FI121508B - Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä - Google Patents

Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä Download PDF

Info

Publication number
FI121508B
FI121508B FI20095466A FI20095466A FI121508B FI 121508 B FI121508 B FI 121508B FI 20095466 A FI20095466 A FI 20095466A FI 20095466 A FI20095466 A FI 20095466A FI 121508 B FI121508 B FI 121508B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
cancer
adenovirus vector
cells
oncolytic adenovirus
cell
Prior art date
Application number
FI20095466A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20095466A0 (fi
Inventor
Akseli Hemminki
Sari Pesonen
Vincenzo Cerullo
Anna Kanerva
Original Assignee
Oncos Therapeutics Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oncos Therapeutics Oy filed Critical Oncos Therapeutics Oy
Publication of FI20095466A0 publication Critical patent/FI20095466A0/fi
Priority to FI20095466A priority Critical patent/FI121508B/fi
Priority to HUE09796016A priority patent/HUE031689T2/en
Priority to PT97960165T priority patent/PT2379586T/pt
Priority to SG2011046109A priority patent/SG173432A1/en
Priority to SI200931586A priority patent/SI2379586T1/sl
Priority to ES09796016.5T priority patent/ES2612889T3/es
Priority to EP09796016.5A priority patent/EP2379586B1/en
Priority to AU2009332883A priority patent/AU2009332883B2/en
Priority to RU2011130511/10A priority patent/RU2520823C2/ru
Priority to JP2011542856A priority patent/JP2012513209A/ja
Priority to US12/643,140 priority patent/US9345787B2/en
Priority to LTEP09796016.5T priority patent/LT2379586T/lt
Priority to KR1020117016272A priority patent/KR101761094B1/ko
Priority to DK09796016.5T priority patent/DK2379586T3/en
Priority to CA2748180A priority patent/CA2748180C/en
Priority to PL09796016T priority patent/PL2379586T3/pl
Priority to BRPI0924123A priority patent/BRPI0924123B8/pt
Priority to CN200980151762.9A priority patent/CN102264760B/zh
Priority to PCT/FI2009/051025 priority patent/WO2010072900A1/en
Application granted granted Critical
Publication of FI121508B publication Critical patent/FI121508B/fi
Priority to ZA2011/04224A priority patent/ZA201104224B/en
Priority to US14/538,707 priority patent/US20150202324A1/en
Priority to JP2015156226A priority patent/JP6280084B2/ja
Priority to US15/075,962 priority patent/US20160208287A1/en
Priority to CY20171100126T priority patent/CY1120039T1/el
Priority to HRP20170165TT priority patent/HRP20170165T1/hr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6009—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses dsDNA viruses
    • C12N2810/6018—Adenoviridae

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä
Keksinnön ala
Esillä oleva keksintö liittyy biotieteiden ja lääketieteen aloihin. Erityisesti keksintö liittyy syöpähoitoihin. Tarkemmin sanottuna esillä oleva keksintö 5 liittyy onkolyyttisiin adenovirusvektoreihin ja soluihin ja mainittuja vektoreita käsittäviin farmaseuttisiin koostumuksiin. Esillä oleva keksintö liittyy myös mainittujen vektoreiden käyttöön kohteen syövän hoitoon tarkoitetun lääkkeen valmistuksessa. Lisäksi esillä oleva keksintö liittyy menetelmiin GM-CSF:n tuottamiseksi solussa ja kasvainspesifisen immuunivasteen lisäämiseksi kohtees-10 sa sekä keksinnön mukaisen onkolyyttisen adenovirusvektorin käyttöön GM-CSF:n tuottamiseksi solussa ja kasvainspesifisen immuunivasteen lisäämiseksi kohteessa.
Keksinnön tausta
Syöpää voidaan hoitaa leikkauksella, hormonihoidoilla, kemoterapi-15 alla ja/tai sädehoidoilla, mutta useissa tapauksissa syöpiä, joille on usein tunnusomaista se, että ne ovat levinneessä vaiheessa, ei voida parantaa nykyisillä hoidoilla. Tämän vuoksi tarvitaan uusia syöpäsoluihin kohdistuvia lähestymistapoja, kuten geenihoitoja.
Viimeisen kahdenkymmenen vuoden aikana geenisiirtoteknologiaa 20 on tutkittu paljon. Syövän geenihoitojen tarkoituksena on viedä terapeuttinen geeni kasvainsoluun. Nämä kohdesoluun viedyt terapeuttiset geenit voivat esimerkiksi korjata mutatoituneita geenejä, suppressoida aktiivisia onkogeene-jä tai luoda soluun lisäominaisuuksia. Sopivia eksogeenisiä terapeuttisia geenejä ovat näihin rajoittumatta immunoterapeuttiset, antiangiogeeniset ja kemo-25 protektiiviset geenit sekä "itsemurhageenit", ja ne voidaan viedä soluun hyödyntämällä modifioituja virusvektoreita tai ei-viraalisia menetelmiä mukaan lukien elektroporaatio, geenipyssy ja lipidi- tai polymeeripäällysteet.
Optimaalisten virusvektoreiden vaatimuksiin kuuluu tehokas kyky löytää spesifisiä kohdesoluja ja ilmentää virusgenomia kohdesoluissa. Lisäksi 30 optimaalisten vektoreiden tulee pysyä aktiivisina kohdekudoksissa tai -soluissa. Kaikki nämä virusvektoreiden ominaisuudet on kehitetty viimeisten vuosikymmenien aikana, ja esimerkiksi retrovirus- ja adenovirusvektoreita ja adenoassosioituneita virusvektoreita on tutkittu laajasti biolääketieteessä.
Kasvaimeen penetraation ja antituumorivaikutuksen paikallisen 35 amplifikaation parantamiseksi edelleen on konstruoitu selektiivisesti onkolyytti- 2 siä aineita, esimerkiksi ehdollisesti replikoituvia adenoviruksia. Onkolyyttiset adenovirukset ovat lupaava keino syöpien hoitoon. Onkolyyttiset adenovirukset tappavat kasvainsoluja replikoimalla virusta kasvainsolussa, jolloin replikaation viimeinen vaihe johtaa tuhansien virionien vapautumiseen ympäröiviin kas-5 vainkudoksiin tehokasta kasvaimeen penetraatiota ja vaskulaarista reinfektiota varten. Kasvainsolut mahdollistavat viruksen replikaation, kun taas normaalit solut säästyvät sellaisten virusgenomiin räätälöityjen muutosten johdosta, jotka estävät replikaation ei-kasvainsoluissa.
Replikaatiovälitteisen solujen tappamisen lisäksi onkolyyttiset 10 adenovirukset voidaan myös varustaa erilaisilla terapeuttisilla siirtogeeneillä. Tässä lähestymistavassa perinteisen geeninviennin edut yhdistyvät replikaa-tiokompetenttien aineiden tehoon. Virusten varustamisen yksi tavoite on immuunireaktion aiheuttaminen virusreplikaation mahdollistavia soluja vastaan. Vaikka virusreplikaatio on immunogeeninen, se ei yksistään normaalisti riitä 15 aiheuttamaan tehokasta kasvaimenvastaista immuniteettia. Terapeuttisen immuniteetin aiheutumisen vahvistamiseksi virukset voidaan varustaa stimulato-risilla proteiineilla, kuten sytokiineilla, ja helpottamalla kasvainantigeenien viemistä dendriittisiin soluihin. Immunoterapeuttisten geenien vieminen kasvain-soluihin ja lisäksi proteiinien translaatio johtavat immuunivasteen aktivoitumi-20 seen ja tehokkaaseen kasvainsolujen tuhoutumiseen. Merkittävimmät im-muunisolut tässä suhteessa ovat luonnolliset tappajasolut (NK:t) ja sytotoksiset CD8+ T -solut.
Adenovirukset ovat keskikokoisia (90-100 nm), vaipattomia ikosahedraalisia viruksia, joilla on noin 36 kiloemäsparin kaksinauhainen line-25 aarinen DNA proteiinikapsidissa. Viruksen kapsidissa on säierakenteita, jotka osallistuvat viruksen kiinnittymiseen kohdesoluun. Ensinnäkin säieproteiinin (fiber protein) ulokealue (knob domain) sitoutuu kohdesolun reseptoriin [esimerkiksi CD46- tai coxsackievirus-adenovirusreseptoriin (CAR)], toiseksi virus vuorovaikuttaa integriinimolekyyliin ja kolmanneksi virus endosytosoituu koh-30 desoluun. Tämän jälkeen virusgenomi siirtyy endosomeista tumaan ja kohdesolun replikaatiokoneistoa hyödynnetään myös virustarkoituksiin (Russell W. C. 2000, J General Virol 81,2573-2604).
Adenovirusgenomilla on varhaisvaiheen (E1-E4), keskivaiheen (IX ja IVa2) ja myöhäisvaiheen geenejä (L1-L5), jotka transkriptoituvat peräkkäi-35 sessä järjestyksessä. Varhaisvaiheen geenituotteet vaikuttavat isäntäsolun puolustusmekanismeihin, solusykliin ja solumetaboliaan. Keski-ja myöhäisvai- 3 heen geenit koodaavat virusten rakenneproteiineja uusien virionien tuottamiseksi (Wu ja Nemerow, 2004, Trends Microbiol 12: 162-168; Russell W. C. 2000, J General Virol 81,2573-2604; Volpers C. ja Kochanek S. 2004, J Gene Med 6 suppl 1, S164-71; Kootstra N. A. ja Verma I. M. 2003, Annu Rev Phar-5 macol Toxicol 43, 413-439).
Ihmiseltä on löydetty yli 50 adenovirusten eri serotyyppiä. Serotyypit luokitellaan kuuteen alaryhmään A-F, ja eri serotyyppien tiedetään liittyvän eri sairauksiin kuten hengityselinsairauksiin, sidekalvontulehdukseen ja maha-suolitulehdukseen. Adenovirusserotyypin 5 (Ad5) tiedetään aiheuttavan hengi-10 tyselinsairauksia, ja se on yleisin geenihoidon alalla tutkittu serotyyppi. Ensimmäisistä Ad5-vektoreista deletoitiin E1- ja/tai E3-alueet, jolloin vierasta DNA:ta voitiin viedä vektoreihin (Danthinne ja Imperiale 2000). Lisäksi muiden alueiden deleetiot ja lisämutaatiot ovat tuottaneet lisäominaisuuksia virusvekto-reille. Useita adenovirusten eri modifikaatioita on siis esitetty tehokkaiden anti-15 tuumorivaikutusten aikaansaamiseksi.
Esimerkiksi patentissa EP1377671 B1 (Cell Genesys, Inc.) ja hakemuksessa US2003/0104625 A1 (Cheng C. et ai.) on kuvattu onkolyyttinen adenovirusvektori, joka koodaa immunoterapeuttista proteiinia granulosyytti-makrofagien kolonisaatiota stimuloivaa tekijää (GM-CSF:ää). Myös julkaisussa 20 EP1767642 A1 (Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd.) osoitetaan, että onkolyyttisten adenovirusvektorien vaikutukset parantavat ihmisen immuunivastetta.
Silti tarvitaan tehokkaampaa ja tarkempaa geenisiirtoa ja geenihoitojen parempaa spesifisyyttä ja riittävää kasvaintentuhoamiskykyä. Terapeut-25 tisten vektorien turvallisuustietojen on myös oltava erinomaisia. Esillä oleva keksintö tarjoaa näillä edellä mainituilla ominaisuuksilla varustetun syövänhoi-tokeinon hyödyntämällä sekä adenovirusten onkolyyttisiä että immunoterapeut-tisia ominaisuuksia uudella ja keksinnöllisellä tavalla.
Keksinnön lyhyt kuvaus 30 Keksinnön tavoitteena on tuottaa uusia menetelmiä ja keinoja adenovirusten edellä mainittujen ominaisuuksien aikaansaamiseksi ja siten myös perinteisten syöpähoitojen ongelmien ratkaisemiseksi. Tarkemmin sanottuna keksintö tarjoaa uusia menetelmiä ja keinoja geenihoitoa varten.
Esillä oleva hakemus kuvaa rekombinanttivirusvektoreiden raken-35 tamista, näihin vektoreihin liittyviä menetelmiä ja niiden käyttöä kasvainsolulin-joissa, eläinmalleissa ja syöpäpotilaissa.
4
Esillä oleva keksintö liittyy onkolyyttiseen adenovirusvektoriin, joka käsittää adenovirusserotyypin 5 (Ad5) nukleiinihappopääketjun, 24 emäsparin deleetion (D24) E1 :n Rb:tä sitovalla pysyvällä alueella 2 ja nukleiinihappose-kvenssin, joka koodaa granulosyytti-makrofagien kolonisaatiota stimuloivaa te-5 kijää (GM-CSF:ää) deletoidun gp19k/6.7K:n tilalla E3-alueella.
Esillä oleva keksintö liittyy edelleen in vitro -soluun, joka käsittää keksinnön mukaista adenovirusvektoria.
Esillä oleva keksintö liittyy myös farmaseuttiseen koostumukseen, joka käsittää keksinnön mukaista adenovirusvektoria.
10 Esillä oleva keksintö liittyy myös keksinnön mukaisen adenovirus- vektorin käyttöön kohteen syövän hoitoon tarkoitetun lääkkeen valmistuksessa.
Lisäksi esillä oleva keksintö liittyy in vitro -menetelmään GM-CSF:n tuottamiseksi solussa, jolloin tässä menetelmässä a) kuljetetaan keksinnön mukaista onkolyyttistä adenovirusvektoria 15 käsittävä kuljetin soluun b) ilmennetään kyseisen vektorin GM-CSF:ää solussa.
Lisäksi esillä oleva keksintö liittyy in vitro -menetelmään kohteen kasvainspesifisen immuunivasteen lisäämiseksi, jolloin menetelmässä a) kuljetetaan keksinnön mukaista onkolyyttistä adenovirusvektoria 20 käsittävä kuljetin kohdesoluun tai -kudokseen b) ilmennetään kyseisen vektorin GM-CSF:ää solussa c) lisätään sytotoksisten T-solujen ja/tai luonnollisten tappajasolujen määrää kyseisessä kohdesolussa tai -kudoksessa.
Esillä oleva keksintö liittyy vielä keksinnön mukaisen onkolyyttisen 25 adenovirusvektorin käyttöön GM-CSF:n tuottamiseksi solussa kasvainspesifisen immuniteetin aikaansaamiseksi kohteessa.
Esillä oleva keksintö liittyy vielä keksinnön mukaisen onkolyyttisen adenovirusvektorin käyttöön kohteen kasvainspesifisen immuunivasteen lisäämiseksi.
30 Esillä oleva keksintö tarjoaa keinon huonosti nykyhoitoihin reagoivi en syöpien hoitamiseksi. Lisäksi hoitoon sopiviin kasvaintyyppeihin liittyviä rajoituksia on vähän verrattuna moniin muihin hoitoihin. Itse asiassa kaikkia kiinteitä kasvaimia voidaan hoitaa esitetyllä keksinnöllä. Massaltaan suuret ja hankalat kasvaimet voidaan parantaa esillä olevalla keksinnöllä. Hoito voidaan 5 antaa kasvaimensisäisesti, ontelonsisäisesti, laskimonsisäisesti ja käyttämällä näiden yhdistelmää. Hoitotapa voi antaa systeemisen tehon huolimatta paikal-lisinjektiosta. Hoitotapa voi myös tuhota solut, joiden oletetaan olevan kasvaimen aiheuttajia (’’syöpäkantasolut”).
5 Sen lisäksi, että keksinnön mukainen vektori mahdollistaa vektorin kuljettamisen kohdealueelle, se myös varmistaa siirtogeenin ilmentymisen ja pysyvyyden. Lisäksi vektorin ja siirtogeenin vastainen immuunivaste minimoituu.
Esillä oleva keksintö ratkaisee ongelman, joka liittyy perinteisten 10 hoitojen hoitoresistenssiin. Lisäksi esillä oleva keksintö tarjoaa keinoja ja menetelmiä selektiivisiä hoitoja varten aiheuttamatta toksisuutta tai vaurioita terveissä kudoksissa. Esillä olevan keksinnön etuja ovat myös erilaiset ja pienemmät sivuvaikutukset verrattuna muihin hoitoihin. Tärkeä seikka on, että hoitokeino on synergistinen monien muiden hoitomuotojen kanssa, mukaan lu-15 kien kemoterapia ja sädehoito, ja sitä voidaan siten käyttää yhdistelmähoito-ohjelmissa.
Immuunireaktion aiheuttaminen sellaisia soluja vastaan, jotka sallivat varustamattomien virusten replikaation, ei normaalisti ole riittävän voimakas saamaan aikaan terapeuttisen kasvainimmuniteetin kehittymisen. Tämän 20 heikkouden poistamiseksi esillä oleva keksintö tuottaa varustettuja viruksia, joissa on voimakas kasvaimenvastaisen immuniteetin aiheuttaja. Esillä oleva keksintö tuottaa syöpähoidon, jossa virionien aiheuttama onkolyysi tuhoaa kasvainsolut. Lisäksi keksintö vaikuttaa useisiin erilaisiin ihmisen immuunivastetta aktivoiviin mekanismeihin, kuten luonnollisten tappajasolujen (NK:iden) ja 25 dendriittisten solujen (DC:iden) aktivointiin.
Tunnetun tekniikan mukaisiin adenoviruskeinoihin verrattuna esillä oleva keksintö tarjoaa yksinkertaisemman, tehokkaamman, edullisemman, myrkyttömämmän ja/tai turvallisemman keinon syöpähoitoa varten. Lisäksi aut-tajaviruksia ei tarvita.
30 Keksinnön mukaiset uudet tuotteet mahdollistavat lisäparannuksia syöpähoitoon.
Kuvioiden lyhyt kuvaus
Kuvio 1 esittää kaavamaisesti Ad5-D24-GMCSF:ää. Viruksessa on 24 emäsparin deleetio E1A:n pysyvällä alueella 2. gp19k ja 6.7K E3:ssa on 35 korvattu ihmisen GM-CSF:n cDNA:lla. ADP viittaa adenoviruksen kuolemapro-teiiniin.
6
Kuvio 2 esittää kaavamaisesti kloonauksen ensimmäistä vaihetta, kun luodaan GM-CSF:ää kantava sukkulaplasmidi (pTHSN).
Kuvio 3 esittää kaavamaisesti kloonauksen toista vaihetta, kun luodaan plasmidi, joka sisältää kaikki adenovirusgeenit ja 24 emäsparin deleetion 5 E1-alueella (joka välittää syöpäsolujen selektiivisen replikaation).
Kuvio 4 esittää kaavamaisesti kloonauksen kolmatta vaihetta, kun luodaan plasmidi, joka sisältää kaikki adenovirusgeenit paitsi gp19k:n ja 6.7K:n, jotka on korvattu GM-CSF:llä (pAd5D24.GM-CSF). Ad5-RGD-D24-GMCSF, Ad5/3-D24-GMCSF ja Ad5-pK7-D24-GMCSF luotiin samalla tavalla. 10 Kuviot 5 esittävät, että GMCSF:n ilmentyminen ei estä viruksen rep- likaatiota ja soluntappovaikutusta. Kuvio 5a esittää tulokset MTS-määrityksestä, joka esittää keuhkosyövän (A549) soluntappotehoa uudella luodulla Ad5-D24-GMCSF-viruksella. Kuvio 5b esittää tulokset MTS-määrityksestä, joka esittää syöpää aiheuttavien JIMT-1-solujen (’’syöpäkan-15 tasolujen”) tappamista Ad5-D24-GMCSF:llä. Kuvio 5c esittää tulokset MTS-määrityksestä, joka esittää rintasyöpäsolujen (MDA-MB-436) tappotehoa uudella luodulla Ad5-D24-GMCSF-viruksella. Kuvio 5d esittää tulokset MTS-määrityksestä, joka esittää MDA-MB-436:n tappotehoa uusilla luoduilla Ad5-D24-GMCSF-, Ad5-RGD-D24-GMCSF- ja Ad5/3-D24-GMCSF-viruksilla.
20 Kuvio 6a esittää adenovirukseen yhdistettyä ihmisen GMCSF:n il mentymistä. A549-solulinja infektoitiin Ad5D24:llä tai Ad5D24-GMCSF:llä, kas-vatusliuosta kerättiin ajan kuluessa ja GMCSF:n ilmentymistä analysoitiin FAC-SARRAYIIa.
Kuvio 6b esittää, että adenovirusilmennetty GMCSF säilyttää biolo-25 gisen aktiivisuutensa ihmisen lymfosyyteissä. TF1 -soluja, jotka tarvitsevat ihmisen GMCSF:ää pysyäkseen elossa, kasvatettiin ihmisen rekombinantti-GMCSF:n (E. coli:ssa tuotettu, ostopaikka Sigma) tai Ad5-D24-GMCSF:llä in-fektoitujen solujen supernatantin läsnä ollessa.
Kuviot 7a ja 7b esittävät in vitro -analyysin potilaan kasvaimen 30 transduktiosta Ad5-pohjaisen viruksen infektiviteetin testaamiseksi.
Kuvio 7c esittää ennusteen kasvaimen transduktiosta Ad5-D25-GMCSF:llä värjäämällä sen reseptori CAR (coxsackievirus-adenovirusreseptori) tallennetuissa kasvainnäytteissä.
Kuvio 8a esittää Ad5-D24-GMCSF:n in vivo -tehokkuuden syyrian-35 hamstereissa (joissa ihmisen adenoviruksen kykenee replikoitumaan), joissa on haimasyöpäkasvaimia. Sekä Ad5D24 että Ad5-D24-GMCSF poistavat kas- 7 vaimet 16 päivän sisällä hoitojen jälkeen. Virusta annettiin 1 x 109 viruspartik-kelia päivinä 0, 2 ja 4.
Kuvio 8b esittää, että kasvaimensisäinen injektio Ad5-D24-GMCSF:ää johti korkeisiin hGMCSF-tasoihin syyrianhamstereiden seerumissa.
5 Ad5D24E3:lla tai Ad5-D24-GMCSF:llä hoidetuista eläimistä otettiin näytteet päivänä 4 ja ihmis-GMCSF:n pitoisuus seerumissa analysoitiin FACSARRAYI-la.
Kuvio 8c esittää, että FlapTI -kasvainten parantaminen Ad5-D24-GMCSF:llä (mutta ei Ad5D24:llä) suojasi syyrianhamstereita myöhemmältä 10 FlapTI-uudelleenaltistukselta. Tämä osoittaa, että Ad5-D24-GMCSF voi aiheuttaa kasvainspesifisen immuunivasteen. Ad5D24:llä tai Ad5D24-GMCSF:llä (kuvio 8a) aiemmin hoidetut eläimet altistettiin uudelleen samalle kasvaimelle ja kasvaimen kasvua mitattiin ajan kuluessa.
Kuvio 8d esittää, että kasvainspesifisen immuunivasteen aiheutta-15 minen Ad5-D24-GMCSF:llä, FlapTI-kasvainten parantaminen Ad5-D24-GMCSF:llä ei suojannut syyrianhamstereita Flak-kasvaimilta. Eläimiä, joiden FlapTI-kasvaimia oli aiemmin hoidettu Ad5D24:llä tai Ad5D24-GMCSF:llä (kuvio 8a), altistettiin uudelleen eri kasvaimelle ja kasvaimen kasvua mitattiin ajan kuluessa.
20 Kuvio 9a esittää Ad5-D24-GMCSF:n tehon yhdessä metronomisen oraalisen syklofosfamidin kanssa. Tietokonetomografialla havaittiin kasvaimen pieneneminen 88 %:lla 71 päivää hoidon aloittamisen jälkeen.
Kuvio 9b esittää Ad5-D24-GMCSF-hoidon tehon sillä hoidetulla munasarjasyöpäpotilaalla. Tietokonetomografia osoitti kaikkien mitattavissa olevi-25 en kasvainten täydellisen katoamisen (osoitettu nuolella).
Kuviot 10a-d esittävät, että Ad5-D24-GMCSF sai aikaan T-soluvasteen sekä kasvainepitoopeille että adenovirukselle (läsnä kasvainso-luissa). Ad5-D24-GMCSF:llä hoidetuista potilaista kerätyt T-solut analysoitiin IFN-gamma-ELISPOT:illa Adenovirus 5:stä saadulla peptidisekoituksella ja 30 kasvainantigeenistä survivin saadulla peptidisekoituksella aikaansaadun stimulaation yhteydessä.
Kuvio 11 esittää adenoviruksen heksoniproteiinille spesifisten T-solujen induktiota. Ad5-D24-GMCSF:llä hoidetuista potilaista kerätyt leukosyytit värjättiin CD3:lla, CD8:lla ja heksonispesifisillä tetrameerivasta-aineilla ja 35 analysoitiin virtaussytometrialla ennen hoitoa ja sen jälkeen. Floito lisäsi hek-sonispesifisiä sytotoksisia T-soluja 0,21 prosentista 2,72 prosenttiin.
8
Kuvio 12 esittää verenkierrossa kiertävien regulatoristen T-solujen vähenemisen potilaassa R73. CD4:lle positiivisten, CD127:lle negatiivisten, mutta paljon Foxp3:a sisältävien PBCM:ien katsotaan olevan tehokkaita regu-latorisia T-soluja.
5 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Adenovirusvektori
Ad5:ssä, kuten myös muissa adenoviruksissa, ikosahedraalinen kapsidi koostuu kolmesta pääproteiinista: heksonista (II), penton base -proteiinista (III) ja ulokkeisesta säikeestä (IV), lisäksi siinä on pieniä proteiine-10 ja; VI, Vili, IX, lila ja IVa2 (Russel W. C. 2000, J General Virol 81,2573-2604). Proteiinit VII, pienpeptidi mu ja terminaaliproteiini (TP) ovat liittyneinä DNA:han. Proteiini V tarjoaa rakennelinkin kapsidiin proteiinin VI välityksellä. Viruksen koodaama proteaasi tarvitaan joidenkin rakenneproteiinien käsittelyä varten.
15 Esillä olevan keksinnön mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori perustuu adenovirusserotyypin 5 (Ad5:n) nukleiinihappopääketjuun, 24 emäs-parin deleetioon (D24) E1 :n Rb:tä sitovalla pysyvällä alueella 2 (CR2:lla) ja nukleiinihapposekvenssiin, joka koodaa granulosyytti-makrofagien kolonisaatiota stimuloivaa tekijää (CM-CSF:ää) deletoidun gp19k/6.7K:n tilalla E3-20 alueella (kuvio 1).
Ad5-genomi sisältää varhaisvaiheen (E1-4), keskivaiheen (IX ja IVa2) ja myöhäisvaiheen geenejä (L1 —5), joiden vasemmalla ja oikealla puolella on invertoituneita terminaalisia toistoja (LITR:iä ja vastaavasti RITR:iä), jotka sisältävät DNA:n replikaatioon tarvittavia sekvenssejä. Genomi sisältää myös 25 pakkaussignaalin (Ψ) ja MLP:n (major late promoter).
Varhaisvaiheen geenin E1A transkriptio aloittaa replikaatiosyklin, jonka jälkeen E1B-, E2A-, E2B-, E3- ja E4-proteiinit ilmentyvät. E1-proteiinit moduloivat solun metaboliaa tavalla, joka tekee solusta alttiimman virusrepli-kaatiolle. Esimerkiksi ne häiritsevät NF-κΒ-, p53- ja pRb-proteiineja. E1A ja 30 E1B estävät yhdessä apoptoosia. E2- (E2A- ja E2B-) ja E4-geenituotteet välittävät DNA:n replikaatiota ja E4-tuotteet vaikuttavat myös viruksen RNA-metaboliaan ja estävät isännän proteiinisynteesiä. E3-geenituotteet vastaavat puolustautumisesta isännän immuunijärjestelmää vastaan, edistävät solun lyy-saantumista ja virusjälkeläisten vapautumista (Russel W. C. 2000, J General 35 Virol 81,2573-2604).
9
Keskivaiheen geenit IX ja IVa2 koodaavat viruskapsidin pieniä proteiineja. MLP vaikuttaa myöhäisvaiheen geenien L1-5 ilmentymiseen, joka johtaa viruksen rakennekomponenttien tuotantoon, viruspartikkeleiden kapsidoi-tumiseen ja kypsymiseen tumassa (Russel W. C. 2000, J General Virol 81, 5 2573-2604).
Verrattuna villityypin adenovirusgenomiin keksinnön mukaisesta adenovirusvektorista puuttuu 24 emäsparia CR2:sta E1-alueella, tarkemmin E1A-alueella, ja gp19k ja 6.7K E3-alueella. Eräässä keksinnön edullisessa so-vellusmuodossa osittaisten E1-ja E3-alueiden lisäksi keksinnön mukainen on-10 kolyyttinen adenovirusvektori käsittää lisäksi yhden tai useamman alueen, jotka valitaan ryhmästä, joka koostuu E2:sta, E4:stä ja myöhäisvaiheen alueista. Eräässä keksinnön edullisessa sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää seuraavat alueet: vasen ITR, osittainen E1, pIX, plVa2, E2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4, osittainen E3, L5, E4 ja oikea ITR. Alueet voivat olla 15 vektorissa missä tahansa järjestyksessä, mutta eräässä keksinnön edullisessa sovellusmuodossa alueet ovat peräkkäisessä järjestyksessä 5’-3’-suunnassa. Avoimet lukukehykset (ORF:t) voivat olla samassa DNA-juosteessa tai eri DNA-juosteissa. Eräässä keksinnön edullisessa sovellusmuodossa E1-alue käsittää viruksen pakkaussignaalin.
20 Tässä yhteydessä ilmaisu ’’adenovirusserotyypin 5 (Ad5) nukleiini- happopääketju” tarkoittaa Ad5:n genomia tai osagenomia, joka käsittää yhden tai useampia alueita, jotka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat Ad5:stä peräisin olevat osittainen E1, pIX, plVa2, E2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4, osittainen E3, L5 ja E4.
25 Tässä yhteydessä ilmaisu ’’osittainen” alue tarkoittaa aluetta, josta puuttuu jokin osa verrattuna vastaavaan villityypin alueeseen. Osittainen E1” tarkoittaa E1 -aluetta, jossa on D24, ja ’’osittainen E3” viittaa E3-alueeseen, josta puuttuu gp19k/6.7K.
Tässä yhteydessä ilmaisut ”VA1” ja ”VA2” tarkoittavat virukseen liit-30 tyviä RNA:ita 1 ja 2, jotka adenovirus transkriptoi mutta jotka eivät translatoidu. VA1:llä ja VA2:lla on osuutensa solun puolustusmekanismeja vastaan taistelemisessa.
Tässä yhteydessä ilmaisu ’’viruksen pakkaussignaali” tarkoittaa viruksen DNA:n osaa, joka koostuu sarjasta AT-rikkaita sekvenssejä ja ohjaa 35 kapsidoitumisprosessia.
10 E1:n 24 emäsparin deleetio (D24) vaikuttaa CR2-alueeseen, joka vastaa Rb-tuumorisuppressori/solusyklinsäätelyproteiinin sitomisesta ja siten sallii synteesivaiheen (S), eli DNA-synteesi- tai replikaatiovaiheen, käynnistymisen. pRb:n ja E1A:n vuorovaikutus edellyttää E1A-proteiinin konservoitu-5 neen alueen kahdeksaa aminohappoa 121-127 (Heise C. et ai. 2000, Nature Med 6, 1134-1139), jotka deletoidaan esillä olevassa keksinnössä. Esillä olevan keksinnön mukainen vektori käsittää niiden nukleotidien deleetion, jotka vastaavat Heise C. et al.:n (2000, Nature Med 6, 1134-1139) vektorin aminohappoja 122-129. D24:n sisältävillä viruksilla tiedetään olevan alentunut kyky 10 ohittaa G1-S-tarkistuspiste ja replikoitua tehokkaasti vain soluissa, joissa tämä vuorovaikutus ei ole tarpeen, esimerkiksi kasvainsoluissa, joissa on viallinen Rb-p16-reitti (Heise C. et ai. 2000, Nature Med 6, 1134-1139; Fueyo J. et ai. 2000, Oncogene 19, 2-12).
E3-alue ei ole olennainen in vitro -virusreplikaatiossa, mutta E3-15 proteiineilla on tärkeä osa isännän immuunivasteen säätelyssä, toisin sanoen sekä luontaisen että spesifisten immuunivasteiden estämisessä. gp19k/6.7K-deleetio E3:ssa tarkoittaa 965 emäsparin deleetiota adenoviruksen E3A-alueella. Seurauksena olevassa adenovirusrakenteessa sekä gp19k- että 6.7K-geenit ovat deletoituneet (Kanerva A. et ai. 2005, Gene Therapy 12, 87-20 94). gp19k-geenituotteen tiedetään sitovan ja houkuttelevan MHC1- molekyylejä (major histocompatibility complex I) solulimakalvostossa ja estävän sytotoksisia T-lymfosyyttejä tunnistamasta infektoituneita soluja. Koska monissa kasvaimissa on MHC1-vajetta, gp19k:n deleetio parantaa virusten kasvainselektiivisyyttä (virus poistetaan nopeammin kuin villityypin virus nor-25 maaleista soluista, mutta kasvainsoluissa ei ole eroa). 6.7K-proteiinit ilmentyvät solun pinnoilla ja osallistuvat TNF:n kaltaisen apoptoosia indusoivan ligan-din (TRAIL) reseptoriin 2 dovvn-regulaatioon.
Esillä olevassa keksinnössä GM-CSF-siirtogeeni sijoitetaan gp19k/6.7k-deletoidulle E3-alueelle E3-promoottorin alaisuuteen. Tämä rajoit-30 taa siirtogeenin ilmentymistä kasvainsoluihin, jotka sallivat viruksen replikaati-on, ja sen jälkeisen E3-promoottorin aktivoinnin. E3-promoottori voi olla mikä tahansa alalla tunnettu eksogeeninen tai endogeeninen promoottori, mieluiten endogeeninen promoottori. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa GM-CSF:ää koodaava nukleiinihapposekvenssi on viruksen E3-promoottorin 35 säätelyn alainen.
11 GM-CSF osallistuu immuunivasteeseen erilaisten mekanismien kautta, mukaan lukien luonnollisten tappajasolujen (NK:iden) rekrytointi ja APC-solujen (antigeeniä esittelevät solut) stimulaatio. APC voi tämän jälkeen rekrytoida, aktivoida ja kohdistaa T-soluja kasvaimeen. GM-CSF:ää koodaava 5 nukleotidisekvenssi voi olla lähtöisin mistä tahansa eläimestä, esimerkiksi ihmisestä, apinasta, rotasta, hiirestä, hamsterista, koirasta tai kissasta, mutta edullisesti GM-CSF:ää koodaa ihmisen sekvenssi. GM-CSF:ää koodaava nukleotidisekvenssi voi olla modifioitu GM-CSF:n vaikutusten parantamiseksi tai modifioimaton, toisin sanoen villityyppinen. Keksinnön eräässä edullisessa so-10 vellusmuodossa GM-CSF:ää koodaava nukleiinihapposekvenssi on villityyppinen.
Keksinnön mukainen vektori voi myös käsittää muita modifikaatioita kuin CR2:n ja E3:n osittaisia deleetioita ja GM-CSF-sekvenssin insertion edellä mainitun mukaisesti. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa kaikki 15 muut Ad5-vektorin alueet ovat villityyppisiä. Keksinnön eräässä toisessa edullisessa sovellusmuodossa E4-alue on villityyppinen. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa E1-alueen ylävirrassa on villityypin alue. ’’Ylävirta” tarkoittaa välittömästi ennen E1-aluetta ilmentymissuunnassa. E1B-alue voi myös olla modifioitu keksinnön mukaisessa vektorissa.
20 Eksogeenisten elementtien insertio voi vahvistaa vektoreiden vaiku tuksia kohdesoluissa. Eksogeenisen kudoksen tai kasvainspesifisten promoot-toreiden käyttö on yleistä rekombinanttiadenovirusvektoreissa, ja niitä voidaan myös hyödyntää esillä olevassa keksinnössä. Esimerkiksi virusreplikaatio voidaan rajoittaa kohdesoluihin esimerkiksi promoottoreilla, joita ovat näihin rajoit-25 tumatta CEA, SLP, Cox-2, Midkine, hTERT, hTERTin variantit, E2F, E2F:n variantit, CXCR4, SCCA2 ja TTS. Ne yleensä lisätään säätelemään E1A-aluetta, mutta lisäksi tai vaihtoehtoisesti voidaan myös säädellä muita geenejä, kuten E1B:tä tai E4:ää. Eksogeenisia insulaattoreita, toisin sanoen epäspesifisten voimistajien (enhancer) estoelementtejä, vasenta ITR:ää, natiivia E1A-30 promoottoria tai kromaatiiniproteiineja voidaan myös sisällyttää rekombinant-tiadenovirusvektoreihin. Valinnaisesti esillä olevan keksinnön mukaisissa vektoreissa voidaan käyttää mitä tahansa lisäkomponentteja tai -modifikaatioita, mutta ne eivät ole pakollisia.
Useimmat aikuiset ovat altistuneet laajimmin käytetylle adenovirus-35 serotyypille Ad5 ja siksi immuunijärjestelmä kykenee nopeasti tuottamaan neutraloivia vasta-aineita (NAb:tä) sitä vastaan. Itse asiassa anti-Ad5-NAb:n 12 prevalenssi voi olla jopa 50 %. On osoitettu, että NAb voidaan käynnistää useimpia adenoviruskapsidin immunogeenisiä proteiineja vastaan, ja toisaalta on osoitettu, että jopa pienet muutokset Ad5:n säieulokkeessa voivat sallia paon kapsidikohtaiselta NAb:lta. Siten ulokkeen modifioiminen on tärkeää 5 geeninsiirron ylläpitämiseksi tai lisäämiseksi käytettäessä adenoviruskontaktia ihmisissä.
Lisäksi Ad5:n tiedetään sitoutuvan CAR:ksi kutsuttuun reseptoriin säikeen ulokeosuuden välityksellä ja tämän ulokeosuuden tai säikeen modifikaatiot voivat parantaa kohdesoluun pääsyä ja aiheuttaa vahvistetun onkolyy-10 sin joissakin syövissä (Ranki T. et ai. 2007, Int J Cancer 121, 165-174). Kap-sidimodifioidut adenovirukset ovatkin edullisia välineitä parannetulle geeninsiirrolle syöpäsoluihin.
Keksinnön eräässä sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvek-tori käsittää kapsidimodifikaation. Tässä yhteydessä ’’kapsidi” tarkoittaa viruk-15 sen proteiinikuorta, joka sisältää heksoni-, säie-ja pentoniemäsproteiineja. Mitä tahansa kapsidimodifikaatiota, toisin sanoen alalla tunnettua heksoni-, säie-ja/tai pentoniemäsproteiinien modifikaatiota, joka parantaa viruksen viemistä kasvainsoluun, voidaan hyödyntää esillä olevassa keksinnössä. Modifikaatiot voivat olla geneettisiä ja/tai fysikaalisia ja sisältää näihin rajoittumatta modifi-20 kaatioita, joilla lisätään ligandeja, jotka tunnistavat spesifisiä solureseptoreja ja/tai estävät natiiveja reseptoreja sitoutumasta, ja joilla korvataan adenovirus-vektorin säie- tai ulokealue toisen adenoviruksen ulokkeella (kimerismi) ja lisätään spesifisiä molekyylejä (esimerkiksi FGF2) adenoviruksiin. Näin ollen kap-sidimodifikaatiot sisältävät näihin rajoittumatta pien(t)en peptidimotiivi(e)n, pep-25 tidi(e)n, kimerismi(e)n tai mutaatio(ide)n lisäämisen säikeeseen (esimerkiksi uloke-, häntä- tai varsiosaan), heksoniin ja/tai penton base -yksikköön. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa kapsidimodifikaatio on Ad5/3-kimerismi, integriiniä sitovan alueen (RGD:n) insertio ja/tai hepariinisulfaattia sitovan polylysiinin modifikaatio säikeeseen.
30 Tässä yhteydessä kapsidin ”Ad5/3-kimerismi” tarkoittaa kimerismiä, jossa säikeen ulokeosa on Ad-serotyyppi 3:sta ja loppusäie on Ad-serotyyppi 5:stä.
Tässä yhteydessä ”RGD-alue” tarkoittaa arginiini-glysiini-asparagiinihappo (RGD) -motiivia, joka on paljastettuna penton base -yksikön 35 pinnalla ja toimii vuorovaikutteisesti adenoviruksen internalisaatiota tukevien solun αν-integriinien kanssa. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodos- 13 sa kapsidimodifikaatio on RGD-4C-modifikaatio. ”RGD-4C-modifikaatio” tarkoittaa säikeen ulokealueen Hl-silmukassa olevan integriiniä sitovan RGD-4C-motiivin insertiota. 4C tarkoittaa neljää kysteiiniä, jotka muodostavat rikkisiltoja RGD-4C:ssä. RGD-4C-peptidin sisältävää säiettä koodaavan rekombinantti-5 Ad5-säiegeenin rakentamista kuvataan yksityiskohtaisesti esimerkiksi Dmitriev I. et al:n artikkelissa (1998, Journal of Virology, 72, 9706-9713).
Tässä yhteydessä ’’heparaanisulfaattia sitova polylysiinimodifikaatio” tarkoittaa seitsemän lysiinin jakson lisäämistä säieulokkeen c-terminukseen.
Ekspressiokasetteja käytetään siirtogeenien ilmentämisessä koh-10 teessä, esimerkiksi solussa, käyttämällä vektoreita. Tässä yhteydessä ilmaisu ’’ekspressiokasetti” tarkoittaa DNA-vektoria tai sen osaa, joka käsittää cDNA:ita tai geenejä koodaavia nukleotidisekvenssejä tai kyseisten cDNA:iden tai geenien ilmentymistä ohjaavia ja/tai sääteleviä nukleotidisekvenssejä. Samanlaisia tai erilaisia ekspressiokasetteja voidaan insertoida yhteen vektoriin tai useam-15 paan erilaiseen vektoriin. Esillä olevan keksinnön mukaiset Ad5-vektorit voivat käsittää joko useita ekspressiokasetteja tai yhden kasetin. Vain yksi ekspressiokasetti on kuitenkin riittävä. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuo-dossa onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää ainakin yhden ekspres-siokasetin. Keksinnön eräässä sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirus-20 vektori käsittää vain yhden ekspressiokasetin.
Keksinnön mukaisen adenovirusvektorin käsittävä solu voi olla mikä tahansa solu, esimerkiksi eukaryoottisolu, bakteerisolu, eläinsolu, ihmissolu, hiirisolu ja niin edelleen. Solua voidaan esimerkiksi käyttää adenovirusvektorin tuottamiseen in vitro.
25 Menetelmässä GM-CSF:n tuottamiseksi solussa keksinnön mukai sen vektorin käsittävä kuljetin kuljetetaan soluun ja lisäksi GM-CSF-geeni ilmennetään ja proteiini translatoidaan ja sekretoidaan parakriinisesti. ’’Kuljetin” voi olla mikä tahansa virusvektori, plasmidi tai muu väline, kuten partikkeli, joka kykenee kuljettamaan keksinnön mukaisen vektorin kohdesoluun. Mitä tahan-30 sa alalla tunnettua tavanomaista menetelmää voidaan käyttää vektorin kuljettamisessa soluun.
Kasvainspesifistä immuunivastetta voidaan lisätä kohteessa käyttämällä esillä olevaa keksintöä. Sytotoksisia T-soluja ja/tai luonnollisia tappajasoluja stimuloidaan, tuotetaan ja kohdistetaan GM-CSF:n ilmentymisen seu-35 rauksena. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa luonnollisten tap- 14 pajasolujen ja/tai sytotoksisten T-solujen määrää lisätään kohdesolussa tai -kudoksessa. Keksinnön vaikutusten seuraamiseksi tai tutkimiseksi voidaan määritellä erilaisia immuunivasteen merkkiaineita (esimerkiksi inflammatorisia merkkiaineita). Yleisimpiä merkkiaineita ovat näihin rajoittumatta proinflamma-5 toristen sytokiinien ja kasvain- tai adenovirusspesifisten sytotoksisten T-solujen lisääntyminen, antigeenejä esittelevien solujen rekrytointi ja aktivointi tai paikallisten imusolmukkeiden suureneminen. Näiden merkkiaineiden tasoja voidaan tutkia minkä tahansa alalla tunnetun tavanomaisen menetelmän mukaisesti mukaan lukien mutta näihin rajoittumatta menetelmät, jotka hyödyntävät vasta-10 aineita, koettimia, alukkeita ja niin edelleen, esimerkiksi ELISPOT-määritys, tetrameerianalyysi, pentameerianalyysi ja veren tai kasvainten eri solutyyppien analyysi.
Syöpä
Keksinnön mukaiset rekombinantti-Ad5-vektorit on rakennettu repli-15 kaatiokompetenssin aikaansaamiseksi soluissa, joilla on virheitä Rb-reitillä, erityisesti Rb-p16-reitillä. Näitä virheellisiä soluja ovat kaikki kasvainsolut eläimissä ja ihmisissä (Sherr C. J. 1996, Science 274, 1672-1677). Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa vektori kykenee replikoitumaan selektiivisesti soluissa, joissa on virheitä Rb-reitissä. Tässä yhteydessä ’’virheet Rb-reitissä” 20 tarkoittavat mutaatioita ja/tai epigeneettisiä muutoksia missä tahansa reitin geeneissä tai proteiineissa. Näistä virheistä johtuen kasvainsolut yli-ilmentävät E2F:ää ja siten Rb:n sitoutuminen E1A CR2:een, mitä normaalisti tarvitaan tehokasta replikaatiota varten, on tarpeetonta.
Mitkä tahansa syövät tai kasvaimet, mukaan lukien pahanlaatuiset 25 ja hyvänlaatuiset kasvaimet sekä primäärikasvaimet ja metastaasit voivat olla geenihoitojen kohteena. Keksinnön eräässä erityisessä sovellusmuodossa syöpä on mikä tahansa kiinteä kasvain. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa syöpä valitaan ryhmästä, johon kuuluvat nasofaryngeaalinen syöpä, synoviaalinen syöpä, hepatosellulaarinen syöpä, munuaissyöpä, side-30 kudossyöpä, melanooma, keuhkosyöpä, suolistosyöpä, paksusuolen syöpä, peräsuolen syöpä, kolorektaalinen syöpä, aivosyöpä, kurkkusyöpä, suusyöpä, maksasyöpä, luusyöpä, haimasyöpä, istukkasyöpä, gastrinooma, feokromosy-tooma, prolaktinooma, T-soluleukemia/lymfooma, neurooma, von hippel-lindaun tauti, zollinger-ellisonin oireyhtymä, lisämunuaissyöpä, anaalinen syö-35 pä, sappitien syöpä, virtsarakon syöpä, virtsajohtimen syöpä, aivosyöpä, oligo-dendrogliooma, neuroblastooma, meningiooma, selkäydinkasvain, luusyöpä, 15 osteokondrooma, kondrosarkooma, Ewingin sarkooma, tuntemattoman pri-määrisijainnin syöpä, karsinoidi, maha-suolikanavan karsinoidi, fibrosarkooma, rintasyöpä, Pagetin tauti, kohdunkaulan syöpä, kolorektaalinen syöpä, peräsuolen syöpä, ruokatorven syöpä, sappirakon syöpä, pään syöpä, silmäsyö-5 pä, niskasyöpä, munuaissyöpä, Wilmsin kasvain, maksasyöpä, Kaposin sarkooma, eturauhassyöpä, keuhkosyöpä, kivessyöpä, Hodgkinin tauti, non-Hodgkinin lymfooma, suusyöpä, ihosyöpä, mesoteliooma, multippeli myeloo-ma, munasarjasyöpä, endokriininen haimasyöpä, glukagonooma, haimasyöpä, paratyroidinen syöpä, penissyöpä, aivolisäkesyöpä, pehmytkudossarkooma, 10 retinoblastooma, ohutsuolisyöpä, mahalaukkusyöpä, kateenkorvasyöpä, kilpi-rauhassyöpä, trofoblastisyöpä, rypäleraskaus, kohtusyöpä, endometriaalinen syöpä, emätinsyöpä, ulkosynnytinsyöpä, akustikus neurinooma, mucosis fun-goides, insulinooma, karsinoidioireyhtymä, somatostatinooma, iensyöpä, sy-dänsyöpä, huulisyöpä, kalvosyöpä, suusyöpä, hermosyöpä, suulakisyöpä, kor-15 vasylkirauhassyöpä, vatsakalvosyöpä, nielusyöpä, pleuraalinen syöpä, sylki-rauhassyöpä, kielisyöpä, risasyöpä.
Farmaseuttinen koostumus
Keksinnön mukainen farmaseuttinen koostumus käsittää ainakin yhtä keksinnön mukaista vektorityyppiä. Lisäksi koostumus voi käsittää ainakin 20 kahta, kolmea tai neljää keksinnön mukaista eri vektoria. Keksinnön mukaisen vektorin lisäksi farmaseuttinen koostumus voi myös käsittää muita vektoreita kuten muita adenovirusvektoreita, muita terapeuttisesti tehokkaita aineita, muita aineita kuten farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantoaineita, puskureita, apuaineita, adjuvantteja, antisepteja, täyte-, stabilointi- tai sakeutusaineita ja/tai mitä 25 tahansa komponentteja, joita on normaalisti vastaavissa tuotteissa.
Farmaseuttinen koostumus voi olla muodoltaan millainen tahansa annettavaksi sopiva koostumus, esimerkiksi kiinteä, puolikiinteä, tai nestemäinen. Formulaatio voidaan valita ryhmästä, joka koostuu näihin kuitenkaan rajoittumatta liuoksista, emulsioista, suspensioista, tableteista, pelleteistä ja kap-30 seleista.
Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus toimii in situ -syöpärokotteena. Tässä yhteydessä ”in situ -syöpärokote” tarkoittaa syöpärokotetta, joka sekä tappaa kasvainsoluja että lisää immuunivastetta kasvainsoluja vastaan. Virus-35 replikaatio on voimakas vaaranmerkki immuunijärjestelmälle (tarpeellinen TH1-tyyppiselle vasteelle) ja toimii siten voimakkaana kostimulatorisena ilmiö- 16 nä APC:iden GM-CSF-välitteiselle kypsymiselle ja aktivoinnille ja NK-solujen rekrytoinnille. Kasvainsolujen lyysis auttaa myös esittämään kasvainfragment-teja ja -epitooneja APC:illeja lisäksi inflammaatio tuottaa kostimulaatiota. Siten epitooppiriippumaton (eli ei HLA-rajoitettu) vaste tuotetaan kussakin kas-5 vaimessa ja näin ollen tapahtuu in situ. Kasvainspesifinen immuunivaste aktivoituu kohdesolussa ja ympäröivissä soluissa, esimerkiksi kohdekudoksessa.
Vektoreiden tehokas annos riippuu ainakin hoitoa tarvitsevasta kohteesta, kasvaimen tyypistä, kasvaimen sijainnista ja kasvaimen vaiheesta. Annos voi vaihdella esimerkiksi noin 10e8 viruspartikkelista (VP:stä) noin 10e14 10 VP:hen, edullisesti noin 5x10e9 VP:stä noin 10e13 VP:hen ja edullisemmin noin 8x10e9 VP:stä noin 10e12 VP:hen. Keksinnön eräässä erityisessä sovel-lusmuodossa annos on noin 5x10e10-5x10e11 VP.
Farmaseuttisia koostumuksia voidaan tuottaa millä tahansa alalla tunnetulla tavanomaisella prosessilla, esimerkiksi hyödyntämällä jotakin seu-15 raavista: erä-, panossyöttö- ja perfuusiokasvatusmoodit, pylväskromatogra-diapuhdistus, CsCI-gradienttipuhdistus ja perfuusiomoodit leikkausteholtaan alhaisissa soluretentiolaitteissa.
Anto
Keksinnön mukainen vektori tai farmaseuttinen koostumus voidaan 20 antaa mihin tahansa eukaryoottiseen kohteeseen, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu kasveista, elämistä ja ihmisistä. Keksinnön eräässä edullisessa so-vellusmuodossa kohde on ihminen tai eläin. Eläin voidaan valita ryhmästä, joka koostuu lemmikkieläimistä, kotieläimistä ja tuotantoeläimistä.
Vektorin tai koostumuksen antamisessa kohteeseen voidaan käyt-25 tää mitä tahansa tavanomaista menetelmää. Antoreitti riippuu koostumuksen formulaatiosta tai muodosta, taudista, kasvainten sijainnista, potilaasta, liitännäissairauksista ja muista tekijöistä. Keksinnön eräässä edullisessa sovellus-muodossa anto tapahtuu kasvaimensisäisellä, lihaksensisäisellä, valtimonsisäisellä, laskimonsisäisellä, keuhkopussinsisäisellä, rakkulansisäisellä, onte-30 lonsisäisellä tai peritoneaalisella injektiolla tai suun kautta.
Jo yhdellä keksinnön mukaisen onkolyyttisen adenovirusvektorin antamisella voidaan saada hoitovaikutuksia. Onkolyyttisiä adenovirusvektoreita tai farmaseuttisia koostumuksia voidaan kuitenkin antaa myös useita kertoja hoitojakson aikana. Onkolyyttiset adenovirusvektorit tai farmaseuttiset koostu-35 mukset voidaan antaa esimerkiksi 1-10 kertaa kahden ensimmäisen viikon aikana, neljän viikon ensimmäisen aikana, kuukausittain tai hoitojakson aikana.
17
Esimerkiksi niitä annetaan 3-7 kertaa kahden ensimmäisen viikon aikana, sitten neljännellä viikolla ja sitten kuukausittain. Niitä voidaan myös antaa neljä kertaa kahden ensimmäisen viikon aikana, sitten neljännellä viikolla ja sitten kuukausittain. Hoitojakson pituus voi vaihdella ja kestää esimerkiksi 2-12 kuu-5 kautta tai enemmän.
Jotta vältetään neutraloivat vasta-aineet kohteessa, keksinnön mukaiset vektorit voivat vaihdella hoitojen välillä. Esimerkiksi kohteelle annetaan onkolyyttistä adenovirusvektoria, jossa on erilainen kapsidin säieuloke aiemman hoidon vektoriin nähden. Tässä yhteydessä ’’kapsidin säieuloke” tarkoittaa 10 säieproteiinin ulokeosaa (kuvio 1).
Geenihoito on tehokas yksinäänkin, mutta adenovirusgeenihoidon yhdistäminen jonkin toisen hoidon, esimerkiksi perinteisen hoidon, kanssa voi olla tehokkaampi kuin kumpikaan yksin. Esimerkiksi yhdistelmähoidon jokainen aine voi toimia itsenäisesti kasvainkudoksessa, adenovirusvektorit voivat her-15 kistää soluja kemoterapialle tai sädehoidolle ja/tai kemoterapia-aineet voivat voimistaa virusreplikaation tasoa tai vaikuttaa kohdesolujen reseptoristatuk-seen. Yhdistelmähoidon aineet voidaan antaa samanaikaisesti tai peräkkäin.
Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa käyttö käsittää lisäksi rinnakkaisen sädehoidon antamisen kohteelle. Keksinnön eräässä toi-20 sessa edullisessa sovellusmuodossa käyttö käsittää lisäksi rinnakkaisen kemo-terapian antamisen kohteelle. Tässä yhteydessä ’’rinnakkainen” tarkoittaa hoitoa, joka on annettu ennen, jälkeen tai samanaikaisesti keksinnön mukaisen geenihoidon kanssa. Rinnakkaishoidon jakso voi vaihdella minuuteista useisiin viikkoihin. Edullisesti rinnakkaishoito kestää joitakin tunteja.
25 Yhdistelmähoitoon sopivia aineita ovat näihin kuitenkaan rajoittu matta All-trans retiinihappo, Azacitidine, Azathioprine, Bleomycin, Carboplatin, Capecitabine, Cisplatin, Chlorambucil, Cyclophosphamide, Cytarabine, Dauno-rubicin, Docetaxel, Doxifluridine, Doxorubicin, Epirubicin, Epothilone, Eto-poside, Fluorouracil, Gemcitabine, Hydroxyurea, Idarubicin, Imatinib, Mechlo-30 rethamine, Mercaptopurine, Methotrexate, Mitoxantrone, Oxaliplatin, Paclita-xel, Pemetrexed, Temozolomide, Teniposide, Tioguanine, Valrubicin, Vinblastine, Vincristine, Vindesine ja Vinorelbine.
18
Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa käyttö käsittää lisäksi verapamiilin tai jonkin muun kalsiumkanavansalpaajan antamisen kohteelle. ’’Kalsiumkanavansalpaaja” tarkoittaa luokkaa lääkkeitä ja luonnonaineita, jotka häiritsevät kalsiumkanavien johtumista, ja se voidaan valita ryhmästä, 5 joka koostuu verapamiilista, dihydropyridiineistä, gallopamiilista, diltiatseemis-ta, mibefradiilista, bepridiilista, fluspirileenista ja fendiliinista.
Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa käyttö käsittää lisäksi autofagian käynnistävien aineiden antamisen kohteelle. Autofagia tarkoittaa katabolista prosessia, jossa solun omat komponentit hajoavat lysosomaali-10 sen koneiston kautta. ’’Autofagian käynnistävät aineet” tarkoittavat aineita, jotka kykenevät käynnistämään autofagian ja jotka voidaan valita ryhmästä, joka koostuu näihin kuitenkaan rajoittamatta mTOR-inhibiittoreista, PI3K-inhibiitto-reista, litiumista, tamoksifeenista, klorokiinista, bafilomysiinista, temsirolimuk-sesta, sirolimuksesta ja temotsolomidista. Keksinnön eräässä erityisessä so-15 vellusmuodossa menetelmä käsittää lisäksi temotsolomidin antamisen kohteelle. Temotsolomidi voi olla joko oraalista tai laskimonsisäistä temotsolomidia.
Keksinnön eräässä sovellusmuodossa käyttö käsittää lisäksi kemo-terapian tai anti-CD20-hoidon tai muun neutraloivia vasta-aineita estävän hoidon antamisen. ”Anti-CD20-hoito” tarkoittaa aineita, jotka kykenevät tappa-20 maan CD20-positiviisia soluja ja jotka voidaan valita ryhmästä, joka koostuu rituksimabista ja muista monoklonaalisista anti-CD20-vasta-aineista. ’’Neutraloivia vasta-aineita estävä hoito” tarkoittaa aineita, jotka kykenevät estämään normaalisti infektion seurauksena muodostuvien antiviraalisten vasta-aineiden kehittymisen ja jotka voidaan valita ryhmästä, joka koostuu eri kemoterapia-25 aineista, immunomodulatorisista aineista, kortikoideista ja muista lääkkeistä. Nämä aineet voidaan valita ryhmästä, joka koostuu näihin kuitenkaan rajoittumatta syklofosfamidista, syklosporiinista, atsatiopriinista, metyyliprenisolonista, etoposidista, CD40L:stä, CTLA4lg4:stä, FK506:sta (takrolismuksesta), IL-12:sta, IFN-gammasta, interleukiini 10:stä, anti-CD8:sta, anti-CD4-vasta-ai-30 neista, myeloablaatiosta ja oraalisista adenovirusproteiineista.
Keksinnön mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori käynnistää kasvainsolujen virionivälitteisen onkolyysin ja aktivoi ihmisen immuunivasteen kasvainsoluja vastaan. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa käyttö käsittää lisäksi sellaisten aineiden annon, jotka kykenevät down-regu-35 loimaan regulatorisia T-soluja kohteessa. ’’Regulatoristen T-solujen down-regu- 19 laatioon kykenevät aineet” tarkoittavat aineita, jotka pienentävät estäjä-T-soluiksi tai regulatorisiksi T-soluiksi tunnistettujen solujen määrää. Näiden solujen on tunnistettu sisältävät yhtä tai useaa seuraavista immunofenotyyppi-merkkiaineista: CD4+, CD25+, FoxP3+, CD127- ja GITR+. Tällaiset estäjä-T-5 solujen tai regulatoristen T-solujen määrää pienentävät aineet voidaan valita ryhmästä, joka koostuu anti-CD25-vasta-aineista tai kemoterapia-aineista.
Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa käyttö käsittää lisäksi syklofosfamidin antamisen kohteelle. Syklofosfamidi on yleinen kemote-rapia-aine, jota on myös käytetty joissakin autoimmuunitaudeissa. Esillä ole-10 vassa keksinnössä syklofosfamidia voidaan käyttää voimistamaan virusrepli-kaatiota ja GM-CSF:n käynnistämän NK-solujen ja sytotoksisten T-solujen stimulaation vaikutuksia parannetun immuunivasteen saamiseksi kasvainta vastaan. Sitä voidaan käyttää laskimonsisäisinä bolusannoksina tai antaa suun kautta pieninä annoksina metronomisesti.
15 Seuraavat esimerkiksi havainnollistavat esillä olevaa keksintöä, mutta niitä ei ole tarkoitettu mitenkään rajoittaviksi.
Esimerkit
Esimerkki 1. Kolmen D24-GM-CSF-tyyppisen viruksen kloonaus - PCR-monista hGM-CSF ulos 20 - Luo Sunl/Munl-kohdat =^> 445 bp (pORF-GM-CSF templaattina) - PCR-tuotteen ja pTHSN:n Sunl/Munl-digestio - Toisiinsa tarttuvien päiden ligaatio => - Pmel-linearisoitu pShuttle-D24 + pTG3602 =^> pAd5-D24
- Ad5-D24-GM-CSF
25 Homol. rekomb.: S/fl-linearisoitu pAd5-D24 + Fspl-linearisoitu pTHSN-GM-CSF => pAd5-D24-GM-CSF Pacl-linearisaatio ja transfektio => Ad5-D24-GM-CSF.
Kaikki kloonausvaiheet varmistettiin PCR:llä ja useilla restriktiodi-gestioilla. pTHSN-GMCSF-sukkulaplasmidi sekvensoitiin. Villityypin E1 pois-30 saolo varmistettiin PCR:llä. E1-alue, siirtogeeni ja säie tarkistettiin lopullisesta viruksesta sekvensoimalla ja PCR:llä, ja se vietiin sitten puhdaslaboratorioon tuotantoa varten. Tätä varten virus-DNA ekstrahoitiin yön yli inkuboinnilla sopivalla puskuriliuoksella ja PCR:n jälkeen ja sekvensointi tehtiin säikeen ja GMCSF cDNA:n integriteetin analysoimiseksi. Virustuotannon, mukaan lukien 35 transfektio, kaikki vaiheet tehtiin A549-soluilla villityypin rekombinaation riskin 20 välttämiseksi aiemmin kuvatulla tavalla (Kanerva A. et ai. 2003, Mol Ther 8, 449-58; Baeurschmitz G. J. et ai. 2006, Mol Ther 14, 164-74). GM-CSF on E3-promoottorin alainen, mikä johtaa replikaatioon assosioituvien siirtogeenien ilmentymiseen, joka alkaa noin 8 h infektion jälkeen. E3 on koskematon lukuun 5 ottamatta 6.7K/gp19K\n deleetiota. Ad5/3-D24-GM-CSF ja Ad5-RGDD24-GM-CSF rakennettiin identtisesti paitsi, että käytettiin pelastajaplasmidia, jossa on joko serotyypin 3 uloke tai RGD-4C Ad5-säikeen Hl-silmukassa (kuviot 2-4).
Esimerkki 2. D24-GM-CSF-tyyppisten virusten in vitro -analyysi D24-GM-CSF-tyypin virusten in vitro -tehoa tutkittiin keuh-10 kosyöpäsoluissa (A549:ssä), rintasyöpäkantasoluista saaduissa eksplantaat-tisoluissa (JIMT-1:ssä) ja rintasyöpäsoluissa (MDA-MB-436:ssa) käyttämällä MTS-soluntappomäärityksiä. MTS-määritys on tällä hetkellä standardi menetelmä solun elinvoimaisuuden tutkimiseksi syövän geenihoitoon liittyvissä julkaisuissa. Ad5Luc1 on replikaatioon kykenemätön virus ja toimii negatiivisena 15 kontrollina. Ad5wt on villityypin Ad5-virus (Ad300wt-kanta) ja sitä käytettiin positiivisena kontrollina. Ad5-d24-E3:ssa on isogeeninen 24 emäsparin deleetio E1 :ssä, mutta sen E3 on koskematon. VP tarkoittaa viruspartikkeleita.
Lyhyesti sanottuna Ad5-D24-GMCSF:llä oli positiivisen kontrollin kaltaista onkolyyttistä aktiviteettia in vitro ja siksi siirtogeenin tuotanto ei hai-20 tannut viruksen onkolyyttistä tehoa (kuviot 5a-c). Samanlaiset tiedot saatiin Ad5/3-D24-GM-CSF:lle ja Ad5-RGD-D24-GM-CSF:lle (kuvio 5d).
Sen testaamiseksi, kykeneekö Ad5D24-GMCSF ilmentämään siirto-geeniä, A549-solulinja infektoitiin 1000 VP:llä per solu ja kasvatusliuosta kerättiin ajan kuluessa. GMCSF-pitoisuus (kuvio 6a) kasvatusliuoksessa mitattiin 25 FACSARRAYIIa. Tämän lisäksi me analysoimme myös sen, säilyttikö viruksen ilmentämä GMCSF biologisen toimintansa. Tätä varten TF1-solulinjaa, jonka kasvu ja elinkykyisyys ovat täysin riippuvaisia ihmisen GMCSF:stä, käsiteltiin aiemmin Ad5D24-GMCSF:llä infektoidusta A549-solulinjasta kerätyllä kasva-tusliuoksella. TF1:n elinkykyisyys arvioitiin ajan kuluessa MTS-määrityksellä. 30 Tämän kokeen tulos oli, että viruksen ilmentämä GMCSF kykeni stimuloimaan tällaisen solulinjan kasvua, eikä mitään eroa löytynyt verrattuna samaan solu-linjaan, jota käsiteltiin ihmisen rekombinantti-GMCSF:llä (Sigma) (kuvio 6b).
21
Esimerkki 3. Transduktion esikäsittelyanälyysi I. Kasvainsolujen infektointi Ad5Luc1:llä
Sen tarkistamiseksi, että kasvain voitiin infektoida Ad5-pohjaisilla viruksilla, kudoksista otetut koepalat homogenoitiin ja infektoitiin lusiferaasia 5 koodaavalla Ad5Luc1:llä infektoimisen standardiprotokollan mukaisesti. Solu siirrostettiin lyhyeksi aikaa PBS:llä kahdesti pestyyn kaivoon, virus sulatettiin ja suspensoitiin uudelleen minimimäärään kasvuliuosta ja kaadettiin hitaasti solujen päälle. Infektio jatkui 30 minuutin ajan ja sen jälkeen solut pestiin uudelleen PBS:llä ja lisättiin sopiva määrä täydellistä kasvuliuosta. Lusiferaasin kvantifi-10 kaatio määritettiin 24 tunnin kuluttua. Pyydämme huomaamaan, että kudosta saatiin vain hyvin pieni määrä, ja siksi solujen määrää ei voitu laskea eikä myöskään viruksen määrää normalisoida kudoksen määrään. Tästä syystä kvantitatiivisia analyysejä ei tehty, mutta kvalitatiivinen data osoitti onnistuneen geeninsiirron potilaissa 012 ja C3 (kuviot 7a-b). Lusiferaasin tausta-arvot 15 (noin 200 RLU) vähennettiin.
II. CAR:n immunohistokemiallinen värjäys
Potilaan kasvainten käytettävissä olevat arkistoidut näytteet kerättiin ja analysoitiin CAR:n (adenovirusserotyyppi 5:n reseptorin) ilmentymisen osalta immunohistokemialla. Syöpäsolujen sytoplasmojen (M3), tyhjäsuolen 20 adenokarsinooman (C3), haimakarsinooman (H7), karsinooman lobulaaristen infiltraatioiden (R8), munasarjasyövän maksametastaasin (012) ja synoviaa-lisarkooman keuhkometastaasin (S23) CAR-adenovirusreseptorin värjäykset on esitetty kuviossa 7c.
Esimerkki 4. D24-GM-CSF-tyypin virusten in vivo -analyysi eläimissä 25 Ad5-D24-GM-CSF:n in vivo -tehokkuus testattiin immuunikompeten- teissa syyrianhamstereissa, jotka ovat semipermissiivisiä ihmisen adenovirus-replikaatiolle (hiiret ovat ei-permissiivisiä) (Ying B. et ai. 2009, Cancer Gene Ther doi:10.1038/cgt.2009.6.). 7*106 HapT1-haimasyöpäsoluja injektoitiin ihonalaisesti ja 1*109 viruspartikkelia (VP) Ad5-D24-GM-CSF:ää tai 30 Ad5D24E3:a (joka ei ilmennä GM-CSF:ää) injektoitiin kasvaimensisäisesti päivinä 0, 2 ja 4. Vertailuryhmään injektoitiin sama määrä kasvuliuosta samoina aikoina. Kuvio 8b esittää, että Ad5-D24-GMCSF:n kasvaimensisäiset injektiot johtivat korkeisiin hGM-CSF:n tasoihin syyrianhamstereiden seerumissa. Ihmisen GM-CSF:n tiedetään olevan aktiivinen syyrianhamstereissa (Oho, Exp To-35 xicol Pathol 2006 voi. 57 (4) s. 321-8). Oli kiinnostavaa, että kaikki eläimet oli- 22 vat kasvaimettomia päivään 16 mennessä lukuun ottamatta vertailuryhmää (kuvio 8a). Kasvainarpia analysoitiin vielä kahden viikon ajan, jotta nähtäisiin uusiutuisiko kasvain. Päivänä 32 ei näissä eläimissä kuitenkaan edelleenkään ollut merkkejä kasvaimesta, joten kokeen ensimmäinen osa päätettiin ja vertai-5 luryhmän eläimille tehtiin eutanasia. Jäljellä olevat hoidetut eläimet altistettiin tässä vaiheessa samalle kasvaimelle antamalla ihonalainen injektio 7*106 HapT1-soluja ylävartalon oikealle puolelle, kun taas vasemmalle puolelle annettiin eri kasvainta (1*106 HaK-kasvainta), joille eläimet olivat naiiveja. Kasvaimen kasvua mitattiin ajan kuluessa ja tulokset esitetään kuvioissa 8c-d. Oli 10 kiinnostavaa, että aiemmin Ad5D24GMCSF:llä hoidetut eläimet eivät kärsineet ollenkaan HapT1-kasvaimista, kun taas Hak-kasvaimet kasvoivat normaalisti samalla kun aiemmin Ad5D24E3:lla hoidetuissa eläimissä kasvoi sekä HapT1-että HaK-kasvaimia (kuviot 8c-d).
Lyhyesti sanottuna tulokset osoittavat, että Ad5-D24-GM-CSF:llä on 15 antituumorinen aktiivisuus immuunikompetenteissa eläimissä, joilla on kasvaimia, ja se kykenee tuottamaan kasvainspesifisen immuniteetin siinä määrin, että se estää saman kasvaimen kasvun myöhemmin.
Esimerkki 5. D24-GM-CSF-tyypin virusten in vivo -analyysi ihmispotilais-sa 20 I. Potilaat
Potilaita, joilla oli pitkälle kehittyneitä ja vaikeasti hoidettavia kiinteitä kasvaimia, pyydettiin osallistumaan valtioneuvoston hyväksymään kokeelliseen käytäntöön. Ad5-D24-GM-CSF:ää saaneiden potilaiden tiedot on listattu taulukossa 1.
25 II. Hoidot GM-CSF:ää koodaavalla adenovirusvektorilla a) Ad5-D24-GM-CSF-, Ad5/3-D24-GM-CSF- tai Ad5-RGD-D24-GM-CSF-hoidot
Ad5-D24-GM-CSF:ää, Ad5/3-D24-GM-CSF:ää ja Ad5-RGD-D24-GM-CSF:ää tuotettiin kliinisen laatuluokan mukaisesti ja potilaiden hoito aloitet-30 tiin. Tätä ’’faasin 0” kokeellisen käytön ohjelmaa on käsitelty Hyksin kirurgisen etiikan lautakunnassa. Ohjelmaa on myös käsitelty FinOHTA:ssa (terveydenhuollon menetelmien arviointiyksikössä) ja Suomen lääkäriliiton eettisten periaatekysymysten valiokunnassa. Oikeusasiat on tarkistettu Sosiaali- ja terveysministeriössä, Lääkelaitoksessa, Suomen lääkäriliiton lakivaliokunnassa, 35 Terveydenhuollon oikeusturvakeskuksessa ja eduskunnan sosiaali- ja terveyslautakunnassa. Geenitekniikanlautakunta on hyväksynyt hoidot.
23
Virus laimennettiin steriilillä suolaliuoksella antoajankohtana asianmukaisissa olosuhteissa. Viruksen antamisen jälkeen kaikkia potilaita tarkkailtiin yön yli sairaalassa ja tämän jälkeen avohoitopotilaina. Hoidon sivuvaikutukset kirjattiin ja pisteytettiin CTCAE:n (Common Terminology Criteria for Ad-5 verse Events) version 3.0 mukaisesti.
Verinäytteet otettiin ennen hoitoa ja sen jälkeen analysointia varten. Taulukossa 1 on yhteenveto Ad5D24-GMCSF:llä hoidettujen potilaiden seerumin viruskuormasta. Tässä analyysissa käytettiin kvantitatiivista PCR:ää (qPCR) (katso menetelmien kuvaukset osasta III).
10 Taulukoissa 2, 3 ja 4 on yhteenveto kaikista hoidon aikana ja sen jälkeen kirjatuista haittavaikutuksista. Kaikki haittavaikutukset on pisteytetty CTCAE:n (Common Terminology Criteria for Adverse Events) version 3.0 mukaisesti. On huomattava, että kaikilla potilailla oli asteen 1 tai/ja 2 flunssatyyppisiä oireita, mutta vain kaksi asteen 3 oiretta todettiin, yhdellä munasar-15 jasyöpäpotilaista oli ummetusta, mutta hänellä oli ollut sitä ennenkin, ja yhdellä asteen 3 hyponatremia.
Taulukossa 5 esitetään tehokkuusarvio RECIST-kriteerien (Theras-se P. et ai. 2000, J Natl Cancer Inst 92, 205-16) mukaisesti. On kiinnostavaa, että 14 analysoitavalla potilaalla havaittiin kaksi täydellistä vastetta (CR) ja viisi 20 stabiilia tautia (SD), jolloin saatiin 50 %:n kliinisen hyödyn taso.
III. Viruksen havaitseminen verestä
Ad5-D24-GM-CSF:llä hoidetuilta potilailta otettiin seeruminäytteet (katso esimerkki 5, /.) ja tavanomainen PCR tehtiin käyttämällä alukkeita ja olosuhteita julkaisun Takayama et ai. 2007, J. Med. Virol. 79:278-284 mukai-25 sesti. Lyhyesti sanottuna kokonais-DNA eristettiin lisäämällä 3 μg kantaja-DNA:ta (polydeoksyadenyylihappoa; Roche, Mannheim, Saksa) 400 μΐιβη seerumia ja käyttämällä QIAamp DNA mini kit -pakkausta. Eristetty DNA eluoitiin 60 ^:ssa nukleaasitonta vettä ja DNA-pitoisuus mitattiin spektrofotometrialla. PCR-monistus perustui alukkeisiin ja koettimiin, jotka kohdistettiin 24 emäspa-30 rin deleetiota ympäröivälle E1A-alueelle [forward-aluke 5’-TCCGGTTTCTATGCCAAACCT-3’ (sekvenssitunnistenro 1), reverse-aluke 5’-TCCTCCGGTGATAATGACAAGA-3’ (sekvenssitunnistenro 2) ja koetin onko 5’FaM-TGATCGATCCACCCAGTGA-3’Mgbnfq (sekvenssitunnistenro 3)]. Lisäksi käytettiin koetinta, joka oli komplementaarinen 24 emäsparin deletoitavaan alu-35 eeseen sisältyvälle sekvenssille, näytteiden testaamiseksi villityypin adenovi- 24 rusinfektion osalta [koetin wt 5,vic-TACCTGCCACGAGGCT-3’mgbnfq (sek-venssitunnistenro 4)].
Kunkin 25 μΙ:η reaktion tosiaikaiset PCR-olosuhteet olivat seuraa-vat: 2X LightCycler480 Probes Master Mix (Roche, Mannheim, Saksa), 800 nM 5 sekä etu- että paluualuketta, 200 nM kutakin koetinta ja 250 ng eristettyä DNA:ta. PCR-reaktiot tehtiin LightCyclerilla (Roche, Mannheim, Saksa) seu-raavissa PCR-olosuhteissa: 10 min 95 °C:ssa, 50 sykliä: 10 s 95 °C:ssa, 30 s 62 °C:ssa ja 20 s 72 °C:ssa ja 10 min 40 °C:ssa. Kaikki näytteet testattiin kaksi kertaa. TaqManin eksogeenisiä, sisäisiä positiivisia kontrollireagensseja (Ap-10 plied Biosystems) käytettiin samoissa PCR-ajoissa PCR-inhibiittoreiden testaamiseksi kustakin näytteestä.
Regression standardikäyrä luotiin käyttämällä DNA:ta, joka oli eristetty tavallisessa ihmisen seerumissa olevan Ad5/3-D24-Cox2L:n (1 x 108—10 vp/ml:n) sarjalaimennoksista. Määrityksen havaitsemis- ja kvantifikaatiorajat 15 olivat 500 vp/ml seerumia.
Positiiviset näytteet varmistettiin tosiaikaisella PCR:llä käyttämällä LightCycler480 SYBR Green I Master Mixiä (Roche, Mannheim, Saksa) ja adenovirusspesifisiä ja GM-CSF-sekvenssispesifisiä alukkeita [forward-aluke 5’-AAACACCACCCTCCTTACCTG-3’ (sekvenssitunnistenro 5) ja reverse-20 aluke 5’-TCATTCATCTCAGCAGCAGTG-3’ (sekvenssitunnistenro 6)].
IV. Erilaistuneiden kasvainsolujen tappaminen
Munasarjasyöpää sairastavan potilaan ja mesotelioomaa sairastavan potilaan tietokonetomografiat (katso taulukko 1) ennen hoitoa ja sen jälkeen esitetään kuvioissa 9a-b.
25 V. Hoidon hematologiset vaikutukset
Leukosyyttien, erytrosyyttien, Hb:n, trombosyyttien, bilirubiinin, INR:n, ALT:n, AST:n, ALP:n, kreatiniinin, K:n, Na:n CRP:n CA19-9:n, GT:n, Fibriinin D-dimeerien ja CEA:n tasot tutkittiin (taulukot 3-4).
VI. Immuunivaste virukselle 30 a) IL-6. IL-10. TNF-g ia IL-8
Yksi adenovirusgeenihoidon mahdollinen haitta on sen viruskom-ponenteista johtuva varhainen toksisuus, joka voi olla immunogeenistä ja johtaa sepsistyyppiseen sokkiin ja jopa kuolemaan (Brunetti-Pierri et ai. Gene Ther 2004; Raper et ai. 2002). Tästä syystä on erittäin tärkeää tarkkailla merk-35 kejä mahdollisesta sytokineesimyrskystä, joka voi myöhemmin johtaa elinten pettämiseen. Tätä varten potilaista otettiin verinäytteitä pian hoidon jälkeen ja 25 ilmoitettuna ajankohtana, ja proinflammatoriset sytokiinit analysoitiin FAC-SARRAYIIa tavalla, joka on kuvattu artikkelissa Cerullo V. et ai. (2007, Mol Ther 15, 378-85). Mitään merkittäviä muutoksia ei havaittu, mikä osoitti, ettei varhaista synnynnäistä toksisuutta ollut.
5 b) svtotoksisten T-soluien käynnistäminen kasvaimia vastaan ia spesifinen immuniteetti kasvainepitooppeia vastaan
Onkolyyttinen solukuolema antaa immuunijärjestelmälle kyvyn tunnistaa ja tappaa kasvainsoluja. Tämä on potentiaalisesti hyödyllistä kasvainten tuhoamisessa ja voi helpottaa hoitoja. Adenovirus poistuu kehosta suhteellisen 10 lyhyessä ajassa annon jälkeen; tästä syystä se erittäin tärkeäksi tulee immuunijärjestelmän stimuloiminen tunnistamaan tiettyä kasvainantigeeniä niin, että hoito voi johtaa kestävään hyötyväikutukseen potilaalle. Lisäksi vasta-aineiden läsnä ollessa virus neutraloituu niin, että se voi menettää kykynsä in-fektoida metastaaseja. Kasvainta vastaan käynnistetyt efektori T- tai NK-solut 15 voivat vapaasti kiertää verenkierrossa ja lopulta tappaa kaukana injektoidusta kasvaimesta olevan metastaasin. Sen osoittamiseksi, että GMCSF:ää ilmentävä adenovirus kykenee saamaan aikaan adenovirus- tai kasvainspesifisen immuniteetin, hoidetuista potilaista kerätyt PBMC:t analysoitiin INF-gamma-ELISPOTilla. ELISPOTin teki sokkomenetelmänä ulkopuolinen yritys, jolle ei 20 annettu tietoja potilaiden saamista hoidoista (Proimmune). Kuvioissa 10a-d esitetään tämän analyysin tulokset. On selvää, että kun T-soluja stimuloitiin joko kasvainantigeenistä (survivinista) tai adenoviruksesta (pentonista) saadulla peptidipoolilla, nämä solut aktivoituivat tuottamaan INF-gammaa (INF-gamma on stimuloitujen T-solujen erityinen aktivaatiomerkkiaine) samoissa potilaissa. 25 Kuvio 11 esittää Adenovirus Hexon -spesifisten T-solujen induktiota.
Ad5-D24-GMCSF:llä hoidetuista potilaista kerättyjä leukosyyttejä värjättiin CD3-, CD8- ja heksonispesifisillä tetrameerivasta-aineilla ja analysoitiin virta ussytometrialla ennen hoitoa ja sen jälkeen. Hoito lisäsi heksonispesifisten sytotoksisten T-solujen määrää 0,21 prosentista 2,72 prosenttiin.
30 c) Requlatoristen T-soluien väheneminen
Aiemmat tiedot ovat osoittaneet, että syslofosfamidin metronominen anto vähentää regulatorisia T-soluja (T-Reg:ejä) koe-eläimissä.
Tätä tietoa hyödynnettiin potilailla, jotka saivat syklofosfamidia met-ronomisesti ennen hoitoa ja sen jälkeen, ja T-reg-analyysi tehtiin näistä poti-35 laista kerätyillä PBMC:illä. Kuviossa 12 esitetyssä esimerkissä on yksi esimerkki potilaalta R73, ja se osoittaa kiertävien T-reg:ien vähenemisen. Potilais- 26 ta kerättiin kokonais-PBMC:t, ja ne jäädytettiin asianmukaisessa kasvatusliu-oksessa. Analysointiaikaan kaikki näytteet sulatettiin ja värjättiin ensin CD- ja CD127-vasta-aineilla, minkä jälkeen solut permeabilisoitiin ja värjättiin transkriptiotekijän Foxp3 osalta. CD4:lle positiivisten ja CD127:lle negatiivisten 5 mutta runsaasti Foxp3:a sisältävien solujen katsottiin olevan tehokkaita regula-torisia T-soluja (kuvio 12).
Taulukko 1. Taulukko osoittaa Ad5-D24-GMCSF:n läsnäolon hoidettujen potilaiden seerumissa
Ennen Päiviä hoidon jälkeen ___ hoitoa_______ I I 1 I 2 | 3-7 | 8-12 | 13-20 | 21^0
Potilas Primäärikasvain Virusannos Viruskuorma seerumissa (VP/ml) (koodi)___(kok.VP)________ C3__Tyhjäsuolisyöpä 8x10* 0__0__500__500__-__-__0 M3 Hepatosellulaarinen __syöpä__1x101°__0__0__4896__0__0__0__0 012__Munasarjasyöpä 3,6x101u 0__0__0__0__0__0__0 014__Munasarjasyöpä 1x10" 0__0__0__500__0__0__0 G15__Mahalaukkusyöpä 1x10" 0__0__565__500__0__0__0 K18 Ei-pienisoluinen 0 __keuhkosyöpä__2x1011___500__;__0__0__0__856 T19 Medullaarinen kilpi- __rauhassyöpä__2χ1θ"__0__765__500__500__0__0__0 U89__Munuaissyöpä_ 2x10" 0__0__-__-__-__-__0 S100__Leiomyosarkooma 2x10" 0__500__-__500__-__-__- S108 Synoviaalinen sar- __kooma__2x10"__0_______ M 50__Mesoteliooma_ 2,5x10" 0__0__-__500__-__0__0 R8__Rintasyöpä_ 3x10'' 0__500__-__500__-__0__0 M 32__Mesoteliooma_ 3x10" 0__0__0__-__-__0__0 X49 Kohdunkaulan syö- 3x10" 0 4290 - - 37975 6706 1211 ____„________ I52__Melanooma_ 3x10" ~ 0 576______ I78__Suonikalvosyöpä 3x10" 0__44867__-__-__-__-__500 C58__Paksusuolen syöpä 4x10" 0__1978__-__4236 878__-__- R73__Rintasyöpä_ 4x10" 0_______ 088__Munasarjasyöpä 4x10" 0_______ 1 27
Taulukko 2. Taulukko esittää yhteenvedon Ad5-D24-GMCSF:llä hoidettujen potilaiden ilmoittamista sivuvaikutuksista __Potilaitten lukumäärä___
Ilmoitetut oireet__Aste 1__Aste 2__Aste 3__Aste 4__Annosalue
Kuume 3_____P_ __1____K_ __6__4____S_
Kipu injektiokohdassa_____P_ __1____K_ ______S_
Lihaskipu 1_____P_ _____K_ __1__1____S_ Päänsärky__1____P_ __1____K_ __1_____S_
Väsymys__1____P
1_____K_ __2__3____S_
Dyspnea_____P_ __1____K_ __2_____S_
Ripuli_____P_ _____K_ __1_____S_
Hypotensio_____P
1 _____K_ __1_____S_
Kuvotus_____P
2 _____K_ __3_____S_
Oksennus_____P_ _____K_ __3_____S_
Huimaus_____P_ _____K_ __2_____S_
Yskä 1_____P_ 1__1____K_ __3__3____S_
Vilu P_ 4_____K_ _| 1 | | S~ 5 P (pieni annos) = Kohortti 1 annosväli 8x109<D<3,6x101° K (keskiannos) = Kohortti 2 annosväli 1x1011<D<2,5x1011 S (suuri annos = Kohortti 3 annosväli 3x1011<D<4x1011 28
Taulukko 3. Hematologiset sivuvaikutukset Ad5-D24-GMCSF:n annon jälkeen
Vaiku- Varhainen toksisuus (1-7 pv)__Myöhäinen toksisuus (>7 päivää) Annos- tus Aste 1 Aste 2 Aste 3 Aste 4 Aste 1 Aste 2 Aste 3 Aste 4__alue
Hypo- 1_________P_ nat- 1_____1__1____K_
remia__6___1______S
Hypoka- 1_____2_____P_
lemia 2 1 K
__1_________S_
Anemia 1_________P_ 1_________K_ __2__4_____3____S_
Trom-______1____P_ bosyto-___ _ _K_
peniä 1__ _S
Leuko-_________P_
peniä 1 K
_| | I | | | | | | S
5 P (pieni annos) = Kohortti 1 annosväli 8x109<D<3,6x101° K (keskiannos) = Kohortti 2 annosväli 1x1011<D<2,5x1011 S (suuri annos = Kohortti 3 annosväli 3x1011<D<4x1011
Taulukko 4. Maksaentsyymit Ad5-D24-GMCSF:n annon jälkeen 10 ___
Varhainen toksisuus (1-7 pv)__Myöhäinen toksisuus (>7 päivää)_ An-
Aste I Aste II Aste III Aste IV Aste I Aste II Aste III Aste IV nos- __________alue ALT_________P_
Potilaiden *\ 1 K
_ 3 1 ~--S~ AST_________P_
Potilaiden 1 K
__1__1____1__1____s
Hyperbili-_________P_ rubinemia_________K_
Potilaiden 2 1 S
lkm____|_|_|____ P (pieni annos) = Kohortti 1 annosväli 8x109<D<3,6x101° K (keskiannos) = Kohortti 2 annosväli 1x1011<D<2,5x1011 S (suuri annos = Kohortti 3 annosväli 3x1011<D<4x1011 29
Taulukko 5. Ad5-D24-GMCSF-hoidon tehokkuus eri Ad5-D24-GMCSF-annoksilla hoidetuilla potilailla. Analyysi tehtiin RECIST-kriteerien mukaisesti. CR = täysi vaste, PR = osittainen vaste, SD = stabiili tauti, PD = progressiivinen tauti, - = ei saatavissa.
5 ______RECIST____Elinkykyisyys (päiviä)
Virusannos Potilai- (VP yht.) den lkm CR PR SD PD - S>300 300<S>200 200<S>100 S<100
8x109 VP__1__ 1 -I
1x101°VP__1 1 !
3,6x101° VP 1__1 -I
1x1011 VP__2__1__ 1 1 1 2x1011 VP 4 14 1 2 1 2,5x1011 yp 1 1 1 3x1011 VP 5 1 3 11 2 3,6x1011 yp -i 4x1011 VP | 3 I I 1 I 1 | l 1 | _ 3

Claims (37)

1. Onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää adenovirusserotyypin 5 (Ad5:n) nukleiinihappopääketjun, 24 emäsparin de- 5 leetion (D24) E1:n Rb:tä sitovalla pysyvällä alueella 2 ja nukleiinihapposek-venssin, joka koodaa granulosyytti-makrofagien kolonisaatiota stimuloivaa tekijää (GM-CSF:ää) deletoidun gp19k/6.7K:n tilalla E3-alueella.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi yhden tai useamman alueen, jotka on 10 valittu E2-ja E4-alueista ja myöhäisvaiheen alueista koostuvasta ryhmästä.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat alueet: vasen ITR, osittainen E1, pIX, plVa2, E2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4, osittainen E3, L5, E4 ja oikea ITR.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että alueet ovat peräkkäisessä järjestyksessä 5’-3’-suun-nassa.
5. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että villityypin alue sijaitsee ylävirtaan
6. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että E1-alue käsittää viruksen pakkaus-signaalin.
7. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen 25 adenovirusvektori, tunnettu siitä, että GM-CSF:ää koodaava nukleiinihap- posekvenssi on viruksen E3-promoottorin alainen.
8. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että GM-CSF:ää koodaava nukleiinihap-posekvenssi on villityyppiä.
9. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että E4-alue on villityyppiä.
10. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää kapsidimodifikaation.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen onkolyyttinen adenovirusvek- 35 tori, tunnettu siitä, että kapsidimodifikaatio on Ad5/3-kimerismi, integriiniä sitovan alueen (RGD:n) insertio ja/tai hepariinisulfaattia sitovan polylysiinin modifikaatio säikeeseen.
12. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen onkolyyttinen adenovi-rusvektori, tunnettu siitä, että kapsidimodifikaatio on RGD-4C-modifikaa- 5 tio.
13. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää ainakin yhden ekspres-siokasetin.
14. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen 10 adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää vain yhden ekspressio- kasetin.
15. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että vektori kykenee selektiivisesti replikoituinaan soluissa, joissa on virheitä Rb-reitillä.
16. In vitro -solu, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patentti vaatimuksen 1-15 mukaista adenovirusvektoria.
17. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukaista adenovirusvektoria.
18. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen 20 adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se toimii in situ -syöpärokotteena.
19. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukaisen adenovirusvektorin käyttö kohteen syövän hoitoon käytettävän lääkkeen valmistuksessa.
20. Patenttivaatimusten 19 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että 25 syöpä valitaan ryhmästä, johon kuuluvat nasofaryngeaalinen syöpä, synoviaa- linen syöpä, hepatosellulaarinen syöpä, munuaissyöpä, sidekudossyöpä, melanooma, keuhkosyöpä, suolistosyöpä, paksusuolen syöpä, peräsuolen syöpä, kolorektaalinen syöpä, aivosyöpä, kurkkusyöpä, suusyöpä, maksasyöpä, luu-syöpä, haimasyöpä, istukkasyöpä, gastrinooma, feokromosytooma, prolak-30 tinooma, T-soluleukemia/lymfooma, neurooma, von hippel-lindaun tauti, zollin-ger-ellisonin oireyhtymä, lisämunuaissyöpä, anaalinen syöpä, sappitien syöpä, virtsarakon syöpä, virtsajohtimen syöpä, aivosyöpä, oligodendrogliooma, neu-roblastooma, meningiooma, selkäydinkasvain, luusyöpä, osteokondrooma, kondrosarkooma, Ewingin sarkooma, tuntemattoman primäärisijainnin syöpä, 35 karsinoidi, maha-suolikanavan karsinoidi, fibrosarkooma, rintasyöpä, Pagetin tauti, kohdunkaulan syöpä, kolorektaalinen syöpä, peräsuolen syöpä, ruoka- torven syöpä, sappirakon syöpä, pään syöpä, silmäsyöpä, niskasyöpä, munu-aissyöpä, Wilmsin kasvain, maksasyöpä, Kaposin sarkooma, eturauhassyöpä, keuhkosyöpä, kivessyöpä, Hodgkinin tauti, non-Hodgkinin lymfooma, suusyöpä, ihosyöpä, mesoteliooma, multippeli myelooma, munasarjasyöpä, endokrii-5 ninen haimasyöpä, glukagonooma, haimasyöpä, paratyroidinen syöpä, penis-syöpä, aivolisäkesyöpä, pehmytkudossarkooma, retinoblastooma, ohutsuoli-syöpä, mahalaukkusyöpä, kateenkorvasyöpä, kilpirauhassyöpä, trofoblasti-syöpä, rypäleraskaus, kohtusyöpä, endometriaalinen syöpä, emätinsyöpä, ul-kosynnytinsyöpä, akustikus neurinooma, mucosis fungoides, insulinooma, kar- 10 sinoidioireyhtymä, somatostatinooma, iensyöpä, sydänsyöpä, huulisyöpä, kal-vosyöpä, suusyöpä, hermosyöpä, suulakisyöpä, korvasylkirauhassyöpä, vat-sakalvosyöpä, nielusyöpä, pleuraalinen syöpä, sylkirauhassyöpä, kielisyöpä ja risasyöpä.
20 E1-alueesta.
21. Patenttivaatimuksen 19 tai 20 mukainen käyttö, tunnettu 15 siitä, että kohde on ihminen tai eläin.
22. Jonkin patenttivaatimuksen 19-21 mukainen käyttö, tunnet-t u siitä, että anto tapahtuu kasvaimensisäisellä, lihaksensisäisellä, valtimonsisäisellä, laskimonsisäisellä, keuhkopussinsisäisellä, rakkulansisäisellä, onte-lonsisäisellä tai peritoneaalisella injektiolla tai suun kautta.
23. Jonkin patenttivaatimuksen 19-22 mukainen käyttö, tunnet- t u siitä, että onkolyyttisiä adenovirusvektoreita tai farmaseuttisia koostumuksia annetaan useita kertoja hoitojakson aikana.
24. Jonkin patenttivaatimuksen 19-23 mukainen käyttö, tunnet-t u siitä, että kohteelle annetaan onkolyyttistä adenovirusvektoria, jolla on eri- 25 lainen kapsidin säikeen uloke kuin aiemmassa hoidossa käytetyssä vektorissa.
25. Jonkin patenttivaatimuksen 19-24 mukainen käyttö, tunnet-t u siitä, että kohteelle annetaan lisäksi rinnakkaista sädehoitoa.
26. Jonkin patenttivaatimuksen 19-24 mukainen käyttö, tunnet-t u siitä, että kohteelle annetaan lisäksi rinnakkaista kemoterapiaa.
27. Jonkin patenttivaatimuksen 19-24 mukainen käyttö, tunnet- t u siitä, että kohteelle annetaan lisäksi verapamiilia tai muuta kalsiumkanavan salpaajaa.
28. Jonkin patenttivaatimuksen 19-24 mukainen käyttö, tunnet-t u siitä, että kohteelle annetaan lisäksi autofagiaa indusoivia aineita.
29. Jonkin patenttivaatimuksen 19-24 mukainen käyttö, tunnet- t u siitä, että kohteelle annetaan lisäksi temotsolomidia.
30. Jonkin patenttivaatimuksen 19-24 mukainen käyttö, tunnet-t u siitä, että kohteelle annetaan lisäksi kemoterapiaa tai anti-CD20-hoitoa tai muuta neutralisoivien vasta-aineiden estohoitoa.
31. Jonkin patenttivaatimuksen 19-24 mukainen käyttö, tunnet-5 t u siitä, että kohteelle annetaan lisäksi regulatoristen T-solujen dovvn-regulaa- tioon kykeneviä aineita.
32. Jonkin patenttivaatimuksen 19-24 mukainen käyttö, tunnet-t u siitä, että kohteelle annetaan lisäksi syklofosfamidia.
33. In vitro -menetelmä GM-CSF:n tuottamiseksi solussa, tun-10 n e 11 u siitä, että menetelmässä: a) kuljetetaan jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukaista onkolyyttis-tä adenovirusvektoria käsittävä kuljetin soluun ja b) ilmennetään kyseisen vektorin GM-CSF:ää solussa.
34. In vitro -menetelmä kasvainspesifisen immuunivasteen lisäämi-15 seksi kohteessa, tunnettu siitä, että menetelmässä: a) kuljetetaan jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukaista onkolyyttis-tä adenovirusvektoria käsittävä kuljetin soluun, b) ilmennetään kyseisen vektorin GM-CSF:ää solussa ja c) lisätään sytotoksisten T-solujen ja/tai luonnollisten tappajasolujen 20 määrää kyseisessä kohdesolussa tai -kudoksessa.
35. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen onkolyyttinen ade-novirusvektori GM-CSF:n tuottamiseksi solussa kasvainspesifisen immuniteetin aikaansaamiseksi kohteessa.
36. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen onkolyyttinen ade-25 novirusvektori kasvainspesifisen immuunivasteen lisäämiseksi kohteessa.
37. Patenttivaatimuksen 36 mukainen onkolyyttinen adenovirusvek-tori kasvainspesifisen immuunivasteen lisäämiseksi kohteessa, jolloin luonnollisten tappajasolujen ja/tai sytotoksisten T-solujen määrää lisätään kohdesolussa tai -kudoksessa.
FI20095466A 2008-12-22 2009-04-27 Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä FI121508B (fi)

Priority Applications (25)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20095466A FI121508B (fi) 2008-12-22 2009-04-27 Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä
KR1020117016272A KR101761094B1 (ko) 2008-12-22 2009-12-21 종양용해성 아데노바이러스 벡터 및 이와 관련된 방법 및 용도
CA2748180A CA2748180C (en) 2008-12-22 2009-12-21 Oncolytic adenoviral vectors and methods and uses related thereto
SG2011046109A SG173432A1 (en) 2008-12-22 2009-12-21 Oncolytic adenoviral vectors and methods and uses related thereto
SI200931586A SI2379586T1 (sl) 2008-12-22 2009-12-21 Onkolitični adenovirusni vektorji in z njimi povezani postopki in uporabe
ES09796016.5T ES2612889T3 (es) 2008-12-22 2009-12-21 Vectores adenovíricos oncolíticos y procedimientos y utilizaciones relacionados con los mismos
EP09796016.5A EP2379586B1 (en) 2008-12-22 2009-12-21 Oncolytic adenoviral vectors and methods and uses related thereto
AU2009332883A AU2009332883B2 (en) 2008-12-22 2009-12-21 Oncolytic adenoviral vectors and methods and uses related thereto
RU2011130511/10A RU2520823C2 (ru) 2008-12-22 2009-12-21 Аденовирусные векторы и способы и применения, связанные с ними
JP2011542856A JP2012513209A (ja) 2008-12-22 2009-12-21 腫瘍溶解アデノウイルスベクター並びに前記に関連する方法および使用
US12/643,140 US9345787B2 (en) 2008-12-22 2009-12-21 Adenoviral vectors and methods and uses related thereto
LTEP09796016.5T LT2379586T (lt) 2008-12-22 2009-12-21 Auglio audinius ardantys adenovirusiniai vektoriai ir su jais susiję būdai ir panaudojimas
HUE09796016A HUE031689T2 (en) 2008-12-22 2009-12-21 Oncolytic adenoviral vectors and related procedures and applications
DK09796016.5T DK2379586T3 (en) 2008-12-22 2009-12-21 Oncolytic adenoviral vectors and methods and applications associated therewith
PT97960165T PT2379586T (pt) 2008-12-22 2009-12-21 Vectores adenovirais oncolíticos e respectivos métodos e utilizações
PL09796016T PL2379586T3 (pl) 2008-12-22 2009-12-21 Onkolityczne wektory adenowirusowe i związane z nimi sposoby i zastosowania
BRPI0924123A BRPI0924123B8 (pt) 2008-12-22 2009-12-21 vetores adenovirais oncolíticos, usos dos mesmos, composição farmacêutica e método para produzir gmcsf em uma célula in vitro
CN200980151762.9A CN102264760B (zh) 2008-12-22 2009-12-21 溶瘤性腺病毒载体及与其相关的方法和用途
PCT/FI2009/051025 WO2010072900A1 (en) 2008-12-22 2009-12-21 Oncolytic adenoviral vectors and methods and uses related thereto
ZA2011/04224A ZA201104224B (en) 2008-12-22 2011-06-07 Oncolytic adenoviral vectors and methods and uses related thereto
US14/538,707 US20150202324A1 (en) 2008-12-22 2014-11-11 Adenoviral vectors and methods and uses related thereto
JP2015156226A JP6280084B2 (ja) 2008-12-22 2015-08-06 腫瘍溶解アデノウイルスベクター並びに前記に関連する方法および使用
US15/075,962 US20160208287A1 (en) 2008-12-22 2016-03-21 Adenoviral vectors and methods and uses related thereto
CY20171100126T CY1120039T1 (el) 2008-12-22 2017-01-27 Ογκολυτικοι αδενοϊικοι φορεις και μεθοδοι και χρησεις οι οποιες σχετιζονται με αυτους
HRP20170165TT HRP20170165T1 (hr) 2008-12-22 2017-02-01 Onkolitički adenovirusni vektori i metode i uporabe u vezi s time

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20080671A FI20080671A0 (fi) 2008-12-22 2008-12-22 Onkolyyttiset virukset
FI20080671 2008-12-22
FI20095466A FI121508B (fi) 2008-12-22 2009-04-27 Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä
FI20095466 2009-04-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI20095466A0 FI20095466A0 (fi) 2009-04-27
FI121508B true FI121508B (fi) 2010-12-15

Family

ID=40240530

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20080671A FI20080671A0 (fi) 2008-12-22 2008-12-22 Onkolyyttiset virukset
FI20095466A FI121508B (fi) 2008-12-22 2009-04-27 Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20080671A FI20080671A0 (fi) 2008-12-22 2008-12-22 Onkolyyttiset virukset

Country Status (1)

Country Link
FI (2) FI20080671A0 (fi)

Also Published As

Publication number Publication date
FI20080671A0 (fi) 2008-12-22
FI20095466A0 (fi) 2009-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2379586B1 (en) Oncolytic adenoviral vectors and methods and uses related thereto
US20160208287A1 (en) Adenoviral vectors and methods and uses related thereto
JP6639412B2 (ja) アルブミン結合部分を含んでなるアデノウイルス
AU2011306845B2 (en) Oncolytic adenoviral vectors coding for monoclonal anti - CTLA - 4 antibodies
CN103221423B (zh) 溶瘤腺病毒载体及与其相关的方法和用途
FI123955B (fi) Onkolyyttinen adenovirus
HUE026386T2 (en) Tumor-selective adenovirus E1A and E1B mutants
FI121574B (fi) Ei-Ad5 adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä
FI121508B (fi) Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä
FI124926B (fi) Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä
FI124927B (fi) Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä

Legal Events

Date Code Title Description
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: ONCOS THERAPEUTICS OY

Free format text: ONCOS THERAPEUTICS OY