〜5548及び33967〜35935でAd5領域を含んでいた。
NSOPTmutを有するアデノウイルスゲノムプラスミドの作成
pCRBluntベクター(Invitrogen)にクローン化した配列番号3のヒトコドン−最適化合成遺伝子(NSOPTmut)をBamH1及びSalI制限酵素で消化し、シャトルベクターポリpMRKpdelE1中に存在するBglIV及びSalI制限部位にクローン化した。生じたクローン(ポリpMRKpdelE1NSOPTmut)をPacI及びBst1107I制限酵素で消化し、pAd5HVO(E1−,E3−)またはpAd6E1−E3−2.6Kb ClaI直線化ゲノムプラスミドと共に細菌株BJ5183に同時形質転換して、それぞれpAd5HVONSOPTmut及びpAd6E1−,E3−NSOPTmutを作成した。
アデノウイルスベクターのレスキュー及び増幅
アデノベクターをPer.6細胞においてレスキューした。Per.C6を、L−グルタミン(最終4mM)、ペニシリン/ストレプトマイシン(最終100U/ml)及び10mM MgCl2を補充した10% FCS/DMEMにおいて増殖した。感染後、細胞を5% ウマ血清(HS)を補充した同一培地において維持した。ウイルスレスキューのために、2.5×106個のPer.C6を6cmΦペトリ皿において平板培養した。
1.5d CsCl(0.5ml)、
1.35d CsCl(3ml)、
1.25d CsCl(3ml)、
ウイルス上清(5ml/チューブ)を適用した。
強化アデノベクターレスキュー
HCV NSOPTmut導入遺伝子を有する第1世代Ad5及びAd6ベクターはレスキューしがたいことが判明した。レスキュー過程の考えられる障害はアデノウイルスの複製機構のための最適以下鋳型であるプラスミドDNAの複製が効率的でないことに起因するであろう。ベクターのE1領域に挿入された導入遺伝子の非常に高いG−C含量に関連して、(通常ウイルスDNA中に存在する)DNAの5’末端に連結している末端タンパク質が不在であるために、プラスミド誘導アデノウイルスの複製速度が実質的に低減し得る。
pE2はクローニングベクターpBI(CLONTECH)をベースとし、細胞培養においてエピソームを複製し、選択するために2つの要素、すなわち(1)EBNA−1を発現させるときに細胞サイクルと同期してプラスミドを複製できるEBV−OriP(EBV[nt]7421−8042)領域及び(2)形質転換した細胞をポジティブ選択し得るハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(HPH)耐性遺伝子を加えた。アデノウイルス遺伝子E2a及びb及びE4−Orf6に対する2つの転写単位を構築し、下記するようにpE2において合わせた。
PerC6細胞を、10% ウシ胎仔血清(FBS)、10mM MgCl2、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)及び2mM グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)において培養した。
HCVポリタンパク質コード化核酸の部分最適化
ヒト宿主での発現のために最適化したコドンを含むアデノベクターの作成を促進するためにHCVポリタンパク質コード化核酸の部分最適化を実施した。総合的目的は、HCVポリタンパク質をコードするアデノベクターの作成を促進しながらコドン最適化により高い発現を与えることであった。
段階1)
インプット完全最適化NSOPTmut配列のコード領域を、各サイクル後1コドンだけスライディングウィンドをシフトする3コドン(9塩基)のスライディングウィンドを用いて分析した。5個以上の連続G’s及び/またはC’sを含むストレッチを前記ウィンドで検出したときにはいつも、以下の置換ルールを適用した。Let Nは既に実施したコドン置換の数を示す。Nが奇数のときにはウインド中の中間コドンを表5に特定したコドンで置換する。Nが偶数のときにはウィンドの第3末端コドンをhuman_high.codのようなコドン最適化表に特定されているコドンで置換する。LeuまたはValが第2または第3コドンに存在しているときには、非常に低い相対コドン使用頻度(例えば、human_high.cod参照)のLeuまたはValコドンが導入されないようにいずれの置換も適用しない。以下のサイクルで、シフトしたウインドの分析を以前のサイクルの置換を含む配列に適用した。
段階1)で実施した全てのコドン置換を含む配列を21コドン(63塩基)長のスライディングウィンドを用いて更に分析した。調節可能なパラメーターに従ってウィンド中の全GC含量を測定した。ウィンド中のGC含量が70%以上ならば、以下のコドン置換戦略を適用した。このウィンドでは、アミノ酸Asn、Asp、Cys、Glu、His、Ile、Lys、Phe、Tyrのコドンを表5に示すコドンで置換する。この組のアミノ酸に対する置換の限定は、a)置換コドンがhuman_high.codにおける許容されるぐらい高い使用頻度を有している、及びb)置換コドンについてGUTG中の平均全ヒトコドン使用は最も高頻度くらい高いという事実により考えられた。以下のサイクルでは、シフトしたウインドの分析を以前のサイクルの置換を含む配列に適用される。
次いで、段階1)及び2)により作成した配列を手動で編集し、追加コドンを以下の基準に従って変化させた。21コドンのウィンドにおいてなお70%以上のGC含量を有している領域を手動で試験して、数個のコドンを表5に示すスキームに従って再び置換した。
その後制限酵素のサブセットを用いてクローニングできるように、段階3で作成した配列を特定の制限部位(BglII、PmeI及びXbaI)の不在及び唯一のStuI部位の存在について試験した。2つの部位(BglIIに対する1部位及びStuIに対する1部位)を各認識部位の一部であるコドンを置換することにより配列から除去した。
次いで、段階1)〜4)により作成した配列をその後修飾NSOPTmut配列を(相同組換えにより)作成できるように修飾した。段階1)〜4)から得た配列では、塩基3556〜3755を含むセグメント及び塩基4456〜4656を含むセグメントをNSOPTmut由来の対応配列により置換した。相同組換えによりNSOPTmut中の問題の領域(No.3900あたり)を置換するために配列番号10の塩基3356〜4656を含むセグメントを使用して、配列番号11の配列を有するNSOPTmutの変異体を得ることができる。
段階1)〜5)で得た配列の分析から、相補鎖上の完全断片にほぼ広がっている可能性あるオープンリーディングフレームが示された。センス鎖からすべてのコドンCTA及びTTA(Leu)とTCA(Ser)を除去すると、相補鎖上の1つのリーディングフレームの1つ中の全てのストップコドンが有効的に除去された。この相補鎖オープンリーディングフレームの転写及びその後のタンパク質への翻訳の可能性は非常に少ないが、センス鎖上でコードされる配列の転写及びその後の翻訳との可能性ある干渉を避けるためにSerに対するTCAコドンをほぼ500塩基毎にセンス上に導入した。相同組換えを実施するために段階5)で導入したセグメントに変化を加えなかった。Serに対するTCAコドンはLeuに対するCTA及びTTAよりも好ましかった。なぜならば、human_high.codにおいてCTA(0.02)及びTTA(0.03)に比してTCA(0.05)は比較的により高い相対頻度であるからである。更に、CUTGからの平均ヒトコドン使用ではTCAが好ましかった(CTA及びTTAの0.07に対して0.14)。
最終段階では、最適化内部リボソームエントリー部位(コザックシグナル)を作成するためにGCCACCを配列の5’末端に付加し、3’にTAAAストップシグナルを付加した。NSsuboptmutの翻訳特性の開始を維持するために、コドン領域の最初の8コドンをNSOPTmut配列と同一に維持した。生じた配列を再びBglII、PmeI及びXbaI認識部位の不在及び唯一のStuI部位の存在についてチェックした。
ウイルス特徴づけ
アデノベクターを、(a)物理的粒子/mlの測定、(b)TaqMan PCRアッセイの実行、及び(c)HeLa細胞の感染後のタンパク質発現のチェックにより特徴づけた。
CsCl精製ウイルスを0.1% SDS PBSで1/10及び1/100希釈した。コントロールとして、緩衝液A105を使用した。これらの希釈物を55℃において10分間インキュベートした。チューブを軽く回転させた後、260nmでODを測定した。ウイルス粒子の量を、1OD260nm=1.1×1012物理的粒子/mlに従って計算した。結果は典型的には5×1011〜1×1012物理的粒子/mlであった。
TaqMan PCRアッセイをアデノベクターゲノムの定量(Q−PCR粒子/ml)のために使用した。TaqMan PCRアッセイは、ABI Prism 7700−配列デテクターを用いて実施した。反応をアデノウイルス骨格に対して特異的なプローブ(最終200μMで)及びオリゴヌクレオチド(最終200nMで)の存在下で最終50μl容量で実施した。ウイルスを0.1% SDS PBSで1/10希釈し、55℃において10分間インキュベートした。チューブを軽く回転させた後、連続1/10希釈物(水中)を調製した。10−3、10−5及び10−7希釈物10μlをPCRアッセイの鋳型として使用した。
HCV NSタンパク質の発現をHeLa細胞を感染させることにより試験した。1.5×106細胞/皿(10cmΦペトリ皿)の感染前日に細胞を平板培養した。50、250及び1250pp/細胞のm.o.i.に対応する異なる量のCsCl精製ウイルスを最終容量5mlまで培地(FCS非含有)で希釈した。希釈ウイルスを細胞に添加し、CO2インキュベーター中37℃において1時間インキュベートした(20分毎にやさしく混合)。5% HS−DMEM(5ml)を添加し、細胞を37℃で48時間インキュベートした。
各種NSカセットをコードするアデノベクターを用いるマウス免疫化
アデノベクターAd5−NS、MRKAd5−NSmut、MRKAd6−NSmut及びMRKAd6−NSOPTmutをC57Black6マウス株に注射して、抗−HCV免疫応答を誘発する可能性を評価した。動物群(N=9−10)には109ppのCsCl精製ウイルスを筋肉内注射した。各動物に対して3週間間隔で2回投与した。
アデノベクターを用いるアカゲザルの免疫化
アカゲザル(N=3−4)を、CsCl精製Ad5−NS、MRKAd5−NSmut、MRKAd6−NSmutまたはMRKAd6−NSOPTmutウイルスを筋肉内注射することにより免疫化した。各動物の三角筋に1011または1010vpを0及び4週目に2回投与した。
IFN−γ ICSのために、R10(10% FCSを補充したRPMI培地)(1ml)中の2×106PBMCをペプチドプール抗原で刺激した。各ペプチドの最終濃度は2μg/mlであった。細胞をCO2インキュベーター中37℃において1時間インキュベートした後、可溶性サイトカインの分泌を抑えるためにBrefeldin Aを10μg/mlの最終濃度まで添加した。細胞を37℃において更に14〜16時間インキュベートした。
Tリンパ球の識別エフェクター機能は、この細胞集団のサブセットの適切なMHC−関連抗原ペプチドを示す細胞を直接溶解する能力である。この細胞毒性活性は、CD8+ Tリンパ球に最も頻繁に関係している。
Claims (5)
- 1つ以上のAD6領域及びAD6中に存在しない領域を含む組換え核酸であって、少なくとも1つのAD6領域がE1A、E1B、E2B、E2A、E4、L1、L2、L4及びL5からなる群から選択されることを特徴とする前記組換え核酸。
- AD6中に存在しない前記領域がAD6中に存在しないポリペプチドをコードする発現カセットであることを特徴とする請求の範囲第1項に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸が、E1をイントランスで供給したときに複製できるE1を少なくとも欠くアデノウイルスベクターであることを特徴とする請求の範囲第2項に記載の組換え核酸。
- 前記ベクターが
a)Ad5またはAd6のいずれかに対応する塩基対約1〜塩基対約450の第1アデノウイルス領域、
b)前記第1領域に連結した、E1平行またはE1逆平行方位の前記遺伝子発現カセット、
c)前記遺伝子発現カセットに連結した、Ad5に対応する塩基対約3511〜塩基対約5548またはAd6に対応する塩基対約3508〜塩基対約5541の第2アデノウイルス領域、
d)前記第2領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約5549〜塩基対約28133またはAd6に対応する塩基対約5542〜塩基対約28156の第3アデノウイルス領域、
e)場合によっては存在する、前記第3領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約28134〜塩基対約30817またはAd6に対応する塩基対約28157〜塩基対約30789の第4アデノウイルス領域、
f)前記第4領域が存在するときにはその第4領域に連結し、前記第4領域が存在しないときには前記第3領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約30818〜塩基対約33966またはAd6に対応する塩基対約30789〜塩基対約33784の第5アデノウイルス領域、及び
g)前記第4領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約33967〜塩基対約35935またはAd6に対応する塩基対約33785〜塩基対約35759の第6アデノウイルス領域、
から構成され、ただし前記した第2、第3及び第5領域の少なくとも1つがAd6由来であることを特徴とする請求の範囲第3項に記載の組換え核酸。 - 前記ベクターが
a)Ad5またはAd6のいずれかに対応する塩基対約1〜塩基対約450の第1アデノウイルス領域、
b)前記第1領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約3511〜塩基対約5548またはAd6に対応する塩基対約3508〜塩基対約5541の第2アデノウイルス領域、
c)前記第2領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約5549〜塩基対約28133またはAd6に対応する塩基対約5542〜塩基対約28156の第3アデノウイルス領域、
d)前記第3領域に連結した、E3平行またはE3逆平行方位の前記遺伝子発現カセット、
e)前記遺伝子発現カセットに連結した、Ad5に対応する塩基対約30818〜塩基対約33966またはAd6に対応する塩基対約30789〜塩基対約33784の第4アデノウイルス領域、及び
f)前記第4領域に連結した、Ad5に対応する塩基対約33967〜塩基対約35935またはAd6に対応する塩基対約33785〜塩基対約35759の第5アデノウイルス領域
から構成され、ただし前記した第2、第3及び第4領域の少なくとも1つがAd6由来であることを特徴とする請求の範囲第3項に記載の組換え核酸。
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