FI124926B - Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä - Google Patents

Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä Download PDF

Info

Publication number
FI124926B
FI124926B FI20105988A FI20105988A FI124926B FI 124926 B FI124926 B FI 124926B FI 20105988 A FI20105988 A FI 20105988A FI 20105988 A FI20105988 A FI 20105988A FI 124926 B FI124926 B FI 124926B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
cancer
adenoviral vector
cells
oncolytic
tumor
Prior art date
Application number
FI20105988A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20105988A0 (fi
FI20105988A (fi
Inventor
Iulia Diaconu
Sari Pesonen
Akseli Hemminki
Cerullo Vincenzo
Original Assignee
Oncos Therapeutics Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oncos Therapeutics Oy filed Critical Oncos Therapeutics Oy
Publication of FI20105988A0 publication Critical patent/FI20105988A0/fi
Priority to FI20105988A priority Critical patent/FI124926B/fi
Priority to JP2013529692A priority patent/JP2013541945A/ja
Priority to US13/825,415 priority patent/US20130323205A1/en
Priority to CA2812096A priority patent/CA2812096A1/en
Priority to KR1020137010384A priority patent/KR20130138245A/ko
Priority to AU2011306846A priority patent/AU2011306846B2/en
Priority to BR112013006669A priority patent/BR112013006669A2/pt
Priority to RU2013118724/10A priority patent/RU2013118724A/ru
Priority to PCT/FI2011/050826 priority patent/WO2012038607A1/en
Priority to CN201180053316.1A priority patent/CN103221423B/zh
Priority to EP11770847.9A priority patent/EP2619224A1/en
Priority to SG2013019112A priority patent/SG188550A1/en
Publication of FI20105988A publication Critical patent/FI20105988A/fi
Priority to ZA2013/01862A priority patent/ZA201301862B/en
Application granted granted Critical
Publication of FI124926B publication Critical patent/FI124926B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä
Keksinnön ala
Esillä oleva keksintö liittyy biotieteiden ja lääketieteen aloihin. Erityisesti keksintö liittyy syöpähoitoihin. Tarkemmin sanottuna esillä oleva keksintö koskee onkolyyttisiä adenovirusvektoreita ja mainittuja vektoreita käsittäviä in vitro -soluja ja farmaseuttisia koostumuksia. Esillä oleva keksintö koskee myös mainittuja vektoreita ja farmaseuttista koostumusta käytettäviksi kohteen syövän hoitoon. Lisäksi esillä oleva keksintö koskee in vitro -menetelmää CD40L:n tuottamiseksi solussa ja onkolyyttistä adenovirusvektoria käytettäväksi kasvainspesifisen immuunivasteen ja apoptoosin lisäämiseksi kohteessa sekä onkolyyttisten adenovirusvektoreiden käyttöön CD40L:n tuottamiseksi solussa in vitro.
Keksinnön tausta
Syöpää voidaan hoitaa leikkauksella, hormonihoidoilla, kemoterapi-oilla, sädehoidoilla ja/tai muilla hoidoilla, mutta useissa tapauksissa syöpiä, joille on usein tunnusomaista se, että ne ovat pitkälle edenneessä vaiheessa, ei voida parantaa nykyisillä hoidoilla. Tämän vuoksi tarvitaan uusia syöpäsoluihin kohdistuvia lähestymistapoja, kuten geenihoitoja.
Viimeisten kahdenkymmenen vuoden aikana geeninsiirtoteknologi-aa on tutkittu runsaasti. Syövän geenihoitojen tarkoituksena on viedä terapeuttinen geeni kasvainsoluun. Nämä kohdesoluun viedyt terapeuttiset geenit voivat esimerkiksi korjata mutatoituneita geenejä, suppressoida aktiivisia onko-geenejä tai luoda soluun lisäominaisuuksia. Sopivia eksogeenisiä terapeuttisia geenejä ovat, mainittuihin rajoittumatta, immunoterapeuttiset, antiangiogeeni-set ja kemoprotektiiviset geenit sekä "itsemurhageenit", ja ne voidaan viedä soluun hyödyntämällä modifioituja virusvektoreita tai ei-viraalisia menetelmiä, kuten esimerkiksi elektroporaatio, geenipyssyja lipidi- tai polymeeripäällysteet.
Optimaalisten virusvektoreiden vaatimuksiin kuuluu tehokas kyky löytää spesifisiä kohdesoluja ja ilmentää virusgenomia kohdesoluissa. Lisäksi optimaalisten vektoreiden tulee pysyä aktiivisina kohdekudoksissa tai -soluissa. Kaikkia näitä virusvektoreiden ominaisuuksia on kehitetty viimeisten vuosikymmenien aikana, ja esimerkiksi retrovirus- ja adenovirusvektoreita ja adeno-assosioituneita virusvektoreita on tutkittu laajasti biolääketieteessä.
Kasvaimeen penetraation ja kasvaimenvastaisen vaikutuksen paikallisen monistumisen parantamiseksi edelleen on muodostettu selektiivisesti onkolyyttisiä aineita, esimerkiksi ehdollisesti replikoituvia adenoviruksia. Onko-lyyttiset adenovirukset ovat lupaava keino syöpien hoitoon, ja ne ovat osoittautuneet hyvin turvallisiksi ja jonkin verran tehokkaiksi kliinisissä kokeissa. Onko-lyyttiset adenovirukset tappavat kasvainsoluja, koska virus replikoituu kasvain-solussa, jolloin replikaation viimeinen vaihe johtaa tuhansien virionien vapautumiseen ympäröiviin kasvainkudoksiin tehokasta kasvaimeen penetraatiota ja vaskulaarista reinfektiota varten. Kasvainsolut sallivat viruksen replikaation, kun taas normaalit solut säästyvät, koska virusgenomiin on räätälöity muutoksia, jotka estävät replikaation muissa kuin kasvainsoluissa.
Replikaatio voidaan rajoittaa kasvainkudokseen joko tekemällä osittaisia deleetioita adenoviruksen E1-alueelle tai käyttämällä kudos- tai kas-vainspesifisiä promoottoreita (TSP). Tällaisen promoottorin lisääminen saattaa tehostaa vektorien vaikutuksia kohdesoluissa, ja eksogeenisten kudos- tai kasvainspesifisten promoottoreiden käyttö on yleistä rekombinanteissa adeno-virusvektoreissa.
Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ihmisen telomeraa-sin käänteistranskriptaasin (hTERT) promoottori on erittäin aktiivinen useimmissa kasvaimissa ja immortaaleissa solulinjoissa mutta inaktiivinen normaaleissa somaattisissa solutyypeissä. hTERT on telomeraasin katalyyttiinen alayksikkö, ja sen toiminta stabiloi telomeerin pituutta kromosomaalisen replikaation aikana. Onkolyyttisiä adenoviruksia, joissa käytetään hTERT-promoottoria adenoviruksen varhaisvaiheen alueiden geenien kontrolloimiseksi, on kuvattu aikaisemmin (katso esimerkiksi Huang, TG, et ai., Gene Therapy 2003; 10, 1241-1247; Ryan, PC. et ai., Cancer Gene Therapy 2004;11, 555-559; Irving et ai., Cancer Gene Therapy 2004; 11, 174-185; Bauerschmitz GJ, et ai., Cancer Res 2008;68:5533-9). Kuitenkin telomeraasi ilmentyy, paitsi kasvain-soluissa, myös muissa ihmissoluissa, joilla on rajoittamaton proliferatiivinen kyky, kuten kantasoluissa.
Useimmat kliiniset kokeet on suoritettu varhaisten sukupolvien ade-noviruksilla, jotka perustuvat adenovirus 5:een (Ad5). Onkolyyttisten adenovi-rusten kasvaimenvastainen vaikutus riippuu niiden geeninsiirtokyvystä. Valitettavasti useimmat kasvaimet ilmentävät heikosti tärkeintä Ad5-reseptoria, minkä vuoksi modifikaatioita on viety Ad5-kapsidiin. Esimerkiksi kapsidimodifikaatio serotyypin 3 ulokkeella on parantanut infektiivisyyttä ja tehoa munasarjasyö vässä (Kanerva A, et ai., Clin Cancer Res 2002;8:275-80; Kanerva A, et ai., Mol Ther 2002;5:695-704; Kanerva A, et ai., Mol Ther 2003;8:449-58). Lisäksi koska Ad-vektorien säie ja penton base -yksikkö ovat soluun sisäänmenome-kanismin avainvälittäjiä, rekombinanttien Ad-vektorien kohdentaminen voidaan saavuttaa näiden kapsidiproteiinien geneettisten modifikaatioiden kautta (Dmit-riev I., et ai. 1998, Journal ofVirology, 72, 9706-9713). Useimmat tällä hetkellä kliinisessä käytössä olevat onkolyyttiset virukset ovat suuresti heikennettyjä replikaation suhteen monien kriittisissä viruksen geeneissä olevien deleetioi-den johdosta. Näillä viruksilla on erinomainen turvallisuusaineisto, mutta kas-vaimenvastainen teho on ollut rajallinen.
Kliiniset ja esikliiniset tulokset kuitenkin osoittavat, että hoito ei-aseis-tetuilla onkolyyttisillä viruksilla ei ole riittävän immunostimulatorista johtaakseen pidempiaikaisiin kasvaimenvastaisiin terapeuttisiin immuunivasteisiin. Tässä suhteessa onkolyyttisiä viruksia on aseistettu, jotta ne olisivat immuno-stimulatorisempiä. Lisäksi viruksen replikaatio ja immunomodulatoristen proteiinien ilmentyminen kasvaimen sisällä voimistaa immuunijärjestelmää indusoimalla sytokiinituotantoa ja kasvainantigeenien vapautumista (Ries SJ, et ai., Nat Med 2000;6:1128-33).
Onkolyyttisten virusten aseistaminen yhdistää perinteisen geeninsiirron edut ja replikoitumiskykyisten aineiden tehon. Eräs virusten aseistamisen päämäärä on immuunireaktion indusointi viruksen replikaation sallivia soluja vastaan. Kuten edellä on mainittu, virusreplikaatio, vaikkakin se on immu-nogeenistä, ei normaalisti yksin riitä indusoimaan tehokasta kasvaimenvastais-ta immuniteettia. Terapeuttisen immuniteetin indusoinnin vahvistamiseksi viruksia on aseistettu stimulatorisilla proteiineilla, kuten sytokiineilla, tarkoituksena helpottaa kasvainantigeenien viemistä antigeenejä esitteleville soluille, kuten dendriittisoluille, ja näiden stimulaatiota ja/tai kypsymistä. Immunoterapeut-tisten geenien vieminen kasvainsoluihin ja lisäksi niiden proteiinien translaatio johtavat immuunivasteen aktivoitumiseen ja tehokkaampaan kasvainsolujen tuhoutumiseen. Merkittävimmät immuunisolut tässä suhteessa ovat luonnolliset tappajasolut (NK:t) ja sytotoksiset CD8+ T -solut.
CD40-ligandi (CD40L) on tyypin II transmembraaniproteiini, joka kuuluu tuumorinekroositekijäperheeseen. CD40L tunnetaan myös CD154:nä tai gp39:nä ja ilmentyy pääasiassa CD4+-T-soluilla ja sitoutuu CD40-reseptoriin antigeeniä esittelevien solujen (APC:t) membraanilla (Grevval IS ja Flavell RA., Ann Rev Immunol 1998;16:111-35; Roy M, et ai., J Immunol 1993; 151:2497- 510). CD40 ilmentyy makrofagien ja dendrittisolujen (DC:t) pinnalla, jolloin sen aktivoituminen CD40L:n vaikutuksesta johtaa antigeenin esittelyyn ja sytokiini-tuotantoon, mitä seuraa T-solujen virittyminen ja vahva synnynnäinen immuunivaste (van Kooten C ja Banchereau J., J Leukoc Biol 2000;67:2-17). Vuorovaikutukset CD40L:n ja sen reseptorin, CD40:n, välillä tuottavat kriittisiä kostimulatorisia signaaleja, jotka käynnistävät T-lymfosyyttien leviämisen (Grevval IS ja Flavell RA, 1998, Annu Rev Immunol 1998;16:111-35), ja lisäävät IL-12-tuotantoa, jota tarvitaan sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL) sitomiseen kasvaimenvastaiseen immuunivasteeseen (Loskog AS, et ai., Clin Can-cer Res 2005;11:8816-21; Mackey MF, et ai., J Immunol 1998;161:2094-8). Aikaisemmat havainnot osoittavat, että rekombinantilla liukoisella proteiinilla, CD40L:Mä, (rsCD40L) on suoria vaikutuksia kasvainsolujen proliferaation supp-ressoinnissa in vitro (Eliopoulos AG, et ai., Oncogene 1996;13:2243-54; Tong AW, et ai., Clin Cancer Res 2001;7:691-703) ja in vivo (Eliopoulos AG, et ai., Mol Cell Biol 2000;20:5503-15; Hirano A, et ai., Blood 1999;93:2999-3007). Muita rsCD40L:n suoria vaikutuksia ovat eloonjäämistä signaloivien reittien (mukaan lukien PI-3-kinaasi ja ERK/MAPK) stimulaatio ja apoptoosin induktio karsinoomasoluissa (Eliopoulos, AG., et ai., Mol Cell Biol 2000;20:5503-15; Davies CC, et ai., J Biol Chem 2004;279:1010-921).
Jotkut viimeaikaiset raportit ovat osoittaneet, että adenovirukset, jotka on aseistettu CD40L:llä, voivat saada aikaan kasvaimen kasvun inhibition yhdessä apoptoottisten tapahtumien lisääntymisen kanssa kasvainkohdassa (Loskog AS, et ai., Clin Cancer Res 2005;11:8816-21; Fernandes MS, et ai., Clin Cancer Res 2009;15:4847-56; Loskog AS, et ai., J Immunol 2004;172:7200-5). On myös jonkin verran todisteita mitä tulee kasvaimenvastaiseen immuunivasteeseen lisääntyneen lymfosyyttien infiltraation ja sytotoksisten CD8+-T-solujen kautta (Hanyu K, et ai., Anticancer Res 2008;28:2785-9; Iida T, et ai., Cancer Sei 2008;99:2097-10324, 25).
Adenovirukset ovat keskikokoisia (90-100 nm), vaipattomia ikosa-hedraalisia viruksia, joilla on noin 36 000 emäsparin kaksijuosteinen lineaarinen DNA proteiinikapsidissa. Viruksen kapsidissa on säierakenteita, jotka osallistuvat viruksen kiinnittymiseen kohdesoluun. Ensinnäkin säieproteiinin uloke-domeeni sitoutuu kohdesolun reseptoriin [esimerkiksi CD46:n tai coxsackievi-ruksen adenovirusreseptoriin (CAR)], toiseksi virus on vuorovaikutuksessa in-tegriinimolekyylin kanssa ja kolmanneksi virus endosytosoituu kohdesoluun. Seuraavaksi virusgenomi kuljetetaan endosomeista tumaan, ja kohdesolun replikaatiokoneistoa hyödynnetään myös viruksen tarkoituksiin (Russell W. C., J General Virol 2000; 81,2573-2604).
Adenovirusgenomissa on varhaisvaiheen (E1-E4), keskivaiheen (IX ja IVa2) ja myöhäisvaiheen geenejä (L1-L5), jotka transkriptoidaan peräkkäisessä järjestyksessä. Varhaisvaiheen geenituotteet vaikuttavat isäntäsolun puolustusmekanismeihin, solusykliin ja solumetaboliaan. Keski-ja myöhäisvaiheen geenit koodaavat virusten rakenneproteiineja uusien virionien tuottamiseksi (Wu ja Nemerovv, Trends Microbiol 2004; 12: 162-168; Russell W. C., J General Virol 2000; 81, 2573-2604; Volpers C. ja Kochanek S., J Gene Med 2004; 6 suppl 1, S164-71; Kootstra N. A. ja Verma I. M., Annu Rev Pharmacol Toxicol 2003; 43, 413-439).
Ihmiseltä on löydetty yli 50 adenovirusten eri serotyyppiä. Serotyypit luokitellaan kuuteen alaryhmään A-F, ja eri serotyyppien tiedetään liittyvän eri sairauksiin, kuten hengityselinsairauksiin, sidekalvontulehdukseen ja maha-suolitulehdukseen. Adenovirusserotyypin 5 (Ad5) tiedetään aiheuttavan hengityselinsairauksia, ja se on yleisin geenihoidon alalla tutkittu serotyyppi. Ensimmäisistä Ad5-vektoreista deletoitiin E1- ja/tai E3-alueet, jolloin vierasta DNA:ta voitiin viedä vektoreihin (Danthinne X, Imperiale, MJ. Gene Therapy. 2000;7:1707-1714). Lisäksi muiden alueiden deleetiot ja lisämutaatiot ovat tuottaneet lisäominaisuuksia virusvektoreille. Useita adenovirusten eri modifikaatioita on siis ehdotettu tehokkaiden kasvaimenvastaisten vaikutusten aikaansaamiseksi.
US-patenttihakemuksessa 2010047208 A1 esitetään ulokemodifioi-tuja adenovirusvektoreita, joissa kasvaimen kohdentaminen saadaan aikaan modifioidulla hTERT-promoottorilla ja joka voi olla aseistettu immunostimulato-risella proteiinilla, kuten GM-CSF:llä.
Silti tarvitaan tehokkaampaa ja tarkempaa geeninsiirtoa ja geenihoitojen lisääntynyttä spesifisyyttä ja riittävää kasvaintentappokykyä. Terapeuttisten vektorien turvallisuustietojen on myös oltava erinomaisia. Esillä oleva keksintö tarjoaa näillä edellä mainituilla ominaisuuksilla varustetun syövänhoito-keinon hyödyntämällä sekä adenovirusten onkolyyttisiä että immunoterapeutti-sia ominaisuuksia uudella ja keksinnöllisellä tavalla.
Keksinnön lyhyt kuvaus
Keksinnön tavoitteena on tuottaa uusia menetelmiä ja välineitä adenovirusten edellä mainittujen ominaisuuksien aikaansaamiseksi ja siten myös perinteisten syöpähoitojen ongelmien ratkaisemiseksi. Tarkemmin sanottuna keksintö tarjoaa uusia menetelmiä ja välineitä geenihoitoa varten.
Esillä oleva hakemus kuvaa rekombinanttien virusvektoreiden rakentamista, näihin vektoreihin liittyviä menetelmiä ja niiden käyttöä kasvainso-lulinjoissa, eläinmalleissa ja syöpäpotilaissa.
Esillä oleva keksintö koskee onkolyyttistä adenovirusvektoria, joka käsittää 1) adenovirusserotyypin 5 (Ad5) nukleiinihappopääketjun, joka käsittää kapsidimodifikaation, edullisesti kapsidimodifikaation adenovirusserotyypin 3 (Ad3) ulokkeella (Ad5/3-kapsidikimeerisyys), 2) nukleiinihapposekvenssin, joka koodaa kasvainspesifistä ihmisen telomeraasin käänteistranskriptaasin (hTERT) promoottoria, ylävirtaan E1-alueesta, ja 3) nukleiinihapposekvenssin, joka koodaa ihmisen CD40L:ää, dele-toidun gp19k/6.7K\n tilalla E3-alueella.
Esillä oleva keksintö koskee edelleen in vitro -solua, joka käsittää keksinnön mukaisen onkolyyttisen adenovirusvektorin.
Esillä oleva keksintö koskee myös farmaseuttista koostumusta, joka käsittää keksinnön mukaisen adenovirusvektorin.
Esillä oleva keksintö koskee myös keksinnön mukaista adenovirusvektoria käytettäväksi kohteen syövän hoitamiseksi.
Esillä oleva keksintö koskee myös keksinnön mukaista farmaseuttista koostumusta käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa.
Esillä oleva keksintö liittyy myös menetelmään kohteen syövän hoitamiseksi, jolloin menetelmä käsittää keksinnön mukaisen vektorin tai farmaseuttisen koostumuksen antamisen kohteelle, joka sairastaa syöpää, erityisesti tavanomaisiin kemoterapeuttisiin ja/tai sädehoitoihin huonosti reagoivaa syöpää.
Lisäksi esillä oleva keksintö koskee in vitro -menetelmää CD40L:n tuottamiseksi solussa, jolloin menetelmässä kuljetetaan keksinnön mukaista onkolyyttistä adenovirusvektoria käsittävä kuljetin soluun ja ilmennetään kyseisen vektorin CD40L:ää solussa.
Lisäksi esillä oleva keksintö liittyy menetelmään kohteen kasvain-spesifisen immuunivasteen lisäämiseksi, jolloin menetelmässä kuljetetaan keksinnön mukaista onkolyyttistä adenovirusvektoria käsittävä kuljetin kohdesoluun tai -kudokseen ilmennetään kyseisen vektorin CD40L:ää solussa lisätään sytotoksisten T-solujen ja/tai luonnollisten tappajasolujen määrää kyseisessä kohdesolussa tai -kudoksessa, ja indusoidaan Th2—»Th1 -vaihtuminen sytotoksisen kasvaimenvastai-sen aktiivisuuden lisäämiseksi kasvaimen mikroympäristössä.
Esillä oleva keksintö koskee vielä myös keksinnön mukaisen onko-lyyttisen adenovirusvektorin käyttöä CD40L:n tuottamiseksi solussa in vitro.
Esillä oleva keksintö liittyy vielä myös keksinnön mukaiseen onko-lyyttiseen adenovirusvektoriin CD40L:n tuottamiseksi solussa.
Esillä oleva keksintö liittyy vielä myös keksinnön mukaisen onkolyyt-tisen adenovirusvektorin käyttöä kohteen kasvainspesifisen immuunivasteen lisäämiseksi.
Esillä oleva keksintö liittyy vielä keksinnön mukaiseen onkolyytti-seen adenovirusvektoriin kohteen kasvainspesifisen immuunivasteen lisäämiseksi.
Esillä oleva keksintö koskee vielä keksinnön mukaista onkolyyttistä adenovirusvektoria käytettäväksi kasvainspesifisen immuunivasteen ja apop-toosin lisäämiseksi, Th2—>Th1 muutokseen tai immuunisuppression vähentämiseen! kohteessa.
Esillä oleva keksintö liittyy uuteen välineeseen syöpien hoitamiseksi, erityisesti huonosti nykyhoitoihin reagoivien tai nykyhoidoilla parantumattomien syöpien hoitamiseksi. Lisäksi hoitoon sopiviin kasvaintyyppeihin liittyviä rajoituksia on vähän verrattuna moniin muihin hoitoihin. Itse asiassa kaikkia kiinteitä kasvaimia voidaan hoitaa esitetyllä keksinnöllä. Hoito voidaan antaa kas-vaimensisäisesti, ontelonsisäisesti, laskimonsisäisesti ja käyttämällä näiden yhdistelmää. Hoitotapa voi antaa systeemisen tehon huolimatta paikallisesta injektiosta. Hoitotapa voi myös hävittää solut, joiden oletetaan olevan kasvaimen aiheuttajia ("syöpäkantasolut”).
Sen lisäksi, että keksinnön mukainen vektori mahdollistaa vektorin kuljettamisen kohdealueelle, se myös varmistaa siirtogeenin ilmentymisen ja pysyvyyden. Esillä oleva keksintö ratkaisee ongelman, joka liittyy perinteisten hoitojen hoitoresistenssiin. Lisäksi esillä oleva keksintö tarjoaa keinoja ja menetelmiä selektiivisiä hoitoja varten aiheuttamatta toksisuutta tai vaurioita terveissä kudoksissa. Esillä olevan keksinnön etuja ovat myös erilaiset ja vähen tyneet sivuvaikutukset verrattuna muihin hoitoihin. Tärkeä seikka on, että hoitokeino on synergistinen monien muiden hoitomuotojen kanssa, mukaan lukien kemoterapia ja sädehoito, ja sitä voidaan siten käyttää yhdistelmähoito-ohjelmissa.
Immuunireaktion indusoiminen sellaisia soluja vastaan, jotka sallivat aseistamattomien adenovirusten replikaation, ei normaalisti ole riittävän voimakas saamaan aikaan terapeuttisen kasvainimmuniteetin kehittymisen. Tämän heikkouden poistamiseksi esillä oleva keksintö tuottaa aseistettuja adeno-viruksia, joissa on voimakas kasvaimenvastaisen immuniteetin aiheuttaja, CD40L, joka lisäksi indusoi paikallisen apoptoosin kasvainkudoksessa.
Tarkemmin kuvattuna CD40L:Mä yhdessä ei-replikoituvien virusvek-toreiden kanssa on osoitettu olevan synergististä kykyä lisätä efektorisolujen (CD8+-T-solujen) aktiivisuutta muuttamalla T-solujen Th2-kemokiinimalleja Th1-tyyppiin (Loskog et ai. 2004, J Immunol 172: 7200-5; Bendriss-Vermare et ai. 2005, J Leucocyte Biol 78: 954-66). Th2 edistää vasta-aineiden tuotantoa, kun taas Th1 edistää sytotoksisuutta, ja jälkimmäinen voi olla edullisempi pyrittäessä kohdentamaan T-soluja tappamaan kasvainsoluja. Tässä patenttiha-kemustekstissä osoitetaan, että tämä ilmiö on erityisen voimakas onkolyyttisen adenoviruksen yhteydessä, minkä osoittavat esikliiniset ja ihmisillä saadut tulokset.
Onkolyyttisen adenoviruksen CD40L-tuotanto on tärkeää myös siksi, että se voi rekrytoida luonnollisia tappajasoluja kasvaimeen ja lisätä niiden kasvaimenvastaista aktiivisuutta (Nakajima et ai. 1998 J Immunol 161:1901 — 7). Lisäksi CD40L voi lisätä antigeeniä esittelevien solujen toimintaa (Nakajima et ai. 1998 J Immunol 161:1901-7). Lopuksi CD40/CD40L-vuorovaikutus saa aikaan voimakkaita estäviä signaaleja suppressiivisille soluille, kuten regulato-risille T-soluille, mikä voi johtaa kasvaimenvastaisten immuunivasteiden voimakkaaseen stimulaatioon (Guiducci et ai. 2005 Eur J Immunol 35:557-67).
Lisäksi virusreplikaatio rajoittuu kohdesoluihin voimakkaan trans-kriptionaalisesti kohdentavan promoottorin, hTERT:in, käytön avulla. Kas-vainspesifinen promoottori hTERT on aktiivinen käytännöllisesti katsoen kaikissa pitkälle edenneissä kiinteissä kasvaimissa, mutta se voi välittää myös onkolyyttisten adenovirusten kohdentamista mahdollisiin syöpää käynnistäviin soluihin, kuten on osoitettu syöpäpotilaiden keuhkopussinestenäytteissä (Bau-erschmitz et ai., Cancer Res 2008 68: 5533-9). Tässä esitetyt kliiniset tulokset osoittavat ei-toksisuutta normaalikudoksen kantasoluille, koska henkeä uhkaavia haittatapahtumia ei esiintynyt.
Esillä oleva keksintö tuottaa syöpähoidon, jossa virionien aiheuttama onkolyysi tuhoaa kasvainsoluja, yhdistettynä useisiin erilaisiin ihmisen immuunivastetta aktivoiviin mekanismeihin, kuten esimerkiksi T-solujen, makro-fagien ja dendriittisolujen (DC:iden) proliferaatioon ja aktivaatioon, mitä seuraa sytokiinituotanto, joka puolestaan indusoi Th1 -tyypin immuunireaktion, jolloin sytotoksisten T-solujen hyökkäys kasvaimeen stimuloituu edelleen. Lisäksi CD40L:n indusoima apoptoosi edistää kasvainkuorman vähenemistä.
Tunnetun tekniikan mukaisiin adenovirusvälineisiin verrattuna esillä oleva keksintö tarjoaa yksinkertaisemman, tehokkaamman, edullisemman, myrkyttömämmän ja/tai turvallisemman välineen syöpähoitoa varten. Lisäksi auttajaviruksia tai rekombinanttimolekyylin samanaikaista annostelua ei tarvita.
Esillä oleva keksintö tarjoaa uuden sukupolven infektiivisyydeltään parempia ja erittäin tehokkaita adenoviruksia, joissa säilyy aikaisempien virusten hyvä turvallisuus mutta jotka johtavat tasoltaan korkeampiin tehokkuuksiin. Mikä tärkeää: esillä oleva keksintö kuvaa onkolyyttisiä adenoviruksia, jotka tuottavat immunologisia tekijöitä, jotka ovat kriittisiä onkolyyttisten virusten tehokkuuden suhteen.
Keksinnön mukaiset uudet tuotteet mahdollistavat lisäparannuksia syöpähoitoon.
Kuvioiden lyhyt kuvaus
Kuviossa 1 esitetään kaavamaisesti virukset Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L, Ad5/3-CMV-hCD40L ja Ad5/3-CMV-mCD40L. Replikoitumiskykyises-sä Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:ssä on nukleiinihapposekvenssi (SEQ ID. NO: 1), joka koodaa kasvainspesifistä ihmisen telomeraasin käänteistranskrip-taasin (hTERT) promoottoria, ylävirtaan E1-alueesta, ja gp19k/6.7K E3-alu-eella on korvattu ihmisen CD40L:n cDNA-sekvenssillä (SEQ ID NO:2) (kuvio 1a). Replikoitumiskyvyttömissä Ad5/3-CMV-hCD40L:ssä (kuvio 1b) ja Ad5/3-CMV-mCD40L:ssä (kuvio 1c) on hCD40L ja vastaavasti mCD40L E1A-alueen tilalla ja luonnollinen E1A-promoottori on korvattu CMV-promoottorilla. ADP viittaa adenoviruksen kuolemaproteiiniin.
Kuviossa 2a esitetään virtaussytometriamäärityksen tulokset hCD40L:n ilmentymiselle 293-solulinjassa 24 tuntia infektion jälkeen annoksella 10 VP/solu. Kuviossa 2b esitetään CD40L-proteiinin ilmentyminen in vivo hiiren seerumissa. hCD40L:n analysoimiseksi Ad5/3-CMV-hCD40L:llä käsitelty jen hiirten seerumista veri kerättiin vain kahdesti (päivinä 4 ja 8) kasvaimen nopeasta kasvusta johtuen, ja eläimet oli tapettava päivänä 8. Kuviossa 2c esitetään replikoitumiskykyisen adenoviruksen Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L ilmentämän hCD40L:n funktionaalisuus. Lusiferaasia koodaava plasmidi, joka sisälsi Nf-KB5-ELAM-promoottorin, transfektoitiin EJ-soluihin ja supernatanttia Ad5/3-hTERT-hCD40L:llä infektoiduista A549-soluista lisättiin. Mockarvot (infektoi-mattomat) vähennettiin ja Nf-KB-aktiivisuus ilmaistaan lusiferaasin ilmentymisen lisääntymisen kertaluokkana (suhteelliset valoyksiköt, RLU). Supernatant-teja soluista, jotka oli infektoitu CD40L:ää sisältämättömällä onkolyyttisellä viruksella (Ad5/3-hTERT-E1A), ja ihmisen rekombinantilla CD40L:llä (hCD40L) käytettiin kontrolleina. Määritys suoritettiin kolme kertaa ja kullakin kerralla kolmoismäärityksenä. Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM; ***, P<0,001. Kuviossa 2d esitetään myös hCD40L:n funktionaalisuus. Ihmisen B-lymfosyytti-solulinja (Ramos-Blue) ilmentää stabiilisti NF-kB/AP-1 -indusoituvaa SEAP-reportterigeeniä. Viruksen infektoimista soluista kerättyä supernatanttia käytettiin Ramos-Blue-solujen stimulointiin ja solujen aktivaation sijaisaineena mitattiin SEAP:n tuotanto QUANTI-Blue-määritysreagenssilla (InvivoGen, San Diego, CA, USA). Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM; ***, P<0,001.
Kuviossa 3 esitetään Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:n onkolyyttinen teho CD40-positiivisissa (EJ) tai CD40-negatiivisissa (A549) solulinjoissa. Keksinnön mukaisen adenoviruksen onkolyyttisen tehon määrittämiseksi, A549-(CD40-) (kuvio 3a) ja EJ- (CD40+) (kuvio 3b) solulinjat infektoitiin Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:llä, Ad5/3-hTERT-E1 A:Ila, Ad5/3-CMV-hCD40L:llä ja Ad5/3Luc1: Mä annoksilla 0,1, 1, 10, 100 ja 1000 VP/solu, ja solujen elinkyky mitattiin MTS-määrityksellä. EJ- ja A549-solujen yksikerrokset infektoitiin joko Ad5/3-hTE RT -E 1 A-hCD40L: lla (kuvio 3c) tai Ad5/3-hTE RT-E 1 A: I la (kuvio 3d).
Määritys pysäytettiin 7 päivää infektion jälkeen, ja solujen elinkyky mitattiin __ *** MTS-määrityksellä. , P<0,001.
Kuviossa 4 esitetään vektoreiden Ad5/3-CMV-hCD40L ja Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L kasvaimenvastainen teho hiirissä. Hiiriin, jotka kantoivat ihonalaisesti A549- (CD40-) (kuvio 4a) tai EJ- (CD40+) (kuvio 4b) kasvaimia, injektoitiin kasvaimensisäisesti replikoitumiskyvytöntä adenovirusta Ad5/3-CMV-hCD40L annoksena 108 VP/kasvain kolmena päivänä (0, 2 ja 4, n = 5 hiirtä/ryhmä), ja kasvaimen kasvua seurattiin. Tämä koe osoittaa, että CD40L:llä on kasvaimenvastainen vaikutus CD40+-soluissa. Kasvaimet indusoitiin hiirissä joko A549- (kuvio 4c) tai EJ- (kuvio 4d) solulinjoilla ja injektoitiin replikoitumiskykyisellä adenoviruksella Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L ja kontrolli-viruksella Ad5/3-hTERT-E1A annoksena 108VP/kasvain kolmena päivänä (0, 2 ja 4, n = 5 hiirtä/ryhmä), ja kasvaintilavuuksia verrattiin suhteessa alkuperäiseen kokoon. Tämä koe osoittaa Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:n onkolyyttisen tehon, mutta se ei ota huomioon CD40L:n immunologista aktiivisuutta, koska hCD40 ei ole aktiivinen hiirissä. Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM. *, P<0,05; ", P<0,01; “, P<0,001.
Kuviossa 5 esitetään kaspaasi-3:n ilmentyminen CD40+-kasvai-missa. EJ (CD40+) -kasvaimia kantaviin hiiriin injektoitiin kasvaimensisäisesti Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:ää, Ad5/3-hTERT-E1A:ta, Ad5/3-CMV-hCD40L:ää ja Ad5/3-Luc1 :tä (vale) kolme kertaa. 26 päivän kuluttua eläimet tapettiin, ja kasvaimet otettiin talteen ja upotettiin paraffiinilohkoihin (n = 5 hiirtä/ryhmä). Immunohistokemia kaspaasi-3:lle suoritettiin apoptoosin indusoinnin tutkimiseksi. Positiivinen värjäytyminen näkyy ruskeana.
Kuviossa 6 osoitetaan, että Ad5/3-CMV-mCD40L estää kasvaimen kasvua immunokompetentissa eläinmallissa. CD40L:n immunologisen vaikutuksen tutkimiseksi onkolyysivaikutuksen sitä sekoittamatta, C57Black-hiiriin, jotka ihonalaisesti kantoivat MB49 (hiiren rakkosyöpäsolulinja) -kasvaimia, injektoitiin kasvaimensisäisesti replikoitumiskyvytöntä adenovirusta Ad5/3-CMV-mCD40L tai kontrollia Ad5/3-Luc1 annoksena 3x108 VP/kasvain päivinä 0, 2 ja 4 (n = 6 hiirtä/ryhmä). Kasvaimen kokoa seurattiin ja verrattiin suhteessa kokoon päivänä 0. Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM, ***, P<0,001 (kuvio 6a). Kuviossa 6b esitetään apoptoosin immunohistokemiallinen analyysi (aktiivinen kaspaasi-3) Ad5/3-CMV-mCD40L:llä tai Ad5/3-Luc1:llä käsitellyissä kasvaimissa. Aktiivisen kaspaasi-3:n ilmentyminen näkyy ruskeana.
Kuviossa 7 kuvataan isännän immuunivasteita syngeenisessä hiiri-mallissa. Kuviossa 7a esitetään sytokiinianalyysi IL-12:lle, IFN-y:lle, TNF-a:lle ja Rantesille Ad5/3Luc1:llä (musta) tai Ad5/3-CMV-mCD40L:llä (valkoinen) käsiteltyjen hiirten pernasoluissa. Pernasoluja viljeltiin 24, 48 tai 72 tuntia. IL-12 osoittaa antigeeniä esittelevien solujen aktivaatiota, kun taas muut ovat Th1-tyypin immuunivasteen merkkejä. Immunohistologista analyysiä varten MB49-kasvaimet otettiin talteen päivänä 16 viruksella infektoinnin jälkeen. Neljän pm:n kasvainleikkeet värjättiin immunohistokemialla eri merkeille. Kuviossa 7b esitetään makrofagi- (F4/80), leukosyytti- (CD45) ja B-lymfosyytti- (CD19) värjäykset. Kuviossa 7c kasvainleikkeet värjättiin auttaja- (CD4+) ja sytotoksisille (CD8+) T-soluille (ruskea).
Kuviossa 8 esitetään kasvainnäytteiden esikäsittelyanalyysi hoidon tehokkuuden ennustamista varten. Solutappomääritys (MTS-määritys) suoritettiin tuoreelle, ennen hoitoa otetulle, pahanlaatuiselle keuhkonesteelle potilaasta, joka sairasti rintasyöpää (R73), käyttäen onkolyyttistä adenovirusta, jossa oli Ad5-kapsidi ja kimeerinen Ad5/3-kapsidi (Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:n kanssa identtinen kapsidi), ja ei-onkolyyttistä adenovirusta.
Kuviossa 9 esitetään adenoviruksen tunnistavien T-solujen indu-sointi onkolyyttisellä adenoviruksella Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L käsittelyn jälkeen. Kokonais-PBMC:t eristettiin ja pulssitettiin adenoviruksen 5-pentonista peräisin olevalla peptidipoolilla adenovirusspesifisten sytotoksisten T-lymfo-syyttien aktivaation määrittämiseksi gamma-interferoni-ELISPOT:lla.
Kuviossa 10 esitetään potilasnäytteiden analyysin tulokset joko Th1-indusoiduille sytokiineille: interferoni-y (IFN-y), tuumorinekroositekijä-α (TNF-a) ja interleukiini-2 (IL-2) tai Th2-sytokiineille: interleukiini-4 (IL-4), interleukiini-5 (IL-5) ja interleukiini 10 (IL-10) käyttäen Becton-Dickinson cytokine multiplex bead array system -pakkausta (BD FACSArray; BD Biosciences, San Jose, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kuvion 10 vasemmalla puolella esitetään Th1-indusoidut sytokiinit ja oikealla puolella Th2-indusoidut sytokiinit. Ennen = seeruminäyte otettu ennen viruksen antoa; 1 kuukausi = seeruminäyte otettu 1 kuukausi virushoidon jälkeen; 2 kuukautta = seeruminäytteet otettu 2 kuukautta virushoidon jälkeen.
Kuviossa 11 esitetään analyysitulokset potilasseeruminäytteistä Th1-sytokiineille: interferoni-y (IFN-y), tuumorinekroositekijä-α (TNF-a) ja interleukiini-2 (IL-2), ja Th2-sytokiineille: interleukiini-4 (IL-4), interleukiini-5 (IL-5) ja interleukiini 10 (IL-10) käyttäen Becton-Dickinson cytokine multiplex bead array system -pakkausta (BD FACSArray; BD Biosciences, San Jose, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sytokiinipitoisuudet raportoidaan suhteessa niiden perustasoon, joka asetettiin 1:ksi ja suhde Th1/Th2 laskettiin kullekin aikapisteelle. 1 kuukausi = seeruminäyte otettu 1 kuukausi virushoidon jälkeen; 2 kuukautta = seeruminäytteet otettu 2 kuukautta virushoidon jälkeen.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Adenovirusvektori
Ad5:ssä, kuten myös muissa adenoviruksissa, ikosahedraalinen kapsidi koostuu kolmesta pääproteiinista: heksonista (II), penton base -proteiinista (III) ja ulokkeisesta säikeestä (IV), lisäksi siinä on pieniä proteiineja; VI,
Vili, IX, lila ja IVa2 (Russel W. C., J General Virol 2000;81, 2573-2604). Proteiinit VII, pienpeptidi mu ja terminaaliproteiini (TP) ovat liittyneinä DNA:han. Proteiini V tarjoaa rakennelinkin kapsidiin proteiinin VI välityksellä. Viruksen koodaama proteaasi tarvitaan joidenkin rakenneproteiinien käsittelyä varten.
Esillä olevan keksinnön mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori perustuu adenovirusserotyypin 5 (Ad5:n) nukleiinihappopääketjuun, joka käsittää kapsidimodifikaation, kuten adenovirusserotyypin 3 (Ad3) ulokkeen (Ad5/3-kapsidikimeerisyys), nukleiinihapposekvenssin, joka koodaa kasvainspesifistä ihmisen telomeraasin käänteistranskriptaasin (hTERT) promoottoria (SEQ ID NO: 1), ylävirtaan E1 -alueesta, ja nukleiinihapposekvenssin, joka koodaa ihmisen CD40L:ää (SEQ ID. NO:2), deletoitujen gp19k/6.7K-sekvenssien (965 emäsparia) tilalla E3-alueella (kuvio 1a). Edullisessa keksinnön suoritusmuodossa adenovirusvektori perustuu ihmisen adenovirukseen. Tässä käytetty CD40L-sekvenssi eroaa ihmisen genomisesta sekvenssistä (NG_007280.1) detektion helpottamiseksi ihmisnäytteistä. Siten esillä olevassa keksinnössä kuvataan ainutlaatuinen CD40L-variantti.
Ad5-genomi sisältää varhaisvaiheen (E1-4), keskivaiheen (IX ja IVa2) ja myöhäisvaiheen geenejä (L1-5), joiden vasemmalla ja oikealla puolella on invertoituneita terminaalisia toistoja (LITR:iä ja vastaavasti RITR:iä), jotka sisältävät DNA:n replikaatioon tarvittavat sekvenssit. Genomi sisältää myös pakkaussignaalin (Ψ) ja MLP:n (major late promoter).
Varhaisvaiheen geenin E1A transkriptio aloittaa replikaatiosyklin, jonka jälkeen E1B-, E2A-, E2B-, E3-ja E4-proteiinit ilmentyvät. E1 -proteiinit moduloivat solun metaboliaa tavalla, joka tekee solusta alttiimman virusrepli-kaatiolle. Esimerkiksi ne häiritsevät NF-κΒ-, p53- ja pRb-proteiineja. E1A ja E1B estävät yhdessä apoptoosia. E2- (E2A- ja E2B-) ja E4-geenituotteet välittävät DNA:n replikaatiota ja E4-tuotteet vaikuttavat myös viruksen RNA-meta-boliaan ja estävät isännän proteiinisynteesiä. E3-geenituotteet vastaavat puolustautumisesta isännän immuunijärjestelmää vastaan, edistävät solun hajoamista ja virusjälkeläisten vapautumista (Russel W. C., J General Virol 2000;81, 2573-2604).
Keskivaiheen geenit IX ja IVa2 koodaavat viruskapsidin pieniä proteiineja. MLP vaikuttaa myöhäisvaiheen geenien L1-5 ilmentymiseen, joka johtaa viruksen rakennekomponenttien tuotantoon, viruspartikkeleiden kapsidoi-tumiseen ja kypsymiseen tumassa (Russel W. C., J General Virol 2000;81, 2573-2604).
Verrattuna villityypin adenovirusgenomiin keksinnön mukainen ade-novirusvektori käsittää hTERT-promoottorin E1-alueella, tarkemmin ylävirtaan E1A-alueelta, siitä puuttuvat gp19k ja 6.7K E3-alueella ja se käsittää kapsidi-modifikaation viruksen säikeessä. Eräässä keksinnön edullisessa sovellus-muodossa muunnettujen/osittaisten E1-ja E3-alueiden lisäksi keksinnön mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää lisäksi yhden tai useamman alueen, jotka valitaan ryhmästä, joka koostuu E2:sta, E4:stä ja myöhäisvaiheen alueista. Eräässä keksinnön edullisessa sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää seuraavat alueet: vasen ITR, osittainen E1, plX, pl-Va2, E2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4, osittainen E3, L5, E4 ja oikea ITR. Alueet voivat olla vektorissa missä tahansa järjestyksessä, mutta eräässä keksinnön edullisessa sovellusmuodossa alueet ovat peräkkäisessä järjestyksessä 5-3’-suunnassa. Avoimet lukukehykset (ORF:t) voivat olla samassa DNA-juos-teessa tai eri DNA-juosteissa. Eräässä keksinnön edullisessa sovellusmuodossa E1-alue käsittää viruksen pakkaussignaalin.
Tässä yhteydessä ilmaisu "adenovirusserotyypin 5 (Ad5) nukleiini-happopääketju” tarkoittaa Ad5:n genomia tai osagenomia, joka käsittää yhden tai useampia alueita, jotka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat Ad5:stä peräisin olevat osittainen E1, plX, plVa2, E2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4, osittainen E3, L5 ja E4. Edullisessa sovellusmuodossa keksinnön mukainen vektori käsittää Ad5:n pääketjun yhdessä osan Ad3:a (esimerkiksi osan kapsidirakennetta) kanssa.
Tässä yhteydessä ilmaisu "osittainen” alue tarkoittaa aluetta, josta puuttuu jokin osa verrattuna vastaavaan villityypin alueeseen. Esimerkiksi "osittainen E3” viittaa E3-alueeseen, josta puuttuu gp19k/6.7K.
Tässä yhteydessä ilmaisut "VA1” ja ”VA2” tarkoittavat virukseen liittyviä RNA:ita 1 ja 2, jotka adenovirus transkriptoi mutta jotka eivät translatoidu. VA1:Mä ja VA2:Ma on osuutensa solun puolustusmekanismeja vastaan taistelemisessa.
Tässä yhteydessä ilmaisu "viruksen pakkaussignaali” tarkoittaa viruksen DNA:n osaa, joka koostuu sarjasta AT-rikkaita sekvenssejä ja ohjaa kapsidoitumisprosessia.
E3-alue ei ole olennainen in vitro -virusreplikaatiossa, mutta E3-pro-teiineilla on tärkeä osa isännän immuunivasteen säätelyssä, toisin sanoen sekä luontaisten että spesifisten immuunivasteiden estämisessä. gp19k/6.7K-deleetio E3:ssa tarkoittaa 965 emäsparin deleetiota adenoviruksen E3A-alu- eella. Seurauksena olevassa adenovirusrakenteessa sekä gp19k- että 6.7K-geeni on poistettu (Kanerva A. et ai., Gene Therapy 2005; 12, 87-94). gp19k-geenin tuotteen tiedetään sitovan ja eristävän MHC1 -molekyylejä (major histo-compatibility complex I) solulimakalvostossa ja estävän sytotoksisia T-lymfo-syyttejä tunnistamasta infektoituneita soluja. Koska monista kasvaimista puuttuu MHC1, gp19k\n deleetio lisää virusten kasvainselektiivisyyttä (virus poistetaan nopeammin kuin villityypin virus normaaleista soluista, mutta kasvainso-luissa ei ole eroa). 6.7K-proteiinit ilmentyvät solun pinnoilla ja osallistuvat TNF:n kaltaisen apoptoosia indusoivan ligandin (TRAIL) reseptorin 2 vähentämiseen.
Esillä olevassa keksinnössä CD40L-siirtogeeni sijoitetaan gp19k/6.7k-6e\eio\6u\\e E3-alueelle E3-promoottorin alaisuuteen. Tämä rajoittaa siirtogeenin ilmentymisen kasvainsoluihin, jotka sallivat viruksen replikaati-on, ja sen jälkeisen E3-promoottorin aktivoinnin. E3-promoottori voi olla mikä tahansa alalla tunnettu eksogeeninen tai endogeeninen promoottori, edullisesti endogeeninen promoottori. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa CD40L:ää koodaava nukleiinihapposekvenssi on viruksen E3-promoottorin säätelyn alainen.
gp79/c-deleetio on erityisen käyttökelpoinen CD40L:n ilmentymisen yhteydessä, koska se voi lisätä kasvainepitooppien MHC1-esittelyä sellaisissa kasvaimissa, joissa tämä kyky säilyy. Tässä yhteydessä APC- ja T-solujen stimulaatio CD40L:n vaikutuksesta voi johtaa optimaaliseen hyötyyn.
CD40L lisää immuunivastetta toimien erilaisten mekanismien kautta, mukaan lukien sytotoksisten T-solujen, luonnollisten tappajasolujen (NK:iden) rekrytointi, antigeeniä esittelevien solujen (APC) stimulaatio ja suppressoivien solujen, kuten regulatoristen T-solujen, vähentäminen. APC voi tämän jälkeen rekrytoida, aktivoida ja kohdistaa T-soluja kasvaimeen. CD40L:ää koodaava nukleotidisekvenssi voi olla lähtöisin mistä tahansa eläimestä, esimerkiksi ihmisestä, apinasta, rotasta, hiirestä, hamsterista, koirasta tai kissasta, hoidettavasta kohteesta riippuen, mutta edullisesti CD40L:ää koodaa ihmisen sekvenssi ihmisten hoidon yhteydessä. CD40L:ää koodaava nukleotidisekvenssi voi olla modifioitu CD40L:n vaikutusten parantamiseksi tai olla modifioimaton, toisin sanoen villityyppinen. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa CD40L:ää koodaava nukleiinihapposekvenssi on modifioitu yhden nukleotidin suhteen villityypin sekvenssistä spesifisen toteamisen sallimiseksi ihmisnäyt-teistä.
Eksogeenisten elementtien lisääminen voi vahvistaa vektoreiden vaikutuksia kohdesoluissa. Eksogeenisten kudos- tai kasvainspesifisten pro-moottoreiden käyttö on yleistä rekombinanteissa adenovirusvektoreissa. Virus-replikaatio rajoitetaan kohdesoluihin käyttämällä hTERT:ä tai hTERTin variantteja E1A-alueen kontrolloimiseksi. Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa hTERT sijaitsee E1A-alueesta ylävirtaan, mutta lisäksi tai vaihtoehtoisesti voidaan myös säädellä muita geenejä, kuten E1 B:tä tai E4:ää. "Ylävirtaan” viittaa välittömästi ennen E1-aluetta ilmentymisen suuntaan. Eksogeenisia insulaatto-reita, toisin sanoen epäspesifisten tehostajien estoelementtejä, vasenta ITR:ää, natiivia E1A-promoottoria tai kromaatiiniproteiineja voidaan myös sisällyttää rekombinantteihin adenovirusvektoreihin. Valinnaisesti esillä olevan keksinnön mukaisissa vektoreissa voidaan käyttää mitä tahansa lisäkomponentteja tai -modifikaatioita, mutta ne eivät ole pakollisia.
Keksinnön mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää kap-sidimodifikaation. Useimmat aikuiset ovat altistuneet laajimmin käytetylle ade-novirusserotyypille Ad5, ja siksi immuunijärjestelmä kykenee nopeasti tuottamaan neutraloivia vasta-aineita (NAb:tä) sitä vastaan. Itse asiassa anti-Ad5-NAb:n esiintyvyys voi olla jopa 50 %. On osoitettu, että NAb voi olla indusoitunut useimpia adenoviruskapsidin immunogeenisiä proteiineja vastaan, ja toisaalta on osoitettu, että jopa pienet muutokset Ad5:n säieulokkeessa voivat sallia paon kapsidispesifiseltä NAb:lta. Siten ulokkeen modifioiminen on tärkeää geeninsiirron ylläpitämiseksi tai lisäämiseksi käytettäessä adenoviruskon-taktia ihmisissä.
Lisäksi Ad5:n tiedetään sitoutuvan CAR:ksi kutsuttuun reseptoriin säikeen ulokeosan välityksellä, ja tämän ulokeosan tai säikeen modifikaatiot voivat parantaa kohdesoluun pääsyä ja aiheuttaa vahvistetun onkolyysin monissa tai joissakin syövissä (Ranki T. et ai., Int J Cancer 2007; 121, 165-174). Kapsidimodifioidut adenovirukset ovatkin edullisia välineitä parannetulle geeninsiirrolle syöpäsoluihin.
Tässä yhteydessä "kapsidi” tarkoittaa viruksen proteiinikuorta, joka sisältää heksoni-, säie- ja penton base -proteiineja. Mitä tahansa kapsidimodi-fikaatiota, toisin sanoen alalla tunnettua heksoni-, säie- ja/tai penton base -proteiinien modifikaatiota, joka parantaa viruksen viemistä kasvainsoluun, voidaan hyödyntää esillä olevassa keksinnössä. Modifikaatiot voivat olla geneettisiä ja/tai fysikaalisia modifikaatioita ja sisältää mainittuihin rajoittumatta modifikaatioita, joilla lisätään ligandeja, jotka tunnistavat spesifisiä solureseptoreja ja/tai estävät natiiveja reseptoreja sitoutumasta, ja joilla korvataan adenovirusvekto-rin säie- tai ulokedomeeni toisen adenoviruksen ulokkeella (kimerismi) ja lisätään spesifisiä molekyylejä (esimerkiksi fibroblastikasvutekijä 2, FGF2) adeno-viruksiin. Näin ollen kapsidimodifikaatiot sisältävät näihin rajoittumatta pienojen peptidimotiivi(e)n, peptidi(e)n, kimerismi(e)n tai mutaatio(ide)n lisäämisen säikeeseen (esimerkiksi uloke-, häntä- tai varsiosaan), heksoniin ja/tai penton base -yksikköön. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa kapsidimodifikaatio on Ad5/3-kimerismi, integriiniä sitovan alueen (RGD:n) in-sertio ja/tai hepariinisulfaattia sitovan polylysiinin modifikaatio säikeeseen. Keksinnön erityisessä suoritusmuodossa kapsidimodifikaatio on Ad5/3-kime-rismi.
Tässä yhteydessä kapsidin ”Ad5/3-kimerismi” tarkoittaa kimerismiä, jossa säikeen ulokeosa on Ad-serotyyppi 3:sta ja loppusäie on Ad-serotyyppi 5:stä.
Keksinnön mukainen vektori voi sisältää myös muita modifikaatioita, kuten E1B-alueen modifikaatioita.
Tässä yhteydessä ”RGD” tarkoittaa arginiini-glysiini-asparagiinihap-po (RGD) -motiivia, joka on paljastettuna penton base -yksikön pinnalla ja toimii vuorovaikutteisesti adenoviruksen internalisaatiota tukevien solun α-ν-β-integriinien kanssa. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa kapsidimodifikaatio on RGD-4C-modifikaatio. ”RGD-4C-modifikaatio” tarkoittaa hete-rologisen integriiniä sitovan RGD-4C-motiivin insertiota säikeen ulokealueen Hl-silmukkaan. 4C tarkoittaa neljää kysteiiniä, jotka muodostavat rikkisiltoja RGD-4C:ssä. RGD-4C-peptidin sisältävää säiettä koodaavan rekombinantti-Ad5-säiegeenin rakentaminen kuvataan yksityiskohtaisesti esimerkiksi Dmit-riev I. et a/:n artikkelissa (Journal ofVirology 1998; 72, 9706-9713).
Tässä yhteydessä "heparaanisulfaattia sitova polylysiinimodifikaatio” tarkoittaa seitsemän lysiinin jakson lisäämistä säieulokkeen C-päähän.
Ekspressiokasetteja käytetään siirtogeenien ilmentämisessä kohteessa, esimerkiksi solussa, käyttämällä vektoreita. Tässä yhteydessä ilmaisu "ekspressiokasetti” tarkoittaa DNA-vektoria tai sen osaa, joka käsittää cDNA:ita tai geenejä koodaavia nukleotidisekvenssejä tai mainittujen cDNA:iden tai geenien ilmentymistä ohjaavia ja/tai sääteleviä nukleotidisekvenssejä. Samanlaisia tai erilaisia ekspressiokasetteja voidaan insertoida yhteen vektoriin tai useampaan erilaiseen vektoriin. Esillä olevan keksinnön mukaiset Ad5-vektorit voivat käsittää joko useita ekspressiokasetteja tai yhden ekspressiokasetin.
Vain yksi ekspressiokasetti on kuitenkin riittävä. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää ainakin yhden ekspressiokasetin. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää vain yhden ekspressiokasetin.
Keksinnön mukaisen adenovirusvektorin käsittävä solu voi olla mikä tahansa solu, esimerkiksi eukaryoottisolu, bakteerisolu, eläinsolu, ihmissolu, hiirisolu ja niin edelleen. Solu voi olla in vitro-, ex vivo- tai in vivo -solu. Solua voidaan esimerkiksi käyttää adenovirusvektorin tuottamiseen in vitro, ex vivo tai in vivo tai solu voi olla kohde, esimerkiksi kasvainsolu, joka on infektoitu adenovirusvektorilla.
Menetelmässä CD40L:n tuottamiseksi solussa keksinnön mukaisen vektorin käsittävä kuljetin kuljetetaan soluun, ja CD40L-geeni ilmennetään ja proteiini translatoidaan ja sekretoidaan parakriinisesti. "Kuljetin” voi olla mikä tahansa virusvektori, plasmidi tai muu väline, kuten partikkeli, joka kykenee kuljettamaan keksinnön mukaisen vektorin kohdesoluun. Mitä tahansa alalla tunnettua tavanomaista menetelmää voidaan käyttää vektorin kuljettamisessa soluun.
Kasvainspesifistä immuunivastetta voidaan lisätä kohteessa käyttämällä esillä olevaa keksintöä. Sytotoksisia T-soluja ja/tai luonnollisia tappajasoluja stimuloidaan ja rekrytoidaan kasvaimen alueelle CD40L:n ilmentymisen seurauksena. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa luonnollisten tappajasolujen ja/tai sytotoksisten T-solujen määrää lisätään kohde-solussa tai -kudoksessa. Keksinnön vaikutusten seuraamiseksi tai tutkimiseksi voidaan määrittää erilaisia immuunivasteen merkkejä (esimerkiksi inflammatorisia merkkejä). Yleisimpiä merkkejä ovat, mainittuihin rajoittumatta, proin-flammatoristen sytokiinien ja kasvain- tai adenovirusspesifisten sytotoksisten T-solujen lisääntyminen, antigeeniä esittelevien solujen rekrytointi ja aktivointi tai paikallisten imusolmukkeiden suureneminen. Näiden merkkiaineiden tasoja voidaan tutkia minkä tahansa alalla tunnetun tavanomaisen menetelmän mukaisesti mukaan lukien mutta mainittuihin rajoittumatta menetelmät, jotka hyödyntävät vasta-aineita, koettimia, alukkeita ja niin edelleen, esimerkiksi ELIS-POT-määritys, tetrameerianalyysi, pentameerianalyysi ja veren tai kasvainten eri solutyyppien analyysi.
Syöpä
Keksinnön mukaiset onkolyyttiset vektorit on rakennettu kykeneviksi replikoitumaan soluissa, jotka ilmentävät ihmisen telomeraasin käänteistrans- kriptaasia (hTERT), joka on ihmisen telomeraasin katalyyttinen aladomeeni. Näihin sisältyvät yli 85 % ihmisen kasvaimista, joiden havaitaan lisäävän hTERT-geenin ja sen promoottorin ilmentymistä, kun taas useimmista aikuisten somaattisista soluista telomeraasi puuttuu tai sitä ilmentyy lyhytaikaisesti erittäin matalina entsyymipitoisuuksina. (Shay ja Bacchetti 1997, Eur J Cancer 33:787-791).
Mitkä tahansa syövät tai kasvaimet, mukaan lukien pahanlaatuiset ja hyvänlaatuiset kasvaimet sekä primäärikasvaimet ja metastaasit voivat olla geenihoitojen kohteena, kunhan ne ilmentävät hTERTiä. Keksinnön eräässä erityisessä sovellusmuodossa syöpä on mikä tahansa kiinteä kasvain. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa syöpä valitaan ryhmästä, johon kuuluvat nasofaryngeaalinen syöpä, synoviaalinen syöpä, hepatosellulaarinen syöpä, munuaissyöpä, sidekudossyöpä, melanooma, keuhkosyöpä, suolisto-syöpä, paksusuolen syöpä, peräsuolen syöpä, kolorektaalinen syöpä, aivo-syöpä, kurkkusyöpä, suusyöpä, maksasyöpä, luusyöpä, haimasyöpä, istukka-syöpä, gastrinooma, feokromosytooma, prolaktinooma, T-soluleukemia/lymfoo-ma, neurooma, von hippel-lindaun tauti, zollinger-ellisonin oireyhtymä, lisä-munuaissyöpä, anaalinen syöpä, sappitien syöpä, virtsarakon syöpä, virtsajohtimen syöpä, oligodendrogliooma, neuroblastooma, meningiooma, selkäydin-kasvain, osteokondrooma, kondrosarkooma, Evvingin sarkooma, tuntemattoman primäärisijainnin syöpä, karsinoidi, maha-suolikanavan karsinoidi, fibro-sarkooma, rintasyöpä, Pagetin tauti, kohdunkaulan syöpä, ruokatorven syöpä, sappirakon syöpä, pään syöpä, silmäsyöpä, niskasyöpä, munuaissyöpä, Wilm-sin kasvain, Kaposin sarkooma, eturauhassyöpä, kivessyöpä, Hodgkinin tauti, non-Hodgkinin lymfooma, ihosyöpä, mesoteliooma, multippeli myelooma, munasarjasyöpä, endokriininen haimasyöpä, glukagonooma, haimasyöpä, paraty-roidinen syöpä, penissyöpä, aivolisäkesyöpä, pehmytkudossarkooma, retino-blastooma, ohutsuolisyöpä, mahalaukkusyöpä, kateenkorvasyöpä, kilpirauhas-syöpä, trofoblastisyöpä, rypäleraskaus, kohtusyöpä, endometriaalinen syöpä, emätinsyöpä, ulkosynnytinsyöpä, kuulohermokasvain, mucosis fungoides, in-sulinooma, karsinoidioireyhtymä, somatostatinooma, iensyöpä, sydänsyöpä, huulisyöpä, kalvosyöpä, suusyöpä, hermosyöpä, suulakisyöpä, korvasylki-rauhassyöpä, vatsakalvosyöpä, nielusyöpä, pleuraalinen syöpä, sylkirauhas-syöpä, kielisyöpä ja risasyöpä.
Farmaseuttinen koostumus
Keksinnön mukainen farmaseuttinen koostumus käsittää ainakin yhtä keksinnön mukaista vektorityyppiä. Lisäksi koostumus voi käsittää ainakin kahta, kolmea tai neljää keksinnön mukaista eri vektoria. Keksinnön mukaisen vektorin lisäksi farmaseuttinen koostumus voi käsittää myös muita vektoreita kuten muita adenovirusvektoreita, kuten julkaisussa US2010166799 A1 kuvattuja vektoreita, muita terapeuttisesti tehokkaita aineita, muita aineita, kuten farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantajia, puskureita, apuaineita, adjuvantteja, antisepteja, täyte-, stabilointi- tai sakeutusaineita ja/tai mitä tahansa komponentteja, joita on normaalisti vastaavissa tuotteissa.
Farmaseuttinen koostumus voi olla muodoltaan millainen tahansa annettavaksi sopiva koostumus, esimerkiksi kiinteä, puolikiinteä, tai nestemäinen. Formulaatio voidaan valita ryhmästä, joka koostuu, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, liuoksista, emulsioista, suspensioista, tableteista, pelleteistä ja kapseleista.
Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus toimii in situ -syöpärokot-teena. Tässä yhteydessä ’’in situ -syöpärokote” tarkoittaa syöpärokotetta, joka sekä tappaa kasvainsoluja että lisää immuunivastetta kasvainsoluja vastaan. Virusreplikaatio on voimakas vaaranmerkki immuunijärjestelmälle (tarpeellinen TH1-tyyppiselle vasteelle) ja toimii siten voimakkaana kostimulatorisena tekijänä CD40L-välitteiselle APC:iden kypsymiselle ja aktivoinnille ja NK-solu-jen rekrytoinnille. Myös regulatoristen solujen suppressio auttaa tässä suhteessa. Kasvainsolujen hajoaminen auttaa myös esittelemään kasvainfrag-mentteja ja -epitooppeja APC:ille, ja inflammaatio tuottaa lisää kostimulaatiota. Siten epitooppiriippumaton (eli ei-HLA-rajoitettu) vaste tuotetaan kussakin kasvaimessa ja näin ollen tapahtuu in situ. Kasvainspesifinen immuunivaste aktivoituu kohdesolussa sallien tämän jälkeen kasvaimenvastaisten vaikutusten tapahtumisen koko kohteen tasolla, esim. kaukaisissa etäpesäkkeissä. Vektoreiden tehokas annos riippuu monista tekijöistä, kuten esimerkiksi hoitoa tarvitsevasta kohteesta, kasvaimen tyypistä, kasvaimen sijainnista ja kasvaimen luokasta. Annos voi vaihdella esimerkiksi noin 108 viruspartikkelista (VP:stä) noin 1014 VP:hen, edullisesti noin 5x109 VP:stä noin 1013 VP:hen ja edullisemmin noin 8x109 VP:stä noin 1012 VP:hen. Keksinnön eräässä erityisessä sovellusmuodossa annos on noin 5x101°-5x1011 VP.
Farmaseuttisia koostumuksia voidaan tuottaa millä tahansa alalla tunnetulla tavanomaisella menetelmällä, esimerkiksi hyödyntämällä jotakin seuraavista: erä-, panossyöttö-ja perfuusiokasvatusmoodit, pylväskromatogra-diapuhdistus, CsCI-gradienttipuhdistus ja perfuusiomoodit leikkausteholtaan alhaisissa soluretentiolaitteissa.
Anto
Keksinnön mukainen vektori tai farmaseuttinen koostumus voidaan antaa mille tahansa eukaryoottiselle kohteelle, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu kasveista, elämistä ja ihmisistä. Keksinnön eräässä edullisessa sovel-lusmuodossa kohde on ihminen tai eläin. Eläin voidaan valita ryhmästä, joka koostuu lemmikkieläimistä, kotieläimistä ja tuotantoeläimistä.
Vektorin tai koostumuksen antamisessa kohteeseen voidaan käyttää mitä tahansa tavanomaista menetelmää. Antoreitti riippuu koostumuksen formulaatiosta tai muodosta, taudista, kasvainten sijainnista, potilaasta, liitännäissairauksista ja muista tekijöistä. Keksinnön eräässä edullisessa sovellus-muodossa anto suoritetaan kasvaimensisäisellä, lihaksensisäisellä, valtimonsisäisellä, laskimonsisäisellä, keuhkopussinsisäisellä, rakkulansisäisellä, onte-lonsisäisellä tai peritoneaalisella injektiolla tai suun kautta.
Jo yhdellä keksinnön mukaisen onkolyyttisen adenovirusvektorin antamisella voidaan saada hoitovaikutuksia. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa onkolyyttisiä adenovirusvektoreita tai farmaseuttisia koostumuksia annetaan kuitenkin useita kertoja hoitojakson aikana. Onkolyyttisiä adenovirusvektoreita tai farmaseuttisia koostumuksia voidaan antaa esimerkiksi 1-10 kertaa kahden ensimmäisen viikon aikana, neljän viikon ensimmäisen aikana, kuukausittain tai hoitojakson aikana. Keksinnön eräässä sovellus-muodossa niitä annetaan 3-7 kertaa kahden ensimmäisen viikon aikana, sitten neljännellä viikolla ja sitten kuukausittain. Keksinnön eräässä erityisessä sovellusmuodossa niitä annetaan neljä kertaa kahden ensimmäisen viikon aikana, sitten neljännellä viikolla ja sitten kuukausittain. Hoitojakson pituus voi vaihdella ja kestää esimerkiksi 2-12 kuukautta tai pidempään.
Lisäksi keksinnön mukaisten onkolyyttisten adenovirusvektoreiden anto voidaan edullisesti yhdistää muiden onkolyyttisten adenovirusvektoreiden, kuten julkaisussa US201066799 A1 kuvattujen vektoreiden, antoon. Anto voi olla samanaikaista tai peräkkäistä.
Jotta vältetään neutraloivat vasta-aineet kohteessa, keksinnön mukaiset vektorit voivat vaihdella hoitojen välillä. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa kohteelle annetaan onkolyyttistä adenovirusvektoria, jossa on erilainen kapsidin säieuloke verrattuna aikaisemman hoidon vektoriin. Tässä yhteydessä "kapsidin säieuloke” tarkoittaa säieproteiinin ulokeosaa (kuvio 1a). Vaihtoehtoisesti viruksen koko kapsidi voidaan vaihtaa eri serotyypin kap-sidiksi.
Keksinnön mukainen geenihoito on tehokas yksinäänkin, mutta ade-novirusgeenihoidon yhdistäminen jonkin toisen hoidon, esimerkiksi perinteisen hoidon, kanssa voi olla tehokkaampi kuin kumpikaan yksin. Esimerkiksi yhdistelmähoidon jokainen aine voi toimia itsenäisesti kasvainkudoksessa, adenovi-rusvektorit voivat herkistää soluja kemoterapialle tai sädehoidolle ja/tai kemo-terapia-aineet voivat voimistaa virusreplikaation tasoa tai vaikuttaa kohdesolu-jen reseptoristatukseen. Vaihtoehtoisesti yhdistelmä voi modifioida kohteen immuunijärjestelmää siten, että se on edullista hoidon tehokkuudelle. Esimerkiksi kemoterapiaa voitaisiin käyttää suppressoivien solujen, kuten regulatoris-ten T-solujen, vähentämiseen. Yhdistelmähoidon aineet voidaan antaa samanaikaisesti tai peräkkäin. Edullisessa tämän keksinnön suoritusmuodossa potilaat saavat samanaikaisesti syklofosfamidia hoidon immunologisen vaikutuksen tehostamiseksi.
Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi rinnakkaisen sädehoidon antamisen kohteelle. Keksinnön eräässä toisessa edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi rinnakkaisen kemoterapian antamisen kohteelle. Vielä eräässä edullisessa sovellutusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi muiden onkolyyttisten adenovirus- tai vacciniavirusvektoreiden annon kohteelle. Vektorit voidaan antaa samanaikaisesti tai peräkkäin.
Tässä yhteydessä "rinnakkainen” tarkoittaa hoitoa, joka on annettu ennen, jälkeen tai samanaikaisesti keksinnön mukaisen geenihoidon kanssa. Rinnakkaishoidon jakso voi vaihdella minuuteista useisiin viikkoihin. Edullisesti rinnakkaishoito kestää joitakin tunteja. Eräässä sovellutusmuodossa syklofos-famidi annetaan sekä suonensisäisenä boluksena että metronomisella tavalla.
Yhdistelmähoitoon sopivia aineita ovat mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta all-trans-retinoidihappo, atsasitidiini, atsatiopriini, bleomysiini, karbo-platiini, kapesitabiini, sisplatiini, klorambusiili, syklofosfamidi, sytarabiini, dau-norubisiini, dosetakseli, doksifluridiini, doksorubisiini, epirubisiini, epotiloni, etoposidi, fluorourasiili, gemsitabiini, hydroksiurea, idarubisiini, imatinibi, me-kloretamiini, merkaptopuriini, metotreksaatti, mitoksantroni, oksaliplatiini, pakli- takseli, pemetreksedi, temotsolomidi, teniposidi, tioguaniini, valrubisiini, vin-blastiini, vinkristiini, vindesiinija vinorelbiini.
Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi verapamiilin tai jonkin muun kalsiumkanavan salpaajan antamisen kohteelle. "Kalsiumkanavan salpaaja” tarkoittaa luokkaa lääkkeitä ja luonnonaineita, jotka häiritsevät kalsiumkanavien johtumista, ja se voidaan valita ryhmästä, joka koostuu verapamiilista, dihydropyridiineistä, gallopamiilista, diltiatseemista, mibefradiilista, bepridiilista, fluspirileenista ja fendiliinista.
Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi autofagiaa indusoivat aineiden antamisen kohteelle. Au-tofagia tarkoittaa katabolista prosessia, jossa solun omat komponentit hajoavat lysosomaalisen koneiston kautta. "Autofagiaa indusoivat aineet” tarkoittavat aineita, jotka kykenevät indusoimaan autofagian ja jotka voidaan valita ryhmästä, joka koostuu mainittuihin kuitenkaan rajoittamatta mTOR-inhibiittoreista, PI3K-inhibiittoreista, litiumista, tamoksifeenista, klorokiinista, bafilomysiinista, temsirolimuksesta, sirolimuksesta ja temotsolomidistä. Keksinnön eräässä erityisessä sovellusmuodossa menetelmä käsittää lisäksi temotsolomidin antamisen kohteelle. Temotsolomidi voi olla joko oraalista tai laskimonsisäistä temot-solomidia. Autofagiaa indusoivia aineita voidaan yhdistää immunomoduloivien aineiden kanssa. Eräässä suoritusmuodossa onkolyyttinen adenovirus, joka koodaa CD40L:ää, yhdistetään sekä temotsolomidiin että syklofosfamidiin.
Keksinnön eräässä sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi kemoterapian tai anti-CD20-hoidon tai muun neutraloivia vasta-aineita estävän hoidon antamisen. ”Anti-CD20-hoito” tarkoittaa aineita, jotka kykenevät tappamaan CD20-positiviisia soluja ja jotka voidaan valita ryhmästä, joka koostuu rituksimabista ja muista monoklonaalisista anti-CD20-vasta-aineista. "Neutraloivia vasta-aineita estävä hoito” tarkoittaa aineita, jotka kykenevät estämään normaalisti infektion seurauksena muodostuvien antiviraalisten vasta-aineiden kehittymisen ja jotka voidaan valita ryhmästä, joka koostuu eri kemo-terapia-aineista, immunomodulatorisista aineista, kortikoideista ja muista lääkkeistä. Nämä aineet voidaan valita ryhmästä, joka koostuu mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta syklofosfamidistä, syklosporiinista, atsatiopriinista, metyyli-prenisolonista, etoposidista, CD40L:stä, CTLA4lg4:stä, FK506:sta (takrolis-muksesta), IL-12:sta, IFN-gammasta, interleukiini 10:stä, anti-CD8:sta, anti-CD4-vasta-aineista, myeloablaatiosta ja oraalisista adenovirusproteiineista.
Tässä hakemuksessa kuvattu lähestymistapa voidaan yhdistää myös molekyyleihin, jotka kykenevät voittamaan neutraloivat vasta-aineet. Sellaisia aineita ovat liposomit, lipopleksit ja polyetyleeniglykoli, jotka voidaan sekoittaa viruksen kanssa. Vaihtoehtoisesti neutraloivat vasta-aineet voidaan poistaa immunofereesikolonnilla, joka koostuu adenoviruksen kapsidiproteii-neista.
Keksinnön mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori käynnistää kasvainsolujen virionivälitteisen onkolyysin ja aktivoi ihmisen immuunivasteen kasvainsoluja vastaan. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi sellaisten aineiden annon, jotka kykenevät vähentämään regulatorisia T-soluja kohteessa. "Regulatoristen T-solujen vähentämiseen kykenevät aineet” tarkoittavat aineita, jotka pienentävät suppres-sori-T-soluiksi tai regulatorisiksi T-soluiksi tunnistettujen solujen määrää. Näiden solujen on tunnistettu sisältävän yhtä tai useaa seuraavista immunofeno-tyyppimerkeistä: CD4+, CD25+, FoxP3+, CD127-ja GITR+. Tällaiset suppres-sori-T-solujen tai regulatoristen T-solujen määrää pienentävät aineet voidaan valita ryhmästä, joka koostuu anti-CD25-vasta-aineista tai kemoterapia-aineis-ta.
Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi syklofosfamidin antamisen kohteelle. Syklofosfamidi on yleinen kemoterapia-aine, jota on myös käytetty joissakin autoimmuunitaudeissa. Esillä olevassa keksinnössä syklofosfamidia voidaan käyttää voimistamaan virusreplikaatiota ja CD40L:n käynnistämän NK-solujen ja sytotoksisten T-solu-jen stimulaation vaikutuksia parannetun immuunivasteen saamiseksi kasvainta vastaan. Sitä voidaan käyttää laskimonsisäisinä bolusannoksina tai antaa suun kautta pieninä annoksina metronomisesti tai näiden yhdistelmänä.
Mikä tahansa keksinnön menetelmä tai käyttö voi olla joko in vivo, ex vixo tai in vitro -menetelmä tai käyttö.
Eräs havaittu adenovirusvektoreiden käytön rajoitus syövän hoidossa on niiden immunogeenisyys. Kuitenkin koska syöpäpotilaan immuunijärjestelmä ei ole onnistunut poistamaan kasvainta kasvainympäristön immunosup-pressiivisen luonteen johdosta, adenovirusten immunogeenisyydestä tulee etu. Esillä olevassa keksinnössä tätä vaikutusta on voimistettu ylläpitämällä repli-koitumiskyky ja aseistamalla immunostimulatorisella molekyylillä, CD40L:llä. Esillä olevan keksinnön mukaisissa adenovirusvektoreissa esiintyy neljä tärkeää piirrettä. Kasvaimen transduktiota on parannettu kapsidimodifikaatiolla, ku ten serotyyppikimerismillä Ad3-ulokkella muuten Ad5:n kapsidissa. Kasvainse-lektiivisyys on saavutettu insertoimalla hTERT-promottori E1A:n eteen. Antigeeniä esittelevien solujen rekrytointi ja stimulaatio Th1-tyyppisen sytotoksisen T-soluvasteen indusoimiseksi on saatu aikaan aseistamalla virus CD40L:Mä. Lopuksi, CD40L voi aiheuttaa myös CD40+-kasvainten apoptoosia.
Esillä olevan keksinnön mukaisten adenovirusten on havaittu olevan tehokkaita CD40L:n ilmentymisen indusoinnissa sekä CD40+- että CD40-soluissa. Onkolyyttisellä mallilla, joka varmistaa, että onkolyysi lopulta tappaa transdusoidut kasvainsolut, CD40L:n erittyminen tai vapautuminen hajoavista soluista saa aikaan apoptoottisen sivustakatsojavaikutuksen lähellä olevissa kasvainsoluissa. Kuitenkin uskotaan, että CD40L:n käytön tärkein etu on im-munostimulatorinen vaikutus.
On osoitettu, että onkolyyttisellä adenoviruksella Ad5/3-hTERT-E1A on merkittävästi korkeampi onkolyyttinen teho verrattuna villityypin Ad5:n tehoon. (Bauerschmitz GJ, et ai., Cancer Res 2008;68:5533-9). Samassa tutkimuksessa, kun hTERT:n selektiivisyyttä verrattiin paneeliin onkolyyttisiä ade-noviruksia, joissa esiintyy erilaisia kasvainspesifisiä promoottoreita, kuten a-laktalbumiini, syklo-oksigenaasi tai monilääkeresistenssiproteiini, Ad5/3-hTERT-E1A:lla saatiin parhaat tulokset in vitro ja merkittävä kasvaimenvastai-nen vaikutus in vivo. Siten Ad5/3-hTERT-E1A on kunnianhimoinen kontrollivi-rus esillä olevan keksinnön mukaisille adenoviruksille.
Kun esillä olevan keksinnön mukaisia onkolyyttisiä adenoviruksia, joista on esimerkkinä Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L, verrattiin ei-aseistettuun onkolyyttiseen adenovirukseen Ad5/3-hTERT-E1A, havaittiin, että molemmat virukset olivat yhtä tehokkaita, mitä tulee onkolyyttiseen tehoon in vivo (kuviot 4c, 4d). Tämä oli tärkeä havainto, koska siirtogeenin ilmentyminen saattaa joskus inhiboida virusten tehoa ja Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L oli hitaampi kuin Ad5/3-hTE RT-E1A A549-soluilla in vitro. In vitro Ad5/3-hTE RT-E 1A-hCD40L:llä oli enemmän kasvaintenvastaista aktiivisuita CD40+-EJ-soluilla kuin CD40-A549-soluilla, kun taas päinvastainen oli totta Ad5/3-hTERT-E1A:lle (kuviot 3c, 3d).
Vaikka keksinnön mukaisten onkolyyttisten adenovirusten, kuten Ad5/3-hTERT-E1 A-hCD40L:n, suurin käyttö voisi olla CD40+-kasvainten yhteydessä, jolloin kaikki kolme kasvaimenvastaista aktiivisuutta (onkolyysi, apoptoosi, immuunistimulaatio) voisivat vaikuttaa, uskotaan, että keksinnön mukaisten adenovirusten mahdollinen käyttö ei rajoitu CD40+-kasvaimiin. On olemassa raportteja, joissa osoitetaan, että CD40L aktivoi antigeenejä esitteleviä soluja jopa silloin, kun kasvain on CD40- (Noguchi M, et ai., Cancer Gene Ther 2001;8:421-9; Sun Y, et ai., Gene Ther 2000;7:1467-76. Koska jopa ei-aseistetuilla onkolyyttisillä adenoviruksilla on osoitettu käyttöä ihmisillä, onko-lyyttiset adenovirukset, joissa on hCD40L, saattaisivat edustaa parannusta kasvaimen CD40-statuksesta riippumatta.
Kliininen ja prekliininen työ kasvainimmunologian ja rokotekehityk-sen alalla viimeisten kahden vuosikymmenen aikana on osoittanut, että kas-vaimenvastaisen immuunivasteen indusointi voidaan saada aikaan useilla lähestymistavoilla. Valitettavasti lähestymistavat, joissa pyritään immuunivasteiden indusointiin, eivät kuitenkaan ole olleet kovinkaan tehokkaita potilaille, joilla on edenneitä ja erittäin immunosuppressoivia kasvaimia. Sen sijaan ensimmäiset menestykselliset immunoterapeuttiset aineet sisältävät joko koulutettuja ja stimuloivia T-soluja (kasvaimen välittämän immunosuppression voittamiseksi) tai vasta-aineita, jotka kykenevät vähentämään immunosuppressiivisuutta (Motohashi et ai. 2006 Clin Cancer Res 12:6079-86; Hodi et ai. 2008 Nature Clinical Practice Oncology 5:557-561). Monet tutkijat käyttävät myös esikäsittelyä “tehdäkseen tilaa” aktivoiduille T-soluille ja vähentääkseen immunosuppressoivia soluja. Siten kriittinen opetus on, että menestyksellinen immuno-terapia saattaa tarvita kasvainten hankkiman immunologisen toleranssin murtamista.
Kuitenkin esillä olevan keksinnön mukaisilla adenovirusvektoreilla esiintyi kasvaimenvastaisia vasteita potilailla, joilla oli huonosti hoitoon reagoiva ja immunosuppressiivinen tauti, ja nämä vaikutukset liittyivät immuniteetin indusointiin ja Th2—>Th1 -muutokseen.
Johtopäätöksenä: keksinnön mukaisilla onkolyyttisillä, CD40L:ää ilmentävillä adenovirusvektoreilla, kuten esimerkiksi Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:llä, saadaan merkittä kasvaimenvastainen vaikutus. Tärkeä osa vaikutuksesta on Th1-tyypin immuunivasteen indusointi, mikä johtaa sytotoksisten T-solujen kerääntymiseen kasvainkohtaan ja niiden aktivoitumiseen.
Seuraavat esimerkiksi havainnollistavat esillä olevaa keksintöä, mutta niitä ei ole tarkoitettu mitenkään rajoittaviksi.
Esimerkit
Eläimet
Helsingin yliopiston koe-eläintoimikunta ja Etelä-Suomen lääninhallitus tarkasti ja hyväksyi kaikki eläinprotokollat. C57Black-hiiret ja NMRI-kar-vattomat hiiret saatiin yhtiöstä Taconic (Ejby, Tanska) 4-5-viikon ikäisinä ja niitä pidettiin karanteenissa vähintään yhden viikon ajan ennen tutkimusta. Hiirten terveydentilaa monitoroitiin usein, ja niin pian kuin ilmeni minkäänlainen merkki kivusta tai tuskasta, ne tapettiin.
Solulinjat
Immuunipuutteisissa malleissa käytettiin 106 A549-soluja (ihmisen keuhkon adenokarsinoomasolulinja, joka on saatavissa American Type Culture Collection -talletuslaitoksesta, ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA) tai EJ-soluja (ihmisen rakkokarsinoomasolulinja, jonka ystävällisesti antoi Tri Angelina Loskog, Uppsalan yliopisto, Ruotsi). Ra-mos-Blue™-solulinja oli InvivoGen-yhtiöstä (San Diego, CA, USA)
Immunokompetentissa mallissa 5x105 MB49-solua (hiiren rakkokarsinoomasolulinja, jonka ystävällisesti antoi Tri Angelina Loskog, Uppsalan yliopisto, Ruotsi) injektoitiin ihonalaisesti C57Black-hiirten (n = 7 hiirtä/ryhmä) ajeltuihin kylkiin. Virus injektoitiin kolmesti kasvaimensisäisesti annoksena 3 x 108 VP/kasvain päivinä 0, 2 ja 4, kun kasvaimet saavuttivat koon noin 5x5 mm.
Statistinen analyysi
Kahden otoksen Studentin t-testiä käytettiin ja p-arvoa <0,05 pidettiin merkitsevänä. Eloonjäämistiedot käsiteltiin Kaplan-Meier-analyysillä.
Esimerkki 1. Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:n, Ad5/3-CMV-hCD40L:n ja Ad5/3-CMV-mCD40L:n kloonaus
Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L (SEQ ID. NO:5) muodostettiin ja monistettiin käyttäen standardeja adenoviruksen valmistustekniikoita (Kanerva A, et ai., Mol Ther 2002;5:695-704; Bauerschmitz GJ, et ai., Mol Ther 2006;14:164-74; Kanerva A ja Hemminki A, Int J Cancer 2004; 110:475-80; VolkAL, et ai., Cancer Biol Ther 2003;2:511-5). Lyhyesti, ihmisen CD40L-cDNA (ystävällinen lahja prof. Eliopoulosilta, Kreetan yliopisto, Heraklion, Kreikka) monistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) käyttäen spesifisiä alukkeita (forward-aluke: TTTAACATCTCTCCCTCTGTGATT; SEQ ID N0:3 ja reverse-aluke: TA-TAAATGGAGCTTGACTCGAAG; SEQ ID N0:4), jotka sisältävät spesifisten restriktiokohtien Sun\IMun\ insertion. PCR-monistustuote jatkokloonattiin sitten pTHSN:ään (Kanerva A., et ai., Gene Ther 2005;12:87-94) ja rekombinoitiin sen jälkeen pAd5/3-hTERT-E1A:n kanssa (Bauerschmitz GJ, et ai., Cancer Res 2008;68:5533-9) pAd5/3-hTERT-E1A-hCD40L:n muodostamiseksi. Tämä plasmidi linearisoitiin Pacl:Mä ja transfektoitiin A549-soluihin monistusta ja talteenottoa varten.
Kaikki kloonausvaiheet varmistettiin PCR:llä ja useilla restriktiodi-gestioilla. pTHSN- hCD40L-sukkulaplasmidi sekvensoitiin. Villityypin E1:n poissaolo varmistettiin PCR:llä. E1-alue, siirtogeeni ja säie tarkistettiin lopullisesta viruksesta sekvensoimalla ja PCR:llä. Virustuotannon kaikki vaiheet, mukaan lukien transfektio, tehtiin A549-soluilla villityypin rekombinaation riskin välttämiseksi, kuten aikaisemmin on kuvattu (Kanerva A. et ai. 2003, Mol Ther 8, 449-58; Baeurschmitz G. J. et ai. 2006, Mol Ther 14, 164-74). hCD40L on E3-promoottorin alainen (erityisesti endogeenisten viruksen E3A-geenieks-pression kontrollielementtien alainen), mikä johtaa replikaatioon assosioituvien siirtogeenien ilmentymiseen, joka alkaa noin 8 h infektion jälkeen. E3 on koskematon lukuun ottamatta 6.7K/gp19K\n deleetiota. Kuviossa 1a esitetään pAd5/3-hTERT-E1A-hCD40L:n rakenne.
Ei-replikoituvien adenovirusten Ad5/3-CMV-hCD40L ja Ad5/3-CMV-mCD40L muodostamiseksi ekspressiokasetit, joissa oli joko hCD40L tai mCD40L, insertoitiin pShuttle-CMV-plasmidin (Stratagene, La Jolla, CA, USA) monikloonauspaikkaan. Sukkulaplasmidit rekombinoitiin pAdeasy-1.5/3-plas-midin (Krasnykh VN, et ai., J Virol 1996;70:6839-46) kanssa, jossa on koko adenoviruksen genomi, ja saadut rescue-plasmidit transfektoitiin 293-soluihin (ihmisen transformoitu alkiomunuaissolulinja, joka on saatavissa yhtiöstä Mic-robix, Toronto, Ontario; Kanada) Ad5/3-CMV-hCD40L:n ja Ad5/3-CMV-mCD40L:n muodostamiseksi. Kuviossa 1b ja 1c esitetään Ad5/3-CMV-hCD40L:n ja vastaavasti Ad5/3-CMV-mCD40L:n rakenteet ja kloonaus.
Kontrollivektorit Ad5/3-Luc1 (Kanerva A, et ai., Clin Cancer Res 2002;8:275-80) ja Ad5/3-hTERT-E1A (Bauerschmitz GJ, et ai., Cancer Res 2008; 68:5533-9) on raportoitu aikaisemmin. Suhteet VP:n suhde plakkia muodostaviin yksiköihin Ad5/3-Luc1:lle, Ad5/3-hTERT-E1A:lle, Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:lle, Ad5/3-CMV-hCD40L:lle ja Ad5/3-CMV-mCD40L:lle olivat 25, 31,200, 138 ja vastaavasti 86.
Esimerkki 2. Muodostettujen adenovirusten ilmentäminen ja funktionaalisuus: in vitro ja in vivo
Virtaussytometriaa ja ELISA-menetelmää (enzyme-linked immunos-orbent assay) käytettiin hCD40L:n ilmentymisen tutkimiseksi. Virtaussytomet-ristä analyysiä varten ihmisen alkion munuais-293-solut infektoitiin Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:llä tai Ad5/3-CMV-hCD40L:llä käyttäen 10 VP/solu kasvatusalustassa, joka sisälsi 2 % vasikansikiönseerumia (FCS). Kontrollisolut (mock) käsiteltiin pelkästään 2-%:isella Dulbeccon modifioidulla Eaglen alustalla. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin solut värjättiin joko hCD40L-FITC-(555699, BD Biosciences Pharmingen Franklin Lakes, NJ) -vasta-aineella 30 minuutin ajan tai isotyyppikontrollilla (IC) sellulaarisesta autofluoresenssista ja ei-antigeenispesifisestä sitoutumisesta syntyvän taustafluoresenssin mittaamiseksi. Virtaussytometria-analyysi suoritettiin BDLSR-laitteella (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).
ELISA-analyysiä varten A549-ksenograftit ja syngeeniset MB49-kasvaimet indusoitiin ja käsiteltiin joko Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:llä, Ad5/3-CMV-hCD40L:llä tai Ad5/3-CMV-mCD40L:llä kuten edellä. Verinäytteet otettiin päivinä 4, 8 ja 12 ensimmäisen virusinjektion jälkeen. hCD40L:n analysoimiseksi Ad5/3-CMV-hCD40L:llä käsiteltyjen hiirten seerumista veri otettiin talteen vain kahdesti (päivä 4 ja 8) nopean kasvaimen kasvun takia, ja eläimet oli tapettava päivänä 8. hCD40L- ja mCD40L-pitoisuudet seerumissa määritettiin ihmisen CD40-ligandi-ELISA-kitillä (ELH-CD40L-001, RayBiotech Inc, Nor-cross GA, USA) ja hiiren sCD40L-ELISA-kitillä (BMS6010, Bender Medsytems, Itävalta) valmistajan protokollan mukaan.
Kuviossa 2a esitetyt virtaussytometriatulokset osoittavat, että sekä replikoitumiskykyinen Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L että replikoitumiskyvytön Ad5/3-CMV-hCD40L johtivat korkeaan CD40L:n ilmentymiseen in vitro.
hCD40L:n ja mCD40L:n ilmentyminen varmennettiin myös in vivo ELISA-analyysillä (kuvio 2b). Ad5/3-CMV-hCD40L johti korkeampiin seerumipitoisuuksiin kuin Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L, koska transdusoidut A549-solut ovat CD40-, eikä CD40L:n odoteta tappavan niitä. Siten transdusoidut solut jatkavat CD40L:n tuottamista ad inifinitum, kun taas Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L saa aikaan A549-solujen onkolyysin, joka rajoittaa sitä aikaa, mikä niillä on tuottaa CD40L:ää. Tämä saattaisi olla edullista turvallisuuden näkökannalta, koska CD40L saattaa aiheuttaa sivuvaikutuksia, kun sitä on läsnä korkeina pitoisuuksina. Ihmisen maksimaalisen siedetyn annoksen rhCD40L:ää oli raportoitu vastaavan 2900 pg/ml:n seerumipitoisuutta, joka on 100 kertaa korkeampi kuin mikä nähtiin Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:llä. Ad5/3-CMV-mCD40L johti matalampiin seerumin mCD40L-pitoisuuksiin kuin Ad5/3-CMV-hCD40L, oletettavasti koska hiiren kudokset ja solut metaboloivat mCD40L:ää, kun taas hCD40L todennäköisesti ei, koska se on inaktiivinen hiirissä.
Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:n ilmentämän CD40L:n funktionaalisuus tutkittiin keuhkosyöpäsoluissa (A549). Solulinjan A549 yksikerroksia (5x106 solua/T25-pullo) infektoitiin annoksella 1000 VP/solu Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:ää ja Ad5/3-hTERT-E1A:ta, ja yhtä pulloa ei infektoitu (mock). Supernatantti kerättiin 48 tuntia infektion jälkeen ja suodatettiin 0,02 pm:n suo-dattimilla (VVhatman 6809-1002, Maidstone England, Englanti). Supernatanttia käytettiin kahteen funktionaalisuusmääritykseen.
Ensimmäisessä funktionaalisuusmäärityksessä EJ-solulinjan yksikerrokset transfektoitiin plasmidilla pNiFty-Luc (InvivoGen) ja viljeltiin yön yli. pNiFty-Luc on geeniteknisesti valmistettu endoteelisolu-leukosyytti-adheesio-molekyylin (ELAM) promoottori, joka yhdistää viisi NF-KB-kohtaa ja koodaa lu-siferaasia. Indusointi NF-κΒ:Mä aktivoi promoottorin, mikä johtaa lusiferaasin ilmentymiseen.
Supernatantti, joka oli otettu talteen A549-yksikerroksista, lisättiin EJ-soluille ja viljeltiin 12 tuntia. Yhtä pg/ml rekombinanttia hCD40L-proteiinia (Abcam, Cambridge, MA) käytettiin positiivisena kontrollina määrityksessä. Solut hajotettiin ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin (Luciferase Assay System, Pro-mega, Madison, Wl). Mockarvot vähennettiin ja Nf-KB-aktiivisuus ilmaistaan lusiferaasin ilmentymisen lisääntymisen monikertana (suhteelliset valoyksiköt, RLU). Määritys suoritettiin viisi kertaa ja kullakin kerralla kolmoismäärityksenä. Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM; ***, P<0,001 (kuvio 2c).
Toinen funktionaalisuusmääritys suoritettiin RAMOS-Blue-soluilla. Ramos-Blue-solulinja on ihmisen B-lymfosyyttisolulinja, joka stabiilisti ilmentää NF-KB/AP-1:lla indusoitavaa SEAP-reportterigeeniä. Stimuloitaessa nämä solut tuottavat supernatanttiin SEAP:ia, joka voidaan mitata käyttäen QUANTI-Blue-määritysreagenssia (InvivoGen, San Diego, CA, USA) (kuvio 2d).
Nämä funktionaalisuusmääritykset osoittavat, että virus tuottaa biologisesti aktiivista hCD40L:ää. 2,3-kertainen lisäys havaitaan NF-KB-aktivaa-tiossa hCD40L:Mä, jota ilmentyy replikoitumiskykyisestä Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L-adenoviruksesta EJ-soluissa, jotka on transfektoitu ELAM-plasmidilla (kuvio 2c), ja 4,5-kertainen lisäys NF-kB/AP-1 :ssä Ramos-Blue-soluissa (kuvio 2d). Yhdessä tarkasteltuna nämä tulokset vahvistavat, että muodostetut virukset ilmentävät täysin funktionaalista CD40L:ää sekä in vitro että in vivo kaikilla pitoisuuksilla, joiden ennustetaan oleva turvallisia ihmisillä rekombinantin hCD40L:n käytön perusteella.
Esimerkki 3. Muodostettujen adenovirusten onkolyyttisen tehon määritys in vitro
Muodostettujen adenovirusten onkolyyttisen tehon määrityksessä käytettiin EJ- (CD40+) ja A549- (CD40-) solulinjoja. Solujen elinkykymäärityk-sessä 96-kuoppaisilla levyillä olevat solut infektoitiin eri pitoisuuksilla (0,1, 10, 100, 1000 VP/solu) Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:ää, Ad5/3-CMV-hCD40L:ää ja niiden kontrolliviruksia Ad5/3-hTERT-E1A ja Ad5/3-Luc1, suspendoituina 2-prosenttiseen DMEM:iin. Yhden tunnin kuluttua solut pestiin, ja niitä inkuboitiin 7 päivää kasvualustassa, joka sisälsi 5 % FCS:ää. Sitten solujen elinkyky analysoitiin käyttäen MTS-määritystä (Cell Titer 96 AQueous One Solution Prolife-ration Assay, Promega).
Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:lla täydellinen tappo nähdään solupitoi-suudella 1000 viruspartikkelia/solu (VP/solu) EJ (CD40+) -solulinjassa (kuvio 3b). A549 (CD40-) -solulinjassa Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:n onkolyyttinen teho on hitaampi verrattuna kontrollivirukseen Ad5/3-hTERT-E1A (kuvio 3a). Kun verrataan A549- ja EJ-solulinjoja, jotka on infektoitu samoilla annoksilla Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:lla, voidaan nähdä merkittävä kasvu EJ (CD40+) -solujen solutapossa (kuvio 3c). Samat solulinjat, kun ne infektoidaan replikoituni iskykyisellä kontrolliadenoviruksella Ad5/3-hTERT-E1A, antavat päinvastaiset tulokset: A549 on herkempi virukselle (kuvio 3d). Nämä kokeet osoittavat, että Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:llä on onkolyyttistä tehoa, joka on verrannollinen kontrolliviruksen kanssa, ja se tappaa CD40+-soluja tehokkaammin kuin positiivinen kontrollivirus.
Esimerkki 4. hCD40L:ää ilmentävien adenovirusten teho in vivo hiirissä
Ihmisen adenoviruksen tuotannollisen replikaation puuttuminen hiiri-soluista ja hCD40L:n inaktiivisuus hiirikudoksissa hankaloittavat Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:n esikliinistä arviointia. Siksi päätettiin eristää kolme kasvaimen-vastaista mekanismia kolmeen eri hiirimalliin.
Immuunipuutteisia malleja varten 106 A549-solua injektoitiin ihonalaisesti karvattomien hiirten kylkiin (n=5 hiirtä/ryhmä). Kun kasvaimet saavut tivat koon noin 5x5 mm:n, ihonalaista A549:ää (CD40-) (kuvio 4a) tai EJ:tä (CD40+) (kuvio 4b) kantaviin hiiriin injektoitiin kasvaimensisäisesti replikoitu-miskyvytöntä adenovirusta Ad5/3-CMV-hCD40L annoksena 108 VP/kasvain kolmena päivänä (0, 2 ja 4), ja kasvaimen kasvua seurattiin. Mock-eläimet saivat vain PBS:ää. Tämä koe osoittaa, että CD40L:Mä on kasvaimenvastaista aktiivisuutta CD40+-soluissa (kuvio 4b), kun taas kasvaimenvastaista aktiivisuutta ei voida nähdä CD40-soluissa (kuvio 4a).
Replikoitumiskykyisiä malleja varten kasvaimet injektoitiin kasvaimensisäisesti Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:llä, Ad5/3-hTERT-E1 A:Mä ja mockel-la annoksena 108 VP/kasvain kolmena päivänä (0, 2 ja 4), ja kasvaintilavuuksia verrattiin suhteessa alkuperäiseen kokoon. Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:n havaittiin olevan yhtä tehokas kuin positiivinen kontrollivirus Ad5/3-hTERT-E1A sekä CD40-negatiivisissa (kuvio 4c) että CD40-positiivisissa kasvaimissa (kuvio 4d). Tämä koe osoittaa Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:n onkolyyttisen tehon, mutta ei ota huomioon CD40L:n immunologista aktiivisuutta, koska hCD40L ei ole aktiivinen hiirissä. Tämä koe osoittaa lisäksi, että siirtogeenin ilmentymien ei haittaa Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:n onkolyyttistä vaikutusta (kuviot 4c, 4d).
Immunokompetenttia mallia varten 5x105 MB49-solua injektoitiin ihonalaisesti C57Black-hiirten ajeltuihin kylkiin (n=7 hiirtä/ryhmä). Ad5/3-CMV-mCD40L-virusta injektoitiin kolme kertaa kasvaimensisäisesti annoksena 3x108VP/kasvain päivinä 0, 2 ja 4, kun kasvaimet saavuttivat noin 5x5 mm:n koon. Kasvaimen kasvua seurattiin ja elimet/kasvaimet otettiin talteen kokeiden lopussa. Kudokset upotettiin paraffiiniin, ja histologia ja immunohistokemia (katso alla oleva esimerkki 5) suoritettiin.
Onkolyysin vaikutuksen tutkimiseksi yhdessä CD40L:n aiheuttaman apoptoosin induktion kanssa ilman immunologisista vaikutuksista johtuvaa vääristymistä käytettiin CD40+-ksenograftimallia (karvattomat hiiret ilman T-soluja). CD40L:n ilmentymisellä oli sinänsä kasvaimenvastainen aktiivisuus (kuvio 4b), ja Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L oli yhtä tehokas kuin positiivinen kontrollivirus, mikä osoittaa, ettei siirtogeenin ilmentymien haittaa Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:n onkolyyttistä vaikutusta (kuvio 4d).
Lisäksi sen osoittamiseksi, että CD40L edistää apoptoosia CD40+-kasvaimissa karvattomissa hiirissä, EJ (CD40+) -kasvaimia kantaviin hiiriin injektoitiin viruksia Ad5/3-Luc1 (mock), Ad5/3-hTERT-E1 A, Ad5/3-hTERT-E 1A-hCD40L ja Ad5/3-CMV-hCD40L kolme kertaa. 26 päivän kuluttua eläimet tapettiin ja kasvaimet otettiin talteen ja upotettiin paraffiinilohkoihin (n = 5 hiir- tä/ryhmä). Immunohistokemia (yksityiskohtia varten, katso alla oleva esimerkki 5) kaspaasi-3:n suhteen suoritettiin apoptoosin mahdollisen induktion tutkimiseksi. Vaikka Ad5/3-hTERT-E1A, kuten onkolyyttisille adenoviruksille on raportoitu, ja vaikka Ad5/3-CMV-hCD40L, sen hCD40L:ää ilmentämisen ja sen apoptoottisen vaikutuksen johdosta, indusoivat jonkin verran apoptoosia, Ad5/3-hTERT-E1 A-hCD40L:llä nähtiin paljon enemmän apoptoosia (kuvio 5).
Esimerkki 5. mCD40L:n kasvaimenvastainen aktiivisuus syngeenisissä immunokompetenteissa eläimissä
Immunohistokemia, jota käytettiin mCD40L:n analyysissä syngeeni-sessä immunokompetentissa eläinmallissa, suoritettiin seuraavasti. Kudokset kiinnitettiin 4-prosenttiseen formaliiniin, ja paraffiinilohkot valmistettiin. Neljä pm paksut kudosleikkeet valmistettiin, ja niitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen kanssa taulukossa 1 mainittuina laimennoksina. Leikkeitä inkuboitiin to-teamiskittien kanssa joko kaneissa, jolloin käytettiin kittiä LSAB2+ Dako System (DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA (K0673)), tai rotissa nostatettuja vasta-aineita, jolloin käytettiin IHC Select -kittiä (DAB150-RT, Millipore, MA, USA). Leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinilla ja vesi poistettiin etanolilla, kirkastettiin ksyleenillä ja suljettiin kanadanbalsamilla. Valokuvat otettiin Axio-plan2-mikroskoopilla (Carl Zeiss), joka oli varustettu Axiocarrrlla (Zeiss).
Taulukko 1.Tutkimuksessa käytetyt vasta-aineet
Figure FI124926BD00341
CD40L:n immunologisen vaikutuksen tutkimiseksi ilman onkolyysi-vaikutuksesta johtuvaa vääristymistä C57Black-hiiret, jotka kantoivat ihonalaisia MB49-kasvaimia, injektoitiin kasvaimensisäisesti replikoitumiskyvyttömällä adenoviruksella Ad5/3-CMV-mCD40L tai kontrollilla Ad5/3-Luc1 annoksena 3x108VP/kasvain päivinä 0, 2 ja 4 (n=6 hiirtä/ryhmä). Kasvaimen kokoa seurattiin ja se esitettiin graafisesti kokoa päivänä 0 vastaan. Tulokset esitetään kuviossa 6a. Ad5/3-CMV-mCD40L:llä käsitellyssä ryhmässä esiintyy merkitsevä kasvaimenvastaisen aktiivisuuden kasvu (p=0,001).
Apoptoosin immunohistokemiallista määritystä varten (aktiivinen kaspaasi-3) Ad5/3-CMV-mCD40L:llä ja Ad5/3-Luc1:Mä käsitellyissä kasvaimissa, kasvaimet kerättiin 16 päivän kuluttua ensimmäisestä käsittelystä ja analysoitiin kaspaasi-3-aktiivisuuden suhteen. Tulokset esitetään kuviossa 6b. Positiivinen värjäytyminen, ts. ruskeana näkyvän aktiivisen kaspaasi-3:n ilmentyminen, viittaa siihen, että kasvaimenvastainen aktiivisuus johtui osittain apop-toosista, jonka indusoi mCD40L:n sitoutuminen CD40+ MB49-soluihin (kuvio 6b).
Isännän immuunivasteiden analysoimiseksi syngeenisessä hiirimal-lissa, 4 pm:n kasvainleikkeet värjättiin immunohistokemialla eri merkeille: mak-rofagi (F4/80), leukosyytit (CD45) ja B-lymfosyytit (CD19) (kuvio 7a). Kasvain-leikkeet värjättiin myös auttaja- (CD4+) ja sytotoksisille (CD8+) T-soluille (ruskeat) (kuvio 7c).
Esimerkki 6. Vaikutus antigeeniä esitteleviin soluihin Tärkeä osa CD40L:ää koodaavien virusten mahdollista kasvaimen-vastaista aktiivisuutta on niiden vaikutus antigeeniä esitteleviin soluihin. Syto-kiinianalyysi IL-12:lle, TNF-a:lle, INF-y:lle ja RANTES:lle suoritettiin seerumista ja viljeltyjen pernasolujen supernatantista hiiristä, joita oli käsitelty Ad5/3Luc1:llä tai Ad5/3-CMV-mCD40L:llä, käyttäen BD FACSArray -pakkausta valmistajan protokollan mukaan (BD Cytometric Bead Array Mouse Flex Sets, BD Biosciences). Pernat hienonnettiin, ja pernasoluja viljeltiin 10-prosentti-sessa DMEM:ssä, jota oli täydennetty 1 %:lla L-glutamiiinia ja penisilliinil-lä/streptomysiinillä. Supernatantit kerättiin 24, 48 ja 72 tunnin kuluttua ja analysoitiin sytokiinien suhteen FACSArray-kitillä.
FACSArray-analyysi osoittaa lisääntynyttä INF-y-, TNF-α-, RAN-TES- ja IL-12-tuotantoa ryhmässä, joka on käsitelty Ad5/3-CMV-mCD40L:llä (kuvio 7A). IL-12:n induktio viittaa makrofagien, joka on antigeeniä esittelevien solujen tärkeä luokka, aktivoitumiseen. INF-y, TNF-α ja RANTES ovat Th1- tyypin immuniteetin indikaattoreita ja viittaavat sytotoksisen T-soluvasteen in-dusoitumiseen.
Tämän korreloimiseksi solutasolle histologiset leikkeet analysoitiin kasvaimista, jotka oli kerätty 16 päivää Ad5/3-CMV-mCD40L-injektion jälkeen. Nähtiin lisääntynyt makrofagien (F4/80) ja leukosyyttien (CD45) rekrytointi, mutta vain pieni lisääntyminen B-lymfosyyteissä (CD19), mikä viittaa siihen, että infiltraatti oli pääasiassa T-soluja (kuvio 7b). T-solujen alaryhmien analyysi osoitti, että useimmat näistä soluista olivat CD8+ -sytotoksisia T-soluja, vaikka pienempi lisääntyminen nähtiin myös CD4+-auttaja-T-soluissa (kuvio 7c). Nämä havainnot osoittavat, että mCD40L:n tuotanto syngeenisissä MB49-kas-vaimissa immunokompetentissa eläinmallissa aiheutti voimakkaan kasvaimen-vastaisen immuunivasteen, jonka välittivät Th1-vasteelliset elementit ja syto-toksisten T-solujen infiltraatio (kuvio 7).
Esimerkki 7. Kasvainnäytteiden analyysi ennen hoitoa hoidon tehon ennustamiseksi ihmispotilaassa
Yhdelle potilaalle (R73) oli saatavissa solutappomääritykseen (MTS-assay) tuoretta, pahalaatuista keuhkopussinestettä, joka oli kerätty ennen hoitoa. Onkolyyttiset adenovirukset, joissa oli kimeerinen Ad5/3-kapsidi (kapsidi, joka on identtinen Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:n kanssa), tappoivat tehokkaammin potilaan keuhkopussinesteessä olevia soluja verrattuna onko-lyyttisiin adenoviruksiin, joissa oli serotyypin 5 kapsidi. Mielenkiintoista on, että tämän potilaan kasvainmerkki Ca15-3 asteittain väheni Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L-hoidon seurauksena, ja 44 %:n väheneminen nähtiin 74 päivää hoidon jälkeen (taulukko 3). Tulokset viittaavat siihen, että adenovirukset, joissa on kimeerinen Ad5/3-kapsidi, tappavat tehokkaasti ihmisen kasvainsoluja, ja ex vivo -soluntappomääritys voisi olla mielenkiintoinen kliinisen käyttökelpoisuuden ennustamisen testaamisessa.
Esimerkki 8. Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:n turvallisuus ja teho ihmis-syöpäpotilaissa /. Potilaat
Potilaita, joilla oli pitkälle edenneitä ja hoitoon huonosti reagoivia kiinteitä kasvaimia, pyydettiin osallistumaan Suomen Lääkealan turvallisuus ja kehittämiskeskuksen (FIMEA) kontrolloimaan Advanced Therapy Access Prog-ram -ohjelmaan. Tiedot potilaista, jotka saavat Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:ää, annokset ja aikaisemmat hoidot luetellaan taulukoissa 2 ja 3.
Yhdeksän potilasta, kolme naispuolista (R73, N235, R8) ja kuusi miespuolista (T181, C239, C229, I244, P251, C220), joilla oli pitkälle edenneitä kiinteitä kasvaimia, jotka reagoivat huonosti standardihoitoihin (taulukko 2), hoidettiin yhdellä ainoalla Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L-hoidolla (R73) tai Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L-sarjahoidolla (T181, C239, I244, P251, N235, C220) kasvaimensisäisesti, laskimonsisäisesti tai intraperitoneaalisesti (taulukko 2). Potilas C229 sai sarjahoitoa Ad5-RGD-D24-GMCSF:llä (PCT/FI2009/051025) ja Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:llä, ja potilas R8 sai sarjahoitoa Ad5-D24-GMCSF:llä, Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:llä ja Ad3-hTERT-E1 :llä (WO2010/086838). Mukaanottokriteerit olivat kiinteät kasvaimet, jotka reagoivat huonosti tavanomaisiin hoitoihin, WFIO:n suoritusarvo 3 tai alle, eikä suuria elinten toimintojen puutteita. Hylkäyskriteerit olivat elinsiirto, HIV, vaikea sydänverisuoni-, metabolinen tai keuhkosairaus tai muut oireet, löydökset tai taudit, jotka estivät onkolyyttisen virushoidon. Kirjallinen suostumusasiakirja saatiin ja hoidot hallinnoitiin hyvän kliinisen tutkimustavan ja Helsingin julistuksen mukaisesti.
Figure FI124926BD00381
Figure FI124926BD00391
II. Hoidot hCD40L:ää koodaavalla adenovirusvektorilla a) Ad5-D24-GM-CSF- Ad5/3-D24-GM-CSF- tai Ad5-RGD-D24-GM-CSF- hoidot
Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L ja Ad5-RGD-D24-GM-CSF tuotettiin kliinisen laatuluokan mukaisesti ja potilaiden hoito aloitettiin.
Käytettiin kahta eri antokaaviota. Sarjahoidon ensimmäisellä kierroksella 4 potilasta (C229, I244, P251, R8) sai neljä viidesosaa annoksesta kasvaimensisäisesti (tai intraperitoneaalisesti peritoneaalista tautia sairastavan potilaan R8 kohdalla) ja yhden viidesosan laskimonsisäisesti, kun taas toiset 4 potilasta (T181, C239, N235, C220) sai vain kasvaimensisäisiä injektioita. Myöhemmillä hoitokierroksilla kaikki potilaat hoidettiin kasvaimensisäisesti. Potilas R73 sai yhden hoitokierroksen ja puolet annoksesta annettiin kasvaimensisäisesti ja puolet intraperitoneaalisesti.
Virusannokset käyvät ilmi taulukosta 2. Annokset valittiin keksijöiden aikaisempien muilla onkolyyttisillä viruksilla saatujen tietojen perusteella.
Virus laimennettiin steriilillä suolaliuoksella antoajankohtana asianmukaisissa olosuhteissa. Viruksen antamisen jälkeen kaikkia potilaita tarkkailtiin yön yli sairaalassa ja tämän jälkeen seuraavat 4 viikkoa avohoitopotilaina. Fyysinen tarkastelu ja sairauskertomus tehtiin jokaisella käynnillä ja kliinisesti relevantteja laboratorioarvo-ja seurattiin.
Hoidon sivuvaikutukset kirjattiin ja pisteytettiin CTCAE:n (Common Ter-minology Criteria for Adverse Events) version 3.0 mukaisesti. Koska monilla syöpäpotilailla on taudista johtuvia oireita, aikaisemmin esiintyville oireille ei annettu numeroa, jos ne eivät pahentuneet. Kuitenkin jos oire tuli vakavammaksi, esim. jos ennen hoitoa oleva aste 1 muuttui asteeksi 2 hoidon jälkeen, sille annetaan numero asteena 2.
Kasvaimen koko määritettiin varjoainetehosteisella tietokonetomografia (CT) -skannauksella. Saatiin maksimaaliset kasvaimen halkaisijat. RECIST1.1 (Res-ponse Evaluation Criteria in Solid Tumors) -kriteerejä sovellettiin koko tautiin, mukaan lukien injektoidut ja injektoimattomat leesiot. Nämä kriteerit ovat: osittainen vaste PR (>30 %:n väheneminen kasvaimen halkaisijoiden summassa), stabiili tauti SD (ei vä-henemistä/lisääntymistä), etenevä tauti PD (>20 %:n lisääntyminen). Selville kasvaimen pienenemisille, jotka eivät täytä PR:ää, annettiin numero vähäisenä vasteena (MR). Seerumin kasvainmerkit määritettiin myös, kun ne nousivat perusarvosta, ja samoja prosenttiosuuksia käytettiin.
Potilaiden seeruminäytteet analysoitiin sekä Th1-tyypin sytokiinien: interfe-roni-y (IFN-y), tuumorinekroositekijä-α (TNF-a) ja interleukiini-2 (IL-2) että Th2-syto-kiineille: interleukiini-4 (IL-4), interleukiini-5 (IL-5) ja interleukiini 10 (IL-10) käyttäen
Becton-Dickinson cytokine multiplex bead array system -pakkausta (BD FACSArray; BD Biosciences, San Jose, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Näytteet sisälsivät perustason, 1 kuukausi virushoidon jälkeen tai 2 kuukautta virushoidon jälkeen.
III Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:n turvallisuus syöpäpotilaissa Taulukossa 4 esitetään yhteenveto haittavaikutuksista, jotka kirjattiin virushoidon aikana ja sen jälkeen. Haittavaikutukset pisteytetiin CTCAE:n (Common Terminology Criteria for Adverse Events) version 3.0 mukaisesti.
Figure FI124926BD00421
Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L oli hyvin siedetty aina korkeimpaan käytettyyn annokseen asti: 5x1011 VP/potilas. Asteen 4-5 haittavaikutuksia ei havaittu. Potilas, joka sai yhden ainoan hoidon Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:llä sai vain asteen 1 oireita, kun taas sarjahoitopotilaat saivat asteen 1-3 oireita, kuten esimerkiksi heikkoutta, pahoinvointia ja lyhytaikaista maksaentsyymien nousua.
IV. Neutraloivien vasta-aineiden tiitterit
Neutraloivat vasta-aineet (NAb) Ad5/3-kapsidia vastaan mitattiin potilasta T181 ja C239 (taulukko 5). 293-solut laitettiin 96-kuoppaisille levyille pitoisuutena 1 x 104 solua/kuoppa ja viljeltiin yön yli. Seuraavana päivänä solut pestiin DMEM:llä, jossa ei ollut FCS:a. Komplementin inaktivoimiseksi ihmis-seeruminäytteitä inkuboitiin 56 °C:ssa 90 min. Nelinkertainen laimennussarja (1:1-1:16 384) valmistettiin seerumittomaan DMEM:iin (Sarkioja M et ai. 2008, Gene Ther 15(12): 921-9). Ad5/3luc1:a sekoitettiin seerumilaimennuksiin ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 min. Seuraavaksi solut kolmoisnäytteinä in-fektoitiin annoksella 100 VP/solu 50 pl:ssa edellä olevaa seosta, ja yhden tunnin kuluttua lisättiin 100 μΙ kasvualustaa, jossa oli 10 % FCS:a. 24 tuntia infektion jälkeen solut hajotettiin ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin Luciferase Assay System -pakkauksella (Promega, Madison, Wl) käyttäen TopCount-lumino-metriä (PerkinElmer, VValtham, MA). Lusiferaasilukemat esitettiin suhteessa geeninsiirtoon, joka saatiin pelkästään Ad5/3luc1:llä neutraloivien vasta-aineiden vaikutuksen arvioimiseksi viruksella hoidettujen potilaiden seerumissa.
Tulokset esitetään taulukossa 5 seerumilaimennostekijänä, joka aiheuttaa 80 %:n inhibition geenisiirrossa Ad5/3-luc1:lla (Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:n kanssa identtinen kapsidi) 293-soluihin. Potilaalla T181 oli korkea NAb-tiitteri jo ennen hoitoa, eikä muutoksia havaittu hoidon aikana. Potilaalla C239 oli alussa matala NAb-tiitteri. Ensimmäinen hoito indusoi korkean NAb-tuotannon, joka laski kohtalaiselle tasolle hoidon aikana. Tätä ei tavallisesti nähdä onkolyyttisillä viruksilla hoidetuilla potilailla (tavallisesti tiitteri nousee jatkuvasti) ja se voi olla indikaattori aktiivisuussiirrosta Th2->Th1.
Figure FI124926BD00441
V. Tehokkuuden arviointi
Taulukossa 5 esitetään myös Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L:n tehokkuuden arviointi RECIST-kriteerien mukaan tietokonetomografialle (CT) (The-rasse P et ai. 2000, J Natl Cancer Inst 92, 205-16) tai PERCIST-kriteerien mukaan (Wahl et ai. 2009 J Nucl Med 50 Suppl 1:122S-50S) positroniemissio-tomografia-tietokonetomografialle (PET-CT). Kaikilla potilailla oli progressiivisia kasvaimia ennen hoitoa. Potilaalla T181 oli stabiili tauti (SD), potilaalla C239 oli stabiili metabolinen tauti (SMD), potilaalla C229 oli progressiivinen tauti (PD), potilaalla I244 oli SMD, potilaalla P251 oli PD ja potilaalla R8 oli SD. Potilaille, joilla oli kohonneet merkit perustasolla, määritettyjen kasvainmerkkien mukaan potilaalla R73 oli täydellinen vaste (CR), potilailla T181 ja N235 oli osittainen vaste -56 % ja vastaavasti -58 %, potilaalla R8 oli vähäinen vasta (MR) -16 %, potilaalla C229 oli stabiili tauti, kun taas potilailla C239, P251 ja C220 oli progressiivinen tauti kasvainmerkin mukaan (taulukko 5). Potilaiden kokonaiseloon-jäänti esitetään myös taulukossa 5.
Kaikkiaan merkkejä kasvaimenvastaisesta tehosta nähtiin 7/9 potilaassa.
Kasvaimenvastaisen aktiivisuuden objektiivisten mittausten lisäksi näimme myös kliinistä ja/tai subjektiivista hyötyä useissa tapauksissa. Potilaalla C229 tapahtui parannus suoritusstatuksessa (WHO 2 ennen virushoitoja ja WHO 1 sarjahoidon jälkeen CGTG-401 :llä) ja potilas I244 koki hyötyä yleisissä oireissa.
VI. Th1- ja Th2-immuunivasteet onkolyyttisellä adenoviruksella Ad5/3-hTERT-E1 A-hCD40L hoidon jälkeen
Potilaiden seeruminäytteet analysoitiin joko Th1-indusoitujen syto-kiinien suhteen: interferoni-y (IFN-y), tuumorinekroositekijä-α (TNF-a) ja inter-leukiini-2 (IL-2) tai Th2-sytokiinien suhteen: interleukiini-4 (IL-4), interleukiini-5 (IL-5) ja interleukiini 10 (IL-10) käyttäen Becton-Dickinson cytokine multiplex bead array system -pakkausta (BD FACSArray; BD Biosciences, San Jose, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kuvion 10 vasemmalla puolella esitetään Th1-indusoidut sytokiinit ja oikealla puolella Th2-indusoidut sytokiinit. Ennen = seeruminäyte otettu ennen viruksen antoa; 1 kuukausi = seeruminäyte otettu 1 kuukausi virushoidon jälkeen; 2 kuukautta = seeruminäytteet otettu 2 kuukautta virushoidon jälkeen.
Kuviossa 11 raportoidaan sytokiinipitoisuudet suhteessa niiden perusarvoon, joka asetettiin 1:ksi ja suhde Th1/Th2 laskettiin kullekin aikapisteelle. 1 kuukausi = seeruminäyte otettu 1 kuukausi virushoidon jälkeen; 2 kuukautta = seeruminäytteet otettu 2 kuukautta virushoidon jälkeen. Suhde yli 1 osoittaa Th1-tyypin immuunivasteen vallitsevuutta, kun taas suhde alle 1 osoittaa Th2-tyypin immuunivasteen vallitsevuutta.
VII Adenoviruksen tunnistavien T-solujen induktio onkolyyttisellä adenoviruksella Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L hoidon jälkeen
Onkolyyttinen solukuolema sallii immuunijärjestelmän saada kyvyn tunnistaa ja tappaa kasvainsoluja. Tämä on potentiaalisesti edullista kasvaimen poistamiselle ja voi helpottaa paranemisia. Adenovirus puhdistetaan kehosta suhteellisen lyhyessä ajassa annon jälkeen; siksi on erittäin tärkeää stimuloida immuunijärjestelmä, niin että se kykenee tunnistamaan spesifiset kas-vainantigeenit, jotta hoito voi johtaa pysyvään edulliseen vaikutukseen potilaalla. Lisäksi kun vasta-aineita syntyy tai on läsnä, virus voi olla osittain tai täysin neutraloitu niin, että se saattaa menettää tehonsa infektoida ja tapppaa metastaaseja. Kuitenkin kasvainta vastaan indusoidut effektori-T- tai NK-solut ovat vapaita kiertämään verenkierrossa ja mahdollisesti tappavat metastaaseja, jotka ovat kaukana injektoidusta kasvaimesta.
Sen osoittamiseksi, että onkolyyttinen adenovirus Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L kykenee indusoimaan adenoviruksen tunnistavia T-soluja, ko-konais-PBMC:t eristettiin ja pulssitettiin adenovirus 5:n pentonista peräisin olevalla peptidipoolilla adenovirus-spesifisten sytotoksisten T-lymfosyyttien aktivaation määrittämiseksi gamma-interferoni-ELISPOT:lla (kuvio 9). Potilaalla T181 esiintyi vähentynyt lukumäärä adenoviruksen tunnistavia T-soluja hoidon jälkeen, kun taas potilaalla C239 näitä soluja oli lisääntynyt määrä hoidon jälkeen. On ehdotettu, että antiviraalinen immuunivaste voi olla tärkeä osa onko-lyyttisten virusten kasvaimenvastaista kokonaisvaikutusta (Alemany 2008, Lancet Oncol 9:507-8; Prestvvich et ai. 2008, Lancet Oncol 9:610-2; Tuve et ai. 2009, Vaccine 27:4225-39).

Claims (32)

1. Onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää 1. adenovirusserotyypin 5 (Ad5:n) nukleiinihappopääketjun, joka käsittää kapsidimodifikaation, 2. nukleiinihapposekvenssin, joka koodaa kasvainspesifistä ihmisen telomeraasin käänteistransskriptaasin (hTERT) promoottoria, ylävirtaan E1-alueesta; ja 3. nukleiinihapposekvenssin, joka koodaa ihmisen CD40L:ää, dele-toidun gp19k/6.7K:n tilalla E3-alueella.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää yhden tai useamman alueen, jotka on valittu ryhmästä, joka koostuu E2-, E4-ja myöhäisvaiheen alueista.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat alueet: vasen ITR, osittainen E1, plX, plVa2, E2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4, osittainen E3, L5, E4 ja oikea ITR.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että alueet ovat peräkkäisessä järjestyksessä 5’-3’-suun-nassa.
5. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että E1-alueesta ylävirtaan sijaitsee villi-tyypin alue.
6. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että E1-alue käsittää viruksen pakkaus-signaalin.
7. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että CD40L:ää koodaava nukleiinihap-posekvenssi on viruksen E3-promoottorin kontrollin alainen.
8. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että CD40L:ää koodaava nukleiinihap-posekvenssi poikkeaa yhdellä nukleotidillä ihmisen villityypin sekvenssistä.
9. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että E4-alue on villityyppiä.
10. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että kapsidimodifikaatio on Ad5/3-kime-rismi, integriiniä sitovan alueen (RGD:n) insertio ja/tai hepariinisulfaattia sitovan polylysiinin modifikaatio säikeeseen.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että kapsidimodifikaatio on Ad5/3-kimerismi.
12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että kapsidimodifikaatio on RGD-4C-modifikaatio.
13. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää ainakin yhden ekspres-siokasetin.
14. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää vain yhden ekspressio-kasetin.
15. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että vektori kykenee selektiivisesti repli-koitumaan soluissa, jotka ilmentävät telomeraasia.
16. In vitro -solu, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukaista adenovirusvektoria.
17. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukaista adenovirusvektoria.
18. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se toimii in situ -syöpärokotteena.
19. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen adenovirusvektori käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa.
20. Patenttivaatimuksen 17 mukainen farmaseuttinen koostumus käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa.
21. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen adenovirusvektori tai patenttivaatimuksen 17 mukainen farmaseuttinen koostumus käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa, tunnettu siitä, että syöpä valitaan ryhmästä, johon kuuluvat nasofaryngeaalinen syöpä, synoviaalinen syöpä, hepatosellulaa-rinen syöpä, munuaissyöpä, sidekudossyöpä, melanooma, keuhkosyöpä, suolistosyöpä, paksusuolen syöpä, peräsuolen syöpä, kolorektaalinen syöpä, ai-vosyöpä, kurkkusyöpä, suusyöpä, maksasyöpä, luusyöpä, haimasyöpä, istukkasyöpä, gastrinooma, feokromosytooma, prolaktinooma, T-soluleukemia/lym- fooma, neurooma, von Hippel-Lindaun tauti, Zollinger-Ellisonin oireyhtymä, li-sämunuaissyöpä, anaalinen syöpä, sappitien syöpä, virtsarakon syöpä, virtsajohtimen syöpä, oligodendrogliooma, neuroblastooma, meningiooma, selkä-ydinkasvain, osteokondrooma, kondrosarkooma, Evvingin sarkooma, tuntemattoman primäärisijainnin syöpä, karsinoidi, maha-suolikanavan karsinoidi, fib-rosarkooma, rintasyöpä, Pagetin tauti, kohdunkaulan syöpä, ruokatorven syöpä, sappirakon syöpä, pään syöpä, silmäsyöpä, niskasyöpä, munuaissyöpä, VVilmsin kasvain, Kaposin sarkooma, eturauhassyöpä, kivessyöpä, Hodgkinin tauti, non-Hodgkinin lymfooma, ihosyöpä, mesoteliooma, multippeli myelooma, munasarjasyöpä, endokriininen haimasyöpä, glukagonooma, paratyroidinen syöpä, penissyöpä, aivolisäkesyöpä, pehmytkudossarkooma, retinoblastooma, ohutsuolisyöpä, mahalaukkusyöpä, kateenkorvasyöpä, kilpirauhassyöpä, tro-foblastisyöpä, rypäleraskaus, kohtusyöpä, endometriaalinen syöpä, emätin-syöpä, ulkosynnytinsyöpä, kuulohermokasvain, mycosis fungoides, insulinoo-ma, karsinoidioireyhtymä, somatostatinooma, iensyöpä, sydänsyöpä, huuli-syöpä, kalvosyöpä, suusyöpä, hermosyöpä, suulakisyöpä, korvasylkirauhas-syöpä, vatsakalvosyöpä, nielusyöpä, pleuraalinen syöpä, sylkirauhassyöpä, kielisyöpäja risasyöpä.
22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa, tunnettu siitä, että kohde on ihminen tai eläin.
23. Patenttivaatimuksen 21 tai 22 mukainen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa, tunnettu siitä, että adenovirusvektorit tai farmaseuttiset koostumukset annostellaan kasvaimensisäisellä, lihaksensisäisellä, valtimonsisäisellä, laskimonsisäi-sellä, keuhkopussinsisäisellä, rakkulansisäisellä, ontelonsisäisellä tai peritone-aalisella injektiolla tai suun kautta.
24. Jonkin patenttivaatimuksen 21-23 mukainen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa, tunnettu siitä, että onkolyyttisiä adenovirusvektoreita tai farmaseuttisia koostumuksia annetaan useita kertoja hoitojakson aikana.
25. Jonkin patenttivaatimuksen 21-24 mukainen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa, tunnettu siitä, että kohteelle annetaan onkolyyttistä adenovirusvektoria, jolla on erilainen kapsidin säikeen uloke kuin aiemmassa hoidossa käytetyssä vektorissa.
26. Jonkin patenttivaatimuksen 21-25 mukainen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa, tunnettu siitä, että adenovirusvektorit tai farmaseuttiset koostumukset annostellaan kohteelle rinnakkain sädehoidon tai kemoterapian kanssa.
27. Jonkin patenttivaatimuksen 21-26 mukainen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa, tunnettu siitä, että adenovirusvektorit tai farmaseuttiset koostumukset annostellaan kohteeseen apuaineen kanssa, joka apuaine on valittu ryhmästä, joka koostuu verapamiilista tai muusta kalsiumkanavanestoaineesta; autofagiaa indusoivasta aineesta; temotsolomidistä; regulatoristen T-solujen vähentämiseen kykenevistä aineista; syklofosfamidistä ja mistä tahansa näiden yhdistelmästä kohteessa.
28. Jonkin patenttivaatimuksen 21-27 mukainen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa, tunnettu siitä, että adenovirusvektorit tai farmaseuttiset koostumukset annostellaan yhdessä kemoterapian tai anti-CD20-hoidon tai muun neutralisoivien vasta-aineiden estämishoidon kanssa.
29. In vitro -menetelmä CD40L:n tuottamiseksi solussa, tunnet-t u siitä, että menetelmä käsittää: a) kuljetetaan jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukaista onkolyyttis-tä adenovirusvektoria käsittävä kuljetin soluun, ja b) ilmennetään kyseisen vektorin CD40L:aa solussa.
30. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukaisen adenovirusvektorin käyttö CD40L:n tuottamiseksi solussa in vitro.
31. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori käytettäväksi kasvainspesifisen immuunivasteen ja apoptoosin lisäämiseksi, Th2—>Th1 muutokseen tai immuunisuppression vähentämiseen kohteessa.
32. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori käytettäväksi patenttivaatimuksen 31 mukaisesti, tunnettu siitä, että luonnollisten tappajasolujen ja/tai sytotoksisten T-solujen määrää lisääntyy kohdesolussa tai -kudoksessa tai suppressorisolujen (kuten regulatoristen T-solujen) määrä vähenee.
FI20105988A 2010-09-24 2010-09-24 Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä FI124926B (fi)

Priority Applications (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20105988A FI124926B (fi) 2010-09-24 2010-09-24 Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä
BR112013006669A BR112013006669A2 (pt) 2010-09-24 2011-09-23 vetores adenovirais oncolíticos e métodos e usos relacionados aos mesmos
PCT/FI2011/050826 WO2012038607A1 (en) 2010-09-24 2011-09-23 Oncolytic adenoviral vectors and methods and uses related thereto
CA2812096A CA2812096A1 (en) 2010-09-24 2011-09-23 Adenoviral vectors and methods and uses related thereto
KR1020137010384A KR20130138245A (ko) 2010-09-24 2011-09-23 종양분해 아데노바이러스 벡터 및 이와 관련된 방법 및 용도
AU2011306846A AU2011306846B2 (en) 2010-09-24 2011-09-23 Oncolytic adenoviral vectors and methods and uses related thereto
JP2013529692A JP2013541945A (ja) 2010-09-24 2011-09-23 腫瘍溶解性アデノウイルスベクターならびにそれに関連する方法および使用
RU2013118724/10A RU2013118724A (ru) 2010-09-24 2011-09-23 Онколитические аденовирусные векторы и связанные с ними способы и применения
US13/825,415 US20130323205A1 (en) 2010-09-24 2011-09-23 Oncolytic adenoviral vectors and methods and uses related thereto
CN201180053316.1A CN103221423B (zh) 2010-09-24 2011-09-23 溶瘤腺病毒载体及与其相关的方法和用途
EP11770847.9A EP2619224A1 (en) 2010-09-24 2011-09-23 Oncolytic adenoviral vectors and methods and uses related thereto
SG2013019112A SG188550A1 (en) 2010-09-24 2011-09-23 Oncolytic adenoviral vectors and methods and uses related thereto
ZA2013/01862A ZA201301862B (en) 2010-09-24 2013-03-12 Oncolytic adenoviral vectors and methods and uses related thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20105988A FI124926B (fi) 2010-09-24 2010-09-24 Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä
FI20105988 2010-09-24

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI20105988A0 FI20105988A0 (fi) 2010-09-24
FI20105988A FI20105988A (fi) 2012-03-25
FI124926B true FI124926B (fi) 2015-03-31

Family

ID=42829717

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20105988A FI124926B (fi) 2010-09-24 2010-09-24 Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä

Country Status (1)

Country Link
FI (1) FI124926B (fi)

Also Published As

Publication number Publication date
FI20105988A0 (fi) 2010-09-24
FI20105988A (fi) 2012-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2011306846B2 (en) Oncolytic adenoviral vectors and methods and uses related thereto
AU2011306845B2 (en) Oncolytic adenoviral vectors coding for monoclonal anti - CTLA - 4 antibodies
AU2019216631B2 (en) Enhanced adoptive cell therapy
RU2520823C2 (ru) Аденовирусные векторы и способы и применения, связанные с ними
CN106471125B (zh) 包括白蛋白结合部分的腺病毒
FI123955B (fi) Onkolyyttinen adenovirus
US20160208287A1 (en) Adenoviral vectors and methods and uses related thereto
Cerullo et al. Oncolytic adenoviruses for cancer immunotherapy: data from mice, hamsters, and humans
CA2750770A1 (en) Non-ad5 adenoviral vectors and methods and uses related thereto
FI124926B (fi) Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä
FI124927B (fi) Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä
FI121508B (fi) Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 124926

Country of ref document: FI

Kind code of ref document: B

MM Patent lapsed