FI124927B - Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä - Google Patents

Description

Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä

Keksinnön ala

Esillä oleva keksintö liittyy biotieteiden ja lääketieteen aloihin. Erityisesti keksintö liittyy syöpähoitoihin. Tarkemmin sanottuna esillä oleva keksintö koskee onkolyyttisiä adenovirusvektoreita ja mainittuja vektoreita käsittäviä in vitro -soluja ja farmaseuttisia koostumuksia. Esillä oleva keksintö koskee myös mainittuja vektoreita ja farmaseuttista koostumusta käytettäviksi kohteen syövän hoitoon. Lisäksi esillä oleva keksintö koskee in vitro -menetelmää mono-klonaalisten anti-CTLA4-vasta-aineiden tuottamiseksi solussa sekä onkolyyttis-ten adenovirusvektoreiden käyttöä monoklonaalisten anti-CTLA4-vasta-ainei-den tuottamiseksi solussa in vitro ja onkolyyttisiä adenovirusvektoreita käytettäväksi kasvainspesifisen immuunivasteen ja apoptoosin lisäämiseksi kohteessa.

Keksinnön tausta

Syöpää voidaan hoitaa leikkauksella, hormonihoidoilla, kemoterapi-oilla, sädehoidoilla ja/tai muilla hoidoilla, mutta useissa tapauksissa syöpiä, joille on usein tunnusomaista se, että ne ovat pitkälle edenneessä vaiheessa, ei voida parantaa nykyisillä hoidoilla. Tämän vuoksi tarvitaan uusia syöpäsoluihin kohdistuvia lähestymistapoja, kuten geenihoitoja.

Viimeisten kahdenkymmenen vuoden aikana geeninsiirtoteknologi-aa on tutkittu paljon. Syövän geenihoitojen tarkoituksena on viedä terapeuttinen geeni kasvainsoluun. Nämä kohdesoluun viedyt terapeuttiset geenit voivat esimerkiksi korjata mutatoituneita geenejä, suppressoida aktiivisia onkogeene-jä tai luoda soluun lisäominaisuuksia. Sopivia eksogeenisiä terapeuttisia geenejä ovat, mainittuihin rajoittumatta, immunoterapeuttiset, antiangiogeeniset ja kemoprotektiiviset geenit sekä "itsemurhageenit", ja ne voidaan viedä soluun hyödyntämällä modifioituja virusvektoreita tai ei-viraalisia menetelmiä, kuten esimerkiksi elektroporaatio, geenipyssyja lipidi- tai polymeeripäällysteet.

Optimaalisten virusvektoreiden vaatimuksiin kuuluu tehokas kyky löytää spesifisiä kohdesoluja ja ilmentää virusgenomia kohdesoluissa. Lisäksi optimaalisten vektoreiden tulee pysyä aktiivisina kohdekudoksissa tai -soluissa. Kaikkia näitä virusvektoreiden ominaisuuksia on kehitetty viimeisten vuosikymmenien aikana, ja esimerkiksi retrovirus- ja adenovirusvektoreita ja adenoassosioituneita virusvektoreita on tutkittu laajasti biolääketieteessä.

Kasvaimeen penetraation ja kasvaimenvastaisen vaikutuksen paikallisen monistumisen parantamiseksi edelleen on muodostettu selektiivisesti onkolyyttisiä aineita, esimerkiksi ehdollisesti replikoituvia adenoviruksia. Onko-lyyttiset adenovirukset ovat lupaava keino syöpien hoitoon, ja ne ovat osoittautuneet hyvin turvallisiksi ja jonkin verran tehokkaiksi kliinisissä kokeissa. Onko-lyyttiset adenovirukset tappavat kasvainsoluja, koska virus replikoituu kasvain-solussa, jolloin replikaation viimeinen vaihe johtaa tuhansien virionien vapautumiseen ympäröiviin kasvainkudoksiin tehokasta kasvaimeen penetraatiota ja vaskulaarista reinfektiota varten. Kasvainsolut sallivat viruksen replikaation, kun taas normaalit solut säästyvät, koska virusgenomiin on räätälöity muutoksia, jotka estävät replikaation muissa kuin kasvainsoluissa.

Replikaatio voidaan rajoittaa kasvainkudokseen joko tekemällä osittaisia deleetioita adenoviruksen E1-alueelle tai käyttämällä kudos- tai kas-vainspesifisiä promoottoreita (TSP). Tällaisen promoottorin lisääminen saattaa tehostaa vektorien vaikutuksia kohdesoluissa, ja eksogeenisten kudos- tai kasvainspesifisten promoottoreiden käyttö on yleistä rekombinanteissa adeno-virusvektoreissa.

Useimmat kliiniset kokeet on suoritettu varhaisten sukupolvien ade-noviruksilla, jotka perustuvat adenovirus 5:een (Ad5). Onkolyyttisten adenovi-rusten kasvaimenvastainen vaikutus riippuu niiden geeninsiirtokyvystä. Valitettavasti useimmat kasvaimet ilmentävät heikosti tärkeintä Ad5-reseptoria, minkä vuoksi modifikaatioita on viety Ad5-kapsidiin. Esimerkiksi kapsidimodifikaatio serotyypin 3 ulokkeella on parantanut infektiivisyyttä ja tehoa munasarjasyövässä (Kanerva A, et ai., Clin Cancer Res 2002;8:275-80; Kanerva A, et ai., Mol Ther 2002;5:695-704; Kanerva A, et ai., Mol Ther 2003;8:449-58). Lisäksi koska Ad-vektorien säie ja penton base -yksikkö ovat soluun sisäänmenome-kanismin avainvälittäjiä, rekombinanttien Ad-vektorien kohdentaminen voidaan saavuttaa näiden kapsidiproteiinien geneettisten modifikaatioiden kautta (Dmit-riev I., et ai. 1998, Journal ofVirology, 72, 9706-9713). Useimmat tällä hetkellä kliinisessä käytössä olevat onkolyyttiset virukset ovat suuresti heikennettyjä replikaation suhteen monien kriittisissä viruksen geeneissä olevien deleetioi-den johdosta. Näillä viruksilla on erinomainen turvallisuusaineisto, mutta kasvaimenvastainen teho on ollut rajallinen.

Kliiniset ja esikliiniset tulokset kuitenkin osoittavat, että hoito ei-aseistetuilla onkolyyttisillä viruksilla ei ole riittävän immunostimulatorista johtaakseen pidempiaikaisiin kasvaimenvastaisiin terapeuttisiin immuunivasteisiin. Tässä suhteessa onkolyyttisiä viruksia on aseistettu, jotta ne olisivat enemmän immunostimulatorisia. Lisäksi viruksen replikaatio ja immunomodulatoristen proteiinien ilmentyminen kasvaimen sisällä voimistaa immuunijärjestelmää indusoimalla sytokiinituotantoa ja kasvainantigeenien vapautumista (Ries SJ, et ai., Nat Med 2000;6:1128-33).

Onkolyyttisten virusten aseistaminen yhdistää perinteisen geeninsiirron edut ja replikoitumiskykyisten aineiden tehon. Eräs virusten aseistamisen päämäärä on immuunireaktion indusointi viruksen replikaation sallivia soluja vastaan. Kuten edellä on mainittu, virusreplikaatio, vaikkakin se on immu-nogeenistä, ei normaalisti yksin riitä indusoimaan tehokasta kasvaimenvastais-ta immuniteettia. Terapeuttisen immuniteetin indusoinnin vahvistamiseksi viruksia on aseistettu stimulatorisilla proteiineilla, kuten sytokiineilla, tarkoituksena helpottaa kasvainantigeenien viemistä antigeenejä esitteleville soluille, kuten dendriittisoluille, ja näiden stimulaatiota ja/tai kypsymistä. Immunoterapeut-tisten geenien vieminen kasvainsoluihin ja lisäksi niiden proteiinien translaatio johtavat immuunivasteen aktivoitumiseen ja tehokkaampaan kasvainsolujen tuhoutumiseen. Merkittävimmät immuunisolut tässä suhteessa ovat luonnolliset tappajasolut (NK:t) ja sytotoksiset CD8+ T -solut.

Avainoivallus syövän immunoterapiassa on ollut sen ymmärtäminen, että kasvaimen immuunijärjestelmän välttämismekanismien johdosta kas-vaimenvastaisen immuunivasteen induktio ei ole riittävä taudin poistamiseksi. Sen sijaan, pitkälle edenneiden kasvainten immunosuppressiivisen luonteen johdosta tarvitaan myös inhiboivien T-solujen vähentämistä (Dranoff G., Nat Rev Cancer 2004;4:11-22; de Visser KE et ai., Nat Rev Cancer 2006;6:24-37). Eräs näistä säätelevistä avainreiteistä käsittää sytotoksisiin T-lymfosyyt-teihin liittyvän antigeeni 4:n (CTLA-4, CD152), joka toimii B7/CD28-välitteistä stimulaatiota vastaan. CTLA-4-vastaisten vasta-aineiden prekliininen kasvai-menvastainen teho on aikaisemmin osoitettu useissa kasvainmalleissa (Leach DR et ai., Science 1996;271:1734-6; Kwon ED et ai., Proc Natl Acad Sei USA 1999;96:15074-9). Tällä hetkellä kahta täysin ihmisperäistä monolonaalista vasta-ainetta (mAb:t) CTLA-4:ää vastaan kehitetään kliinisesti; lgG1 ipilimumabi (aikaisemmin MDX-010) ja lgG2 tremelimumabi (aikaisemmin CP-675,206). Useat julkaistut tutkimukset pyrkivät vahvistamaan oikeiksi ipilimumabin ja treme-limumabin biologisen ja kliinisen aktiivisuuden melanoomaa ja muita syöpiä sairastavissa potilaissa (Kirkvvood JM et ai., Clin Cancer Res 2010;16:1042-8;

Hodi FS et ai., N Engl J Med. 2010; 363;8:711—23; Ribas A et ai., Oncologist 2007;12:873-83). Vaikka kasvaimenvastainen aktiivisuus on nähty monissa kokeissa, on raportoitu myös vakavia ja jopa kuolemaan johtaneita sivuvaikutuksia Sivuvaikutukset koskevat normaalien kudosten altistumista, mikä johtuu systeemisestä annosta, kun taas tehon määrää immuunisuppression väheneminen kasvaimessa. Siten mahdollisuudet CTLA-4 mAb:n paikalliseen tuotantoon ovat perusteltuja. CTLA-4 on aktivaatiolla indusoituva tyypin I transmembraaniproteii-ni, joka kuuluu Ig-superperheeseen, sitä ilmentävät T-lymfosyytit kovalenttise-na homodimeerinä, joka toimii inhiboivana reseptorina kostimulatorisille molekyyleille B7.1 (CD80) ja B7.2 (CD86) (Ribas A et ai., Oncologist 2007; 12:873-83). CTLA-4:n esto mAb:illa johtaa lisääntyneeseen interleukiini-2- (IL-2) ja gamma-interferoni (IFN-γ) -tuotantoon lymfosyyttien toimesta; ja lisääntyneeseen kudosten yhteensopivuuskompleksin (major histocompatibility complex, MHC) luokan I molekyylien tuotantoon (Lee KM et ai., Science 1998; 282:2263-6; ParadisTJ et ai., Cancer Immunol Immunother 2001;50:125-33).

Eräs tärkeimmistä mekanismeista, joita kasvaimet käyttävät välttääkseen kasvaimenvastaisen immuniteetin, välittyy regulatoristen T-solujen kautta. Monista tähän saakka käytetyistä lähestymistavoista T-Reg:ien vähentämiseksi anti-CTLA4-mAb on ainoa, jonka turvallisuus ja teho on osoitettu suuressa satunnaistetussa tutkimuksessa (Hodi FS et ai., N Engl J Med. 2010; 363;8:711-23). Vaikka tämä koe edustaa läpimurtoa kasvainimmunoterapialle, sitä edelsi negatiivinen faasin 3 tutkimus toisella anti-CTLA4 mAb:lla (Ribas A et ai. J Clin Oncol ASCO suppl. 2008; 287). Lisäksi kaikissa anti-CTLA4-mAb-kokeissa vakavat immuunijärjestelmään liittyvät haittavaikutukset (irAEs) ovat aiheuttaneet kuolemia, mikä johtaa huoleen tämän lähestymistavan turvallisuudesta. Siksi tarvitaan muita lähestymistapoja, kuten geeniterapiamallin käyttöä, koska se voisi lisätä paikallista pitoisuutta lisääntyneen tehon saamiseksi samalla vähentäen systeemiseen altistukseen liittyviä haittavaikutuksia.

On raportoitu, että kasvaimeen paikallistuneen anti-CTLA4-scFv:n ilmentämisen yhdistämisellä menetelmiin systeemisen T-Reg:n poistamiseksi on synergistisiä vaikutuksia (Tuve S, et ai. Cancer Res 2007;67:5929-39). Kirjoittajat eivät myöskään havainneet autoimmuunireaktioita hiirimallissa, kun kasvaimet ilmentävät jatkuvasti anti-CTLA-4-scFv-vasta-ainetta ja anti-CD25-vasta-aineita annetaan i.p. (Tuve S, et ai. Cancer Res 2007;67:5929-39). Sitä vastoin, kun anti-CTLA4-mAb annetaan systeemisesti yhdessä T-Reg-solujen kanssa, havaitaan autoimmuunireaktioita (Sutmuller RP et ai., J Exp Med 2001;194:823-32; Takahashi T et ai. J Exp Med 2000;192:303-10). Yksi mahdollinen syy synergiaan on, että T-Reg-solujen poisto vähentää regulatoristen solujen lukumäärää, samalla kun anti-CTLA-4 vähentää suppressiivisten solujen aktiivisuutta. Lisäksi anti-CTLA4 voi myös vähentää antigeeniä esittelevien solujen suppressiota.

Adenovirukset ovat keskikokoisia (90-100 nm), vaipattomia ikos-ahedraalisia viruksia, joilla on noin 36 000 emäsparin kaksijuosteinen lineaarinen DNA proteiinikapsidissa. Viruksen kapsidissa on säierakenteita, jotka osallistuvat viruksen kiinnittymiseen kohdesoluun. Ensinnäkin säieproteiinin uloke-domeeni sitoutuu kohdesolun reseptoriin [esimerkiksi CD46:n tai coxsackievi-ruksen adenovirusreseptoriin (CAR)], toiseksi virus on vuorovaikutuksessa in-tegriinimolekyylin kanssa ja kolmanneksi virus endosytosoituu kohdesoluun. Seuraavaksi virusgenomi kuljetetaan endosomeista tumaan, ja kohdesolun replikaatiokoneistoa hyödynnetään myös viruksen tarkoituksiin (Russell W. C., J General Virol 2000; 81, 2573-2604).

Adenovirusgenomissa on varhaisvaiheen (E1-E4), keskivaiheen (IX ja IVa2) ja myöhäisvaiheen geenejä (L1-L5), jotka transkriptoidaan peräkkäisessä järjestyksessä. Varhaisvaiheen geenituotteet vaikuttavat isäntäsolun puolustusmekanismeihin, solusykliin ja solumetaboliaan. Keski- ja myöhäisvaiheen geenit koodaavat virusten rakenneproteiineja uusien virionien tuottamiseksi (Wu ja Nemerovv, Trends Microbiol 2004; 12: 162-168; Russell W. C., J General Virol 2000; 81, 2573-2604; Volpers C. ja Kochanek S., J Gene Med 2004; 6 suppl 1, S164—71; Kootstra N. A. ja Verma I. M., Annu Rev Pharmacol Toxicol 2003; 43, 413-439).

Ihmiseltä on löydetty yli 50 adenovirusten eri serotyyppiä. Serotyypit luokitellaan kuuteen alaryhmään A-F, ja eri serotyyppien tiedetään liittyvän eri sairauksiin, kuten hengityselinsairauksiin, sidekalvontulehdukseen ja maha-suolitulehdukseen. Adenovirusserotyypin 5 (Ad5) tiedetään aiheuttavan hengityselinsairauksia, ja se on yleisin geenihoidon alalla tutkittu serotyyppi. Ensimmäisistä Ad5-vektoreista deletoitiin E1- ja/tai E3-alueet, jolloin vierasta DNA:ta voitiin viedä vektoreihin (Danthinne X, Imperiale, MJ. Gene Therapy. 2000;7:1707-1714). Lisäksi muiden alueiden deleetiot ja lisämutaatiot ovat tuottaneet lisäominaisuuksia virusvektoreille. Useita adenovirusten eri modifikaatioita on siis ehdotettu tehokkaiden kasvaimenvastaisten vaikutusten aikaansaamiseksi.

Silti tarvitaan tehokkaampaa ja tarkempaa geeninsiirtoa ja geenihoitojen lisääntynyttä spesifisyyttä ja riittävää kasvaintentappokykyä. Terapeuttisten vektorien turvallisuustietojen on myös oltava erinomaisia. Esillä oleva keksintö tarjoaa näillä edellä mainituilla ominaisuuksilla varustetun syövänhoito-keinon hyödyntämällä sekä adenovirusten onkolyyttisiä että immunoterapeutti-sia ominaisuuksia uudella ja keksinnöllisellä tavalla.

Keksinnön lyhyt kuvaus

Keksinnön tavoitteena on tuottaa uusia menetelmiä ja välineitä adenovirusten edellä mainittujen ominaisuuksien aikaansaamiseksi ja siten myös perinteisten syöpähoitojen ongelmien ratkaisemiseksi. Tarkemmin sanottuna keksintö tarjoaa uusia menetelmiä ja välineitä geenihoitoa varten.

Esillä oleva hakemus kuvaa rekombinanttien virusvektoreiden muodostamista, näihin vektoreihin liittyviä menetelmiä ja niiden käyttöä kasvainso-lulinjoissa, eläinmalleissa ja syöpäpotilaiden ja normaalien luovuttajien verisoluissa.

Esillä oleva keksintö koskee onkolyyttistä adenovirusvektoria, joka käsittää 1) adenovirusserotyypin 5 (Ad5:n) nukleiinihappopääketjun, joka käsittää kapsidimodifikaation, edullisesti kapsidimodifikaation adenoviruksen se-rotyypin 3 (Ad3) ulokkeella (Ad5/3-kapsidikimerismi), 2) 24 emäsparin deleetion (D24) E1:n Rb:tä sitovalla varoalueella 2 ja 3) nukleiinihapposekvenssin, joka koodaa CTLA-4-spesifistä täysin ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta (aCTLA-4-mAb), deletoidun gp19k/6.7K.r\ tilalla E3-alueella.

Esillä oleva keksintö koskee edelleen in vitro -solua, joka käsittää keksinnön mukaisen onkolyyttisen adenovirusvektorin.

Esillä oleva keksintö koskee myös farmaseuttista koostumusta, joka käsittää keksinnön mukaisen adenovirusvektorin.

Esillä oleva keksintö koskee myös keksinnön mukaista adenovirusvektoria käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa.

Esillä oleva keksintö koskee myös keksinnön mukaista farmaseuttista koostumusta käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa.

Esillä oleva keksintö liittyy myös menetelmään kohteen syövän hoitamiseksi, jolloin menetelmä käsittää keksinnön mukaisen vektorin tai farmaseuttisen koostumuksen antamisen kohteelle, joka sairastaa syöpää, erityi sesti tavanomaisiin kemoterapeuttisiin ja/tai sädehoitoihin huonosti reagoivaa syöpää.

Lisäksi esillä oleva keksintö koskee in vitro -menetelmää CTLA-4-spesifisen täysin ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi solussa, jolloin menetelmä käsittää: a) kuljetetaan keksinnön mukaista onkolyyttistä adenovirusvektoria käsittävä kuljetin soluun ja b) ilmennetään kyseisen vektorin CTLA-4-spesifistä täysin ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta solussa.

Lisäksi esillä oleva keksintö liittyy menetelmään kohteen kasvain-spesifisen immuunivasteen lisäämiseksi, jolloin menetelmässä kuljetetaan keksinnön mukaista onkolyyttistä adenovirusvektoria käsittävä kuljetin kohdesoluun tai -kudokseen, ilmennetään kyseisen vektorin täysin ihmisperäistä, CTLA-4:lle spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta solussa, lisätään anti-CTLA4-mAb-tuotannon määrää kasvaimissa (mutta ei normaaleissa kudoksissa) viruksen genomin kasvainspesifisen replikoitumisen ansiosta.

Esillä oleva keksintö koskee vielä myös keksinnön mukaisen onko-lyyttisen adenovirusvektorin käyttöä täysin ihmisperäisen, CTLA-4:lle spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi solussa in vitro.

Esillä oleva keksintö liittyy vielä myös keksinnön mukaiseen onko-lyyttiseen adenovirusvektoriin täysin ihmisperäisen, CTLA-4:lle spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi solussa.

Esillä oleva keksintö liittyy vielä myös keksinnön mukaisen onkolyyt-tisen adenovirusvektorin käyttöön kohteen kasvainspesifisen immuunivasteen lisäämiseksi.

Esillä oleva keksintö liittyy vielä keksinnön mukaisen onkolyyttiseen adenovirusvektoriin kohteen kasvainspesifisen immuunivasteen lisäämiseksi.

Esillä oleva keksintö koskee vielä keksinnön mukaista onkolyyttistä adenovirusvektoria käytettäväksi kasvainspesifisen immuunivasteen ja apop-toosin lisäämiseksi kohteessa.

Esillä oleva keksintö tarjoaa uuden välineen syöpien hoitamiseksi, jotka reagoivat huonosti nykyhoitoihin tai eivät ole nykyhoidoilla parannettavissa. Lisäksi hoitoon sopiviin kasvaintyyppeihin liittyviä rajoituksia on vähän verrattuna moniin muihin hoitoihin. Itse asiassa kaikkia kiinteitä kasvaimia voidaan hoitaa esitetyllä keksinnöllä. Esillä oleva keksintö voi auttaa tuhoamaan massaltaan suurempia kasvaimia ja kompleksisempia kasvaimia kuin aikaisemmilla tekniikoilla. Hoito voidaan antaa kasvaimensisäisesti, ontelonsisäisesti, laskimonsisäisesti ja käyttämällä näiden yhdistelmää. Hoitotapa voi antaa systeemisen tehon huolimatta paikallisesta injektiosta. Hoitotapa voi myös tuhota soluja, joiden oletetaan olevan kasvaimen aiheuttajia ("syöpäkantasolut”). (Eriksson M et ai. Mol Ther2007; 15(12):2088-93).

Sen lisäksi, että keksinnön mukainen vektori mahdollistaa vektorin kuljettamisen kohdealueelle, se myös varmistaa siirtogeenin ilmentymisen ja pysyvyyden. Esillä oleva keksintö ratkaisee ongelman, joka liittyy perinteisten hoitojen hoitoresistenssiin. Lisäksi esillä oleva keksintö tarjoaa keinoja ja menetelmiä selektiivisiä hoitoja varten vähemmällä toksisuudella tai vaurioilla terveissä kudoksissa. Esillä olevan keksinnön etuja ovat myös erilaiset ja vähentyneet sivuvaikutukset verrattuna muihin hoitoihin. Tärkeä seikka on, että hoitokeino on synergistinen monien muiden hoitomuotojen kanssa, mukaan lukien kemoterapia, pienimolekyyliset inhibiittorit ja sädehoito, ja sitä voidaan siten käyttää yhdistelmähoito-ohjelmissa.

Immuunireaktion aiheuttaminen sellaisia soluja vastaan, jotka sallivat aseistamattomien adenovirusten replikaation, ei normaalisti ole riittävän voimakas saamaan aikaan terapeuttisen kasvainimmuniteetin kehittymisen. Tämän heikkouden poistamiseksi esillä oleva keksintö tuottaa aseistettuja ade-noviruksia, joissa on täysin ihmisperäistä, CTLA-4:lle spesifistä monoklonaalis-ta vasta-ainetta, joka voimistaa kasvaimenvastaista immuniteettiä aktivoimalla sytotoksisia T-soluja ja antigeeniä esitteleviä soluja ja vähentämällä regulatori-sia T-soluja ja muita suppressiivisia soluja. Anti-CTLA-4-mAb:t voivat myös suoraan indusoida usein CTLA-4:ää ilmentävien kasvainsolujen apoptoosia. Keksinnön mukaisten adenovirusvektoreiden kautta realisoituvat monet edellä kuvatut CTLA-4:ää estävien vasta-aineiden välittämät kasvaimenvastaiset mekanismit: (A) : Anti-CTLA-4-mAb:t voivat estää aktivoitujen T-solujen pinnalla olevasta CTLA-4-molekyylistä peräisin olevaa immuunivastetta suppressoivaa signalointia (Chambers CA et ai., Annu Rev Immunol 2001;19:565-94). (B) : Tärkeä T-solujen inhiboiva alajoukko (regulatoriset T-solut, T-Reg) ilmentää konstitutiivisesti CTLA-4:ta ja voi sitoa B7-molekyylejä dendriit-tisolujen pinnalla, jotka ovat avainasemassa olevia antigeeniä esitteleviä soluja (Paust S et ai., Proc Natl Acad Sei USA 2004;101:10398-403). Tästä seuraa- va indoliamiini-2,3-dioksigenaasin ja muiden suppressiivisten verkostojen lisääminen johtaa T-solujen toleranssin induktioon mikroympäristössä sytotoksi-sen vaikutuksen sijasta (Munn DH et ai., J Clin Invest 2004; 114:280-90). (C) : CTLA-4:ää ilmentävät T-solut (mukaan lukien T-Reg-solut) voivat myös sitoutua suoraan aktivoituihin T-soluihin, koska kostimulatorisia B7-molekyylejä ilmennetään aktivoitujen ihmisen T-solujen pinnalla. CTLA-4:ää estävät mAb:t häiritsevät tätä suppressiivista signalointia ja johtavat kasvainan-tigeenispesifisten T-solujen paikalliseen ekspansioon (Paust S et ai., Proc Natl Acad Sei USA 2004; 101:10398^103). (D) : CTLA-4 ilmentyy monien kasvainsolujen pinnalla (Contardi E et ai., Int J Cancer 2005;117:538-50), mikä oletettavasti heijastaa suoraa immu-nosuppressiivista vaikutusta sytotoksisten T-solujen B7:ään ja DC:ihin. On mielenkiintoista, että CTLA-4:ää estävät mAb:t voivat indusoida kasvainsolujen suoraa tappamista käynnistämällä apoptoosin (Ribas A et ai., Oncologist 2007;12:873-83; Contardi E et ai., Int J Cancer 2005; 117:538-50) ja in vivo tätä voitaisiin lisätä edelleen vasta-aineesta riippuvaisella sellulaarisella sytotok-sisuudella (Jinushi M et ai. Proc Natl Acad Sei U S A 2006;103:9190-5). (E) : Kasvaimen ilmentämä CTLA-4 voi käynnistää lisääntyneen in-doliamiini-2,3-dioksigenaasin kasvainta infiltroivissa DC:issä, ja CTLA-4:lle spesifiset monoklonaaliset vasta-aineet voisivat myös estää tämän efektin (Ribas A et ai., Oncologist 2007;12:873-83).

Siten viisi eri mekanismia tekee keksinnön mukaisista adenoviruk-sista, jotka käsittävät monoklonaalista anti-CTLA-4:ää, tehokkaan kasvaimen-vastaisen lähestymistavat ilman systeemiseen altistukseen liittyviä sivuvaikutuksia, jotka ovat johtaneet huoliin turvallisuudesta (Hodi FS et ai., N Engl J Med. 2010; 363;8:711-23; Sanderson K et ai., J Clin Oncol 2005;23:741-50. Näiden viiden siirtogeenin välittämän mekanismin lisäksi viruksen onkolyytti-nen replikaatio lisää kasvaimenvastaista tehoa. Kun otetaan huomioon itse adenoviruksen välittämä voimakas immunostimulatorinen aktiivisuus (Tuve S, et ai. Vaccine. 2009;27(31 ):4225-39), onkolyysi lisää lähestymistavan kokonaista immunologista käyttöä. Alla olevassa esimerkissä 9 (kuviot 1, 11, 12) kuvaamme lisäparannuksen tässä suhteessa: CpG-ryhmien lisääminen adenoviruksen genomiin tekee viruksen vielä immunostimulatorisemmaksi.

Tunnetun tekniikan mukaisiin adenovirusvälineisiin verrattuna esillä oleva keksintö tarjoaa yksinkertaisemman, tehokkaamman, edullisemman, myr- kyttömämmän ja/tai turvallisemman välineen syöpähoitoa varten. Lisäksi autta-javiruksia tai rekombinanttimolekyylin samanaikaista annostelua ei tarvita.

Esillä oleva keksintö tarjoaa uuden sukupolven infektiivisyydeltään parempia ja erittäin tehokkaita adenoviruksia, joissa säilyy aikaisempien virusten hyvä turvallisuus mutta jotka johtavat tasoltaan korkeampiin tehokkuuksiin. Mikä tärkeää: esillä oleva keksintö kuvaa onkolyyttisiä adenoviruksia, jotka tuottavat immunologisia tekijöitä, jotka ovat kriittisiä onkolyyttisten virusten tehokkuuden suhteen.

Keksinnön mukaiset uudet tuotteet mahdollistavat lisäparannuksia syöpähoitoon.

Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuviossa 1 esitetään yksöis- ja kaksoiskohdennettujen ja anti-CTLA-4:llä aseistettujen onkolyyttisten adenovirusten muodostaminen. Kaavamainen esitys onkolyyttisistä asenoviruksista Ad5/3-A24aCTLA4 (yksöis-kohdennettu; muut ovat kaksoiskohdennettuja), Ad5/3-hTERT-A24aCTLA4, Ad5/3-hTERT-A24aCTLA4-CpG, Ad5/3-E2F-A24aCTLA4 ja Ad5/3E2F-A24aCTLA4-CpG, replikoitumiskyvytön Ad5/3-aCTLA4 sekä aseistamaton on-kolyyttinen Ad5/3-A24 (positiivinen kontrolli) ja replikoitumiskyvytön Ad5/3-Luc1 (negatiivinen kontrolli).

Kuvioissa 2A - 2D esitetään viruksen tuottaman monoklonaalisen anti-CTLA4-vasta-aineen ilmentymisen ja toiminnan arviointi.

Kuvio 2A: Viruksella infektoitujen A549- (kaistat 1 ja 2 vasemmalta oikealle) tai PC3-MM2 (kaistat 3 ja 4) -solujen seerumia sisältämättömät su-pernatantit analysoituna Western blot -määrityksellä ihmisen lg:n (sekä raskaat että kevyet ketjut) toteamiseksi spesifisesti natiiveissa (ylempi rivi) tai denaturoivissa olosuhteissa (alempi rivi). Kaistat 1 ja 3: Ad5/3-A24aCTLA4:llä infektoidut solut; kaistat 2 ja 4: Ad5/3-aCTLA4:llä infektoidut solut.

Kuvio 2B: Funktionaalinen määritys, joka osoittaa viruksen tuottaman monoklonaalisen anti-CTLA4-vasta-aineen aktiivisuuden. Jurkat-soluja in-kuboitiin ionomysiinin, forboli-12-myristaatti-13-asetaatin (PMA) ja rekombinan-tin ihmisen B7:n kanssa, mikä johtaa CD28- ja CTLA-4-positiivisiin soluihin, jotka muistuttavat T-soluja, joita stimuloivat antigeeniä esittelevät solut mutta joita inhiboivat suppressorisolut, tilanne, joka usein havaitaan pitkälle edenneissä kasvaimissa. Supernatantti Ad5/3-A24aCTLA4:llä tai Ad5/3-aCTLA4:llä infektoiduista soluista johti B7/CTLA-4-välitteisen suppression inhibitioon. Tämä nähdään T-solun aktivaatiomerkin, IL-2:n, lisääntyneenä tuotantona. Re- kombinantti monoklonaalinen anti-CTLA4-vasta-aine oli mukana positiivisena kontrollina.

Kuvio 2C: Loss of function (toiminnon menetys) -määritys, joka osoittaa rekombinantin CTLA-4:n (rCTLA-4) affiniteetin viruksen tuottamaan monoklonaalisen anti-CTLA4-vasta-aineeseen. Jurkat-solut aktivoitiin kuten edellä, mutta nyt lisättiin myös rCTLA-4:ää sitomaan B7:ää, mikä estää CTLA-4:n aktivaation. Kun aCTLA4:ää sisältävä supernatantti lisättiin, rCTLA-4 estyi ja B7 kykeni sitomaan CTLA-4:ää, jolloin IL-2-tuotanto alenee. Pylväät, kolmen itsenäisen kokeen keskiarvo; tangot, SE *, P < 0,05; ***, P < 0,001.

Kuvio 2D: CTLA4:n ilmentymistasot A549-, SKOV3-ip1-, PC3-MM2-kasvainsolulinjoissa ja alhaisen kasvatuksen kasvaineksplantissa (low-passa-ge tumor explant) UT-SCC8. Kaikki kasvainsolulinjat olivat positiivisia CTLA4:n suhteen fluoresenssiavusteisessa solulajittelussa.

Kuvio 3 esittää anti-CTLA4:lla aseistettujen adenovirusten ja kont-rollivektoreiden solutappotehokkuuden. Kasvainsolulinjat (A) PC3-MM2, (B) SKOV3-ip1, (C) A549 ja (D) alhaisen kasvatuksen kasvaineksplantti UT-SCC8 infektoitiin. Ad5/3-A24aCTLA4:llä oli samanlainen onkolyyttinen teho kuin positiivisella kontrolliviruksella Ad5/3-A24 kaikissa solulinjoissa. Myös replikoitu-miskyvyttömällä Ad5/3-aCTLA4:llä oli kasvaimenvastaista aktiivisuutta, koska kasvainsolut ilmentävät CTLA4:ää. Pylväät, kolmoismäärityksen keskiarvo; tangot, SE. **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

Kuvio 4 esittää kasvaimen kasvun suppression ja apoptoosin im-muunipuutteiseissa hiirissä, joissa oli ihmisen eturauhassyöpäksenograftit ja joita oli käsitelty monoklonaalista anti-CTLA-4-vasta-ainetta ilmentävällä onko-lyyttisellä adenoviruksella. PC3-MM2-kasvaimet (n = 8/ryhmä) muodostettiin karvattomiin hiiriin, joissa ihmisen anti-CTLA-4:llä ei ole immunologista aktiivisuutta. Siksi malli mittaa vain anti-CTLA-4:n onkolyysiä ja proapoptoottista vaikutusta. Seitsemän päivän kuluttua kasvaimia (5-8 mm halkaisijaltaan) käsiteltiin kasvaimensisäisesti 1*108 viruspartikkelilla päivinä 0, 2 ja 4 (nuolet). Mock-hiiret injektoitiin vain kasvualustoilla.

Kuvio 4A: Ad5/3-A24aCTLA4:lla oli paras kasvaimenvastainen aktiivisuus tässä erittäin aggressiivisessa mallissa. Kasvainkoko esitetään suhteessa keskimääräiseen alkuperäiseen kokoon. Pisteet, keskiarvo; tangot, SE; **, P < 0.01 (Studentin t-testi päivänä 7).

Kuvio 4B: Päivänä 5 kasvainten jääleikkeet värjättiin anti-CTLA4:n ilmentymisen suhteen (ihmisen IgG, ylempi rivi) tai apoptoosin suhteen (aktiivi nen kaspaasi-3, alempi rivi) immunohistokemialla (ruskea). Kuvat on otettu suurennoksella *40.

Kuvio 4C: Päivänä 7 ihmisen lgG:n pitoisuudet Ad5/3- A24aCTLA4:llä tai Ad5/3-aCTLA4:llä käsiteltyjen hiirten kasvaimissa ja plasmassa mitattiin. Ad5/3-Ä24aCTLA4:llä käsitellyillä kasvaimilla havaittiin 81-kertaisesti enemmän anti-CTLA4-mAb:tta verrattuna Ad5/3-aCTLA4:llä käsiteltyihin kasvaimiin (p<0,05). Lisäksi 43,3-kertaisesti enemmän anti-CTLA4-mAb:tta havaittiin kasvaimissa, joita oli käsitelty Ad5/3-A24aCTLA4:llä kuin samojen eläinten plasmassa (p<0,05). Keskimääräinen plasmapitoisuus oli 392,6 pg/g (SE 312,0), mikä on alle pitoisuuksien, joita on raportoitu siedetyiksi ihmisillä, joita on hoidettu ipilimumabilla (561 pg/ml) ja vastaavasti tremeli-mumabilla, 450 pg/m, (REFS) (1 ml plasmaa painaa noin 1 g). Ad5/3-Ä24aCTLA4-kasvaimissa mAb-pitoisuus oli 16 977 pg/g ja siten paljon korkeampi kuin plasmassa. Pylväät, kolmoismääritysten keskiarvo; tangot, SE.

Kuviossa 5 esitetään Ad5/3-Ä24aCTLA4:n välittämä lisääntynyt IL-2- ja IFN-y-tuotanto syöpäpotilaiden stimuloiduissa perifeerisen veren mono-nukleaarisisa soluissa (PBMC). Syöpäpotilaiden (potilas I244, potilas C261, potilas M158 tai potilas X258) PBMC:t stimuloitiin ionomysiinillä, PMA:lla ja re-kombinantilla ihmisen B7:llä kasvaimen indusoiman immuunisuppression matkimiseksi ja käsiteltiin suodatetuilla supernatanteilla viruksella infektoiduista PC3-MM2-soluista. IL-2 (A) ja IFN-γ (B) ovat T-soluaktivaation merkkejä, ja ne mitattiin FACS-arraylla. Rekombinantti monoklonaalinen anti-CTLA-4-vasta-aine sisällytettiin positiiviseksi kontrolliksi. Pylväät, kolmen itsenäisen kokeen keskiarvo; tangot, SE. *, P < 0,05; **, P < 0,01 ; ***, P < 0,001.

Kuviossa 6 esitetään Ad5/3-A24aCTLA4:n välittämä IL-2- ja IFN-y-tuotanto terveiden luovuttajien perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC). PBMC:t kahdesta terveestä luovuttajasta stimuloitiin ionomysiinillä, PMA:lla ja rekombinantilla ihmisen B7:llä ja niitä käsiteltiin suodatetuilla supernatanteilla viruksella infektoiduista PC3-MM2-soluista. IL-2- (A) tai IFN-γ- (B) pitoisuudet kasvatusalustoissa mitattiin FACS-arraylla. Pylväät, kolmen itsenäisen kokeen keskiarvo; tangot,SE. *, P < 0,.05; ***, P < 0,001.

Kuviossa 7 esitetään kuvioissa 2, 5 ja 6 esitetyissä esimerkeissä esitettyjen anti-CTLA-4:n funktionaalisuusmääritysten kaavio. In vivo, dendriit-tisolut esittelevät antigeenejä kudosten yhteensopivuuskompleksin (MHC) kautta T-solureseptorille (TCR) T-solun pinnalla. Immuunivasteelle toleranssin sijasta tarvitaan myös kostimulaatiota. Tätä välittää (DC:iden pinnalla olevien) B7.1:n tai B7.2:n sitoutuminen CD28:aan T-solulla. T-soluaktivaatio voidaan kvantitoida IL-2:n ja IFN-γιη tuotannolla.

Kuvio 7A: Koskemattoman immuunisysteemin puuttuessa T-solu-aktivaatio voidaan stimuloida in vitro inkuboimalla PBMC:t forboli-12-myris-taatti-13-asetaatin (PMA) ja ionomysiinin kanssa, mikä johtaa aktivaatioon, joka on riippumaton TCR-ja CD28-signaloinnista.

Kuvio 7B: T-soluaktivaatiossa negatiivisena palautekontrollimeka-nismina myös CTLA-4:n ilmentyminen lisääntyy.

Kuvio 7C: CTLA-4:lla on 10O-kertaisesti korkeampi affiniteetti kuin CD28:lla B7:ään, mikä johtaa T-solukiinniottoon.

Kuvio 7D: CTLA-4-signaloinnin esto anti-CTLA-4-vasta-aineiden toimesta estää inhibition, mikä johtaa T-solujen aktivaatioon.

Kuvio 7E: Kun liukoista rekombinanttia ihmisen CTLA-4:ää lisätään, anti-CTLA-4-mAb otetaan kiinni, mikä jättää B7:n vapaaksi sitoutumaan CTLA-4:ään T-solukiinniottoa varten.

Kuvio 7F: Jos rekombinanttia CTLA-4:ää lisätään kasvatusalustaan ilman anti-CTLA4-mAb:iden läsnäoloa, se ottaa kiinni B7:n jättäen T-solun aktivoituun tilaan.

Kuviossa 8 esitetään spesifinen anti-CTLA4-mAb-aktiivisuus Ad5/3-A24aCTLA4:n vaikutuksesta syöpäpotilaiden stimuloiduissa perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC). Syöpäpotilaiden (potilas I244, potilas C261, potilas M158tai potilas X258) PBMC:t stimuloitiin ionomysiinillä, PMA:lla ja rekombinantilla ihmisen B7:llä ja rekombinantilla ihmisen CTLA-4:lla; ja niitä käsiteltiin suodatetuilla supernatanteilla viruksella infektoiduista PC3-MM2-soluista. IL-2- (A) tai IFN-γ- (B) pitoisuudet kasvatusalustoissa mitattiin FACS-arraylla. Pylväät, kolmen itsenäisen kokeen keskiarvo; tangot,SE. *, P < 0,05.

Kuviossa 9 esitetään Ad5/3-A24aCTLA4:n välittämä spesifinen anti-CTLA4-mAb-aktiivisuus terveiden luovuttajien stimuloiduissa perifeerisen veren mononukleaarisisa soluissa (PBMC). PBMC:itä inkuboitiin ionomysiinin, PMA:n ja rekombinantin ihmisen B7:n kanssa, ja niitä käsiteltiin suodatetuilla supernatanteilla viruksella infektoiduista PC3-MM2-soluista. IL-2- (A) tai IFN-y-(B) pitoisuudet kasvatusalustoissa mitattiin FACS-arraylla. Pylväät, kolmen itsenäisen kokeen keskiarvo.

Kuvio 10 osoittaa replikoitumiskykyisen mallin käyttökelpoisuuden anti-CTLA4-mAb:n ilmentymisen lisäämisessä verrattuna replikoitumiskyvyttö-mään virukseen. PC3-MM2-solut istutettiin pitoisuutena 20 000 solua kuoppaa kohti ja infektoitiin 10 viruspartikkelilla vastaavilla viruksilla. 24, 48 ja 72 tuntia infektion jälkeen supernatantit otettiin talteen ja analysoitiin ELISA:Ma ihmisen lgG:n määrän suhteen. Kolminkertainen lisäys havaittiin onkolyyttisellä viruksella Ad5/3-A24aCTLA4 verrattuna replikoitumiskyvyttömään Ad5/3-aCTLA4:ään. Pylväät, nelinkertaisten määritysten keskiarvo; tangot, SE. ***, P <0,001.

Kuviossa 11 osoitetaan onkolyyttisen adenoviruksen, joka sisältää TLR-9:ää (toll-like receptor 9) stimuloivia CpG-molekyylejä, vaikutus keuhkosyövän ksenograftihiirimallissa. Karvattomiin hiiriin (5 hiirtä ryhmää kohti, kaksi kasvainta hiirtä kohti) istutettiin A549-soluja ja niitä käsiteltiin seuraavasti: fysiologinen suolaliuos (musta kolmio), CpG-rikas onkolyyttinen adenovirus (Ad5-A24CpG, valkoinen ympyrä), onkolyyttinen adenovirus (Ad5-A24, musta neliö), onkolyyttinen adenovirus + rekombinantit CpG-oligot (valkoinen neliö). CpG-rikas virus oli tehokkain välittämään kasvaimenvastaista immuniteettiä, ja se oli jopa tehokkaampi kuin onkolyyttinen adenovirus annettuna yhdessä re-kombinantin CpG-molekyylin kanssa.

Kuviossa 12 esitetään tulokset MTS-solutappomäärityksestä, joka suoritettiin pernasoluilla, jotka oli otettu käsitellyistä hiiristä ajanhetkellä 72 tuntia (samat hiiret kuin kuviossa 11). Raportoidaan vielä elossa olevien A549-solujen määrä osoitettuna ajanhetkenä.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Adenovirusvektori

Ad5:ssä, kuten myös muissa adenoviruksissa, ikosahedraalinen kapsidi koostuu kolmesta pääproteiinista: heksonista (II), penton base -proteiinista (III) ja ulokkeisesta säikeestä (IV), lisäksi siinä on pieniä proteiineja; VI, Vili, IX, lila ja IVa2 (Russel W. C., J General Virol 2000;81, 2573-2604). Proteiinit VII, pienpeptidi mu ja terminaaliproteiini (TP) ovat liittyneinä DNA:han. Proteiini V tarjoaa rakennelinkin kapsidiin proteiinin VI välityksellä. Viruksen koodaama proteaasi tarvitaan joidenkin rakenneproteiinien käsittelyä varten.

Esillä olevan keksinnön mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori perustuu adenoviruksen serotyypin 5 (Ad5) nukleiinihappopääketjuun, joka käsittää kapsidimodifikaation, kuten adenoviruksen serotyypin 3 (Ad3) ulokkeen (Ad5/3-kapsidikimerismi), 24 emäsparin deleetion (D24) E1:n Rb:tä sitovalla vakioalueella 2 ja nukleiinihapposekvenssin, joka koodaa CTLA-4:lle spesifistä täysin ihmisperäistä monoklonaalista vasta-ainetta (anti-CTLA4 mAb tai aCT-LA4) poistetun gp19k/6.7K:n tilalla E3-alueella.

Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa adenovirusvektori perustuu ihmisen adenovirukseen.

Ad5-genomi sisältää varhaisvaiheen (E1-4), keskivaiheen (IX ja IVa2) ja myöhäisvaiheen geenejä (L1-5), joiden vasemmalla ja oikealla puolella on invertoituneita terminaalisia toistoja (LITR:iä ja vastaavasti RITR:iä), jotka sisältävät DNA:n replikaatioon tarvittavat sekvenssit. Genomi sisältää myös pakkaussignaalin (Ψ) ja MLP:n (major late promoter).

Varhaisvaiheen geenin E1A transkriptio aloittaa replikaatiosyklin, jonka jälkeen E1B-, E2A-, E2B-, E3-ja E4-proteiinit ilmentyvät. E1 -proteiinit moduloivat solun metaboliaa tavalla, joka tekee solusta alttiimman virusrepli-kaatiolle. Esimerkiksi ne häiritsevät NF-κΒ-, p53- ja pRb-proteiineja. E1A ja E1B estävät yhdessä apoptoosia. E2- (E2A-ja E2B-) ja E4-geenituotteet välittävät DNA:n replikaatiota ja E4-tuotteet vaikuttavat myös viruksen RNA-metaboliaan ja estävät isännän proteiinisynteesiä. E3-geenituotteet vastaavat puolustautumisesta isännän immuunijärjestelmää vastaan, edistävät solun hajoamista ja virusjälkeläisten vapautumista (Russel W. C., J General Virol 2000;81,2573-2604).

Keskivaiheen geenit IX ja IVa2 koodaavat viruskapsidin pieniä proteiineja. MLP vaikuttaa myöhäisvaiheen geenien L1-5 ilmentymiseen, joka johtaa viruksen rakennekomponenttien tuotantoon, viruspartikkeleiden kapsidoi-tumiseen ja kypsymiseen tumassa (Russel W. C., J General Virol 2000;81, 2573-2604).

Verrattuna villityypin adenoviruksen genomiin keksinnön mukaisesta adenovirusvektorista puuttuu 24 emäsparia E1-alueen, tarkemmin sanottuna E1A-alueen, CR2:sta, ja gp19k ja 6.7K E3-alueelta ja se käsittää kapsidimodi-fikaation viruksen säikeessä. Joissakin suoritusmuodoissa verrattuna villityypin adenoviruksen genomiin, keksinnön mukainen adenovirusvektori lisäksi käsittää hTERT-promoottorin tai E2F-promoottorin E1-alueella, erityisesti ylävirtaan E1A-alueesta, ja siitä puuttuu gp19k ja 6.7K E3-alueelta. Joissakin suoritusmuodoissa keksintö sisältää myös adenoviruksen rungon, joka on rikastettu TLR-9:ää sitovilla CpG-saarekkeille, jotka on laitettu E3-alueelle (kuvio 1).

Eräässä keksinnön edullisessa sovellusmuodossa muunnettujen/-osittaisten E1-ja E3-alueiden lisäksi keksinnön mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää lisäksi yhden tai useamman alueen, jotka valitaan ryhmäs tä, joka koostuu E2:sta, E4:stä ja myöhäisvaiheen alueista. Eräässä keksinnön edullisessa sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää seu-raavat alueet: vasen ITR, osittainen E1, plX, plVa2, E2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4, osittainen E3, L5, E4 ja oikea ITR. Alueet voivat olla vektorissa missä tahansa järjestyksessä, mutta eräässä keksinnön edullisessa sovellusmuodossa alueet ovat peräkkäisessä järjestyksessä 5-3’-suunnassa. Avoimet lukukehykset (ORF:t) voivat olla samassa DNA-juosteessa tai eri DNA-juosteissa. Eräässä keksinnön edullisessa sovellusmuodossa E1-alue käsittää viruksen pakkaussignaalin. Tässä yhteydessä ilmaisu "adenovirusserotyypin 5 (Ad5) nukleiini-happopääketju” tarkoittaa Ad5:n genomia tai osagenomia, joka käsittää yhden tai useampia alueita, jotka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat Ad5:stä peräisin olevat osittainen E1, plX, plVa2, E2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4, osittainen E3, L5 ja E4. Edullisessa sovellusmuodossa keksinnön mukainen vektori käsittää Ad5:n pääketjun yhdessä osan Ad3:a (esimerkiksi osan kapsidirakennetta) kanssa. Tässä yhteydessä ilmaisu "osittainen” alue tarkoittaa aluetta, josta puuttuu jokin osa verrattuna vastaavaan villityypin alueeseen. Esimerkiksi "osittainen E3” viittaa E3-alueeseen, josta puuttuu gp19k/6.7K. Tässä yhteydessä ilmaisut ”VA1” ja ”VA2” tarkoittavat virukseen liittyviä RNA:ita 1 ja 2, jotka adenovirus transkriptoi mutta jotka eivät translatoidu. VA1:Mä ja VA2:lla on osuutensa solun puolustusmekanismeja vastaan taistelemisessa. Tässä yhteydessä ilmaisu "viruksen pakkaussignaali” tarkoittaa viruksen DNA:n osaa, joka koostuu sarjasta AT-rikkaita sekvenssejä ja ohjaa kapsidoitumisprosessia. E1:n 24 emäsparin deleetio (D24) vaikuttaa CR2-domeeniin, joka on vastuussa kasvaimen suppressori/solusyklin säätelyproteiinin Rb sitomisesta ja siten sallii (S)-faasin, ts. DNA-synteesin tai replikaatiovaiheen, synteesin induktion. pRb:n ja E1A:n vuorovaikutus vaatii E1A-proteiin säilyneen alueen kahdeksan aminohappoa, 121-127 (Heise C. et ai. 2000, Nature Med 6, 1134-1139), jotka on poistettu esillä olevassa keksinnössä. Esillä olevan keksinnön mukainen vektori käsittää aminohappoja 122-129 vastaavien nukleiinihappojen deleetion Heise C. et ai.’n (2000, Nature Med 6, 1134-1139) vektorista. Viruksilla, joissa on D24, tiedetään olevan vähentynyt kyky kiertää G1-S-tarkistuspiste ja replikoituvan tehokkaasti vain soluissa, joissa tämä vuorovai kutus ei ole välttämätön, esim. kasvainsoluissa, jotka ovat puutteellisia Rb-p16-reitin suhteen (Heise C. et ai. 2000, Nature Med 6, 1134-1139; Fueyo J et ai. 2000, Oncogene 19, 2-12). E3-alue ei ole olennainen in vitro -virusreplikaatiossa, mutta E3-pro-teiineilla on tärkeä osa isännän immuunivasteen säätelyssä, toisin sanoen sekä luontaisten että spesifisten immuunivasteiden estämisessä. gp19k/6.7K-6e-leetio E3:ssa tarkoittaa 965 emäsparin deleetiota adenoviruksen E3A-alueella. Seurauksena olevassa adenovirusrakenteessa sekä gp19k- että 6.7K-geeni on poistettu (Kanerva A. et ai., Gene Therapy 2005; 12, 87-94). gp19k-geenin tuotteen tiedetään sitovan ja eristävän MHC1-molekyylejä (major histocompa-tibility complex I) solulimakalvostossa ja estävän sytotoksisia T-lymfosyyttejä tunnistamasta infektoituneita soluja. Koska monista kasvaimista puuttuu MHC1, gp19k\n deleetio lisää virusten kasvainselektiivisyyttä (virus poistetaan nopeammin kuin villityypin virus normaaleista soluista, mutta kasvainsoluissa ei ole eroa). 6.7K-proteiinit ilmentyvät solun pinnoilla ja osallistuvat TNF:n kaltaisen apoptoosia indusoivan ligandin (TRAIL) reseptorin 2 vähentämiseen.

Esillä olevassa keksinnössä CTLA4-mAb:tta koodaava cDNA sijoitetaan gp19k/6.7/f-deletoidulle E3-alueelle E3-promoottorin alaisuuteen. Tämä rajoittaa siirtogeenin ilmentymisen kasvainsoluihin, jotka sallivat viruksen repli-kaation ja sen jälkeisen E3-promoottorin aktivoinnin. E3-promoottori voi olla mikä tahansa alalla tunnettu eksogeeninen tai endogeeninen promoottori, edullisesti endogeeninen promoottori. Keksinnön eräässä edullisessa sovel-lusmuodossa anti-CTLA4-mAb:ta koodaava nukleiinihapposekvenssi on viruksen E3-promoottorin säätelyn alainen. gp 19k-de\eet\o on erityisen käyttökelpoinen CD40L:n ilmentymisen yhteydessä, koska se voi lisätä kasvainepitooppien MFlC1-esittelyä sellaisissa kasvaimissa, joissa tämä kyky säilyy. Tässä yhteydessä APC-ja T-solujen stimulaatio anti-CTLA-mAb:n vaikutuksesta voi johtaa optimaaliseen hyötyyn.

Anti-CTLA4-mAb toimimalla monien eri mekanismien kautta, kuten esimerkiksi sytotoksisten T-solujen aktivaatio, regulatoristen T-solujen (T-Reg:t) vähentäminen ja CTLA-4:ää ilmentävien kasvainsolujen vaikutuksesta tapahtuvan sytotoksisten T-solujen ja antigeeniä esittelevien solujen (esim. dendriit-tisolujen) suoran immunosuppression inhibointi. Näiden 5 siirtogeenin välittämän, edellä yksityiskohtaisesti selitetyn mekanismin lisäksi viruksen onkolyytti-nen replikaatio lisää kasvaimenvastaista vaikutusta. CTLA4-mAb:tta koodaava nukleotidisekvenssi voi olla mistä tahansa eläimestä, kuten ihmisestä, apinasta, rotasta, hiirestä, koirasta tai kissasta riippuen hoidettavasta kohteesta, mutta edullisesti CTLA4-mAb:tta koodaa täysin ihmisperäinen sekvenssi ihmisten hoidon yhteydessä. CTLA4-mAb:tta koodaava nukleotidisekvenssi voi olla modifioitu sen vaikutusten parantamiseksi, tai modifioimaton, ts. villiä tyyppiä. Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa CTLA4-mAb:tta koodaava nukleiinihapposekvenssi on modifioimaton.

Eksogeenisten elementtien lisääminen saattaa lisätä vektoreiden vaikutuksia kohdesoluissa. Eksogeenisten kudos- tai kasvainspesifisten pro-moottoreiden käyttö on yleistä rekombinanteissa adenovirusvektoreissa, ja niitä voidaan käyttää hyväksi myös esillä olevassa keksinnössä Joissakin suoritusmuodoissa keksinnön mukaiset adenovirukset käsittävät hTERT:in tai hTERT:n variantin tai E2F:n E1A-alueen kontrolloimiseksi, edullisesti ylävirtaan E1A:sta. hTERT ohjaa vektorin soluihin, jotka ilmentävät telomeraasia, kun taas E2F ohjaa vektorin soluihin, joissa on Rb/p16-reitin puutteita. Tällaiset puutteet johtavat vapaan E2F:n korkeisiin ilmentymistasoihin ja E2F-promoot-torin korkeaan aktiivisuuteen. Kuitenkin viruksen replikaatio voidaan rajoittaa kohdesoluihin millä tahansa muulla sopivalla promoottorilla, joita ovat mainittuihin rajoittumatta CEA, SLP, Cox-2, Midkine, CXCR4, SCCA2 ja TTS. Ne lisätään tavallisesti kontrolloimaan E1A-aluetta, mutta sen lisäksi tai vaihtoehtoisesti muita geenejä, kuten E1B tai E4, voidaan myös säädellä. Eksogeenisiä insulaattoreita, ts. estäviä elementtejä epäspesifisiä tehostajia vastaan, vasen ITR, natiivi E1A-promoottori tai kromatiiniproteiineja, voidaan myös sisällyttää rekombinantteihin adenovirusvektoreihin. Mitä tahansa lisäkomponenttia tai modifikaatiota voidaan mahdollisesti käyttää, mutta ne eivät ole välttämättömiä esillä olevan keksinnön mukaisissa vektoreissa.

Muissa keksinnön suoritusmuodoissa keksinnön mukaisissa adenovirusvektoreissa esiintyy TLR-9:ää sitova CpG-rikas DNA-alue adenoviruksen rungossa (kuviot 1, 11, 12).

Keksinnön mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää kap-sidimodifikaation. Useimmat aikuiset ovat altistuneet laajimmin käytetylle ade-novirusserotyypille Ad5 ja siksi immuunijärjestelmä kykenee nopeasti tuottamaan neutraloivia vasta-aineita (NAb:tä) sitä vastaan. Itse asiassa anti-Ad5-NAb:n esiintyvyys voi olla jopa 50 %. On osoitettu, että NAb voi olla indusoitunut useimpia adenoviruskapsidin immunogeenisiä proteiineja vastaan, ja toisaalta on osoitettu, että jopa pienet muutokset Ad5:n säieulokkeessa voivat sallia paon kapsidispesifiseltä NAb:lta (Särkioja M, et ai. Gene Ther. 2008; 15(12):921-9). Siten ulokkeen modifioiminen on tärkeää geeninsiirron ylläpitämiseksi tai lisäämiseksi käytettäessä adenoviruskontaktia ihmisissä.

Lisäksi Ad5:n tiedetään sitoutuvan CAR:ksi kutsuttuun reseptoriin säikeen ulokeosan välityksellä, ja tämän ulokeosan tai säikeen modifikaatiot voivat parantaa kohdesoluun pääsyä ja aiheuttaa vahvistetun onkolyysin monissa tai joissakin syövissä (Ranki T. et ai., Int J Cancer 2007; 121, 165-174). Kapsidimodifioidut adenovirukset ovatkin edullisia välineitä parannetulle geeninsiirrolle syöpäsoluihin. Tässä yhteydessä "kapsidi” tarkoittaa viruksen proteiinikuorta, joka sisältää heksoni-, säie-ja penton base -proteiineja. Mitä tahansa kapsidimodi-fikaatiota, toisin sanoen alalla tunnettua heksoni-, säie- ja/tai penton base -proteiinien modifikaatiota, joka parantaa viruksen viemistä kasvainsoluun, voidaan hyödyntää esillä olevassa keksinnössä. Modifikaatiot voivat olla geneettisiä ja/tai fysikaalisia modifikaatioita ja sisältää mainittuihin rajoittumatta modifikaatioita, joilla lisätään ligandeja, jotka tunnistavat spesifisiä solureseptoreja ja/tai estävät natiiveja reseptoreja sitoutumasta, ja joilla korvataan adenovirusvekto-rin säie- tai ulokedomeeni toisen adenoviruksen ulokkeella (kimerismi) ja lisätään spesifisiä molekyylejä (esimerkiksi fibroblastikasvutekijä 2, FGF2) adeno-viruksiin. Näin ollen kapsidimodifikaatiot sisältävät mainittuihin rajoittumatta pienojen peptidimotiivi(e)n, peptidi(e)n, kimerismi(e)n tai mutaatio(ide)n lisäämisen säikeeseen (esimerkiksi uloke-, häntä- tai varsiosaan), heksoniin ja/tai penton base -yksikköön. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa kapsidimodifikaatio on Ad5/3-kimerismi, integriiniä sitovan alueen (RGD:n) in-sertio ja/tai hepariinisulfaattia sitovan polylysiinin modifikaatio säikeeseen. Keksinnön erityisessä suoritusmuodossa kapsidimodifikaatio on Ad5/3-kime-rismi. Tässä yhteydessä kapsidin ”Ad5/3-kimerismi” tarkoittaa kimerismiä, jossa säikeen ulokeosa on Ad-serotyyppi 3:sta ja loppusäie on Ad-serotyyppi 5:stä.

Keksinnön mukainen vektori voi sisältää myös muita modifikaatioita, kuten E1B-alueen modifikaatioita. Tässä yhteydessä ”RGD” tarkoittaa arginiini-glysiini-asparagiini-happo (RGD) -motiivia, joka on paljastettuna penton base -yksikön pinnalla ja toimii vuorovaikutteisesti adenoviruksen internalisaatiota tukevien solun α-ν-β-integriinien kanssa. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa kapsi- dimodifikaatio on RGD-4C-modifikaatio. ”RGD-4C-modifikaatio” tarkoittaa hete-rologisen integriiniä sitovan RGD-4C-motiivin insertiota säikeen ulokealueen Hl-silmukkaan. 4C tarkoittaa neljää kysteiiniä, jotka muodostavat rikkisiltoja RGD-4C:ssä. RGD-4C-peptidin sisältävää säiettä koodaavan rekombinantti-Ad5-säiegeenin rakentaminen kuvataan yksityiskohtaisesti esimerkiksi Dmit-riev I. et ai:n artikkelissa (Journal ofVirology 1998; 72, 9706-9713). Tässä yhteydessä "heparaanisulfaattia sitova polylysiinimodifikaatio” tarkoittaa seitsemän lysiinin jakson lisäämistä säieulokkeen C-päähän.

Ekspressiokasetteja käytetään siirtogeenien ilmentämisessä kohteessa, esimerkiksi solussa, käyttämällä vektoreita. Tässä yhteydessä ilmaisu "ekspressiokasetti” tarkoittaa DNA-vektoria tai sen osaa, joka käsittää cDNA:ita tai geenejä koodaavia nukleotidisekvenssejä tai mainittujen cDNA:iden tai geenien ilmentymistä ohjaavia ja/tai sääteleviä nukleotidisekvenssejä. Samanlaisia tai erilaisia ekspressiokasetteja voidaan insertoida yhteen vektoriin tai useampaan erilaiseen vektoriin. Esillä olevan keksinnön mukaiset Ad5-vektorit voivat käsittää joko useita ekspressiokasetteja tai yhden ekspressiokasetin. Vain yksi ekspressiokasetti on kuitenkin riittävä. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää ainakin yhden ekspressiokasetin. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää vain yhden ekspressiokasetin.

Keksinnön mukaisen adenovirusvektorin käsittävä solu voi olla mikä tahansa solu, esimerkiksi eukaryoottisolu, bakteerisolu, eläinsolu, ihmissolu, hiirisolu ja niin edelleen. Solu voi olla in vitro-, ex vivo- tai in vivo -solu. Solua voidaan esimerkiksi käyttää adenovirusvektorin tuottamiseen in vitro, ex vivo tai in vivo tai solu voi olla kohde, esimerkiksi kasvainsolu, joka on infektoitu adenovirusvektorilla.

Menetelmässä CTLA4-mAb:ien tuottamiseksi solussa keksinnön mukaisen vektorin käsittävä kuljetin kuljetetaan soluun, ja CTLA4-mAb-geeni ilmennetään ja proteiini translatoidaan ja sekretoidaan parakriinisesti. "Kuljetin” voi olla mikä tahansa virusvektori, plasmidi tai muu väline, kuten partikkeli, joka kykenee kuljettamaan keksinnön mukaisen vektorin kohdesoluun. Mitä tahansa alalla tunnettua tavanomaista menetelmää voidaan käyttää vektorin kuljettamisessa soluun.

Esillä olevalla keksinnöllä voidaan lisätä kasvainspesifistä immuunivastetta kohteessa. Sytotoksisten T-solujen aktivaatio, regulatoristen T-solujen (T-Reg:t) vähentäminen ja CTLA-4:ää ilmentävien kasvainsolujen suoraa syto- toksisten T-solujen ja dendriittisolujen immunosuppression inhibointi tapahtuu seurauksena CTLA4-mAb:n ilmentymisestä.

Keksinnön vaikutusten seuraamiseksi tai tutkimiseksi voidaan määrittää erilaisia immuunivasteen parametreja. Yleisimpiä merkkejä ovat esimerkiksi mainittuihin rajoittumatta muutokset kasvain- tai adenovirusspesifisissä sytotoksisissa T-soluissa veressä tai kasvaimissa. Antigeeniä esittelevien solujen rekrytointia ja aktivaatiota voidaan tutkia kasvaimissa tai imukudoksessa. Lisäksi voidaan tutkia regulatoristen solujen alaryhmiä (esim. regulatorisia T-soluja) lukumäärän tai aktiivisuuden suhteen. Seerumin sytokiiniprofiilit voivat valaista Th1/Th2-ympäristöä, mikä myös on tärkeää immuunisuus versus toleranssille. Näiden merkkiaineiden tasoja voidaan tutkia minkä tahansa alalla tunnetun tavanomaisen menetelmän mukaisesti mukaan lukien mutta mainittuihin rajoittumatta menetelmät, jotka hyödyntävät vasta-aineita, koettimia, alukkeita ja niin edelleen, esimerkiksi ELISPOT-määritys, tetrameerianalyysi, pentameerianalyysi, solunsisäinen sytokiinivärjäys, vasta-aineiden analyysi veressä ja veren tai kasvainten eri solutyyppien analyysi.

Syöpä

Keksinnön mukaiset rekombinantit Ad5/3-vektorit on rakennettu kykeneviksi replikoitumaan soluissa, joissa on puutteita Rb-reitissä, erityisesti Rb-p16-reitissä. Nämä puutteiset solut sisältävät kaikki kasvainsolut eläimissä ja ihmisissä (Sherr C.J. 1996, Science 274, 1672-1677). Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa vektori kykenee replikoitumaan selektiivisesti soluissa, joissa on puutteita Rb-reitissä. Tässä käytettynä “puutteita Rb-reiteissä” viittaa mutaatioihin ja/tai epigeneettisiin muutoksiin missä tahansa reitin geeneistä tai proteiineista. Näiden puutteiden johdosta kasvainsolut yli-ilmentävät E2F:ääja siten Rb:n sitominen E1A-CR2:n toimesta, mitä normaalisti tarvitaan tehokkaaseen replikaatioon tarvittavan E2F:n vapauttamiseksi, on tarpeeton.

Jotkut keksinnön mukaiset onkolyyttiset adenovirusvektorit on lisäksi rakennettu kykeneviksi replikoitumaan soluissa, jotka ilmentävät ihmisen te-lomeraasin käänteistranskriptaasia (hTERT), joka on ihmisen telomeraasin katalyyttinen aladomeeni. Näihin sisältyy yli 85 % ihmisen kasvaimista, joiden havaitaan lisäävän hTERT-geenin ja sen promoottorin ilmentymistä, kun taas useimmista aikuisten somaattisista soluista telomeraasi puuttuu tai sitä ilmentyy lyhytaikaisesti erittäin matalina entsyymipitoisuuksina. (Shay ja Bacchetti 1997, Eur J Cancer 33:787-791). Tällaiset Rb-p16-reittipuutteiset/hTERT-pro-mottori-yhdistelmät voivat kohdentua mihin tahansa syöpään tai kasvaimeen mukaan lukien sekä pahalaatuiset että hyvälaatuiset kasvaimet, samoin kuin geeniterapian kohteena voivat olla primaariset kasvaimet ja metastaasit. E2F-transkriptiotekijät säätelevät monimuotoisen geenijoukon ilmentymistä, jotka geenit ovat mukana kasvun kontrollointiin liittyvissä avaintapahtumissa soluissa (Johnson ja Schneider-Broussard 1998, Role of E2F in cell cycle Control and cancer, Front Biosci. 1998 huhtikuu 27;3:d447-8; Muller ja Helin 2000, The E2F transcription factors: key regulators of cell proliferation, Biochim Biophys Acta. 2000 Helmikuu 14;1470(1):M1-12).

Ei-jakautumisvaiheessa olevissa (non-cycling) normaalisoluissa E2F jää kiinni pRb/E2F-komplekseihin ja siten vähän vapaata E2F:ää on vapaasti saatavilla. pRb-reitti on katkaistu lähes kaikissa ihmisen syövissä johtaen vapaaseen E2F:ään useimmissa syövissä, mikä osoittaa sen merkitystä fysiologisen kasvun kontrolloinnissa. Reitti voidaan katkaista mutaatiolla missä tahansa monista eri molekyyleistä. Kuitenkin yleinen piirre on seurauksena oleva E2F-promottorin aktivaatio lisääntyneiden E2F-pitoisuuksien aikaansaamiseksi. E2F sitoo monien kohdegeenien promoottoria, mutta sen toiminnalle on tärkeä myös autoaktivaatio. Siksi soluissa, jotka eivät ole toimintakykyisiä p16/Rb:n suhteen, esiintyy korkeita E2F-pitoisuuksia, jotka monistuvat edelleen E2F:n sitoutumisen kautta promoottoriinsa (Hanahan ja VVeinberg 2000, Cell 7; 100(1 ):57—70; Johnson et ai. 2002, Cancer Cell 1(4):325-37).

Kuitenkin, jos adenoviruksen E1A:ta kontrolloidaan E2F-promootto-rilla (kuten esimerkiksi patenttijulkaisussa US 2008118470 A1), on olemassa riski itse-monistuvalle pahalle silmukalle, jollei samanaikaisesti käytetä E1A/Rb:tä poistavaa D24-deleetiota. Spesifisesti jopa normaalisoluissa läsnä olevat matalat pitoisuudet E2F:ää sitoutuisivat E2F-promoottoriin, mikä johtaa E1A:n ilmentymiseen, mikä johtaa E2F:n lisävapautumiseen pRb/E2F-kom-plekseista, mikä johtaa lisääntyneeseen E2F-promoottorin aktivaatioon ja siten suurempaan määrään E1A:ta. Siten ilman D24-deleetiota, joka katkaisee E1A:n sitoutumisen pRb:hen, E2F-promootti johtaa onkolyyttisiin adenoviruk-siin, jotka voivat replikoitua myös normaaleissa soluissa, millä saattaisi olla turvallisuusvaikutuksia.

Metyloitumaton kaksisäikeinen DNA voi stimuloida TLR9:ää, endo-somaalista reseptoria, joka yhdistää luontaisen ja hankitun immuunivasteen. CpG-rikkaiden alueiden lisääminen adenoviruksen runkoon lisää adenoviruksen kykyä stimuloida TLR9:ää antigeeniä esittelevissä soluissa siten lisäten T- solustimulaatiota ja kypsymistä samoin kuin NK-aktivaatiota (Nayak S, Herzog RW. Gene Ther. 2010 Mar; 17(3):295-304).

Keksinnön eräässä erityisessä sovellusmuodossa syöpä on mikä tahansa kiinteä kasvain. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa syöpä valitaan ryhmästä, johon kuuluvat nasofaryngeaalinen syöpä, synoviaa-linen syöpä, hepatosellulaarinen syöpä, munuaissyöpä, sidekudossyöpä, melanooma, keuhkosyöpä, suolistosyöpä, paksusuolen syöpä, peräsuolen syöpä, kolorektaalinen syöpä, aivosyöpä, kurkkusyöpä, suusyöpä, maksasyöpä, luu-syöpä, haimasyöpä, istukkasyöpä, gastrinooma, feokromosytooma, prolakti-nooma, T-soluleukemia/lymfooma, neurooma, von hippel-lindaun tauti, zollin-ger-ellisonin oireyhtymä, lisämunuaissyöpä, anaalinen syöpä, sappitien syöpä, virtsarakon syöpä, virtsajohtimen syöpä, oligodendrogliooma, neuroblastooma, meningiooma, selkäydinkasvain, osteokondrooma, kondrosarkooma, Evvingin sarkooma, tuntemattoman primäärisijainnin syöpä, karsinoidi, maha-suolikana-van karsinoidi, fibrosarkooma, rintasyöpä, Pagetin tauti, kohdunkaulan syöpä, ruokatorven syöpä, sappirakon syöpä, pään syöpä, silmäsyöpä, niskasyöpä, munuaissyöpä, VVilmsin kasvain, Kaposin sarkooma, eturauhassyöpä, kives-syöpä, Hodgkinin tauti, non-Hodgkinin lymfooma, ihosyöpä, mesoteliooma, multippeli myelooma, munasarjasyöpä, endokriininen haimasyöpä, gluka-gonooma, haimasyöpä, paratyroidinen syöpä, penissyöpä, aivolisäkesyöpä, pehmytkudossarkooma, retinoblastooma, ohutsuolisyöpä, mahalaukkusyöpä, kateenkorvasyöpä, kilpirauhassyöpä, trofoblastisyöpä, rypäleraskaus, kohtu-syöpä, endometriaalinen syöpä, emätinsyöpä, ulkosynnytinsyöpä, kuuloher-mokasvain, mucosis fungoides, insulinooma, karsinoidioireyhtymä, somatosta-tinooma, iensyöpä, sydänsyöpä, huulisyöpä, kalvosyöpä, suusyöpä, her-mosyöpä, suulakisyöpä, korvasylkirauhassyöpä, vatsakalvosyöpä, nielusyöpä, pleuraalinen syöpä, sylkirauhassyöpä, kielisyöpä ja risasyöpä.

Farmaseuttinen koostumus

Keksinnön mukainen farmaseuttinen koostumus käsittää ainakin yhtä keksinnön mukaista vektorityyppiä. Lisäksi koostumus voi käsittää ainakin kahta, kolmea tai neljää keksinnön mukaista eri vektoria. Keksinnön mukaisen vektorin lisäksi farmaseuttinen koostumus voi käsittää myös muita vektoreita kuten muita adenovirusvektoreita, kuten julkaisussa US2010166799 A1 kuvattuja vektoreita, muita terapeuttisesti tehokkaita aineita, muita aineita, kuten farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantajia, puskureita, apuaineita, adjuvantteja, antisepteja, täyte-, stabilointi- tai sakeutusaineita ja/tai mitä tahansa komponentteja, joita on normaalisti vastaavissa tuotteissa.

Farmaseuttinen koostumus voi olla muodoltaan millainen tahansa annettavaksi sopiva koostumus, esimerkiksi kiinteä, puolikiinteä, tai nestemäinen. Formulaatio voidaan valita ryhmästä, joka koostuu mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta liuoksista, emulsioista, suspensioista, tableteista, pelleteistä ja kapseleista.

Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus toimii in situ -syöpärokot-teena. Tässä yhteydessä "in situ -syöpärokote” tarkoittaa syöpärokotetta, joka sekä tappaa kasvainsoluja että lisää immuunivastetta kasvainsoluja vastaan. Virusreplikaatio on voimakas vaaranmerkki immuunijärjestelmälle (tarpeellinen TH1 -tyyppiselle sytotoksiselle T-soluvasteelle) ja toimii siten voimakkaana ko-stimulatorisena tekijänä APC:iden kypsymiselle ja aktivoinnille ja NK-solujen rekrytoinnille.

Kriittinen havainto kasvainimmunologian alalla on se, että kasvai-menvastaisen immuunivasteen induktio ei ole riittävä terapeuttiselle vaikutukselle. Sen sijaan on kriittistä myös vähentää kasvaimen välittämää immuuni-suppressiota. Kasvainsolujen hajoaminen auttaa myös esittelemään kasvain-fragmentteja ja -epitooppeja APC:ille ja inflammaatio tuottaa lisää kostimu-laatiota. Siten epitooppiriippumaton (eli-ei HLA-rajoitettu) vaste tuotetaan kunkin kasvaimen yhteydessä ja näin ollen tapahtuu in situ. Kasvainspesifinen immuunivaste aktivoituu kohdesolussa sallien tämän jälkeen kasvaimenvas-taisten vaikutusten tapahtumisen koko kohteen tasolla, esim. kaukaisissa etäpesäkkeissä.

Vektoreiden tehokas annos riippuu monista tekijästä, kuten esimerkiksi hoitoa tarvitsevasta kohteesta, kasvaimen tyypistä, kasvaimen sijainnista ja kasvaimen luokasta. Annos voi vaihdella esimerkiksi noin 108 viruspartikke-lista (VP:stä) noin 1014 VP:hen, edullisesti noin 5x109 VP:stä noin 1013 VP:hen ja edullisemmin noin 8x109 VP:stä noin 1012VP:hen. Keksinnön eräässä erityisessä sovellusmuodossa annos on noin 5x101°-5x1011 VP.

Farmaseuttisia koostumuksia voidaan tuottaa millä tahansa alalla tunnetulla tavanomaisella menetelmällä, esimerkiksi hyödyntämällä jotakin seuraavista: erä-, panossyöttö- ja perfuusiokasvatusmoodit, pylväskromato-gradiapuhdistus, CsCI-gradienttipuhdistus ja perfuusiomoodit leikkaustehol-taan alhaisissa soluretentiolaitteissa.

Anto

Keksinnön mukainen vektori tai farmaseuttinen koostumus voidaan antaa mille tahansa eukaryoottiselle kohteelle, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu kasveista, elämistä ja ihmisistä. Keksinnön eräässä edullisessa sovel-lusmuodossa kohde on ihminen tai eläin. Eläin voidaan valita ryhmästä, joka koostuu lemmikkieläimistä, kotieläimistä ja tuotantoeläimistä.

Vektorin tai koostumuksen antamisessa kohteeseen voidaan käyttää mitä tahansa tavanomaista menetelmää. Antoreitti riippuu koostumuksen formulaatiosta tai muodosta, taudista, kasvainten sijainnista, potilaasta, liitännäissairauksista ja muista tekijöistä. Keksinnön eräässä edullisessa sovellus-muodossa anto suoritetaan kasvaimensisäisellä, lihaksensisäisellä, valtimonsisäisellä, laskimonsisäisellä, keuhkopussinsisäisellä, rakkulansisäisellä, onte-lonsisäisellä tai peritoneaalisella injektiolla tai suun kautta.

Jo yhdellä keksinnön mukaisen onkolyyttisen adenovirusvektorin antamisella voidaan saada hoitovaikutuksia. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa onkolyyttisiä adenovirusvektoreita tai farmaseuttisia koostumuksia annetaan kuitenkin useita kertoja hoitojakson aikana. Onkolyyttisiä adenovirusvektoreita tai farmaseuttisia koostumuksia voidaan antaa esimerkiksi 1-10 kertaa kahden ensimmäisen viikon aikana, neljän viikon ensimmäisen aikana, kuukausittain tai hoitojakson aikana. Keksinnön eräässä sovellus-muodossa niitä annetaan 3-7 kertaa kahden ensimmäisen viikon aikana, sitten neljännellä viikolla ja sitten kuukausittain. Keksinnön eräässä erityisessä sovellusmuodossa niitä annetaan neljä kertaa kahden ensimmäisen viikon aikana, sitten neljännellä viikolla ja sitten kuukausittain. Hoitojakson pituus voi vaihdella ja kestää esimerkiksi 2-12 kuukautta tai pidempään.

Lisäksi keksinnön mukaisten onkolyyttisten adenovirusvektoreiden anto voidaan edullisesti yhdistää muiden onkolyyttisten adenoviruvektoreiden, kuten julkaisussa US201066799 A1 kuvattujen vektoreiden, antoon. Anto voi olla samanaikaista tai peräkkäistä.

Jotta vältetään neutraloivat vasta-aineet kohteessa, keksinnön mukaiset vektorit voivat vaihdella hoitojen välillä. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa kohteelle annetaan onkolyyttisiä adenovirusvektoria, jossa on erilainen kapsidin säieuloke verrattuna aikaisemman hoidon vektoriin nähden. Tässä yhteydessä "kapsidin säieuloke” tarkoittaa säieproteiinin ulokeosaa (kuvio 1a). Vaihtoehtoisesti viruksen koko kapsidi voidaan vaihtaa eri serotyy-pin kapsidiksi.

Keksinnön mukainen geenihoito on tehokas yksinäänkin, mutta ade-novirusgeenihoidon yhdistäminen jonkin toisen hoidon, esimerkiksi perinteisen hoidon, kanssa voi olla tehokkaampi kuin kumpikaan yksin. Esimerkiksi yhdistelmähoidon jokainen aine voi toimia itsenäisesti kasvainkudoksessa, adenovi-rusvektorit voivat herkistää soluja kemoterapialle tai sädehoidolle ja/tai kemo-terapia-aineet voivat voimistaa virusreplikaation tasoa tai vaikuttaa kohdesolu-jen reseptoristatukseen. Vaihtoehtoisesti yhdistelmä voi modifioida kohteen immuunijärjestelmää siten, että se on edullista hoidon tehokkuudelle. Esimerkiksi kemoterapiaa voitaisiin käyttää suppressoivien solujen, kuten regulatoris-ten T-solujen, vähentämiseen. Vaihtoehtoisesti kemoterapiaa voidaan käyttää onkolyyttisellä viruksella hoidon jälkeen immunologisen vasteen tehostamiseksi tappamalla kasvainsoluja ja siitä seurauksena olevalla epitooppien ja/tai virusten vapauttamisella. Kemoterapia voi myös herkistää kasvainsoluja onko-lyyttisille viruksille ja päinvastoin. Yhdistelmähoidon aineet voidaan antaa samanaikaisesti tai peräkkäin. Edullisessa tämän keksinnön suoritusmuodossa potilaat saavat samanaikaisesti syklofosfamidia hoidon immunologisen vaikutuksen tehostamiseksi.

Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi rinnakkaisen sädehoidon antamisen kohteelle. Keksinnön eräässä toisessa edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi rinnakkaisen kemoterapian antamisen kohteelle. Vielä eräässä edullisessa sovellutusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi muiden onkolyyttisten adenovirus- tai vacciniavirusvektoreiden annon kohteelle. Vektorit voidaan antaa samanaikaisesti tai peräkkäin. Tässä yhteydessä "rinnakkainen” tarkoittaa hoitoa, joka on annettu ennen, jälkeen tai samanaikaisesti keksinnön mukaisen geenihoidon kanssa. Rinnakkaishoidon jakso voi vaihdella minuuteista useisiin viikkoihin. Edullisesti rinnakkaishoito kestää joitakin tunteja. Eräässä sovellutusmuodossa syklofos-famidi annetaan sekä suonensisäisenä boluksena että metronomisella tavalla.

Yhdistelmähoitoon sopivia aineita ovat mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta all-trans-retinoidihappo, atsasitidiini, atsatiopriini, bleomysiini, karbo-platiini, kapesitabiini, sisplatiini, klorambusiili, syklofosfamidi, sytarabiini, dau-norubisiini, dosetakseli, doksifluridiini, doksorubisiini, epirubisiini, epotiloni, eto-posidi, fluorourasiili, gemsitabiini, hydroksiurea, idarubisiini, imatinibi, meklore-tamiini, merkaptopuriini, metotreksaatti, mitoksantroni, oksaliplatiini, paklitakse- li, pemetreksedi, temotsolomidi, teniposidi, tioguaniini, valrubisiini, vinblastiini, vinkristiini, vindesiini ja vinorelbiini.

Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi verapamiilin tai jonkin muun kalsiumkanavan salpaajan antamisen kohteelle. "Kalsiumkanavan salpaaja” tarkoittaa luokkaa lääkkeitä ja luonnonaineita, jotka häiritsevät kalsiumkanavien johtumista, ja se voidaan valita ryhmästä, joka koostuu verapamiilista, dihydropyridiineistä, gallopamiilista, diltiatseemista, mibefradiilista, bepridiilista, fluspirileenista ja fendiliinista.

Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi autofagiaa indusoivat aineiden antamisen kohteelle. Au-tofagia tarkoittaa katabolista prosessia, jossa solun omat komponentit hajoavat lysosomaalisen koneiston kautta. "Autofagiaa indusoivat aineet” tarkoittavat aineita, jotka kykenevät indusoimaan autofagian ja jotka voidaan valita ryhmästä, joka koostuu mainittuihin kuitenkaan rajoittamatta mTOR-inhibiittoreista, PI3K-inhibiittoreista, litiumista, tamoksifeenista, klorokiinista, bafilomysiinista, temsirolimuksesta, sirolimuksesta ja temotsolomidistä. Keksinnön eräässä erityisessä sovellusmuodossa menetelmä käsittää lisäksi temotsolom idin antamisen kohteelle. Temotsolomidi voi olla joko oraalista tai laskimonsisäistä temotsolom idia. Autofagiaa indusoivia aineita voidaan yhdistää immunomoduloivien aineiden kanssa. Eräässä suoritusmuodossa onkolyyttinen adenovirus, joka koodaa anti-CTLA4-mAb:ta, yhdistetään sekä temotsolomidiin että syklofosfa-midiin.

Keksinnön eräässä sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi kemoterapian tai anti-CD20-hoidon tai muun neutraloivia vasta-aineita estävän hoidon antamisen. ”Anti-CD20-hoito” tarkoittaa aineita, jotka kykenevät tappamaan CD20-positiviisia soluja ja jotka voidaan valita ryhmästä, joka koostuu rituksimabista ja muista monoklonaalisista anti-CD20-vasta-aineista. "Neutraloivia vasta-aineita estävä hoito” tarkoittaa aineita, jotka kykenevät estämään normaalisti infektion seurauksena muodostuvien antiviraalisten vasta-aineiden kehittymisen ja jotka voidaan valita ryhmästä, joka koostuu eri kemo-terapia-aineista, immunomodulatorisista aineista, kortikoideista ja muista lääkkeistä. Nämä aineet voidaan valita ryhmästä, joka koostuu mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta syklofosfamidistä, syklosporiinistä, atsatiopriinista, metyyli-prenisolonista, etoposidista, CD40L:stä, CTLA4lg4:stä, FK506:sta (takrolis-muksesta), IL-12:sta, IFN-gammasta, interleukiini 10:stä, anti-CD8:sta, anti-CD4-vasta-aineista, myeloablaatiosta ja oraalisista adenovirusproteiineista. Tässä hakemuksessa kuvattu lähestymistapa voidaan yhdistää myös molekyyleihin, jotka kykenevät voittamaan neutraloivat vasta-aineet. Sellaisia aineita ovat liposomit, lipopleksit ja polyetyleeniglykoli, jotka voidaan sekoittaa viruksen kanssa. Vaihtoehtoisesti neutraloivat vasta-aineet voidaan poistaa immunofereesikolonnilla, joka koostuu adenoviruksen kapsidiproteii-neista.

Keksinnön mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori käynnistää kasvainsolujen virionivälitteisen onkolyysin ja aktivoi ihmisen immuunivasteen kasvainsoluja vastaan. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi sellaisten aineiden annon, jotka kykenevät vähentämään regulatorisia T-soluja kohteessa. "Regulatoristen T-solujen vähentämiseen kykenevät aineet” tarkoittavat aineita, jotka pienentävät suppres-sori-T-soluiksi tai regulatorisiksi T-soluiksi tunnistettujen solujen määrää. Näiden solujen on tunnistettu sisältävän yhtä tai useaa seuraavista immunofeno-tyyppimerkeistä: CD4+, CD25+, FoxP3+, CD127-ja GITR+. Tällaiset suppres-sori-T-solujen tai regulatoristen T-solujen määrää pienentävät aineet voidaan valita ryhmästä, joka koostuu anti-CD25-vasta-aineista tai kemoterapia-ai-neista. Nämä aineet voivat olla käyttökelpoisia regulatoristen T-solujen lukumäärän vähentämiseksi, joiden aktiivisuuden suppressoinnissa aCTLA4 on pääasiassa tehokas.

Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi syklofosfamidin antamisen kohteelle. Syklofosfamidi on yleinen kemoterapia-aine, jota on myös käytetty joissakin autoimmuunitaudeissa. Esillä olevassa keksinnössä syklofosfamidia voidaan käyttää voimistamaan virusreplikaatiota ja aCTLA4:n käynnistämän NK-solujen ja sytotoksisten T-solujen stimulaation vaikutuksia parannetun immuunivasteen saamiseksi kasvainta vastaan. Sitä voidaan käyttää laskimonsisäisinä bolusannoksina tai antaa suun kautta pieninä annoksina metronomisesti tai näiden yhdistelmänä.

Esillä olevassa keksinnössä sen varmistamiseksi, ettei CTLA-4:ää estävä mAb tapa aktivoituja sytotoksisia T-soluja, jotka voivat olla hyödyllistä hoidon kannalta, valittiin ihmisen lgG2-alatyyppi. lgG2 saa aikaan minimaalisen komplementin aktivaation ja Ab-riippuvaisen soluvälitteisen sytotoksisuu-den (Bruggemann M. et ai. J Exp Med 1987;166:1351-1361) ja myös vähentää sytokiinisyndrooman mahdollisuutta ihmiskäytön yhteydessä (Ribas A. et ai., Oncologist 2007;12:873-83).

Mikä tahansa keksinnön menetelmä tai käyttö voi olla joko in vivo, ex vixo tai in vitro -menetelmä tai käyttö.

Esillä olevassa keksinnössä onkolyyttinen adenovirus on aseistettu täysin ihmisperäisellä, CTLA-4:lle spesifisellä monoklonaalisella vasta-aineella. Tässä lähestymistavassa kasvainsolut kuolevat viruksen replikaation johdosta ja anti-CTLA4-mAb:n kasvaimenvastaisen immuuniaktivaation ja suora pro-apoptoottisen kasvainsolutapon johdosta. Lisäetua voi syntyä kasvainantigee-nin vapautumisesta viruksen replikaation johdosta, mikä voi parantaa anti-CTLA-4-mAb-hoitoa potentiaalisesti sallimalla spesifisemmän immuunivasteen kasvainkohteita vastaan (Hodi FS et ai., N Engl J Med 2010; 363;8:711—23; Mokyr MB et ai., Cancer Res 1998;58:5301-4; VVoIchok JD ja Saenger Y., On-cologist 2008; 13 Suppl 4:2-9 ). Myöskään hoitojen sivuvaikutukset eivät ole päällekkäisiä, mikä saattaisi mahdollistaa lisääntyneen tehokkuuden toksisuutta lisäämättä. Osoitetaan, että onkolyyttiset adenovirukset voivat tehokkaasti ilmentää toimivaa anti-CTLA4-mAb:tta siirtogeeninä syöpäsolulinjoissa (kuvio 2). Havaittiin myös, että on mahdollista yhdistää onkolyyttisen adenoviruksen replikaatio anti-CTLA4-mAb:n kanssa ja saada lisääntynyt solutappo (kuviot 3-4). Tämä on aiheuttanut huolta, koska CTLA-4:n esto mAb:iella johtaa lisääntyneeseen IFN-y:n ja kudosten yhteensopivuuskompleksin (MHC) luokan I molekyylien tuotantoon, joka potentiaalisesti voi inhiboida viruksen replikaatiota (McCart JA et ai., Gene Ther 2000;7:1217-23; Nakamura H et ai., Cancer Res 2001;61:5447-52). Virusonkolyysi yhdessä anti-CTLA4-mAb:n ilmentymisen kanssa johti korkeampaan kasvaimenvastaiseen aktiivisuuteen in vivo kuin kumpikaan hoito yksin (kuvio 4). On olemassa aikaisempia raportteja syöpäpotilaiden hoidosta onkolyyttisillä viruksilla, jotka ilmentävät granulosyytti-makro-fagikasvutekijää (GMCSF) yhdessä matala-annoksisen metronomisen syklo-fosfamidin kanssa T-Reg:ien vähentämiseksi (Cerullo V et ai., Cancer Res;70:4297-309; Koski A et ai., Mol Ther. 2010 Jul 27. [Epub ahead of print], PMID: 20664527). Lisäksi hiiren anti-CTLA-4:n soluvälitteinen anto GM-CSF:a erittävästä kasvainsoluimmunoterapiasta aktivoi voimakkaita kasvaimenvastai-sia vasteita ja pidensi kokonaiseloonjäämistä, jolloin esiintyi myös vähemmän todisteita systeemisestä autoimmuunisuudesta (Simmons AD et ai., Cancer Immunol Immunother 2008;57:1263-70). Siksi lähestymistavan tehokkuutta voidaan edelleen parantaa multimodaalisessa lähestymistavassa, jossa käytetään tavanomaisia syöpähoitoja, esim. säteilytys+kemoterapia, rokotteet, esim. GM-CSF tai/ja T-Reg:ien vähentämien esim. syklofosfamidilla. Tämä on ensimmäinen kerta, kun on osoitettu, että täyspitkää mAb:a voidaan tuottaa onkolyyttisestä adenoviruksesta. Lisäksi se on ensimmäinen täysin ihmisen anti-CTLA4-mAb, jota ilmennetään kasvaimeen kohdistuvalla replikoitumiskykyisellä mallilla. Suoritetussa hiirikokeessa ei nähty mitään sivuvaikutuksia. Tulokset syöpäpotilaiden PBMC:illä antavat perustelut sille, että Ad5/3-A24aCTLA4 kääntyy kliinisesti onkolyyttiseksi virusvektoriksi pitkälle edennyttä syöpää sairastavien potilaiden hoitamiseksi. Koska p16-Rb-reitti on puutteellinen monissa, jollei kaikissa, kiinteissä kasvaimissa (Sherr CJ., Science 1996;274:1672-724), Ad5/3-A24aCTLA4 ja muut keksinnön mukaiset A24-puutteiset adenovirukset sopivat useimpien käytettävissä oleviin hoitoihin reagoimattomien syöpätyyppien hoitoon. Ne keksinnön suoritusmuodot, jotka käsittävät Δ24:η lisäksi myös hTERT- tai E2F-promoottorit, laajentavat esillä olevan keksinnön käytettävyyttä käytännössä kaikkiin syöpiin. Lisäksi promoottorin lisääminen voi sallia suuremmat hoitoannokset, vähäisemmät sivuvaikutukset ja tehostetun systeemisen käytön. Mikä tärkeää CpG-ryhmien lisääminen viruksen genomiin voi lisätä kasvaimenvastaista immuunivastetta.

Seuraavat esimerkiksi havainnollistavat esillä olevaa keksintöä, mutta niitä ei ole tarkoitettu mitenkään rajoittaviksi.

Esimerkit

Eläimet

Helsingin yliopiston koe-eläintoimikunta ja Etelä-Suomen lääninhallitus tarkasti ja hyväksyi kaikki eläinprotokollat. C57Black-hiiret ja NMRI-kar-vattomat hiiret saatiin yhtiöstä Taconic (Ejby, Tanska) 4-5-viikon ikäisinä ja niitä pidettiin karanteenissa vähintään yhden viikon ajan ennen tutkimusta. Hiirten terveydentilaa monitoroitiin usein, ja niin pian kuin ilmeni minkäänlainen merkki kivusta tai tuskasta, ne tapettiin.

Soluviljely

Ihmisen pään ja kaulan alueen okasolukarsinoman (HNSCC) alhaisen kasvatuksen kasvainsoluviljelmää UT-SCC8 (ääniraon yläpuolinen kur-kunpää) (27) kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen alustassa (DMEM), jota oli täydennetty 10 %:lla FCS:ää (PromoCell GmbH, Heidelberg, Saksa), 1 %:lla ei-välttämättömiä aminohappoja (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia) 2 mmol/l glutamiinilla, 100 yksikköllä/ml penisilliiniä ja 100 yksiköllä/ml strepto mysiiniä (kaikki Sigmalta, St. Louis, MO). UT-SCC-soluja käytettiin alhaisessa kasvatuksessa, tyypillisesti 15-30 kasvatuksessa.

Ihmisen transformoitu alkion munuaissolulinja 293, ihmisen keuh-kosyöpäsolulinja A549, ihmisen munasarjasolulinja SKOV3-ip1 ja ihmisen etu-rauhassyöpäsolulinja PC-3MM2 sekä Jurkat- (klooni E6-1) ihmisen leukeemi-set T-solulymfoblastisolut saatiin ATCC:stä (American Type Culture Collecti-on, Manassas, VA, USA). Kaikkia soluja ylläpidettiin suositelluissa olosuhteissa.

Ihmisnäytteet

Terveiden yksilöiden ja potilaiden, joilla oli tavanomaisiin hoitoihin vastaamattomia, pitkälle edenneitä metastaattisia kasvaimia, perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC) saatiin kirjallinen suostumuksella.

Statistinen analyysi

Kaksisuuntaista Studentin t-testiä käytettiin ja p-arvoa <0,05 pidettiin merkitsevänä.

Esimerkki 1. Adenovirusten muodostaminen

Kimeeriset adenovirukset, jotka kantavat cDNA-sekvenssiä, joka koodaa lgG2-tyyppistä anti-CTLA4-mAb:tta, muodostettiin (kuvio 1). Anti-CTLA4-mAb:n koodaava sekvenssi vietiin adenoviruksen E3A:n 6.7K/gp19K-deleetioon replikoitumiskykyisten adenovirusten Ad5/3-A24aCTLA4 (SEQ ID. NO:1), Ad5/3-hTERT-A24aCTLA4 (SEQ ID. NO:2), Ad5/3-hTERT- A24aCTLA4-CpG (SEQ ID. NO:3), Ad5/3-E2F-A24aCTLA4 (SEQ ID. NO:4) ja Ad5/3-E2F-A24aCTLA4-CpG (SEQ ID. NO:5) muodostamiseksi tai CMV-promoottorin ohjaamaan deletoituun E1:een replikoitumiskyvyttömän adenoviruksen Ad5/3-aCTLA4 (SEQ ID. NO:6) muodostamiseksi.

Onkolyyttiset adenovirukset muodostettiin ja monistettiin käyttäen standardeja adenoviruksen valmistusmenetelmiä (Kanerva A, et ai., Mol Ther 2002;5:695-704; Bauerschmitz GJ, et ai., Mol Ther 2006;14:164-74; Kanerva A ja Hemminki A, Int J Cancer 2004;110:475-80; Volk AL, et ai., Cancer Biol Ther 2003;2:511-5). Lyhyesti kuvattuna joko E1- tai E3-sukkulavektori, jossa oli siirtogeeni ja muut ryhmät (promoottorit, CpG, poly-A) muodostettiin ensin ja yhdistettiin resque-plasmidiin bakteerisoluissa, joissa oli ihmisen rekombinaa-seja. Virusten tärkeimmät ominaisuudet mukaan lukien kontrollivirusten Ad5Luc1 (Kanerva A et ai., Clin Cancer Res 2002;8:275-80) ja Ad5/3-A24 (Kanerva A et ai., Mol Ther 2003;8:449-58) tärkeimmät ominaisuudet kuvataan kuviossa 1.

Ad5/3-Ä24aCTLA4:n muodostamiseksi muodostettiin plasmidi pTHSN-aCTLA4. pTHSN-aCTLA4 sisältää lgG2-tyypin anti-CTLA4-mAb:n raskaat ja kevyet ketjut adenoviruksen genomista, josta on poistettu 6.7K/gp19K, E3-alueella. Ekvimolaarisuus raskaiden ja kevyiden ketjujen välillä saavutetaan sisäisen ribosomin sisääntulopaikan (IRES) avulla ketjujen välillä. pAdEasy-1,5/3-A24-aCTLA4 muodostettiin homologisella rekombinaatiolla Escherichia coli BJ5183 -soluissa (Qbiogene Inc., Irvine, CA, USA) FspUlä linearisoidun pTHSN-aCTLA4 ja S/fl:lla linearisoidun pAdEasy-1.5/3-A24:n välillä (Kanerva A et ai., Clin Cancer Res 2002;8:275-80), resque-plasmidi, joka sisältää sero-tyypin 3 ulokkeen ja 24 emäsparin deleetion E1A:ssa. Ad5/3-A24aCTLA4:n genomi vapautettiin Pacl-digestiolla ja sitä seuraavalla transfektiolla A549-soluihin. Virusta lisättiin A549-soluilla ja puhdistettiin cesiumkloridigradienteilla. Viruspartikkelipitoisuus määritettiin aallonpituudella 260 nm, ja standardi TCID50 (median tissue culture infective dose) -määritys 293-soluilla suoritettiin infektoivien partikkelien tiitterin määrittämiseksi.

Ad5/3-hTERT-A24aCTLA4:n, Ad5/3-hTERT-A24aCTLA4-CpG:n, Ad5/3-E2F-A24aCTLA4:n ja Ad5/3-E2F-A24aCTLA4-CpG:n muodostamiseksi anti-CTLA-monistustuote jatkokloonattiin ensin pTFISN:ään tai pTHSN-CpG:hen ja rekombinoitiin sen jälkeen pAd5/3-hTERT-E1A:n tai pAd5/3-E2F-E1A:n kanssa (Bauerschmitz GJ, et ai., Cancer Res 2008;68:5533-9. Hakkarainen T, et ai. Clin Cancer Res. 2009; 15(17):5396-403.) Saatu plasmidi li-nearisoitiin PacMIä ja transfektoitiin A549-soluihin monistusta ja kiinniottoa. Viruksia lisättiin A549-soluissa ja puhdistettiin cesiumkloridigradienteilla. Viruspartikkelipitoisuus määritettiin aallonpituudella 260 nm, ja standardi TCID50 (median tissue culture infective dose) -määritys 293-soluilla suoritettiin infektoivien partikkelien tiitterin määrittämiseksi.

Kaikki kloonausvaiheet varmistettiin PCR:Mä ja useilla restriktiodi-gestioilla. pTHSN-aCTLA4-sukkulaplasmidi sekvensoitiin. Villityypin E1 poissaolo varmistettiin PCR:llä. E1-alue, siirtogeeni ja säie tarkistettiin lopullisesta viruksesta sekvensoimalla ja PCR:llä. Virustuotannon, mukaan lukien transfek-tio, kaikki vaiheet tehtiin A549-soluilla villityypin rekombinaation riskin välttämiseksi, kuten aikaisemmin on kuvattu (Kanerva A. et ai. 2003, Mol Ther 8, 449-58; Baeurschmitz G. J. et ai. 2006, Mol Ther 14, 164-74). aCTLA4 on E3-promoottorin alainen (erityisesti endogeenisten viruksen E3A-geeniekspres- sion kontrollielementtien alainen), mikä johtaa replikaatioon assosioituvaan siirtogeenien ilmentymiseen, joka alkaa noin 8 h infektion jälkeen. E3 on koskematon lukuun ottamatta 6.7K/gp19K\n deleetiota.

Ei-replikoituvan E1-puutteisen kontrolliviruksen Ad5/3-aCTLA4 muodostamiseksi anti-CTLA4-mAb-cDNA:n molemmat ketjut ligatoitiin pShuttle-CMV:hen. Homologinen rekombinaatio suoritettiin pAdEasy-1.5/3-plasmidin (Krasnykh VN, et ai., J Virol 1996;70:6839-46), joka kantaa kokonaista adeno-viruksen genomia, ja Pmel:Mä linearisoidun pShuttle-CMV-aCTLA4:n välillä pAdEasy-1.5/3-aCTLA4:n muodostamiseksi. Ad5/3-aCTLA4:n genomi vapautettiin Pacl:llä ja transfektoitiin 29. Virusta lisättiin A549-soluissa ja puhdistettiin cesiumkloridigradienteilla. Viruspartikkelipitoisuus määritettiin aallonpituudella 260 nm, ja plakkimääritys 293-soluilla suoritettiin infektoivien partikkelien määrittämiseksi.

Esimerkki 2. Muodostettujen adenovirusten ilmentäminen ja funktionaalisuus in vitro

Western blot -analyysiä käytettiin sen varmistamiseksi, että muodostetut adenovirukset ilmentävät anti-CTLA4-mAb:tta. A549- tai PC3-MM2-kasvainsolut infektoitiin muodostetulla Ad5/3-A24aCTLA4:lla tai Ad5/3-aCTLA4:lla pitoisuudella 10 viruspartikkelia (VP) solua kohti. 48 tunnin kuluttua viruksella infektoitujen solujen supernatantit suodatetiin 0,02 pm:n suodattimil-la (Anotop, Whatman, Englanti), 15 pl ajettiin 7,5-%:isessa SDS-polyakryyli-amidigeelielektroforeesi (PAGE) -geelissä pelkistävissä tai natiiveissa olosuhteissa ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Kalvoa inkuboitiin vuohen anti-ihmis-lgG:n (raskaat ja kevyet ketjut) (AbD serotec, MorphoSys, Saksa), pestiin ja inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen kanssa, johon oli kytketty piparjuuripe-roksidaasi, (Dako, Tanska). Signaalin toteaminen tehtiin vahvistetulla kemilu-minesenssillä (GE Healthcare, Amersham, UK).

Western blot -analyysissä Ad5/3-A24aCTLA4 ja Ad5/3-aCTLA4 ilmensivät odotettuja noin 150 kDa:n anti-CTLA4-mAb:tta natiiveissa olosuhteissa ja noin 50 kDa:n raskaita ketjuja ja noin 25 kDa:n kevyitä ketjuja denaturoivissa olosuhteissa (kuvio 2A) supernatanteissa 48 tuntia infektion jälkeen.

Onkolyyttisen viruksen Ad5/3-A24aCTLA4 tai replikoitumiskyvyttö-män Ad5/3-aCTLA4:n ilmentämän Anti-CTLA4-mAb:n vertaamiseksi PC3-MM2-soluja laitettiin pitoisuutena 20 000 solua kuoppaa kohti ja infektoitiin pitoisuudella 10 VP solua kohti vastaavilla viruksilla. 24 h, 48 h ja 72 h infektion jälkeen supernatantit otettiin talteen ja analysoitiin ELISAJIa ihmisen lgG:n määrän suhteen (kuvioi 0).

Sen varmistamiseksi, että Ad5/3-Ä24aCTLA4 ja Ad5/3-aCTLA4 ilmentävät funktionaalista anti-CTLA4-mAb:ia, stimuloitujen Jurkat-solujen lisääntynyt IL-2-tuotanto tutkittiin, kuten aikaisemmin on kuvattu (Lee KM et ai., Science 1998;282:2263-68).

Jurkat-solut (klooni 6.1) stimuloitiin 0,3 pg/ml:Ma ionomysiiniä (Sig-ma-AIdrich Co.), 0,03 pg/ml:Ma forbolimyristyyliasetaattia (PMA) (Sigma-AIdrich Co.) ja 1 pg/ml:lla rekombinattia ihmisen B7-Fc-kimeeriä (R&D systems) ja käsiteltiin viruksella infektoitujen PC3-MM2-solujen supernatanteilla, jotka oli suodatettu 0,02 pm:n suodattimena (Anotop, VVhatman, Englanti). Neljäkymmen-täkahdeksantuntia Jurkat-solujen stimulation jälkeen interleukiini-2 (IL-2) -pitoisuudet kasvualustoissa analysoitiin BD Cytometric Bead Array Human Solu-ble Protein Flex Set -pakkauksella (Becton Dickinson) valmistajan ohjeiden mukaan. Käytettiin kymmentä viruspartikkelia (VP) solua kohti ja 48 tuntia myöhemmin supernatantit otettiin talteen. Hiiren anti-ihmis-CTLA-4 (=CD152) -mAb:ia (BD Pharmingen™, Eurooppa) käytettiin positiivisena kontrollina. FCAP Array v.1.0.2 (Soft Flow) -ohjelmistoa käytettiin analysointiin. Kuviossa 7 esitetään kaaviot funktionaalisuusmäärityksistä.

Anti-CTLA4-mAb sitoo solun pinnan CTLA-4:ää estäen immunosup-pressiivisen interaktion rekombinantin B7:n (rB7) kanssa. Tämä analyysi osoittaa, että mAb:n anti-CTLA4-aktiivisuutta löydettiin Ad5/3-A24aCTLA4:llä ja Ad5/3-aCTLA4:llä infektoitujen solujen supernatanteista verrattuna vastaaviin isogeenisiin kontrolleihin, Ad5/3-A24- ja Ad5/3Luc1-infektoituihin soluihin (kuvio 2B). Rekombinanttia anti-CTLA4-mAb:ta käytettiin positiivisena kontrollina ja se oli potentimpi kuin Jurkat-soluista kerätty supernatantti.

Jotta voitiin vielä varmistaa, että viruksen ilmentämä anti-CTLA4-mAb kykenee estämään signaloinnin CTLA-4:n kautta, suoritettiin loss-of-func-tion -määritys. Jurkat-solut aktivoitiin kuten edellä mutta 0,1 pg/ml rekombinanttia ihmisen CTLA-4/Fc-kimeeraa (R&D Systems) (rCTLA-4) lisättiin iono-mysiiniin, PMA:han ja rekombinanttiin B7:ään. rCTLA-4 sitoutuu anti-CTLA4-mAb:een kasvualustassa vapauttaen solun pinnalla olevaa CTLA-4:ää olemaan vuorovaikutuksessa rB7:n kanssa ja torjumaan T-solujen aktivaation, joka nähdään vähenemisenä IL-2:n tuotannossa. Anti-CTLA4-mAb-funktion menetys havaittiin supernatantilla soluista, jotka oli infektoitu Ad5/3-A24aCTLA4:lla ja Ad5/3-aCTLA4:lla verrattuna vastaaviin isogeenisiin, aseis tamattomiin kontrolleihin Ad5/3-A24 tai Ad5/3Luc1 (kuvio 2C). Lisäksi korkein toiminnon menetys havaittiin supernatantilla Ad5/3-Ä24aCTLA4:n infektoimista kasvainsoluista, jopa korkeampi kuin positiivinen kontrolli. Yhdessä tarkasteltuna nämä tulokset osoittavat, että syöpäsolujen infektointi Ad5/3-A24aCTLA4:lla johtaa funktionaalisen, ihmisen CTLA-4-vastaisen, täysin ihmisen mAb:n korkeaan ilmentymiseen, mikä johtaa T-soluaktiivisuuden vähenemiseen mitattuna IL-2:n avulla.

Esimerkki 3. Kasvainsolulinjojen ja alhaisen kasvun kasvaineksplanttien CTLA-4:n ilmentäminen

Koska on raportoitu, että melkein 90 % kasvainsolulinjoista ilmentää CTLA-4:ää ja että anti-CTLA-4-mAb:lla voisi olla suoraa kasvaimenvastaista aktiivisuutta (13), tutkittiin, olisiko tämä totta myös kasvainsolulinjoissa mukaan lukien käytetyt alhaisen kasvun HNSCC-kasvaineksplantit.

Epäsuora immunofluoresenssi suoritettiin alhaisen kasvun UT-SCC8-kasvainsoluviljelmässä tai kasvainsolulinjoissa A549, SKOV3-ip1 ja PC3-MM2 pinnalla olevan CTLA-4:n analysoimiseksi. Lyhyesti kuvattuna solu-pellettiä inkuboitiin 30 min 4 °C:ssa hiiren anti-ihmisen CTLA-4-mAb:n kanssa (BD Pharmingen™, Eurooppa) primäärisenä vasta-aineena, mitä seurasi vielä 30 m in: n inkubointi 4 °C:ssa Alexa Fluor® 488 -aasin anti-hiiren lgG:n kanssa (Invitrogen) sekundaarisena vasta-aineena. Fluoresenssin intensiteetti mitattiin LSR-virtaussytometrillä (BD Pharmingen™, Eurooppa). Vähintään 40 000 so-lua/näyte laskettiin. Clontech Discovery Labvvare -immunosytometriajärjes-telmiä (BD Pharmingen™, Eurooppa) ja FlovvJo 7.6.1-ohjelmistoa käytettiin analysointiin. A549-, SKOV3-ip1- ja PC3-MM2-kasvainsolulinjat ilmensivät 99,5 %, 96,6 % ja vastaavasti 96,6 % CTLA-4:ää, kun taas alhaisen kasvun kasvaimen UT-SCC8-eksplantit ilmensivät 90,3 % CTLA-4:ää (kuvio 2D).

Esimerkki 4. Muodostettujen adenovirusten onkolyyttisen tehon määritys in vitro ja in vivo

Ad5/3-A24aCTLA4:n onkolyyttinen teho (eli solutappo) eri kasvainsolu-linjoihin ja HNSCC:n alhaisen kasvun kasvainsoluviljelmään arvioitiin. HNSCC:n aAlhaisen kasvun kasvainasoluviljelmä tai kasvainsolulin-jat PC3-MM2, SKOV3-ip1 tai A549 laitettiin pitoisuutena 1,5*104 tai 1,0*104 solua/kuoppa 96-kuoppaisille levyille. Seuraavana päivänä virukset laimennettiin DMEM:ään, jossa oli 2 % FCS:ää, eri pitoisuuksina (1, 10, 100, 1000 VP/- solu), soluja infektoitiin yksi tunti 37 °C:ssa, pestiin ja inkuboitiin DMEM:ssä, jossa oli 5 % FCS:ää. Solujen elinkyky määritettiin valmistajan protokollan mukaisesti (Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Prome-ga). Tulokset esitetään kuviossa 3.

Ad5/3-A24aCTLA4:n onkolyyttinen teho oli samanlainen kuin positiivisen kontrolliviruksen Ad5/3-A24 kaikissa solulinjoissa. Myös replikoitumisky-vyttömällä Ad5/3-aCTLA4:lla oli kasvaimenvastaista aktiivisuutta, koska kas-vainsolut ilmentävät CTLA4:ää.

Ad5/3-A24aCTLA4:n onkolyyttinen vaikutus johti 97,6 %:n, 78,2 %:n, 69,1 %:n ja 57,3 %:n solutappoon PC3-MM2:llä, SKOV3-ip1:lla, A549:llä ja vastaavasti UT-SCC8:llä (kuvio 3). Tilastollista eroa ei esiintynyt Ad5/3-A24aCTLA4:llä ja sen vastineella ilman siirtogeeniä E3:ssa (Ad5/3-A24) syto-toksisuudessa missään analysoiduista kasvainsolulinjoista.

Ei-replikoituvalla Ad5/3-aCTLA4:lla ei havaittu sytotoksisuutta alhaisilla virusannoksilla (kuvio 3). Kuitenkin sytotoksisuutta havaittiin korkeimmilla Ad5/3-aCTLA4-arvoilla maksimaalisten solutappolukujen ollessa 96,2 %, 74,3 %, 49,1 % ja 56,15 % PC3-MM2:lla, SKOV3-ip1:llä, A549:llä ja vastaavasti UT-SCC8:lla (kuvio 3). Tämä tulos on yhdenmukainen aikaisemmin osoitetun anti-CTLA-4:n suoran sitoutumisen syöpäsolujen pinnalla ilmentyvän CTLA:han kanssa, mikä aiheuttaa solukuoleman (Contardi E et ai., Int J Cancer 2005;117:538-50).

Esimerkki 5. Ad5/3-A24aCTLA4:n kasvaimenvastaisen aktiivisuuden määritys

Adenovirusten kasvaimen kasvun suppressio ja apoptoosi määritettiin immuunipuutteisilla karvattomilla hiirillä, joilla oli ihmisen eturauhassyövän ksenografteja, käsittelemällä hiiriä monoklonaalista anti-CTLA-4-vasta-ainetta ilmentävillä onkolyyttisillä adenoviruksilla.

Ihmisen eturauhaseksplanttiksenograftit muodostettiin injektoimalla 5x106 PC3-MM2-solua 5-6 viikkoa vanhojen naaraspuolisten NMRI/karvatto-mien hiirten (Taconic, Ejby, Tanska) kylkiin. Seitsemän päivän kuluttua kasvaimet (n = 8/ryhmä, 5-8 mm halkaisijaltaan) injektoitiin käyttäen tilavuutta 50 pl kolme kertaa joka toinen päivä annoksella 1x108 VP (päivinä 0, 2 ja 4) ja kontrollikasvaimet injektoitiin vain DMEM:llä. Kaavaa (pituus x leveys2 x 0,5) käytettiin kasvaimen tilavuuden laskemiseksi. Päivänä 5 kasvainten kryoleikkeet värjättiin anti-CTLA4:n ilmentämisen (ihmisen IgG) tai apoptoosin (aktiivinen kaspaasi-3) suhteen immunohis- tokemialla. Tissue Tek OCT -tuotteeseen (Sakura, Torrance, CA, USA) valettujen jäätyneiden kasvainten 4-5 pm:n kryoleikkeet valmistettiin ja kiinnitettiin asetonilla 10 min:n ajan -20 °C:ssa. Primaarisina vasta-aineina käytettiin vuohen anti-ihmis-lgG:tä (raskaat ja kevyet ketjut) (AbD serotec, MorphoSys) ja kanin monoklonaalista vasta-ainetta aktiivista kaspaasi-3:a vastaan laimennoksena 1:200 yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa (BD Pharmingen Tm, AB559565). Lisäksi leikkeitä inkuboitiin valmistajan ohjeiden mukaan käyttäen LSAB2 System-HRP -pakkausta (K0673, DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Sitoutuneet vasta-aineet tehtiin näkyviksi käyttäen 3,3’-diaminobentsi-diinia (DAB, Sigma, St Louis, MO, USA). Lopuksi leikkeet vastavärjättiin hema-toksyliinillä ja vesi poistettiin etanolissa, kirkastettiin ksyleenissä ja suljettiin kanadanbalsamilla. Edustavat kuvat otettiin suurennuksella 40 käyttäen Leica DM LB -mikroskoopilla varustettua Olympus DP50 -värikameraa. Päivänä 7 ihmisen lgG:n pitoisuudet Ad5/3-A24aCTLA4:llä tai Ad5/3-aCTLA4:llä käsiteltyjen hiirten kasvaimissa ja plasmassa mitattiin (kuvio 4C). Ad5/3-A24aCTLA4:llä käsitellyissä kasvaimissa havaittiin 81 kertaa enemmän anti-CTLA4-mAb:tta verrattuna Ad5/3-aCTLA4:llä käsiteltyihin kasvaimiin (p<0,05). Lisäksi 43,3 kertaa enemmän anti-CTLA4-mAb:tta havaittiin Ad5/3-A24aCTLA4:llä käsitellyissä kasvaimissa kuin samojen eläinten plasmassa (p<0,05). Keskimääräinen plasmapitoisuus oli 392,6 pg/g (SE 312,0), joka on alle pitoisuuksien, jotka on raportoitu siedetyiksi ihmisillä, jotka on käsitelty ipilimumabilla (561 pg/ml) ja vastaavasti tremelimumabilla 450 pg/ml (Weber JS, et ai. J Clin Oncol 2008;26:5950-6; Ribas A, et ai. J Clin Oncol 2005;23:8968-77; Tarhini AA, Iqbal F, Oncol Targets Ther 2010;3:15-25) (1 ml plasma painaa noin 1 g). Ad5/3-Ä24aCTLA4-kasvaimissa mAb-pitoisuus oli 16 977 pg/g ja siten paljon korkeampi kuin plasmassa.

Ihmisen anti-CTLA-4-mAb ei sitoudu hiiren CTLA-4:ään, ja kseno-graftikokeet tarvitsevat T-solupuutteisia karvattomia hiiriä. Siten tämä malli määrittää vain onkolyyttisiä ja proapoptoottisia vaikutuksia. Kuitenkin Ad5/3-Ä24aCTLA4 osoitti merkittävää kasvaimenvastaista aktiivisuutta verrattuna mock-kontrolliin (p < 0,01; kuvio 4A) tässä aggressiivisessa ihonalaisessa eturauhassyövän ksenograftimallissa. Mikään muu käsitelty ryhmä ei osoittanut merkittävää vaikutusta mock-kontrolliin verrattuna. Ad5/3-Ä24aCTLA4:n ja Ad5/3-Ä24:n välillä ei havaittu tilastollista eroa (p=0,43), mikä varmistaa in vitro -tulokset, joiden mukaan anti-CTLA4-mAb:n ilmentäminen ei vähennä viruksen kasvaimenvastaista tehoa.

Koska tiedetään, että CTLA-4:ää estävät vasta-aineet indusoivat kasvainsolujen suoraa tappoa käynnistämällä apoptoosin, määritettiin, liittyikö kasvaimenvastainen teho ihmisen anti-CTLA4-mAb-tuotantoon ja sen jälkeen lisääntyneeseen apoptoosiin. Ihmisen mAb:n värjäys Ad5/3-A24aCTLA4:llä ja Ad5/3-aCTLA4:llä käsitellyissä kasvaimissa havaittiin, mutta ei Ad5/3-A24:llä tai Ad5/3-Luc1:Ma (kuvio 4B). Ihmisen mAb:n ilmentäminen vaikuttaa korreloivan lisääntyneeseen apoptoosiin (kuvio 4B). Siten Ad5/3-Ä24aCTLA4:llä käsitellyt kasvaimet ilmentävät anti-CTLA-4-mAb:a mikä johtaa lisääntyneeseen apoptoosiin.

Esimerki 6. Syöpäpotilaiden T-solujen immunomodulaatio anti-CTLA4-mAb:a ilmentävillä onkolyyttisillä adenoviruksilla

Prekliinisten havaintojen laajentamiseksi ihmisiin, tutkittiin PBMC:ita potilailta, joilla oli pitkälle edenneitä kiinteitä kasvaimia, jotka reagoivat huonosti kemoterapiaan. Syöpäpotilaiden (potilas I244, joka sairastaa kondroideaalis-ta melanoomaa, potilas C26, joka sairastaa paskusuolisyöpää, potilas M158, joka sairastaa mesotelioomaa tai potilas X258, joka sairastaa kohdunkaulansyöpää) PBMC:t stimuloitiin 0,3 pg/ml:lla ionomysiiniä (Sigma-AIdrich Co.), 0,03 pg/ml:llaforbolimyristyyliasetaattia (PMA) (Sigma-AIdrich Co.) ja 1 pg/ml:lla rekombinanttia ihmisen B7-Fc-kimeraa (R&D Systems) kasvaimen aiheuttaman immunosuppression matkimiseksi. Stimulaation jälkeen PBMC:itä käsiteltiin Ad5/3-A24aCTLA4:lla, Ad5/3-A24:lla, Ad5/3-aCTLA4:lla tai Ad5/3-Luc1:llä in-fektoitujen PC3-MM2-solujen 0,02 pm:n suodattimena (Anotop, VVhatman, England) suodatetuilla supernatanteilla.

Loss of function -määrityksessä 0,1 pg/ml rekombinanttia ihmisen CTLA-4/Fc-kimeraa (R&D Systems) lisättiin ionomysiiniin, PMA:jan ja rekom-binanttiin B7:ään. Kaksikymmentäneljä tuntia PBMC-stimulaation jälkeen inter-leukiini-2- (IL-2) tai interferoni-y (IFN-γ) -pitoisuudet kasvatusalustoissa analysoitiin BD Cytometric Bead Array Human Soluble Protein Flex Set -pakkauksella (Becton Dickinson) valmistajan ohjeiden mukaan. Käytettiin kymmentä vi-ruspartikkelia (VP) solua kohti ja 48 tuntia myöhemmin supernatantit otettiin talteen. Hiiren monoklonaalista anti-ihmis-CTI_A-4 (=CD152) -vasta-ainetta (BD Pharmingen™, Eurooppa) käytettiin positiivisena kontrollina. FCAP Array v. 1.0.2 (Soft Flow) -ohjelmistoa käytettiin analyysiin.

Kaikissa neljässä potilasnäytteessä supernatantti anti-CTLA4-mAb:tta ilmentävistä onkolyyttisistä adenoviruksista kykeni lisäämään T-soluaktiivi-suutta mitattuna IL-2:lla ja gamma-interferonilla (kuvio 5). Kokeen periaate esi tetään kuviossa 7. On mielenkiintoista, että, vaikka rekombinantti mAb oli tehokkaampi Jurkat-soluissa, joka on immortalisoitu T-solulinja, potilasnäytteillä virussupernatantit olivat tehokkaampia. Samanlaisia tuloksia saatiin loss of function -määrityksessä (kuvio 8), periaate kuvioissa 7E-F.

Esimerkki 7. Anti-CTLA4-mAb:n vaikutus terveiltä yksilöiltä otettuihin PBMC:ihin.

Esimerkissä 6 kuvatut kokeet suoritettiin käyttäen myös käyttäen terveiden yksilöiden PBMC:itä. Päinvastoin kuin syöpäpotilailla, supernatantti Ad5/3-A24aCTLA4:llä infektoiduista soluista ei lisännyt IL-2:n tai gamma-interferonin tuotantoa. Merkittäviä muutoksia ei nähty myöskään loss of function -määrityksessä. Kuitenkin, koska positiivinen kontrolli, rekombinantti mAb, oli tehokas molemmissa tapauksissa (lisäsi IL-2:ta ja-gamma-interferonia kuviossa 6 ja vähensi niitä kuviossa 8; lisääntynyt IL-2 p<0,05 ja p=0,206, lisääntynyt INF-γ p<0,05 ja vastaavasti p=0,120, luovuttajassa 1 ja luovuttajassa 2 kuviossa 6; vähentynyt IL-2 p<0,001 ja p<0,05; ja vähentynyt INF-γ p<0,001 ja vastaavasti p<0,05 vastaavasti luovuttajassa 1 ja luovuttajassa 2 kuviossa 8; verrattuna rB7:ään, rCTLA4. lonomysiini ja PMA vain käsitellyt solut), otaksuttiin, että tämä on annosvaikutus. Tätä tukee ei-merkittävä trendi, joka nähdään Ad5/3-A24aCTLA4:ssä loss-of-function -määrityksessä (kuvio 8) ja useissa tapauksissa merkittävä vaikutus supernatantilla Ad5/3-aCTLA4:llä infektoiduissa soluissa (kuviot 6 ja 8). Kuitenkin anti-CTLA-4-mAb:n vaikutus on huomattava syöpäpotilailla, ehkä koska niillä on korkeampi käynnissä olevien immunosup-pressiivisten prosessien aste läsnä olevan edenneen kasvaimen takia.

Esimerkki 8: Replikoitumiskykyisen mallin käyttökelpoisuus anti-CTLA4 mAb:n ilmentymisen lisäämisessä

Replikoitumiskykyisen mallin käyttö anti-CTLA4-mAb:n ilmentymisen lisäämisessä verrattuna replikoitumiskyvyttömään virukseen analysoitiin. PC3-MM2-solut laitettiin pitoisuutena 20 000 solua kuoppaa kohti ja infektoitiin pitoisuudella 10 VP solua kohti Ad5/3-A24aCTLA4:lla ja vastaavasti Ad5/3-aCTLA4:lla. 24 h, 48 h ja 72 h infektion jälkeen supernatantit kerättiin ja analysoitiin ELISA:lla ihmisen lgG:n määrän suhteen. Kolminkertainen lisäys havaittiin onkolyyttisellä viruksella Ad5/3-A24aCTLA4 verrattuna replikoitumiskyvyttömään Ad5/3-aCTLA4:iin. Ad5/3-aCTLA4 (kuvio 10).

Yksi onkolyyttisen mallin hyöty siirtogeenin ilmentymisen saatu korkeampi taso. Varhaisvaiheen geenien ilmentämisen jälkeen viruksen genomi monistuu ja jopa 10 000 kopiota virus-DNA:ta tuotetaan. Tämä johtaa paljon useampiin kopioihin, jotka voivat tuottaa siirtogeeniä (kuvio 10).

Esimerkki 9: Onkolyyttiset adenovirusvektorit, joilla on lisääntynyt immuunivaste

Immuunivasteen lisäämiseksi edelleen tutkittiin onkolyyttisiä adeno-virusta, jotka sisältävät TLR-9:a (toll-like receptor 9) stimuloivia CpG-molekyylejä viruksen rungossa (kuvio 1), käyttäen keuhkosyövän ksenografti-hiirimallia. Karvattomiin NMRI-hiiriin (5 hiirtä ryhmää kohti, kaksi kasvainta hiirtä kohti) istutettiin A549-soluja ja käsiteltiin 1x108 VP:llä CpG-rikkaalla onko-lyyttisellä adenoviruksella Ad5-A24CpG, onkolyyttisellä adenoviruksella, joka sisältää A24-deleetion, onkolyyttisellä adenoviruksella + CpG:tä sisältävillä re-kombinanteilla oligoilla (ODN 2395, InvivoGen, USA). Kasvaimen kasvua mitattiin kahden päivän välein 12 päivää, kuten aikaisemmin on kuvattu. CpG-rikas virus Ad5-A24CpG oli tehokkain kasvaimenvastaisen immuniteetin välittämisessä (kuvio 11).

Pernasoluja, jotka oli otettu talteen samoilta hiiriltä, stimuloitiin UV-inaktivoidulla viruksella ja keraviljeltiin suhteessa 1:1 ja 10:1 A549-solujen kanssa. MTS-solutappomääritys suoritettiin ajanhetkenä 72 tuntia. Annetaan prosenttiosuus A549-soluista, jotka ovat vielä elossa annettuna ajankohtana. Kuviossa 12 esitetty tulos osoittaa, että CpG-modifioitu virus kykeni stimuloimaan antigeeniä esitteleviä soluja ja tämä johti lisääntyneeseen kasvaimen-vastaiseen immuunivasteeseen. Vaste oli niin voimakas, että se voitiin nähdä jopa karvattomissa hiirissä, joilta T-solut puuttuvat. Niinpä jopa parempia tuloksia odotetaan immuunikompotenteissa eläimissä ja ihmisissä. TLR-9-stimulaa-tion käyttö (joka indusoi kasvaimenvastaisen immuniteetin) on todennäköisesti merkittävin samanaikaisen suppressiivisten signaalien vähentämisen kanssa aCTLA-4:lla.

Esimerkki 10. Monoklonaalisia anti-CTLA-4-vasta-aineita sisältävien on-colyyttisten adenovirusvektoreiden turvallisuus ja teho ihmisten syövässä 1. Potilaat

Potilaita, joilla on pitkälle kehittyneitä ja vaikeasti hoidettavia kiinteitä kasvaimia, pyydetään osallistumaan Suomen Lääkealan turvallisuus ja kehittä miskeskuksen (FIMEA) hyväksymään Advanced Therapy Access Program (ATAP) -ohjelmaan.

Potilaat valitaan syöpäpotilaista, joilla oli pitkälle edenneitä kiinteitä kasvaimia, jotka vastasivat huonosti standardihoitoihin. Mukaanottokriteerit olivat kiinteät kasvaimet, jotka reagoivat huonosti tavanomaisiin hoitoihin, WHO:n suoritusarvo 3 tai alle, eikä suuria elinten toimintojen puutteita. Hylkäyskriteerit olivat elinsiirto, HIV, vaikea sydänverisuoni-, metabolinen tai keuhkosairaus tai muut oireet, löydökset tai taudit, jotka estivät onkolyyttisen virushoidon. Kirjallinen suostumusasiakirja saatiin ja hoidot hallinnoitiin hyvän kliinisen tutkimustavan ja Helsingin julistuksen mukaisesti. Hoidot annetaan kasvaimensisäises-ti, suonensisäisesti tai intraperitoneaalisesti, kulloinkin sopivasti. II. Hoidot aCTLA-4 mAb:tta:ää koodaavalla adenovirusvektorilla

Onkolyyttiset adenovirukset tuotetaan kliinisen laatuluokan mukaisesti ja potilaiden hoito aloitetaan.

Hoito annetaan kasvaimensisäisinä injektioina. Hoitojen kokonaislukumäärä on kolme joka kolmas viikko. Virusannokset valitaan perustuen keksijöiden aikaisempiin tietoihin muilla onkolyyttisillä viruksilla. Kuitenkin voidaan käyttää muita anto-ohjelmia kulloinkin sopivasti. Esimerkiksi sarjahoitojen ensimmäisellä kierroksella potilaat saavat osan annoksesta, esim. neljä viidesosaa tai kaksi viidesosaa annoksesta kasvaimensisäisesti tai intraperionaali-sesti ja lopun annoksen suonensisäisesti

Virus laimennetaan steriilillä suolaliuoksella antoajankohtana asianmukaisissa olosuhteissa. Viruksen antamisen jälkeen kaikkia potilaita tarkkaillaan yön yli sairaalassa ja tämän jälkeen avohoitopotilaina. Fyysinen tarkastelu ja sairauskertomus tehtiin jokaisella käynnillä ja kliinisesti relevantteja laborato-rioarvoja seurattiin.

Hoidon sivuvaikutukset kirjataan ja pisteytetään CTCAE:n (Common Terminology Criteria for Adverse Events) version 3.0 mukaisesti. Koska monilla syöpäpotilailla on taudista johtuvia oireita, aikaisemmin esiintyville oireille ei anneta numeroa, jos ne eivät pahene. Kuitenkin jos oire tuli vakavammaksi, esim. Jos ennen hoitoa oleva aste 1 muuttui asteeksi 2 hoidon jälkeen, sille annetaan numero asteena 2.

Kasvaimen koko määritetään varjoainetehosteisella tietokonetomografia (CT) -skannauksella. Saadaan maksimaaliset kasvaimen halkaisijat. RECIST1.1 (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) -kriteerejä sovelletaan koko tautiin, mukaan lukien injektoidut ja injektoimattomat leesiot. Nämä kriteerit ovat: osittainen vaste PR (>30 %:n väheneminen kasvaimen halkaisijoiden summassa), stabiili tauti SD (ei vähenemistä/lisääntymistä), etenevä tauti PD (>20 %:n lisääntyminen). Selville kasvaimen pienenemisille, jotka eivät täytä PR:ää, annetaan numero vähäisinä vasteina (MR). Seerumin kas-vainmerkit määritettiin myös, kun ne nousivat perusarvosta, ja samoja prosenttiosuuksia käytettiin.

Potilaiden seeruminäytteet analysoidaan immunologisten ja virologisten parametrien suhteen, kuten esimerkiksi viruksen kopiolukumäärä veressä ajan mittaan, virusvastaisten neutraloivien vasta-aineiden indusointi, muutokset virusvastaisissa ja kasvaimenvastaisissa T-soluissa, muut immunologiset solutyypit ja muutokset kasvaimenvastaisissa vasta-aineissa. Lisäksi haittavaikutukset asteistetaan Common Terminology for Adverse Events v3.0 (CTCAE) -käytännön mukaan, neutraloivien vasta-aineiden tiitterit mitataan ja teho ar-voidaan RECIST-kriteereiden mukaan tietokonetomografialle (CT) (Therasse P et ai. 2000, J Natl Cancer Inst 92, 205-16PERCIST-kriteerien mukaan (VVahl et ai 2009 J Nucl Med 50 Suppl 1:122S-50S) positroniemissiotomografia-tietokonetomografialle (PET-CT). Kaikilla potilailla oli ollut eteneviä kasvaimia ennen hoitoa ja he ovat taudin eri tiloissa.

Claims (34)

1. Onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää 1. adenovirusserotyypin 5 (Ad5:n) nukleiinihappopääketjun, joka käsittää kapsidimodifikaation, 2) 24 emäsparin deleetion (D24) E1:n Rb:tä sitovalla varoalueella 2 ja 3. nukleiinihapposekvenssin, joka koodaa CTLA-4-spesifistä täysin ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta (aCTLA-4-mAb), deletoidun gp19k/6.7K:n tilalla E3-alueella.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää yhden tai useamman alueen, jotka on valittu ryhmästä, joka koostuu E2-, E4-ja myöhäisvaiheen alueista.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat alueet: vasen ITR, osittainen E1, plX, plVa2, E2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4, osittainen E3, L5, E4 ja oikea ITR.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että alueet ovat peräkkäisessä järjestyksessä 5’-3’-suun-nassa.

5. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että E1-alueesta ylävirtaan sijaitsee villi-tyypin alue.

6. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että E1-alue käsittää viruksen pakkaus-signaalin.

7. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että aCTLA-4-mAb:tä koodaava nukleii-nihapposekvenssi on viruksen E3-promoottorin kontrollin alainen.

8. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää kasvainspesifistä ihmisen telomeraasin käänteistransskriptaasin (hTERT) promoottoria tai E2F-promoottoria koodaavan nukleiinihapposekvenssin ylävirtaan E1-alueesta.

9. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää CpG-kohdan viruksen pääketjussa.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että CpG-kohta on E3-alueella.

11. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että E4-alue on villityyppiä.

12. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että kapsidimodifikaatio on Ad5/3-kime-rismi, integriiniä sitovan alueen (RGD:n) insertio ja/tai hepariinisulfaattia sitovan polylysiinin modifikaatio säikeeseen.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että kapsidimodifikaatio on Ad5/3-kimerismi.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että kapsidimodifikaatio on RGD-4C-modifikaatio.

15. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää ainakin yhden ekspres-siokasetin.

16. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää vain yhden ekspressio-kasetin.

17. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että vektori kykenee selektiivisesti repli-koitumaan soluissa, joissa on virheitä Rb/p16-reitillä.

18. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että vektori kykenee selektiivisesti repli-koitumaan soluissa, jotka ilmentävät telomeraasia.

19. In vitro -solu, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-18 mukaista adenovirusvektoria.

20. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-18 mukaista adenovirusvektoria.

21. Jonkin patenttivaatimuksen 1-18 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori tai patenttivaatimuksen 20 farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se toimii in situ -syöpärokotteena.

22. Jonkin patenttivaatimuksen 1-18 mukainen adenovirusvektori käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa.

23. Patenttivaatimuksen 20 mukainen farmaseuttinen koostumus käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa.

24. Jonkin patenttivaatimuksen 1-18 mukainen adenovirusvektori tai patenttivaatimuksen 20 mukainen farmaseuttinen koostumus käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa, tunnettu siitä, että syöpä valitaan ryhmästä, johon kuuluvat nasofaryngeaalinen syöpä, synoviaalinen syöpä, hepatosellu-laarinen syöpä, munuaissyöpä, sidekudossyöpä, melanooma, keuhkosyöpä, suolistosyöpä, paksusuolen syöpä, peräsuolen syöpä, kolorektaalinen syöpä, aivosyöpä, kurkkusyöpä, suusyöpä, maksasyöpä, luusyöpä, haimasyöpä, istukkasyöpä, gastrinooma, feokromosytooma, prolaktinooma, T-soluleukemia/-lymfooma, neurooma, von Hippel-Lindaun tauti, Zollinger-Ellisonin oireyhtymä, lisämunuaissyöpä, anaalinen syöpä, sappitien syöpä, virtsarakon syöpä, virtsajohtimen syöpä, oligodendrogliooma, neuroblastooma, meningiooma, selkä-ydinkasvain, osteokondrooma, kondrosarkooma, Evvingin sarkooma, tuntemattoman primäärisijainnin syöpä, karsinoidi, maha-suolikanavan karsinoidi, fibro-sarkooma, rintasyöpä, Pagetin tauti, kohdunkaulan syöpä, ruokatorven syöpä, sappirakon syöpä, pään syöpä, silmäsyöpä, niskasyöpä, munuaissyöpä, Wilm-sin kasvain, Kaposin sarkooma, eturauhassyöpä, kivessyöpä, Hodgkinin tauti, non-Hodgkinin lymfooma, ihosyöpä, mesoteliooma, multippeli myelooma, munasarjasyöpä, endokriininen haimasyöpä, glukagonooma, paratyroidinen syöpä, penissyöpä, aivolisäkesyöpä, pehmytkudossarkooma, retinoblastooma, ohutsuolisyöpä, mahalaukkusyöpä, kateenkorvasyöpä, kilpirauhassyöpä, trofo-blastisyöpä, rypäleraskaus, kohtusyöpä, endometriaalinen syöpä, emätinsyö-pä, ulkosynnytinsyöpä, kuulohermokasvain, mycosis fungoides, insulinooma, karsinoidioireyhtymä, somatostatinooma, iensyöpä, sydänsyöpä, huulisyöpä, kalvosyöpä, suusyöpä, hermosyöpä, suulakisyöpä, korvasylkirauhassyöpä, vatsakalvosyöpä, nielusyöpä, pleuraalinen syöpä, sylkirauhassyöpä, kielisyöpä ja risasyöpä.

25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa, tunnettu siitä, että kohde on ihminen tai eläin.

26. Patenttivaatimuksen 24 tai 25 mukainen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa, tunnettu siitä, että adenovirusvektorit tai farmaseuttiset koostumukset annostellaan kasvaimensisäisellä, lihaksensisäisellä, valtimonsisäisellä, laskimonsi- säisellä, keuhkopussinsisäisellä, rakkulansisäisellä, ontelonsisäisellä tai peri-toneaalisella injektiolla tai suun kautta.

27. Jonkin patenttivaatimuksen 24-26 mukainen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa, tunnettu siitä, että onkolyyttisiä adenovirusvektoreita tai farmaseuttisia koostumuksia annetaan useita kertoja hoitojakson aikana.

28. Jonkin patenttivaatimuksen 24-27 mukainen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa, tunnettu siitä, että kohteelle annetaan onkolyyttistä adenovirusvektoria, jolla on erilainen kapsidin säikeen uloke kuin aiemmassa hoidossa käytetyssä vektorissa.

29. Jonkin patenttivaatimuksen 24-28 mukainen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa, tunnettu siitä, että adenovirusvektorit tai farmaseuttiset koostumukset annostellaan kohteelle rinnakkain sädehoidon kanssa tai rinnakkain kemoterapian kanssa tai rinnakkain muiden syöpähoitojen kanssa.

30. Jonkin patenttivaatimuksen 24-29 mukainen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa, tunnettu siitä, että adenovirusvektorit tai farmaseuttiset koostumukset annostellaan kohteelle apuaineen kanssa, joka apuaine on valittu ryhmästä, joka koostuu verapamiilista tai muusta kalsiumkanavanestäjästä; autofagiaa indusoivasta aineesta; temotsolomidista; regulatoristen T-solujen vähentämiseen kykenevästä aineesta; syklofosfamidistä ja mistä tahansa näiden yhdistelmästä kohteessa.

31. Jonkin patenttivaatimuksen 24-30 mukainen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa, tunnettu siitä, että adenovirusvektorit tai farmaseuttiset koostumukset annostellaan yhdessä kemoterapian tai anti-CD20-hoidon tai muiden neutralisoivien vasta-aineiden estohoitojen kanssa.

32. In vitro -menetelmä CTLA-4-spesifisen täysin ihmisen monoklo-naalisen vasta-aineen tuottamiseksi solussa, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää: a) kuljetetaan jonkin patenttivaatimuksen 1-18 mukaista onkolyyttistä adenovirusvektoria käsittävä kuljetin soluun ja b) ilmennetään kyseisen vektorin CTLA-4-spesifistä täysin ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta solussa.

33. Jonkin patenttivaatimuksen 1-18 mukaisen onkolyyttisen ade-novirusvektorin käyttö anti-CTLA-4-mAb:n tuottamiseksi solussa in vitro.

34. Jonkin patenttivaatimuksen 1-18 mukainen onkolyyttinen ade-novirusvektori käytettäväksi kasvainspesifisen immuunivasteen ja apoptoosin lisäämiseksi kohteessa.