CN103221423A - 溶瘤腺病毒载体及与其相关的方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生命科学和医学领域。具体地，本发明涉及癌症疗法。更具体地，本发明涉及溶瘤腺病毒载体以及包含所述载体的细胞和药物组合物。本发明还涉及用于治疗受试者的癌症的所述载体以及用于治疗受试者的癌症的方法。此外，本发明涉及在细胞中产生CD40L以及增强受试者的肿瘤特异性免疫应答和细胞凋亡的方法，以及本发明的溶瘤腺病毒载体用于在细胞中产生CD40L和在受试者中增强肿瘤特异性免疫应答和细胞凋亡，同时减少肿瘤相关免疫抑制的用途。

Description

溶瘤腺病毒载体及与其相关的方法和用途
发明领域
本发明涉及生命科学和医学领域。具体地，本发明涉及癌症疗法。更具体地，本发明涉及溶瘤腺病毒载体以及包含所述载体的细胞和药物组合物。本发明还涉及用于治疗受试者的癌症的所述载体以及用于治疗受试者的癌症的方法。此外，本发明涉及在细胞中产生CD40L以及增强受试者的肿瘤特异性免疫应答和细胞凋亡的方法，以及溶瘤腺病毒载体用于在细胞中产生CD40L和增强受试者的肿瘤特异性免疫应答和细胞凋亡的用途。
发明背景
癌症可利用手术、激素疗法、化学疗法、放射疗法和/或其它疗法来治疗，但在许多情况下，通常特征在于晚期的癌症不能用现有疗法来治愈。因此，需要新型癌细胞靶向方法，例如基因疗法。
在过去20年中，基因转移技术一直处于严密的审查中。癌症基因疗法的目的是，向肿瘤细胞引入治疗性基因。引入靶细胞的此类治疗性基因可以例如修正突变的基因，抑制活性癌基因或对细胞产生额外的性质。适当的外源性治疗基因包括但不限于，免疫治疗性、抗血管生成性、化学保护性(chemoprotective)和“自杀”基因，并且可通过利用修饰的病毒载体或非病毒法(包括电穿孔、基因枪和脂质或聚合物包衣)将其引入细胞。
最佳病毒载体的要求包括，发现特定靶细胞和在靶细胞中表达病毒基因组的高效能力。此外，最佳载体必须在靶组织或细胞中保持活性。在过去10年中，已开发了具有此类性质的病毒载体，例如，逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒(adeno-associated viral)载体已在生物医学中得到广泛研究。
为了进一步改善对肿瘤的穿透性和抗肿瘤作用的局部放大，已构建了选择性溶瘤剂，例如条件复制腺病毒。溶瘤腺病毒是用于治疗癌症的很有前景的工具，并且在临床试验中已显示良好的安全性和一定的功效。肿瘤细胞因病毒在肿瘤细胞中的复制而被溶瘤腺病毒杀死，复制的晚期导致数以千计的病毒体(virion)释放入周围肿瘤组织，有效地进行肿瘤穿透和血管再感染。由于病毒基因组的工程改变(该改变阻止在非肿瘤细胞中的复制)，因此肿瘤细胞允许病毒复制，然而正常细胞则避免了病毒复制。
可通过在腺病毒E1区域中产生部分缺失或通过使用组织或肿瘤特异性启动子(TSP)来将复制局限于肿瘤组织。此类启动子的插入可增强载体在靶细胞中的作用，并且外源组织或肿瘤特异性启动子的使用在重组腺病毒载体中是非常常见的。
先前的研究已显示，人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子在大多数肿瘤和永生化细胞系中是高度活跃的，但在正常体细胞类型中是无活性的。hTERT是端粒酶的催化亚基并且用于在染色体复制过程中稳定端粒长度。先前已描述了利用hTERT启动子来控制腺病毒早期区基因的溶瘤腺病毒(参见，例如Huang,TG,等人,Gene Therapy2003;10,1241-1247;Ryan,PC.等人,Cancer Gene Therapy2004;11,555-559;Irving等人,Cancer Gene Therapy2004;11,174-185;Bauerschmitz GJ,等人,Cancer Res2008;68:5533-9)。然而，端粒酶除了在肿瘤细胞中表达外，还在其它具有无限增殖潜能的人细胞例如干细胞中表达。
大多数临床试验一直以来利用基于腺病毒5(Ad5)的早期腺病毒来进行。溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用依赖于它们的基因递送能力。不幸的是，大多数肿瘤低表达主要的Ad5受体，因此已向Ad5衣壳(capsid)中引入修饰。例如，使用血清型3型的结(knob)的衣壳修饰已在卵巢癌中显示提高的感染性和良好效力(Kanerva A,等人,Clin CancerRes2002;8:275-80;Kanerva A,等人,Mol Ther2002;5:695-704;Kanerva A,等人,Mol Ther2003;8:449-58)。此外，由于Ad载体的纤突(fiber)和五邻体(penton)底座是细胞进入机制的至关重要的介体，因此可通过此类衣壳蛋白的遗传修饰来实现重组Ad载体的靶向(Dmitriev I.,等人1998,Journal of Virology,72,9706-9713)。目前，在临床中使用的大部分溶瘤病毒由于关键病毒基因的若干缺失而在复制方面被高度减弱。此类病毒已显示优良的安全记录，但抗肿瘤功效仍然是有限的。
然而，临床和临床前结果显示，利用未被武装的(unarmed)溶瘤病毒的治疗的免疫刺激不足以导致持续的抗肿瘤治疗性免疫应答。在这一点上，溶瘤病毒已被武装(be armed)以更具免疫刺激性。此外，肿瘤内的病毒复制和免疫刺激蛋白的表达通过诱导细胞因子的产生和肿瘤抗原的释放而增强免疫系统(Ries SJ,等人,Nat Med2000;6:1128-33)。
武装溶瘤病毒组合了常规基因递送的有利方面与能复制的试剂的效力。武装病毒的一个目的是，诱导针对允许病毒复制的细胞的免疫应答。如上文中所提及的，单独的病毒复制，尽管具有免疫原性，但通常不足以诱导有效的抗肿瘤免疫。为了增强治疗性免疫的诱导，已用刺激蛋白例如细胞因子武装病毒，以促进肿瘤抗原至抗原呈递细胞例如树突细胞的引入以及它们的刺激和/或成熟。免疫治疗性基因至肿瘤细胞的引入以及此外其蛋白质的翻译，导致免疫应答的激活和更高效的肿瘤细胞破坏。在这一点上，最相关的免疫细胞是天然杀伤细胞(NK)和细胞毒性CD8+T细胞。
CD40配体(CD40L)是属于肿瘤坏死因子家族的II型跨膜蛋白质。CD40L也称为CD154或gp39，其主要在CD4+T细胞上表达并且结合抗原呈递细胞(APC)的膜上的CD40受体(Grewal IS和Flavell RA.,AnnRev Immunol1998;16:111-35;Roy M,等人,J Immunol1993;151:2497-510)。CD40在巨噬细胞和树突细胞(DC)上表达，在所述细胞上其被CD40L激活，导致抗原呈递和细胞因子产生，随后导致T细胞引发(T-cell priming)和强先天性免疫应答(van Kooten C和Banchereau J.,J Leukoc Biol2000;67:2-17)。CD40L与其受体CD40之间的相互作用提供了触发T-淋巴细胞扩增的至关重要的共刺激信号(Grewal IS和Flavell RA,1998,Annu Rev Immunol1998;16:111-35)，且增加了IL-12的产量(其是在抗肿瘤免疫应答中衔接细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所必需的)(Loskog AS,等人,Clin Cancer Res2005;11:8816-21;Mackey MF,等人,J Immunol1998;161:2094-8)。先前的观察显示，重组可溶性蛋白CD40L(rsCD40L)在肿瘤细胞增殖的体外抑制(Eliopoulos AG,等人,Oncogene1996;13:2243-54;Tong AW,等人,Clin Cancer Res2001;7:691-703)和体内抑制(Eliopoulos AG,等人,Mol Cell Biol2000;20:5503-15;Hirano A,等人,Blood1999;93:2999-3007)中具有直接作用。rsCD40L的其它直接作用是，刺激存活信号转导途径(包括PI-3-激酶和ERK/MAPK)和诱导癌细胞的细胞凋亡(Eliopoulos,AG.,等人,MolCell Biol2000;20:5503-15;Davies CC,等人,J Biol Chem2004;279:1010-921)。
一些最近的报导已显示，用CD40L武装的腺病毒可在肿瘤位置上诱导肿瘤生长的抑制以及细胞凋亡事件的增加(Loskog AS,等人,Clin Cancer Res2005;11:8816-21;Fernandes MS,等人,ClinCancer Res2009;15:4847-56;Loskog AS,等人,J Immunol2004;172:7200-5)。同样地，还存在一些关于抗肿瘤免疫应答(通过增加的淋巴细胞浸润和细胞毒性T细胞-CD8+的存在)的证据(Hanyu K,等人,Anticancer Res2008;28:2785-9;Iida T,等人,Cancer Sci2008;99:2097-10324,25)。
腺病毒是中等大小的(90-100nm)无包膜二十面体病毒，其在蛋白质衣壳中具有约36000个碱基对的双链线性DNA。病毒衣壳具有纤突结构，其参与病毒至靶细胞的附着。首先，纤突蛋白质的结(knob)结构域结合靶细胞的受体(例如，CD46或柯萨奇病毒腺病毒受体(CAR))，第二，病毒与整联蛋白分子相互作用，第三，病毒被内吞入靶细胞。接着，病毒基因组被从内体(endosome)转移进入细胞核，且靶细胞的复制机制也被用于病毒目的(Russell W.C.,J General Virol2000;81:2573-2604)。
腺病毒基因组具有按相继顺序转录的早期(E1-E4)、中期(IX和IVa2)和晚期基因(L1-L5)。早期基因产物影响宿主细胞的防御机制、细胞周期和细胞代谢。中期和晚期基因编码用于产生新病毒体的结构病毒蛋白质(Wu和Nemerow,Trends Microbiol2004;12:162-168;Russell W.C.,J General Virol2000;81;2573-2604;Volpers C.和Kochanek S.J Gene Med2004;6,suppl1:S164-71;KootstraN.A.和Verma I.M.Annu Rev PharmacolToxicol2003;43:413-439)。
已在人中发现超过50种不同血清型的腺病毒。血清型被分类成6个亚组A-F，并且已知不同的血清型与不同的病况(即，呼吸性疾病、结膜炎和胃肠炎)相关。已知腺病毒血清型5型(Ad5)引起呼吸疾病，其是基因治疗领域中最常研究的血清型。在第一种Ad5载体中，E1和/或E3区域被缺失，从而使得能够将外源DNA插入载体(Danthinne X,Imperiale MJ.,Gene Therapy.2000;7:1707-1714)。此外，其它区域的缺失以及另外的突变已给病毒载体提供了额外的性质。事实上，已提出腺病毒的各种修饰来实现有效抗肿瘤作用。
US2010047208A1公开了结修饰的腺病毒载体，其中利用修饰的hTERT启动子来实现肿瘤靶向，并且所述载体可用免疫调节蛋白例如GM-CSF进行武装。
基因疗法的更高效和精确的基因转移以及增加的特异性和充足的肿瘤杀伤能力仍然是有必要的。治疗性载体的安全记录必须也是优异的。本发明通过利用腺病毒的溶瘤和免疫治疗性性质，以创新方式提供了具有上述性质的癌症治疗工具。
发明概述
本发明的目的是，提供用于实现腺病毒的上述性质的新型方法和工具，从而解决常规癌症疗法的问题。更具体地，本发明提供了用于基因疗法的新型方法和工具。
本申请描述了重组病毒载体的构建、与载体相关的方法以及其在肿瘤细胞系、动物模型和癌症患者中的用途。
本发明涉及溶瘤腺病毒载体，所述载体包含：
1)腺病毒血清型5型(Ad5)核酸主链，其包含衣壳修饰，优选具有腺病毒血清型3型(Ad3)的结的衣壳修饰(Ad5/3衣壳嵌合体)，
2)在E1区域上游的编码肿瘤特异性人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子的核酸序列；和
3)替代E3区域中的缺失的腺病毒基因gp19k/6.7K序列的编码人CD40L的核酸序列。
本发明还涉及包含本发明的溶瘤腺病毒载体的细胞。
本发明还涉及包含本发明的腺病毒载体的药物组合物。
本发明还涉及用于治疗受试者的癌症的本发明的腺病毒载体。
本发明还涉及治疗受试者的癌症的方法，其中所述方法包括给患有癌症(特别地常规化学疗法和/或放射疗法难以治疗的癌症)的受试者施用本发明的载体或药物组合物。
此外，本发明还涉及在细胞中产生CD40L的方法，其中所述方法包括：
将包含本发明的溶瘤腺病毒载体的媒介物运送至细胞，和
在细胞中表达所述载体的CD40L。
此外，本发明还涉及增强受试者的肿瘤特异性免疫应答的方法，其中所述方法包括：
将包含本发明的溶瘤腺病毒载体的媒介物运送至靶细胞或组织,
在细胞中表达所述载体的CD40L，
在所述靶细胞或组织中增加细胞毒性T细胞和/或天然杀伤细胞的量，和
诱导Th2至Th1的转变，以在肿瘤微环境中增强细胞毒性抗肿瘤活性。
本发明还涉及本发明的溶瘤腺病毒载体用于在细胞中产生CD40L的用途。
本发明还涉及用于在细胞中产生CD40L的本发明的溶瘤腺病毒载体。
本发明还涉及本发明的溶瘤腺病毒载体用于增强受试者的肿瘤特异性免疫应答的用途。
本发明还涉及用于增强受试者的特异性免疫应答的本发明的溶瘤腺病毒载体。
本发明提供了用于治疗癌症，特别地现有治疗方法难以治疗或不能治愈的癌症的新型工具。此外，相较于许多其它治疗，对于适合于本发明的治疗的肿瘤类型的限制也很少。事实上，可利用提出的发明治疗所有实体瘤。可通过瘤内、腔内、静脉内途径以及与此类途径的组合提供治疗。本发明方法可提供全身性效力，尽管进行局部注射。本发明方法还可根除被提及为肿瘤起始(“癌症干细胞(cancer stemcell)”)的细胞。
除了使得能够将载体转运至目的位置外，本发明的载体还确保了转基因的表达和保持。本发明解决了与常规疗法的治疗抗性相关的问题。此外，本发明提供了用于选择性治疗、而在健康组织中无毒性或损害的工具和方法。本发明的有利方面还包括，相较于其它疗法，不同的和减小的副作用。重要地，本发明方法与许多其它形式的疗法(包括化学疗法和放射疗法)具有协同作用，从而可以以组合方案使用。
未武装的腺病毒的针对允许复制的细胞的免疫反应的诱导通常未能强至足以导致治疗性肿瘤免疫的发生。为了克服该弱点，本发明提供了具有抗肿瘤免疫的有效诱导物CD40L的武装的腺病毒，所述病毒还诱导肿瘤组织的局部细胞凋亡。
特别地，已显示，CD40L与非复制型病毒载体一起，具有通过将T细胞的Th2趋化因子模式转变成Th1类型来增强效应子细胞(CD8+T细胞)的活性的协同效力(Loskog等人2004,J Immunol172:7200-5;Bendriss-Vermare等人2005,J Leucocyte Biol78:954-66)。Th2促进抗体的产生，而Th1促进细胞毒性，并且当试图使T细胞靶向杀伤肿瘤细胞时，后者可以是更有利的。在本申请说明书中，已显示，该现象在溶瘤腺病毒的背景中是特别有效力的，如通过临床前和人数据所证明的。
通过溶瘤腺病毒来产生CD40L也是非常重要的，因为其可将天然杀伤细胞招募至肿瘤并且增强其抗肿瘤活性(Nakajima等人1998JImmunol161:1901-7)。此外，CD40L可增强抗原呈递细胞的功能(Nakajima等人1998J Immunol161:1901-7)。最后，CD40/CD40L相互作用提供了强劲的抑制信号来抑制细胞例如调节性T细胞，这可导致抗肿瘤免疫反应的有力刺激(Guiducci等人2005Eur J Immunol35:557-67)。
此外，通过使用强劲的转录靶向启动子hTERT，将病毒复制局限于靶细胞。事实上，肿瘤特异性启动子hTERT在所有晚期实体瘤中具有活性，但其还可介导溶瘤腺病毒至推定的癌症起始细胞的靶向，如已在癌症患者的胸腔积液样品中所显示的(Bauerschmitz等人，Cancer Res200868:5533-9)。此处提供的临床数据显示，对正常组织干细胞无毒性，因为未发生威胁生命的不良事件。
本发明实现了癌症疗法，其中肿瘤细胞通过与各种不同的激活人免疫应答的机制组合的、病毒体引起的溶瘤作用而被破坏，所述机制包括T细胞、巨噬细胞和树突细胞(DC)的增殖和活化，随后细胞因子的产生，这反过来诱导Th1型免疫反应，以额外地刺激细胞毒性T细胞对肿瘤的攻击。此外，CD40L诱导的细胞凋亡促进肿瘤负荷的减小。
与现有技术的腺病毒工具相比较，本发明提供了更简单、更有效、廉价的、无毒性和/或更安全的癌症治疗工具。此外，无需辅助病毒或重组分子的共施用。
本发明提供了新一代的感染性增强的、高度有效的腺病毒，所述腺病毒保留了更早代的病毒的良好安全性，且导致更高的功效水平。重要地，本发明描述了这样的溶瘤腺病毒，其提供了对于溶瘤病毒的功效是至关重要的免疫因子。
本发明的新型产物使得能够进一步改善癌症疗法。
附图概述
图1显示了Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L、Ad5/3-CMV-hCD40L和Ad5/3-CMV-mCD40L的示意图。能复制的Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L在E1区域的上游具有编码肿瘤特异性人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子的核酸序列(SEQ ID.NO:1)，并且E3区域中的gp19k/6.7K已被人CD40L的cDNA序列(SEQ ID NO:2)替代(图1a)。复制缺陷型Ad5/3-CMV-hCD40L(图1b)和Ad5/3-CMV-mCD40L(Fig1c)分别具有替代E1A区域的hCD40L和mCD40L，且天然的E1A启动子已被CMV启动子替代。ADP是指腺病毒死亡蛋白。
图2a显示，用10VP/细胞感染后24小时，293细胞系中的hCD40L表达的流式细胞术分析的结果。图2b显示小鼠血清中CD40L蛋白的体内表达。为了分析用Ad5/3-CMV-hCD40L处理的小鼠的血清中的hCD40L，因肿瘤快速生长和动物将在第8天被杀死，而仅收集血液2次(第4天和第8天)。图2c显示，由复制型腺病毒Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L表达的hCD40L的功能性。将特征在于编码萤光素酶的Nf-κB5-ELAM启动子的质粒转染进入EJ细胞，添加来自用Ad5/3-hTERT-hCD40L感染的A549细胞的上清液。扣除模拟对照的值(非感染的)，且Nf-κB活性以萤光素酶表达的倍数增加(相对光单位(relative light unit,RLU)表示。将来自用不具有CD40L(Ad5/3-hTERT-E1A)和具有人重组CD40L(hCD40L)的溶瘤病毒感染的细胞的上清液用作对照。进行测定3次，且每次以一式三份进行评估。数据表示为平均值±SEM；***，P<0.001。图2d还显示hCD40L的功能性。人B-淋巴细胞细胞系(Ramos-Blue)稳定地表达NF-κB/AP-1可诱导的SEAP报道基因。将从病毒感染的细胞收集的上清液用于刺激Ramos-Blue细胞，且作为细胞活化的替代物，用QUANTI-Blue测定试剂(InvivoGen,San Diego,CA,USA)测量SEAP的产量。数据表示为平均值±SEM;***，P<0.001。
图3显示Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L在CD40阳性(EJ)或CD40阴性(A549)细胞系中的溶瘤效力。为了评价本发明的腺病毒的溶瘤效力，用Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L、Ad5/3-hTERT-E1A、Ad5/3-CMV-hCD40L和Ad5/3Luc1以0.1、1、10、100和1000VP/细胞的剂量感染A549(CD40-)(图3a)和EJ(CD40+)(图3b)细胞系，利用MTS测定测量细胞活力(viability)。利用Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L(图3c)或Ad5/3-hTERT-E1A(图3d)感染EJ和A549细胞单层。在感染后7天停止测定，利用MTS测定测量细胞活力。***，P<0.001。
图4显示载体Ad5/3-CMV-hCD40L和Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L在小鼠中的抗肿瘤效力。在3天(第0、2和4天，n=5只小鼠/组)中利用复制缺陷型腺病毒Ad5/3-CMV-hCD40L以108VP/肿瘤的剂量瘤内注射具有皮下A549(CD40-)(图4a)或EJ(CD40+)(图4b)肿瘤的小鼠，跟踪肿瘤生长。该实验显示，CD40L在CD40+细胞中具有抗肿瘤活性。利用A549(图4c)或EJ(图4d)细胞系在小鼠中诱导肿瘤，在3天(第0、2和4天，n=5只小鼠/组)中以108VP/肿瘤的剂量用复制型腺病毒Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L和对照病毒Ad5/3-hTERT-E1A注射肿瘤，且将肿瘤体积相对于初始尺寸作图。该实验显示Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L的溶瘤效力，但未考虑CD40L的免疫活性，因为hCD40在小鼠不具有活性。数据表示为平均值±SEM。*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001。
图5显示，胱天蛋白酶-3在CD40+肿瘤中的表达。利用Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L、Ad5/3-hTERT-E1A、Ad5/3-CMV-hCD40L和Ad5/3-Luc1(模拟)瘤内注射具有EJ(CD40+)肿瘤的小鼠3次。26天后，杀死动物，收集肿瘤，将其包埋在石蜡块(n=5只小鼠/组)中。进行胱天蛋白酶-3的免疫组织化学分析，以研究细胞凋亡的诱导。阳性染色以褐色显示。
图6显示，Ad5/3-CMV-mCD40L抑制具有免疫能力的动物模型的肿瘤生长。为了在无因溶瘤作用而导致的混淆的情况下研究CD40L的免疫效应，在第0、2和4天用复制缺陷型腺病毒Ad5/3-CMV-mCD40L或对照Ad5/3-Luc1以3x108VP/肿瘤的剂量瘤内注射具有皮下MB49(小鼠膀胱癌细胞系)肿瘤的C57Black小鼠(n=6只小鼠/组)。跟踪肿瘤尺寸，将其相对于第0天的尺寸作图。数据表示为平均值±SEM,***,P<0.001(图6a)。图6b显示，用Ad5/3-CMV-mCD40L或Ad5/3-Luc1处理的肿瘤中细胞凋亡(活性胱天蛋白酶-3)的免疫组织化学分析。活性胱天蛋白酶-3的表达以褐色显示。
图7描述了同基因鼠模型的宿主免疫应答。图7a显示，用Ad5/3Luc1(黑色)或Ad5/3-CMV-mCD40L(白色)处理的小鼠的脾细胞中的IL-12、IFN-γ、TNF-α和Rantes的细胞因子分析。将脾细胞培养24、48或72小时。IL-12指示抗原呈递细胞的活化，而其它细胞因子是Th1型免疫应答的标志。为了进行免疫组织学分析，在病毒注射后16天收集MB49肿瘤。通过针对不同标志的免疫组织化学分析对4μm的肿瘤切片进行染色。图7b显示巨噬细胞(F4/80)、白细胞(CD45)和B淋巴细胞(CD19)染色。在图7c中，对肿瘤切片的辅助(CD4+)和细胞毒性(CD8+)T细胞(褐色)进行染色。
图8显示了用于预测疗效的肿瘤样品的预处理分析。对患有乳腺癌(R73)的患者的新鲜预处理(使用具有Ad5-衣壳和嵌合Ad5/3衣壳(与Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L相同的衣壳)的溶瘤腺病毒和使用非溶瘤腺病毒)的恶性胸腔积液进行细胞杀伤测定(MTS测定)。
图9显示，在用溶瘤腺病毒Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L处理后，识别T细胞的腺病毒的诱导。分离总PBMC，利用腺病毒5型五邻体衍生的肽库进行脉冲，以通过干扰素γELISPOT评价腺病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的活化。
图10显示按照制造商的说明书，利用Becton-Dickinson细胞因子多重珠粒阵列系统(BD FACSArray;BD Biosciences,San Jose,CA)分析患者样品的Th1诱导的细胞因子：干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-2(IL-2)或Th2细胞因子：白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)和白细胞介素10(IL-10)的结果。在图10的左侧上显示了Th1诱导的细胞因子，在右侧上显示了Th2诱导的因子。之前=在给予病毒之前采集的血清样品；1个月=在病毒处理后1个月采集的血清样品；2个月=在病毒处理后2个月采集的血清样品。
图11显示按照制造商的说明书，利用Becton-Dickinson细胞因子多重珠粒阵列系统(BD FACSArray;BD Biosciences,San Jose,CA)分析患者血清样品的Th1细胞因子：干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-2(IL-2)以及Th2细胞因子：干扰素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)和白细胞介素10(IL-10)的结果。报告相对于其基线水平(该水平被设置为1)的细胞因子水平，计算每一个时间点的Th1/Th2之间的比率。1个月=在病毒处理后1个月采集的血清样品；2个月=在病毒处理后2个月采集的血清样品。
图12显示，在无预刺激的情况下，利用干扰素γELISPOT评价腺病毒特异性(12A)和肿瘤特异性(12B)细胞毒性T淋巴细胞的活化的结果。星号指示病毒施用的天数。紧在病毒注射前收集PBMC。
图13显示处理之前和之后评价的IL-6(13A)、IL-8(13B)、IL-10(13C)、IL-12(13D)、TNF-α(13E)和INF-γ(13F)的血清水平。数据表示为平均值±SD。
图14显示对抗肿瘤和抗腺病毒免疫的作用。用肿瘤来源的肽库(pool)(根据肿瘤类型针对每一个患者指定的)或腺病毒来源的肽库脉冲预刺激的和克隆扩增的PBMC。利用细胞内细胞因子染色估量TNF-α/INF-γ双阳性肿瘤特异性CD8+T细胞(14A)、肿瘤特异性CD4+T细胞(14B)和腺病毒特异性CD4+T细胞(14C)的相对数目。星号指示病毒施用的天数。紧在病毒注射前收集PBMC。
图15显示可溶性CD40L(sCD40L;15A)和RANTES(15B)在恶性肿瘤腹水液中的局部水平(与此类细胞因子的全身性水平相比)。在病毒处理后第28天，在恶性肿瘤腹水液(15C)和从腹水分离的细胞(15D)中发现大量病毒粒子(VP)，然而在同一天在血清中未检测到病毒。
图16显示在治疗前(基线)和治疗后几个时间点上，9个癌症患者血清中的sCD40L和RANTES浓度的评价。数据表示为平均值±SD。
图17显示，通过Kaplan-Meier分析获得的用溶瘤腺病毒Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L(在图17中称为CGTG-401)治疗的患者的总体存活(A,p=0.007)和无进展存活(B,p=0.146)。历史对照具有相似的包含和淘汰标准，且利用具有相同的衣壳但缺乏转基因的溶瘤腺病毒(Ad5/3-cox2L-D24)进行治疗。
发明详述
腺病毒载体
在Ad5中以及在其它腺病毒中，二十面体衣壳由三种主要蛋白质：六邻体(II)、五邻体基座(penton base)(III)和多节纤突(knobbedfiber)(IV)以及次要蛋白质：VI、VIII、IX、IIIa和IVa2组成(RussellW.C.,J General Virol2000;81:2573-2604)。蛋白质VII、小肽mu和末端蛋白质(TP)与DNA缔合。蛋白质V通过蛋白质VI提供至衣壳的结构连接。病毒编码的蛋白酶是加工一些结构蛋白质所需要的。
本发明的溶瘤腺病毒载体基于腺病毒血清型5型(Ad5)核酸主链，该核酸主链包含衣壳修饰例如腺病毒血清型3型(Ad3)的结(Ad5/3衣壳嵌合体)、E1区域上游的编码肿瘤特异性人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子的核酸序列(SEQ ID.NO:1)；和替代E3区域中的缺失的gp19k/6.7K序列(965个碱基对)的编码人CD40L的核酸序列(SEQ ID.NO:2)(图1a)。在本发明的优选实施方案中，腺病毒载体基于人腺病毒。此处使用的CD40L序列与人基因组序列(NG_007280.1)不同，以有利于在人样品中的检测。因此，本发明公开了CD40L的独特序列变体。
Ad5基因组包含侧翼连接有左和右末端反向重复(分别地LITR和RITR)的早期(E1-4)、中期(IX和IVa2)和晚期(L1-5)基因，其包含DNA复制所需的序列。基因组还包含包装信号(ψ)和主要晚期启动子(MLP)。
早期基因E1A的转录启动复制周期，随后表达E1B、E2A、E2B、E3和E4。E1蛋白以使细胞对病毒复制更易感的方式调节细胞代谢。例如，它们干扰NF-κB、p53和pRb-蛋白。E1A和E1B一起用于抑制细胞凋亡。E2(E2A和E2B)和E4基因产物介导DNA复制，E4产物也影响病毒RNA代谢并且阻止宿主蛋白质的合成。E3基因产物负责抵抗宿主免疫系统的防御，增强细胞裂解，并且释放病毒后代(RussellW.C.,J General Virol2000;81:2573-2604)。
中期基因IX和IVa2编码病毒衣壳的次要蛋白。晚期基因L1-5(其导致病毒结构组分的产生、病毒颗粒在细胞核中的衣壳化和成熟)的表达受MLP影响(Russell W.C.,J General Virol2000;81:2573-2604)。
与野生型腺病毒基因组相比较，本发明的腺病毒载体在E1区中，特别地在E1A区域的上游包含hTERT启动子，在E3区域中缺乏gp19k和6.7K，并且在病毒的纤突中包含衣壳修饰。在本发明的优选实施方案中，除了修正的/部分区域E1和E3外，本发明的溶瘤腺病毒载体还包含选自E2、E4和晚期区域的一个或多个区域。在本发明的优选实施方案中，溶瘤腺病毒载体包含下列区域：左ITR、部分E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分E3、L5、E4和右ITR。所述区域可以以任何顺序存在于载体中，但在本发明的优选实施方案中，所述区域按5'至3'的方向依次排列。开放阅读框架(ORF)可以在相同的DNA链或或在不同的DNA链中。在本发明的优选实施方案中，E1区域包含病毒包装信号。
如本文中所用，表述“腺病毒血清型5型(Ad5)核酸主链”是指Ad5的基因组或部分基因组，其包含选自Ad5来源的部分E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分E3、L5和E4的一个或几个区域。在优选实施方案中，本发明的载体包含具有Ad3的一部分(例如，衣壳结构的一部分)的Ad5核酸主链。
如本文中所用，表述“部分”区域是指，与相应野生型区域相比，缺乏任何部分的区域。例如，“部分E3”可以指缺乏gp19k/6.7K的E3区域。
如本文中所用，表述“VA1”和“VA2”是指病毒相关RNA1和2，其由腺病毒转录但不被翻译。VA1和VA2在抵抗细胞防御机制中具有作用。
如本文中所用，表述“病毒包装信号”是指病毒DNA的一部分，其由一系列富含AT的序列组成并且控制衣壳化过程。
E3区域不是病毒体外复制所必需的，但E3区域在宿主免疫应答的调控，即在抑制先天和特异性免疫应答中具有重要作用。E3中的gp19k/6.7K缺失是指，来自腺病毒E3A区域的965个碱基对的缺失。在所得的腺病毒构建体中，gp19k和6.7K基因都已缺失(Kanerva A等人,Gene Therapy2005;12:87-94)。已知gp19k基因产物结合主要组织相容性复合物I(MHC1)分子并且将其隔离(sequester)在内质网中，且防止细胞毒性T淋巴细胞识别感染的细胞。由于许多肿瘤缺乏MHC1，所以gp19k的缺失增强了病毒的肿瘤选择性(病毒比野生型病毒更快地从正常细胞清除但在肿瘤细胞中无差异)。6.7K的蛋白质在细胞表面上表达，它们参与下调诱导TNF相关细胞凋亡的配体(TRAIL)的受体2。
在本发明中，将CD40L转基因置于缺失gp19k/6.7k的E3区域中，处于E3启动子之下。这将转基因表达限制于允许病毒复制，且随后激活E3启动子的肿瘤细胞。E3启动子可以是本领域已知的任何外源或内源性启动子，优选内源性启动子。在本发明的优选实施方案中，编码CD40L的核酸序列处于病毒E3启动子的控制之下。
gp19k缺失在CD40L表达的背景中特别有用，因为其可增强保持该能力的此类肿瘤中的肿瘤表位的MHC1呈递。在该背景中，CD40L对APC和T细胞的刺激可产生最佳益处。
CD40L经由各种机制(包括招募细胞毒性T细胞、天然杀伤(NK)细胞、刺激抗原呈递细胞(APC)和下调抑制细胞例如调节性T细胞)起作用，从而增强免疫应答。APC随后可招募、活化T细胞并且将其靶向肿瘤。取决于待治疗的受试者，编码CD40L的核苷酸序列可来自任何动物例如人、猿、大鼠、小鼠、仓鼠、狗或猫，但优选在人的治疗的背景中CD40L由人序列编码。编码CD40L的核苷酸序列可进行修饰以增强CD40L的作用，或不进行修饰，即野生型序列。在本发明的优选实施方案中，编码CD40L的核酸序列经修饰具有不同于野生型序列的一个核苷酸，以允许在人样品中进行特异性检测。
外源性元件的插入可增强载体在靶细胞中的作用。外源组织或肿瘤特异性启动子的使用在重组腺病毒载体中是常见的。通过使用hTERT或hTERT的变体控制E1A区域，将病毒复制限制于靶细胞。在本发明的优选实施方案中，将hTERT置于E1A的上游，但除此之外或备选地，还可调节其它基因例如E1B或E4。“上游”是指在表达的方向上紧在E1区域之前。还可将外源绝缘子(insulator)即针对非特异性增强子的阻断元件、左ITR、天然E1A启动子或染色质蛋白质包含在重组腺病毒载体中。可任选地使用任何额外的组分或修饰，但其在本发明的载体中不是必须的。
本发明的溶瘤腺病毒载体包含衣壳修饰。大多数成人已被暴露于最广泛使用的腺病毒血清型Ad5，因此免疫系统可快速产生针对它们的中和抗体(NAb)。事实上，抗-Ad5NAb的流行可达到50%。已显示，可针对腺病毒衣壳的多个免疫原性蛋白质中的大多数诱导NAb，以及在另一方面，已显示Ad5纤突的结的甚至小的变化可允许逃脱衣壳特异性NAb。因此，结的修饰在接触腺病毒的情况下对于在人中保持或增加基因递送是非常重要的。
此外，已知Ad5通过纤突的结部分结合称为CAR的受体，并且该结部分或纤突的修饰可促进至靶细胞的进入，并且在许多或大多数癌症中引起增强的溶瘤作用(Ranki T.等人,Int J Cancer2007;121:165-174)。事实上，衣壳修饰的腺病毒是用于改善基因至癌细胞的递送的有利工具。
如本文中所用，“衣壳”是指病毒的蛋白质外壳，其包括六邻体、纤突和五邻体基座蛋白。本领域已知的任何衣壳修饰，即六邻体、纤突和/或五邻体基座蛋白的修饰(所述修饰促进病毒至肿瘤细胞的递送)可用于本发明。修饰可以是遗传和/或物理修饰，包括但不限于，用于整合配体(其识别特定细胞受体和/或阻断天然受体结合)的修饰，用其它腺病毒的结替代腺病毒载体的纤突或结结构域(嵌合体)的修饰，以及向腺病毒添加特定分子(例如，成纤维细胞生长因子2，FGF2)的修饰。因此，衣壳修饰包括但不限于，小肽基序、肽、嵌合体或突变至纤突(例如，至结、尾或轴部分内)、六邻体和/或五邻体基座内的掺入。在本发明的优选实施方案中，衣壳修饰是Ad5/3嵌合体，整联蛋白结合(RGD)区域和/或硫酸肝素结合多聚赖氨酸修饰至纤突的插入。在本发明的具体实施方案中，衣壳修饰为Ad5/3嵌合体。
如本文中所用，衣壳的“Ad5/3嵌合体”是指，其中纤突的结部分来自Ad血清型3型并且纤突的其余部分来自Ad血清型5型的嵌合体。
本发明的载体还可包含其它修饰，例如E1B区域的修饰。
如本文中所用，“RGD”是指精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序，其在五邻体基座上暴露并且与支持腺病毒内吞的细胞α-v-β-整联蛋白相互作用。在本发明的优选实施方案中，衣壳修饰为RGD-4C修饰。“RGD-4C修饰”是指，异源整联蛋白结合RGD-4C基序在纤突结结构域的HI环中的插入。4C是指4个半胱氨酸，其形成RGD-4C中的硫桥。编码具有RGD-4C肽的纤突的重组Ad5纤突基因的构建详细地描述于例如DmitrievI.等人的论文(Journal of Virology1998;72:9706-9713)中。
如本文中所用，“硫酸乙酰肝素结合多聚赖氨酸修饰”是指7个赖氨酸的区段至纤突结c-末端的添加。
可通过使用载体，将表达盒用于在靶例如细胞中表达转基因。如本文中所用，表述“表达盒”是指DNA载体或其部分，包含编码cDNA或基因的核苷酸序列以及控制和/或调控所述cDNA或基因的表达的核苷酸序列。可将相似或不同的表达盒插入一个载体或插入几个不同的载体。本发明的Ad5载体可包含几个或一个表达盒。然而，仅一个表达盒也是足够的。在本发明的优选实施方案中，溶瘤腺病毒载体包含至少一个表达盒。在本发明的优选实施方案中，溶瘤腺病毒载体仅包含一个表达盒。
包含本发明的腺病毒载体的细胞可以是任何细胞，例如真核细胞、细菌细胞、动物细胞、人细胞、小鼠细胞等。细胞可以是体外、离体或体内细胞。例如，细胞可用于体外、离体或体内产生腺病毒载体，或细胞可以是靶，例如肿瘤细胞，其已被腺病毒载体感染。
在于细胞中产生CD40L的方法中，包含本发明的载体的媒介物被运送至细胞内，CD40L基因进行表达，蛋白质被翻译并且以旁分泌的方式进行分泌。“媒介物”可以是任何病毒载体、质粒或其它工具，例如颗粒，其能够将本发明的载体递送至靶细胞。本领域已知的任何常规方法可用于将载体递送至细胞。
可通过本发明增加受试者的肿瘤特异性免疫应答。由于CD40L的表达，细胞毒性T细胞和/或天然杀伤细胞被刺激并且招募至肿瘤区域。在本发明的优选实施方案中，天然杀伤细胞和/或细胞毒性T细胞的量在靶细胞或组织中得到增加。为了跟踪或研究本发明的效果，可测定免疫应答的各种标志(例如炎症标志)。最常见的标志包括但不限于，促炎细胞因子、肿瘤或腺病毒特异性细胞毒性T细胞的增加、抗原呈递细胞的招募和活化或局部淋巴结的尺寸的增加。可按照本领域已知的任何常规方法研究此类标志的水平，包括但不限于利用抗体、探针、引物等的那些方法，例如ELISPOT测定、四聚体分析、五聚体分析以及血液或肿瘤中的不同细胞类型的分析。
癌症
本发明的溶瘤腺病毒载体经构建在表达人端粒酶逆转录酶(hTERT)的细胞中具有复制能力，该酶是人端粒酶的催化亚结构域。这些包括超过85%的人肿瘤，其被发现上调hTERT基因及其启动子的表达，然而大多数正常成人体细胞缺乏端粒酶或瞬时表达极低水平的该酶(Shay和Bacchetti1997,Eur J Cancer33:787-791)。
任何癌症或肿瘤，包括恶性和良性肿瘤以及原发性肿瘤和转移可以是基因疗法的靶，只要它们表达hTERT。在本发明的具体实施方案中，癌症是任何实体瘤。在本发明的优选实施方案中，癌症选自：鼻咽癌、滑膜癌(synovial cancer)、肝细胞癌、肾癌、结缔组织的癌症、黑素瘤、肺癌、肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、脑癌、喉癌、口癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、绒毛膜癌、胃泌素瘤、嗜铬细胞瘤、催乳素瘤、T细胞白血病/淋巴瘤、神经瘤、VHL病(von Hippel-Lindaudisease)、卓-艾综合征(Zollinger-Ellison syndrome)、肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、输尿管癌、少突胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、脑膜瘤、脊髓瘤、骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing'ssarcoma)、原发部位不明癌症(cancer of unknown primary site)、类癌(carcinoid)、胃肠道类癌、纤维肉瘤、乳腺癌、派杰氏病(Paget'sdisease)、宫颈癌、食道癌、胆囊癌、头部癌症(head cancer)、眼癌、颈癌、肾癌、肾母细胞瘤(Wilms'tumor)、卡波西肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、前列腺癌、睾丸癌、霍奇金氏病、非霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、内分泌胰腺癌、胰高血糖素瘤(glucagonoma)、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、垂体癌(pituitarycancer)、软组织肉瘤、视网膜母细胞瘤、小肠癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、滋养层癌症、葡萄胎、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、听神经瘤、蕈样肉芽肿病(mycosis fungoides)、胰岛素瘤、类癌综合征、生长抑素瘤(somatostatinoma)、牙龈癌(gum cancer)、心脏癌症(heart cancer)、唇癌、脑膜癌(meninges cancer)、口腔癌、神经癌、腭癌(palate cancer)、腮腺癌、腹膜癌、咽癌、胸膜癌、涎腺癌、舌癌和扁桃体癌。
药物组合物
本发明的药物组合物包含至少一种类型的本发明的载体。此外，组合物可包含至少两种、三种或四种不同的本发明的载体。除了本发明的载体以外，药物组合物还可包含任何其它载体，例如其它腺病毒载体，例如US2010166799A1中描述的那些载体、其它治疗有效试剂、任何其它试剂例如药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、佐剂、抗菌药(antiseptics)、填充剂、稳定剂或增稠剂和/或通常在相应产物中发现的任何组分。
药物组合物可以为适合于施用的任何形式，例如固体、半固体或液体形式。制剂可选自但不限于，溶液、乳剂、悬浮液、片剂、丸剂和胶囊。
在本发明的优选实施方案中，溶瘤腺病毒载体或药物组合物用作原位癌症疫苗。如本文中所用，“原位癌症疫苗”是指杀死肿瘤细胞并且还增加抗肿瘤细胞的免疫应答的癌症疫苗。病毒复制是免疫系统的强危险信号(=TH1型应答所需要的)，从而用作CD40L介导的APC成熟和活化以及NK细胞的招募的强有力共刺激因子。调节性细胞的抑制在这一点上是有帮助的。肿瘤细胞裂解还帮助呈递肿瘤片段和表位至APC，且其它共刺激由炎症产生。因此，不依赖于表位(即，非HLA限制性)的应答在各肿瘤的背景中产生，且原位发生。肿瘤特异性免疫应答在靶细胞中被激活，随后允许抗肿瘤活性在整个受试者水平上例如在远端转移中发生。载体的有效剂量取决于许多因素，包括需要治疗的受试者、肿瘤类型、肿瘤的位置和肿瘤的分期。剂量可例如从约108个病毒粒子(VP)变化至约1014个VP，优选从约5x109个VP变化至约1013个VP，更优选从约8x109个VP变化至约1012个VP。在本发明的一个具体实施方案中，剂量在约5x1010-5x1011VP的范围内。
药物组合物可通过本领域已知的任何常规方法，例如通过利用下列方法之任一种来产生：分批、分批补料和灌注培养模式、柱层析纯化、CsCl梯度纯化和利用低剪切力细胞保留装置的灌注模式。
施用
可将本发明的载体或药物组合物施用给选自植物、动物和人类的任何真核生物受试者。在本发明的优选实施方案中，受试者是人或动物。动物可选自宠物、家养动物和生产性动物(production animal)。
任何常规方法可用于将载体或组合物给受试者施用。施用途径取决于组合物的制剂或形式、疾病、肿瘤位置、患者、共病和其它因素。在本发明的优选实施方案中，通过瘤内、肌内、动脉内、静脉内、胸膜内、血管内、腔内或腹膜内注射或口服施用来进行施用。
本发明的溶瘤腺病毒载体的仅一次施用可具有疗效。然而，在本发明的优选实施方案中，在治疗期间，数次施用溶瘤腺病毒载体或药物组合物。可在前2周、4周、每月或在治疗过程中施用溶瘤腺病毒载体或药物组合物例如1至10次。在本发明的一个实施方案中，在前2周，随后在第4周，随后每月，施用3至7次。在本发明的具体实施方案中，在前2周，随后在第4周，随后每月，施用4次。治疗期的长度可发生变化，例如可持续2至12个月或更长时间。
此外，可优选将本发明的溶瘤腺病毒载体的施用与其它溶瘤腺病毒载体例如US2010166799A1中描述的载体的施用组合。施用可以是同时的或相继的。
为了避免受试者中的中和抗体，可在治疗之间改变本发明的载体。在本发明的优选实施方案中，与早期治疗的载体相比较，将具有不同的衣壳纤突结的溶瘤腺病毒载体给受试者施用。如本文中所用，“衣壳的纤突结”是指纤突蛋白的结部分(图1a)。或者，可将病毒的完整衣壳转变成不同血清型的衣壳。
本发明的基因疗法单独是有效的，但腺病毒基因疗法与任何其它疗法例如常规疗法的组合可比单独的任一种疗法更有效。例如，组合疗法的每一种试剂可在肿瘤组织中独立地工作，腺病毒载体可使细胞对化学疗法或放射疗法敏感和/或化学治疗剂可升高病毒复制的水平或影响靶细胞的受体状态。或者，组合可以以对于治疗的效力是有益的方式调节受试者的免疫系统。例如，化学疗法可用于下调抑制细胞例如调节性T细胞。可同时或相继地施用联合治疗的试剂。在本发明的优选实施方案中，患者同时接受环磷酰胺以增强治疗的免疫效应。
在本发明的优选实施方案中，所述方法或用途还包括给受试者施用同步放射疗法(concurrent radiotherapy)。在本发明的另一个优选实施方案中，所述方法或用途还包括给受试者施用同步化学疗法。在本发明的另一个优选实施方案中，所述方法或用途还包括给受试者施用其它溶瘤腺病毒或疫苗病毒。载体的施用可是同时的或相继的。
如本文中所用，“同步”是指在本发明基因疗法之前、之后或同时施用的疗法。同步疗法的时间段可从数分钟变化至数周。优选，同步疗法持续数小时。在一个实施方案中，以节律方式将环磷酰胺通过静脉团注和口服进行施用。
适用于联合治疗的试剂包括但不限于，所有反式视黄酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、爱波喜龙、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、氮芥、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。
在本发明的优选实施方案中，所述方法或用途还包括给受试者施用维拉帕米或另一种钙通道阻断剂。“钙通道阻断剂”是指一种药物和天然物质，其破坏钙通道的传导，其可选自维拉帕米、二氢吡啶、戈洛帕米、地尔硫卓、咪拉地尔、苄普地尔、氟司必林和芬地林。
在本发明的优选实施方案中，所述方法或用途还包括给受试者施用自噬诱导剂。自噬是指牵涉通过溶酶体机制降解细胞自己的组分的催化过程。“自噬诱导剂”是指能够诱导自噬的试剂，其可选自但不限于，mTOR抑制剂、PI3K抑制剂、锂、他莫昔芬、氯喹、巴弗洛霉素、坦西莫司、西罗莫司和替莫唑胺。在本发明的具体实施方案中，所述方法还包括给受试者施用替莫唑胺。替莫唑胺可以是口服或静脉内替莫唑胺。可将自噬诱导剂与免疫调节剂组合。在一个实施方案中，将编码CD40L的溶瘤腺病毒与替莫唑胺和环磷酰胺组合。
在本发明的一个实施方案中，所述方法或用途还包括施用化学疗法或抗-CD20疗法或用于阻断中和抗体的其它方法。“抗-CD20疗法”是指能够杀死CD20阳性细胞的试剂，其可选自利妥昔单抗和其它抗-CD20单克隆抗体。“用于阻断中和抗体的方法”是指能够抑制通常因感染而产生的抗-病毒抗体产生的试剂，其可选自不同的化学治疗剂、免疫调节物质、皮质激素和其它药物。此类物质可选自但不限于，环磷酰胺、环孢素、硫唑嘌呤、甲泼尼龙、依托泊苷、CD40L、CTLA4Ig4、FK506(他克莫司)、IL-12、IFN-γ、白细胞介素10、抗-CD8、抗-CD4抗体、骨髓脱离(myeloablation)和口服腺病毒蛋白质。
还可将本申请中描述的方法与能够克服中和抗体的分子组合。此类试剂包括脂质体、脂质复合物和聚乙二醇，可将所述试剂与病毒混合。或者，可利用由腺病毒衣壳蛋白组成的免疫血浆取出法柱(immunopheresis column)除去中和抗体。
本发明的溶瘤腺病毒载体诱导病毒体介导的肿瘤细胞的溶瘤作用并且激活抗肿瘤细胞的人免疫应答。在本发明的优选实施方案中，所述方法或用途还包括施用能够下调受试者的调节性T细胞的物质。“能够下调调节性T细胞的物质”是指减少鉴定为T抑制细胞或调节性T细胞的细胞的量。此类细胞已被鉴定为特征在于下列免疫表型标志的一个或多个：CD4+、CD25+、FoxP3+、CD127-和GITR+。减少T抑制细胞或调节性T细胞的此类试剂可选自抗-CD25抗体或化学治疗剂。
在本发明的优选实施方案中，所述方法或用途还包括给受试者施用环磷酰胺。环磷酰胺是常见化学治疗剂，其也已被用于一些自身免疫性障碍。在本发明中，环磷酰胺可用于增强病毒复制以及CD40L诱导的NK或细胞毒性T细胞的刺激(以增强抗肿瘤免疫应答)。其可以以静脉内团注剂量(bolus dose)或口服低剂量节律施用或它们的组合的方式使用。
本发明的任何方法或用途可以是体内、离体或体外方法或用途。
腺病毒用于治疗癌症的用途的一个可理解的限制是其免疫原性。然而，由于癌症患者的免疫系统因肿瘤环境的免疫抑制性质而不能消除肿瘤，因此腺病毒的免疫原性变成有利方面。在本发明中，该效应已通过保留复制能力和用免疫刺激分子CD40L武装来进行加强。本发明的腺病毒载体的特征在于4个重要方面。肿瘤转导(transduction)通过衣壳修饰(例如在Ad5衣壳中具有Ad3结的血清型嵌合体)来改善。通过将hTERT启动子插入在E1A之前来实现肿瘤选择性。通过用CD40L武装病毒来实现抗原呈递细胞的招募和刺激以诱导Th1型细胞毒性T细胞应答。最后，CD40L还可引起CD40+肿瘤的细胞凋亡。
本发明的腺病毒被发现在诱导CD40+和CD40-细胞的CD40L表达中是有效的。在溶瘤平台(该平台确保转导的肿瘤细胞最终被溶瘤作用杀死)中，CD40L从裂解的细胞的分泌或释放将引起对附近肿瘤细胞的细胞凋亡旁观者效应。然而，据信使用CD40L的主要有利方面是免疫刺激作用。
已显示溶瘤腺病毒Ad5/3-hTERT-E1A相较于野生型Ad5具有显著更高的溶瘤能力(Bauerschmitz GJ,等人,Cancer Res2008;68:5533-9)。在相同的研究中，当在一组特征在于不同组织特异性启动子例如α-乳清蛋白、环-加氧酶或多药抗性蛋白质的溶瘤腺病毒中比较hTERT选择性时，Ad5/3-hTERT-E1A展示最佳体外结果和显著的体内抗肿瘤作用。因此，Ad5/3-hTERT-E1A是本发明腺病毒的高标准(ambitious)对照病毒。
当将本发明的溶瘤腺病毒例如Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L与非武装的溶瘤腺病毒Ad5/3-hTERT-E1A相比较时，发现两种病毒在体内溶瘤效力方面同样地有效(图4c,4d)。这是重要的发现，因为转基因的表达有时可抑制病毒的效力，并且Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L，与Ad5/3-hTERT-E1A相比，在体外对A549细胞的作用更慢。在体外，Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L对CD40+EJ细胞比对CD40-A549细胞具有更强的抗肿瘤活性，然而对于Ad5/3-hTERT-E1A而言，情况则相反(图3c,3d)。
虽然本发明的溶瘤腺病毒例如Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L的最大效用可能出现在CD40+肿瘤的背景中，其中所有3种抗肿瘤活性(溶瘤作用、细胞凋亡、免疫刺激)都有贡献，但据信本发明的腺病毒的潜在效用不限于CD40+肿瘤。有报导显示，CD40L即使当肿瘤为CD40-时也激活抗原呈递细胞(Noguchi M,等人,Cancer Gene Ther2001;8:421-9;Sun Y,等人,Gene Ther2000;7:1467-76。由于甚至未武装的溶瘤腺病毒已在人中显示效用，因此，具有hCD40L的溶瘤腺病毒可代表改进，无论肿瘤的CD40状态如何。
在过去20年中，肿瘤免疫学和疫苗开发领域中的临床和临床前工作已证明，可通过几种方法实现抗肿瘤免疫应答的诱导。然而不幸地，目的在于诱导免疫应答的方法对于患有晚期的和高度免疫抑制的肿瘤的患者一直以来不是十分有效。相反地，第一个成功的免疫治疗剂的特征在于，受训的和经刺激的T细胞(以克服肿瘤介导的免疫抑制)或能够下调免疫抑制性的抗体(Motohashi等人2006Clin Cancer Res12:6079-86;Hodi等人2008Nature Clinical Practice Oncology5:557-561)。许多研究人员也使用预条件化(preconditioning)来为激活的T细胞“腾出空间”和减少免疫抑制细胞。因此，至关重要的经验是，打破肿瘤获得的免疫耐受性可能是成功的免疫疗法所需要的。
然而，本发明的腺病毒载体在患有难治性和免疫抑制性疾病的患者中显示抗肿瘤应答，并且这些效应与免疫的诱导和Th2至Th1的转变相关。
总之，通过利用本发明的表达CD40L的溶瘤腺病毒载体(包括Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L)，获得了显著的抗肿瘤效应。所述效应的重要部分是，诱导导致细胞毒性T细胞在肿瘤位置上的积累及其活化的Th1型免疫应答。
本发明通过下列实施例来举例说明，所述实施例无意以任何方式进行限定。
实施例
动物
所有动物实验方案都通过赫尔辛基大学的实验动物委员会和南芬兰的省政府评审和批准。4至5周龄的C57Black小鼠和NMRI裸小鼠获自Taconic(Ejby,Denmark)，并且在研究之前隔离检疫至少1周。小鼠的健康状态被频繁监测，只要疼痛或痛苦的任何征兆明显，就将它们杀死。
细胞系
对于免疫缺陷型模型，使用106个A549(人肺腺癌细胞系，可从美国典型培养物保藏中心,ATCC,10801University Boulevard,Manassas,Virginia20110-2209,USA获得)或EJ细胞(人膀胱癌细胞系，由Dr.Angelina Loskog，University of Uppsala,Sweden友好提供)。Ramos-BlueTM细胞系来自InvivoGen(San Diego,CA,USA)。
对于具有免疫能力的模型，将5x105个MB49细胞(小鼠膀胱癌细胞系，由Dr.Angelina Loskog，University of Uppsala,Sweden友好提供)皮下注射在C57Black小鼠(n=7只小鼠/组)的剃除体毛的胁腹上。当肿瘤达到约5x5mm的尺寸时，在第0、2和4天以3x108VP/肿瘤的剂量瘤内注射病毒3次。
统计分析
使用双尾学生t检验(two tailed Student's t-test)，且小于0.05的p值被认为是显著的。利用Kaplan-Meier分析处理存活数据。
实施例1.Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L、Ad5/3-CMV-hCD40L和Ad5/3-CMV-mCD40L的克隆
使用标准腺病毒制备技术(Kanerva A,等人,Mol Ther2002;5:695-704;Bauerschmitz GJ,等人,Mol Ther2006;14:164-74;Kanerva A和Hemminki A.,Int J Cancer2004;110:475-80;VolkAL,等人,Cancer Biol Ther2003;2:511-5)产生和扩增Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L(SEQ ID.NO:5)。简而言之，利用特异性引物(正向引物:TTTAACATCTCTCCCTCTGTGATT;SEQ ID NO:3和反向引物:TATAAATGGAGCTTGACTCGAAG;SEQ ID NO:4)(特征在于特异性限制位点SunI/MunI的插入)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增人CD40LcDNA(来自Prof Eliopoulos,University of Crete,Heraklion,Greece的友好礼物)。随后将PCR扩增产物亚克隆入pTHSN(Kanerva A.,等人,Gene Ther2005;12:87-94)，随后将其与pAd5/3-hTERT-E1A(Bauerschmitz GJ,等人,Cancer Res2008;68:5533-9)重组以产生pAd5/3-hTERT-E1A-hCD40L。利用PacI将该质粒线性化，并将其转染进入A549细胞以进行扩增和拯救。
利用PCR和多个限制性消化来确认所有阶段的克隆。对穿梭质粒pTHSN-hCD40L进行测序。利用PCR确认野生型E1的不存在。通过测序和PCR在最终的病毒中检查E1区域、转基因和纤突。在A549细胞上进行病毒产生的所有阶段(包括转染)以避免野生型重组的风险，如先前所描述的(Kanerva A等人2003,MolTher8,449-58;Bauerschmitz GJ等人2006,MolTher14,164-74)。hCD40L处于E3启动子之下(具体地处于内源病毒E3A基因表达控制元件之下)，这导致与复制相关的转基因表达，这始于感染后约8小时。除6.7K/gp19K的缺失外，E3是完整的。图1a显示pAd5/3-hTERT-E1A-hCD40L的结构。
为了构建非复制型腺病毒Ad5/3-CMV-hCD40L和Ad5/3-CMV-mCD40L，将具有hCD40L或mCD40L的表达盒插入pShuttle-CMV质粒(Stratagene,La Jolla,CA,USA)的多克隆位点。将穿梭质粒与pAdeasy-1.5/3质粒重组(Krasnykh VN,等人,J Virol1996;70:6839-46),所述pAdeasy-1.5/3质粒具有完整腺病毒基因组，将所得的拯救质粒转染至293细胞(人转化的胚肾细胞系，可从Microbix,Toronto,Ontario;Canada获得)以产生Ad5/3-CMV-hCD40L和Ad5/3-CMV-mCD40L。图1b和1c分别显示Ad5/3-CMV-hCD40L和Ad5/3-CMV-mCD40L的结构和克隆。
先前已报导了对照载体Ad5/3-Luc1(Kanerva A,等人,ClinCancer Res2002;8:275-80)和Ad5/3-hTERT-E1A(Bauerschmitz GJ,等人,Cancer Res2008;68:5533-9)。Ad5/3-Luc1、Ad5/3-hTERT-E1A、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L、Ad5/3-CMV-hCD40L和Ad5/3-CMV-mCD40L的VP对噬斑形成单位的比分别为25、31、200、138和86。
实施例2.构建的腺病毒的表达和功能性：体外和体内
使用流式细胞术和酶联免疫吸附测定(ELISA)来研究hCD40L表达。为了进行流式细胞术分析，在含有2%胎牛血清(FCS)的生长培养基中，利用Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L或Ad5/3-CMV-hCD40L以10VP/细胞感染人胚肾293细胞。用单独的2%的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)处理对照细胞(模拟试验)。24小时后，利用hCD40L-FITC(555699,BD Biosciences Pharmingen Franklin Lakes,NJ)抗体对细胞染色30分钟，或用同种型对照(IC)染色以测量来自细胞自身荧光和非抗原特异性结合的本底荧光。在BDLSR(BD Biosciences,FranklinLakes,NJ)上进行流式细胞术分析。
为了进行ELISA分析，诱导A549异种移植物和同基因MB49肿瘤，并如上利用Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L、Ad5/3-CMV-hCD40L或Ad5/3-CMV-mCD40L进行处理。在第一次病毒注射后第4、8和12天采集血液样品。为了分析用Ad5/3-CMV-hCD40L处理的小鼠的血清中的hCD40L，因快速的肿瘤生长且动物将在第8天被杀死，而仅采集血液2次(第4和8天)。按照制造商的方案，利用人CD40配体ELISA试剂盒(ELH-CD40L-001,RayBiotech Inc,NorcrossGA,USA)和小鼠sCD40L ELISA试剂盒(BMS6010,Bender Medsytems,Austria)测定血清中hCD40L和mCD40L的浓度。
图2a中显示的流式细胞术结果表明，具有复制能力的Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L和复制缺陷型Ad5/3-CMV-hCD40L导致CD40L的高体外表达。
还利用ELISA分析体内确认了hCD40L和mCD40L的表达(图2b)。Ad5/3-CMV-hCD40L导致比Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L更高的血清水平，因为转导的A549细胞为CD40-并且预期不被CD40L杀死。因此，转导的细胞无休止地继续产生CD40L，而Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L引起A549细胞的溶瘤作用，这限制了它们产生CD40L的时间。从安全性角度来说，这可能是有利的，因为当以高浓度存在时，CD40L可造成副作用。rhCD40L的人最大耐受剂量据报导相应于2900pg/ml的血清浓度，这为对于Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L看到的浓度的100倍。Ad5/3-CMV-mCD40L导致比Ad5/3-CMV-hCD40L更低的血清mCD40L水平，这可能是因为mCD40L被鼠组织和细胞代谢掉，而hCD40L可能不是这样(因为其在小鼠中无活性)。
在肺癌细胞(A549)中研究由Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L表达的CD40L的功能性。利用1000VP/细胞的Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L和Ad5/3-hTERT-E1A感染细胞系A549单层(5x106个细胞/T25培养瓶)，且一个培养瓶未被感染(模拟试验)。在感染后48小时收集上清液，利用0.02μm过滤器(Whatman6809-1002,Maidstone England,England)进行过滤。将上清液用于两个功能性测定。
在第一个功能性测定中，用质粒pNiFty-Luc(InvivoGen)转染EJ细胞系单层，培养过夜。pNiFty-Luc是组合5个NF-κB位点且编码萤光素酶的工程内皮细胞-白细胞粘附分子(ELAM)的启动子。NF-κB的诱导激活启动子，从而导致萤光素酶的表达。
将从A549单层收集的上清液添加在EJ细胞上，培养12小时。将1μg/ml重组hCD40L蛋白(Abcam,Cambridge,MA)用作测定的阳性对照。裂解细胞，测量萤光素酶活性(Luciferase Assay System,Promega,Madison,WI)。扣除模拟试验的值，将Nf-κB活性表示为萤光素酶表达的倍数增加(相对光单位,RLU)。进行测定3次，且每次测定以一式三份进行评估。数据表示为平均值±SEM;***,P<0.001(图2c)。
在RAMOS-Blue细胞上进行第二个功能性测定。Ramos-Blue细胞系是人B-淋巴细胞细胞系，其稳定地表达NF-κB/AP-1可诱导的SEAP报告基因。当被刺激时，此类细胞在上清液中产生SEAP，其可使用QUANTI-Blue测定试剂(InvivoGen,San Diego,CA,USA)来进行测量(图2d)。
这些功能性测定显示，病毒产生具有生物学活性的hCD40L。在用ELAM质粒(图2c)转染的EJ细胞中观察到，从具有复制能力的Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L腺病毒表达的hCD40L导致NF-κB激活的2.3倍增加，而在Ramos-Blue细胞中观察到NF-κB/AP-1的4.5倍增加(图2d)。综上，这些结果确认了，所构建的病毒在体外和体内以预期在人中是安全的水平(基于重组hCD40L的使用)表达功能性CD40L。
实施例3.所构建的腺病毒的溶瘤效力的体外评估
为了评估构建的腺病毒的溶瘤效力，使用EJ(CD40+)和A549(CD40-)细胞系。在细胞活力测定中，用不同浓度(0.1、1、10、100、1000VP/细胞)的悬浮于2%DMEM中的Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L、Ad5/3-CMV-hCD40L及其对照病毒Ad5/3-hTERT-E1A和Ad5/3-Luc1感染96孔板上的细胞。1小时后，洗涤细胞，将其在含有5%FCS的生长培养基中温育7天。随后使用MTS测定(Cell Titer96AQueous OneSolution Proliferation Assay,Promega)分析细胞活力。
对于Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L，在1000个病毒颗粒/细胞(VP/细胞)的情况下，在EJ(CD40+)细胞系中看到完全细胞杀伤(图3b)。在A549(CD40-)细胞系中，Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L的溶瘤效力慢于对照病毒Ad5/3-hTERT-E1A(图3a)。当比较以相同剂量用Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L感染的A549和EJ细胞系时，可看到EJ(CD40+)细胞的细胞杀伤的显著增加(图3C)。当用对照复制型腺病毒Ad5/3-hTERT-E1A感染时，相同的细胞系显示相反的结果：A549对病毒更敏感(图3d)。这些实验显示，Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L具有与对照病毒相当的溶瘤效力且比阳性对照病毒更高效地杀死CD40+细胞。
实施例4.表达hCD40L的腺病毒在小鼠中的体内效力
人腺病毒在小鼠细胞中不存在生产性复制以及hCD40L在小鼠组织中无活性使Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L的临床前评价变得复杂。因此，选择将3个抗肿瘤机制分为3个不同的小鼠模型。
对于免疫缺陷型模型，将106个A549细胞皮下注射至裸小鼠(n=5只小鼠/组)的胁腹。当肿瘤达到约5x5mm的尺寸时，在3天(第0、2和4天)中，用复制缺陷型腺病毒Ad5/3-CMV-hCD40L以108VP/肿瘤的剂量瘤内注射具有皮下A549(CD40-)(图4a)或EJ(CD40+)(图4b)的小鼠，跟踪肿瘤生长。模拟试验动物仅接受PBS。该实验显示，CD40L在CD40+细胞(图4b)中具有抗肿瘤活性，然而在CD40-细胞(图4a)中未看到抗肿瘤活性。
关于具有复制能力的模型，在3天(第0、2和4天)中，用Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L、Ad5/3-hTERT-E1A和模拟物以108VP/肿瘤的剂量瘤内注射肿瘤，将肿瘤体积相对于初始尺寸作图。发现在CD40阴性(图4c)和CD40阳性肿瘤(图4d)中，Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L与阳性对照病毒Ad5/3-hTERT-E1A同样有效。该实验证明了Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L的溶瘤效力，但未考虑CD40L的免疫学活性，因为hCD40L在小鼠中是无活性的。该实验还显示，Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L的溶瘤作用不被转基因表达阻止(图4c,4d)。
关于具有免疫能力的模型，在C57Black小鼠(n=7只小鼠/组)的剃除体毛的胁腹上皮下注射5x105个MB49细胞。当肿瘤达到约5x5mm的尺寸时，在第0、2和4天，以3x108VP/肿瘤的剂量瘤内注射Ad5/3-CMV-mCD40L病毒3次。跟踪肿瘤生长，在实验结束时收集器官/肿瘤。将组织包埋在石蜡中，进行组织学和免疫组织化学分析(参见下文中的实施例5)。
为了在无因免疫学效应而导致的混淆的情况下研究溶瘤作用与CD40L对细胞凋亡的诱导的效应，使用CD40+异种移植物模型(不具有T细胞的裸小鼠)。CD40L的表达本身具有抗肿瘤活性(图4b)，且Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L与阳性对照病毒一样有效，表明Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L的溶瘤作用未受到转基因表达的阻止(图4d)。
此外，为了显示CD40L在裸小鼠中促进CD40+肿瘤的细胞凋亡，用Ad5/3-Luc1(模拟)、Ad5/3-hTERT-E1A、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L、Ad5/3-CMV-hCD40L瘤内注射具有EJ(CD40+)肿瘤的小鼠3次。26天后，杀死动物，采集肿瘤，将其包埋在石蜡块中(n=5只小鼠/组)。进行胱天蛋白酶-3的免疫组织化学分析(关于详细内容，参见下文中的实施例5)以研究细胞凋亡的潜在诱导。虽然一些细胞凋亡由Ad5/3-hTERT-E1A(如对于溶瘤腺病毒报导的)和由Ad5/3-CMV-hCD40L(因其hCD40L表达和其细胞凋亡效应)诱导，但对于Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L，看到多得多的细胞凋亡(图5)。
实施例5.mCD40L在具有免疫能力的同基因动物中的抗肿瘤活性
如下在具有免疫能力的同基因动物模型中进行用于分析mCD40L的免疫组织化学分析。将组织固定在4%的福尔马林中，制备石蜡块。制备4μm厚的组织切片，以表1中所述的稀释度用一抗进行温育。使用LSAB2+Dako系统(DakoCytomation,Carpinteria,CA,USA(K0673))用针对兔的检测试剂盒，或用针对大鼠中产生的抗体的IHC Select试剂盒(DAB150-RT,Millipore,MA,USA)温育切片。利用苏木精对切片进行复染，将其于乙醇中脱水，在二甲苯中进行透明化，利用加拿大香树脂封片。利用配备有Axiocam(Zeiss)的Axioplan2显微镜(Carl Zeiss)拍摄图像。
表1.研究中使用的抗体
稀释因子 目录号 公司
FITC小鼠抗-人CD40L 1:5 555699 BD Pharmigen
FITC小鼠IgG1 1:5 555909 BD Pharmigen
抗人CD40 1:100 VP-C349 Vector Laboratories
兔抗-活性胱天蛋白酶-3 1:100 559565 BD Pharmigen
兔抗-小鼠F4/80 1:100 14-4801 ebioscience
大鼠抗-小鼠CD45 1:100 550539 BD Pharmigen
大鼠抗-小鼠CD19 1:50 14-0193 ebioscience
大鼠抗-小鼠CD4 1:50 14-0041 ebioscience
大鼠抗-小鼠CD8 1:100 14-0083 ebioscience
为了在无因溶瘤作用而导致的混淆的情况下研究CD40L的免疫学效应，在第0、2和4天以3x108VP/肿瘤的剂量，用复制缺陷型腺病毒Ad5/3-CMV-mCD40L或对照Ad5/3-Luc1瘤内注射具有皮下MB49肿瘤的C57Black小鼠(n=6只小鼠/组)。跟踪肿瘤尺寸，将其相对于第0天的尺寸作图。数据示于图6a中。在用Ad5/3-CMV-mCD40L处理的组中，抗肿瘤活性存在显著的增加(p=0.001)。
为了在用Ad5/3-CMV-mCD40L和Ad5/3-Luc1处理的肿瘤中进行细胞凋亡(活性胱天蛋白酶-3)的免疫组织化学分析，在第一次处理后16天收集肿瘤，分析胱天蛋白酶-3活性。结果示于图6b中。以褐色显示的阳性染色，即活性胱天蛋白酶-3表达，表明抗肿瘤活性部分归因于通过mCD40L对CD40+MB49细胞的结合诱导的细胞凋亡(图6b)。
为了在同基因小鼠模型中分析宿主免疫应答，通过不同标记：巨噬细胞(F4/80)、白细胞(CD45)和B淋巴细胞(CD19)的免疫组织化学对4μm肿瘤切片进行染色(图7a)。还对肿瘤切片的辅助(CD4+)和细胞毒性(CD8+)T细胞(褐色)进行染色(图7c)。
实施例6.对抗原呈递细胞的作用
编码CD40L的病毒的推定的抗肿瘤活性的重要部分是，它们对抗原呈递细胞的作用。按照制造商的方案(BD Cytometric Bead ArrayMouse Flex Sets,BD Biosciences)，使用BD FACSArray对来自用Ad5/3Luc1或Ad5/3-CMV-mCD40L处理的小鼠的血清和培养的脾细胞的上清液的IL-12、TNF-α、INF-γ和RANTES进行细胞因子分析。将脾切碎，将脾细胞培养在补充有1%L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的10%的DMEM中。在24、48和72小时收集上清液，利用FACSArray分析其细胞因子。
FACSArray分析在用Ad5/3-CMV-mCD40L处理的组中显示增加的INF-γ、TNF-α、RANTES和IL-12产量(图7A)。IL-12的诱导表明巨噬细胞(一个重要的抗原呈递细胞类别)的活化。INF-γ、TNF-α和RANTES是Th1型免疫的指标，且表明细胞毒性T细胞应答的诱导。
为了在细胞水平上进行关联，分析在Ad5/3-CMV-mCD40L注射后16天收集的肿瘤的组织学切片。观察到巨噬细胞(F4/80)和白细胞(CD45)的增加的招募，但只看到B淋巴细胞(CD19)的少量增加，这表明浸润主要是T细胞(图7b)。T细胞亚组的分析显示，此类细胞的大多数为CD8+细胞毒性T细胞，虽然也看到CD4+辅助T细胞的较少量增加(图7c)。这些发现表明，在具有免疫能力的动物模型中，mCD40L在同基因MB49肿瘤中的产生促成强抗肿瘤免疫应答(通过Th1应答元件和细胞毒性T细胞浸润介导)(图7)。
实施例7.用于预测人患者中的疗效的肿瘤样品的预处理分析
对于一个患者(R73)，获得新鲜预处理的恶性胸腔积液用于细胞杀伤测定(MTS测定)。具有嵌合Ad5/3衣壳(与Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L相同的衣壳)的溶瘤腺病毒，相较于具有血清型5型衣壳的溶瘤腺病毒，显示更高效的对患者的胸腔积液细胞的杀伤。有趣地，该患者的肿瘤标志Ca15-3在用Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L治疗后逐渐减少，且在治疗后74天看到44%的减少(表3)。数据表明，具有嵌合Ad5/3衣壳的腺病毒高效地杀伤人肿瘤细胞，且离体细胞杀伤测定可用于测试或预测临床效用。
实施例8.Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L在人癌症患者中的安全性和效力
I.患者
在Finnish Medicines Agency管理的Advanced Therapy Access项目中招募了患有晚期和难治性实体瘤的患者。表2和3中列出了关于接受Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L的患者、剂量和先前治疗的信息。
利用Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L的单次治疗(R73)或利用Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L的一系列治疗(T181、C239、I244、P251、N235、C220)用于瘤内、静脉内或腹膜内治疗9个患有标准疗法难以治疗的晚期实体瘤的患者(3个女性(R73、N235、R8)和6个男性(T181、C239、C229、I244、P251、C220))(表2)。患者C229接受利用Ad5-RGD-D24-GMCSF(PCT/FI2009/051025)和Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L的一系列治疗，患者R8接受利用Ad5-D24-GMCSF、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L和Ad3-hTERT-E1(WO2010/086838)的一系列治疗。选择标准是常规疗法难以治疗的实体瘤、WHO表现评分为3或更低，以及无主要器官功能缺陷。淘汰标准是器官移植、HIV、严重心血管病、代谢病或肺病或阻碍溶瘤病毒治疗的其它症状、发现或疾病。获得书面知情同意，并遵循Good Clinical Practice和Declaration of Helsinki，施用治疗。
Figure BDA00003144180800361
II.利用编码hCD40L的腺病毒载体的治疗
Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L和Ad5-RGD-D24-GM-CSF根据临床等级而产生，并开始患者的治疗。
使用两个不同的施用方案。对于第一轮的系列治疗，4个患者(C229、I244、P251、R8)瘤内(或者对于患有腹膜疾病的患者R8，腹膜内)接受4/5的剂量和静脉内接受1/5的剂量，同时另外4个患者(T181、C239、N235、C220)仅接受瘤内注射。对于后一轮的治疗，瘤内治疗所有患者。患者R73接受单轮治疗，并且瘤内提供一半剂量以及腹膜内提供一半剂量。
病毒剂量示于表2中。对于其它溶瘤病毒，基于发明人的先前数据选择剂量。
在适当的条件下在施用时将病毒稀释在无菌盐水溶液中。在病毒施用后，在医院监测所有患者过夜，随后在接下来的4周作为门诊病人进行监测。在每一次就诊时进行体格评价和医疗史记录，跟踪临床相关实验室值。
按照Common Terminology for Adverse Events v3.0(CTCAE)记录治疗的副作用，并且对其进行评分。由于许多癌症患者具有因疾病而产生的症状，因此，如果它们不恶化，则不对预先存在的症状进行评分。然而，如果症状变得更严重，例如治疗前的等级1在治疗后变成等级2，则将其评分为等级2。
利用造影剂增强的计算机断层摄影术(CT)扫描评价肿瘤尺寸。获得最大肿瘤直径。将实体瘤的应答评价标准(RECIST1.1)用于总体疾病，包括注射的和非注射的损伤。这些标准是：部分应答PR(肿瘤直径之和的大于30%的减小)、稳定的疾病SD(无减小/增加)、进行性疾病PD(大于20%的增加)。未满足PR的明显的肿瘤减小被评分为最小应答(minor responses，MR)。当在基线上升高时，还评价血清肿瘤标志，并且使用相同的百分比。
按照制造商的说明书，利用Becton-Dickinson细胞因子多重珠粒阵系统(BD FACSArray;BD Biosciences,San Jose,CA)分析患者血清样品的Th1型细胞因子：干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-2(IL-2)，以及Th2细胞因子：白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)和白细胞介素10(IL-10)。样品包括基线，在病毒治疗后1个月，或在病毒治疗后2个月。
III Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L在癌症患者中的安全性
表4概述了在病毒治疗期间和之后记录的不良事件。按照CommonTerminology for Adverse Events v3.0(CTCAE)对不良事件进行分级。
Figure BDA00003144180800401
Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L被很好地耐受，直至所使用的最高剂量：5x1011VP/患者。未看到等级4-5的不良事件。接受使用Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L的单次治疗的患者仅经历等级1的症状，然而接受系列治疗的患者经历等级1至3的症状，包括疲劳、恶心和肝酶的瞬间升高。
IV.中和抗体滴度
测量患者T181和C239的抗Ad5/3衣壳的中和抗体(NAb)(表5)。将293细胞以1x104个细胞/孔接种在96孔板上，并且培养过夜。第二天，用不含FCS的DMEM洗涤细胞。为了灭活补体，将人血清样品在56℃下温育90分钟。在无血清DMEM中制备4倍系列稀释物(1:1至1:16384)(Sarkioja M等人2008,Gene Ther15(12):921-9)。将Ad5/3luc1与血清稀释物混合，在室温下温育30分钟。随后，在50μl的上述混合物中，用100VP/细胞感染一式三份的细胞，1小时后，添加100μl具有10%FCS的生长培养基。感染后24小时，裂解细胞，利用TopCount照度计(PerkinElmer,Waltham,MA)使用萤光素酶测定系统(Promega,Madison,WI)测量萤光素酶活性。将萤光素酶读数相对于利用单独的Ad5/3luc1获得的基因转移作图，以评价用病毒治疗的患者的血清中的中和抗体的作用。
数据在表5中显示为，引起80%的Ad5/3-luc1(衣壳与Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L相同)至293细胞的基因转移的抑制的血清稀释因子。患者T181在治疗之前已具有高NAb滴度，且在治疗期间未看到改变。患者C239最初显示低NAb滴度。第一次治疗诱导高NAb产量，该产量随着治疗下降至中等水平。这在用溶瘤病毒治疗的患者中是不常见的(通常滴度持续增加)，且可以是Th2->Th1活性的指标。
V.效力评价
表5还报导了根据计算机断层摄影术(CT)的RECIST标准(Therasse P等人2000,J Natl Cancer Inst92,205-16)或正电子发射断层成像计算断层摄影术(PET-CT)的PERCIST标准(Wahl等人2009J Nucl Med50Suppl1:122S-50S)的Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L的效力评价。所有患者在治疗之前具有进行性肿瘤。患者T181具有稳定的疾病(SD)，患者C239具有稳定的代谢疾病(SMD)，患者C229具有进行性疾病(PD)，患者I244具有SMD，患者P251具有PD，以及患者R8具有SD。在针对在基线已具有升高的标志的患者而评价的肿瘤标志方面，患者R73具有完全应答(CR)，患者T181和N235分别显示-56%和-58%的部分应答，患者R8显示-16%的最小应答(MR)，患者C229具有稳定的疾病，然而患者C239、P251和C220在肿瘤标志上显示进行性疾病(表5)。患者的总存活也示于表5中。
总体上，在7/9的患者中看到抗肿瘤效力的迹象。
除了抗肿瘤活性的客观测量外，我们还在几种情况下看到临床和/或主观益处。患者C229经历表现状态的改善(在病毒治疗之前为WHO2，在用CGTG-401系列治疗之后为WHO1)，患者I244在全身症状上获益。
为了进行Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L治疗的患者的总体存活分析，将用具有相同衣壳的未武装的溶瘤腺病毒(Ad5/3-D24-Cox2L)治疗的癌症患者用作对照。将存活数据绘制入Kaplan-Meier曲线，利用时序检验比较组群。在该非随机化比较中，Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L(图17中称为CGTG-401)和Ad5/3-D24-Cox2L治疗的患者的中位OS分别为304天和105天(p=0.017)(图17)。
VI.用溶瘤腺病毒Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L治疗后的Th1和Th2免疫应答和炎性/毒性相关细胞因子应答
按照制造商的说明书，使用Becton-Dickinson细胞因子多重珠粒阵列系统(BD FACSArray;BD Biosciences,San Jose,CA)分析患者血清样品的Th1诱导的细胞因子：干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-2(IL-2)或Th2细胞因子：白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)和白细胞介素10(IL-10)。在图10的左侧显示Th1诱导的细胞因子，在右侧显示Th2诱导的细胞因子。之前=在提供病毒之前采集的血清样品；1个月=在病毒治疗后1个月采集的血清样品；2个月=在病毒治疗后2个月采集的血清样品。
在图11中，报导了相对于其基线水平的细胞因子水平，所述基线水平被设置为1，计算每一个时间点的Th1/Th2之间的比率。1个月=在病毒治疗后1个月采集的血清样品；2个月=在病毒治疗后2个月采集的血清样品。高于1的比率表示Th1型免疫应答占优势，然而低于1的比率表示Th2型免疫应答占优势。
测量白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的血清水平以进一步评价治疗的安全性。IL-6和TNF-α已被提议为急性腺病毒毒性的敏感标志，但在治疗后在此类细胞因子中未看到显著增加(图13)。此外，未看到白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)、干扰素-γ(IFN-γ)的血清水平的治疗后增加(图13)。
VII用溶瘤腺病毒Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L治疗后识别腺病毒和肿瘤抗原的T细胞的诱导
溶瘤性细胞死亡允许免疫系统获得识别和杀死肿瘤细胞的能力。这对于肿瘤根除是潜在有益的并且可有利于治愈。腺病毒在施用后在相对短的时间内被从身体清除掉；因此，刺激免疫系统以能够识别特异性肿瘤抗原(从而治疗可导致针对患者的持续有益效应)变得至关重要。此外，当诱导或存在抗体时，病毒可被部分或完全中和，从而其可失去其感染和杀伤转移灶的效力。然而，诱导的抗肿瘤的效应T细胞或NK细胞自由地循环，并最终杀死远离注射的肿瘤的转移灶。
为了证明溶瘤腺病毒Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L能够诱导识别腺病毒的T细胞，分离总PBMC，用腺病毒5型的五邻体衍生的肽库脉冲总PBMC，以通过干扰素γELISPOT评价腺病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的活化(图9)。患者T181在治疗后显示减少数目的识别腺病毒的T细胞，然而患者C239在治疗后显示此类细胞的数目的增加。已表明，抗病毒免疫应答可以是由溶瘤病毒介导的总的抗肿瘤效应的重要部分(Alemany2008,Lancet Oncol9:507-8;Prestwich等人2008,Lancet Oncol9:610-2;Tuve等人2009,Vaccine27:4225-39)。
此外，为了进行腺病毒ELISPOT，用HAdv-5五邻体肽库(ProImmune,Oxford,UK)刺激来自患者的外周单核细胞(PBMC)。为了进行肿瘤抗原ELISPOT，使用BIRC5PONAB肽，即存活素(ProImmune)。在该测定中未进行PBMC的预刺激或克隆性扩增，从而结果表示这些细胞在血液中的实际频数。
8个可评价的患者中有4个(C239、P251、I244、C220)显示全身性腺病毒特异性PBMC的增加，这表示抗腺病毒免疫的诱导(图12A)。两个患者(T181、R73)显示减少，这可归因于细胞至肿瘤(此处病毒浓度最高)的运输。患者N235显示在病毒注射后5周腺病毒特异性PBMC的少量增加，但在第一次治疗9周后未看到循环的腺病毒特异性PBMC。R8显示恒定低的或不可检测水平的循环的腺病毒特异性PBMC。
关于存活素特异性应答，8个可评价的患者中有4个(P251、N235、C220、I244)在治疗后显示增加数目的PBMC(图12B)。在患者R73和R8中看到，肿瘤特异性T细胞的数目的减少，这可能表明至肿瘤位置的运输。患者T181和C239具有不可检测水平的循环的存活素特异性PBMC。
VIII患者PBMC的细胞内细胞因子的分析
存活素是用于估计肿瘤特异性免疫的有用的原型靶，因为其被大多数肿瘤表达。然而，其可能不是最具免疫原性的表位，从而抗存活素T细胞可低估抗肿瘤免疫的诱导。抗肿瘤细胞的离体扩增，随后针对肿瘤特异性表位库的反应性的测试，可提供关于抗肿瘤免疫的另一种观点，因此，当可获得充足的细胞数目时，通过细胞内细胞因子分析测量肿瘤特异性CD8+和CD4+T细胞。
在解冻后，用六邻体和五邻体肽的hAd5混合物或用根据癌症类型选择的3-7TAA PepMixes的混合物以1μg/mL的浓度脉冲刺激PBMC。在刺激后，用CTL生长培养基RPMI1640(HyClone,Logan,UT)+Click's培养基(EHAA;Irvine Scientific,Santa Ana,CA)(1:1,补充有5%人AB血清(Valley Biomedical)和2mmol/L L-谷氨酰胺(GlutaMAX TM-I;Invitrogen,Carlsbad,CA)，含有IL-4和IL-7(hAd5-脉冲的细胞)或IL-12和IL-7(TAA-脉冲的细胞;R&D Systems,Minneapolis,MN)；对于IL-4，1000U/mL的浓度；和对于IL-7和IL-12，10ng/mL的浓度)饲养细胞。在培养10天后，用hAd5或TAA肽混合物再刺激细胞(如先前添加CD28和CD49(0.1μg/ml;BD,Franklin Lakes,NJ,USA)以进行共刺激一样)，然后用抗CD3和CD8的单克隆抗体(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)以饱和量(5μl)对表面进行染色。用20μl FITC-抗-IFN-γ或Pe-抗-TNF-α-抗体(BD Biosciences)对细胞的细胞因子进行染色，使用配备有CellQuest软件的FACSCalibur(BD,San Diego,CA)进行分析。
患者T181和C239在所有治疗后测量中显示肿瘤特异性CD8+T细胞的增加(图14A)。关于CD4+细胞，T181和P251相较于基线显示增加(图14B)。此外，研究患者C239的识别腺病毒的CD4+T-细胞的数目，在病毒施用后3周看到瞬间增加(图14C)，这确证了ELISPOT数据(参见第VII项)。
IX.CD40L和RANTES的局部和全身性水平的分析
为了评估恶性腹水中的CD40L和RANTES(其表达部分由CD40L决定的下游分子)的局部水平，评估液体中可溶性CD40L(sCD40L)和RANTES的浓度，将其与这类细胞因子的全身性水平相比较(分别地图15A和图15B)。在病毒施用之前和施用后28天从患者R8的腹腔取出恶性腹水(由腹膜肿瘤团块产生)，使用BD Cytometric Bead Array(CBA)Human Soluble Protein Flex Set(BD,San Diego,CA)分析CD40L和RANTES的浓度。sCD40L和RANTES的水平在肿瘤中都局部升高，然而未看到全身性水平的升高。
此外，分析腹水(图15C)和从腹水分离的细胞(图15D)中的病毒粒子(VP)的量以评估病毒在肿瘤位置的复制。使用靶向侧翼于CD40L序列的E3区域的引物和探针(正向引物5'-CCGAGCTCAGCTACTCCATC-3',SEQ ID NO:6,反向引物5'-GCAAAAAGTGCTGACCCAAT-3',SEQ ID NO:7和探针onco5'FAM-CCTGCCGGGAACGTACGATG-3'MGBNFQ,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10)通过qPCR进行分析。在病毒治疗后第28天，在腹水和细胞中发现了表示在肿瘤中的复制的大量病毒，然而在同一天在血清中未发现病毒。
因此，sCD40L和RANTES的水平在肿瘤处局部升高，然而未看到全身性水平的升高，这表明免疫学作用限制于肿瘤位置。
为了进一步确认免疫学作用是限制于局部的，在病毒治疗之前和之后评估全部9个患者的sCD40L和RANTES的全身性水平。在任何患者中未观察到显著增加，这表明免疫学作用局限于肿瘤位置，如通过病毒设计所预测的(图16)。在治疗之前(基线)和在治疗后的几个时间点上采集全部9个患者的血液样品。评估血清中的可溶性CD40L(sCD40L)和RANTES的浓度。数据表示为平均值±SD。
Figure IDA00003144181400011
Figure IDA00003144181400021
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Figure IDA00003144181400151
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Claims (33)

1.一种溶瘤腺病毒载体，其包含
1)包含衣壳修饰的腺病毒血清型5型(Ad5)核酸主链,
2)位于E1区域上游的编码肿瘤特异性人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子的核酸序列；和
3)替代E3区域中的缺失的腺病毒基因gp19k/6.7K的编码人CD40L的核酸序列。
2.权利要求1的溶瘤腺病毒载体，其还包含选自E2、E4和晚期区域的一个或多个区域。
3.权利要求1或2的溶瘤腺病毒载体，其包含下列区域：左ITR、部分E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分E3、L5、E4和右ITR。
4.权利要求3的溶瘤腺病毒载体，其中所述区域按5'至3'的方向依次排列。
5.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其中野生型区域位于E1区域的上游。
6.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其中所述E1区域包含病毒包装信号。
7.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其中编码CD40L的核酸序列处于病毒E3启动子的控制之下。
8.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其中编码CD40L的核酸序列与野生型人序列相异于一个核苷酸。
9.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其中E4区域是野生型的。
10.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其中所述衣壳修饰是Ad5/3嵌合体、整联蛋白结合(RGD)区域和/或硫酸肝素结合多聚赖氨酸修饰至纤突的插入。
11.权利要求10的溶瘤腺病毒载体，其中所述衣壳修饰是Ad5/3嵌合体。
12.权利要求10的溶瘤腺病毒载体，其中所述衣壳修饰是RGD-4C修饰。
13.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其包含至少一个表达盒。
14.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其仅包含一个表达盒。
15.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其中所述载体能够在表达端粒酶的细胞中选择性复制。
16.一种细胞，其包含权利要求1-15的任一项的腺病毒载体。
17.一种药物组合物，其包含权利要求1-15的任一项的腺病毒载体。
18.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体或药物组合物，其用作原位癌症疫苗。
19.权利要求1-15的任一项的腺病毒载体，其用于治疗受试者的癌症。
20.一种治疗受试者的癌症的方法，其中所述方法包括给受试者施用权利要求1-15或17的任一项的载体或药物组合物。
21.权利要求19-20的腺病毒载体或方法，其中所述癌症选自：鼻咽癌、滑膜癌、肝细胞癌、肾癌、结缔组织的癌症、黑素瘤、肺癌、肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、脑癌、喉癌、口癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、绒毛膜癌、胃泌素瘤、嗜铬细胞瘤、催乳素瘤、T细胞白血病/淋巴瘤、神经瘤、VHL病、卓-艾综合征、肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、输尿管癌、少突胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、脑膜瘤、脊髓瘤、骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、原发部位不明癌症、类癌、胃肠道类癌、纤维肉瘤、乳腺癌、派杰氏病、宫颈癌、食道癌、胆囊癌、头部癌症、眼癌、颈癌、肾癌、肾母细胞瘤、卡波西肉瘤、前列腺癌、睾丸癌、霍奇金氏病、非霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、内分泌胰腺癌、胰高血糖素瘤、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、垂体癌、软组织肉瘤、视网膜母细胞瘤、小肠癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、滋养层癌症、葡萄胎、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、听神经瘤、蕈样肉芽肿病、胰岛素瘤、类癌综合征、生长抑素瘤、牙龈癌、心脏癌症、唇癌、脑膜癌、口腔癌、神经癌、腭癌、腮腺癌、腹膜癌、咽癌、胸膜癌、涎腺癌、舌癌和扁桃体癌。
22.权利要求19-21的腺病毒载体或方法，其中所述受试者是人或动物。
23.权利要求19-22的任一项的腺病毒载体或方法，其中通过瘤内、肌内、动脉内、静脉内、胸膜内、血管内、腔内或腹膜注射或口服施用来进行施用。
24.权利要求19-23的任一项的腺病毒载体或方法，其中在治疗期间施用所述溶瘤腺病毒载体或药物组合物数次。
25.权利要求19-24的任一项的腺病毒载体或方法，其中将与早期治疗的载体相比，具有不同的衣壳纤突结的溶瘤腺病毒载体施用给受试者。
26.权利要求19-25的任一项的腺病毒载体或方法，其中所述方法还包括给受试者施用同步放射疗法或同步化学疗法。
27.权利要求19-26的任一项的腺病毒载体或方法，其中所述方法还包括在受试者中给受试者施用辅助剂，其选自维拉帕米或另一种钙通道阻断剂；自噬诱导剂；替莫唑胺；能够下调调节性T细胞的物质；环磷酰胺及其任何组合。
28.权利要求19-27的任一项的腺病毒载体或方法，其中所述方法还包括，施用化学疗法或抗-CD20疗法或用于阻断中和抗体的其它方法。
29.一种在细胞中产生CD40L的方法，其中所述方法包括：
a)将包含权利要求1-15任一项的溶瘤腺病毒载体的媒介物运送至细胞，和
b)在细胞中表达所述载体的CD40L。
30.一种增强受试者的肿瘤特异性免疫应答的方法，其中所述方法包括：
a)将包含权利要求1-15任一项的溶瘤腺病毒载体的媒介物运送至靶细胞或组织，
b)在细胞中表达所述载体的CD40L，和
c)在所述靶细胞或组织中增加细胞毒性T细胞和/或天然杀伤细胞的量或活性。
31.权利要求1-15任一项的溶瘤腺病毒载体的用途，其用于在细胞中产生CD40L。
32.权利要求1-15任一项的溶瘤腺病毒载体的用途，其用于增强受试者的肿瘤特异性免疫应答、Th1->Th2转换或降低免疫抑制。
33.权利要求32的溶瘤腺病毒载体的用途，其中天然杀伤细胞和/或细胞毒性T细胞的量在靶细胞或组织中增加，或者抑制细胞(例如调节性T细胞)减少。
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