CN107849111B - 在免疫显性腺病毒抗原表位中具有突变的溶瘤腺病毒及其在癌症治疗中的用途 - Google Patents

在免疫显性腺病毒抗原表位中具有突变的溶瘤腺病毒及其在癌症治疗中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有腺病毒蛋白的免疫显性T细胞表位的功能性缺失的溶瘤腺病毒，以及使用该溶瘤腺病毒来治疗诸如癌症等疾病的方法。该溶瘤腺病毒还可包括各自编码肿瘤抗原或表位的一种或多种异源核酸序列。该溶瘤腺病毒还可包括用于赋予选择性和抗肿瘤效力的DNA序列的其它突变和插入。本发明应用于癌症治疗领域。

Description

在免疫显性腺病毒抗原表位中具有突变的溶瘤腺病毒及其在 癌症治疗中的用途
技术领域
本发明的领域大体涉及一种具有腺病毒蛋白的免疫显性T细胞表位的功能性缺失的溶瘤腺病毒，以及使用该溶瘤腺病毒来治疗诸如癌症等疾病的方法。
背景技术
目前，癌症治疗主要是基于化疗、放疗和手术。尽管早期实施治疗的成功率高，但大多数晚期疾病由于无法通过手术切除肿瘤或可给药的放疗和化疗剂量受限于对正常细胞的毒性而无法治愈。为了缓解这个问题，开发了追求更高选择性和效力的生物技术策略。其中，基因疗法和病毒疗法使用对癌症具有治疗目标的病毒。在基因疗法中，对病毒进行修饰以避免其复制并用作治疗性遗传物质的媒介物或载体。另一方面，病毒疗法使用在肿瘤细胞中选择性复制和增殖的病毒。在病毒疗法中，肿瘤细胞是由于细胞内的病毒复制引起细胞病变效应而死亡，而不是由治疗基因的作用而死亡。在肿瘤细胞中的优先复制称为溶瘤作用。虽然在广泛意义上，词语“溶瘤”可用于能够裂解肿瘤细胞的任何可复制的病毒(甚至无选择性)；但在严格意义上，只有在肿瘤中选择性复制的病毒才被称为溶瘤病毒。在本说明书中，术语“溶瘤”在两种意义下使用。
免疫疗法是基于利用免疫系统来消除肿瘤。治疗的主要观念是刺激或恢复免疫系统识别肿瘤细胞并激活效应细胞以选择性破坏它们的能力。不同的免疫疗法分为以下两组：a)被动疗法，其目的在于提高已有的抗肿瘤免疫力；和b)主动疗法，其涉及直接刺激患者免疫系统来引起抗肿瘤免疫应答。被动免疫疗法包括阻断抑制免疫系统信号的单克隆抗体，例如，易普利姆玛(Ipilimumab)(CTLA-4)、纳武单抗(Nivolumab)(PD-1)或MDX-1105(PD-L1)(Pardoll,D.M.,Nat Rev Cancer.2012Mar；12(4):252-64)。在该组中，我们还发现自体T细胞的转移。有若干种赋予抗肿瘤能力的技术，但都涉及一定程度的细胞离体操作。细胞离体操作包括：a)刺激针对肿瘤抗原的细胞并特异性地扩增这些细胞；b)通过插入针对肿瘤相关抗原的转基因的高亲和力T细胞受体(TCR)或将TCR替换为嵌合抗原受体(CAR)，来引入肿瘤特异性受体(Kalos,M.and June,C.H.,Immunity 2013Jul 25；39(1):49-60)。在主动疗法的情况下，一种方法是在体内重新激活或重新刺激患者的免疫系统。例如，数十年来，已经使用免疫刺激细胞因子IL-2来治疗黑素瘤和肾癌(Amin,A.and White,R.L.Jr.,Oncology(Williston Park).2013；112(277):680-91)。此外，已经在癌症治疗中使用了TNF-α(van Horssen,R.,et al.,Oncologist.2006Apr；11(4):397-408)以及I型和II型IFN(Kotredes,K.P.and Gamero,A.M.,J Interferon Cytokine Res.2013Apr；33(4):162-70)。最后，近年来发展更多的领域之一是治疗性疫苗(Myc,L.A.,et al.,Arch ImmunolTher Exp(Warsz).2011Aug；59(4):249-59)。已经有大量制剂用于免疫，包括：基于DNA的疫苗(Bei,R.and Scardino A.,J Biomed Biotechnol.2010；2010:102758)、基于肽的疫苗(Arens,R.,et al.,Semin Immunol.2013Apr；25(2):182-90；Vacchelli,E.,et al.,Oncoimmunology.2012Dec 1；1(9):1557-1576)、基于树突状细胞的疫苗(Bonaccorsi,I.,et al.,Immunol Lett.2013Sep-Oct；155(1-2):6-10；Palucka,K.and Banchereau,J.,Immunity.2013Jul 25；39(1):38-48)和基于病毒载体的疫苗(Larocca,C.and Schlom,J.,Cancer J.2011Sep-Oct；17(5):359-71)。尽管已经做出了很大努力，这一类型的疗法的效果仍然有限。要克服的主要障碍是肿瘤免疫抑制以及所诱导的应答的效能和特异性。
癌症病毒疗法的使用时间比基因疗法更长。第一例关于用病毒治愈癌症的报道追溯至上世纪初。在1912年，De Pace在宫颈癌中接种狂犬病毒后肿瘤发生消退(De Pace N.,Ginecologia 1912；9:82-89)。自1912年De Pace以来，已经将许多类型的病毒注射到肿瘤中来治疗它们。存在表现出天然趋瘤性的病毒，例如，自主性细小病毒、水疱性口炎病毒和呼肠孤病毒。其它病毒可经基因操作来实现在肿瘤中的选择性复制。例如，已经通过缺失核糖核苷酸还原酶基因，对于在诸如肿瘤细胞中进行活跃增殖来说不必要的酶活性，而赋予了单纯疱疹病毒(HSV)趋瘤性。然而，腺病毒由于其低致病性和感染肿瘤细胞的高效力，而成为癌症病毒疗法和基因疗法中最为常用的病毒。
在癌症病毒疗法中使用复制型病毒是基于以下想法：作为病毒复制的结果，肿瘤被破坏并且所释放的病毒后代感染周围的细胞。多轮复制后，实现了肿瘤的完全破坏。原则上，最初仅感染少数细胞，但病毒复制效果产生链式反应，这样病毒扩散遍及整个肿瘤块。一旦病毒到达并感染周围的正常细胞，病毒就由于其肿瘤选择性而不能在它们中复制，正常组织不会受到致病影响。
在选择用于癌症病毒疗法的病毒种类时，要考虑不同的方面。腺病毒是具有二十面体衣壳的直径为70～90nm的无包膜病毒。它们的基因组是大小范围为25～45千碱基的线性、双链DNA，在两个末端处具有反向末端重复(ITR)，且具有附于5'末端的末端蛋白(Russell,W.C.,J Gen Virol 2009 90:1-20)。腺病毒具有裂解性复制周期，从而杀死它们在其中复制的细胞。此外，对腺病毒生物学的广泛了解和操作腺病毒DNA的可能性使得易于通过几种策略赋予选择性，改善诸如肿瘤细胞感染性等其它特征，并增加溶瘤效力。另外，腺病毒是在具有免疫能力的患者中具有非常低的突变率和非常温和的病理学的病毒。此外，腺病毒的复制能力高，这使得它能以高度浓缩的量(1012～1013病毒颗粒(vp)/mL)产生。
二十面体衣壳通过三种主要蛋白形成，其中六邻体三聚体是最丰富的(Nemerow,G.R.,et al.Virology 2009 384:380-8)。衣壳的十二个顶点中各自还包含五聚体蛋白，共价连接至纤维的五邻体基底。纤维是从五邻体基底突出的三聚体蛋白质，是一种有节的棒状结构。其它病毒蛋白IIIa、IVa2、VI、VIII和IX同样与病毒衣壳相关联。蛋白VII、小肽mu和末端蛋白(TP)与DNA相关联。蛋白V经由蛋白VI提供至衣壳的结构连接。
六邻体蛋白是最丰富的衣壳蛋白并占病毒总蛋白质质量的63％。蛋白具有定义明确的不同结构区域。V1和V2结构域形成每个亚基的基底。这些结构域采用“双筒(doublebarrel)”或“双卷(double jellyroll)”构造，并产生伪六面体同源三聚体形式，这允许病毒壳体的更大的组装。这些结构由底部的VC区和上半部分的环DE2隔开。这些区域高度保守，因此在稳定V1和V2中扮演重要角色。DE1、FG1和FG2形成三聚体的顶部。DE1和FG1区包含高度可变且柔性的区域，其结构还未被确认。这些区域被称为高变区(HVR)。可在不影响病毒组装的情况下，在HVR中进行各种修饰(Roberts,D.M.,et al.,Nature.2006May 11；441(7090):239-43；Alba,R.,et al.,Blood.2009Jul 30；114(5):965-71；Matthews,Q.L.,MolPharm.2011Feb 7；8(1):3-11)。
人腺病毒属于腺病毒科。已经鉴定出五十七种人腺病毒血清型，并将它们分成六个不同组，A至G。人腺病毒5型(Ad5)属于C组，由含有36千碱基(kb)的双链、线性DNA的二十面体蛋白衣壳组成。腺病毒依赖于细胞机器(cellular machinery)来复制病毒基因组。它们可以感染静止期细胞并诱导它们进入能使病毒DNA复制的细胞周期S期样状态。Ad5基因组在两个DNA链上都具有八个重叠的转录单元。根据转录的时间顺序，将八个单元分组为：即刻早期基因(E1A)，早期基因(E1B、E2、E3、E4)，中期基因(IX,IVa)和晚期基因(L1-L5)(Russell,W.C.,J Gen Virol 2009 90:1-20)。在基因组的端部是彼此相同且包含病毒DNA复制起点的两个ITR序列。由腺嘌呤和胸腺嘧啶富集序列形成的病毒粒子包装信号存在于基因组的左端。
Ad5感染在成人中通常无症状，而在儿童中引起感冒和结膜炎。一般来说，Ad5感染上皮细胞，该上皮细胞在自然感染中是支气管上皮细胞。它凭借像触角一样从衣壳的十二个顶点伸出的纤维与参与细胞间粘附的细胞蛋白(被称为柯萨奇腺病毒受体(CAR))的相互作用来进入细胞。当病毒DNA到达细胞核时，开始早期基因(E1至E4)的转录。要表达的首批基因是来自早期1A区(E1A)的那些基因。E1A结合至细胞蛋白pRb(成视网膜细胞瘤蛋白)，以释放转录因子E2F来激活诸如E2、E3和E4等其它病毒基因，和激活细胞周期的细胞基因的转录。另一方面，E1B结合至转录因子p53来激活细胞周期并抑制所感染的细胞的凋亡。E2编码用于病毒复制的蛋白。E3编码抑制抗病毒免疫应答的蛋白。E4编码参与病毒RNA转运的蛋白。早期基因的表达引起基因组的复制，一旦基因组被复制，就引起主要晚期启动子的激活。该启动子驱动mRNA的表达，其中mRNA通过差异化剪切处理，产生编码形成衣壳的结构蛋白的所有RNA。
关于溶瘤腺病毒的设计，考虑两个重要的点：选择性和效力。为实现对肿瘤细胞的选择性，使用了三种策略：缺失在正常细胞中复制所需的，但在肿瘤细胞中复制非必要的病毒功能；将病毒启动子替换为肿瘤选择性启动子，例如，在肿瘤选择性启动子下驱动启动病毒复制的基因的表达；以及对感染宿主细胞必需的病毒衣壳蛋白进行修饰。通过这样的基因修饰，已获得相当水平的选择性，在肿瘤细胞中的复制效率比正常细胞中高10000倍。
腺病毒需要宿主细胞机器来复制其遗传物质。因此，在参与激活细胞复制或抑制细胞凋亡的病毒基因中的突变或缺失产生有条件的复制的病毒。相比之下，肿瘤细胞同时具有激活细胞周期和抑制凋亡的通路，这能使在参与激活病毒复制或抑制凋亡的病毒基因中具有突变或缺失的腺病毒进行复制。例如，在经感染的细胞中p53被激活，它的效果正常被E1b-55K阻断。鉴于p53在约50％的肿瘤中发生突变，病毒dl1520(ONYX-015)被用作溶瘤病毒(Bischoff,J.R.,et al.,Science.1996Oct 18；274(5286):373-6)。该病毒具有E1b-55K基因的827bp缺失。选择机制基于以下事实：在允许病毒的复制周期完成前，有功能性p53的正常细胞进入凋亡。然而，无功能性p53(或影响调节的其它失调)的肿瘤细胞能使病毒正常复制(Hall,A.R.,et al.,Nat Med.1998Sep；4(9):1068-72；Rothmann,T.,et al.,JVirol.1998Dec；72(12):9470-8；Goodrum,F.D.and Ornelles,D.A.,J Virol.1998Dec；72(12):9479-90)。
在另一实现选择性的策略中，E1A的部分缺失引起正常细胞中限制性复制，但允许在诸如癌细胞等靶细胞中复制。已建立特征为在CR2(恒定区2)中缺失24个碱基对的有条件复制的病毒，该病毒显示出在治疗神经胶质瘤和乳腺癌异种移植物方面是有效的且是选择性的(Fueyo,J.,et al.,Oncogene 2000 19:2-12；Heise,C.,et al.,Nat Med 2000 6(10):1139-9)。它们的癌症特异性是由于功能失调的E1A不能释放E2F1转录因子，这导致需要游离的E2F1。E2F1富含于pRb通路最经常被破坏的癌症细胞中(Hanahan,D.andWeinberg,R.A.,Cell.2000Jan 7；100(1):57-70)。
赋予肿瘤选择性的另一策略是使用携带腺病毒VA-RNA基因缺失的腺病毒(Cascalló,M.,et al.,Cancer Res.2003Sep 1；63(17):5544-50；Cascalló,M.,et al.,Hum Gene Ther.2006Sep；17(9):929-40)，这依赖于通常存在于肿瘤细胞中的RAS通路的激活或干扰素通路的截断。
赋予肿瘤选择性的另一策略是使用对特定类型的肿瘤具有特异性的启动子，来限制病毒复制必需的腺病毒基因的表达。已经使用各种特异性启动子，如甲胎蛋白启动子，来产生腺病毒(Hallenbeck,P.L.,et al.,Hum Gene Ther.1999Jul 1；10(10):1721-33)。该病毒在过表达甲胎蛋白的肝癌细胞中选择性复制。类似地，使用以下项构建了控制E1A表达的病毒：1)源自人前列腺特异性抗原(PSA)基因的启动子，以实现在表达PSA的前列腺癌细胞中的选择性复制(Rodriguez,R.,et al.,Cancer Res.1997Jul 1；57(13):2559-63)；2)人骨钙素(hOC)启动子，来实现在表达hOC的前列腺癌细胞中的选择性复制(Hsieh et al.,Cancer Res.2002Jun 1；62(11):3084-92)；以及3)DF3/MUC1启动子，来实现在MUC1阳性的乳腺癌细胞中的选择性复制(Kurihara,T.,et al.,J Clin Invest.2000Sep；106(6):763-71)。
与对某些类型的肿瘤具有特异性的启动子相比，响应E2F转录因子的启动子，如E2F-1启动子，在广泛的肿瘤中允许病毒复制必需的腺病毒基因的表达(Cascallo,M.,etal.,Mol Ther.2007Sep；15(9):1607-15；Johnson,L.,et al.,Cancer Cell.2002May；1(4):325-37,Rojas,J.J.,et al.,Gene Ther.2009Dec；16(12):1441-51,Tsukuda,K.,etal.,Cancer Res.2002Jun 15；62(12):3438-47)。在正常细胞中，由于E2F与pRb相关联，所以来自E2F-1启动子的必需腺病毒基因的表达会被抑制。然而，在肿瘤细胞中，作为无pRb或pRb高度磷酸化的结果，存在水平增加的“游离”E2F，这引起来自E2F-1启动子的必需腺病毒基因的表达。例如，ICOVIR15K腺病毒(SEQ ID NO:1)包含插入到内源E1A启动子中的回文结构E2F结合位点。这些位点的插入能使E1AΔ24蛋白在诸如癌细胞等高度复制性细胞中进行选择性表达。此外，ICOVIR15K的E1AΔ24蛋白携带E1A的pRb结合位点的缺失，这使得突变体腺病毒在无症状的正常细胞中无法使pRb与E2F分离开。
对病毒衣壳蛋白进行修饰来实现选择性的实例是除去纤维轴的肝素硫酸盐糖胺聚糖(HSG)结合位点KKTK(SEQ ID NO:26)来减少肝趋向性(Bayo-Puxan,N.,et al.,HumGene Ther.2009Oct；20(10):1214-21)。在ICOVIR15K腺病毒中，这通过将纤维轴中的HSG结合位点KKTK(SEQ ID NO:26)替换为整合素结合基序(RGFK)(SEQ ID NO:27)来实现。ICOVIR15K腺病毒中的这种修饰提高了相对于野生型病毒纤维的肿瘤/肝脏转导率，增强了毒性特征，提高了癌细胞的病毒感染力，并增加了在体内实验模型中的抗肿瘤效力(Rojas,J.J.,et al.,Gene Ther.2012Apr；19(4):453-7)。
另外，已有关于若干种基因修饰来增加溶瘤效力的描述。这些修饰影响病毒进入细胞，或影响病毒从细胞中释放。为了增强进入步骤，病毒用来感染细胞的衣壳蛋白已被修饰。例如，在纤维中插入RGD肽(精氨酸-甘氨酸-天冬酰胺基序)能使腺病毒使用整合素连接到细胞中，而不仅仅如野生型腺病毒那样进行内化。使用整合素作为病毒的细胞受体增强了感染性和溶瘤效力。
对于增加病毒从被感染的细胞中的释放的修饰，这些修饰包括E1b-19K的缺失，E3-11.6K(ADP)的过表达，和使E3/19K定位在质膜中。E1b-19K是与Bcl-2同源的凋亡抑制因子。E1b-19K缺失通过被感染细胞的过早凋亡增加了细胞死亡。这种过早凋亡通常在许多被感染的细胞系中引起较低的总病毒产量；但却加速了病毒的快速释放，反过来加速了病毒在细胞培养物中的传播。因此，在噬斑试验中，不表达E1b-19K的突变体与野生型腺病毒相比呈现出大的噬斑表型。E3-11.6K(ADP)蛋白在被感染细胞的裂解中起作用，且ADP的过表达增加了积累在核内的病毒的释放。ADP过表达病毒的表型的特征还在于：大的空斑以及在被感染细胞的上清中存在更多病毒。通过以下两种机制实现了ADP过表达：1)除去除ADP外，或除ADP和E3-12.5K外的其它E3基因；以及2)将ADP基因插入到强启动子后面。将除ADP外，或除ADP和E3-12.5K外的其它E3基因除去，去掉了由E3启动子驱动的mRNA前体中的其它剪切位点。没有这些剪切位点的竞争，有利于编码ADP的mRNA的加工。
用于增加腺病毒溶瘤效力的另一个策略是：将治疗性基因插入到溶瘤腺病毒的基因组中以产生“武装溶瘤腺病毒”。在这种情况下，治疗性基因将必须利用以下方式来介导未被感染的肿瘤细胞的死亡：激活具有旁效应(也就是说，杀死未被感染的邻近细胞的效应)的前药，激活针对肿瘤的免疫系统，诱导凋亡，抑制血管生成，或除去细胞外基质，等等。在这些情况中，治疗性基因的表达方式和时机对于治疗性方法的最终结果来说是关键的。
对于经治疗性基因武装以激活针对肿瘤的免疫系统的溶瘤病毒，被病毒感染的细胞在递送非病毒抗原(即，肿瘤抗原)用于交叉呈递方面是优越的(Schulz,O.,et al.,Nature.2005Feb24；433(7028):887-92)，且预期病毒诱导的细胞死亡会增强肿瘤相关抗原被树突细胞(DC)摄取的可能性(Moehler,M.H.,et al.,Hum Gene Ther.2005Aug；16(8):996-1005)，随后增强细胞毒性T细胞的刺激。此外，病毒感染可改变来自肿瘤的细胞因子产生的平衡，随后影响对肿瘤的免疫反应的性质，即通过抵消肿瘤微环境的免疫抑制性质(Prestwich,R.J.,et al.,Expert Rev Anticancer Ther.2008Oct；8(10):1581-8)。最重要的是，病毒可经设计以高表达免疫原性蛋白，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。当免疫原性蛋白在肿瘤细胞内表达时，它们是特异性和持久的抗肿瘤免疫力的强效刺激剂。将免疫治疗基因引入肿瘤细胞中，并且进一步翻译成蛋白质，引起免疫应答的激活并且更有效地破坏肿瘤细胞。在这方面，最相关的免疫细胞是自然杀伤细胞(NK)和细胞毒性CD8+T细胞。
针对溶瘤病毒的免疫应答是研发病毒治疗时要考虑的最重要的参数之一。关于宿主的免疫应答，两个看似相反的立场正在发挥作用。一个认为免疫系统是在消灭所有肿瘤细胞之前除去溶瘤病毒的屏障。另一个认为病毒是诱导抗肿瘤免疫应答的媒介物。
术语“免疫优势”和“免疫显性”最初在二十世纪六、七十年代使用，指对特定抗原决定簇的特别有效力的体液免疫应答。(Curtiss,L.K.and Krueger,R.G.,Immunochemistry.1975Dec；12(12):949-57；Johnston et al.,J PatholBacteriol.1968Apr；95(2):477-80)。几年之后，不同的作者描述了取决于病原体，实验小鼠中对各种病原体的应答仅限于H-2的某些等位基因；或者主要应答仅限于一个特定的H-2等位基因(Biddison et al.,J.Ex.Med.1978Dec 1；148(6):1678-86；Doherty P.C.andZinkernagel R.M.,Nature.1975Jul 3；256(5512):50-2)。还描述了特定的H-2等位基因与对给定抗原决定簇的低响应或无响应有关(Bennink,J.R.and Yewdell,J.W.,J ExpMed.1988Nov 1；168(5):1935-9)。随着关于抗原决定簇的肽性质的认识的发展，描述了根据诱导可检测到的免疫应答所需的抗原的量，存在免疫显性或亚显性决定簇(Sercarz,E.E.,et al.,Annu Rev Immunol.1993；11:729-66)。表位免疫优势是指被病毒或细菌感染后所观察到的现象，其中病毒或细菌具有多种抗原，并产生能够被MHC I类的3至6个不同的等位基因(在人中)呈递的数百或数千种肽。然而，这些表位中只有少数真正被某些MHC等位基因呈递并能够产生应答(Yewdell,J.W.and Del Val,M.,Immunity.2004Aug；21(2):149-53)。存在参与表位免疫优势的不同的因素，包括：免疫史；感染途径；病毒蛋白和抗原加工的丰度；肽/MHC复合体的运输和稳定性；MHC多个等位基因的共表达；初始细胞库中前体T细胞的频率；MHC/TCR相互作用；记忆性CTL的产生；以及调节性T(Treg)细胞的产生。总体而言，定义免疫优势层级的最重要参数是表位被有效地加工，并且对锚定到给定的MHC等位基因至少具有最小阈值亲和力(Beekman et al.,J Immunol.2000Feb 15；164(4):1898-905；Seifert et al.,J Clin Invest.2004Jul；114(2):250-9；Sette,A.,et al.,JImmunol.1994Dec 15；153(12):5586-92；Regner et al.,Viral Immunol.2001；14(2):135-49)。在缺少这些最小限度特征的情况下，表位不会与蛋白质降解的正常过程中产生的大量非免疫原性肽有区别。
尽管迄今为止付出了很多努力，但仍有必要去寻找有效治疗癌症的新的治疗方法。
发明内容
发明人惊奇地发现：含腺病毒蛋白的免疫显性T细胞表位的至少一个功能性缺失的溶瘤腺病毒在哺乳动物中引起从抗腺病毒免疫应答到抗肿瘤免疫应答的免疫转移(immune-shift)。因此，本发明提供了在腺病毒蛋白的免疫显性T细胞表位中具有突变的新型溶瘤腺病毒，及它们用于治疗疾病如癌症的方法。还提供了含编码溶瘤腺病毒的核酸序列的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的载体。进一步提供了含本发明的溶瘤腺病毒和/或多核苷酸的细胞。还提供了包含所述新型溶瘤腺病毒的组合物(如药物组合物)。此外，还提供了制备和使用所述新型溶瘤腺病毒的方法，例如，使用新型溶瘤腺病毒诱导肿瘤细胞裂解，抑制哺乳动物体内的肿瘤生长，治疗哺乳动物体内的癌症和/或增加哺乳动物体内的对抗癌症的免疫应答的方法。
因此，在一个方面，本发明提供了一种溶瘤腺病毒，所述溶瘤腺病毒含腺病毒蛋白的免疫显性T细胞表位的至少一个功能性缺失。这种缺失的目的是间接地使得针对肿瘤抗原的免疫应答更强，但不一定旨在提供对肿瘤细胞更好的感染性或复制趋向性。在某些实施方式中，所述免疫显性T细胞表位是人淋巴细胞抗原(HLA)I类限制性表位。在实施方式中，所述免疫显性T细胞表位是人淋巴细胞抗原A2.1(HLA-A2.1)限制性表位。在某一实施方式中，所述免疫显性T细胞表位是人淋巴细胞抗原(HLA)II类限制性表位。
在一个实施方式中，与缺少所述至少一个缺失的亲代腺病毒相比，所述至少一个功能性缺失与大幅降低的细胞毒性或大幅降低的病毒复制无关。
在另一实施方式中，免疫显性T细胞表位的所述至少一个功能性缺失在选自由以下项组成的组中的腺病毒蛋白中：E1A、E1B、六邻体、五邻体基底、纤维蛋白、衣壳蛋白IX、DNA聚合酶和单链DNA结合蛋白。在某一实施方式中，免疫显性T细胞表位的所述至少一个功能性缺失在腺病毒六邻体蛋白中。在某一实施方式中，免疫显性T细胞表位的所述至少一个功能性缺失在腺病毒六邻体蛋白的保守的基底区(conserved base region)中。
在某些实施方式中，免疫显性T细胞表位的所述至少一个功能性缺失选自由以下项组成的组中：Hex512(GLVDCYINL)(SEQ ID NO:23)，Hex713(YLNHTFKKV)(SEQ ID NO:11)，Hex892(LLYANSAHA)(SEQ ID NO:15)，和Hex917(YVLFEVFDV)(SEQ ID NO:19)。在某些实施方式中，所述腺病毒包括选自由以下项组成的组中的至少一个突变：Hex512表位中的L520P突变，Hex713表位中的V721A突变，Hex892表位中的A900S突变，和Hex917表位中的V925K。
在一个实施方式中，所述腺病毒包括免疫显性T细胞表位Hex512(GLVDCYINL)(SEQID NO:23)和Hex917(YVLFEVFDV)(SEQ ID NO:19)的功能性缺失。在某一实施方式中，所述腺病毒包括Hex512表位中的L520P突变和Hex917表位中的V925K。
在一个实施方式中，所述腺病毒包括免疫显性T细胞表位Hex713(YLNHTFKKV)(SEQID NO:11)，Hex892(LLYANSAHA)(SEQ ID NO:15)和Hex917(YVLFEVFDV)(SEQ ID NO:19)的功能性缺失。在另一实施方式中，所述腺病毒包括Hex713表位中的V721A突变，Hex892表位中的A900S突变和Hex917表位中的V925K。
在一个实施方式中，所述腺病毒包括免疫显性T细胞表位Hex512(GLVDCYINL)(SEQID NO:23)，Hex713(YLNHTFKKV)(SEQ ID NO:11)，Hex892(LLYANSAHA)(SEQ ID NO:15)和Hex917(YVLFEVFDV)(SEQ ID NO:19)的功能性缺失。在另一实施方式中，所述腺病毒包括Hex512表位中的L520P突变，Hex713表位中的V721A突变，Hex892表位中的A900S突变和Hex917表位中的V925K。
在一个实施方式中，所述腺病毒是人腺病毒。在某些实施方式中，所述腺病毒是选自由以下项组成的组中的人腺病毒：人腺病毒血清1至51型及它们的衍生物。在一个实施方式中，所述腺病毒是人腺病毒血清5型。
在某些实施方式中，所述溶瘤腺病毒在肿瘤中选择性复制。在一个实施方式中，所述溶瘤腺病毒在肿瘤中选择性复制，并进一步包括组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子以实现在肿瘤中的选择性复制。在另一实施方式中，所述组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子是控制选自由E1a、E1b、E2和E4组成的组中的一种或多种基因的表达，以实现在肿瘤中的选择性复制的启动子序列。在某一实施方式中，所述组织特异性启动子选自由以下项组成的组：E2F启动子、端粒酶hTERT启动子、酪氨酸酶启动子、前列腺特异性抗原启动子、甲胎蛋白启动子和COX-2启动子。在某一实施方式中，所述溶瘤腺病毒在肿瘤中选择性复制，并进一步包括在选自由E1a、E1b、E4和VA-RNA组成的组中的一种或多种基因中的突变，以实现在肿瘤中的选择性复制。
在某些实施方式中，所述腺病毒进一步包括衣壳修饰以增加它的感染性或靶向肿瘤细胞中存在的受体。
在一些实施方式中，所述腺病毒进一步包括常用于癌症基因治疗领域中的至少一种基因。在某一实施方式中，常用于癌症治疗领域中的所述至少一种基因是选自由前药激活基因、肿瘤抑制基因和免疫刺激基因组成的组中的基因。
在另一实施方式中，本发明的溶瘤腺病毒进一步包括各自编码肿瘤抗原或表位的一种或多种异源核酸序列。在某一实施方式中，所述一种或多种异源核酸序列包括各自编码肿瘤抗原或表位的1至5种异源核酸序列。在某一实施方式中，所述肿瘤抗原或表位由选自以下项组成的组：MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、CEA、酪氨酸酶、中期因子、BAGE、CASP-8、β-连环蛋白(β-catenin)、CA-125、CDK-1、ESO-1、gp75、gp100、MART-1、MUC-1、MUM-1、p53、PAP、PSA、PSMA、ras、trp-1、HER-2、TRP-1、TRP-2、IL13Rα、IL13Rα2、AIM-2、AIM-3、NY-ESO-1、C9orf1l2、SART1、SART2、SART3、BRAP、RTN4、GLEA2、TNKS2、KIAA0376、ING4、HSPH1、C13orf24、RBPSUH、C6orf153、NKTR、NSEP1、U2AF1L、CYNL2、TPR、SOX2、GOLGA、BMI1、COX-2、EGFRvIII、EZH2、LICAM、活素(Livin)、MRP-3、巢蛋白、OLIG2、ART1、ART4、B-细胞周期蛋白、Gli1、Cav-1、组织蛋白酶B、CD74、E-钙粘蛋白、EphA2/Eck、Fra-1/Fosl1、GAGE-1、神经节苷脂/GD2、GnT-V、β1,6-N、Ki67、Ku70/80、PROX1、PSCA、SOX10、SOX11、生存素、UPAR、间皮素和WT-1，或它们的表位。在一个实施方式中，所述肿瘤抗原或表位是人肿瘤抗原或表位。
在某些实施方式中，所述异源核酸序列插入到腺病毒基因中，其中所述基因编码上述具有免疫显性T细胞表位的至少一个缺失的腺病毒蛋白。
在某些实施方式中，所述异源核酸序列插入到腺病毒基因中，其中所述腺病毒基因编码除上述具有免疫显性T细胞表位的至少一个缺失的腺病毒蛋白外的其他腺病毒蛋白。
在某些实施方式中，所述异源核酸序列插入到编码腺病毒六邻体蛋白的腺病毒基因中。在一个实施方式中，所述异源核酸序列插入到所述腺病毒六邻体蛋白的高变区中。在另一实施方式中，所述高变区是高变区5(HVR5)。
在某些实施方式中，所述肿瘤抗原或表位的两侧是柔性连接子。在一个实施方式中，所述柔性连接子包括选自由以下项组成的组中的氨基酸序列：GSGSR(SEQ ID NO:28)、AGSGSR(SEQ ID NO:29)和AGSGS(SEQ ID NO:30)。
在实施方式中，所述一种或多种异源核酸序列编码gp100肿瘤抗原或表位，或酪氨酸酶肿瘤抗原或表位。在某一实施方式中，所述一种或多种异源核酸序列包括：(a)编码gp100抗原或表位的异源核酸序列和(b)编码酪氨酸酶抗原或表位的异源核酸序列。在某一实施方式中，所述gp100肿瘤抗原或表位包括氨基酸序列YLEPGPVTA(SEQ ID NO:31)，而所述酪氨酸酶抗原或表位包括氨基酸序列YMDGTMSQV(SEQ ID NO:32)。在某一实施方式中，编码gp100抗原或表位的异源核酸序列插入到所述腺病毒六邻体蛋白的高变区5中。在某一实施方式中，编码酪氨酸酶肿瘤抗原或表位的异源核酸序列插入到所述腺病毒六邻体蛋白的高变区5中。在某一实施方式中，编码gp100抗原或表位的异源核酸序列和编码酪氨酸酶抗原或表位的异源核酸序列均插入到所述腺病毒六邻体蛋白的高变区5中。
在另一实施方式中，本发明提供了一种溶瘤腺病毒，所述溶瘤腺病毒含SEQ IDNO:3或4所示的核苷酸序列。
在另一实施方式中，本发明提供了一种溶瘤腺病毒，所述溶瘤腺病毒含SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括药理学有效剂量的本发明的溶瘤腺病毒，和一种或多种药学上可接受的载剂或赋形剂。
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明的药物组合物和使用说明书。在某一实施方式中，所述试剂盒进一步包括一种或多种额外的治疗剂。在某一实施方式中，所述治疗剂为化学治疗剂。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的溶瘤腺病毒。
本发明还提供了一种制备感染性腺病毒颗粒的方法，所述方法包括：(a)在允许所述溶瘤腺病毒增殖和形成感染性腺病毒颗粒的条件下培养本发明的宿主细胞，以及(b)回收所述感染性腺病毒颗粒。
本发明还提供了本发明的溶瘤腺病毒在制备用于治疗或预防哺乳动物中的癌症或引起癌症的癌前病变的药物中的应用。在一个实施方式中，所述哺乳动物是人。
本发明还提供了本发明的溶瘤腺病毒用作药物。在某一实施方式中，本发明的溶瘤腺病毒用作癌症的预防和/或治疗剂。
本发明还提供了一种诱导肿瘤细胞裂解的方法，所述方法包括：将所述肿瘤细胞与有效量的本发明的溶瘤腺病毒或药物组合物接触，以诱导所述肿瘤细胞的裂解。本发明还提供了一种抑制哺乳动物中的肿瘤生长的方法，所述方法包括：将治疗有效量的本发明的溶瘤腺病毒或药物组合物给药予所述哺乳动物。在某一实施方式中，所述哺乳动物是人。
在实施方式中，所述肿瘤是选自由以下项组成的组中的肿瘤：腺癌、腺瘤、星形细胞瘤、恶性上皮肿瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、囊腺瘤、无性细胞瘤、红白血病、纤维瘤、纤维肉瘤、粒层细胞瘤、血管瘤、血管肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、莱迪希细胞瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、成淋巴细胞白血病、淋巴细胞白血病、淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑色素瘤、肥大细胞瘤、黑色素细胞瘤、脑膜瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓性白血病、少突神经胶质瘤、骨瘤、骨肉瘤、浆细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、精原细胞瘤、支持细胞瘤、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状上皮乳头状瘤、滑膜细胞肉瘤、胸腺瘤和移行细胞癌。
本发明还提供了一种治疗哺乳动物中的癌症的方法，所述方法包括：将治疗有效量的本发明的溶瘤腺病毒或药物组合物给药予所述哺乳动物。本发明还提供了一种用于增加哺乳动物中的针对癌症的免疫应答的方法，所述方法包括：将本发明的溶瘤腺病毒或药物组合物，以有效增加所述哺乳动物中的针对所述一种或多种肿瘤抗原或表位的免疫应答的量给药予所述哺乳动物。在某一实施方式中，所述哺乳动物是人。
在一个实施方式中、所述癌症选自由以下项组成的组：鼻咽癌、滑膜癌、肝细胞癌、肾癌(renal cancer)、结缔组织癌、黑色素瘤、肺癌、肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、脑癌、喉癌、口腔癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、绒毛膜癌、胃泌素瘤、嗜铬细胞瘤、泌乳素瘤、T细胞白血病/T细胞淋巴瘤、神经瘤、希佩尔-林道综合征(von Hippel-Lindau disease)、卓-艾综合征(Zollinger-Ellison syndrome)、肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、输尿管癌、少突神经胶质瘤、成神经细胞瘤、脑膜瘤、脊髓肿瘤、骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、原发部位不明的癌症、类癌、胃肠道类癌、纤维肉瘤、乳腺癌、佩吉特氏病、宫颈癌、食道癌、胆囊癌、头癌、眼癌、颈癌、肾脏癌(kidney cancer)、维尔姆斯瘤、卡波西肉瘤、前列腺癌、睾丸癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、内分泌胰腺癌、胰高血糖素瘤、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、垂体癌、软组织肉瘤、成视网膜细胞瘤、小肠癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞癌(trophoblastic cancer)、葡萄胎、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、听神经瘤、蕈样霉菌病、胰岛素瘤、类癌瘤综合征、生长抑素瘤、牙龈癌、心脏癌、唇癌、脑膜癌、口癌(mouth cancer)、神经癌、腭癌、腮腺癌、腹膜癌、喉咽癌(pharynxcancer)、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌和扁桃体癌。
在一个实施方式中，通过瘤内、静脉内、血管内、鞘内、气管内、肌肉内、皮下、腹腔内、皮内、非肠道，鼻内、经皮、眼部、颅内或口服给药的方式，给药所述溶瘤腺病毒或药物组合物。在一个实施方式中，将腺病毒的约104至1014的病毒颗粒给药予所述哺乳动物。在某一实施方式中，将约103至1013的空斑形成单位的腺病毒给药予所述哺乳动物。
在一个实施方式中，所述方法进一步包括将一种或多种额外的治疗剂给药予所述哺乳动物。在某一实施方式中，所述治疗剂为化学治疗剂。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括与选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组中的序列至少90％一致，至少95％一致，至少99％一致或100％一致的序列。本发明还提供了一种载体，所述载体包括本发明的分离的多核苷酸。本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的载体。
附图说明
图1：溶瘤腺病毒ICOVR15K-gp100-tyr(SEQ ID NO:2)中六邻体修饰的示意图。
图2：显示细胞病变效应(CPE)的腺病毒的十次连续传代(P)的示意图。
图3：ICOVIR15K(SEQ ID NO:1)、ICOVIR15K-TD(SEQ ID NO:3)、ICOVIR15K-gp100-tyr(SEQ ID NO:2)和ICOVIR15K-TD-gp100-tyr(SEQ ID NO:4)溶瘤病毒的空斑实验。
图4：ICOVIR15K、ICOVIR15K-TD、ICOVIR15K-gp100-tyr和ICOVIR15K-TD-gp100-tyr溶瘤病毒的细胞毒性及它们对应的IC50值。
图5A-B：ICOVIR15K、ICOVIR15K-TD、ICOVIR15K-gp100-tyr和ICOVIR15K-TD-gp100-tyr溶瘤病毒的病毒产生实验。图5A显示在感染后不同时间，由每种病毒产生的每毫升转导单位(TU)的总数。图5B显示在感染后不同时间，由每种病毒释放的TU/ml的数量。
图6A-C：ICOVIR15K-TD-gp100-tyr中的突变表位于HAd5中野生型表位相比的结合亲和力。图6A显示了突变的腺病毒表位的HLA-A2.1亲和力曲线。图6B显示了肿瘤表位的HLA-A2.1亲和力曲线。图6C显示了对于每种突变的Kd值和功能性。
图7：用具有或不具有三重缺失的ICOVIR15K-gp100-tyr对转基因HLA-A2.1小鼠的免疫。使用IM给药灭活病毒进行初始免疫，并用活性病毒静脉内给药进行加强免疫，两者均为每只小鼠1010vp。使用每孔2500000的脾细胞进行ELISPOT。Hx库(六邻体库)。初始脾细胞(
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splenocytes)用ICOVIR15K-gp100-tyr(15K-gp-tyr)或ICOVIR15K-TD-gp100-tr(15K-TD-pgtyr)感染24h，并随后在ELISPOT实验中，加入到来自经免疫小鼠的脾细胞中。
图8A-D：图8A显示了用含ICOVIR15-TD-gp100-tyr的不同溶瘤腺病毒给HHD转基因小鼠接种的实验设计。在第0天肌内(IM)给予1010病毒颗粒(vp)的单次用量的灭活病毒，随后在第14天使用静脉内(IV)注射活性病毒给予1010vp的加强用量。21天后，用106个B16CAR-A2细胞攻击(challenge)小鼠。随时间监控肿瘤生长表现(图8B)和生长(图8C)，直至对脾细胞进行ELISPOT分析。图8D显示了使用GraphPad Prism绘制的存活曲线。最终的端点建立在500mm3。N＝12个肿瘤注射位点/组，N＝6只小鼠/组。
图9：携带突变TD(ICOVIR15K-TD；SEQ ID NO：3)或QD(ICOVIR15K-QD；SEQID NO：5)的溶瘤腺病毒的细胞毒性评估与亲代(ICOVIR15K)进行比较，以便确定它们的IC50值。以不同的MOI感染A549细胞，并在感染后6天用BCA实验评估细胞存活。使用GraFit计算IC50值。
图10A-B：ICOVIR15K-QD中的突变表位Hex512和Hex917相比于HAd5中野生型表位的肽结合亲和力。图10A显示了突变的Hex512和Hex917的HLA-A2.1亲和力曲线。图10B显示了每种突变的Kd值和功能性。
图11A-B：转基因C57BL/6A2/KbH-2+小鼠中ICOVIR15K与ICOVIR15K-QD的相比的抗肿瘤效力。将B16CAR-A2细胞皮下注射到小鼠两侧腹中并允许形成肿瘤。肿瘤用ICOVIR15K、ICOVIR15K-QD或PBS进行瘤内注射。图11A显示了肿瘤体积。图11B显示了肿瘤消退。在第0天注射1010vp/肿瘤的病毒。N＝7～9个肿瘤/组。
图12A-C：转基因HHD转基因小鼠中ICOVIR15K与ICOVIR15K-QD的相比的抗肿瘤效力。图12A是显示了将B16CAR-A2细胞皮下注射到小鼠两侧腹中并允许形成肿瘤的示意图。感染后9天，右侧肿瘤用ICOVIR15K(N＝6),ICOVIR15K-QD(N＝5)或PBS(N-4)以1010vp/肿瘤的量进行瘤内注射(第0天)。对于所有组，均未处理左侧肿瘤。图12B显示了经直接注射的肿瘤的体积。图12C显示了未经注射的肿瘤的体积(对侧的)(N＝6～7个肿瘤/组)。
图13：在携带B16CAR-A2肿瘤的转基因HLA-A2.1小鼠中，瘤内给药1010vp/肿瘤的ICOVIR15K或ICOVIR15K-QD后产生的免疫应答。使用每孔2,500,000个脾细胞进行ELISPOT。B16+IFN是指对预先用IFN-γ孵育的B16CAR-A2肿瘤的反应性。
具体实施方式
本发明提供了一种新型试剂，包括但不限于在腺病毒蛋白的免疫显性T细胞表位中具有一个或多个功能性缺失的溶瘤腺病毒。还提供了相关的多肽和多核苷酸，含溶瘤腺病毒的组合物，以及制备或生产溶瘤腺病毒的方法。进一步提供了使用该新型溶瘤腺病毒的方法，如诱导肿瘤细胞裂解，抑制肿瘤生长，治疗癌症和/或增加对癌症的免疫应答的方法。
I.定义
为了便于理解本发明，下面对一些术语和词语进行了定义。
如本文所提到的，术语“腺病毒”是指分离自人的52种以上的腺病毒亚型，以及一样多的来自其它哺乳动物或鸟类的腺病毒亚型。参见，例如Strauss,S.E.,"AdenovirusInfections in Humans,"in The Adenoviruses,Ginsberg,ed.,Plenum Press,New York,N.Y.,pp.451-496(1984)。术语“腺病毒”在本文中可以用缩写“Ad”后接指示血清型的数字来表示，如Ad5。
如本文所使用的，术语“溶瘤腺病毒”是指能够在肿瘤细胞中复制或为在肿瘤细胞中有复制能力的腺病毒。它们不同于非复制型腺病毒，因为非复制型腺病毒不能在靶细胞中复制。非复制型腺病毒在基因治疗中用作向靶细胞运载基因的运载体，因为目的是在完整的细胞内表达治疗性基因而不是裂解细胞。相反，溶瘤腺病毒的治疗作用是基于复制能力和裂解靶细胞的能力，从而消除肿瘤细胞。如本文所使用的，溶瘤腺病毒包括：即使没有选择性，也能够裂解肿瘤细胞的增殖型腺病毒；和在肿瘤中选择性复制的溶瘤腺病毒。
如本文所使用的，术语“增殖型腺病毒载体”或“增殖型腺病毒”分别指，在特定细胞或组织中进行病毒复制所需的任何基因功能都不存在缺陷的任何腺病毒载体或腺病毒。所述载体或腺病毒能够复制并被包装，但可能在特定细胞或组织中选择性复制或仅有条件地复制。
如本文所使用的，“肿瘤特异性溶瘤腺病毒”是选择性杀死增殖性失调的细胞如癌细胞的腺病毒。“肿瘤特异性溶瘤腺病毒”优先在预定细胞群体中抑制细胞增殖、引起细胞裂解或诱导凋亡(统称为杀死)，该预定细胞群体具有支持病毒复制的给定表型。在不具有预定的细胞表型的细胞中，这样的病毒不能抑制细胞增殖、引起细胞裂解、诱导凋亡或以其它方式复制，或其能力是有限的。癌细胞的杀死可以通过现有技术中已有的任何方法来检测，例如，测定活细胞计数、细胞病变效应、赘生性细胞的凋亡、癌细胞中病毒蛋白的合成(如通过代谢标记、病毒蛋白的Western分析或复制所需的病毒基因的逆转录聚合酶链式反应)或肿瘤尺寸的减小。
如本文所使用的，“免疫显性T细胞表位的功能性缺失”是指在免疫显性T细胞表位编码序列中引起表位的HLA-A2结合亲和力降低至少约10倍的任何突变(如插入、替换或缺失)。
在本文中，术语“表位”或“抗原决定簇”可互换使用，是指能够被免疫系统(如T细胞、B细胞和抗体)识别的抗原的部分。当抗原为多肽时，表位可以由连续的氨基酸，和通过蛋白质三级折叠并置的非连续的氨基酸形成。由连续的氨基酸形成的表位在蛋白质变性后通常得以保留，而通过三级折叠形成的表位在蛋白质变性后通常丢失。表位通常包括处于独特的空间构象中的至少3个，且更经常至少5个或8～10个氨基酸。术语“免疫显性T细胞表位”是指与被细胞同时处理的同一抗原或其它抗原的其它表位相比，易于被免疫系统识别并引起稳健的CD4+或CD8+T细胞应答的抗原的表位或抗原决定簇。
如本文所使用的，具有“细胞毒性大幅降低”的腺病毒是指感染后5天在A549细胞中，其IC50值(达到50％细胞毒性所需的感染复数)与亲代腺病毒相比降低约2倍或更多倍的腺病毒。
如本文所使用的，具有“病毒复制大幅降低”的腺病毒是指感染后60小时在A549细胞中，总病毒爆发大小(viral burst size)(由一个经感染细胞产生的病毒颗粒的量)与亲代腺病毒相比降低超过约一个对数级(one log)的腺病毒。
“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是以非天然存在的形式存在的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括那些已被纯化至不再是天然存在的形式的程度。在一些实施方式中，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。
如本文所使用的，“基本上纯的”是指至少50％纯的(即没有污染物)，至少90％纯的，至少95％纯的，至少98％纯的或至少99％纯的物质。
如本文所使用的，术语“增殖性失调”是指细胞增殖比正常组织生长更快的任何细胞性失调。增殖性失调包括，但不限于癌症。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中细胞群体以不受监管的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于恶性上皮肿瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这些癌症的更具体实例包括：鼻咽癌、滑膜癌、肝细胞癌、肾癌(renal cancer)、结缔组织癌、黑色素瘤、肺癌、肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、脑癌、喉癌、口腔癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、绒毛膜癌、胃泌素瘤、嗜铬细胞瘤、泌乳素瘤、T细胞白血病/T细胞淋巴瘤、神经瘤、希佩尔-林道综合征、卓-艾综合征、肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、输尿管癌、少突神经胶质瘤、成神经细胞瘤、脑膜瘤、脊髓肿瘤、骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、原发部位不明的癌症、类癌、胃肠道类癌、纤维肉瘤、乳腺癌、佩吉特氏病、宫颈癌、食道癌、胆囊癌、头癌、眼癌、颈癌、肾脏癌(kidney cancer)、维尔姆斯瘤、卡波西肉瘤、前列腺癌、睾丸癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、内分泌胰腺癌、胰高血糖素瘤、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、垂体癌、软组织肉瘤、成视网膜细胞瘤、小肠癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞癌(trophoblastic cancer)、葡萄胎、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、听神经瘤、蕈样霉菌病、胰岛素瘤、类癌瘤综合征、生长抑素瘤、牙龈癌、心脏癌、唇癌、脑膜癌、口癌(mouth cancer)、神经癌、腭癌、腮腺癌、腹膜癌、喉咽癌(pharynxcancer)、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌和扁桃体癌。
“肿瘤”和“赘生物”是指由过度的细胞生长或增殖产生的任何组织块，是良性的(非癌性的)或包括癌前病变的恶性的(癌性的)。肿瘤的实例包括但不限于：腺癌、腺瘤、星形细胞瘤、恶性上皮肿瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、囊腺瘤、无性细胞瘤、红白血病、纤维瘤、纤维肉瘤、粒层细胞瘤、血管瘤、血管肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、莱迪希细胞瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、成淋巴细胞白血病、淋巴细胞白血病、淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑色素瘤、肥大细胞瘤、黑色素细胞瘤、脑膜瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓性白血病、少突神经胶质瘤、骨瘤、骨肉瘤、浆细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、精原细胞瘤、支持细胞瘤、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状上皮乳头状瘤、滑膜细胞肉瘤、胸腺瘤和移行细胞癌。
术语“癌细胞”、“肿瘤细胞”和语法上的等同物是指来源于肿瘤或癌前期病变的细胞总群体，包括构成大部分肿瘤细胞群体的非致瘤细胞和致瘤干细胞(癌症干细胞)。当仅指缺乏更新和分化能力的那些肿瘤细胞时，如本文所使用的术语“肿瘤细胞”将由术语“非致瘤”来修饰，以区别于那些来自癌症干细胞的肿瘤细胞。
术语“受试者”是指将成为具体治疗的接受者的任何动物(如哺乳动物)，包括但不限于人、非人的灵长类动物、啮齿动物等。通常，在涉及人受试者时，术语“受试者”和“患者”在本文中可交换使用。
与一种或多种额外的治疗剂“组合”给药包括同时(并行)给药和以任何顺序连续给药。
术语“药物制剂”和“药物组合物”是指这样一种制剂，其形式使得活性成分的生物活性是有效的，且不含对于将要给药制剂的受试者来说有不可接受的毒性的额外成分。该制剂和组合物可以是无菌的。
术语“药学上可接受的盐”或“药学上可接受的载剂”是指包括用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐，这取决于在本文所述的化合物上发现的具体取代基。当本申请的化合物含有相对酸性的官能团时，可以通过使这种化合物的中性形式与足够量的所需碱在不掺水或在合适的惰性溶剂中接触来获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐或镁盐，或者类似的盐。当本申请的化合物含有相对碱性的官能团时，可以通过使这种化合物的中性形式与足够量的所需酸在不掺水或在合适的惰性溶剂中接触来获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括由无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等衍生的那些；以及由相对无毒的有机酸，如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等衍生的盐。还包括氨基酸诸如精氨酸等的盐，以及有机酸诸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见，例如Berge,S.M.,et al.,J Pharm Sci.1977Jan；66(1):1-19)。本领域技术人员已知的其它药学上可接受的载剂也适用于本申请的组合物。如本文所公开的，溶瘤腺病毒或其它药物的“有效量”是足以进行特定所宣称的目的(如治疗目的或预防目的)的量。根据所宣称的目的，“有效量”可以凭经验和以常规方式确定。
术语“治疗有效量”是指溶瘤腺病毒或其它药物的有效“治疗”受试者或哺乳动物中的疾病或失调的量。在癌症情况下，溶瘤腺病毒或其它药物的治疗有效量可减少癌细胞数量；减小肿瘤尺寸；抑制(在一定程度上减慢，在某一实施方式中停止)癌细胞浸润至外周器官；抑制(在一定程度上减慢，在某一实施方式中停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或，在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。参见本文“治疗”的定义。为了达到溶瘤腺病毒或药物可阻止已有的癌细胞生长和/或杀死已有的癌细胞的程度，其可以是抑制细胞生长的或是细胞毒性的。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间内，有效达到预期的预防效果的量。通常但非必要的，由于预防用量在疾病发病前或疾病早期用于受试者，因此预防有效量将少于治疗有效量。
术语“用量(dose)”和“剂量(dosage)”在本文中可以互换使用。用量是指每次给药时给予个体的活性成分的量。用量会根据一些因素而变化，包括用于给定疗法的正常用量范围，给药频率；个体大小和容忍度；症状的严重性；副作用的风险；以及给药途径。本领域技术人员将认识到可以根据上述因素或基于治疗进程来改变用量。术语“剂型”是指药物或药物组合物的特定形式，并取决于给药途径。例如，剂型可以是用于雾化的液体形式(例如用于吸入)，片剂或液体(例如用于口服递送)或盐溶液(例如用于注射)。
当在本文中使用时，“标签”一词是指可检测的化合物或组合物，其直接或间接地结合病毒颗粒或多肽以产生“有标签的”病毒颗粒或多肽。所述标签可以通过自身对其进行检测(如放射性同位素标签或荧光标签)，或在酶标签的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
“化学治疗剂”是不管作用机制如何，对治疗癌症有用的化合物。化学治疗剂的种类包括但不限于：烷化剂、抗代谢物，纺锤体毒素植物生物碱、细胞毒素/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、抗体、光敏剂和激酶抑制剂。化学治疗剂包括用于“靶向疗法”和常规化学疗法的化合物。
例如“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“以治疗(to treat)”或“缓减”或“以缓减”的术语是指：1)使经诊断的病理状况或失调的症状治愈、减缓、减轻，和/或使经诊断的病理状况或失调的进展停止的治疗措施；以及2)防止和/或减缓目标病理状况或失调发展的预防性或防止性措施。因此，那些需要治疗的人包括那些已经患有失调的人；那些容易患有失调的人；以及那些需要预防失调的人。在某些实施方式中，若患者表现出以下一项或多项，则根据本发明的方法成功“治疗”了受试者的癌症：癌细胞数量减少或完全消失；肿瘤尺寸减小；抑制或不存在癌细胞浸润到外周器官中，包括例如癌症扩散到软组织和骨中；抑制或不存在肿瘤转移；抑制或不存在肿瘤生长；与特定癌症相关的一种或多种症状缓解；发病率和死亡率降低；生活质量提高；致瘤性、致瘤率或致瘤能力降低；肿瘤中癌症干细胞的数量或发生率降低；致瘤细胞分化成非致瘤状态；或某些效果的组合。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中可以互换使用，是指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或者可以是通过DNA或RNA聚合酶可并入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸或他们的类似物。若存在对核苷酸结构的修饰，则该修饰可以在聚合物组装之前或之后被给予。核苷酸序列可以被非核苷酸成分打断。多核苷酸可以在聚合后进一步进行修饰，例如通过与标签成分结合来进行修饰。其它类型的修饰包括，例如“帽子(cap)”；用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，例如用不带电荷的键(如甲基膦酸酯，磷酸三酯，磷酰胺酯，氨基甲酸酯等)和用带电荷的键(硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)的那些；含侧基，诸如蛋白(如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、ply-L-赖氨酸等)的那些；具有嵌入物(如吖啶、补骨脂素等)的那些；含螯合物(如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些；含烷化剂的那些；具有修饰的键(如α端基异构核酸等)的那些；以及未修饰形式的多核苷酸。此外，通常存在于糖中的任何羟基可以被例如膦酸酯基团、磷酸酯基团替换，被标准保护基团保护，或者被活化以制备额外核苷酸的额外键，或者可以被结合到固体支持物上。5'和3'末端的OH可以被磷酸化，或被1至20个碳原子的胺或有机封端基团取代。其它羟基也可以衍生成标准保护基团。多核苷酸还可以含有本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括：例如，2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖，碳环糖类似物，α端基异构糖，差向异构糖如阿拉伯糖、木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，硫杂庚糖，非环类似物，和无碱基核苷类似物如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键可被替换成可替代的连接基团。这些可替代的连接基团包括但不限于：其中磷酸酯被替换为P(O)S(“硫代”)、“P(S)S(“二硫代”)”、“(O)NR2(“酰胺化”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲乙缩醛”)的实施方式，其中每个R或R'独立为H或被取代或未被取代的烷基(1-20C)，任选含乙醚(--O--)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳基。不是所有多核苷酸中的键都需要是相同的。前面的描述适用于本文所涉及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
术语“载体”指在宿主细胞中能够递送并表达感兴趣的一种或多种感兴趣的基因或序列的构建物。载体的实例包括但不限于病毒载体，裸DNA或RNA表达载体，质粒、粘粒或噬菌体载体，与阳离子缩合剂相关联的DNA或RNA表达载体，包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体，及某些真核细胞如生产细胞。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可以互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，可包括经修饰的氨基酸，且可以被非氨基酸打断。该术语还涵盖了经天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分结合。同样在该定义范围内的有：例如，含一种或多种氨基酸类似物的多肽(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本领域已知的其它修饰。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及后来经修饰的那些氨基酸，如羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即与氢、羧基，氨基和R基相结合的碳)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有经修饰的R基(如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化合物。
在两个或多个核苷酸或多肽背景下，术语“一致的”或百分比“同一性”是指在进行比较和比对时(如果需要，引入间隙)以获得最大对应性时，两个或更多个序列或子序列相同，或具有特定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基，而不考虑作为序列同一性一部分的任何保守氨基酸的取代。百分比同一性可以使用序列比较软件或算法或通过目测来测量。可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的各种算法和软件在本领域中是已知的。这样的序列比对算法的一个非限制性实例为描述于Karlin,S.and Altschul,S.F.,Proc Natl AcadSci USA.1990March；87(6):2264-2268中的，如Karlin,S.and Altschul,S.F.,Proc NatlAcad Sci USA.1993Jun 15；90(12):5873-5877中进行修改的，并引入到NBLAST和XBLAST程序(Altschul,S.F.,et al.,Nucleic Acids Res.1997Sep 1；25(17):3389-402)中的算法。在某些实施方式中，Gapped BLAST可以如Altschul et al.中描述的来使用，BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul,S.F.and Gish,W.,Methods Enzymol.1996；266:460-80.)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,California)或Megalign(DNASTAR)为可用于比对序列的额外的公开可用的软件程序。在某些实施方式中，使用GCG软件中的GAP程序(例如，使用NWSgapdna.CMP矩阵，以及40、50、60、70或90的间隙权重和1、2、3、4、5或6的长度权重)，来确定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。在某些替代性实施方式中，可以使用GCG软件包中的GAP程序来确定两个氨基酸序列间的百分比同一性(例如使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的间隙权重和1、2、3、4、5的长度权重)，该GCG软件包合并了Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))的算法。或者，在某些实施方式中，使用Myers和Miller的算法(CABIOS,4:11-17(1989))来确定核苷酸或氨基酸序列间的百分比同一性。例如，可以使用ALIGN程序(2.0版)并使用具有残基表的PAM120，12的间隙长度罚分和4的间隙罚分来确定百分比同一性。本领域技术人员可以确定用于通过具体比对软件进行最大比对的适当参数。在某些实施方式中，使用比对软件的默认参数。在某些实施方式中，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的百分比同一性“X”通过100×(Y/Z)来计算，其中，Y是在第一和第二序列比对中作为完全匹配得分的氨基酸残基数(通过目测或具体的序列比对程序进行比对)，而Z是第二序列中残基的总数。若第一序列的长度比第二序列长，则第一序列与第二序列的百分比同一性将大于第二序列与第一序列的百分比同一性。
作为非限制性实例，在某些实施方式中，可以使用Bestfit程序(WisconsinSequence Analysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,WI 53711)来确定任何具体的多核苷酸是否与参考序列具有一定的百分比序列同一性(例如，为至少约80％一致、至少约85％一致、至少约90％一致，且在一些实施方式中，至少约95％、96％、97％、98％或99％一致)。Bestfit使用Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)的局部同源算法，以发现两个序列之间的最佳同源片段。当使用Bestfit或任何其它序列比对程序来确定具体序列是否与本发明的参考序列例如95％一致时，将参数设定为：在参考核苷酸序列的全长上计算同一性百分比，且允许同源性中的间隙多达参考序列中核苷酸总数的5％。
在一些实施方式中，本发明的两个核酸或多肽基本上一致，是指如使用序列比较算法或通过目测来测量的，当比较和比对最大对应性时，它们具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％的核苷酸或氨基酸残基同一性，且在一些实施方式中具有至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸或氨基酸残基同一性。在某些实施方式中，同一性存在于长度为至少约10个、约20个、约40～60个残基或在其间的任何整数值的序列区域内，或存在于比60～80个残基长的至少约90～100个残基的区域内，或者序列在被比较的序列的全长，例如核苷酸序列的编码区上是基本上一致的。
“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残基所取代。本领域已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守取代。在某些实施方式中，本发明的多肽和抗体的序列中的保守取代不会取消含氨基酸序列的该多肽或抗体与抗原(即多肽或抗体结合的FOLR1)的结合。不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的鉴定方法是本领域公知的(参见例如，Brummell,D.A.,et al.,Biochemistry.1993Feb 2；32(4):1180-7；Kobayashi,H.,et al.,Protein Eng.1999Oct；12(10):879-84；和Burks,E.A.,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1997Jan 21；94(2):412-7)。
词语“严格杂交条件”是指在该条件下，通常在核酸的复杂混合物中，探针将与靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是序列依赖的并且在不同环境下是不一样的。较长序列在较高温度下特异性杂交。在Tijssen,P.,Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes.1993；24:19-78中能找到对核酸杂交的广泛指导。通常，选择严格条件比特定序列在限定的离子强度pH下的热解链温度(Tm)低约5～10℃。Tm是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下的)如下温度，在该温度下，与靶标互补的50％的探针以平衡状态与靶序列杂交(由于靶序列过量存在，因此在Tm处，50％的探针以平衡状态被占据)。严格条件也可以通过加入如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性杂交或特异性杂交，阳性信号至少是背景的两倍，优选是背景杂交的10倍。示例性的严格杂交条件可以是：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，在42℃下孵育，或者，5×SSC、1％SDS，在65℃下孵育，且用0.2×SSC和0.1％SDS在65℃下洗涤。
对于严格条件下不相互杂交的核酸来说，如果它们所编码的多肽基本上一致，则它们仍然是基本一致的。例如，当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性来产生核酸拷贝时，会发生这种情况。在这些情况下，核酸通常在中度严格杂交条件下杂交。示例性的“中度严格杂交条件”包括在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中在37℃下杂交，并在IXSSC中于45℃下洗涤。阳性杂交至少是背景的两倍。本领域普通技术人员将容易地认识到，可以利用替代性杂交条件和洗涤条件来提供具有相似严格性的条件。许多文献中提供了用于确定杂交参数的额外指导，例如，分子生物学最新指南(Current Protocols inMolecular Biology,ed.Ausubel,et al.,John Wiley&Sons)。
对于PCR，尽管退火温度取决于引物长度可在约32℃和48℃之间变化，但对于低严格性扩增来说通常为约36℃的温度。对于高严格性PCR扩增，虽然高严格性退火温度取决于引物长度和特异性可以在约50℃至约65℃的范围内变化，但通常为约62℃的温度。高严格性扩增和低严格性扩增的典型的循环条件包括：90℃至95℃持续30秒至2分钟的变性阶段；持续30秒至2分钟的退火阶段；约72℃持续1至2分钟的延伸阶段。例如，在Innis,M.A.,etal.,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.N.Y.(1990))中，提供了用于低严格性和高严格性扩增反应的方案和指南。
当用于例如细胞，或核酸、蛋白，或病毒，或载体时，术语“重组”指细胞、核酸、蛋白、病毒或载体已经实验室方法修饰或者是实验室方法的结果。因此，例如，重组蛋白包括由实验室方法生产的蛋白。重组蛋白可以包括在内源性(非重组)形式的蛋白中未发现的氨基酸残基，或者可以包括经修饰的(如被标记的)氨基酸残基。重组细胞、重组病毒、重组核酸、重组蛋白或重组载体可以包括通过引入异源核酸或蛋白质，或者通过内源性核酸或蛋白的改变，而被修饰的细胞、病毒、核酸、蛋白或载体。因此，例如，重组细胞包括以下细胞，该细胞表达在内源性(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或者其表达的内源基因表达异常、表达不足或完全不表达。
当用于核酸的部分时，术语“异源的”表示该核酸包括在自然界中彼此未发现相同关系的两个或更多个子序列。例如，该核酸通常重组地产生，具有来自不相关基因的两个或更多个序列，这两个或更多个序列经排列得到新的功能性核酸，例如，来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。类似地，异源蛋白是指该蛋白包括在自然界中彼此未发现相同关系的两个或更多个子序列(如融合蛋白)。
如本文所使用的，术语“修饰”是指核酸或蛋白序列的序列变化。例如，氨基酸序列修饰通常落入以下三类中的一种或多种：取代变体、插入变体或缺失变体。插入包括氨基和/或羧基末端的融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。缺失是以从蛋白序列去除一个或多个氨基酸残基为特征。如本文所使用的，符号Δ或德尔塔(delta)指示缺失。取代修饰是那些其中已经去除了至少一个残基并在其位置插入不同残基的修饰。氨基酸取代通常发生于单一残基，但是可以同时发生在许多不同的位置。取代、缺失、插入或它们的任何组合可以进行组合以得到最终构建体。这些修饰可以通过修饰编码蛋白质的DNA中的核苷酸，从而产生编码该修饰的DNA来制备。在序列已知的DNA中的预定位点处进行插入、缺失和取代突变的技术是公知的。修饰技术可涉及使用重组DNA技术来操作编码一种或多种多肽区域的DNA序列。任选地，修饰技术包括例如，重组、M13引物诱变和PCR诱变。
术语“转染(transfection)”、“转导(transduction)”、“转染(transfecting)”或“转导(transducing)”可以互换使用，并且被定义为将核酸分子或蛋白质引入细胞的过程。使用非病毒或基于病毒的方法将核酸引入细胞。核酸分子可以是编码完整蛋白或其功能部分的序列。核酸载体通常包括蛋白表达所需的元件(如启动子，转录起始位点等)。非病毒转染方法包括不使用病毒DNA或病毒颗粒作为递送系统将核酸分子引入细胞的任何合适的方法。示例性的非病毒转染方法包括磷酸钙转染、脂质体转染、核转染、声致穿孔、通过热休克转染、磁化和电穿孔。对于基于病毒的方法，任何有用的病毒载体均可用于本文所述的方法中。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体。在一些方面，按照本领域公知的标准程序使用腺病毒载体将核酸分子引入细胞中。术语“转染”或“转导”也指将蛋白从外部环境引入细胞。蛋白质的转导或转染通常依赖于能够穿过细胞膜的肽或蛋白质附着至目的蛋白质。参见例如，Ford,K.G.,et al.,GeneTher.2001Jan；8(1):1-4和Prochiantz,A.,Nat Methods.2007Feb；4(2):119-20。
“对照”或“标准对照”是指用作参考(通常是已知参考)的样品、测量值或数值，其用于与测试样品、测量值或数值进行比较。例如，可以从疑似患有给定疾病的患者(例如，自身免疫疾病、炎症性自身免疫疾病、癌症，传染病、免疫疾病或其它疾病)中获取测试样品，并与已知正常(未患病)个体(例如标准对照受试者)进行比较。标准对照还可以表示从未患给定疾病的相似个体(例如，标准对照受试者)的群体(即标准对照群体)收集的平均测量值或数值，其中相似个体例如为具有相似医学背景、相同年龄、体重等的健康个体。标准对照数值也可以从同一个体获得，例如，从疾病发作前的患者的较早获得的样品获得。技术人员应认识到，可以设计标准对照用于评估任何数量的参数(例如，RNA水平、蛋白水平、特定细胞类型、特定体液、特定组织、滑膜细胞、滑液、滑液组织、成纤维细胞样滑膜细胞、巨噬细胞样滑膜细胞等)。
本领域技术人员应理解，在给定情况下哪些标准对照是最合适的，并且能够基于与标准对照数值的比较来分析数据。标准对照对于确定数据的显著性(如统计学显著性)也是有价值的。例如，若给定参数的数值在标准对照中变化很大，则不会认为测试样本中的变化是显著的。
如本公开和权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确规定，单数形式“一/一个(a)”、“一/一个(an)”和“该/所述(the)”包括复数形式。
应该理解地是，无论在何处本文使用语言“包括/包含”来描述实施方式，同样提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其它类似的实施方式。
在本文中，在诸如“A和/或B”的表述中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。同样地，如在诸如“A、B和/或C”的表述中使用的术语“和/或”旨在包括以下各实施方式：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
II.溶瘤腺病毒
本发明提供了溶瘤腺病毒，该溶瘤腺病毒含腺病毒蛋白的免疫显性T细胞表位的至少一个功能性缺失。
在某些实施方式中，上述免疫显性T细胞表位是人淋巴细胞抗原(HLA)I类限制性表位。例如，在某些实施方式中，上述免疫显性T细胞表位是人淋巴细胞抗原A2.1(HLA-A2.1)限制性表位。在其它实施方式中，上述免疫显性T细胞表位是人淋巴细胞抗原(HLA)II类限制性表位。免疫显性表位是通过测量抗原免疫宿主(动物)后的免疫应答效力来鉴定的。针对给定表位的免疫应答效力是指在识别该表位后，识别且被激活的淋巴细胞的数量。细胞的免疫蛋白酶体将抗原切割成小片段(大约9个氨基酸)，并将这些片段移位到内质网，并装载到MHC I类或II类分子中以呈递给淋巴细胞上的T细胞受体。这种加工和呈递通路的效率取决于氨基酸的序列和MHC分子的单体型。所呈递的片段被定义为表位。免疫显性表位被定义为所呈递的片段，该片段激活经免疫的宿主的较高数量的淋巴细胞。可以使用诸如ELISPOT或细胞内细胞因子染色(ICS)等不同技术，对激活的淋巴细胞数量进行定量，其中，细胞因子染色通常检测由激活的淋巴细胞分泌的细胞因子。已经研究了在感染野生型腺病毒的人中识别人腺病毒表位的CD8+或CD4+的量，以鉴定人腺病毒的免疫显性表位。参见例如，Tang J.,et al.,Virology 2006Jul；350(2):312-22；Leen,A.M.,et al.,Blood2004Oct；104(8):2432-40；和Leen,A.M.,et al.,J Virol.2008Jan；82(1):546-54。
在一些实施方式中，与缺少至少一个缺失的亲代腺病毒相比，上述至少一个缺失与大幅降低的细胞毒性或大幅降低的病毒复制无关。
在某些实施方式中，免疫显性T细胞表位的上述至少一个缺失是腺病毒蛋白中，选自由以下项组成的组：E1A、E1B、六邻体、五邻体基底、纤维蛋白、衣壳蛋白IX、DNA聚合酶和单链DNA结合蛋白。在一些实施方式中，免疫显性T细胞表位的上述至少一个缺失在腺病毒六邻体蛋白的保守的基底区中。例如，在某些实施方式中，免疫显性T细胞表位的上述至少一个缺失选自由以下项组成的组：Hex512(GLVDCYINL)(SEQ ID NO:23)，Hex713(YLNHTFKKV)(SEQ ID NO:11)，Hex892(LLYANSAHA)(SEQ ID NO:15)，和Hex917(YVLFEVFDV)(SEQ ID NO:19)。在一些实施方式中，腺病毒包括选自由以下项组成的组中的至少一个突变：Hex512表位中的L520P突变，Hex713表位中的V721A突变，Hex892表位中的A900S突变和Hex917表位中的V925K。在某些实施方式中，腺病毒包括免疫显性T细胞表位Hex512(GLVDCYINL)(SEQ ID NO:23)和Hex917(YVLFEVFDV)(SEQ ID NO:19)的缺失。在一些实施方式中，腺病毒包括Hex512表位中的L520P突变和Hex917表位中的V925K突变。在某些实施方式中，腺病毒包括免疫显性T细胞表位Hex713(YLNHTFKKV)(SEQ ID NO:11)，Hex892(LLYANSAHA)(SEQ ID NO:15)和Hex917(YVLFEVFDV)(SEQ ID NO:19)的缺失。在一些实施方式中，腺病毒包括Hex713表位中的V721A突变，Hex892表位中的A900S突变和Hex917表位中的V925K。在某些实施方式中，腺病毒包括免疫显性T细胞表位Hex512(GLVDCYINL)(SEQ IDNO:23)，Hex713(YLNHTFKKV)(SEQ ID NO:11)，Hex892(LLYANSAHA)(SEQ ID NO:15)和Hex917(YVLFEVFDV)(SEQ ID NO:19)的缺失。在一些实施方式中，腺病毒包括Hex512表位中的L520P突变，Hex713表位中的V721A突变，Hex892表位中的A900S突变和Hex917表位中的V925K突变。
在某些实施方式中，腺病毒是人腺病毒。例如，在某些实施方式中，腺病毒是选自由以下项组成的组中的人腺病毒：人腺病毒血清1至51型及它们的衍生物。在一些实施方式中，腺病毒是人腺病毒血清5型。
可以对本文所描述的溶瘤腺病毒进行修饰以改善溶瘤腺病毒治疗癌症的能力。这样的溶瘤腺病毒的修饰已由Jiang,H.,et al.,Curr Gene Ther.2009Oct；9(5):422-7描述，还参见美国专利申请号20060147420，它们中的每一个都通过引用并入本文。例如，在几种肿瘤类型中不存在或存在低水平的柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)可限制溶瘤腺病毒的功效。可将各种肽基序加入到纤维节中，例如，RGD基序(RGD序列模拟细胞表面整合素的正常配体)、Tat基序、聚赖氨酸基序、NGR基序、CTT基序、CNGRL基序、CPRECES基序或链霉标签基序(strept-tag motif)(Ruoslahti,E.and Rajotte,D.,Annu Rev Immunol.2000；18:813-27，以引用的方式将其整体并入本文)。可以将基序插入腺病毒纤维蛋白的HI环中。对衣壳进行修饰能使CAR进行独立的目标细胞感染。这允许更高的复制，更有效的感染和增加的肿瘤细胞裂解(Suzuki et al.,Clin Cancer Res.2001Jan；7(1):120-6，以引用的方式将其整体并入本文)。还可加入结合特异性受体例如EGFR或uPR的肽序列。仅仅或优先在癌细胞表面发现的特定受体(如EGFRvIII)可用作腺病毒结合和感染的靶标。
在某些实施方式中，溶瘤腺病毒在肿瘤中选择性复制，并在选自由E1a、E1b、E4和VA-RNA组成的组中的一种或多种基因中进一步包括突变，以实现在肿瘤中的选择性复制。例如，在一些实施方式中，对溶瘤腺病毒进行修饰以在E1A的CR2区域中包括24个碱基对的缺失(E1AΔ24)。
在某些实施方式中，溶瘤腺病毒在肿瘤中选择性复制。例如，在一些实施方式中，溶瘤腺病毒包括组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子以实现在肿瘤中的选择性复制。在一些实施方式中，上述组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子是控制选自由E1a、E1b、E2和E4组成的组中的一种或多种基因以实现在肿瘤中的选择性复制的启动子序列。在一些实施方式中，上述组织特异性启动子选自由以下项组成的组：E2F启动子、端粒酶hTERT启动子、酪氨酸酶启动子、前列腺特异性抗原启动子、甲胎蛋白启动子和COX-2启动子。例如，在一些实施方式中，对溶瘤腺病毒进行修饰以表达来自E2F-1启动子的必要基因。在一些实施方式中，将回文结构的E2F结合位点插入到溶瘤腺病毒内源E1A启动子中，以允许在高度复制细胞中选择性表达E1A或E1AΔ24。
在某些实施方式中，上述腺病毒包括衣壳修饰以增加它的感染性或靶向肿瘤细胞中存在的受体。例如，在一些实施方式中，对溶瘤腺病毒进行进一步修饰来消除纤维轴的肝素硫酸糖胺聚糖(HSG)结合位点KKTK(SEQ ID NO:26)以减少肝趋向性。在一些实施方式中，对溶瘤腺病毒进行进一步修饰，将纤维轴的肝素硫酸糖胺聚糖(HSG)结合位点KKTK(SEQ IDNO:26)替换为整合素结合基序(如RGDK)(SEQ ID NO:27)以增加传染性和溶瘤效力。
在某些实施方式中，腺病毒进一步包括常用于癌症基因治疗领域中的至少一种基因。例如，在一些实施方式中，常用于癌症治疗领域中的至少一种基因是选自由前药激活基因、肿瘤抑制基因和免疫刺激基因组成的组中的基因。
在某些实施方式中，本发明的溶瘤腺病毒进一步包括各自编码肿瘤抗原或表位的一种或多种异源核酸序列。在一些实施方式中，该一种或多种异源核酸序列包括各自编码肿瘤抗原或表位的1至5种异源核酸序列。在一些实施方式中，肿瘤抗原或表位包括由具有对肿瘤细胞来说独特的突变或重排的基因、再激活的胚胎基因编码的蛋白，组织特异性分化抗原和许多其它自身蛋白。
在一些实施方式中，上述肿瘤抗原或表位由选自以下项组成的组：MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、CEA、酪氨酸酶、中期因子、BAGE、CASP-8、β-连环蛋白、CA-125、CDK-1、ESO-1、gp75、gp100、MART-1、MUC-1、MUM-1、p53、PAP、PSA、PSMA、ras、trp-1、HER-2、TRP-1、TRP-2、IL13Rα、IL13Rα2、AIM-2、AIM-3、NY-ESO-1、C9orf1l2、SART1、SART2、SART3、BRAP、RTN4、GLEA2、TNKS2、KIAA0376、ING4、HSPH1、C13orf24、RBPSUH、C6orf153、NKTR、NSEP1、U2AF1L、CYNL2、TPR、SOX2、GOLGA、BMI1、COX-2、EGFRvIII、EZH2、LICAM、活素、MRP-3、巢蛋白、OLIG2、ART1、ART4、B-细胞周期蛋白、Gli1、Cav-1、组织蛋白酶B、CD74、E-钙粘蛋白、EphA2/Eck、Fra-1/Fosl1、GAGE-1、神经节苷脂/GD2、GnT-V、β1,6-N、Ki67、Ku70/80、PROX1、PSCA、SOX10、SOX11、生存素、UPAR、间皮素和WT-1，或它们的表位。在一些实施方式中，上述肿瘤抗原或表位是人肿瘤抗原或表位。
在一些实施方式中，上述异源核酸序列插入到腺病毒基因中，其中腺病毒基因编码具有免疫显性T细胞表位的至少一个功能性缺失的腺病毒蛋白。在一些实施方式中，上述异源核酸序列插入到腺病毒基因中，其中腺病毒基因编码除具有免疫显性T细胞表位的至少一个缺失的腺病毒蛋白外的其他腺病毒蛋白。在一些实施方式中，上述异源核酸序列插入到编码腺病毒六邻体蛋白的腺病毒基因中。例如，上述异源核酸序列可以插入到上述腺病毒六邻体蛋白的高变区中。在某一实施方式中，上述高变区是高变区5(HVR5)。在某些实施方式中，上述异源核酸序列插入到六邻体高变区1、纤维蛋白HI环中，或与蛋白IX融合。
在一些实施方式中，上述肿瘤抗原或表位两侧是柔性连接子。例如，在一些实施方式中，上述柔性连接子包括选自由以下项组成的组中的氨基酸序列：GSGSR(SEQ ID NO:28)、AGSGSR(SEQ ID NO:29)和AGSGS(SEQ ID NO:30)。优选的，异源核酸序列的插入“在读框内”进行。
在某些实施方式中，本发明的溶瘤腺病毒进一步包括编码gp100肿瘤抗原或表位，或酪氨酸酶肿瘤抗原或表位的一种或多种异源核酸序列。在一些实施方式中，该一种或多种异源核酸序列包括：(a)编码gp100抗原或表位的异源核酸序列和(b)编码酪氨酸酶抗原或表位的异源核酸序列。例如，在一些实施方式中，上述gp100肿瘤抗原或表位包括氨基酸序列YLEPGPVTA(SEQ ID NO:31)，而酪氨酸酶抗原或表位包括氨基酸序列YMDGTMSQV(SEQID NO:32)。在一些实施方式中，编码gp100抗原或表位的异源核酸序列插入到腺病毒六邻体蛋白的高变区5中。在一些实施方式中，编码酪氨酸酶肿瘤抗原或表位的上述异源核酸序列插入到腺病毒六邻体蛋白的高变区5中。在一些实施方式中，编码gp100抗原或表位的异源核酸序列和编码酪氨酸酶抗原或表位的异源核酸序列均插入到腺病毒六邻体蛋白的高变区5中。
在某些实施方式中，本发明提供了一种溶瘤腺病毒，所述溶瘤腺病毒含SEQ IDNO:3或4所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，本发明提供了一种溶瘤腺病毒，所述溶瘤腺病毒含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，腺病毒在具有突变Rb通路的细胞中是有增殖能力的。转染后，从覆盖琼脂糖的细胞中分离腺病毒空斑，并且扩增病毒颗粒用于分析。对于详细的方案，本领域技术人员参考Graham,F.L.and Prevec,L.,Methods Mol Biol.1991；7:109-28(通过引用的方式整体并入本文)。
用于产生腺病毒或腺病毒载体的替代性技术包括：利用细菌人工染色体(BAC)系统，在recA+细菌菌株中用含互补腺病毒序列的两个质粒进行体内细菌重组，以及酵母人工染色体(YAC)系统(PCT公开95/27071和96/33280，它们通过引用的方式并入本文)。
III.多核苷酸和多肽
本文还提供了编码上述溶瘤腺病毒的核酸。任选地，提供了编码溶瘤腺病毒的一种核酸(例如，质粒)。任选地，提供了编码溶瘤腺病毒的多种核酸(例如，多个质粒)。
还提供了全文描述的已被经修饰的腺病毒感染的宿主细胞。宿主细胞可以通过上述经修饰的腺病毒转化。任选地，由于摄取、掺入并表达上述经修饰的腺病毒的遗传物质，宿主细胞已被遗传改变了。任选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，如人类细胞。腺病毒可以是哺乳动物腺病毒，如人腺病毒。
在某些实施方式中，本发明涵盖分离的多核苷酸，包括与选自由SEQ ID NO:3、SEQID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组中的序列至少约90％一致的序列。在一些实施方式中，上述分离的多核苷酸包括与选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组中的序列至少约95％一致的序列。在一些实施方式中，上述分离的多核苷酸包括与选自由SEQID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组中的序列至少约99％一致的序列。在一些实施方式中，上述分离的多核苷酸包括选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组中的序列。在某些实施方式中，本发明涵盖了含本发明多核苷酸的载体。在某些实施方式中，本发明涵盖了含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞。
使用本领域已知的任意数量方法在病毒核酸中生成修饰。例如，定点诱变可用于修饰核酸序列。最常见的定点诱变方法之一是寡核苷酸定向诱变。在寡核苷酸定向诱变中，编码序列中所需变化的寡核苷酸与目标DNA的一条链退火，并作为用于启动DNA合成的引物。在该方法中，含有序列变化的寡核苷酸被引入到新合成的链上。参见例如，Kunkel,T.A.,Proc Natl Acad Sci U S A.1985Jan；82(2):488-92；Kunkel,T.A.,et al.,MethodsEnzymol.1987；154:367-82；Lewis,M.K.and Thompson,D.V.,Nucleic Acids Res.1990Jun25；18(12):3439-43；Bohnsack,R.N.,Methods Mol Biol.1996；57:1-12；Deng,W.P.&Nickoloff,J.A.,Anal Biochem.1992Jan；200(1):81-8；及Shimada,A.,Methods MolBiol.1996；57:157-65(其中，每一篇都通过引用的方式整体并入本文)。本领域中常规使用其它方法将修饰引入序列中。例如，使用PCR或化学合成来产生经修饰的核酸，或者可以化学合成在氨基酸序列中具有所需变化的多肽。参见例如，Bang,D.and Kent,S.B.,ProcNatl Acad Sci U S A.2005Apr 5；102(14):5014-9及其参考文献。对病毒在其中通常不生长的细胞类型(如人类细胞)的选择和/或化学诱变(参见例如，Rudd,P.and Lemay,G.,JGen Virol.2005May；86(Pt.5):1489-97)(通过引用的方式整体并入本文)同样可用于生成在病毒核酸中的修饰。
可以通过本领域已知的任何合适的方法来产生本文所述的分离的多肽。这些方法从直接的蛋白合成方法，到构建编码分离的多肽序列的DNA序列并在合适的转化宿主中表达这些序列。在一些实施方式中，使用重组技术，通过分离或合成编码感兴趣的野生型蛋白质的DNA序列来构建DNA序列。任选地，可以通过位点特异性诱变对序列进行诱变以提供其功能类似物。参见例如，Mark,D.F.,et al.,Proc Natl Acad Sci USA.1984Sep；81(18):5662-6和美国专利号4,588,585(它们通过引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方式中，使用寡核苷酸合成仪，通过化学合成来构建编码一种或多种感兴趣多肽的DNA序列。可以基于所需多肽的氨基酸序列设计这样的寡核苷酸，并选择在其中将生产感兴趣的重组多肽的宿主细胞所偏好的那些密码子。可以应用标准方法来合成分离的多核苷酸序列，该分离的多核苷酸序列编码感兴趣的分离的多肽。例如，可以使用完整的氨基酸序列来构建回译基因。此外，可以合成DNA寡聚物，该DNA寡聚物含有编码特定分离的多肽的核苷酸序列。例如，可以合成编码所需多肽部分的若干小寡核苷酸，然后将它们连接起来。各个寡核苷酸通常含有用于互补组装的5'或3'突出端。
一旦组装(通过合成、定点诱变或另一方法)，就将编码感兴趣的特定分离多肽的多核苷酸序列插入至表达载体中，并可操作地连接至适于在所希望的宿主中表达蛋白的表达控制序列。正确的组装可以通过核苷酸测序、限制性内切图谱以及生物活性多肽在合适宿主中的表达来确认。如本领域所公知的，为了在宿主中获得转染基因的高表达水平，基因必须可操作地连接到在所选表达宿主中有功能的转录和翻译表达控制序列。
在某些实施方式中，重组表达载体用于扩增和表达编码感兴趣的一种或多种多肽的DNA。重组表达载体是可复制的DNA构建体，其含有编码感兴趣的多肽的合成的或衍生自cDNA的DNA片段，该DNA片段可操作地连接至源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的合适的转录或翻译调节元件。转录单位通常包括如下文详细描述的以下集合：(1)遗传元件或在基因表达中具有调节作用的元件，如转录启动子或增强子；(2)转录成mRNA并翻译为蛋白质的结构或编码序列；以及(3)适当的转录和翻译的起始序列和终止序列。这样的调节元件可以包括操纵子序列来控制转录。另外可以额外引入通常由复制起始点赋予的在宿主中复制的能力，和帮助识别转化体的选择基因。DNA区域在功能上彼此相关时，可将它们操作地连接在一起。例如，若作为参与多肽分泌的前体来表达，则将信号肽(分泌前导区)的DNA可操作地连接至多肽的DNA；若要控制序列的转录，则将启动子可操作地连接至编码序列；或者若要定位以允许翻译，则将核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。打算用于酵母表达系统的结构元件包括能够通过宿主细胞对翻译的蛋白进行细胞外分泌的前导序列。或者，在不含前导序列或转运序列的情况下表达重组蛋白时，可以包含N端甲硫氨酸残基。随后可以任选地从表达的重组蛋白上切下该残基以提供最终产物。
表达控制序列和表达载体的选择将取决于所选择的宿主。可以使用多种表达宿主/载体的组合。对于真核宿主有用的表达载体包括例如，含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。对于细菌宿主有用的表达载体包括已知的细菌质粒，例如，来自大肠杆菌的质粒，包括pCR1、pBR322、pMB9及它们的衍生物，更广泛宿主范围的质粒，如M13和丝状单链DNA噬菌体。
用于表达一种或多种感兴趣的多肽的合适的宿主细胞包括：在适当启动子控制下的原核生物、酵母、昆虫或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括如下所述的已建立的哺乳动物来源的细胞系。也可以使用无细胞翻译系统。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的适合的克隆与表达载体由Pouwels et al.(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)所描述，其相关内容通过引用的方式并入本文。关于蛋白生产方法的额外信息可以参见例如美国专利公开号2008/0187954、美国专利号6,413,746和6,660,501以及国际专利公开号WO04009823，其均通过引用的方式整体并入本文。
可以根据任何合适的方法来纯化经转化的宿主所生产的蛋白。这样的标准方法包括层析(例如，离子交换柱层析、亲和柱层析和尺寸柱层析)、离心、差异溶解度，或用于蛋白纯化的任何其它标准技术。可以将诸如六聚组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感病毒外壳序列和谷胱甘肽-S-转移酶的亲和标签连接到蛋白上，以允许由通过合适的亲和柱来容易地纯化。还可以使用诸如蛋白水解、核磁共振和X射线晶体学等技术对分离的蛋白进行物理表征。
在本发明的某些实施方式中，可通过将报告基因包括在表达载体内，以在体外识别被腺病毒或腺病毒载体感染的细胞。一般来说，可选择性报告子是赋予允许选择的性质的报告子。阳性可选择性报告子是其中报告基因的存在允许对其进行选择的报告子；而阴性可选择性报告子是其中报告基因的存在阻止对其进行选择的报告子。阳性可选择性标记物的一个实例为药物抗性标记物(赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素(zeocin)和组氨醇抗性的基因)。其它类型的报告子包括诸如GFP等可筛选的报告子。
可以使用用于确定蛋白质水平和活性的各种实验，如扩增/表达方法、免疫组织化学方法、FISH和脱落抗原测定、Southern印迹、Western印迹或PCR技术。此外，可以使用体内诊断实验来评估蛋白的表达或扩增，其中体内诊断实验例如为通过施用与待检测蛋白结合且标记有可检测的标签(如放射性同位素)的分子(如抗体)，并从外部扫描患者以确定标签的位置。因此，测量细胞中蛋白水平的方法在本领域中通常是已知的，并且如果适用的话，可用来评估与本文提供的方法和组合物有关的蛋白水平和/或蛋白活性。这些实验可以用于确定腺病毒多肽(例如，E1A、E1B、六邻体、五邻体基底、纤维蛋白，衣壳蛋白Ⅸ、DNA聚合酶和单链DNA结合蛋白)中修饰的效果。例如，这些实验可以用于确定修饰是否导致腺病毒不能产生正常水平或全功能基因产物的多肽，或用于确认腺病毒含一种或多种腺病毒多肽的全部或部分的突变。
IV.使用方法和药物组合物
本发明的溶瘤腺病毒可用于多种应用，包括但不限于治疗性治疗方法，诸如癌症治疗。在某些实施方式中，溶瘤腺病毒可用于诱导肿瘤细胞裂解、抑制肿瘤生长、治疗癌症和/或增加对癌症的免疫应答。使用方法可以是体外方法、离体方法或体内方法。
在一个方面，本发明的溶瘤腺病毒可用于制备在哺乳动物中治疗或预防癌症或引起癌症的癌前病变的药物。在一些实施方式中，哺乳动物是人。
在一个方面，本发明的溶瘤腺病毒可用作药物。在一些实施方式中，本发明的溶瘤腺病毒可用作癌症的预防剂和/或治疗剂。
在一个方法，本发明提供了一种诱导肿瘤细胞裂解的方法，所述方法包括：将肿瘤细胞与有效量的本发明的溶瘤腺病毒或药物组合物接触，以诱导肿瘤细胞的裂解。在某些实施方式中，诱导肿瘤细胞裂解的方法包括使肿瘤细胞与溶瘤腺病毒在体外接触。例如，将永生化细胞系或癌细胞系在添加溶瘤腺病毒的培养基中培养以诱导肿瘤细胞的裂解。在一些实施方式中，肿瘤细胞分离自患者样品，例如组织活检、胸腔积液或血液样品，并在添加有溶瘤腺病毒的培养基中培养以诱导肿瘤细胞的溶解。在某些实施方式中，诱导肿瘤细胞裂解的方法包括使肿瘤细胞与溶瘤腺病毒在动物模型中接触。例如，可以将溶瘤腺病毒给药予已经在免疫受损小鼠(如NOD/SCID小鼠)中生长的肿瘤异种移植物以诱导肿瘤细胞的裂解。在一些实施方式中，癌症干细胞分离自患者样品，例如组织活检、胸腔积液或血液样品，并注射到免疫受损小鼠中，随后向该免疫受损小鼠给药溶瘤腺病毒以诱导肿瘤细胞的溶解。在一些实施方式中，在将致瘤细胞引入动物中的同时或短时间后，给药溶瘤腺病毒以诱导肿瘤细胞的裂解。在一些实施方式中，在致瘤细胞生长至特定大小之后，将溶瘤腺病毒作为治疗剂给药。
在一个方面，本发明提供了一种在哺乳动物中抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括：将治疗有效量的本发明的溶瘤腺病毒或药物组合物给药予所述哺乳动物。在一些实施方式中，所述哺乳动物是人。在一些实施方式中，所述哺乳动物患有肿瘤或已除去肿瘤。
在一些实施方式中，所述肿瘤是选自由以下项组成的组中的肿瘤：腺癌、腺瘤、星形细胞瘤、恶性上皮肿瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、囊腺瘤、无性细胞瘤、红白血病、纤维瘤、纤维肉瘤、粒层细胞瘤、血管瘤、血管肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、莱迪希细胞瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、成淋巴细胞白血病、淋巴细胞白血病、淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑色素瘤、肥大细胞瘤、黑色素细胞瘤、脑膜瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓性白血病、少突神经胶质瘤、骨瘤、骨肉瘤、浆细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、精原细胞瘤、支持细胞瘤、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状上皮乳头状瘤、滑膜细胞肉瘤、胸腺瘤和移行细胞癌。
在另一方面，本发明提供了一种在哺乳动物中治疗癌症的方法，所述方法包括：将治疗有效量的本发明的溶瘤腺病毒或药物组合物给药予所述哺乳动物。在另一方面，本发明提供了一种用于增加哺乳动物中针对癌症的免疫应答的方法，所述方法包括：将本发明的溶瘤腺病毒或药物组合物以有效增加所述哺乳动物中的针对所述一种或多种肿瘤抗原或表位的免疫应答的量，给药予所述哺乳动物。在一些实施方式中，所述哺乳动物是人。在一些实施方式中，所述哺乳动物患有肿瘤或已除去肿瘤。
在一些实施方式中、所述癌症选自由以下项组成的组：鼻咽癌、滑膜癌、肝细胞癌、肾癌(renal cancer)、结缔组织癌、黑色素瘤、肺癌、肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、脑癌、喉癌、口腔癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、绒毛膜癌、胃泌素瘤、嗜铬细胞瘤、泌乳素瘤、T细胞白血病/T细胞淋巴瘤、神经瘤、希佩尔-林道综合征、卓-艾综合征、肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、输尿管癌、少突神经胶质瘤、成神经细胞瘤、脑膜瘤、脊髓肿瘤、骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、原发部位不明的癌症、类癌、胃肠道类癌、纤维肉瘤、乳腺癌、佩吉特氏病、宫颈癌、食道癌、胆囊癌、头癌、眼癌、颈癌、肾脏癌(kidney cancer)、维尔姆斯瘤、卡波西肉瘤、前列腺癌、睾丸癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、内分泌胰腺癌、胰高血糖素瘤、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、垂体癌、软组织肉瘤、成视网膜细胞瘤、小肠癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞癌(trophoblastic cancer)、葡萄胎、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、听神经瘤、蕈样霉菌病、胰岛素瘤、类癌瘤综合征、生长抑素瘤、牙龈癌、心脏癌、唇癌、脑膜癌、口癌(mouth cancer)、神经癌、腭癌、腮腺癌、腹膜癌、喉咽癌(pharynx cancer)、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌和扁桃体癌。
根据本发明的腺病毒可局部给药或全身给药。例如，在一些实施方式中，通过瘤内、静脉内、血管内、鞘内、气管内、肌肉内、皮下、腹腔内、皮内、非肠道、鼻内、经皮、眼部、颅内或口服给药的方式，给药所述溶瘤腺病毒或药物组合物。根据本发明的腺病毒还可以在细胞载体中给药。
基于预期的目标，例如刺激针对肿瘤的免疫应答，来确定治疗剂或预防剂的有效量。本领域技术人员非常清楚如何在体内和离体情况下应用基因递送。对于腺病毒和腺病毒载体，通常制备腺病毒或腺病毒载体原液。在一些实施方式中，根据本发明的腺病毒的给药可以以单次给药或多次给药来进行。在一些实施方式中，病毒可以以至少约、至多约或约1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013或1×1014个病毒颗粒的剂量或其间的任何数值或范围给药予受试者。在一些实施方式中，病毒可以以至少约、至多约或约1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012或1×1013个空斑形成单位(PFU)的剂量或其间的任何数值或范围给药予受试者。根据治疗次数和用量，待给药的量取决于要治疗的受试者、受试者的状态和所期望的保护。治疗组合物的精确量还取决于医师的判断，并且对每个个体是特定的。
在一些实施方式中，上述方法进一步包括将一种或多种额外的治疗剂给药予所述哺乳动物。例如，在一些实施方式中，治疗剂为化学治疗剂。化学治疗剂包括但不限于：5-氟尿嘧啶；丝裂霉素C；甲氨蝶呤；羟基脲；环磷酰胺；达卡巴嗪；米托蒽醌；蒽环类(表柔比星和多柔比星)；针对受体的抗体，如赫赛汀；依托泊苷；孕甾体(pregnasome)；激素疗法，如他莫昔芬和抗雌激素；干扰素；芳香酶抑制剂；促孕剂；和LHRH类似物。CDK(周期蛋白依赖性激酶)抑制剂是抑制CDK功能的治疗剂。用于所提供方法的合适的CDK抑制剂包括但不限于：AG-024322、AT7519、AZD5438、夫拉平度、因地苏拉(indisulam)、P1446A-05、PD-0332991和P276-00(参见例如，Lapenna,S.,et al,Nat Rev Drug Discov.2009Jul；8(7):547-66,以引用的方式整体并入本文)。基于给定的待治疗的疾病，本领域技术人员能够容易地确定试剂的选择及剂量。组合给药考虑使用单独的制剂或单一药物制剂来共同给药，并以任一顺序连续给药，其中，优选存在两个(或全部)活性剂同时发挥其生物学活性的时间段。试剂或组合物的组合可以伴行地(如作为混合物)，分别但同时地(如通过单独的静脉注射线)或顺序地(如首先给药一种试剂，然后给药第二试剂)给药。因此，术语组合用于指两种或更多种试剂或组合物的伴行地、同时地或顺序地给药。
本发明进一步提供含本文所述的一种或多种溶瘤腺病毒的药物组合物。在某些实施方式中，该药物组合物进一步包括药学上可接受的载剂或赋形剂。这些药物组合物可用于诱导肿瘤细胞裂解、抑制肿瘤细胞生长、治疗癌症和/或增加针对癌症的免疫应答。
在某些实施方式中，通过将本发明的纯化抗体或试剂与药学上可接受的溶媒(如载剂、赋形剂)组合，制备用于储存和使用的制剂(Gennaro,A.R.,Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,20th Edition Mack Publishing,2000)。合适的药学上可接受的溶媒包括但不限于：无毒缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；盐，如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量多肽(如少于约10个氨基酸残基)；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属复合物(如锌蛋白复合物)；以及非离子表面活性剂，如吐温或聚乙二醇(PEG)。
本发明的药物组合物可以以任何数量的方式进行局部或全身治疗。给药可以是局部给药(例如，阴道和直肠的粘膜递送)；肺部给药(例如，通过吸入或吹入气雾剂，包括通过雾化器；气管内、鼻内、表皮和经皮)；口服给药；或肠胃外给药，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输液；或颅内给药(例如，鞘内或脑室内)。
适合注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液，和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须是易于注射程度存在的流体。在生产和储存条件下必须稳定，并且必须防止诸如细菌和真菌等的微生物的污染。载剂可以是含诸如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，它们适合的混合物及植物油的溶剂或分散介质。若需要，可以使用各种抗细菌剂或抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包括等渗剂，如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。
在某些实施方式中，通过将需要量的化合物掺入含上面列举的各种其它成分的合适的溶剂中，如果需要，随后进行过滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基本分散介质和所需的上述列举的其它成分的无菌溶媒中来制备分散体。在制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术从先前的无菌过滤溶液中产生活性成分加任何另外的所需成分的粉末。
一经配制，溶液将以与剂量配方相容的方式并以治疗或预防有效的量来给药。对于以水溶液的肠胃外给药，如果需要可以对溶液进行适当地缓冲，液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖进行等渗处理。这些特定的水溶液特别适用于血管内和瘤内给药。就此而言，根据本公开内容，可以使用的无菌水性介质对本领域技术人员来说已知的。
本发明的溶瘤腺病毒可以在药物组合制剂或作为组合疗法的用药方案中与额外的治疗剂组合。在本发明的一个方面，该额外的治疗剂具有抗癌性质。例如，在一些实施方式中，该额外的治疗剂为化学治疗剂。药物组合制剂或用药方案的额外的治疗剂优选具有与溶瘤腺病毒互补的活性，使得它们不会对彼此产生不利的影响。还提供了含有溶瘤腺病毒和额外治疗剂的药物组合物。
为了治疗疾病，额外的治疗剂的适当剂量取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程、疾病的响应性、先前的治疗、患者的临床病史等，均由主治医师决定。额外的治疗剂可以给药一次或在持续几天到几个月的系列治疗中给药，或者直到有效治愈或实现疾病状态的减少(如肿瘤尺寸减小)。试剂的最佳用药方案可以根据患者体内药物积累的测量值来计算，并且将根据单一试剂的相对效能而变化。主治医生可以容易地确定最佳剂量、用药方法和重复率。在某些实施方式中，试剂的剂量为每千克体重0.01μg至100mg，并且可以每天、每周、每月或每年给予一次或多次。在某些实施方式中，所述试剂每两周给予一次或每三周给予一次。在某些实施方式中，试剂的剂量为每千克体重约0.1mg至约20mg。主治医师可以基于所测量的药物在体液或组织中的停留时间和浓度来估计用药的重复率。
组合疗法可以提供“协同作用”并且证明是“协同的”，即活性成分一起使用的效果大于单独使用化合物所产生的效果之和。当活性成分为以下情形时，可获到协同效应：(1)共同配制，并且以组合的单位剂量剂型的形式同时给药或递送；(2)作为单独的剂型交替或平行递送；或(3)通过一些其他方案。以交替疗法递送时，当化合物例如通过单独的注射器进行不同注射，依次给药或递送时，可以获得协同效应。通常，在交替治疗期间，将有效剂量的每种活性成分依次地(即连续地)给药，而在组合治疗中，将有效剂量的两种或更多种活性成分一起给药。
V.含溶瘤腺病毒的试剂盒
本发明提供了试剂盒，该试剂盒含所公开的溶瘤腺病毒或本文所描述的其它试剂并能够用于实施本文所描述的方法。在某些实施方式中，试剂盒包括在一个或多个容器中的至少一种溶瘤腺病毒。在某些实施方式中，试剂盒包括本文所描述的至少一种药物组合物和使用说明书。本领域技术人员将容易认识到，本发明公开的溶瘤腺病毒或其它试剂可以容易地并入本领域公知的已使用的试剂盒形式中。
进一步提供了含本发明的溶瘤腺病毒或药物组合物以及一种或多种额外治疗剂的试剂盒。例如，在一些实施方式中，该试剂盒包括本发明的溶瘤腺病毒或药物组合物以及一种或多种额外化学治疗剂。
本公开的实施方式可以通过参考以下非限制性实施例来进一步定义，所述非限制性实施例详细描述了本公开内容的某些溶瘤腺病毒的制备以及本公开的溶瘤腺病毒的使用方法。对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本公开范围的情况下可以对材料和方法进行许多修改。
实施例
应理解，本文所描述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员可对其进行各种修改或改变，并且将被包括在本申请的精神和范围内。
实施例1-4显示了通过缺失腺病毒免疫显性T细胞表位，由抗腺病毒到抗肿瘤的免疫应答的免疫转移。使用ICO15K-TD-gp100-tyr(其是包含六邻体的三个免疫显性T细胞表位中的突变和插入在六邻体中的人肿瘤表位gp100-tyr的HAd5溶瘤腺病毒)，证明了与用ICO15K-gp100-tyr(其是缺乏三个六邻体突变的对照病毒)处理的小鼠相比，用ICO15K-TD-gp100-tyr处理的小鼠具有减弱的总体抗腺病毒的免疫应答，同时对tyr肿瘤表位显示出更高的免疫应答。
实施例5显示了，ICO15K-TD-gp100-tyr在携带鼠科肿瘤的动物中诱导出比ICO15K-gp100-tyr更有效的抗肿瘤活性。具体而言，与用ICO15K-gp100-tyr处理的动物相比，注射ICO15K-TD-gp100-tyr的动物更难以形成肿瘤。
实施例6-8显示了在不存在肿瘤表位的情况下，免疫转移对抗肿瘤活性的影响。具体而言，四重缺失(QD)ICOVIR15K腺病毒(ICOVIR15K-QD)在携带鼠科肿瘤的动物中诱导出比ICO15K更有效的抗肿瘤活性，其中与ICOVIR15K-TD相比，四重缺失(QD)ICOVIR15K腺病毒(ICOVIR15K-QD)缺少人肿瘤表位且引入了额外的六邻体表位突变。
实施例1
使用限制文库法(restricted-library method)生成含三重缺失(TD)的溶瘤腺病毒ICOVIR15K-TD及其衍生物ICO15K-TD-gp100-tyr
通过PubMed，在文献中检索受腺病毒5的人淋巴细胞抗原-A2.1(HLA-A2.1)限制的免疫显性表位。选择HLA-A2.1的原因在于它是在高加索人(Caucasian)和麦士蒂索人(Mestizo)人群中更普遍(35～50％)的主要组织相容性复合体(MHC)I类(Gonzalez‐Galarza,F.F.,et al.,Nucleic Acids Res.2011Jan；39(Database issue):D913-9)。每个表位具有在肽的第2和9位上的针对HLA-A2.1的两个主要锚定位点，和在第1和3位上的两个次要锚定位点。六邻体被认为是人类腺病毒5的最具免疫原性的蛋白质，以下三种表位是基于在不同研究中(Leen,A.M.,et al.,Blood.2004Oct 15；104(8):2432-40；Leen,A.M.,etal.,J Virol.2008Jan；82(1):546-54；Olive,M.,et al.,Hum Gene Ther.2002Jul 1；13(10):1167-78；Tang,J.,et al.,Virology.2006Jul 5；350(2):312-22)被腺病毒5感染的患者中的人活性的普遍性和一系列计算机模拟预测之后选择的。为了此目标，使用程序NetMHC、IEDB、BIMAS和Rankpep分析了六邻体蛋白，以预测以高亲和力结合小鼠H2-Db表位的表位(表1)。除了SYFPEITHI和SVRMHC程序(Gowthaman,U.,et al.,AminoAcids.2010Nov；39(5):1333-42)(通过引用的方式整体并入本文)外，这些程序也用于鉴定人HLA-A2.1表位。所选择出的待缺失表位为Hex713(YLNHTFKKV)(SEQ ID NO:11)，Hex892(LLYANSAHA)(SEQ ID NO:15)和Hex917(YVLFEVFDV)(SEQ ID NO:19)，其中，“Hex”后面的数字表示表位的第一个氨基酸在六邻体蛋白序列(SEQ ID NO:9)中的位置。
表1
显示最近的且可使用的网址及其参考文献的用于MHC型表位预测的服务器
Figure BDA0001487915120000291
Figure BDA0001487915120000301
在酵母中，通过同源重组对溶瘤腺病毒ICOVIR15K的质粒(Rojas,J.J.,et al.,Gene Ther.2012Apr；19(4):453-7)(通过引用的方式整体并入本文)进行基因修饰以缺失所选的Hex713、Hex892和Hex917表位。使这些表位缺失的最初方法是替换这些表位中的关键氨基酸(表位的第一个氨基酸或第2和9位的锚定氨基酸)。在腺病毒质粒中构建的若干突变体(影响hex713表位的Y713C、Y713D、Y713E、L714D、L714G、L714P；影响Hex892的L902D、L902E、L902G、L902K、L902S、L902W；和影响Hex917的Y917D、Y917P、V918D、V918G、V925D、V925G、V925K、V925N、V925P、V925Q、V925S)中，在这些质粒转染到HEK293细胞中后仅获得一种活的病毒。获得的腺病毒在表位Hex917中具有V925K突变，其中表位第9位(对应于六邻体的第925个氨基酸)的缬氨酸(V)被赖氨酸(K)取代。考虑到通过定向突变获得免疫显性表位的活的缺失的困难，在创建突变体文库的基础上遵循不同的策略。为此，使用了细菌中的同源重组来引入随后的表位突变，这是因为与酵母中的重组相比，细菌中的同源重组在所使用的时间和阳性克隆数量方面更有效(Stanton,R.J.,et al.,Biotechniques.2008Dec；45(6):659-62,664-8)。这种细菌中的同源重组是基于，插入到腺病毒基因组中的正-负选择基因被含预期的基因突变(在我们的情况中为表位缺失)的供体片段取代。应用限制文库法来使免疫显性表位缺失。该系统涉及使用简并引物(寡核苷酸)来替代除原始的单个氨基酸或多个氨基酸，亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸外的任何其他氨基酸的编码序列。排除原始的氨基酸以及亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸是因为这些氨基酸能够结合HLA-A2.1位点。简并引物用某些不确定的核苷酸来合成，这样所合成的引物相当于引物文库。在简并引物中，将对应于待缺失的氨基酸的密码子的核苷酸合成为“NVN”，其中，N可以是A、T、C、G，而V可以是A、C、G。因此，文库中不存在密码子第二位含T的所有氨基酸(Phe、Leu、Ile、Met和Val)。这些氨基酸是通常在表位的锚定残基中发现的非极性脂肪族疏水性氨基酸。简并序列也可以以“NBN”位于反向引物中，其中，B是T、C或G。六邻体的PCR片段使用简并引物来合成，并在细菌的同源重组中用作供体片段。应用这种限制性文库方法使Hex713和Hex892表位缺失，获得了Hex713表位中缬氨酸被丙氨酸取代的突变体(V721A)和Hex892表位中丙氨酸被丝氨酸取代的突变体(A901S)。将这组突变与先前获得的V925K一同命名为“TD”(三重缺失)并包括以下3种突变：(1)Hex713表位第9位的V721A突变，其中缬氨酸被丙氨酸取代；(2)Hex892表位第9位A900S突变，其中丙氨酸被丝氨酸取代；和(3)Hex917表位第9位的V925K突变，其中缬氨酸(V)被赖氨酸(K)取代。
表2显示了与其野生型对应物相比，每个突变体区域的确切的氨基酸序列，同时显示了按照表1中列出的NetMHC预测方法，对其相应的HLA等位基因的预期亲和力。对于该预测，低的IC50值对应于良好的结合物，而突变形式显示出高的IC50预测值。
表2
对应于包含在TD中的三个突变表位的氨基酸序列及其对于人HLA-A*02.01的预测亲和力(按照NetMHC模拟器)
Figure BDA0001487915120000311
使用磷酸钙法将含有病毒基因组的质粒转染到真核293细胞中。使用分光计技术分析所产生的每种病毒的溶瘤能力，该分光计技术测量在组织培养中杀死50％细胞所必需的感染性颗粒的数量(IC50)。具有突变V721A、A901S和V925K的病毒在其溶瘤能力方面未显示出任何损失。
如图1所示，为构建ICO15K-TD-gp100-tyr，用黑素瘤表位gp100-280(gp100)和酪氨酸酶369(tyr)取代对应于六邻体第270～281位氨基酸的六邻体(HVR5)的高变区5(HVR5)。gp100和tyr表位序列分别对应于YLEPGPVTA(SEQ ID NO：31)和YMDGTMSQV(SEQ IDNO：32)。在对应于内源性酪氨酸酶第372位氨基酸的位置对tyr表位进行修饰，以引入N372D突变。tyr中的N372D突变引起翻译后修饰，使其易于被TCR识别(Skipper,J.C.,et al.,JExp Med.1996Feb 1；183(2):527-34)。构建具有表位gp100和tyr的对照病毒ICO15K-gp100-tyr，其不存在三重缺失。如图1所示，肿瘤表位的两侧是连接子GSGSR(SEQ ID NO:28)、AGSGSR(SEQ ID NO:29)和AGSGS(SEQ ID NO:30)。为了产生表位插入物的文库，将连接子插入到表位之间以具有可用于重叠PCR产物的同源性区域。由于其柔性，将连接子设计为含甘氨酸和丝氨酸(GS)的氨基酸(Vigne,E.,et al.,J Virol.1999Jun；73(6):5156-61；Taremi,S.S.,et al.,Protein Sci.1998Oct；7(10):2143-9；Kingston,R.L.,et al.,ProcNatl Acad Sci U S A.2004Jun 1；101(22):8301-6)。连接子中除了重复的GS内容之外，使用不同的密码子DNA序列以避免同源重组。此外，通过使用蛋白酶体切割预测网站NetChop3.1服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetChop)，选择了丙氨酸(A)用于一些连接子，以提供在蛋白酶体加工期间的良好的C-ter切割位点；并且选择了精氨酸(R)用于一些连接子，以提供用于TAP(与抗原加工相关的转运蛋白)结合和使其进入内质网的良好氨基酸(Uebel,S.and Tampé,R.,Curr Opin Immunol.1999Apr；11(2):203-8)。将含ICO15K-TD-gp100-tyr和含ICO15K-gp100-tyr病毒基因组的两种质粒转染到293细胞中，在A459中扩增并随后纯化。
实施例2
体外验证新构建体的存活性。
病毒原液在人癌细胞A549中的连续传代以及产生细胞病变效应所需的时间
为了评估三重缺失的稳定性，如图2所示，分析了每个三重缺失的病毒的10次连续传代的细胞病变效应(CPE)。这涉及用ICOVIR15K-TD-gp100-tyr或ICOVIR15K-TD感染A549细胞单层。对于野生型腺病毒，通常在感染后72h观察到CPE。该时间范围在三重缺失的病毒的所有十次传代中也观察到。
在A549细胞的空斑测定中，产生空斑的能力和空斑大小(单层整体)
用三重缺失的病毒(ICOVIR15K-TD-gp100-tyr或ICOVIR15K-TD)或不存在三重缺失的对照病毒(ICOVIR15K或ICOVIR15K-gp100-tyr)感染A549细胞单层7天，然后通过中性红染色对活细胞进行染色。如图3所示，与任一对照病毒相比，三重缺失的病毒的空斑大小都没有变化。这些发现表明，三重缺失的病毒继续表现得与亲代病毒一样，不会失去产生空斑的能力。
体外细胞毒性实验来确定A549细胞中的IC50值
使用ICOVIR15K、ICOVIR15K-TD、ICOVIR15K-gp100-tyr或ICOVIR15K-TD-gp100-tyr以0.00001至200转导单位(TU)/细胞的感染复数(MOI)感染A549细胞，感染后5天评估细胞存活。具有三重缺失的每种病毒的IC50值表明，与亲代病毒相比，这些病毒没有丧失任何溶瘤活性或细胞毒性。这些发现表明，衣壳修饰不妨碍三重缺失的病毒的溶瘤能力。
病毒产生实验
用ICOVIR15K、ICOVIR15K-TD、ICOVIR15K-gp100-tyr或ICOVIR15K-TD-gp100-tyr以25TU/细胞的MOI感染A549细胞4小时，然后用PBS洗涤。在感染后24、48、72和96小时分析总病毒产量(图5A，实线)和释放的病毒产量(图5B，间断线)。亲代病毒ICOVIR15K用作良好的溶瘤病毒的对照参考。感染后24小时，与ICOVIR15K对照病毒相比，具有三重缺失的病毒(ICOVIR15K-TD和ICOVIR15K-TD-gp100-tyr)在总产量上似乎减少约1个对数级；然而，使用曼-惠特尼(Mann-Whitney)U-检验比较病毒产量曲线的统计分析(Wang,G.P.and Bushman,F.D.,J Virol Methods.2006Jul；135(1):118-23)证明组间不存在差异。此外，三重缺失的病毒与对照病毒在病毒随时间释放的量的方面不存在显著差异。这些结果显示了三重缺失的病毒和对照病毒在总病毒产量和释放的病毒产量方面都表现出相似的病毒产量。这些发现还得到了图4所示的细胞毒性实验IC50中得到的结果的支持，在图4中，与在衣壳中缺少基因修饰的对照病毒相比，三重缺失的病毒未观察到差异。感染后5天获得IC50值，从而允许多轮病毒复制以正确评估溶瘤能力。
实施例3
存在于ICOVIR15K-TD-gp100-tyr中的突变的腺病毒表位和肿瘤表位与人HLA-A2.1的结合亲和力
通过对Takiguchi等人(Takiguchi,M.,Tissue Antigens.2000Apr；55(4):296-302)(通过引用全部并入本文)进行小的修改，使用HLA-A2.1稳定性实验来评估突变肽的结合亲和力。将表达HLA‐A2.1的鼠科细胞(RMA-S A2细胞)于26℃下孵育18h，以在不存在任何肽的情况下允许HLA-A2的表面表达。从100μL体积中的300μM开始直到0.1μM，将肽以1:3系列稀释在具有U形底部的96孔板中。将2.5e5RMA-S A2细胞加入到每个孔中的100μl体积中。将混合物于26℃下孵育2小时，然后在37℃下孵育2小时，以允许未结合的HLA-A2.1被内化。将细胞以500g离心3分钟，并用PBS、5％FBS、0.5％BSA洗涤3次。将细胞与100μl的杂交瘤抗HLA-A2.1(PA2.1)的上清液孵育，并在4℃孵育30分钟。将细胞洗涤三次，然后与1:500稀释的Alexa
Figure BDA0001487915120000331
488山羊抗小鼠IgG(Molecular
Figure BDA0001487915120000332
)在4℃下孵育30分钟。将细胞洗涤三次，然后用Gallios流式细胞仪(Beckman Coulter)分析。作为阴性对照，在相同实验条件下，将RMA-S A2细胞与对HLA-A2.1无亲和力的肽一起孵育。使用以下公式计算荧光指数：荧光素指数＝(样品荧光-阴性对照的荧光)/阴性对照的荧光。
使用GraphPad Prism v5，用非线性回归分析Kd值。获得每个肽的Kd值，其表示与最大可能的结合的一半平衡的结合常数。
使用该实验，分析了ICOVIR15K-TD-gp100-tyr中的HLA-A2结合表位。如图6A所示，，表位Hex982和Hex713的突变形式与它们的未修饰对应物相比在与HLA-A2的结合方面保持了相同水平。因此，认为这些突变是“非功能性缺失”。如图6A所示，Hex917表位中的突变V925K与其未修饰的对应物相比显著降低了近600倍的HLA-A2结合。因此，认为该突变是“功能性缺失”。此外，如图6B所示，引入ICOVIR15K-TD-gp100-tyr中的所有肿瘤表位都与人HLA-A2.1结合，并且是有功能的。如图6C中总结的，ICOVIR15K-TD-gp100-tyr含有导致免疫显性腺病毒表位和功能性gp100和tyr表位丢失的“功能性缺失”。
实施例4
由ICOVIR15K-TD-gp100-tyr产生的免疫应答的体外分析
采用基于在第0天肌内注射灭活病毒进行初免(prime)，并在第14天静脉内给药活性病毒进一步加强免疫的免疫方案，用ICOVIR15K-gp100-tyr或ICOVIR15K-TD-gp100-tyr免疫HHD转基因小鼠，其中该HHD转基因小鼠是敲除了鼠科I类MHC H-2并设计以表达显著量的人类I类MHC Ag HLA-A2.1的C57BL/6小鼠品系(也称为HHD A2/Kb H-2b-；Firat,H.,etal.,Eur J Immunol.1999Oct；29(10):3112-21)。在第28天，分析针对多个六邻体表位的免疫应答，以确定哪些六邻体表位更具免疫原性，以及三重缺失的表位是否无法产生免疫应答。
使用酶联免疫吸附斑点(ELISPOT)实验来评估在第28天的时间点针对不同表位的免疫应答，该实验能使各反应细胞在膜上的分泌产物(即IFNγ)可视化，由此提供定性(抗原的类型)和定量(应答细胞的数量)信息。为了进行这样的分析，在第28天处死小鼠，收获脾脏并分离脾细胞。每只动物的脾细胞以2,500,000个细胞/孔铺板。使用植物凝集素(15ng/mL的PHA)加离子霉素(250ng/mL)作为阳性对照，将仅培养基用作阴性对照。使用终浓度为1μM的肽和肽库。将抗原与脾细胞在37℃、5％CO2下孵育至少18小时。洗涤孔，并与第二生物素化的抗IFNγ抗体(Mabtech 3321-6-250)孵育2小时，洗涤，然后与链霉亲和素-ALP(Sigma E2636.2.2ML)孵育1小时。用PBS洗涤平板，使用BCIP/NBT溶液(Sigma B1911-100ML)显影斑点，直到出现明显斑点(15～30分钟)。用自来水洗涤平板，静置干燥过夜，并使用AID EliSpot reader classic(ELR071；AID GmbH，Strassberg，德国)对斑点进行计数。随着CD8含量从0.5％变化到3.5％，斑点的数量经脾细胞群中CD8淋巴细胞的含量来校正。
在这个实验中，评估了针对六邻体表位组的反应性，该六邻体表位组包括三重缺失(Hex713、Hex892和Hex917)所靶向的那些表位，和根据表1所示的不同计算机方法预测的与HLA-A2.1以高亲和力结合的那些表位。包括以下人HLA-A2.1限制性腺病毒/肿瘤表位或多肽：E1A19(LLDQLIEEV)(SEQ ID NO:33)；Hex63(RLTLRFIPV)(SEQ ID NO:34)；Hex512(GLVDCYINL)(SEQ ID NO:23)；Hex548(MLLGNGRYV)(SEQ ID NO:35)；Hex652(MLYPIPANA)(SEQ ID NO:36)；Hex713(YLNHTFKKV)(SEQ ID NO:11)；Hex892(LLYANSAHA)(SEQ ID NO:15)；Hex914(TLLYVLFEV)(SEQ ID NO:37)；Hex917(YVLFEVFDV)(SEQ ID NO:19)；Tyr369(3D)(YMDGTMSQV(SEQ ID NO:32))；gp100-209(IMDQVPFSV)(SEQ ID NO:38)和gp100-280(YLEPGPVTA(SEQ ID NO:31))。此外，还包括六邻体多肽(与所有六邻体蛋白序列的9个氨基酸重叠的15种氨基酸多肽)，和用ICOVIR15K-gp100-tyr或ICOVIR15K-TD-gp100-tyr预感染24小时的初始脾细胞的库。
结果示于图7中。六邻体表位组包括三重缺失(Hex713、Hex892和Hex917)所靶向的那些表位，和根据不同的预测模型预测的与HLA-A2.1以高亲和力结合的那些表位。尽管当用ICOVIR15K-gp100-tyr来免疫时，检测不到针对三重缺失的六邻体表位Hex713和Hex892的CD8T细胞应答，而看到针对Hex917的低应答，但是三重缺失的病毒ICOVIR15K-TD-gp100-tyr不能够增强针对Hex917表位的应答，因此六邻体中的氨基酸取代V925K在体内是有功能的。还评估了针对经预测与HLA-A2.1以高亲和力结合的其它六邻体表位，如Hex63、Hex512、Hex548、Hex652和Hex914的免疫应答。在这些预测的表位中，只有Hex512能够诱导高免疫应答。有趣的是，与亲代对照病毒相比，经三重缺失的病毒ICOVIR15K-TD-gp100-tyr处理的小鼠对Hex512具有更高的应答，这表明当存在三重缺失时，存在免疫优势向其他六邻体表位的转移。
在ELISPOT实验中分析六邻体肽库(与所有六邻体蛋白序列的9个氨基酸重叠的15种氨基酸肽)时，ICOVIR15K-gp100-tyr和ICOVIR15K-TD-gp100-tyr病毒均产生对六邻体的高免疫应答，但是由三重缺失的病毒产生的对六邻体的免疫应答水平显著低于对照病毒。这一重要发现表明，即使未检测到针对三重缺失中的各靶向表位的高免疫应答，但是当这三个表位缺失时，总体抗六邻体的免疫原性降低(图7)。此外，为了测试针对所有腺病毒蛋白质的全身免疫是否由于三重缺失而改变，我们使用了感染病毒的初始脾细胞和抗原呈递细胞将全部腺病毒表位呈递给经免疫的动物的脾细胞。初始脾细胞经ICOVIR15K-gp100-tyr或ICOVIR15K-TD-gp100-tyr离体感染24小时，然后在ELISPOT实验中，加入到来自经免疫的小鼠的脾细胞中(图7)。用ICOVIR15K-gp100-tyr免疫的小鼠对用ICOVIR15K-gp100-tyr或ICOVIR15K-TD-gp100-tyr感染的初始脾细胞的应答非常好。然而，用三重缺失的病毒ICOVIR15K-TD-gp100-tyr免疫的小鼠对用ICOVIR15K-gp100-tyr或ICOVIR15K-TD-gp100-tyr感染的初始脾细胞的应答活性较低。与非三重缺失的病毒ICOVIR15K-gp100-tyr相比，用三重缺失的病毒ICOVIR15K-TD-gp100-tyr免疫的小鼠中总体抗腺病毒免疫应答显著降低。
为了评估针对具有三重缺失表位的六邻体的免疫应答调节是否增加了存在于腺病毒衣壳内的肿瘤表位的免疫原性，在图7中还分析了针对肿瘤表位酪氨酸酶的免疫应答。令人惊讶的是，当在三重缺失的病毒ICOVIR15K-TD-gp100-tyr的环境中展现肿瘤表位时，针对酪氨酸酶的免疫应答增加了50％。
总体而言，这些数据显示三重缺失的病毒ICOVIR15K-TD-gp100-tyr能够部分地躲避免疫系统，从而使得酪氨酸酶肿瘤表位比它在对照病毒ICOVIR15K-gp100-tyr中呈递时具有更高的免疫原性。
实施例5
免疫转移对抗肿瘤活性的影响
如上所述，在用ICOVIR15K-TD-gp100-tyr免疫的小鼠中检测到针对酪氨酸酶表位的强CD8+免疫活性(图7)。下面的实施例显示了与ICO15K-gp100-tyr相比，ICO15K-TD-gp100-tyr在携带鼠科肿瘤的动物中诱导更有效的抗肿瘤活性。具体而言，与用ICO15K-gp100-tyr处理的动物相比，注射ICO15K-TD-gp100-tyr的动物更难以形成肿瘤。
用亲代溶瘤腺病毒ICOVIR15K，具有展示于HVR5中的黑素瘤表位的溶瘤腺病毒(ICOVIR15K-gp100-tyr)，以及具有黑色素瘤表位、但携带三重缺失的相同腺病毒(ICOVIR15K-TD-gp100-trp)接种HHD转基因小鼠。如图8A所示的简图中所描述的那样来接种小鼠。随后，在皮下给予106个B16CAR-A2鼠科肿瘤细胞(酪氨酸酶阳性细胞)进行最后一次接种后7天，攻击(challenge)小鼠。B16CAR-A2细胞是先前用编码HLA-A2/Kb的cDNA序列的非复制型逆转录病毒载体MSCV-A2转导的B16CAR细胞的衍生物，其中，HLA-A2/Kb转基因表达在CMV启动子控制下的与鼠科α3结构域Kb融合的人HLA-A2.1的α1和α2结构域。
如在经典的肿瘤攻击形成实验(tumor challenge formation assay)中评估肿瘤形成，并监测肿瘤生长(图8B)。所有用亲代病毒ICOVIR15K接种的小鼠均发生肿瘤，而接种ICOVIR15K-gp100-tyr的小鼠中有90％发生肿瘤，用ICOVIR15K-TD-gp100-tyr接种时只有60％的小鼠发生肿瘤。表现出显著肿瘤生长抑制的唯一处理组是展示黑色素瘤表位且携带三重缺失的处理组(ICOVIR15K-TD-gp100-tyr)。
为了进一步评估抗肿瘤效力，用数显卡尺测量肿瘤尺寸，并根据公式V(mm3)＝π/6×W×L×D计算，其中，W、L和D分别为肿瘤的宽度、长度和深度(图8C)。用双尾学生t检验来成对比较不同处理组之间肿瘤体积差异的统计学显著性。结果表明，注射B16CAR-A2细胞后，用组合了三重缺失(TD)与肿瘤表位(gp100/tyr)展示的溶瘤病毒接种疫苗对肿瘤生长具有显著的影响。此外，对于每个组还绘制了的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)生存曲线，其终点设立在肿瘤体积≥500mm3处(图8D)。肿瘤大小从未达到阈值的动物列为右侧检查信息(right censored information)。使用对数秩检验来确定事件发生时间(time-to-event)上的差异的统计学显著性。再一次，相对于未处理组表现出显著增强的小鼠存活的唯一处理组是展示黑色素瘤表位且携带三重缺失的处理组(ICOVIR15K-gp100-tyr)。
总的来说，这些数据表明腺病毒的一个免疫显性六邻体表位的缺失连同肿瘤相关表位在腺病毒衣壳中的展示，能够增加溶瘤腺病毒的抗肿瘤功效。
实施例6
溶瘤腺病毒ICOVIR15K-QD的产生和表征
使用ICOVIR15K-TD作为背景，产生新的溶瘤腺病毒ICOVIR15K-QD，其保持ICOVIR15K-TD的“TD”并且在六邻体中引入了新的突变。如图7所示，Hex512是在转基因HHD鼠科模型中产生最高免疫应答之一的腺病毒表位。引入这种新突变的方法与产生ICOVIR15K-TD所使用的方法相同，使用简并引物将Hex512氨基酸的编码序列取代为除原始序列外的任何其它序列。这套新病毒的六邻体表位缺失被称为四重缺失(QuadrupleDeletion，QD)。值得注意的是，在该病毒中未引入肿瘤抗原。ICOVIR15K-QD中包括以下六邻体表位缺失：(1)Hex713表位第9位的V721A突变，缬氨酸被丙氨酸取代；(2)Hex892表位第9位A900S突变，其中丙氨酸被丝氨酸取代；(3)Hex917表位第9位的V925K突变，其中缬氨酸(V)被赖氨酸(K)取代；和(4)Hex512表位第9位的L520P突变，其中亮氨酸(L)被脯氨酸(P)取代。
表3显示了与其野生型对应物相比，每个突变体区域的确切的氨基酸序列。
表3
对应于包含于QD中的四个突变表位的氨基酸序列
Figure BDA0001487915120000361
通过基因组测序确认了六邻体中所有的QD缺失。经纯化的病毒ICOVIR15K-QD的物理和功能表征显示了功能性病毒比率(vp/TU)在正常标准内，并且通过未受影响的IC50值测量显示溶瘤复制能力未丢失(图9)。
还使用先前描述的HLA-A2.1稳定性实验，测试了存在于ICOVIR15K-QD中的突变形式Hex512的结合亲和力。如图10所示，Hex512表位中的突变L520P使HLA-A2结合显著减少了10倍以上，这可以认为是功能性表位缺失。
实施例7
溶瘤腺病毒ICOVIR15K-QD的抗肿瘤活性
使用其中未插入肿瘤抗原的ICOVIR15K-QD，进一步评估由免疫显性腺病毒表位缺失导致的免疫转移的治疗潜力。在两种不同的小鼠模型中评估它的抗肿瘤活性：HHD转基因小鼠和转基因C57BL/6A2/KbH-2+小鼠。C57BL/6A2/KbH-2+小鼠是也经设计以表达人I类MHCAg HLA-A2.1，但未敲除鼠科I类MHC H-2的小鼠品系。
溶瘤腺病毒ICOVIR15K-QD在转基因C57BL/6A2/KbH-2+小鼠中的抗肿瘤活性
将106个B16CAR-A2细胞皮下注射到转基因C57BL/6A2/KbH-2+小鼠的两侧腹中，并使其形成肿瘤(n＝5只动物/组)。在接种后第8天，使用1010vp的以下项对肿瘤进行瘤内注射：1)ICOVIR15K溶瘤腺病毒、2)ICOVIR15K-QD或3)PBS。在PBS中将病毒原液稀释至5.1011vp/ml，并使用0.3ml、30G的BD胰岛素注射器(Becton Dickinson 324826)，以每个注射部位10μl的量对每个肿瘤注射两次。具体而言，向肿瘤施加第一次注射并用5μl外科胶(VetBond)密封。等第一次密封凝固30秒后，向同一肿瘤施加第二次注射并用VetBond密封。用数显卡尺测量一直到81天的肿瘤尺寸，并根据公式V(mm3)＝π/6×W×L×D计算肿瘤体积，其中，W、L和D分别为肿瘤的宽度、长度和深度。用双尾学生t检验来成对比较不同处理组之间肿瘤体积差异的统计学显著性。对于卡普兰-迈耶生存曲线，将终点设立在肿瘤体积≥500mm3处。肿瘤大小从未达到阈值的动物列为右侧检查信息。使用对数秩检验来确定事件发生时间上的差异的统计学显著性。结果示于图11中。
注射PBS的肿瘤生长迅速。注射ICOVIR15K溶瘤腺病毒的肿瘤由于肿瘤内腺病毒复制引起的肿瘤细胞破坏而显著延迟了肿瘤生长。此外，七个注射ICOVIR15的肿瘤中的三个肿瘤消失。然而，在注射ICOVIR15K-QD的组中，肿瘤生长相对于ICOVIR15K显著地进一步降低，八个经注射的肿瘤中的四个消失(图11A)。用ICOVIR15K处理的动物的中位存活期(median survival)确定为24天(相比于PBS处理组的21天)，而用ICOVIR15K-QD处理的动物的中位存活期是65天(图11B)。这些数据表明，不管来自病毒的肿瘤抗原的表达如何，缺失腺病毒的免疫显性T细胞表位(Hex917和Hex512突变)都引起溶瘤腺病毒的抗肿瘤活性增强，这表明在病毒复制和细胞毒性的影响下从肿瘤中释放出来的肿瘤抗原能够驱动有效的抗肿瘤免疫应答。
溶瘤腺病毒ICOVIR15K-QD在HHD转基因小鼠中的抗肿瘤活性
将1e6的B16CAR-A2细胞皮下注射到转基因HHD A2/Kb H-2b-小鼠的两侧腹中，并使其形成肿瘤(n＝4只动物/组)。使用1.1010vp的以下项对右侧腹肿瘤进行瘤内注射：1)ICOVIR15K溶瘤腺病毒、2)ICOVIR15K-QD或3)PBS。在这个实验中，所有组的左侧肿瘤未进行处理以评估全身抗肿瘤活性。如前所述稀释病毒原液并施用。测量了7天的肿瘤尺寸，并根据公式V(mm3)＝π/6×W×L×D来计算它的体积。用双尾学生t检验来成对比较不同处理组之间肿瘤体积差异的统计学显著性。结果示于图12中。如下文实施例8中所述，在注射后7天将动物处死以收集脾细胞用于进一步的ELISPOT评估。
注射PBS的肿瘤以及其对侧的未经注射的肿瘤生长迅速。与PBS组相比，注射ICOVIR15K的肿瘤生长缓慢，尽管在7天的监测期间相对于其它组无显著性差异，但经ICOVIR15K-QD处理的肿瘤的生长进一步降低(图12A)。值得注意的是，在ICOVIR15K处理组中，对侧肿瘤未经历任何的肿瘤生长抑制，而对于ICOVIR15K-QD处理的肿瘤，对侧肿瘤的生长显著降低(图12B)。该证据有力地支持了：仅对于用ICOVIR15K-QD处理的动物产生了对肿瘤的全身免疫应答。
总的来说，这些数据令人惊讶地表明，在腺病毒衣壳中缺失免疫显性六邻体表位通过不需要展示来自腺病毒的肿瘤相关表位的全身性机制，增加了溶瘤腺病毒的抗肿瘤功效。
实施例8
在不存在肿瘤表位的情况下，通过缺失腺病毒免疫显性表位实现从抗腺病毒到抗肿瘤免疫应答的免疫转移。
同样用实施例7的HHD转基因小鼠(在其两侧腹携带有B16CAR-A2肿瘤并在左侧腹肿瘤中注射了ICOVIR15K、ICOVIR15K-QD或PBS)来分析由ICOVIR15K-QD病毒在体内产生的免疫应答。如实施例7中所述，在注射后七天处死动物，收获脾脏，并从脾中分离出脾细胞。为了评估在这个时间点针对不同表位的免疫应答，根据实施例4中描述的方案，使用2,500,000个脾细胞/孔通过酶联免疫斑点(ELISPOT)实验来测定免疫反应性。
在这个实验中，评估了针对以下人HLA-A2.1限制性腺病毒表位或多肽的反应性：E1A19(LLDQLIEEV)(SEQ ID NO:33)；Hex512(GLVDCYINL)(SEQ ID NO:23)；Hex713(YLNHTFKKV)(SEQ ID NO:11)；Hex892(LLYANSAHA)(SEQ ID NO:15)；和Hex917(YVLFEVFDV)(SEQ ID NO:19)。此外，还包括了六邻体肽的库，与所有六邻体蛋白序列的9个氨基酸重叠的15种氨基酸肽。由于未确定可增强抗肿瘤应答所针对的肿瘤表位，所以还包括了用IFN-γ预孵育以增强其抗原呈递性质的肿瘤B16CAR-A2鼠科细胞。
ELISPOT实验的结果示于图13中。与用ICOVIR15K处理的小鼠形成鲜明对比，肿瘤内注射ICOVIR15K-QD的小鼠不能增加对Hex512和Hex917表位的应答，这确定了六邻体中的氨基酸取代L520P和V925K在体内是有功能的。
此外，当将这些动物的脾细胞与完整的肿瘤B16CAR-A2鼠科细胞共培养以测试针对这些细胞的免疫力时，与用ICOVIR15K或PBS处理的小鼠相比，用ICOVIR15K-QD处理的小鼠显示出对B16CAR-A2肿瘤更高的免疫反应性。
总体而言，这些数据显示，与未经修饰的腺病毒相比，用其中已缺失免疫显性腺病毒表位的溶瘤腺病毒处理能够产生对肿瘤的更有效的抗肿瘤免疫应答。
本文引用的所有出版物、专利、专利申请、互联网网站和登录号/数据库序列(包括多核苷酸和多肽序列)出于所有目的通过引用的方式整体并入本文，如同具体地且单独地表明通过引用方式并入每个单独的出版物、专利、专利申请、互联网站点或登录号/数据库序列。
序列
SEQ ID NO:1-ICOVIR15K
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SEQ ID NO:2-ICOVIR15K-gp100-tyr
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SEQ ID NO:3-ICOVIR15K-TD
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SEQ ID NO:4-ICOVIR15K-TD-gp100-tyr
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SEQ ID NO:5-ICOVIR15K-QD
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SEQ ID NO:6–具有连接子的gp100-tyr插入序列
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SEQ ID NO:7–具有连接子的gp100-tyr插入序列
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SEQ ID NO:8–wt六邻体
atggctaccccttcgatgatgccgcagtggtcttacatgcacatctcgggccaggacgcctcggagtacctgagccccgggctggtgcagtttgcccgcgccaccgagacgtacttcagcctgaataacaagtttagaaaccccacggtggcgcctacgcacgacgtgaccacagaccggtcccagcgtttgacgctgcggttcatccctgtggaccgtgaggatactgcgtactcgtacaaggcgcggttcaccctagctgtgggtgataaccgtgtgctggacatggcttccacgtactttgacatccgcggcgtgctggacaggggccctacttttaagccctactctggcactgcctacaacgccctggctcccaagggtgccccaaatccttgcgaatgggatgaagctgctactgctcttgaaataaacctagaagaagaggacgatgacaacgaagacgaagtagacgagcaagctgagcagcaaaaaactcacgtatttgggcaggcgccttattctggtataaatattacaaaggagggtattcaaataggtgtcgaaggtcaaacacctaaatatgccgataaaacatttcaacctgaacctcaaataggagaatctcagtggtacgaaactgaaattaatcatgcagctgggagagtccttaaaaagactaccccaatgaaaccatgttacggttcatatgcaaaacccacaaatgaaaatggagggcaaggcattcttgtaaagcaacaaaatggaaagctagaaagtcaagtggaaatgcaatttttctcaactactgaggcgaccgcaggcaatggtgataacttgactcctaaagtggtattgtacagtgaagatgtagatatagaaaccccagacactcatatttcttacatgcccactattaaggaaggtaactcacgagaactaatgggccaacaatctatgcccaacaggcctaattacattgcttttagggacaattttattggtctaatgtattacaacagcacgggtaatatgggtgttctggcgggccaagcatcgcagttgaatgctgttgtagatttgcaagacagaaacacagagctttcataccagcttttgcttgattccattggtgatagaaccaggtacttttctatgtggaatcaggctgttgacagctatgatccagatgttagaattattgaaaatcatggaactgaagatgaacttccaaattactgctttccactgggaggtgtgattaatacagagactcttaccaaggtaaaacctaaaacaggtcaggaaaatggatgggaaaaagatgctacagaattttcagataaaaatgaaataagagttggaaataattttgccatggaaatcaatctaaatgccaacctgtggagaaatttcctgtactccaacatagcgctgtatttgcccgacaagctaaagtacagtccttccaacgtaaaaatttctgataacccaaacacctacgactacatgaacaagcgagtggtggctcccgggttagtggactgctacattaaccttggagcacgctggtcccttgactatatggacaacgtcaacccatttaaccaccaccgcaatgctggcctgcgctaccgctcaatgttgctgggcaatggtcgctatgtgcccttccacatccaggtgcctcagaagttctttgccattaaaaacctccttctcctgccgggctcatacacctacgagtggaacttcaggaaggatgttaacatggttctgcagagctccctaggaaatgacctaagggttgacggagccagcattaagtttgatagcatttgcctttacgccaccttcttccccatggcccacaacaccgcctccacgcttgaggccatgcttagaaacgacaccaacgaccagtcctttaacgactatctctccgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgcaactgggcggctttccgcggctgggccttcacgcgccttaagactaaggaaaccccatcactgggctcgggctacgacccttattacacctactctggctctataccctacctagatggaaccttttacctcaaccacacctttaagaaggtggccattacctttgactcttctgtcagctggcctggcaatgaccgcctgcttacccccaacgagtttgaaattaagcgctcagttgacggggagggttacaacgttgcccagtgtaacatgaccaaagactggttcctggtacaaatgctagctaactacaacattggctaccagggcttctatatcccagagagctacaaggaccgcatgtactccttctttagaaacttccagcccatgagccgtcaggtggtggatgatactaaatacaaggactaccaacaggtgggcatcctacaccaacacaacaactctggatttgttggctaccttgcccccaccatgcgcgaaggacaggcctaccctgctaacttcccctatccgcttataggcaagaccgcagttgacagcattacccagaaaaagtttctttgcgatcgcaccctttggcgcatcccattctccagtaactttatgtccatgggcgcactcacagacctgggccaaaaccttctctacgccaactccgcccacgcgctagacatgacttttgaggtggatcccatggacgagcccacccttctttatgttttgtttgaagtctttgacgtggtccgtgtgcaccagccgcaccgcggcgtcatcgaaaccgtgtacctgcgcacgcccttctcggccggcaacgccacaacataa
SEQ ID NO:9–wt六邻体
MATPSMMPQWSYMHISGQDASEYLSPGLVQFARATETYFSLNNKFRNPTVAPTHDVTTDRSQRLTLRFIPVDREDTAYSYKARFTLAVGDNRVLDMASTYFDIRGVLDRGPTFKPYSGTAYNALAPKGAPNPCEWDEAATALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQKTHVFGQAPYSGINITKEGIQIGVEGQTPKYADKTFQPEPQIGESQWYETEINHAAGRVLKKTTPMKPCYGSYAKPTNENGGQGILVKQQNGKLESQVEMQFFSTTEATAGNGDNLTPKVVLYSEDVDIETPDTHISYMPTIKEGNSRELMGQQSMPNRPNYIAFRDNFIGLMYYNSTGNMGVLAGQASQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDSIGDRTRYFSMWNQAVDSYDPDVRIIENHGTEDELPNYCFPLGGVINTETLTKVKPKTGQENGWEKDATEFSDKNEIRVGNNFAMEINLNANLWRNFLYSNIALYLPDKLKYSPSNVKISDNPNTYDYMNKRVVAPGLVDCYINLGARWSLDYMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGSYTYEWNFRKDVNMVLQSSLGNDLRVDGASIKFDSICLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQSFNDYLSAANMLYPIPANATNVPISIPSRNWAAFRGWAFTRLKTKETPSLGSGYDPYYTYSGSIPYLDGTFYLNHTFKKVAITFDSSVSWPGNDRLLTPNEFEIKRSVDGEGYNVAQCNMTKDWFLVQMLANYNIGYQGFYIPESYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDDTKYKDYQQVGILHQHNNSGFVGYLAPTMREGQAYPANFPYPLIGKTAVDSITQKKFLCDRTLWRIPFSSNFMSMGALTDLGQNLLYANSAHALDMTFEVDPMDEPTLLYVLFEVFDVVRVHQPHRGVIETVYLRTPFSAGNATT-
SEQ ID NO:10–Hex713表位
tacctcaaccacacctttaagaaggtg
SEQ ID NO:11–Hex713表位
YLNHTFKKV
SEQ ID NO:12–V721A表位
tacctcaaccacacctttaagaaggct
SEQ ID NO:13–V721A表位
YLNHTFKKA
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cttctctacgccaactccgcccacgcg
SEQ ID NO:15–Hex892表位
LLYANSAHA
SEQ ID NO:16–A901S表位
cttctctacgccaactccgcccactcc
SEQ ID NO:17–A901S表位
LLYANSAHS
SEQ ID NO:18–Hex917表位
tatgttttgtttgaagtctttgacgtg
SEQ ID NO:19–Hex917表位
YVLFEVFDV
SEQ ID NO:20–V925K表位
tatgttttgtttgaagtctttgacaag
SEQ ID NO:21–V925K表位
YVLFEVFDK
SEQ ID NO:22–Hex512表位
gggttagtggactgctacattaacctt
SEQ ID NO:23–Hex512表位
GLVDCYINL
SEQ ID NO:24–L520P表位
gggttagtggactgctacattaacccc
SEQ ID NO:25–L520P表位
GLVDCYINP
SEQ ID NO:26–肝素硫酸盐糖胺聚糖(HSG)结合位点
KKTK
SEQ ID NO:27–整合素结合基序
RGDK
SEQ ID NO:28–柔性连接子
GSGSR
SEQ ID NO:29–柔性连接子
AGSGSR
SEQ ID NO:30–柔性连接子
AGSGS
SEQ ID NO:31–gp100-280表位
YLEPGPVTA
SEQ ID NO:32–Tyr369(3D)表位
YMDGTMSQV
SEQ ID NO:33–E1A19表位
LLDQLIEEV
SEQ ID NO:34–Hex63表位
RLTLRFIPV
SEQ ID NO:35–Hex548表位
MLLGNGRYV
SEQ ID NO:36–Hex652表位
MLYPIPANA
SEQ ID NO:37–Hex914表位
TLLYVLFEV
SEQ ID NO:38–gp100-209表位
IMDQVPFSV
序列表
<110> VCN生物科学有限公司（VCN Biosciences SL）
莱蒙·阿莱马尼（ALEMANY, RAMON）
拉鲁·吉尔（GIL, Raul）
米里阿姆·巴赞（BAZAN, Miriam）
<120> 在免疫显性腺病毒抗原表位中具有缺失的溶瘤腺病毒及它们在癌症治疗中的用途
<130> P15365PC00
<140> PCT/IB2016/052554
<141> 2016-05-04
<150> US 62/156,748
<151> 2015-05-04
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOVIR15K (nt1-36124)
<400> 1
taattaccct gttatcccta catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata 60
tgataatgag ggggtggagt ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg 120
tagtagtgtg gcggaagtgt gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg 180
tggcaaaagt gacgtttttg gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg 240
gttttaggcg gatgttgtag taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc 300
gggaaaactg aataagagga agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa 360
tatttgtcta gggccgcggg gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt 420
ctcaggtgtt ttccgcgtac tcggcggctc gtggctcttt cgcggcaaaa aggatttggc 480
gcgtaaaagt ggttcgaagt actcggcggc tcgtggctct ttcgcggcaa aaaggatttg 540
gcgcgtaaaa gtggttcgaa gtacgtcgac cacaaacccc gcccagcgtc ttgtcattgg 600
cgtcgacgct gtacggggtc aaagttggcg ttttattatt atagtcagct gacgtgtagt 660
gtatttatac ccggtgagtt cctcaagagg ccactcttga gtgccagcga gtagagtttt 720
ctcctccgag ccgctccgac accgggactg aaaatgagac atattatctg ccacggaggt 780
gttattaccg aagaaatggc cgccagtctt ttggaccagc tgatcgaaga ggtactggct 840
gataatcttc cacctcctag ccattttgaa ccacctaccc ttcacgaact gtatgattta 900
gacgtgacgg cccccgaaga tcccaacgag gaggcggttt cgcagatttt tcccgactct 960
gtaatgttgg cggtgcagga agggattgac ttactcactt ttccgccggc gcccggttct 1020
ccggagccgc ctcacctttc ccggcagccc gagcagccgg agcagagagc cttgggtccg 1080
gtttctatgc caaaccttgt accggaggtg atcgatccac ccagtgacga cgaggatgaa 1140
gagggtgagg agtttgtgtt agattatgtg gagcaccccg ggcacggttg caggtcttgt 1200
cattatcacc ggaggaatac gggggaccca gatattatgt gttcgctttg ctatatgagg 1260
acctgtggca tgtttgtcta cagtaagtga aaattatggg cagtgggtga tagagtggtg 1320
ggtttggtgt ggtaattttt tttttaattt ttacagtttt gtggtttaaa gaattttgta 1380
ttgtgatttt tttaaaaggt cctgtgtctg aacctgagcc tgagcccgag ccagaaccgg 1440
agcctgcaag acctacccgc cgtcctaaaa tggcgcctgc tatcctgaga cgcccgacat 1500
cacctgtgtc cagagaatgc aatagtagta cggatagctg tgactccggt ccttctaaca 1560
cacctcctga gatacacccg gtggtcccgc tgtgccccat taaaccagtt gccgtgagag 1620
ttggtgggcg tcgccaggct gtggaatgta tcgaggactt gcttaacgag cctgggcaac 1680
ctttggactt gagctgtaaa cgccccaggc cataaggtgt aaacctgtga ttgcgtgtgt 1740
ggttaacgcc tttgtttgct gaatgagttg atgtaagttt aataaagggt gagataatgt 1800
ttaacttgca tggcgtgtta aatggggcgg ggcttaaagg gtatataatg cgccgtgggc 1860
taatcttggt tacatctgac ctcatggagg cttgggagtg tttggaagat ttttctgctg 1920
tgcgtaactt gctggaacag agctctaaca gtacctcttg gttttggagg tttctgtggg 1980
gctcatccca ggcaaagtta gtctgcagaa ttaaggagga ttacaagtgg gaatttgaag 2040
agcttttgaa atcctgtggt gagctgtttg attctttgaa tctgggtcac caggcgcttt 2100
tccaagagaa ggtcatcaag actttggatt tttccacacc ggggcgcgct gcggctgctg 2160
ttgctttttt gagttttata aaggataaat ggagcgaaga aacccatctg agcggggggt 2220
acctgctgga ttttctggcc atgcatctgt ggagagcggt tgtgagacac aagaatcgcc 2280
tgctactgtt gtcttccgtc cgcccggcga taataccgac ggaggagcag cagcagcagc 2340
aggaggaagc caggcggcgg cggcaggagc agagcccatg gaacccgaga gccggcctgg 2400
accctcggga atgaatgttg tacaggtggc tgaactgtat ccagaactga gacgcatttt 2460
gacaattaca gaggatgggc aggggctaaa gggggtaaag agggagcggg gggcttgtga 2520
ggctacagag gaggctagga atctagcttt tagcttaatg accagacacc gtcctgagtg 2580
tattactttt caacagatca aggataattg cgctaatgag cttgatctgc tggcgcagaa 2640
gtattccata gagcagctga ccacttactg gctgcagcca ggggatgatt ttgaggaggc 2700
tattagggta tatgcaaagg tggcacttag gccagattgc aagtacaaga tcagcaaact 2760
tgtaaatatc aggaattgtt gctacatttc tgggaacggg gccgaggtgg agatagatac 2820
ggaggatagg gtggccttta gatgtagcat gataaatatg tggccggggg tgcttggcat 2880
ggacggggtg gttattatga atgtaaggtt tactggcccc aattttagcg gtacggtttt 2940
cctggccaat accaacctta tcctacacgg tgtaagcttc tatgggttta acaatacctg 3000
tgtggaagcc tggaccgatg taagggttcg gggctgtgcc ttttactgct gctggaaggg 3060
ggtggtgtgt cgccccaaaa gcagggcttc aattaagaaa tgcctctttg aaaggtgtac 3120
cttgggtatc ctgtctgagg gtaactccag ggtgcgccac aatgtggcct ccgactgtgg 3180
ttgcttcatg ctagtgaaaa gcgtggctgt gattaagcat aacatggtat gtggcaactg 3240
cgaggacagg gcctctcaga tgctgacctg ctcggacggc aactgtcacc tgctgaagac 3300
cattcacgta gccagccact ctcgcaaggc ctggccagtg tttgagcata acatactgac 3360
ccgctgttcc ttgcatttgg gtaacaggag gggggtgttc ctaccttacc aatgcaattt 3420
gagtcacact aagatattgc ttgagcccga gagcatgtcc aaggtgaacc tgaacggggt 3480
gtttgacatg accatgaaga tctggaaggt gctgaggtac gatgagaccc gcaccaggtg 3540
cagaccctgc gagtgtggcg gtaaacatat taggaaccag cctgtgatgc tggatgtgac 3600
cgaggagctg aggcccgatc acttggtgct ggcctgcacc cgcgctgagt ttggctctag 3660
cgatgaagat acagattgag gtactgaaat gtgtgggcgt ggcttaaggg tgggaaagaa 3720
tatataaggt gggggtctta tgtagttttg tatctgtttt gcagcagccg ccgccgccat 3780
gagcaccaac tcgtttgatg gaagcattgt gagctcatat ttgacaacgc gcatgccccc 3840
atgggccggg gtgcgtcaga atgtgatggg ctccagcatt gatggtcgcc ccgtcctgcc 3900
cgcaaactct actaccttga cctacgagac cgtgtctgga acgccgttgg agactgcagc 3960
ctccgccgcc gcttcagccg ctgcagccac cgcccgcggg attgtgactg actttgcttt 4020
cctgagcccg cttgcaagca gtgcagcttc ccgttcatcc gcccgcgatg acaagttgac 4080
ggctcttttg gcacaattgg attctttgac ccgggaactt aatgtcgttt ctcagcagct 4140
gttggatctg cgccagcagg tttctgccct gaaggcttcc tcccctccca atgcggttta 4200
aaacataaat aaaaaaccag actctgtttg gatttggatc aagcaagtgt cttgctgtct 4260
ttatttaggg gttttgcgcg cgcggtaggc ccgggaccag cggtctcggt cgttgagggt 4320
cctgtgtatt ttttccagga cgtggtaaag gtgactctgg atgttcagat acatgggcat 4380
aagcccgtct ctggggtgga ggtagcacca ctgcagagct tcatgctgcg gggtggtgtt 4440
gtagatgatc cagtcgtagc aggagcgctg ggcgtggtgc ctaaaaatgt ctttcagtag 4500
caagctgatt gccaggggca ggcccttggt gtaagtgttt acaaagcggt taagctggga 4560
tgggtgcata cgtggggata tgagatgcat cttggactgt atttttaggt tggctatgtt 4620
cccagccata tccctccggg gattcatgtt gtgcagaacc accagcacag tgtatccggt 4680
gcacttggga aatttgtcat gtagcttaga aggaaatgcg tggaagaact tggagacgcc 4740
cttgtgacct ccaagatttt ccatgcattc gtccataatg atggcaatgg gcccacgggc 4800
ggcggcctgg gcgaagatat ttctgggatc actaacgtca tagttgtgtt ccaggatgag 4860
atcgtcatag gccattttta caaagcgcgg gcggagggtg ccagactgcg gtataatggt 4920
tccatccggc ccaggggcgt agttaccctc acagatttgc atttcccacg ctttgagttc 4980
agatgggggg atcatgtcta cctgcggggc gatgaagaaa acggtttccg gggtagggga 5040
gatcagctgg gaagaaagca ggttcctgag cagctgcgac ttaccgcagc cggtgggccc 5100
gtaaatcaca cctattaccg gctgcaactg gtagttaaga gagctgcagc tgccgtcatc 5160
cctgagcagg ggggccactt cgttaagcat gtccctgact cgcatgtttt ccctgaccaa 5220
atccgccaga aggcgctcgc cgcccagcga tagcagttct tgcaaggaag caaagttttt 5280
caacggtttg agaccgtccg ccgtaggcat gcttttgagc gtttgaccaa gcagttccag 5340
gcggtcccac agctcggtca cctgctctac ggcatctcga tccagcatat ctcctcgttt 5400
cgcgggttgg ggcggctttc gctgtacggc agtagtcggt gctcgtccag acgggccagg 5460
gtcatgtctt tccacgggcg cagggtcctc gtcagcgtag tctgggtcac ggtgaagggg 5520
tgcgctccgg gctgcgcgct ggccagggtg cgcttgaggc tggtcctgct ggtgctgaag 5580
cgctgccggt cttcgccctg cgcgtcggcc aggtagcatt tgaccatggt gtcatagtcc 5640
agcccctccg cggcgtggcc cttggcgcgc agcttgccct tggaggaggc gccgcacgag 5700
gggcagtgca gacttttgag ggcgtagagc ttgggcgcga gaaataccga ttccggggag 5760
taggcatccg cgccgcaggc cccgcagacg gtctcgcatt ccacgagcca ggtgagctct 5820
ggccgttcgg ggtcaaaaac caggtttccc ccatgctttt tgatgcgttt cttacctctg 5880
gtttccatga gccggtgtcc acgctcggtg acgaaaaggc tgtccgtgtc cccgtataca 5940
gacttgagag gcctgtcctc gagcggtgtt ccgcggtcct cctcgtatag aaactcggac 6000
cactctgaga caaaggctcg cgtccaggcc agcacgaagg aggctaagtg ggaggggtag 6060
cggtcgttgt ccactagggg gtccactcgc tccagggtgt gaagacacat gtcgccctct 6120
tcggcatcaa ggaaggtgat tggtttgtag gtgtaggcca cgtgaccggg tgttcctgaa 6180
ggggggctat aaaagggggt gggggcgcgt tcgtcctcac tctcttccgc atcgctgtct 6240
gcgagggcca gctgttgggg tgagtactcc ctctgaaaag cgggcatgac ttctgcgcta 6300
agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat ttgatattca cctggcccgc ggtgatgcct 6360
ttgagggtgg ccgcatccat ctggtcagaa aagacaatct ttttgttgtc aagcttggtg 6420
gcaaacgacc cgtagagggc gttggacagc aacttggcga tggagcgcag ggtttggttt 6480
ttgtcgcgat cggcgcgctc cttggccgcg atgtttagct gcacgtattc gcgcgcaacg 6540
caccgccatt cgggaaagac ggtggtgcgc tcgtcgggca ccaggtgcac gcgccaaccg 6600
cggttgtgca gggtgacaag gtcaacgctg gtggctacct ctccgcgtag gcgctcgttg 6660
gtccagcaga ggcggccgcc cttgcgcgag cagaatggcg gtagggggtc tagctgcgtc 6720
tcgtccgggg ggtctgcgtc cacggtaaag accccgggca gcaggcgcgc gtcgaagtag 6780
tctatcttgc atccttgcaa gtctagcgcc tgctgccatg cgcgggcggc aagcgcgcgc 6840
tcgtatgggt tgagtggggg accccatggc atggggtggg tgagcgcgga ggcgtacatg 6900
ccgcaaatgt cgtaaacgta gaggggctct ctgagtattc caagatatgt agggtagcat 6960
cttccaccgc ggatgctggc gcgcacgtaa tcgtatagtt cgtgcgaggg agcgaggagg 7020
tcgggaccga ggttgctacg ggcgggctgc tctgctcgga agactatctg cctgaagatg 7080
gcatgtgagt tggatgatat ggttggacgc tggaagacgt tgaagctggc gtctgtgaga 7140
cctaccgcgt cacgcacgaa ggaggcgtag gagtcgcgca gcttgttgac cagctcggcg 7200
gtgacctgca cgtctagggc gcagtagtcc agggtttcct tgatgatgtc atacttatcc 7260
tgtccctttt ttttccacag ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc tttccagtac 7320
tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa cggtaagagc ctagcatgta gaactggttg 7380
acggcctggt aggcgcagca tcccttttct acgggtagcg cgtatgcctg cgcggccttc 7440
cggagcgagg tgtgggtgag cgcaaaggtg tccctgacca tgactttgag gtactggtat 7500
ttgaagtcag tgtcgtcgca tccgccctgc tcccagagca aaaagtccgt gcgctttttg 7560
gaacgcggat ttggcagggc gaaggtgaca tcgttgaaga gtatctttcc cgcgcgaggc 7620
ataaagttgc gtgtgatgcg gaagggtccc ggcacctcgg aacggttgtt aattacctgg 7680
gcggcgagca cgatctcgtc aaagccgttg atgttgtggc ccacaatgta aagttccaag 7740
aagcgcggga tgcccttgat ggaaggcaat tttttaagtt cctcgtaggt gagctcttca 7800
ggggagctga gcccgtgctc tgaaagggcc cagtctgcaa gatgagggtt ggaagcgacg 7860
aatgagctcc acaggtcacg ggccattagc atttgcaggt ggtcgcgaaa ggtcctaaac 7920
tggcgaccta tggccatttt ttctggggtg atgcagtaga aggtaagcgg gtcttgttcc 7980
cagcggtccc atccaaggtt cgcggctagg tctcgcgcgg cagtcactag aggctcatct 8040
ccgccgaact tcatgaccag catgaagggc acgagctgct tcccaaaggc ccccatccaa 8100
gtataggtct ctacatcgta ggtgacaaag agacgctcgg tgcgaggatg cgagccgatc 8160
gggaagaact ggatctcccg ccaccaattg gaggagtggc tattgatgtg gtgaaagtag 8220
aagtccctgc gacgggccga acactcgtgc tggcttttgt aaaaacgtgc gcagtactgg 8280
cagcggtgca cgggctgtac atcctgcacg aggttgacct gacgaccgcg cacaaggaag 8340
cagagtggga atttgagccc ctcgcctggc gggtttggct ggtggtcttc tacttcggct 8400
gcttgtcctt gaccgtctgg ctgctcgagg ggagttacgg tggatcggac caccacgccg 8460
cgcgagccca aagtccagat gtccgcgcgc ggcggtcgga gcttgatgac aacatcgcgc 8520
agatgggagc tgtccatggt ctggagctcc cgcggcgtca ggtcaggcgg gagctcctgc 8580
aggtttacct cgcatagacg ggtcagggcg cgggctagat ccaggtgata cctaatttcc 8640
aggggctggt tggtggcggc gtcgatggct tgcaagaggc cgcatccccg cggcgcgact 8700
acggtaccgc gcggcgggcg gtgggccgcg ggggtgtcct tggatgatgc atctaaaagc 8760
ggtgacgcgg gcgagccccc ggaggtaggg ggggctccgg acccgccggg agagggggca 8820
ggggcacgtc ggcgccgcgc gcgggcagga gctggtgctg cgcgcgtagg ttgctggcga 8880
acgcgacgac gcggcggttg atctcctgaa tctggcgcct ctgcgtgaag acgacgggcc 8940
cggtgagctt gaacctgaaa gagagttcga cagaatcaat ttcggtgtcg ttgacggcgg 9000
cctggcgcaa aatctcctgc acgtctcctg agttgtcttg ataggcgatc tcggccatga 9060
actgctcgat ctcttcctcc tggagatctc cgcgtccggc tcgctccacg gtggcggcga 9120
ggtcgttgga aatgcgggcc atgagctgcg agaaggcgtt gaggcctccc tcgttccaga 9180
cgcggctgta gaccacgccc ccttcggcat cgcgggcgcg catgaccacc tgcgcgagat 9240
tgagctccac gtgccgggcg aagacggcgt agtttcgcag gcgctgaaag aggtagttga 9300
gggtggtggc ggtgtgttct gccacgaaga agtacataac ccagcgtcgc aacgtggatt 9360
cgttgatatc ccccaaggcc tcaaggcgct ccatggcctc gtagaagtcc acggcgaagt 9420
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tggccggaca ggccgcgtcg tgcacgcagc accttgcgtc ggtgttggag atctgcacca 23220
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taat 36124
<210> 2
<211> 36156
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOVIR15K-gp100-tyr
<400> 2
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gtcggcggct cgtggctctt tcgcggcaaa aaggatttgg cgcgtaaaag tggttcgagt 480
acgtcggcgg ctcgtggctc tttcgcggca aaaaggattt ggcgcgtaaa agtggttcga 540
agtacgtcga ccacaaaccc cgcccagcgt cttgtcattg gcgtcgacgc tgtacggggt 600
caaagttggc gttttattat tatagtcagc tgacgtgtag tgtatttata cccggtgagt 660
tcctcaagag gccactcttg agtgccagcg agtagagttt tctcctccga gccgctccga 720
caccgggact gaaaatgaga catattatct gccacggagg tgttattacc gaagaaatgg 780
ccgccagtct tttggaccag ctgatcgaag aggtactggc tgataatctt ccacctccta 840
gccattttga accacctacc cttcacgaac tgtatgattt agacgtgacg gcccccgaag 900
atcccaacga ggaggcggtt tcgcagattt ttcccgactc tgtaatgttg gcggtgcagg 960
aagggattga cttactcact tttccgccgg cgcccggttc tccggagccg cctcaccttt 1020
cccggcagcc cgagcagccg gagcagagag ccttgggtcc ggtttctatg ccaaaccttg 1080
taccggaggt gatcgatcca cccagtgacg acgaggatga agagggtgag gagtttgtgt 1140
tagattatgt ggagcacccc gggcacggtt gcaggtcttg tcattatcac cggaggaata 1200
cgggggaccc agatattatg tgttcgcttt gctatatgag gacctgtggc atgtttgtct 1260
acagtaagtg aaaattatgg gcagtgggtg atagagtggt gggtttggtg tggtaatttt 1320
ttttttaatt tttacagttt tgtggtttaa agaattttgt attgtgattt ttttaaaagg 1380
tcctgtgtct gaacctgagc ctgagcccga gccagaaccg gagcctgcaa gacctacccg 1440
ccgtcctaaa atggcgcctg ctatcctgag acgcccgaca tcacctgtgt ccagagaatg 1500
caatagtagt acggatagct gtgactccgg tccttctaac acacctcctg agatacaccc 1560
ggtggtcccg ctgtgcccca ttaaaccagt tgccgtgaga gttggtgggc gtcgccaggc 1620
tgtggaatgt atcgaggact tgcttaacga gcctgggcaa cctttggact tgagctgtaa 1680
acgccccagg ccataaggtg taaacctgtg attgcgtgtg tggttaacgc ctttgtttgc 1740
tgaatgagtt gatgtaagtt taataaaggg tgagataatg tttaacttgc atggcgtgtt 1800
aaatggggcg gggcttaaag ggtatataat gcgccgtggg ctaatcttgg ttacatctga 1860
cctcatggag gcttgggagt gtttggaaga tttttctgct gtgcgtaact tgctggaaca 1920
gagctctaac agtacctctt ggttttggag gtttctgtgg ggctcatccc aggcaaagtt 1980
agtctgcaga attaaggagg attacaagtg ggaatttgaa gagcttttga aatcctgtgg 2040
tgagctgttt gattctttga atctgggtca ccaggcgctt ttccaagaga aggtcatcaa 2100
gactttggat ttttccacac cggggcgcgc tgcggctgct gttgcttttt tgagttttat 2160
aaaggataaa tggagcgaag aaacccatct gagcgggggg tacctgctgg attttctggc 2220
catgcatctg tggagagcgg ttgtgagaca caagaatcgc ctgctactgt tgtcttccgt 2280
ccgcccggcg ataataccga cggaggagca gcagcagcag caggaggaag ccaggcggcg 2340
gcggcaggag cagagcccat ggaacccgag agccggcctg gaccctcggg aatgaatgtt 2400
gtacaggtgg ctgaactgta tccagaactg agacgcattt tgacaattac agaggatggg 2460
caggggctaa agggggtaaa gagggagcgg ggggcttgtg aggctacaga ggaggctagg 2520
aatctagctt ttagcttaat gaccagacac cgtcctgagt gtattacttt tcaacagatc 2580
aaggataatt gcgctaatga gcttgatctg ctggcgcaga agtattccat agagcagctg 2640
accacttact ggctgcagcc aggggatgat tttgaggagg ctattagggt atatgcaaag 2700
gtggcactta ggccagattg caagtacaag atcagcaaac ttgtaaatat caggaattgt 2760
tgctacattt ctgggaacgg ggccgaggtg gagatagata cggaggatag ggtggccttt 2820
agatgtagca tgataaatat gtggccgggg gtgcttggca tggacggggt ggttattatg 2880
aatgtaaggt ttactggccc caattttagc ggtacggttt tcctggccaa taccaacctt 2940
atcctacacg gtgtaagctt ctatgggttt aacaatacct gtgtggaagc ctggaccgat 3000
gtaagggttc ggggctgtgc cttttactgc tgctggaagg gggtggtgtg tcgccccaaa 3060
agcagggctt caattaagaa atgcctcttt gaaaggtgta ccttgggtat cctgtctgag 3120
ggtaactcca gggtgcgcca caatgtggcc tccgactgtg gttgcttcat gctagtgaaa 3180
agcgtggctg tgattaagca taacatggta tgtggcaact gcgaggacag ggcctctcag 3240
atgctgacct gctcggacgg caactgtcac ctgctgaaga ccattcacgt agccagccac 3300
tctcgcaagg cctggccagt gtttgagcat aacatactga cccgctgttc cttgcatttg 3360
ggtaacagga ggggggtgtt cctaccttac caatgcaatt tgagtcacac taagatattg 3420
cttgagcccg agagcatgtc caaggtgaac ctgaacgggg tgtttgacat gaccatgaag 3480
atctggaagg tgctgaggta cgatgagacc cgcaccaggt gcagaccctg cgagtgtggc 3540
ggtaaacata ttaggaacca gcctgtgatg ctggatgtga ccgaggagct gaggcccgat 3600
cacttggtgc tggcctgcac ccgcgctgag tttggctcta gcgatgaaga tacagattga 3660
ggtactgaaa tgtgtgggcg tggcttaagg gtgggaaaga atatataagg tgggggtctt 3720
atgtagtttt gtatctgttt tgcagcagcc gccgccgcca tgagcaccaa ctcgtttgat 3780
ggaagcattg tgagctcata tttgacaacg cgcatgcccc catgggccgg ggtgcgtcag 3840
aatgtgatgg gctccagcat tgatggtcgc cccgtcctgc ccgcaaactc tactaccttg 3900
acctacgaga ccgtgtctgg aacgccgttg gagactgcag cctccgccgc cgcttcagcc 3960
gctgcagcca ccgcccgcgg gattgtgact gactttgctt tcctgagccc gcttgcaagc 4020
agtgcagctt cccgttcatc cgcccgcgat gacaagttga cggctctttt ggcacaattg 4080
gattctttga cccgggaact taatgtcgtt tctcagcagc tgttggatct gcgccagcag 4140
gtttctgccc tgaaggcttc ctcccctccc aatgcggttt aaaacataaa taaaaaacca 4200
gactctgttt ggatttggat caagcaagtg tcttgctgtc tttatttagg ggttttgcgc 4260
gcgcggtagg cccgggacca gcggtctcgg tcgttgaggg tcctgtgtat tttttccagg 4320
acgtggtaaa ggtgactctg gatgttcaga tacatgggca taagcccgtc tctggggtgg 4380
aggtagcacc actgcagagc ttcatgctgc ggggtggtgt tgtagatgat ccagtcgtag 4440
caggagcgct gggcgtggtg cctaaaaatg tctttcagta gcaagctgat tgccaggggc 4500
aggcccttgg tgtaagtgtt tacaaagcgg ttaagctggg atgggtgcat acgtggggat 4560
atgagatgca tcttggactg tatttttagg ttggctatgt tcccagccat atccctccgg 4620
ggattcatgt tgtgcagaac caccagcaca gtgtatccgg tgcacttggg aaatttgtca 4680
tgtagcttag aaggaaatgc gtggaagaac ttggagacgc ccttgtgacc tccaagattt 4740
tccatgcatt cgtccataat gatggcaatg ggcccacggg cggcggcctg ggcgaagata 4800
tttctgggat cactaacgtc atagttgtgt tccaggatga gatcgtcata ggccattttt 4860
acaaagcgcg ggcggagggt gccagactgc ggtataatgg ttccatccgg cccaggggcg 4920
tagttaccct cacagatttg catttcccac gctttgagtt cagatggggg gatcatgtct 4980
acctgcgggg cgatgaagaa aacggtttcc ggggtagggg agatcagctg ggaagaaagc 5040
aggttcctga gcagctgcga cttaccgcag ccggtgggcc cgtaaatcac acctattacc 5100
gggtgcaact ggtagttaag agagctgcag ctgccgtcat ccctgagcag gggggccact 5160
tcgttaagca tgtccctgac tcgcatgttt tccctgacca aatccgccag aaggcgctcg 5220
ccgcccagcg atagcagttc ttgcaaggaa gcaaagtttt tcaacggttt gagaccgtcc 5280
gccgtaggca tgcttttgag cgtttgacca agcagttcca ggcggtccca cagctcggtc 5340
acctgctcta cggcatctcg atccagcata tctcctcgtt tcgcgggttg gggcggcttt 5400
cgctgtacgg cagtagtcgg tgctcgtcca gacgggccag ggtcatgtct ttccacgggc 5460
gcagggtcct cgtcagcgta gtctgggtca cggtgaaggg gtgcgctccg ggctgcgcgc 5520
tggccagggt gcgcttgagg ctggtcctgc tggtgctgaa gcgctgccgg tcttcgccct 5580
gcgcgtcggc caggtagcat ttgaccatgg tgtcatagtc cagcccctcc gcggcgtggc 5640
ccttggcgcg cagcttgccc ttggaggagg cgccgcacga ggggcagtgc agacttttga 5700
gggcgtagag cttgggcgcg agaaataccg attccgggga gtaggcatcc gcgccgcagg 5760
ccccgcagac ggtctcgcat tccacgagcc aggtgagctc tggccgttcg gggtcaaaaa 5820
ccaggtttcc cccatgcttt ttgatgcgtt tcttacctct ggtttccatg agccggtgtc 5880
cacgctcggt gacgaaaagg ctgtccgtgt ccccgtatac agacttgaga ggcctgtcct 5940
cgagcggtgt tccgcggtcc tcctcgtata gaaactcgga ccactctgag acaaaggctc 6000
gcgtccaggc cagcacgaag gaggctaagt gggaggggta gcggtcgttg tccactaggg 6060
ggtccactcg ctccagggtg tgaagacaca tgtcgccctc ttcggcatca aggaaggtga 6120
ttggtttgta ggtgtaggcc acgtgaccgg gtgttcctga aggggggcta taaaaggggg 6180
tgggggcgcg ttcgtcctca ctctcttccg catcgctgtc tgcgagggcc agctgttggg 6240
gtgagtactc cctctgaaaa gcgggcatga cttctgcgct aagattgtca gtttccaaaa 6300
acgaggagga tttgatattc acctggcccg cggtgatgcc tttgagggtg gccgcatcca 6360
tctggtcaga aaagacaatc tttttgttgt caagcttggt ggcaaacgac ccgtagaggg 6420
cgttggacag caacttggcg atggagcgca gggtttggtt tttgtcgcga tcggcgcgct 6480
ccttggccgc gatgtttagc tgcacgtatt cgcgcgcaac gcaccgccat tcgggaaaga 6540
cggtggtgcg ctcgtcgggc accaggtgca cgcgccaacc gcggttgtgc agggtgacaa 6600
ggtcaacgct ggtggctacc tctccgcgta ggcgctcgtt ggtccagcag aggcggccgc 6660
ccttgcgcga gcagaatggc ggtagggggt ctagctgcgt ctcgtccggg gggtctgcgt 6720
ccacggtaaa gaccccgggc agcaggcgcg cgtcgaagta gtctatcttg catccttgca 6780
agtctagcgc ctgctgccat gcgcgggcgg caagcgcgcg ctcgtatggg ttgagtgggg 6840
gaccccatgg catggggtgg gtgagcgcgg aggcgtacat gccgcaaatg tcgtaaacgt 6900
agaggggctc tctgagtatt ccaagatatg tagggtagca tcttccaccg cggatgctgg 6960
cgcgcacgta atcgtatagt tcgtgcgagg gagcgaggag gtcgggaccg aggttgctac 7020
gggcgggctg ctctgctcgg aagactatct gcctgaagat ggcatgtgag ttggatgata 7080
tggttggacg ctggaagacg ttgaagctgg cgtctgtgag acctaccgcg tcacgcacga 7140
aggaggcgta ggagtcgcgc agcttgttga ccagctcggc ggtgacctgc acgtctaggg 7200
cgcagtagtc cagggtttcc ttgatgatgt catacttatc ctgtcccttt tttttccaca 7260
gctcgcggtt gaggacaaac tcttcgcggt ctttccagta ctcttggatc ggaaacccgt 7320
cggcctccga acggtaagag cctagcatgt agaactggtt gacggcctgg taggcgcagc 7380
atcccttttc tacgggtagc gcgtatgcct gcgcggcctt ccggagcgag gtgtgggtga 7440
gcgcaaaggt gtccctgacc atgactttga ggtactggta tttgaagtca gtgtcgtcgc 7500
atccgccctg ctcccagagc aaaaagtccg tgcgcttttt ggaacgcgga tttggcaggg 7560
cgaaggtgac atcgttgaag agtatctttc ccgcgcgagg cataaagttg cgtgtgatgc 7620
ggaagggtcc cggcacctcg gaacggttgt taattacctg ggcggcgagc acgatctcgt 7680
caaagccgtt gatgttgtgg cccacaatgt aaagttccaa gaagcgcggg atgcccttga 7740
tggaaggcaa ttttttaagt tcctcgtagg tgagctcttc aggggagctg agcccgtgct 7800
ctgaaagggc ccagtctgca agatgagggt tggaagcgac gaatgagctc cacaggtcac 7860
gggccattag catttgcagg tggtcgcgaa aggtcctaaa ctggcgacct atggccattt 7920
tttctggggt gatgcagtag aaggtaagcg ggtcttgttc ccagcggtcc catccaaggt 7980
tcgcggctag gtctcgcgcg gcagtcacta gaggctcatc tccgccgaac ttcatgacca 8040
gcatgaaggg cacgagctgc ttcccaaagg cccccatcca agtataggtc tctacatcgt 8100
aggtgacaaa gagacgctcg gtgcgaggat gcgagccgat cgggaagaac tggatctccc 8160
gccaccaatt ggaggagtgg ctattgatgt ggtgaaagta gaagtccctg cgacgggccg 8220
aacactcgtg ctggcttttg taaaaacgtg cgcagtactg gcagcggtgc acgggctgta 8280
catcctgcac gaggttgacc tgacgaccgc gcacaaggaa gcagagtggg aatttgagcc 8340
cctcgcctgg cgggtttggc tggtggtctt ctacttcggc tgcttgtcct tgaccgtctg 8400
gctgctcgag gggagttacg gtggatcgga ccaccacgcc gcgcgagccc aaagtccaga 8460
tgtccgcgcg cggcggtcgg agcttgatga caacatcgcg cagatgggag ctgtccatgg 8520
tctggagctc ccgcggcgtc aggtcaggcg ggagctcctg caggtttacc tcgcatagac 8580
gggtcagggc gcgggctaga tccaggtgat acctaatttc caggggctgg ttggtggcgg 8640
cgtcgatggc ttgcaagagg ccgcatcccc gcggcgcgac tacggtaccg cgcggcgggc 8700
ggtgggccgc gggggtgtcc ttggatgatg catctaaaag cggtgacgcg ggcgagcccc 8760
cggaggtagg gggggctccg gacccgccgg gagagggggc aggggcacgt cggcgccgcg 8820
cgcgggcagg agctggtgct gcgcgcgtag gttgctggcg aacgcgacga cgcggcggtt 8880
gatctcctga atctggcgcc tctgcgtgaa gacgacgggc ccggtgagct tgagcctgaa 8940
agagagttcg acagaatcaa tttcggtgtc gttgacggcg gcctggcgca aaatctcctg 9000
cacgtctcct gagttgtctt gataggcgat ctcggccatg aactgctcga tctcttcctc 9060
ctggagatct ccgcgtccgg ctcgctccac ggtggcggcg aggtcgttgg aaatgcgggc 9120
catgagctgc gagaaggcgt tgaggcctcc ctcgttccag acgcggctgt agaccacgcc 9180
cccttcggca tcgcgggcgc gcatgaccac ctgcgcgaga ttgagctcca cgtgccgggc 9240
gaagacggcg tagtttcgca ggcgctgaaa gaggtagttg agggtggtgg cggtgtgttc 9300
tgccacgaag aagtacataa cccagcgtcg caacgtggat tcgttgatat cccccaaggc 9360
ctcaaggcgc tccatggcct cgtagaagtc cacggcgaag ttgaaaaact gggagttgcg 9420
cgccgacacg gttaactcct cctccagaag acggatgagc tcggcgacag tgtcgcgcac 9480
ctcgcgctca aaggctacag gggcctcttc ttcttcttca atctcctctt ccataagggc 9540
ctccccttct tcttcttctg gcggcggtgg gggagggggg acacggcggc gacgacggcg 9600
caccgggagg cggtcgacaa agcgctcgat catctccccg cggcgacggc gcatggtctc 9660
ggtgacggcg cggccgttct cgcgggggcg cagttggaag acgccgcccg tcatgtcccg 9720
gttatgggtt ggcggggggc tgccatgcgg cagggatacg gcgctaacga tgcatctcaa 9780
caattgttgt gtaggtactc cgccgccgag ggacctgagc gagtccgcat cgaccggatc 9840
ggaaaacctc tcgagaaagg cgtctaacca gtcacagtcg caaggtaggc tgagcaccgt 9900
ggcgggcggc agcgggcggc ggtcggggtt gtttctggcg gaggtgctgc tgatgatgta 9960
attaaagtag gcggtcttga gacggcggat ggtcgacaga agcaccatgt ccttgggtcc 10020
ggcctgctga atgcgcaggc ggtcggccat gccccaggct tcgttttgac atcggcgcag 10080
gtctttgtag tagtcttgca tgagcctttc taccggcact tcttcttctc cttcctcttg 10140
tcctgcatct cttgcatcta tcgctgcggc ggcggcggag tttggccgta ggtggcgccc 10200
tcttcctccc atgcgtgtga ccccgaagcc cctcatcggc tgaagcaggg ctaggtcggc 10260
gacaacgcgc tcggctaata tggcctgctg cacctgcgtg agggtagact ggaagtcatc 10320
catgtccaca aagcggtggt atgcgcccgt gttgatggtg taagtgcagt tggccataac 10380
ggaccagtta acggtctggt gacccggctg cgagagctcg gtgtacctga gacgcgagta 10440
agccctcgag tcaaatacgt agtcgttgca agtccgcacc aggtactggt atcccaccaa 10500
aaagtgcggc ggcggctggc ggtagagggg ccagcgtagg gtggccgggg ctccgggggc 10560
gagatcttcc aacataaggc gatgatatcc gtagatgtac ctggacatcc aggtgatgcc 10620
ggcggcggtg gtggaggcgc gcggaaagtc gcggacgcgg ttccagatgt tgcgcagcgg 10680
caaaaagtgc tccatggtcg ggacgctctg gccggtcagg cgcgcgcaat cgttgacgct 10740
ctagaccgtg caaaaggaga gcctgtaagc gggcactctt ccgtggtctg gtggataaat 10800
tcgcaagggt atcatggcgg acgaccgggg ttcgagcccc gtatccggcc gtccgccgtg 10860
atccatgcgg ttaccgcccg cgtgtcgaac ccaggtgtgc gacgtcagac aacgggggag 10920
tgctcctttt ggcttccttc caggcgcggc ggctgctgcg ctagcttttt tggccactgg 10980
ccgcgcgcag cgtaagcggt taggctggaa agcgaaagca ttaagtggct cgctccctgt 11040
agccggaggg ttattttcca agggttgagt cgcgggaccc ccggttcgag tctcggaccg 11100
gccggactgc ggcgaacggg ggtttgcctc cccgtcatgc aagaccccgc ttgcaaattc 11160
ctccggaaac agggacgagc cccttttttg cttttcccag atgcatccgg tgctgcggca 11220
gatgcgcccc cctcctcagc agcggcaaga gcaagagcag cggcagacat gcagggcacc 11280
ctcccctcct cctaccgcgt caggaggggc gacatccgcg gttgacgcgg cagcagatgg 11340
tgattacgaa cccccgcggc gccgggcccg gcactacctg gacttggagg agggcgaggg 11400
cctggcgcgg ctaggagcgc cctctcctga gcggtaccca agggtgcagc tgaagcgtga 11460
tacgcgtgag gcgtacgtgc cgcggcagaa cctgtttcgc gaccgcgagg gagaggagcc 11520
cgaggagatg cgggatcgaa agttccacgc agggcgcgag ctgcggcatg gcctgaatcg 11580
cgagcggttg ctgcgcgagg aggactttga gcccgacgcg cgaaccggga ttagtcccgc 11640
gcgcgcacac gtggcggccg ccgacctggt aaccgcatac gagcagacgg tgaaccagga 11700
gattaacttt caaaaaagct ttaacaacca cgtgcgtacg cttgtggcgc gcgaggaggt 11760
ggctatagga ctgatgcatc tgtgggactt tgtaagcgcg ctggagcaaa acccaaatag 11820
caagccgctc atggcgcagc tgttccttat agtgcagcac agcagggaca acgaggcatt 11880
cagggatgcg ctgctaaaca tagtagagcc cgagggccgc tggctgctcg atttgataaa 11940
catcctgcag agcatagtgg tgcaggagcg cagcttgagc ctggctgaca aggtggccgc 12000
catcaactat tccatgctta gcctgggcaa gttttacgcc cgcaagatat accatacccc 12060
ttacgttccc atagacaagg aggtaaagat cgaggggttc tacatgcgca tggcgctgaa 12120
ggtgcttacc ttgagcgacg acctgggcgt ttatcgcaac gagcgcatcc acaaggccgt 12180
gagcgtgagc cggcggcgcg agctcagcga ccgcgagctg atgcacagcc tgcaaagggc 12240
cctggctggc acgggcagcg gcgatagaga ggccgagtcc tactttgacg cgggcgctga 12300
cctgcgctgg gccccaagcc gacgcgccct ggaggcagct ggggccggac ctgggctggc 12360
ggtggcaccc gcgcgcgctg gcaacgtcgg cggcgtggag gaatatgacg aggacgatga 12420
gtacgagcca gaggacggcg agtactaagc ggtgatgttt ctgatcagat gatgcaagac 12480
gcaacggacc cggcggtgcg ggcggcgctg cagagccagc cgtccggcct taactccacg 12540
gacgactggc gccaggtcat ggaccgcatc atgtcgctga ctgcgcgcaa tcctgacgcg 12600
ttccggcagc agccgcaggc caaccggctc tccgcaattc tggaagcggt ggtcccggcg 12660
cgcgcaaacc ccacgcacga gaaggtgctg gcgatcgtaa acgcgctggc cgaaaacagg 12720
gccatccggc ccgacgaggc cggcctggtc tacgacgcgc tgcttcagcg cgtggctcgt 12780
tacaacagcg gcaacgtgca gaccaacctg gaccggctgg tgggggatgt gcgcgaggcc 12840
gtggcgcagc gtgagcgcgc gcagcagcag ggcaacctgg gctccatggt tgcactaaac 12900
gccttcctga gtacacagcc cgccaacgtg ccgcggggac aggaggacta caccaacttt 12960
gtgagcgcac tgcggctaat ggtgactgag acaccgcaaa gtgaggtgta ccagtctggg 13020
ccagactatt ttttccagac cagtagacaa ggcctgcaga ccgtaaacct gagccaggct 13080
ttcaaaaact tgcaggggct gtggggggtg cgggctccca caggcgaccg cgcgaccgtg 13140
tctagcttgc tgacgcccaa ctcgcgcctg ttgctgctgc taatagcgcc cttcacggac 13200
agtggcagcg tgtcccggga cacataccta ggtcacttgc tgacactgta ccgcgaggcc 13260
ataggtcagg cgcatgtgga cgagcatact ttccaggaga ttacaagtgt cagccgcgcg 13320
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cggcagaaga tcccctcgtt gcacagttta aacagcgagg aggagcgcat tttgcgctac 13440
gtgcagcaga gcgtgagcct taacctgatg cgcgacgggg taacgcccag cgtggcgctg 13500
gacatgaccg cgcgcaacat ggaaccgggc atgtatgcct caaaccggcc gtttatcaac 13560
cgcctaatgg actacttgca tcgcgcggcc gccgtgaacc ccgagtattt caccaatgcc 13620
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gagggtaacg atggattcct ctgggacgac atagacgaca gcgtgttttc cccgcaaccg 13740
cagaccctgc tagagttgca acagcgcgag caggcagagg cggcgctgcg aaaggaaagc 13800
ttccgcaggc caagcagctt gtccgatcta ggcgctgcgg ccccgcggtc agatgctagt 13860
agcccatttc caagcttgat agggtctctt accagcactc gcaccacccg cccgcgcctg 13920
ctgggcgagg aggagtacct aaacaactcg ctgctgcagc cgcagcgcga aaaaaacctg 13980
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ttttaaaaaa aaaaaagcat gatgcaaaat aaaaaactca ccaaggccat ggcaccgagc 14280
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cgaggtattc agctcaacga cgagtcggtg agctcctcgc ttggtctccg tccggacggg 27840
acatttcaga tcggcggcgc cggccgtcct tcattcacgc ctcgtcaggc aatcctaact 27900
ctgcagacct cgtcctctga gccgcgctct ggaggcattg gaactctgca atttattgag 27960
gagtttgtgc catcggtcta ctttaacccc ttctcgggac ctcccggcca ctatccggat 28020
caatttattc ctaactttga cgcggtaaag gactcggcgg acggctacga ctgaatgtta 28080
agtggagagg cagagcaact gcgcctgaaa cacctggtcc actgtcgccg ccacaagtgc 28140
tttgcccgcg actccggtga gttttgctac tttgaattgc ccgaggatca tatcgagggc 28200
ccggcgcacg gcgtccggct taccgcccag ggagagcttg cccgtagcct gattcgggag 28260
tttacccagc gccccctgct agttgagcgg gacaggggac cctgtgttct cactgtgatt 28320
tgcaactgtc ctaaccttgg attacatcaa gatctttgtt gccatctctg tgctgagtat 28380
aataaataca gaaattaaaa tatactgggg ctcctatcgc catcctgtaa acgccaccgt 28440
cttcacccgc ccaagcaaac caaggcgaac cttacctggt acttttaaca tctctccctc 28500
tgtgatttac aacagtttca acccagacgg agtgagtcta cgagagaacc tctccgagct 28560
cagctactcc atcagaaaaa acaccaccct ccttacctgc cgggaacgta cgagtgcgtc 28620
accggccgct gcaccacacc taccgcctga ccgtaaacca gactttttcc ggacagacct 28680
caataactct gtttaccaga acaggaggtg agcttagaaa acccttaggg tattaggcca 28740
aaggcgcagc tactgtgggg tttatgaaca attcaagcaa ctctacgggc tattctaatt 28800
caggtttctc tagaatcggg gttggggtta ttctctgtct tgtgattctc tttattctta 28860
tactaacgct tctctgccta aggctcgccg cctgctgtgt gcacatttgc atttattgtc 28920
agctttttaa acgctggggt cgccacccaa gatgattagg tacataatcc taggtttact 28980
cacccttgcg tcagcccacg gtaccaccca aaaggtggat tttaaggagc cagcctgtaa 29040
tgttacattc gcagctgaag ctaatgagtg caccactctt ataaaatgca ccacagaaca 29100
tgaaaagctg cttattcgcc acaaaaacaa aattggcaag tatgctgttt atgctatttg 29160
gcagccaggt gacactacag agtataatgt tacagttttc cagggtaaaa gtcataaaac 29220
ttttatgtat acttttccat tttatgaaat gtgcgacatt accatgtaca tgagcaaaca 29280
gtataagttg tggcccccac aaaattgtgt ggaaaacact ggcactttct gctgcactgc 29340
tatgctaatt acagtgctcg ctttggtctg taccctactc tatattaaat acaaaagcag 29400
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ccactaactg ctttactcgc tgcttgcaaa acaaattcaa aaagttagca ttataattag 29520
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ctatgtggga tatgctccag cgctacaacc ttgaagtcag gcttcctgga tgtcagcatc 29640
tgactttggc cagcacctgt cccgcggatt tgttccagtc caactacagc gacccaccct 29700
aacagagatg accaacacaa ccaacgcggc cgccgctacc ggacttacat ctaccacaaa 29760
tacaccccaa gtttctgcct ttgtcaataa ctgggataac ttgggcatgt ggtggttctc 29820
catagcgctt atgtttgtat gccttattat tatgtggctc atctgctgcc taaagcgcaa 29880
acgcgcccga ccacccatct atagtcccat cattgtgcta cacccaaaca atgatggaat 29940
ccatagattg gacggactga aacacatgtt cttttctctt acagtatgat taaatgagac 30000
atgattcctc gagtttttat attactgacc cttgttgcgc ttttttgtgc gtgctccaca 30060
ttggctgcgg tttctcacat cgaagtagac tgcattccag ccttcacagt ctatttgctt 30120
tacggatttg tcaccctcac gctcatctgc agcctcatca ctgtggtcat cgcctttatc 30180
cagtgcattg actgggtctg tgtgcgcttt gcatatctca gacaccatcc ccagtacagg 30240
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tgctgattat ttgcacccta tctgcgtttt gttccccgac ctccaagcct caaagacata 30360
tatcatgcag attcactcgt atatggaata ttccaagttg ctacaatgaa aaaagcgatc 30420
tttccgaagc ctggttatat gcaatcatct ctgttatggt gttctgcagt accatcttag 30480
ccctagctat atatccctac cttgacattg gctggaaacg aatagatgcc atgaaccacc 30540
caactttccc cgcgcccgct atgcttccac tgcaacaagt tgttgccggc ggctttgtcc 30600
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caggaggaga tgactgacac cctagatcta gaaatggacg gaattattac agagcagcgc 30720
ctgctagaaa gacgcagggc agcggccgag caacagcgca tgaatcaaga gctccaagac 30780
atggttaact tgcaccagtg caaaaggggt atcttttgtc tggtaaagca ggccaaagtc 30840
acctacgaca gtaataccac cggacaccgc cttagctaca agttgccaac caagcgtcag 30900
aaattggtgg tcatggtggg agaaaagccc attaccataa ctcagcactc ggtagaaacc 30960
gaaggctgca ttcactcacc ttgtcaagga cctgaggatc tctgcaccct tattaagacc 31020
ctgtgcggtc tcaaagatct tattcccttt aactaataaa aaaaaataat aaagcatcac 31080
ttacttaaaa tcagttagca aatttctgtc cagtttattc agcagcacct ccttgccctc 31140
ctcccagctc tggtattgca gcttcctcct ggctgcaaac tttctccaca atctaaatgg 31200
aatgtcagtt tcctcctgtt cctgtccatc cgcacccact atcttcatgt tgttgcagat 31260
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cggtcctcca actgtgcctt ttcttactcc tccctttgta tcccccaatg ggtttcaaga 31380
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cgtagcaact ggtccaggtg tgactattaa taatacttcc ttgcaaacta aagttactgg 31980
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tgattctcaa aacagacgcc ttatacttga tgttagttat ccgtttgatg ctcaaaacca 32100
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cactttggtc ttaacaaaat gtggcagtca aatacttgct acagtttcag ttttggctgt 32580
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caactacatt aatgaaatat ttgccacatc ctcttacact ttttcataca ttgcccaaga 33000
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tcttaggtgt tatattccac acggtttcct gtcgagccaa acgctcatca gtgatattaa 33300
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cttttggcat gttgtaattc accacctccc ggtaccatat aaacctctga ttaaacatgg 33840
cgccatccac caccatccta aaccagctgg ccaaaacctg cccgccggct atacactgca 33900
gggaaccggg actggaacaa tgacagtgga gagcccagga ctcgtaacca tggatcatca 33960
tgctcgtcat gatatcaatg ttggcacaac acaggcacac gtgcatacac ttcctcagga 34020
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tacattcggg cagcagcgga tgatcctcca gtatggtagc gcgggtttct gtctcaaaag 34200
gaggtagacg atccctactg tacggagtgc gccgagacaa ccgagatcgt gttggtcgta 34260
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cctacacatt cgttctgcga gtcacacacg ggaggagcgg gaagagctgg aagaaccatg 34560
tttttttttt tattccaaaa gattatccaa aacctcaaaa tgaagatcta ttaagtgaac 34620
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gctaaaccct tcagggtgaa tctcctctat aaacattcca gcaccttcaa ccatgcccaa 34800
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tacatacccg caggcgtaga gacaacatta cagcccccat aggaggtata acaaaattaa 35640
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cccgctccag aacaacatac agcgcttcca cagcggcagc cataacagtc agccttacca 35760
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agtgtaaaaa agggccaagt gcagagcgag tatatatagg actaaaaaat gacgtaacgg 35880
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caaaaaaccc acaacttcct caaatcgtca cttccgtttt cccacgttac gtcacttccc 36000
attttaagaa aactacaatt cccaacacat actagttact ccgccctaaa acctacgtca 36060
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gcttcaatcc aaaataaggt atattattga tgatgt 36156
<210> 3
<211> 36090
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOVIR15K-TD
<400> 3
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240
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agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360
gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgtac 420
gtcggcggct cgtggctctt tcgcggcaaa aaggatttgg cgcgtaaaag tggttcgagt 480
acgtcggcgg ctcgtggctc tttcgcggca aaaaggattt ggcgcgtaaa agtggttcga 540
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caaagttggc gttttattat tatagtcagc tgacgtgtag tgtatttata cccggtgagt 660
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caccgggact gaaaatgaga catattatct gccacggagg tgttattacc gaagaaatgg 780
ccgccagtct tttggaccag ctgatcgaag aggtactggc tgataatctt ccacctccta 840
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ttttttaatt tttacagttt tgtggtttaa agaattttgt attgtgattt ttttaaaagg 1380
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ccgtcctaaa atggcgcctg ctatcctgag acgcccgaca tcacctgtgt ccagagaatg 1500
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tgaatgagtt gatgtaagtt taataaaggg tgagataatg tttaacttgc atggcgtgtt 1800
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agtctgcaga attaaggagg attacaagtg ggaatttgaa gagcttttga aatcctgtgg 2040
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gcggcaggag cagagcccat ggaacccgag agccggcctg gaccctcggg aatgaatgtt 2400
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aaggataatt gcgctaatga gcttgatctg ctggcgcaga agtattccat agagcagctg 2640
accacttact ggctgcagcc aggggatgat tttgaggagg ctattagggt atatgcaaag 2700
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tctcgcaagg cctggccagt gtttgagcat aacatactga cccgctgttc cttgcatttg 3360
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ggtaaacata ttaggaacca gcctgtgatg ctggatgtga ccgaggagct gaggcccgat 3600
cacttggtgc tggcctgcac ccgcgctgag tttggctcta gcgatgaaga tacagattga 3660
ggtactgaaa tgtgtgggcg tggcttaagg gtgggaaaga atatataagg tgggggtctt 3720
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aggtagcacc actgcagagc ttcatgctgc ggggtggtgt tgtagatgat ccagtcgtag 4440
caggagcgct gggcgtggtg cctaaaaatg tctttcagta gcaagctgat tgccaggggc 4500
aggcccttgg tgtaagtgtt tacaaagcgg ttaagctggg atgggtgcat acgtggggat 4560
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tggccagggt gcgcttgagg ctggtcctgc tggtgctgaa gcgctgccgg tcttcgccct 5580
gcgcgtcggc caggtagcat ttgaccatgg tgtcatagtc cagcccctcc gcggcgtggc 5640
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ccaggtttcc cccatgcttt ttgatgcgtt tcttacctct ggtttccatg agccggtgtc 5880
cacgctcggt gacgaaaagg ctgtccgtgt ccccgtatac agacttgaga ggcctgtcct 5940
cgagcggtgt tccgcggtcc tcctcgtata gaaactcgga ccactctgag acaaaggctc 6000
gcgtccaggc cagcacgaag gaggctaagt gggaggggta gcggtcgttg tccactaggg 6060
ggtccactcg ctccagggtg tgaagacaca tgtcgccctc ttcggcatca aggaaggtga 6120
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gtgagtactc cctctgaaaa gcgggcatga cttctgcgct aagattgtca gtttccaaaa 6300
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tctggtcaga aaagacaatc tttttgttgt caagcttggt ggcaaacgac ccgtagaggg 6420
cgttggacag caacttggcg atggagcgca gggtttggtt tttgtcgcga tcggcgcgct 6480
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ggtcaacgct ggtggctacc tctccgcgta ggcgctcgtt ggtccagcag aggcggccgc 6660
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agtctagcgc ctgctgccat gcgcgggcgg caagcgcgcg ctcgtatggg ttgagtgggg 6840
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cgcgcacgta atcgtatagt tcgtgcgagg gagcgaggag gtcgggaccg aggttgctac 7020
gggcgggctg ctctgctcgg aagactatct gcctgaagat ggcatgtgag ttggatgata 7080
tggttggacg ctggaagacg ttgaagctgg cgtctgtgag acctaccgcg tcacgcacga 7140
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cgcagtagtc cagggtttcc ttgatgatgt catacttatc ctgtcccttt tttttccaca 7260
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atcccttttc tacgggtagc gcgtatgcct gcgcggcctt ccggagcgag gtgtgggtga 7440
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tggaaggcaa ttttttaagt tcctcgtagg tgagctcttc aggggagctg agcccgtgct 7800
ctgaaagggc ccagtctgca agatgagggt tggaagcgac gaatgagctc cacaggtcac 7860
gggccattag catttgcagg tggtcgcgaa aggtcctaaa ctggcgacct atggccattt 7920
tttctggggt gatgcagtag aaggtaagcg ggtcttgttc ccagcggtcc catccaaggt 7980
tcgcggctag gtctcgcgcg gcagtcacta gaggctcatc tccgccgaac ttcatgacca 8040
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ggcctgctga atgcgcaggc ggtcggccat gccccaggct tcgttttgac atcggcgcag 10080
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cgcaatggcc aaatccgccg ccgaggtcga tggccgcggg ctgggtgtgc gcggcaccag 24060
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<213> 人工序列
<220>
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ggtggtcccg ctgtgcccca ttaaaccagt tgccgtgaga gttggtgggc gtcgccaggc 1620
tgtggaatgt atcgaggact tgcttaacga gcctgggcaa cctttggact tgagctgtaa 1680
acgccccagg ccataaggtg taaacctgtg attgcgtgtg tggttaacgc ctttgtttgc 1740
tgaatgagtt gatgtaagtt taataaaggg tgagataatg tttaacttgc atggcgtgtt 1800
aaatggggcg gggcttaaag ggtatataat gcgccgtggg ctaatcttgg ttacatctga 1860
cctcatggag gcttgggagt gtttggaaga tttttctgct gtgcgtaact tgctggaaca 1920
gagctctaac agtacctctt ggttttggag gtttctgtgg ggctcatccc aggcaaagtt 1980
agtctgcaga attaaggagg attacaagtg ggaatttgaa gagcttttga aatcctgtgg 2040
tgagctgttt gattctttga atctgggtca ccaggcgctt ttccaagaga aggtcatcaa 2100
gactttggat ttttccacac cggggcgcgc tgcggctgct gttgcttttt tgagttttat 2160
aaaggataaa tggagcgaag aaacccatct gagcgggggg tacctgctgg attttctggc 2220
catgcatctg tggagagcgg ttgtgagaca caagaatcgc ctgctactgt tgtcttccgt 2280
ccgcccggcg ataataccga cggaggagca gcagcagcag caggaggaag ccaggcggcg 2340
gcggcaggag cagagcccat ggaacccgag agccggcctg gaccctcggg aatgaatgtt 2400
gtacaggtgg ctgaactgta tccagaactg agacgcattt tgacaattac agaggatggg 2460
caggggctaa agggggtaaa gagggagcgg ggggcttgtg aggctacaga ggaggctagg 2520
aatctagctt ttagcttaat gaccagacac cgtcctgagt gtattacttt tcaacagatc 2580
aaggataatt gcgctaatga gcttgatctg ctggcgcaga agtattccat agagcagctg 2640
accacttact ggctgcagcc aggggatgat tttgaggagg ctattagggt atatgcaaag 2700
gtggcactta ggccagattg caagtacaag atcagcaaac ttgtaaatat caggaattgt 2760
tgctacattt ctgggaacgg ggccgaggtg gagatagata cggaggatag ggtggccttt 2820
agatgtagca tgataaatat gtggccgggg gtgcttggca tggacggggt ggttattatg 2880
aatgtaaggt ttactggccc caattttagc ggtacggttt tcctggccaa taccaacctt 2940
atcctacacg gtgtaagctt ctatgggttt aacaatacct gtgtggaagc ctggaccgat 3000
gtaagggttc ggggctgtgc cttttactgc tgctggaagg gggtggtgtg tcgccccaaa 3060
agcagggctt caattaagaa atgcctcttt gaaaggtgta ccttgggtat cctgtctgag 3120
ggtaactcca gggtgcgcca caatgtggcc tccgactgtg gttgcttcat gctagtgaaa 3180
agcgtggctg tgattaagca taacatggta tgtggcaact gcgaggacag ggcctctcag 3240
atgctgacct gctcggacgg caactgtcac ctgctgaaga ccattcacgt agccagccac 3300
tctcgcaagg cctggccagt gtttgagcat aacatactga cccgctgttc cttgcatttg 3360
ggtaacagga ggggggtgtt cctaccttac caatgcaatt tgagtcacac taagatattg 3420
cttgagcccg agagcatgtc caaggtgaac ctgaacgggg tgtttgacat gaccatgaag 3480
atctggaagg tgctgaggta cgatgagacc cgcaccaggt gcagaccctg cgagtgtggc 3540
ggtaaacata ttaggaacca gcctgtgatg ctggatgtga ccgaggagct gaggcccgat 3600
cacttggtgc tggcctgcac ccgcgctgag tttggctcta gcgatgaaga tacagattga 3660
ggtactgaaa tgtgtgggcg tggcttaagg gtgggaaaga atatataagg tgggggtctt 3720
atgtagtttt gtatctgttt tgcagcagcc gccgccgcca tgagcaccaa ctcgtttgat 3780
ggaagcattg tgagctcata tttgacaacg cgcatgcccc catgggccgg ggtgcgtcag 3840
aatgtgatgg gctccagcat tgatggtcgc cccgtcctgc ccgcaaactc tactaccttg 3900
acctacgaga ccgtgtctgg aacgccgttg gagactgcag cctccgccgc cgcttcagcc 3960
gctgcagcca ccgcccgcgg gattgtgact gactttgctt tcctgagccc gcttgcaagc 4020
agtgcagctt cccgttcatc cgcccgcgat gacaagttga cggctctttt ggcacaattg 4080
gattctttga cccgggaact taatgtcgtt tctcagcagc tgttggatct gcgccagcag 4140
gtttctgccc tgaaggcttc ctcccctccc aatgcggttt aaaacataaa taaaaaacca 4200
gactctgttt ggatttggat caagcaagtg tcttgctgtc tttatttagg ggttttgcgc 4260
gcgcggtagg cccgggacca gcggtctcgg tcgttgaggg tcctgtgtat tttttccagg 4320
acgtggtaaa ggtgactctg gatgttcaga tacatgggca taagcccgtc tctggggtgg 4380
aggtagcacc actgcagagc ttcatgctgc ggggtggtgt tgtagatgat ccagtcgtag 4440
caggagcgct gggcgtggtg cctaaaaatg tctttcagta gcaagctgat tgccaggggc 4500
aggcccttgg tgtaagtgtt tacaaagcgg ttaagctggg atgggtgcat acgtggggat 4560
atgagatgca tcttggactg tatttttagg ttggctatgt tcccagccat atccctccgg 4620
ggattcatgt tgtgcagaac caccagcaca gtgtatccgg tgcacttggg aaatttgtca 4680
tgtagcttag aaggaaatgc gtggaagaac ttggagacgc ccttgtgacc tccaagattt 4740
tccatgcatt cgtccataat gatggcaatg ggcccacggg cggcggcctg ggcgaagata 4800
tttctgggat cactaacgtc atagttgtgt tccaggatga gatcgtcata ggccattttt 4860
acaaagcgcg ggcggagggt gccagactgc ggtataatgg ttccatccgg cccaggggcg 4920
tagttaccct cacagatttg catttcccac gctttgagtt cagatggggg gatcatgtct 4980
acctgcgggg cgatgaagaa aacggtttcc ggggtagggg agatcagctg ggaagaaagc 5040
aggttcctga gcagctgcga cttaccgcag ccggtgggcc cgtaaatcac acctattacc 5100
gggtgcaact ggtagttaag agagctgcag ctgccgtcat ccctgagcag gggggccact 5160
tcgttaagca tgtccctgac tcgcatgttt tccctgacca aatccgccag aaggcgctcg 5220
ccgcccagcg atagcagttc ttgcaaggaa gcaaagtttt tcaacggttt gagaccgtcc 5280
gccgtaggca tgcttttgag cgtttgacca agcagttcca ggcggtccca cagctcggtc 5340
acctgctcta cggcatctcg atccagcata tctcctcgtt tcgcgggttg gggcggcttt 5400
cgctgtacgg cagtagtcgg tgctcgtcca gacgggccag ggtcatgtct ttccacgggc 5460
gcagggtcct cgtcagcgta gtctgggtca cggtgaaggg gtgcgctccg ggctgcgcgc 5520
tggccagggt gcgcttgagg ctggtcctgc tggtgctgaa gcgctgccgg tcttcgccct 5580
gcgcgtcggc caggtagcat ttgaccatgg tgtcatagtc cagcccctcc gcggcgtggc 5640
ccttggcgcg cagcttgccc ttggaggagg cgccgcacga ggggcagtgc agacttttga 5700
gggcgtagag cttgggcgcg agaaataccg attccgggga gtaggcatcc gcgccgcagg 5760
ccccgcagac ggtctcgcat tccacgagcc aggtgagctc tggccgttcg gggtcaaaaa 5820
ccaggtttcc cccatgcttt ttgatgcgtt tcttacctct ggtttccatg agccggtgtc 5880
cacgctcggt gacgaaaagg ctgtccgtgt ccccgtatac agacttgaga ggcctgtcct 5940
cgagcggtgt tccgcggtcc tcctcgtata gaaactcgga ccactctgag acaaaggctc 6000
gcgtccaggc cagcacgaag gaggctaagt gggaggggta gcggtcgttg tccactaggg 6060
ggtccactcg ctccagggtg tgaagacaca tgtcgccctc ttcggcatca aggaaggtga 6120
ttggtttgta ggtgtaggcc acgtgaccgg gtgttcctga aggggggcta taaaaggggg 6180
tgggggcgcg ttcgtcctca ctctcttccg catcgctgtc tgcgagggcc agctgttggg 6240
gtgagtactc cctctgaaaa gcgggcatga cttctgcgct aagattgtca gtttccaaaa 6300
acgaggagga tttgatattc acctggcccg cggtgatgcc tttgagggtg gccgcatcca 6360
tctggtcaga aaagacaatc tttttgttgt caagcttggt ggcaaacgac ccgtagaggg 6420
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ccttggccgc gatgtttagc tgcacgtatt cgcgcgcaac gcaccgccat tcgggaaaga 6540
cggtggtgcg ctcgtcgggc accaggtgca cgcgccaacc gcggttgtgc agggtgacaa 6600
ggtcaacgct ggtggctacc tctccgcgta ggcgctcgtt ggtccagcag aggcggccgc 6660
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ccacggtaaa gaccccgggc agcaggcgcg cgtcgaagta gtctatcttg catccttgca 6780
agtctagcgc ctgctgccat gcgcgggcgg caagcgcgcg ctcgtatggg ttgagtgggg 6840
gaccccatgg catggggtgg gtgagcgcgg aggcgtacat gccgcaaatg tcgtaaacgt 6900
agaggggctc tctgagtatt ccaagatatg tagggtagca tcttccaccg cggatgctgg 6960
cgcgcacgta atcgtatagt tcgtgcgagg gagcgaggag gtcgggaccg aggttgctac 7020
gggcgggctg ctctgctcgg aagactatct gcctgaagat ggcatgtgag ttggatgata 7080
tggttggacg ctggaagacg ttgaagctgg cgtctgtgag acctaccgcg tcacgcacga 7140
aggaggcgta ggagtcgcgc agcttgttga ccagctcggc ggtgacctgc acgtctaggg 7200
cgcagtagtc cagggtttcc ttgatgatgt catacttatc ctgtcccttt tttttccaca 7260
gctcgcggtt gaggacaaac tcttcgcggt ctttccagta ctcttggatc ggaaacccgt 7320
cggcctccga acggtaagag cctagcatgt agaactggtt gacggcctgg taggcgcagc 7380
atcccttttc tacgggtagc gcgtatgcct gcgcggcctt ccggagcgag gtgtgggtga 7440
gcgcaaaggt gtccctgacc atgactttga ggtactggta tttgaagtca gtgtcgtcgc 7500
atccgccctg ctcccagagc aaaaagtccg tgcgcttttt ggaacgcgga tttggcaggg 7560
cgaaggtgac atcgttgaag agtatctttc ccgcgcgagg cataaagttg cgtgtgatgc 7620
ggaagggtcc cggcacctcg gaacggttgt taattacctg ggcggcgagc acgatctcgt 7680
caaagccgtt gatgttgtgg cccacaatgt aaagttccaa gaagcgcggg atgcccttga 7740
tggaaggcaa ttttttaagt tcctcgtagg tgagctcttc aggggagctg agcccgtgct 7800
ctgaaagggc ccagtctgca agatgagggt tggaagcgac gaatgagctc cacaggtcac 7860
gggccattag catttgcagg tggtcgcgaa aggtcctaaa ctggcgacct atggccattt 7920
tttctggggt gatgcagtag aaggtaagcg ggtcttgttc ccagcggtcc catccaaggt 7980
tcgcggctag gtctcgcgcg gcagtcacta gaggctcatc tccgccgaac ttcatgacca 8040
gcatgaaggg cacgagctgc ttcccaaagg cccccatcca agtataggtc tctacatcgt 8100
aggtgacaaa gagacgctcg gtgcgaggat gcgagccgat cgggaagaac tggatctccc 8160
gccaccaatt ggaggagtgg ctattgatgt ggtgaaagta gaagtccctg cgacgggccg 8220
aacactcgtg ctggcttttg taaaaacgtg cgcagtactg gcagcggtgc acgggctgta 8280
catcctgcac gaggttgacc tgacgaccgc gcacaaggaa gcagagtggg aatttgagcc 8340
cctcgcctgg cgggtttggc tggtggtctt ctacttcggc tgcttgtcct tgaccgtctg 8400
gctgctcgag gggagttacg gtggatcgga ccaccacgcc gcgcgagccc aaagtccaga 8460
tgtccgcgcg cggcggtcgg agcttgatga caacatcgcg cagatgggag ctgtccatgg 8520
tctggagctc ccgcggcgtc aggtcaggcg ggagctcctg caggtttacc tcgcatagac 8580
gggtcagggc gcgggctaga tccaggtgat acctaatttc caggggctgg ttggtggcgg 8640
cgtcgatggc ttgcaagagg ccgcatcccc gcggcgcgac tacggtaccg cgcggcgggc 8700
ggtgggccgc gggggtgtcc ttggatgatg catctaaaag cggtgacgcg ggcgagcccc 8760
cggaggtagg gggggctccg gacccgccgg gagagggggc aggggcacgt cggcgccgcg 8820
cgcgggcagg agctggtgct gcgcgcgtag gttgctggcg aacgcgacga cgcggcggtt 8880
gatctcctga atctggcgcc tctgcgtgaa gacgacgggc ccggtgagct tgagcctgaa 8940
agagagttcg acagaatcaa tttcggtgtc gttgacggcg gcctggcgca aaatctcctg 9000
cacgtctcct gagttgtctt gataggcgat ctcggccatg aactgctcga tctcttcctc 9060
ctggagatct ccgcgtccgg ctcgctccac ggtggcggcg aggtcgttgg aaatgcgggc 9120
catgagctgc gagaaggcgt tgaggcctcc ctcgttccag acgcggctgt agaccacgcc 9180
cccttcggca tcgcgggcgc gcatgaccac ctgcgcgaga ttgagctcca cgtgccgggc 9240
gaagacggcg tagtttcgca ggcgctgaaa gaggtagttg agggtggtgg cggtgtgttc 9300
tgccacgaag aagtacataa cccagcgtcg caacgtggat tcgttgatat cccccaaggc 9360
ctcaaggcgc tccatggcct cgtagaagtc cacggcgaag ttgaaaaact gggagttgcg 9420
cgccgacacg gttaactcct cctccagaag acggatgagc tcggcgacag tgtcgcgcac 9480
ctcgcgctca aaggctacag gggcctcttc ttcttcttca atctcctctt ccataagggc 9540
ctccccttct tcttcttctg gcggcggtgg gggagggggg acacggcggc gacgacggcg 9600
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gttatgggtt ggcggggggc tgccatgcgg cagggatacg gcgctaacga tgcatctcaa 9780
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attaaagtag gcggtcttga gacggcggat ggtcgacaga agcaccatgt ccttgggtcc 10020
ggcctgctga atgcgcaggc ggtcggccat gccccaggct tcgttttgac atcggcgcag 10080
gtctttgtag tagtcttgca tgagcctttc taccggcact tcttcttctc cttcctcttg 10140
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catgtccaca aagcggtggt atgcgcccgt gttgatggtg taagtgcagt tggccataac 10380
ggaccagtta acggtctggt gacccggctg cgagagctcg gtgtacctga gacgcgagta 10440
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ctagaccgtg caaaaggaga gcctgtaagc gggcactctt ccgtggtctg gtggataaat 10800
tcgcaagggt atcatggcgg acgaccgggg ttcgagcccc gtatccggcc gtccgccgtg 10860
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ccgcgcgcag cgtaagcggt taggctggaa agcgaaagca ttaagtggct cgctccctgt 11040
agccggaggg ttattttcca agggttgagt cgcgggaccc ccggttcgag tctcggaccg 11100
gccggactgc ggcgaacggg ggtttgcctc cccgtcatgc aagaccccgc ttgcaaattc 11160
ctccggaaac agggacgagc cccttttttg cttttcccag atgcatccgg tgctgcggca 11220
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ggtgcttacc ttgagcgacg acctgggcgt ttatcgcaac gagcgcatcc acaaggccgt 12180
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ataggtcagg cgcatgtgga cgagcatact ttccaggaga ttacaagtgt cagccgcgcg 13320
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gacatgaccg cgcgcaacat ggaaccgggc atgtatgcct caaaccggcc gtttatcaac 13560
cgcctaatgg actacttgca tcgcgcggcc gccgtgaacc ccgagtattt caccaatgcc 13620
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cacgaccgtc agcggggtct ggtgtgggag gacgatgact cggcagacga cagcagcgtc 14160
ctggatttgg gagggagtgg caacccgttt gcgcaccttc gccccaggct ggggagaatg 14220
ttttaaaaaa aaaaaagcat gatgcaaaat aaaaaactca ccaaggccat ggcaccgagc 14280
gttggttttc ttgtattccc cttagtatgc ggcgcgcggc gatgtatgag gaaggtcctc 14340
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tcgatgctcc cctggacccg ccgtttgtgc ctccgcggta cctgcggcct accgggggga 14460
gaaacagcat ccgttactct gagttggcac ccctattcga caccacccgt gtgtacctgg 14520
tggacaacaa gtcaacggat gtggcatccc tgaactacca gaacgaccac agcaactttc 14580
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caaatgtgaa cgagttcatg tttaccaata agtttaaggc gcgggtgatg gtgtcgcgct 14760
tgcctactaa ggacaatcag gtggagctga aatacgagtg ggtggagttc acgctgcccg 14820
agggcaacta ctccgagacc atgaccatag accttatgaa caacgcgatc gtggagcact 14880
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cccgcaactt cagactgggg tttgaccccg tcactggtct tgtcatgcct ggggtatata 15000
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aggacatgaa cgatcatgcc attcgcggcg acacctttgc cacacgggct gaggagaagc 15360
gcgctgaggc cgaagcagcg gccgaagctg ccgcccccgc tgcgcaaccc gaggtcgaga 15420
agcctcagaa gaaaccggtg atcaaacccc tgacagagga cagcaagaaa cgcagttaca 15480
acctaataag caatgacagc accttcaccc agtaccgcag ctggtacctt gcatacaact 15540
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tgtatgatga ggtgtacggc gacgaggacc tgcttgagca ggccaacgag cgcctcgggg 17040
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ttaaacgctg gggtcgccac ccaagatgat taggtacata atcctaggtt tactcaccct 28920
tgcgtcagcc cacggtacca cccaaaaggt ggattttaag gagccagcct gtaatgttac 28980
attcgcagct gaagctaatg agtgcaccac tcttataaaa tgcaccacag aacatgaaaa 29040
gctgcttatt cgccacaaaa acaaaattgg caagtatgct gtttatgcta tttggcagcc 29100
aggtgacact acagagtata atgttacagt tttccagggt aaaagtcata aaacttttat 29160
gtatactttt ccattttatg aaatgtgcga cattaccatg tacatgagca aacagtataa 29220
gttgtggccc ccacaaaatt gtgtggaaaa cactggcact ttctgctgca ctgctatgct 29280
aattacagtg ctcgctttgg tctgtaccct actctatatt aaatacaaaa gcagacgcag 29340
ctttattgag gaaaagaaaa tgccttaatt tactaagtta caaagctaat gtcaccacta 29400
actgctttac tcgctgcttg caaaacaaat tcaaaaagtt agcattataa ttagaatagg 29460
atttaaaccc cccggtcatt tcctgctcaa taccattccc ctgaacaatt gactctatgt 29520
gggatatgct ccagcgctac aaccttgaag tcaggcttcc tggatgtcag catctgactt 29580
tggccagcac ctgtcccgcg gatttgttcc agtccaacta cagcgaccca ccctaacaga 29640
gatgaccaac acaaccaacg cggccgccgc taccggactt acatctacca caaatacacc 29700
ccaagtttct gcctttgtca ataactggga taacttgggc atgtggtggt tctccatagc 29760
gcttatgttt gtatgcctta ttattatgtg gctcatctgc tgcctaaagc gcaaacgcgc 29820
ccgaccaccc atctatagtc ccatcattgt gctacaccca aacaatgatg gaatccatag 29880
attggacgga ctgaaacaca tgttcttttc tcttacagta tgattaaatg agacatgatt 29940
cctcgagttt ttatattact gacccttgtt gcgctttttt gtgcgtgctc cacattggct 30000
gcggtttctc acatcgaagt agactgcatt ccagccttca cagtctattt gctttacgga 30060
tttgtcaccc tcacgctcat ctgcagcctc atcactgtgg tcatcgcctt tatccagtgc 30120
attgactggg tctgtgtgcg ctttgcatat ctcagacacc atccccagta cagggacagg 30180
actatagctg agcttcttag aattctttaa ttatgaaatt tactgtgact tttctgctga 30240
ttatttgcac cctatctgcg ttttgttccc cgacctccaa gcctcaaaga catatatcat 30300
gcagattcac tcgtatatgg aatattccaa gttgctacaa tgaaaaaagc gatctttccg 30360
aagcctggtt atatgcaatc atctctgtta tggtgttctg cagtaccatc ttagccctag 30420
ctatatatcc ctaccttgac attggctgga aacgaataga tgccatgaac cacccaactt 30480
tccccgcgcc cgctatgctt ccactgcaac aagttgttgc cggcggcttt gtcccagcca 30540
atcagcctcg ccccacttct cccaccccca ctgaaatcag ctactttaat ctaacaggag 30600
gagatgactg acaccctaga tctagaaatg gacggaatta ttacagagca gcgcctgcta 30660
gaaagacgca gggcagcggc cgagcaacag cgcatgaatc aagagctcca agacatggtt 30720
aacttgcacc agtgcaaaag gggtatcttt tgtctggtaa agcaggccaa agtcacctac 30780
gacagtaata ccaccggaca ccgccttagc tacaagttgc caaccaagcg tcagaaattg 30840
gtggtcatgg tgggagaaaa gcccattacc ataactcagc actcggtaga aaccgaaggc 30900
tgcattcact caccttgtca aggacctgag gatctctgca cccttattaa gaccctgtgc 30960
ggtctcaaag atcttattcc ctttaactaa taaaaaaaaa taataaagca tcacttactt 31020
aaaatcagtt agcaaatttc tgtccagttt attcagcagc acctccttgc cctcctccca 31080
gctctggtat tgcagcttcc tcctggctgc aaactttctc cacaatctaa atggaatgtc 31140
agtttcctcc tgttcctgtc catccgcacc cactatcttc atgttgttgc agatgaagcg 31200
cgcaagaccg tctgaagata ccttcaaccc cgtgtatcca tatgacacgg aaaccggtcc 31260
tccaactgtg ccttttctta ctcctccctt tgtatccccc aatgggtttc aagagagtcc 31320
ccctggggta ctctctttgc gcctatccga acctctagtt acctccaatg gcatgcttgc 31380
gctcaaaatg ggcaacggcc tctctctgga cgaggccggc aaccttacct cccaaaatgt 31440
aaccactgtg agcccacctc tccgaggaga caagtcaaac ataaacctgg aaatatctgc 31500
acccctcaca gttacctcag aagccctaac tgtggctgcc gccgcacctc taatggtcgc 31560
gggcaacaca ctcaccatgc aatcacaggc cccgctaacc gtgcacgact ccaaacttag 31620
cattgccacc caaggacccc tcacagtgtc agaaggaaag ctagccctgc aaacatcagg 31680
ccccctcacc accaccgata gcagtaccct tactatcact gcctcacccc ctctaactac 31740
tgccactggt agcttgggca ttgacttgaa agagcccatt tatacacaaa atggaaaact 31800
aggactaaag tacggggctc ctttgcatgt aacagacgac ctaaacactt tgaccgtagc 31860
aactggtcca ggtgtgacta ttaataatac ttccttgcaa actaaagtta ctggagcctt 31920
gggttttgat tcacaaggca atatgcaact taatgtagca ggaggactaa ggattgattc 31980
tcaaaacaga cgccttatac ttgatgttag ttatccgttt gatgctcaaa accaactaaa 32040
tctaagacta ggacagggcc ctctttttat aaactcagcc cacaacttgg atattaacta 32100
caacaaaggc ctttacttgt ttacagcttc aaacaattcc aaaaagcttg aggttaacct 32160
aagcactgcc aaggggttga tgtttgacgc tacagccata gccattaatg caggagatgg 32220
gcttgaattt ggttcaccta atgcaccaaa cacaaatccc ctcaaaacaa aaattggcca 32280
tggcctagaa tttgattcaa acaaggctat ggttcctaaa ctaggaactg gccttagttt 32340
tgacagcaca ggtgccatta cagtaggaaa caaaaataat gataagctaa ctttgtggac 32400
cacaccagct ccatctccta actgtagact aaatgcagag aaagatgcta aactcacttt 32460
ggtcttaaca aaatgtggca gtcaaatact tgctacagtt tcagttttgg ctgttaaagg 32520
cagtttggct ccaatatctg gaacagttca aagtgctcat cttattataa gatttgacga 32580
aaatggagtg ctactaaaca attccttcct ggacccagaa tattggaact ttagaaatgg 32640
agatcttact gaaggcacag cctatacaaa cgctgttgga tttatgccta acctatcagc 32700
ttatccaaaa tctcacggta aaactgccaa aagtaacatt gtcagtcaag tttacttaaa 32760
cggagacaaa actaaacctg taacactaac cattacacta aacggtacac aggaaacagg 32820
agacacaact ccaagtgcat actctatgtc attttcatgg gactggtctg gccacaacta 32880
cattaatgaa atatttgcca catcctctta cactttttca tacattgccc aagaataaag 32940
aatcgtttgt gttatgtttc aacgtgttta tttttcaatt gcagaaaatt tcaagtcatt 33000
tttcattcag tagtatagcc ccaccaccac atagcttata cagatcaccg taccttaatc 33060
aaactcacag aaccctagta ttcaacctgc cacctccctc ccaacacaca gagtacacag 33120
tcctttctcc ccggctggcc ttaaaaagca tcatatcatg ggtaacagac atattcttag 33180
gtgttatatt ccacacggtt tcctgtcgag ccaaacgctc atcagtgata ttaataaact 33240
ccccgggcag ctcacttaag ttcatgtcgc tgtccagctg ctgagccaca ggctgctgtc 33300
caacttgcgg ttgcttaacg ggcggcgaag gagaagtcca cgcctacatg ggggtagagt 33360
cataatcgtg catcaggata gggcggtggt gctgcagcag cgcgcgaata aactgctgcc 33420
gccgccgctc cgtcctgcag gaatacaaca tggcagtggt ctcctcagcg atgattcgca 33480
ccgcccgcag cataaggcgc cttgtcctcc gggcacagca gcgcaccctg atctcactta 33540
aatcagcaca gtaactgcag cacagcacca caatattgtt caaaatccca cagtgcaagg 33600
cgctgtatcc aaagctcatg gcggggacca cagaacccac gtggccatca taccacaagc 33660
gcaggtagat taagtggcga cccctcataa acacgctgga cataaacatt acctcttttg 33720
gcatgttgta attcaccacc tcccggtacc atataaacct ctgattaaac atggcgccat 33780
ccaccaccat cctaaaccag ctggccaaaa cctgcccgcc ggctatacac tgcagggaac 33840
cgggactgga acaatgacag tggagagccc aggactcgta accatggatc atcatgctcg 33900
tcatgatatc aatgttggca caacacaggc acacgtgcat acacttcctc aggattacaa 33960
gctcctcccg cgttagaacc atatcccagg gaacaaccca ttcctgaatc agcgtaaatc 34020
ccacactgca gggaagacct cgcacgtaac tcacgttgtg cattgtcaaa gtgttacatt 34080
cgggcagcag cggatgatcc tccagtatgg tagcgcgggt ttctgtctca aaaggaggta 34140
gacgatccct actgtacgga gtgcgccgag acaaccgaga tcgtgttggt cgtagtgtca 34200
tgccaaatgg aacgccggac gtagtcatat ttcctgaagc aaaaccaggt gcgggcgtga 34260
caaacagatc tgcgtctccg gtctcgccgc ttagatcgct ctgtgtagta gttgtagtat 34320
atccactctc tcaaagcatc caggcgcccc ctggcttcgg gttctatgta aactccttca 34380
tgcgccgctg ccctgataac atccaccacc gcagaataag ccacacccag ccaacctaca 34440
cattcgttct gcgagtcaca cacgggagga gcgggaagag ctggaagaac catgtttttt 34500
tttttattcc aaaagattat ccaaaacctc aaaatgaaga tctattaagt gaacgcgctc 34560
ccctccggtg gcgtggtcaa actctacagc caaagaacag ataatggcat ttgtaagatg 34620
ttgcacaatg gcttccaaaa ggcaaacggc cctcacgtcc aagtggacgt aaaggctaaa 34680
cccttcaggg tgaatctcct ctataaacat tccagcacct tcaaccatgc ccaaataatt 34740
ctcatctcgc caccttctca atatatctct aagcaaatcc cgaatattaa gtccggccat 34800
tgtaaaaatc tgctccagag cgccctccac cttcagcctc aagcagcgaa tcatgattgc 34860
aaaaattcag gttcctcaca gacctgtata agattcaaaa gcggaacatt aacaaaaata 34920
ccgcgatccc gtaggtccct tcgcagggcc agctgaacat aatcgtgcag gtctgcacgg 34980
accagcgcgg ccacttcccc gccaggaacc atgacaaaag aacccacact gattatgaca 35040
cgcatactcg gagctatgct aaccagcgta gccccgatgt aagcttgttg catgggcggc 35100
gatataaaat gcaaggtgct gctcaaaaaa tcaggcaaag cctcgcgcaa aaaagaaagc 35160
acatcgtagt catgctcatg cagataaagg caggtaagct ccggaaccac cacagaaaaa 35220
gacaccattt ttctctcaaa catgtctgcg ggtttctgca taaacacaaa ataaaataac 35280
aaaaaaacat ttaaacatta gaagcctgtc ttacaacagg aaaaacaacc cttataagca 35340
taagacggac tacggccatg ccggcgtgac cgtaaaaaaa ctggtcaccg tgattaaaaa 35400
gcaccaccga cagctcctcg gtcatgtccg gagtcataat gtaagactcg gtaaacacat 35460
caggttgatt cacatcggtc agtgctaaaa agcgaccgaa atagcccggg ggaatacata 35520
cccgcaggcg tagagacaac attacagccc ccataggagg tataacaaaa ttaataggag 35580
agaaaaacac ataaacacct gaaaaaccct cctgcctagg caaaatagca ccctcccgct 35640
ccagaacaac atacagcgct tccacagcgg cagccataac agtcagcctt accagtaaaa 35700
aagaaaacct attaaaaaaa caccactcga cacggcacca gctcaatcag tcacagtgta 35760
aaaaagggcc aagtgcagag cgagtatata taggactaaa aaatgacgta acggttaaag 35820
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acccacaact tcctcaaatc gtcacttccg ttttcccacg ttacgtcact tcccatttta 35940
agaaaactac aattcccaac acatactagt tactccgccc taaaacctac gtcacccgcc 36000
ccgttcccac gccccgcgcc acgtcacaaa ctccaccccc tcattatcat attggcttca 36060
atccaaaata aggtatatta ttgatgatgt 36090
<210> 6
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gp100-tyr 插入有连接子
<400> 6
ggaagcggtt ctcgctacct ggagcctggc ccagtgactg ccgctggttc cggaagcaga 60
tacatggacg gaacaatgtc ccaggttgcc ggttctggct cc 102
<210> 7
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> gp100-tyr 插入有连接子
<400> 7
Gly Ser Gly Ser Arg Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Ala Ala Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ser Arg Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val Ala Gly Ser
20 25 30
Gly Ser
<210> 8
<211> 2859
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> wt 六邻体
<400> 8
atggctaccc cttcgatgat gccgcagtgg tcttacatgc acatctcggg ccaggacgcc 60
tcggagtacc tgagccccgg gctggtgcag tttgcccgcg ccaccgagac gtacttcagc 120
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tttgacatcc gcggcgtgct ggacaggggc cctactttta agccctactc tggcactgcc 360
tacaacgccc tggctcccaa gggtgcccca aatccttgcg aatgggatga agctgctact 420
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gctgagcagc aaaaaactca cgtatttggg caggcgcctt attctggtat aaatattaca 540
aaggagggta ttcaaatagg tgtcgaaggt caaacaccta aatatgccga taaaacattt 600
caacctgaac ctcaaatagg agaatctcag tggtacgaaa ctgaaattaa tcatgcagct 660
gggagagtcc ttaaaaagac taccccaatg aaaccatgtt acggttcata tgcaaaaccc 720
acaaatgaaa atggagggca aggcattctt gtaaagcaac aaaatggaaa gctagaaagt 780
caagtggaaa tgcaattttt ctcaactact gaggcgaccg caggcaatgg tgataacttg 840
actcctaaag tggtattgta cagtgaagat gtagatatag aaaccccaga cactcatatt 900
tcttacatgc ccactattaa ggaaggtaac tcacgagaac taatgggcca acaatctatg 960
cccaacaggc ctaattacat tgcttttagg gacaatttta ttggtctaat gtattacaac 1020
agcacgggta atatgggtgt tctggcgggc caagcatcgc agttgaatgc tgttgtagat 1080
ttgcaagaca gaaacacaga gctttcatac cagcttttgc ttgattccat tggtgataga 1140
accaggtact tttctatgtg gaatcaggct gttgacagct atgatccaga tgttagaatt 1200
attgaaaatc atggaactga agatgaactt ccaaattact gctttccact gggaggtgtg 1260
attaatacag agactcttac caaggtaaaa cctaaaacag gtcaggaaaa tggatgggaa 1320
aaagatgcta cagaattttc agataaaaat gaaataagag ttggaaataa ttttgccatg 1380
gaaatcaatc taaatgccaa cctgtggaga aatttcctgt actccaacat agcgctgtat 1440
ttgcccgaca agctaaagta cagtccttcc aacgtaaaaa tttctgataa cccaaacacc 1500
tacgactaca tgaacaagcg agtggtggct cccgggttag tggactgcta cattaacctt 1560
ggagcacgct ggtcccttga ctatatggac aacgtcaacc catttaacca ccaccgcaat 1620
gctggcctgc gctaccgctc aatgttgctg ggcaatggtc gctatgtgcc cttccacatc 1680
caggtgcctc agaagttctt tgccattaaa aacctccttc tcctgccggg ctcatacacc 1740
tacgagtgga acttcaggaa ggatgttaac atggttctgc agagctccct aggaaatgac 1800
ctaagggttg acggagccag cattaagttt gatagcattt gcctttacgc caccttcttc 1860
cccatggccc acaacaccgc ctccacgctt gaggccatgc ttagaaacga caccaacgac 1920
cagtccttta acgactatct ctccgccgcc aacatgctct accctatacc cgccaacgct 1980
accaacgtgc ccatatccat cccctcccgc aactgggcgg ctttccgcgg ctgggccttc 2040
acgcgcctta agactaagga aaccccatca ctgggctcgg gctacgaccc ttattacacc 2100
tactctggct ctatacccta cctagatgga accttttacc tcaaccacac ctttaagaag 2160
gtggccatta cctttgactc ttctgtcagc tggcctggca atgaccgcct gcttaccccc 2220
aacgagtttg aaattaagcg ctcagttgac ggggagggtt acaacgttgc ccagtgtaac 2280
atgaccaaag actggttcct ggtacaaatg ctagctaact acaacattgg ctaccagggc 2340
ttctatatcc cagagagcta caaggaccgc atgtactcct tctttagaaa cttccagccc 2400
atgagccgtc aggtggtgga tgatactaaa tacaaggact accaacaggt gggcatccta 2460
caccaacaca acaactctgg atttgttggc taccttgccc ccaccatgcg cgaaggacag 2520
gcctaccctg ctaacttccc ctatccgctt ataggcaaga ccgcagttga cagcattacc 2580
cagaaaaagt ttctttgcga tcgcaccctt tggcgcatcc cattctccag taactttatg 2640
tccatgggcg cactcacaga cctgggccaa aaccttctct acgccaactc cgcccacgcg 2700
ctagacatga cttttgaggt ggatcccatg gacgagccca cccttcttta tgttttgttt 2760
gaagtctttg acgtggtccg tgtgcaccag ccgcaccgcg gcgtcatcga aaccgtgtac 2820
ctgcgcacgc ccttctcggc cggcaacgcc acaacataa 2859
<210> 9
<211> 952
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> wt 六邻体
<400> 9
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ser Tyr Met His Ile Ser
1 5 10 15
Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala
20 25 30
Arg Ala Thr Glu Thr Tyr Phe Ser Leu Asn Asn Lys Phe Arg Asn Pro
35 40 45
Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu
50 55 60
Thr Leu Arg Phe Ile Pro Val Asp Arg Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Tyr
65 70 75 80
Lys Ala Arg Phe Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met
85 90 95
Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Thr
100 105 110
Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Leu Ala Pro Lys Gly
115 120 125
Ala Pro Asn Pro Cys Glu Trp Asp Glu Ala Ala Thr Ala Leu Glu Ile
130 135 140
Asn Leu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asn Glu Asp Glu Val Asp Glu Gln
145 150 155 160
Ala Glu Gln Gln Lys Thr His Val Phe Gly Gln Ala Pro Tyr Ser Gly
165 170 175
Ile Asn Ile Thr Lys Glu Gly Ile Gln Ile Gly Val Glu Gly Gln Thr
180 185 190
Pro Lys Tyr Ala Asp Lys Thr Phe Gln Pro Glu Pro Gln Ile Gly Glu
195 200 205
Ser Gln Trp Tyr Glu Thr Glu Ile Asn His Ala Ala Gly Arg Val Leu
210 215 220
Lys Lys Thr Thr Pro Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Tyr Ala Lys Pro
225 230 235 240
Thr Asn Glu Asn Gly Gly Gln Gly Ile Leu Val Lys Gln Gln Asn Gly
245 250 255
Lys Leu Glu Ser Gln Val Glu Met Gln Phe Phe Ser Thr Thr Glu Ala
260 265 270
Thr Ala Gly Asn Gly Asp Asn Leu Thr Pro Lys Val Val Leu Tyr Ser
275 280 285
Glu Asp Val Asp Ile Glu Thr Pro Asp Thr His Ile Ser Tyr Met Pro
290 295 300
Thr Ile Lys Glu Gly Asn Ser Arg Glu Leu Met Gly Gln Gln Ser Met
305 310 315 320
Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Ala Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu
325 330 335
Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala
340 345 350
Ser Gln Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu
355 360 365
Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Asp Ser Ile Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe
370 375 380
Ser Met Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile
385 390 395 400
Ile Glu Asn His Gly Thr Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro
405 410 415
Leu Gly Gly Val Ile Asn Thr Glu Thr Leu Thr Lys Val Lys Pro Lys
420 425 430
Thr Gly Gln Glu Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Thr Glu Phe Ser Asp
435 440 445
Lys Asn Glu Ile Arg Val Gly Asn Asn Phe Ala Met Glu Ile Asn Leu
450 455 460
Asn Ala Asn Leu Trp Arg Asn Phe Leu Tyr Ser Asn Ile Ala Leu Tyr
465 470 475 480
Leu Pro Asp Lys Leu Lys Tyr Ser Pro Ser Asn Val Lys Ile Ser Asp
485 490 495
Asn Pro Asn Thr Tyr Asp Tyr Met Asn Lys Arg Val Val Ala Pro Gly
500 505 510
Leu Val Asp Cys Tyr Ile Asn Leu Gly Ala Arg Trp Ser Leu Asp Tyr
515 520 525
Met Asp Asn Val Asn Pro Phe Asn His His Arg Asn Ala Gly Leu Arg
530 535 540
Tyr Arg Ser Met Leu Leu Gly Asn Gly Arg Tyr Val Pro Phe His Ile
545 550 555 560
Gln Val Pro Gln Lys Phe Phe Ala Ile Lys Asn Leu Leu Leu Leu Pro
565 570 575
Gly Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Asn Phe Arg Lys Asp Val Asn Met Val
580 585 590
Leu Gln Ser Ser Leu Gly Asn Asp Leu Arg Val Asp Gly Ala Ser Ile
595 600 605
Lys Phe Asp Ser Ile Cys Leu Tyr Ala Thr Phe Phe Pro Met Ala His
610 615 620
Asn Thr Ala Ser Thr Leu Glu Ala Met Leu Arg Asn Asp Thr Asn Asp
625 630 635 640
Gln Ser Phe Asn Asp Tyr Leu Ser Ala Ala Asn Met Leu Tyr Pro Ile
645 650 655
Pro Ala Asn Ala Thr Asn Val Pro Ile Ser Ile Pro Ser Arg Asn Trp
660 665 670
Ala Ala Phe Arg Gly Trp Ala Phe Thr Arg Leu Lys Thr Lys Glu Thr
675 680 685
Pro Ser Leu Gly Ser Gly Tyr Asp Pro Tyr Tyr Thr Tyr Ser Gly Ser
690 695 700
Ile Pro Tyr Leu Asp Gly Thr Phe Tyr Leu Asn His Thr Phe Lys Lys
705 710 715 720
Val Ala Ile Thr Phe Asp Ser Ser Val Ser Trp Pro Gly Asn Asp Arg
725 730 735
Leu Leu Thr Pro Asn Glu Phe Glu Ile Lys Arg Ser Val Asp Gly Glu
740 745 750
Gly Tyr Asn Val Ala Gln Cys Asn Met Thr Lys Asp Trp Phe Leu Val
755 760 765
Gln Met Leu Ala Asn Tyr Asn Ile Gly Tyr Gln Gly Phe Tyr Ile Pro
770 775 780
Glu Ser Tyr Lys Asp Arg Met Tyr Ser Phe Phe Arg Asn Phe Gln Pro
785 790 795 800
Met Ser Arg Gln Val Val Asp Asp Thr Lys Tyr Lys Asp Tyr Gln Gln
805 810 815
Val Gly Ile Leu His Gln His Asn Asn Ser Gly Phe Val Gly Tyr Leu
820 825 830
Ala Pro Thr Met Arg Glu Gly Gln Ala Tyr Pro Ala Asn Phe Pro Tyr
835 840 845
Pro Leu Ile Gly Lys Thr Ala Val Asp Ser Ile Thr Gln Lys Lys Phe
850 855 860
Leu Cys Asp Arg Thr Leu Trp Arg Ile Pro Phe Ser Ser Asn Phe Met
865 870 875 880
Ser Met Gly Ala Leu Thr Asp Leu Gly Gln Asn Leu Leu Tyr Ala Asn
885 890 895
Ser Ala His Ala Leu Asp Met Thr Phe Glu Val Asp Pro Met Asp Glu
900 905 910
Pro Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Glu Val Phe Asp Val Val Arg Val
915 920 925
His Gln Pro His Arg Gly Val Ile Glu Thr Val Tyr Leu Arg Thr Pro
930 935 940
Phe Ser Ala Gly Asn Ala Thr Thr
945 950
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hex713 表位
<400> 10
tacctcaacc acacctttaa gaaggtg 27
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hex713 表位
<400> 11
Tyr Leu Asn His Thr Phe Lys Lys Val
1 5
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V721A 表位
<400> 12
tacctcaacc acacctttaa gaaggct 27
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V721A 表位
<400> 13
Tyr Leu Asn His Thr Phe Lys Lys Ala
1 5
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hex892 表位
<400> 14
cttctctacg ccaactccgc ccacgcg 27
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hex892 表位
<400> 15
Leu Leu Tyr Ala Asn Ser Ala His Ala
1 5
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A901S 表位
<400> 16
cttctctacg ccaactccgc ccactcc 27
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A901S 表位
<400> 17
Leu Leu Tyr Ala Asn Ser Ala His Ser
1 5
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hex917 表位
<400> 18
tatgttttgt ttgaagtctt tgacgtg 27
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hex917 表位
<400> 19
Tyr Val Leu Phe Glu Val Phe Asp Val
1 5
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V925K 表位
<400> 20
tatgttttgt ttgaagtctt tgacaag 27
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V925K 表位
<400> 21
Tyr Val Leu Phe Glu Val Phe Asp Lys
1 5
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hex512 表位
<400> 22
gggttagtgg actgctacat taacctt 27
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hex512 表位
<400> 23
Gly Leu Val Asp Cys Tyr Ile Asn Leu
1 5
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L520P 表位
<400> 24
gggttagtgg actgctacat taacccc 27
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L520P 表位
<400> 25
Gly Leu Val Asp Cys Tyr Ile Asn Pro
1 5
<210> 26
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肝素硫酸盐糖胺聚糖（HSG）结合位点
<400> 26
Lys Lys Thr Lys
1
<210> 27
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 整合素结合基序
<400> 27
Arg Gly Asp Lys
1
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性连接子
<400> 28
Gly Ser Gly Ser Arg
1 5
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性连接子
<400> 29
Ala Gly Ser Gly Ser Arg
1 5
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性连接子
<400> 30
Ala Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> gp100-280
<400> 31
Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Ala
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tyr369(3D)
<400> 32
Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E1A19
<400> 33
Leu Leu Asp Gln Leu Ile Glu Glu Val
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hex63
<400> 34
Arg Leu Thr Leu Arg Phe Ile Pro Val
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hex548
<400> 35
Met Leu Leu Gly Asn Gly Arg Tyr Val
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hex652
<400> 36
Met Leu Tyr Pro Ile Pro Ala Asn Ala
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hex914
<400> 37
Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Glu Val
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> gp100-209
<400> 38
Ile Met Asp Gln Val Pro Phe Ser Val
1 5

Claims (54)

1.一种溶瘤腺病毒，所述溶瘤腺病毒包含腺病毒蛋白的免疫显性T细胞表位的至少一个功能性缺失，其中，所述功能性缺失选自由以下项组成的组：
- Hex512表位中的L520P突变，所述Hex512表位的序列为GLVDCYINL（SEQ ID NO:23），
- Hex713表位中的V721A突变，所述Hex713表位的序列为YLNHTFKKV（SEQ ID NO:11），
- Hex892表位中的A900S突变，所述Hex892表位的序列为LLYANSAHA（SEQ ID NO:15），和
- Hex917表位中的V925K突变，所述Hex917表位的序列为YVLFEVFDV（SEQ ID NO:19）。
2.根据权利要求1所述的溶瘤腺病毒，其中，所述腺病毒包含Hex512表位中的L520P突变和Hex917表位中的V925K突变。
3.根据权利要求1所述的溶瘤腺病毒，其中，所述腺病毒包含Hex713表位中的V721A突变，Hex892表位中的A900S突变和Hex917表位中的V925K突变。
4.根据权利要求1所述的溶瘤腺病毒，其中，所述腺病毒包含Hex512表位中的L520P突变，Hex713表位中的V721A突变，Hex892表位中的A900S突变和Hex917表位中的V925K突变。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的溶瘤腺病毒，所述溶瘤腺病毒进一步包括各自编码肿瘤抗原或表位的一种或多种异源核酸序列。
6.根据权利要求5所述的溶瘤腺病毒，其中，所述一种或多种异源核酸序列包括各自编码肿瘤抗原或表位的1至5种异源核酸序列。
7.根据权利要求5或6所述的溶瘤腺病毒，其中，所述肿瘤抗原或表位选自由以下项组成的组：MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、CEA、酪氨酸酶、中期因子、BAGE、CASP-8、β-连环蛋白、CA-125、CDK-1、ESO-1、gp75、gp100、MART-1、MUC-1、MUM-1、p53、PAP、PSA、PSMA、ras、trp-1、HER-2、TRP-1、TRP-2、IL13Rα、IL13Rα2、AIM-2、AIM-3、NY-ESO-1、C9orf1l2、SART1、SART2、SART3、BRAP、RTN4、GLEA2、TNKS2、KIAA0376、ING4、HSPH1、C13orf24、RBPSUH、C6orf153、NKTR、NSEP1、U2AF1L、CYNL2、TPR、SOX2、GOLGA、BMI1、COX-2、EGFRvIII、EZH2、LICAM、活素、MRP-3、巢蛋白、OLIG2、ART1、ART4、B-细胞周期蛋白、Gli1、Cav-1、组织蛋白酶B、CD74、E-钙粘蛋白、EphA2/Eck、Fra-1/Fosl1、GAGE-1、神经节苷脂/GD2、GnT-V、β1,6-N、Ki67、Ku70/80、PROX1、PSCA、SOX10、SOX11、生存素、UPAR、间皮素和WT-1，或它们的表位。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述肿瘤抗原或表位是人肿瘤抗原或表位。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述异源核酸序列插入到腺病毒基因中，其中所述腺病毒基因编码具有免疫显性T细胞表位的至少一个缺失的腺病毒蛋白。
10.根据权利要求5至8中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述异源核酸序列插入到腺病毒基因中，其中，所述腺病毒基因编码除具有免疫显性T细胞表位的至少一个缺失的腺病毒蛋白之外的其它腺病毒蛋白。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述异源核酸序列插入到编码腺病毒六邻体蛋白的腺病毒基因中。
12.根据权利要求11所述的溶瘤腺病毒，其中，所述异源核酸序列插入到所述腺病毒六邻体蛋白的高变区中。
13.根据权利要求12所述的溶瘤腺病毒，其中，所述高变区是高变区5。
14.根据权利要求5至13中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述肿瘤抗原或表位的两侧是柔性连接子。
15.根据权利要求14所述的溶瘤腺病毒，其中，所述柔性连接子包括选自由以下项组成的组中的氨基酸序列：GSGSR (SEQ ID NO: 28)、AGSGSR (SEQ ID NO: 29)和AGSGS (SEQID NO: 30)。
16.根据权利要求5至15中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述一种或多种异源核酸序列编码gp100肿瘤抗原或表位，或酪氨酸酶肿瘤抗原或表位。
17.根据权利要求5至15中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述一种或多种异源核酸序列包括：（a）编码gp100抗原或表位的异源核酸序列，和（b）编码酪氨酸酶抗原或表位的异源核酸序列。
18.根据权利要求16或17所述的溶瘤腺病毒，其中，所述gp100肿瘤抗原或表位包括氨基酸序列YLEPGPVTA (SEQ ID NO: 31)，其中，所述酪氨酸酶抗原或表位包括氨基酸序列YMDGTMSQV (SEQ ID NO: 32)。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的溶瘤腺病毒，所述异源核酸序列插入到所述腺病毒六邻体蛋白的高变区5中。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述腺病毒是人腺病毒。
21.根据权利要求20所述的溶瘤腺病毒，其中，所述人腺病毒选自由以下项组成的组：人腺病毒血清1至51型。
22.根据权利要求21所述的溶瘤腺病毒，其中，所述人腺病毒是血清5型。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述溶瘤腺病毒在肿瘤中选择性复制。
24.根据权利要求23中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述腺病毒进一步包括组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子，以实现在肿瘤中的选择性复制。
25.根据权利要求24所述的溶瘤腺病毒，其中，所述组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子是控制选自由E1a、E1b、E2和E4组成的组中的一种或多种基因的表达，以实现在肿瘤中选择性复制的启动子序列。
26.根据权利要求25所述的溶瘤腺病毒，其中，所述组织特异性启动子选自由以下项组成的组：E2F启动子、端粒酶hTERT启动子、酪氨酸酶启动子、前列腺特异性抗原启动子、甲胎蛋白启动子和COX-2启动子。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述腺病毒进一步包括在选自由E1a、E1b、E4和VA-RNA组成的组中的一种或多种基因中的突变，以实现在肿瘤中的选择性复制。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述腺病毒进一步包括衣壳修饰，以增加它的感染性或靶向肿瘤细胞中存在的受体。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的溶瘤腺病毒，其中，所述腺病毒进一步包括常用于癌症基因治疗领域中的至少一种基因。
30.根据权利要求29所述的溶瘤腺病毒，其中，所述常用于癌症治疗领域中的至少一种基因是选自由前药激活基因、肿瘤抑制基因和免疫刺激基因组成的组的基因。
31.一种溶瘤腺病毒，所述溶瘤腺病毒包含SEQ ID NO: 3或4所示的核苷酸序列。
32.一种溶瘤腺病毒，所述溶瘤腺病毒包含SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列。
33.一种药物组合物，所述药物组合物包含药理学有效剂量的如权利要求1至32中任一项所述的溶瘤腺病毒，和一种或多种药学上可接受的载剂或赋形剂。
34.一种药物组合物，所述药物组合物包含药理学有效剂量的如权利要求5至32中任一项所述的溶瘤腺病毒，以及一种或多种药学上可接受的载剂或赋形剂。
35.一种试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求33或34所述的药物组合物，和使用说明书。
36.根据权利要求35所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括一种或多种额外的治疗剂。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中，所述治疗剂是化学治疗剂。
38.一种含有如权利要求1至32中任一项所述的溶瘤腺病毒的宿主细胞。
39.一种制备感染性腺病毒颗粒的方法，所述方法包括：（a）在允许溶瘤腺病毒增殖和形成感染性腺病毒颗粒的条件下培养如权利要求38所述的宿主细胞，以及（b）回收所述感染性腺病毒颗粒。
40.如权利要求1至32中任一项所述的溶瘤腺病毒在制备用于治疗或预防哺乳动物中的癌症或引起癌症的癌前病变的药物中的用途。
41.根据权利要求40所述的溶瘤腺病毒的用途，其中，所述哺乳动物是人。
42.根据权利要求1至32中任一项所述的溶瘤腺病毒，用作药物。
43.根据权利要求42所述的溶瘤腺病毒，用作癌症的预防剂和/或治疗剂。
44.权利要求1至32中任一项所述的溶瘤腺病毒或如权利要求33所述的药物组合物在制备用于诱导所述肿瘤细胞的裂解的药物中的用途。
45.权利要求1至32中任一项所述的溶瘤腺病毒或如权利要求33所述的药物组合物在制备用于抑制哺乳动物中的肿瘤生长的药物中的用途。
46.权利要求5至32中任一项所述的溶瘤腺病毒或如权利要求34所述的药物组合物在制备用于增加哺乳动物中的针对癌症的免疫应答的药物中的用途。
47.根据权利要求45至46中任一项所述的用途，其中，通过瘤内、静脉内、血管内、鞘内、气管内、肌肉内、皮下、腹腔内、皮内、非肠道、鼻内、经皮、眼部、颅内或口服给药的方式，给药所述溶瘤腺病毒或药物组合物。
48.根据权利要求47所述的用途，其中，将约104至1013的所述腺病毒的病毒颗粒给药予所述哺乳动物。
49.根据权利要求45至48中任一项所述的用途，进一步包括将一种或多种额外的治疗剂给药予所述哺乳动物。
50.根据权利要求49所述的用途，其中，所述治疗剂是化学治疗剂。
51.根据权利要求45至50中任一项所述的用途，其中，所述哺乳动物是人。
52.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO: 4和SEQID NO: 5组成的组中的序列。
53.一种含有如权利要求52所述的多核苷酸的载体。
54.一种含有如权利要求53所述的载体的宿主细胞。
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