FI121574B - Ei-Ad5 adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä - Google Patents

Ei-Ad5 adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä Download PDF

Info

Publication number
FI121574B
FI121574B FI20095751A FI20095751A FI121574B FI 121574 B FI121574 B FI 121574B FI 20095751 A FI20095751 A FI 20095751A FI 20095751 A FI20095751 A FI 20095751A FI 121574 B FI121574 B FI 121574B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
cancer
adenoviral vector
cells
oncolytic
tumor
Prior art date
Application number
FI20095751A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20095751A (fi
FI20095751A0 (fi
Inventor
Akseli Hemminki
Sari Pesonen
Otto Hemminki
Gerd Bauerschmitz
Vincenzo Cerullo
Original Assignee
Oncos Therapeutics Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oncos Therapeutics Oy filed Critical Oncos Therapeutics Oy
Publication of FI20095751A0 publication Critical patent/FI20095751A0/fi
Priority to FI20095751A priority Critical patent/FI121574B/fi
Priority to EP10704194.9A priority patent/EP2391722B1/en
Priority to RU2011136280/10A priority patent/RU2011136280A/ru
Priority to SG2011055563A priority patent/SG173502A1/en
Priority to AU2010209334A priority patent/AU2010209334A1/en
Priority to KR1020117020181A priority patent/KR20110110371A/ko
Priority to CA2750770A priority patent/CA2750770A1/en
Priority to BRPI1008159A priority patent/BRPI1008159A2/pt
Priority to US13/147,288 priority patent/US20120063995A1/en
Priority to CN2010800087768A priority patent/CN102325887A/zh
Priority to JP2011547047A priority patent/JP2012516682A/ja
Priority to PCT/IB2010/050452 priority patent/WO2010086838A2/en
Publication of FI20095751A publication Critical patent/FI20095751A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI121574B publication Critical patent/FI121574B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10345—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10371—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Ei-Ad5 adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä
Keksinnön ala
Esillä oleva keksintö liittyy lääketieteen alaan. Erityisesti keksintö liit-5 tyy syöpähoitoihin. Tarkemmin sanottuna esillä oleva keksintö liittyy onkolyytti-siin adenovirusvektoreihin ja soluihin ja mainittuja vektoreita käsittäviin farmaseuttisiin koostumuksiin. Esillä oleva keksintö liittyy myös mainittujen vektoreiden käyttöön kohteen syövän hoitoon tarkoitetun lääkkeen valmistuksessa ja menetelmään kohteen syövän hoitamiseksi. Lisäksi esillä oleva keksintö liit-10 tyy menetelmään adenovirusvektorin tuottamiseksi.
Keksinnön tausta
Syöpää voidaan hoitaa leikkauksella, hormonihoidoilla, kemoterapi-alla ja/tai sädehoidoilla, mutta useissa tapauksissa syöpiä, joille on usein tunnusomaista se, että ne ovat levinneessä vaiheessa, ei voida parantaa nykyisil-15 lä hoidoilla. Tämän vuoksi tarvitaan uusia syöpäsoluihin kohdistuvia lähestymistapoja, kuten geenihoitoja.
Viimeisen kahdenkymmenen vuoden aikana geenisiirtoteknologiaa on tutkittu paljon. Syövän geenihoitojen tarkoituksena on viedä terapeuttinen geeni kasvainsoluun. Nämä kohdesoluun viedyt terapeuttiset geenit voivat 20 esimerkiksi korjata mutatoituneita geenejä, suppressoida aktiivisia onkogeene-jä tai luoda soluun lisäominaisuuksia. Sopivia eksogeenisiä terapeuttisia geenejä ovat näihin rajoittumatta immunoterapeuttiset, antiangiogeeniset ja kemo-protektiiviset geenit sekä "itsemurhageenit", ja ne voidaan viedä soluun hyödyntämällä modifioituja virusvektoreita tai ei-viraalisia menetelmiä mukaan lu-o 25 kien elektroporaatio, geenipyssy ja lipidi- tai polymeeripäällysteet.
° Optimaalisten virusvektoreiden vaatimuksiin kuuluu tehokas kyky löytää spesifisiä kohdesoluja ja ilmentää virusgenomia kohdesoluissa. Lisäksi i ^ optimaalisten vektoreiden tulee pysyä aktiivisina kohdekudoksissa tai x -soluissa. Kaikki nämä virusvektoreiden ominaisuudet on kehitetty viimeisten
CC
30 vuosikymmenien aikana, ja esimerkiksi retrovirus- ja adenovirusvektoreita ja
Jo adenoassosioituneita virusvektoreita on tutkittu laajasti biolääketieteessä.
σ> Kasvaimeen penetraation ja antituumorivaikutuksen paikallisen o ° amplifikaation parantamiseksi edelleen on konstruoitu selektiivisesti onkolyytti- siä aineita, esimerkiksi ehdollisesti replikoituvia adenoviruksia. Onkolyyttiset 35 adenovirukset ovat lupaava keino syöpien hoitoon. Onkolyyttiset adenovirukset 2 tappavat kasvainsoluja replikoitumalla kasvainsolussa, jolloin replikaation viimeinen vaihe johtaa tuhansien virionien vapautumiseen ympäröiviin kasvain-kudoksiin tehokasta kasvaimeen penetraatiota ja vaskulaarista reinfektiota varten. Hoitovaihtoehdoissa käytetään hyväksi normaalien ja kasvainsolujen väli-5 siä molekyylieroja. Kasvainsolut mahdollistavat viruksen replikaation, kun taas normaalit solut säästyvät sellaisten virusgenomiin räätälöityjen muutosten johdosta, jotka estävät replikaation ei-kasvainsoluissa. Optimaalinen onkolyyttinen adenovirus infektoisi ainoastaan syöpäsoluja ja replikoituisi niissä, ja se olisi riittävän tehokas tuhoamaan kaikki syöpäsolut ennen kuin immuunivaste neut-10 raloi viruksen.
Tietyillä deleetioilla tai lisäämällä kudosspesifisiä promoottoreita virus voidaan saada selektiivisemmäksi, ja siirtogeenien lisäämisellä voidaan saada voimakkaampi teho. Todellakin, replikaatiovälitteisen solujen tappamisen lisäksi onkolyyttiset adenovirukset voidaan myös varustaa erilaisilla tera-15 peuttisilla siirtogeeneillä. Tässä lähestymistavassa perinteisen geeninsiirron edut yhdistyvät replikaatiokompetenttien aineiden tehoon. Virusten varustamisen yksi tavoite on immuunireaktion aiheuttaminen virusreplikaation mahdollistavia soluja vastaan. Vaikka virusreplikaatio on immunogeeninen, se ei yksistään normaalisti riitä aiheuttamaan tehokasta kasvaimenvastaista immuniteet-20 tia. Terapeuttisen immuniteetin aiheutumisen vahvistamiseksi virukset voidaan varustaa stimulatorisilla proteiineilla, kuten sytokiineilla, ja helpottamalla kas-vainantigeenien viemistä dendriittisiin soluihin. Immunoterapeuttisten geenien vieminen kasvainsoluihin ja lisäksi proteiinien translaatio johtavat immuunivasteen aktivoitumiseen ja tehokkaaseen kasvainsolujen tuhoutumiseen.
25 Adenovirukset ovat keskikokoisia (90-100 nm), vaipattomia ikosahedraalisia viruksia, joilla on noin 36 kiloemäsparin kaksinauhainen line-2 aarinen DNA proteiinikapsidissa. Viruksen kapsidissa on säierakenteita, jotka ^ osallistuvat viruksen kiinnittymiseen kohdesoluun. Ensinnäkin säieproteiinin V (fiber protein) ulokealue (knob domain) sitoutuu kohdesolun reseptoriin [esi- 30 merkiksi CD46- tai coxsackievirus-adenovirusreseptoriin (CAR)], toiseksi virus £ vuorovaikuttaa integriinimolekyyliin ja kolmanneksi virus endosytosoituu koh-
CL
desoluun. Tämän jälkeen virusgenomi siirtyy endosomeista tumaan ja koh- rC desolun replikaatiokoneistoa hyödynnetään myös virustarkoituksiin (Russell W.
§ C. 2000, J General Virol 81,2573-2604).
o
(M
3
Adenovirusgenomilla on varhaisvaiheen (E1-E4), keskivaiheen (IX ja IVa2) ja myöhäisvaiheen geenejä (L1-L5), jotka transkriptoituvat peräkkäisessä järjestyksessä. Varhaisvaiheen geenituotteet vaikuttavat isäntäsolun puolustusmekanismeihin, solusykliin ja solumetaboliaan. Keski-ja myöhäisvai-5 heen geenit koodaavat virusten rakenneproteiineja uusien virionien tuottamiseksi (Wu ja Nemerow, 2004, Trends Microbiol 12: 162-168; Russell W. C. 2000, J General Virol 81,2573-2604; Volpers C. ja Kochanek S. 2004, J Gene Med 6 suppl 1, S164-71; Kootstra N. A. ja Verma I. M. 2003, Annu Rev Pharmacol Toxicol 43, 413-439).
10 Ihmiseltä on löydetty yli 50 adenovirusten eri serotyyppiä. Serotyypit luokitellaan kuuteen alaryhmään A-F, ja eri serotyyppien tiedetään liittyvän eri sairauksiin kuten hengityselinsairauksiin, sidekalvontulehdukseen ja maha-suolitulehdukseen. Kuitenkin kaikissa syöpäkokeissa, joissa on käytetty re-kombinantteja adenoviruksia, on ollut mukana alaryhmän C viruksia, jotka 15 useimmiten ovat Ad5-virusta. Serotyyppien kimerikapsidien edut muuten sero-tyypin 5 mukaisessa viruksessa on myös havaittu. Vaikka serotyypin kimerismi sallii osittaisen paon Ad5-vastaisista neutraloivista vasta-aineista (Nab), suurin osa viruskapsidista on kuitenkin Ad5:stä, minkä vuoksi pako ei ole täydellinen (Sarkioja M et ai. 2008, Gene Ther 15:921-929).
20 Tarvitaan siis onkolyyttinen kokonaan ei-Ad5 virus, joka kykenee pakenemaan Ad5-vastaisesta Nab:stä. Tällaiset virukset ovat hyödyllisiä erityisesti jo olemassa olevan Ad5-vastaisen NAb:n yhteydessä. Tällainen tilanne voisi syntyä luonnollisen infektion seurauksena tai Ad5-pohjaisella onkolyytti-sellä viruksella annetun hoidon jälkeen.
25 Toistaiseksi serotyypin 3 mukaisista adenoviruksista ei ole julkaistu paljon geeniterapian puitteissa. Ad3:n villityypin tiedetään aiheuttavan pääasi-2 assa hengitystietulehduksia ja sidekalvontulehdusta ihmisille. Täydellinen ^ DNA-sekvenssi raportoitiin vuonna 2005, ja sen identiteetti serotyypin 5 kans- v sa on vain 62,75 %. Genomien järjestys on samankaltainen kuin muissa ihmi- 30 sen adenoviruksissa, joissa on varhaisia ja viivästyneesi! varhaisia transkrip-£ tioyksiköitä, joihin kuuluvat myös myöhäisen ja erittäin myöhäisen vaiheen yk- ___ siköt (Sirena D et ai. 2005, Virology 343: 283-298). Joitakin vuosia sitten Ad3- rC viruksen villityyppiä tutkittiin normoksisissa ja hypoksisissa olosuhteissa (Shen § BH et ai. 2006, Gene Ther 13: 986-990). Äskettäin sama ryhmä julkaisi Colo-
° 35 Ad1:n, kompleksin Ad3/Ad11p kimeerisen viruksen (Kuhn I et ai. 2008, PLoS
ONE 3: e2409). ColoAdl tehtiin poolaamalla serotyyppien ryhmä, minkä jäi- 4 keen poolit saatettiin olosuhteisiin, jotka edesauttavat rekombinaatiota sero-tyyppien välillä. Kirjoittajat kutsuvat tätä menetelmää nimellä ’’Directed Evolution” (= suunnattu evoluutio). Näihin erittäin monimuotoisiin viruspooleihin kohdistettiin sitten tiukasti suunnattu valinta tehokkaiden aineiden luomiseksi ja 5 tunnistamiseksi. Kokeissaan he havaitsivat, että kimeerinen Ad3/Ad11p-virus oli 2-3 suuruusluokkaa vahvempi ja selektiivisempi kuin kantaserotyypit tai kliinisesti edistynein onkolyyttinen Ad, ONYX-015, in vitro. Näitä tuloksia tukivat myös in vivo ja ex vivo -tutkimukset. ColoAd1:n kehittämisen lähtökohdan huomioon ottaen siitä puuttuu rationaalinen perusta kasvainselektiivisyydelle. 10 Lisäksi sen aktiivisuus ja turvallisuus in vivo ymmärretään heikosti, koska sitä on tutkittu vain yhdellä eläinmallilla, jossa oli kyseessä paksusuolen syövän ksenograftit hiirissä.
Tarvitaan siis tehokkaampaa ja tarkempaa ei-Ad5-vektoreihin perustuvaa geenisiirtoa ja parempaa spesifisyyttä sekä riittävää kasvaintentu-15 hoamiskykyä ei-Ad5-geenihoidoilla. Terapeuttisten vektorien turvallisuustieto-jen on myös oltava erinomaisia. Esillä oleva keksintö tarjoaa näillä edellä mainituilla ominaisuuksilla varustetun syövänhoitokeinon hyödyntämällä onkolyyt-tisiä ei-Ad5-viruksia.
Keksinnön lyhyt kuvaus 20 Keksinnön tavoitteena on tuottaa uusia keinoja adenovirusten edellä mainittujen ominaisuuksien aikaansaamiseksi ja siten myös nykyisten syöpä-hoitojen ongelmien ratkaisemiseksi. Tarkemmin sanottuna keksintö tarjoaa uusia keinoja geenihoitoa varten.
Esillä oleva hakemus kuvaa onkolyyttisten Ad3-vektoreiden konst- 25 ruoimista ja niiden käyttöä kasvainsolulinjoissa ja eläinmalleissa ja tarjoaa ° vaihtoehdon serotyypin 5 onkolyyttisille adenovirusvektoreille virushoidoissa.
o cv Keksinnön mukainen vektori on ensimmäinen ainoastaan serotyyppiin 3 perus- ^ tuva selektiivisesti onkolyyttinen adenovirus. Vektori on myös ensimmäinen ei-
Ad5-pohjainen onkolyyttinen adenovirus, jota ohjataan kasvainspesifillä pro-x 30 moottorilla.
CC
Keksinnön kohteena on täysin ihmisen serotyyppiä 3 oleva onkolyyt-[5 tinen adenovirusvektori.
g Keksinnön kohteena on myös solu, joka käsittää keksinnön mukai- c3 sen adenovirusvektorin.
5
Keksinnön kohteena on myös farmaseuttinen koostumus, joka käsittää keksinnön mukaisen adenovirusvektorin.
Lisäksi keksinnön kohteena on keksinnön mukaisen adenovirusvektorin käyttö kohteessa olevan syövän hoitoon tarkoitetun lääkkeen valmistami-5 seksi.
Edelleen keksinnön kohteena on menetelmä keksinnön mukaisen adenovirusvektorin valmistamiseksi siten, että menetelmä käsittää sen, että i) saadaan aikaan DNA-vektori, joka käsittää ainakin osittaisen Ad3-DNA:n ja valinnaisesti yhden tai useamman promoottorin ja/tai valinnaisesti 10 yhden tai useamman siirtogeenin, ja ii) insertoidaan jäljelle jäävä osa Ad3-genomia ja valinnaisesti yksi tai useampi promoottori ja/tai valinnaisesti yksi tai useampi siirtogeeni vektoriin.
Esillä oleva keksintö tarjoaa keinon huonosti nykyhoitoihin reagoivi-15 en syöpien hoitamiseksi. Lisäksi keksinnössä on hoitoon sopiviin kasvaintyyp-peihin liittyviä rajoituksia vähän verrattuna moniin muihin hoitoihin. Itse asiassa kaikkia kiinteitä kasvaimia voidaan hoitaa esitetyllä keksinnöllä. Hoito voidaan antaa kasvaimensisäisesti, ontelonsisäisesti, valtimonsisäisesti, laskimonsisäisesti ja käyttämällä näiden yhdistelmää.
20 Ad3-pohjaiset virukset kykenevät menemään syöpäkantasolu- tyyppisiin soluihin paremmin kuin Ad5-virukset. Keksinnön mukaisen viruksen tehokkuus nähtiin kasvainsolulinjoissa, ja virus oli ainakin yhtä tehokas kuin Ad5- tai Ad5/3-pohjaiset kontrollit useissa ihmisen syövän hiirimalleissa.
Sen lisäksi, että keksinnön mukainen vektori mahdollistaa vektorin 25 kuljettamisen kohdealueelle, se myös varmistaa siirtogeeni(e)n ilmentymisen ja pysyvyyden. Immuunireaktion aiheuttaminen sellaisia soluja vastaan, jotka sal-2 livat varustamattomien virusten replikaation, ei normaalisti ole riittävän voima- ™ kas saamaan aikaan terapeuttisen kasvainimmuniteetin kehittymisen. Tämän V heikkouden poistamiseksi esillä oleva keksintö tuottaa aseistettuja viruksia, oi 30 joissa on voimakas kasvaimenvastaisen immuniteetin aiheuttaja (esim. GM- £ CSF).
CL
Keksinnössä käytetään myös ihmisen natriumjodisymportteri-siirto-geeniä (hNIS) radiojodin kohdistamiseksi kohdesoluun. Tämän lähestymista- LT) § van ansiosta kasvainsolut saadaan tuhottua viruksen onkolyyttisellä vaikutuk-
O
cvj 35 sella ja säteilyn aikaansaamalla solukuolemalla. Lähestymistavassa käytetään 6 hyödyksi myös säteilyn ja onkolyyttisen adenoviruksen replikaation välistä synergiaa. Ottamalla hNIS siirtogeeniksi voidaan radiojodihoitoa käyttää ei-tyroidisten syöpien hoitoon. Eräs hyödyllinen hNIS:n ominaisuus on siirtogeenin ilmentämisen ei-invasiivinen kuvantaminen, jolla viruksen leviämistä ja py-5 syvyyttä voidaan valvoa.
Keksintö ratkaisee myös ongelman, joka liittyy perinteisten hoitojen ja muiden adenovirushoitojen hoitoresistenssiin. Yksi keksinnön erittäin potentiaalinen kohderyhmä on potilaat, joilla on korkeat anti-Ad5 Nab-tiitterit tai joita on aiemmin hoidettu Ad5-aineilla.
10 Lisäksi esillä oleva keksintö tarjoaa keinoja ja menetelmiä selektiivi siä hoitoja varten aiheuttamatta toksisuutta tai vaurioita terveissä kudoksissa. Esillä olevan keksinnön etuja ovat myös erilaiset ja pienemmät sivuvaikutukset verrattuna muihin hoitoihin. Tärkeä seikka on, että hoitokeino on synergistinen monien muiden hoitomuotojen kanssa, mukaan lukien kemoterapia ja sädehoi-15 to, ja sitä voidaan siten käyttää yhdistelmähoito-ohjelmissa.
Tunnetun tekniikan mukaisiin adenoviruskeinoihin verrattuna esillä oleva keksintö tarjoaa yksinkertaisemman, tehokkaamman, edullisemman, myrkyttömämmän ja/tai turvallisemman keinon syöpähoitoa varten. Lisäksi aut-tajaviruksia ei tarvita.
20 Keksinnön mukaiset uudet tuotteet mahdollistavat lisäparannuksia syöpähoitoon.
Kuvioiden lyhyt kuvaus
Kuvio 1 esittää kaaviot viruksista Ad3-hTERT-hNIS-E1A, Ad3-hTERT-GMCSF-E1A, Ad3-hTERT-E1A-E3-hNIS ja Ad3-hTERT-E1A-E3-25 GMCSF.
? Kuvio 2 esittää kuviossa 1 kuvattujen virusten kloonauksen. Ylem- o ^ mällä rivillä nähdään sellaisten virusten kloonaus, joiden siirtogeenit ovat ^ E1A:ssa, ja alemmalla rivillä nähdään sellaisten virusten kloonaus, joiden siirsi togeenit ovat deletoidussa Ad3 E3gp19k-lokuksessa.
= 30 Kuvio 3 esittää a) Ad3-hTERT-E1A:n rakenteen. hTERT-promoottori (295bp) sijoitettiin korvaamaan TATA-laatikko adenovirus 3:n E1A-alueen edessä. Nuolet osoittavat kuviossa 3b käytettyjen PCR-alukkeiden paikan, b) g Ad3-hTERT-E1A:n PCR. PCR vahvistaa, että hTERT-promoottori on oikeassa oj paikassa ja että pääketju on serotyyppi 3. Vasemmalla näemme 270 emäspa- 35 rin (base pair, bp) nauhan ja oikealla 210 emäsparin hTERT-promoottorin in-sertioalueen molemmilta puolilta. Nämä fragmentit on sekvensoitu ja ne tuotti- 7 vat odotetun sekvenssin. Negatiivisina kontrolleina käytettiin Ad3wt:tä, Ad5/3-hTERT-Agp:tä ja MilliQ-vettä. Villityypin adenovirusserotyyppien 3 ja 5 sekä kapsidimuokattujen Ad5/3-virusten läsnäolo suljettiin pois muissa PCR-ko-keissa. c) Progressiivinen infektiivisyysmääritys Ad3-hTERT-E1A:lla. Solut 5 maljattiin 96-kuoppaisille levyille ja rivit infektoitiin alentamalla Ad3-hTERT-E1A:n laimennusta arvosta 10'5 arvoon 10'12, ja kukin laimennus tehtiin kymmenenä kappaleena. Levyjä havainnoitiin mikroskoopilla, ja viruskuoppia verrattiin vertailukuoppiin. Havainnoista laskettiin pfu/ml samalla tavalla kuin TCID50:ssä (Adeasy manual, Agilent Technologies, Inc. 2008). Kasvatusliuos 10 (DMEM, 5 % FBS) vaihdettiin 4-7 päivän välein. Pfu/ml-tiitteri tasoittuu 30 päivän jälkeen, mikä viittaa hitaaseen in vitro replikaatiokinetiikkaan Ad3-hTERT-E1A:n osalta.
Kuvio 4 esittää soluntappokokeita syöpäsolulinjoilla. Kokeissa käytettiin PC3-MM2- (eturauhassyöpä-), A549- (keuhkosyöpä-), HTC116- (pak-15 susuolisyöpä-) ja SKOV3.ip1- (munasarjasyöpä-) soluja. Ad3-hTERT-E1A tappoi soluja kaikissa solulinjoissa (P<0,05 versus Ad5/3luc1, replikaation suhteen puutteellinen kontrolli 10 viruspartikkelilla/solu). Ad300wt, Ad5/3-hTERT-Ägp ja Ad5/3-A24 tappoivat soluja nopeammin kuin Ad3-pohjaiset virukset. Palkit osoittavat SE:n.
20 Kuviossa 5 nähdään ei-maligneilla ja Ad3-reseptorivajailla soluilla tehtyjä soluntappomäärityksiä. Ihmisen umbilikaalisen suonen endoteliaalisolu-ja (HUVEC) ja fibroblasteja (FSH173WE) käytettiin ei-kasvainsoluina. Ad3-hTERT-E1A ei poikennut replikaatioon kykenemättömästä Ad5/3-luc1 :stä matalilla annoksilla ja tappoi merkittävästi vähemmän soluja kuin positiiviset kont-25 rollit Ad3wt, Ad300wt, Ad5/3-Ä24, kun viruspartikkeleita (VP) oli 0,1; 1 ja 10 solua kohti (P<0,05). Tiedettiin, että LNM-35- (keuhkosyöpä-) soluista puuttuu ^ Ad3-reseptori (Särkioja M et ai. 2006, Cancer 107: 1578-1588). Ad3wt ja Ad3- ^ hTERT-E1A eivät osoittaneet mitään sytotoksisuutta näillä soluilla. Palkit osoit- V tavat SE:n.
30 Kuviossa 6 esitetään Ad3-hTERT-E1A:n in vivo -tehokkuus a) PC3- k MM2- (erittäin metastaattisissa, huonosti hormoneilla hoidettavissa olevissa
CL
eturauhasen karsinooma-) kasvaimissa nude-hiirissä. Jokaiseen kasvaimeen rC injektoitiin viikoittain 109 viruspartikkelia kaikkiaan kolmena injektiona, ja kas- § vaimet mitattiin 2-3 päivän välein. Ad3-hTERT-E1A:lla hoidetut kasvaimet ° 35 kasvoivat hitaammin kuin PBS:llä hoidetut (P=0,0035). b) Vastaavia tietoja ha vaittiin hiirissä, joilla oli A549- (keuhkosyöpä-) kasvaimia, vaikka PSB-ryhmä oli 8 lopetettava varhain suuren kasvainkoon vuoksi. Päivänä 17 havaittiin merkittävän rajalla (P=0,051) oleva ero verrattaessa PSB:tä ja Ad3-hTERT-E1A:ta. Myös päivänä 30 Ad3-hTERT-E1A todettiin merkittävästi (P=0,01) paremmaksi kuin Ad5/3-hTERT-E1A, mikä viittasi Ad3-hTERT-E1A:n hyödyllisyyteen tässä 5 mallissa, c) Lusiferaasia ilmentäviä SKOV3-luc munasarjasyöpäsoluja kasvatettiin intraperitoneaalisesti SCID-hiirissä. Tehtiin yksi intraperitoneaalinen 109 VP:n virusinjektio, ja kasvainsolujen määrä ajan funktiona arvioitiin elävien eläinten toistuvalla lusiferaasikuvantamisella. Merkittävä ero lusiferaasisignaa-lissa havaittiin kaikkien viruksella hoidettujen ryhmien ja PBS-ryhmän 10 (P<0,0001) välillä, eikä virusryhmien välillä ollut eroja. Huomattakoon, että
Ad300wt-virus (Ad5-vi11ityyppi) voitiin ottaa mukaan ainoastaan kohtiin c-d. Palkit osoittavat SE:n. d) Eloonjäämisanalyysissä kaikki viruksella hoidetut ryhmät pysyivät elossa pidempään kuin PBS-ryhmä (P<0,01). Ainoa kokeessa pitkään elossa pysynyt oli yksi seitsemästä Ad3-hTERT-E1A-ryhmän hiirestä. 15 Se oli terve eikä siitä löytynyt kasvaimia kuvantamisessa eikä koepaloista päivän 100 kohdalla, jolloin koe päättyi.
Kuviossa 7 esitetään soluntappomäärityksiä CAMA-1 - (rintasyöpä-), PANC-1- (haimasyöpä-) ja ACHN- (munuaissyöpä-) soluilla. Ad3-hTERT-E1A tappoi soluja kaikissa näissä syöpätyypeissä. Kaikissa kokeissa Ad3-hTERT-20 E1A oli merkittävästi tehokkaampi kuin replikaatioon kykenemätön kontrolli Ad5/3-luc1 100 VP:ssä/solu (P<0,05).
Kuviossa 8 esitetään Ad3-hTERT:in in vivo anti-kasvaintehokkuus. Bioluminesenssikuva, joka on otettu päivänä 28.
Kuviossa 9 esitetään elektronimikroskooppikuva Ad3-hTERT- 25 E1A:sta.
Kuviossa 10 esitetään Ad3-hTERT-E1:n osittainen sekvenssi. Sek-^ vensoitu DNA on merkitty lihavoinnilla. PubMedistä saatu hTERT-sek- ^ venssi on alleviivattu. (Emäkset, jotka puuttuvat sekvensoidusta Ad3-hTERT- v E1A:sta verrattuna PubMedistä saatuun Ad3-pääketjuun, on merkitty sulkei- 3 30 siin). ISOT KIRJAIMET OSOITTAVAT hTERT:in INSERTION. Käytetyt aluk- £ keet on merkitty kursiivilla.
CL
___ Kuviossa 11 esitetään Ad5/3-A24-hNIS-välitteinen jodikertymä etu- rC rauhassyöpäsoluihin. Soluja infektoitiin Ad5/3-A24-hNIS:llä tai Ad5/3-A24- § Agp19K:lla 10 VP/solu ja altistettiin 125l:lle 24 ja 48 h infektion jälkeen. Solut
O
<m 35 analysoitiin gammaspektrometrillä solujen radioaktiivisen jodipitoisuuden mää- 9 rittämiseksi. Ei-infektoituja soluja käytettiin negatiivisena kontrollina. Virhepalkit osoittavat SEM:in. * p<0,05; ** p<0,01 ja *** p<0,001.
Kuviossa 12 esitetään Ad5/3-A24-hNIS-replikaatio ja onkolyysi etu-rauhassyöpäsoluissa ilman radiojodia. Soluja infektoitiin useilla eri virusannok-5 silla (0-100 VP/solu), ja solujen elinvoimaisuus määriteltiin 6-9 päivää myöhemmin MTS-määrityksellä. Replikaatioon kykenemätöntä Ad5/3luc1 :tä ja on-kolyyttistä Ad5/3-A24:ää käytettiin kontrolleina. Virhepalkit osoittavat SEM:in.
Kuviossa 13 esitetään Ad5/3-A24-hNIS-välitteinen jodikertymä in vivo. Hiiret, joilla oli ihonalaisia eturauhaskasvaimia saivat Ad5/3-A24-hNIS:ää 10 kasvaimensisäisesti (kyljen alaosan kasvaimet), Ad5/3-A24-Agp19K:ta (kasvain ylhäällä oikealla) tai suolaliuosta (kasvain ylhäällä vasemmalla) ja sen jälkeen laskimonsisäisen 1231-injektion (1,85 MBq/hiiri). Jodikertymä kuvannettiin a) 2 h ja b) 13 h laskimonsisäisen 123 I -injektion jälkeen gammakameralla. Pikselikoko oli 1,08 mm x 1,08 mm. c) 123 l:n biojakauma 13 h 123 I -injektion 15 jälkeen. Palkit osoittavat SEM:in, n=3, paitsi hNIS-kasvaimissa n=6.
Kuviossa 14 nähdään Ad5/3-A24-hNIS:n antitumoorinen teho in vivo. Hiirille, joilla oli ihonalainen eturauhaskasvain (6 hiirtä/ryhmä, 12 kasvain-ta/ryhmä), annettiin Ad5/3-A24-hNIS:ää tai kasvatusliuosta kasvaimensisäisesti kahtena peräkkäisenä päivänä ja sen jälkeen 131 I tai suolaliuosta 50 MBq.n 20 intraperitoneaalisena injektiona. Kasvaimen koko mitattiin joka toinen päivä. Kasvaimen kasvunopeus oli huomattavasti hitaampi yhdistelmällä hoidetussa ryhmässä (Ad5/3-A24-hNIS + 131 I) kuin kaikissa muissa ryhmissä (*** p <0,001). Eläintenpitoon liittyvien rajoitusten vuoksi koe oli lopetettava etukäteen määrättynä ajankohtana 17 päivää jodi-injektion jälkeen.
25 Kuvioissa 15 nähdään, että GMCSF:n ilmentyminen ei estä viruksen replikaatiota ja soluntappovaikutusta. Kuvio 15a esittää tulokset MTS-määri-o ς tyksestä, joka esittää keuhkosyövän (A549) soluntappotehoa uudella luodulla ^ Ad5-D24-GMCSF-viruksella. Kuvio 15b esittää tulokset MTS-määrityksestä, v joka esittää syöpää aiheuttavien JIMT-1-solujen (’’syöpäkantasolujen”) tappa- 30 mistä Ad5-D24-GMCSF:llä. Kuvio 15c esittää tulokset MTS-määrityksestä, joit ka esittää rintasyöpäsolujen (MDA-MB-436) tappotehoa uudella luodulla Ad5-
CL
D24-GMCSF-viruksella. Kuvio 15d esittää tulokset MTS-määrityksestä, joka esittää MDA-MB-436:n tappotehoa uusilla luoduilla Ad5-D24-GMCSF-, Ad5- § RGD-D24-GMCSF- ja Ad5/3-D24-GMCSF-viruksilla.
o
C\J
10
Kuvio 16a esittää adenovirukseen yhdistettyä ihmisen GMCSF:n ilmentymistä. A549-solulinja infektoitiin Ad5D24:llä tai Ad5D24-GMCSF:llä, kas-vatusliuosta kerättiin ajan kuluessa ja GMCSF:n ilmentymistä analysoitiin FAC-SARRAYIIa.
5 Kuviossa 16b nähdään, että adenovirusilmennetty GMCSF säilyttää biologisen aktiivisuutensa ihmisen lymfosyyteissä. TF1-soluja, jotka tarvitsevat ihmisen GMCSF:ää pysyäkseen elossa, kasvatettiin ihmisen rekombinantti-GMCSF:n (E. coli:ssa tuotettu, ostopaikka Sigma) tai Ad5-D24-GMCSF:llä in-fektoitujen solujen supernatantin läsnä ollessa.
10 Kuvio 17a esittää Ad5-D24-GMCSF:n in vivo -tehokkuuden syyrian- hamstereissa (jotka ovat permissiivisiä ihmisen adenoviruksen replikoitumisel-le), joissa on haimasyöpäkasvaimia. Sekä Ad5D24 että Ad5-D24-GMCSF poistavat kasvaimet 16 päivän sisällä hoitojen jälkeen. Virusta annettiin 1 x 109 viruspartikkelia päivinä 0, 2 ja 4.
15 Kuviossa 17b nähdään, että kasvaimensisäinen injektio Ad5-D24- GMCSF:ää johti korkeisiin hGMCSF-tasoihin syyrianhamstereiden seerumissa. Ad5D24E3:lla tai Ad5-D24-GMCSF:llä hoidetuista eläimistä otettiin näytteet päivänä 4 ja ihmis-GMCSF:n pitoisuus seerumissa analysoitiin FACSARRAYllä.
20 Kuviossa 17c nähdään, että HapT1-kasvainten parantaminen Ad5- D24-GMCSF:llä (mutta ei Ad5D24:llä) suojasi syyrianhamstereita myöhemmäl-tä HapT1-uudelleenaltistukselta. Tämä osoittaa, että Ad5-D24-GMCSF voi aiheuttaa kasvainspesifisen immuunivasteen. Ad5D24:llä tai Ad5D24-GMCSF:llä (kuvio 17a) aiemmin hoidetut eläimet altistettiin uudelleen samalle kasvaimelle 25 ja kasvaimen kasvua mitattiin ajan kuluessa.
Kuviossa 17d nähdään, että kasvainspesifisen immuunivasteen ai-? heuttaminen Ad5-D24-GMCSF:llä, H a pT1-kasvainten parantaminen Ad5-D24- ^ GMCSF:llä ei suojannut syyrianhamstereita Hak-kasvaimilta. Eläimiä, joiden V HapT1-kasvaimia oli aiemmin hoidettu Ad5D24:llä tai Ad5D24-GMCSF:llä (ku- w 30 vio 17a), altistettiin uudelleen eri kasvaimelle ja kasvaimen kasvua mitattiin k ajan kuluessa.
CL
in h-· m σ> o o
(M
11
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Adenovirusvektori
Esillä olevassa keksinnössä osoitetaan, että serotyypin 3 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori voidaan koostaa ja se sallii kasvainsolun tap-5 pamisen.
Ad3:ssä, kuten myös muissa adenoviruksissa, ikosahedraalinen kapsidi koostuu ainakin kolmesta pääproteiinista: heksonista, penton base -proteiinista ja säikeestä, lisäksi siinä on pieniä proteiineja, kuten VI, Vili, IX, lila ja IVa2 (Russel W. C. 2000, J General Virol 81,2573-2604; Sirena D et ai. 1 o 2005, Virology 343: 283-298).
Sirena et ai. (2005, Virology 343: 283-298) ovat raportoineet villi-tyypin Ad3 täydellisen nukleotidisekvenssin (GeneBank hakunumero DQ086466). Ad3-genomi sisältää varhaisvaiheen (E1-4), välivaiheen (IX ja IVa2)ja suuria myöhäisvaiheen yksikön (major late unit, MLTU) alueita, joiden reunoilla on 15 vasemmalle ja oikealle invertoituneita terminaalitoisteita (LITR:iä, vastaavasti, RITR:iä), jotka sisältävät DNA:n replikaatioon tarvittavat sekvenssit.
Eräässä keksinnön sovellusmuodossa kokonaan serotyyppiä 3 oleva onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää yhden tai useamman alueen, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu E1:stä, E2:sta, E3:sta, E4:stä, keski-ja myö-20 häisen vaiheen alueista.
Eräässä keksinnön sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää seuraavat alueet: vasen ITR, E1, pIX, plVa2, E2, VA1, VA2, myöhäisvaiheen alue, E3 tai osittainen E3, E4, ja oikea ITR.
Alueet voivat olla vektorissa missä tahansa järjestyksessä, mutta 25 eräässä keksinnön sovellusmuodossa alueet ovat peräkkäisessä järjestykses-0 sä 5’-3’-suunnassa. Avoimet lukukehykset (ORF:t) voivat olla samassa DNA- o juosteessa tai eri DNA-juosteissa.
^ Tässä yhteydessä ilmaisu ’’adenovirusserotyyppi 3 (Ad3)” tarkoittaa ^ Ad3:n genomia tai osagenomia, joka käsittää yhden tai useampia alueita, jotka ^ 30 valitaan ryhmästä, johon kuuluvat Ad3:stä peräisin olevat E1, pIX, plVa2, E2,
X
£ VA1, VA2, myöhäisvaiheen alue, E3 tai osittainen E3 ja E4.
Tässä yhteydessä ilmaisu ’’osittainen” alue tarkoittaa aluetta, josta puuttuu jokin osa verrattuna vastaavaan villityypin alueeseen. ’’Osittainen E3” σ> § tarkoittaa E3-aluetta, josta puuttuu gp19k.
0X1 35 Tässä yhteydessä ilmaisut ”VA1” ja ”VA2” tarkoittavat virukseen liit tyviä RNA 1 :tä ja 2:ta, jotka adenovirus transkriptoi, mutta jotka eivät transloi- 12 du. VA1:llä ja VA2:lla on merkitystä solun puolustusmekanismien vastaisessa taistelussa.
Endogeenisten tai eksogeenisten elementtien lisääminen voi vahvistaa vektorien vaikutusta kohdesoluissa. Eksogeenisen kudoksen tai kasvains-5 pesifisten promoottorien käyttö rekombinanttiadenovirusvektoreissa on tavanomaista, ja myös esillä olevassa keksinnössä voidaan käyttää niitä. Esimerkiksi, virusreplikaatio voidaan rajoittaa kohdesoluihin esimerkiksi promoottoreilla, joihin kuuluu muun muassa, näihin kuitenkaan rajoittumatta, hTERT, hTERTin variantit, CEA, SLP, Cox-2, Midkine, E2F, E2F:n variantit, CXCR4, SCCA2 ja 10 TTS. Ne lisätään yleensä E1A-alueen kontrolloimiseksi, mutta lisäksi tai vaihtoehtoisesti voidaan säädellä myös muita geenejä, kuten E1B:tä ja E4:ää.
Eräässä keksinnön sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvek-tori käsittää Ad3 E1A -alueen hTERT-promoottorin alaisuudessa. Ad3-hTERT-E1A sisältää ihmisen telomeraasin katalyyttisen domeenin promoottorin ylävir-15 taan E1A transkriptiokohdasta kasvainspesifisille replikaatiolle.
Telomeerien ja telomeraasien tutkimus on edennyt voimakkaasti viime vuosina. Telomeraasiaktivaatio on merkittävä askel ihmisen karsinogenee-sissä, ja useimmissa ihmisen kasvaimissa nähdään telomeraasiaktiivisuutta. Tämä piirre liittyy läheisesti aktiivisuuteen hTERT-promoottorissa, jonka on esi-20 tetty olevan aktiivinen useimmissa ihmisen kasvaimissa, joten se muistuttaa hyödyllistä kasvainspesifistä promoottoria. Eräässä keksinnön sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori kykenee replikoitumaan ainoastaan soluissa, joissa on telomeraasiaktiivisuutta.
Eräässä keksinnön sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvek-25 tori käsittää Ad3 E3 -alueen replikaatioaktivoidun Ad3 E3 -promoottorin alaisuudessa. Eräässä keksinnön erityisessä sovellusmuodossa siirtogeeni sijoite-T- taan gp19k-deletoidulle E3-alueelle E3 promoottorin alaisuuteen. Tämä rajoit- ^ taa siirtogeenien ilmentymistä kasvainsoluihin, jotka sallivat viruksen replikaa- v tion ja sitä seuraavan E3-promoottorin aktivoitumisen. E3-promoottori voi olla 30 mikä tahansa alalla tunnettu eksogeeninen tai endogeeninen promoottori, £ edullisesti endogeeninen promoottori.
Q-
Rekombinanttiadenovirusvektoreissa voi olla myös eksogeenisia in-rC sulaattoreita eli epäspesifisten vahvistimien estoelementtejä, vasen ITR, E1A-
LO
§ natiivipromoottori tai kromatiiniproteiineja. Mitä tahansa lisäkomponentteja tai ° 35 modifikaatioita voidaan valinnaisesti käyttää, mutta ne eivät ole pakollisia kek sinnön mukaisissa vektoreissa.
13 E3-alue ei ole olennainen in vitro -virusreplikaatiossa, mutta E3-proteiineilla on tärkeä osa isännän immuunivasteen säätelyssä eli sekä luontaisten että spesifisten immuunivasteiden estossa. Keksinnön mukaisessa vektorissa voi olla deleetio gp19k-alueella E3:ssa. gp19k-geenituotteen tiedetään 5 sitovan ja houkuttelevan MHC1-molekyylejä (major histocompatibility complex I) solulimakalvostossa ja estävän sytotoksisia T-lymfosyyttejä tunnistamasta infektoituneita soluja. Koska monissa kasvaimissa on MHC1-vajetta, gp19k:n deleetio parantaa virusten kasvainselektiivisyyttä (virus poistetaan nopeammin kuin villityypin virus normaalisoluista, mutta kasvainsoluissa ei ole eroa).
10 Eräässä keksinnön sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvek- tori käsittää yhden tai useamman siirtogeenin. Eräässä keksinnön sovellus-muodossa siirtogeeni sijoitetaan E1:een hTERT-promoottorin alaisuuteen ja/tai E3:een replikaatioaktivoidun Ad3 E3 -promoottorin alaisuuteen. Eräässä keksinnön sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää siirtogeenin 15 deletoidun gp19k:n tilalla E3-alueella.
Eräässä keksinnön sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää sisäisen ribosomaalisen tuloalueen (IRES) siirtogeenin ja E1A-alueen välissä. IRES viittaa nukleotidisekvenssiin, joka mahdollistaa translaation alkamisen lähetti-RNA-sekvenssin keskellä proteiinisynteesissä. Eräässä 20 keksinnön sovellusmuodossa IRES on enkefalomyokarditis-viruksesta (EMCV), joka saadaan Clontech-vektorista plRES2-DsRed2. Eräässä keksinnön sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää hTERT-promoottorin, siirtogeenin, IRES:in ja E1A:n.
Eräässä keksinnön sovellusmuodossa siirtogeeni valitaan ryhmästä, 25 jossa on granulosyytti-makrofagien kolonisaatiota stimuloiva tekijä (CM-CSF), ihmisen natriumjodisymportteri (hNIS), interferoni-alfa, interferoni-beta, interfe-? roni-gamma, tuumorinekroositekijä-alfa, CD40L, trastutsumabi ja muita mono- ^ klonaalisia vasta-aineita.
v GM-CSF osallistuu immuunivasteeseen useiden eri mekanismien 30 kautta, joihin kuuluu luonnollisten tappajasolujen (NK:iden) rekrytointi ja APC-£ solujen (antigeeniä esittelevät solut) stimulaatio. APC voi tämän jälkeen rekry-
CL
toida, aktivoida ja kohdistaa T-soluja kasvaimeen. GM-CSF:ää koodaava nuk-£ ieotidisekvenssi voi olla lähtöisin mistä tahansa eläimestä, esimerkiksi ihmises-
LO
§ tä, apinasta, rotasta, hiirestä, hamsterista, koirasta tai kissasta, mutta edulli- ° 35 sesti GM-CSF:ää koodaa ihmisen sekvenssi. GM-CSF:ää koodaava nukleoti- disekvenssi voi olla modifioitu GM-CSF:n vaikutusten parantamiseksi tai modi- 14 fioimaton, toisin sanoen villityyppinen. Keksinnön eräässä edullisessa sovel-lusmuodossa GM-CSF:ää koodaava nukleiinihapposekvenssi on villityyppinen.
Eräässä keksinnön sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvek-tori käsittää hNIS:n, joka kohdistaa radiojodin kohdesoluun. Natriumjodisym-5 portterin (hNIS) ilmentäminen siirtogeeninä on menetelmä systeemisesti soveltuvien radioisotooppien, esim. radiojodien, kohdistamiseksi kasvaimiin. Tällä menetelmällä kasvainsolut saadaan tapettua viruksen onkolyyttisellä vaikutuksella sekä säteilyn aiheuttaman solukuoleman ansiosta, ja menetelmässä käytetään myös hyödyksi säteilyn ja onkolyyttisen adenoviruksen replikaation vä-10 listä synergiaa. Vielä eräs hyödyllinen hNIS:n ominaisuus on siirtogeenin ilmenemisen ei-invasiivinen kuvantaminen, jolla viruksen leviämistä ja pysyvyyttä voidaan valvoa.
hNIS on integraalien plasmamembraanin glykoproteiini, joka ilmentyy pääasiassa kilpirauhasen follikulaarisoluissa (Dohan O et ai. 2003, Endocr 15 Rev. 24: 48-77). hNIS:n biologinen tehtävä on välittää jodin aktiivista kuljetusta, joka on ratkaiseva osa kilpirauhashormonin biosynteesiä. Tätä hNIS:n kulje-tuskykyä on käytetty puoli vuosisataa kilpirauhaskarsinooman radiojodihoidossa, jossa radioaktiivisia jodimolekyylejä (1311) käytetään kilpirauhasesta peräisin olevien syöpäsolujen säteilyttämiseen sisäisesti.
20 Esillä olevassa keksinnössä interferoni-alfaa, interferoni-betaa, in terferoni-gammaa, tuumorinekroositekijä, CD40L:ää, trastutsumabia ja/tai muita monoklonaalisia vasta-aineita voidaan myös käyttää siirtogeeneinä potilaiden immuunijärjestelmän herättämiseksi kasvainsoluja vastaan esim. aktivoimalla luonnollisia tappajasoluja, T-soluja ja/tai makrofageja.
25 Keksinnön mukainen vektori voi käsittää myös muita modifikaatioita kuin E3:n osittaisia deleetioita ja siirtogeenien ja/tai promoottorien insertion o 5 edellä esitetyllä tavalla. Esillä olevassa keksinnössä voidaan myös hyödyntää ^ mitä tahansa alalla tunnettua kapsidimodifikaatiota, eli heksoni-, säie- ja/tai V pentoniemäsproteiinien modifikaatiota, mikä parantaa viruksen toimittamista 30 kasvainsoluun. Tässä yhteydessä ’’kapsidi” tarkoittaa viruksen proteiinikuorta, | joka sisältää heksoni-, säie- ja pentoniemäsproteiineja. Modifikaatiot voivat ol- la geneettisiä ja/tai fysikaalisia ja sisältää näihin rajoittumatta modifikaatioita, joilla lisätään ligandeja, jotka tunnistavat spesifisiä solureseptoreja ja/tai estäen vät natiiveja reseptoreja sitoutumasta, ja joilla korvataan adenovirusvektorin o ^ 35 säie- tai ulokealue toisen adenoviruksen ulokkeella (kimerismi) ja lisätään spe sifisiä molekyylejä (esimerkiksi FGF2) adenoviruksiin. Näin ollen kapsidimodifi- 15 kaatiot sisältävät näihin rajoittumatta pien(t)en peptidimotiivi(e)n, peptidi(e)n, kimerismi(e)n tai mutaatio(ide)n lisäämisen säikeeseen (esimerkiksi uloke-, häntä- tai varsiosaan), heksoniin ja/tai pentoniemäkseen.
Ekspressiokasetteja käytetään siirtogeenien ilmentämisessä koh-5 teessä, esimerkiksi solussa, käyttämällä vektoreita. Tässä yhteydessä ilmaisu ’’ekspressiokasetti” tarkoittaa DNA-vektoria tai sen osaa, joka käsittää cDNA:ita tai geenejä koodaavia nukleotidisekvenssejä tai kyseisten cDNA:iden tai geenien ilmentymistä ohjaavia ja/tai sääteleviä nukleotidisekvenssejä. Samanlaisia tai erilaisia ekspressiokasetteja voidaan insertoida yhteen vektoriin tai useam-10 paan erilaiseen vektoriin. Esillä olevan keksinnön mukaiset Ad3-vektorit voivat käsittää joko useita ekspressiokasetteja tai yhden kasetin. Vain yksi ekspressiokasetti on kuitenkin riittävä. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuo-dossa onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää ainakin yhden ekspressiokasetin. Keksinnön eräässä sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää 15 vain yhden ekspressiokasetin.
Keksinnön mukaisen adenovirusvektorin käsittävä solu voi olla mikä tahansa solu, esimerkiksi eukaryoottisolu, bakteerisolu, eläinsolu, ihmissolu, hiirisolu ja niin edelleen. Solua voidaan esimerkiksi käyttää adenovirusvektorin tuottamiseen in vitro tai in vivo tai solu voi olla kohde, esimerkiksi kasvainsolu, 20 joka on infektoitu adenovirusvektorilla.
Syöpä
Mitkä tahansa syövät tai kasvaimet, mukaan lukien pahanlaatuiset ja hyvänlaatuiset kasvaimet sekä primäärikasvaimet ja metastaasit voivat olla geenihoitojen kohteena. Keksinnön eräässä erityisessä sovellusmuodossa 25 syöpä on mikä tahansa kiinteä kasvain. Keksinnön eräässä edullisessa sovelsi lusmuodossa syöpä valitaan ryhmästä, johon kuuluvat nasofaryngeaalinen 0 ^ syöpä, synoviaalinen syöpä, hepatosellulaarinen syöpä, munuaissyöpä, side- Y kudossyöpä, melanooma, keuhkosyöpä, suolistosyöpä, paksusuolen syöpä, 01 peräsuolen syöpä, kolorektaalinen syöpä, aivosyöpä, kurkkusyöpä, suusyöpä, ^ 30 maksasyöpä, luusyöpä, haimasyöpä, istukkasyöpä, gastrinooma, feokromosy-
CL
tooma, prolaktinooma, T-soluleukemia/lymfooma, neurooma, von hippel-lindaun tauti, zollinger-ellisonin oireyhtymä, lisämunuaissyöpä, anaalinen syö-
LO
g pa, sappitien syöpä, virtsarakon syöpä, virtsajohtimen syöpä, aivosyopa, oligo- ^ dendrogliooma, neuroblastooma, meningiooma, selkäydinkasvain, luusyöpä, 35 osteokondrooma, kondrosarkooma, Ewingin sarkooma, tuntemattoman pri-määrisijainnin syöpä, karsinoidi, maha-suolikanavan karsinoidi, fibrosarkooma, 16 rintasyöpä, Pagetin tauti, kohdunkaulan syöpä, kolorektaalinen syöpä, peräsuolen syöpä, ruokatorven syöpä, sappirakon syöpä, pään syöpä, silmäsyö-pä, niskasyöpä, munuaissyöpä, Wilmsin kasvain, maksasyöpä, Kaposin sar-kooma, eturauhassyöpä, keuhkosyöpä, kivessyöpä, Hodgkinin tauti, non-5 Hodgkinin lymfooma, suusyöpä, ihosyöpä, mesoteliooma, multippeli myeloo-ma, munasarjasyöpä, endokriininen haimasyöpä, glukagonooma, haimasyöpä, paratyroidinen syöpä, penissyöpä, aivolisäkesyöpä, pehmytkudossarkooma, retinoblastooma, ohutsuolisyöpä, mahalaukkusyöpä, kateenkorvasyöpä, kilpi-rauhassyöpä, trofoblastisyöpä, rypäleraskaus, kohtusyöpä, endometriaalinen 10 syöpä, emätinsyöpä, ulkosynnytinsyöpä, akustikus neurinooma, mucosis fun-goides, insulinooma, karsinoidioireyhtymä, somatostatinooma, iensyöpä, sy-dänsyöpä, huulisyöpä, kalvosyöpä, suusyöpä, hermosyöpä, suulakisyöpä, kor-vasylkirauhassyöpä, vatsakalvosyöpä, nielusyöpä, pleuraalinen syöpä, sylki-rauhassyöpä, kielisyöpä, risasyöpä.
15 Farmaseuttinen koostumus
Keksinnön mukainen farmaseuttinen koostumus käsittää ainakin yhtä keksinnön mukaista vektorityyppiä. Lisäksi koostumus voi käsittää ainakin kahta, kolmea tai neljää keksinnön mukaista eri vektoria. Keksinnön mukaisen vektorin lisäksi farmaseuttinen koostumus voi myös käsittää muita vektoreita 20 kuten muita adenovirusvektoreita, muita terapeuttisesti tehokkaita aineita, muita aineita kuten farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantoaineita, puskureita, apuaineita, adjuvantteja, antisepteja, täyte-, stabilointi- tai sakeutusaineita ja/tai mitä tahansa komponentteja, joita on normaalisti vastaavissa tuotteissa.
Farmaseuttinen koostumus voi olla muodoltaan millainen tahansa 25 annettavaksi sopiva koostumus, esimerkiksi kiinteä, puolikiinteä, tai nestemäi-? nen. Formulaatio voidaan valita ryhmästä, joka koostuu näihin kuitenkaan ra-
O
^ joittumatta liuoksista, emulsioista, suspensioista, tableteista, pelleteistä ja kap- V seleista.
Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa onkolyyttinen ^ 30 adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus toimii in situ -syöpärokotteena.
CL
Tässä yhteydessä "in situ -syöpärokote” tarkoittaa syöpä rokotetta, joka sekä tappaa kasvainsoluja että lisää immuunivastetta kasvainsoluja vastaan. Virus-m § replikaatio on voimakas vaaranmerkki immuunijärjestelmälle (tarpeellinen ° TH1-tyyppiselle vasteelle) ja toimii siten voimakkaana kostimulatorisena ilmiö- 35 nä APC:iden GM-CSF-välitteiselle kypsymiselle ja aktivoinnille ja NK-solujen rekrytoinnille. Kasvainsolujen lyysis auttaa myös esittämään kasvainfragment- 17 teja ja -epitooppeja APC:ille ja lisäksi inflammaatio tuottaa kostimulaatiota. Siten epitooppiriippumaton (eli ei HLA-rajoitettu) vaste tuotetaan kussakin kasvaimessa ja näin ollen tapahtuu in situ. Kasvainspesifinen immuunivaste aktivoituu kohdesolussa ja ympäröivissä soluissa, esimerkiksi kohdekudoksessa.
5 Vektoreiden tehokas annos riippuu ainakin hoitoa tarvitsevasta koh teesta, kasvaimen tyypistä, kasvaimen sijainnista ja kasvaimen vaiheesta. Annos voi vaihdella esimerkiksi noin 10e8 viruspartikkelista (VP:sta) noin 10e14 VP:iin, edullisesti noin 5x10e9 VP:sta noin 10e13 VP:iin ja edullisemmin noin 8x10e9 VP:sta noin 10e12 VP:iin.
10 Farmaseuttisia koostumuksia voidaan tuottaa millä tahansa alalla tunnetulla tavanomaisella prosessilla, esimerkiksi hyödyntämällä jotakin seu-raavista: erä-, panossyöttö- ja perfuusiokasvatusmoodit, pylväskromatogra-fiapuhdistus, CsCI-gradienttipuhdistus ja perfuusiomoodit leikkausteholtaan alhaisissa soluretentiolaitteissa.
15 Anto
Keksinnön mukainen vektori tai farmaseuttinen koostumus voidaan antaa mihin tahansa eukaryoottiseen kohteeseen, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu kasveista, elämistä ja ihmisistä. Keksinnön eräässä edullisessa so-vellusmuodossa kohde on ihminen tai eläin. Eläin voidaan valita ryhmästä, jo-20 ka koostuu lemmikkieläimistä, kotieläimistä ja tuotantoeläimistä.
Useimmat aikuiset ovat altistuneet laajimmin käytetylle adenovirus- serotyypille Ad5 ja siksi immuunijärjestelmä kykenee nopeasti tuottamaan neutraloivia vasta-aineita (NAb:tä) sitä vastaan. Itse asiassa anti-Ad5-NAb:n prevalenssi voi olla jopa 50 %. On osoitettu, että NAb voidaan käynnistää 25 useimpia adenoviruskapsidin monia immunogeenisiä proteiineja vastaan. Erääs- ? sä keksinnön sovellusmuodossa kohteella on suuria määriä neutraloivia anti- o ^ Ad5-vasta-aineita. Eräässä keksinnön sovellusmuodossa kohdetta on hoidettu ^ Ad5:llä aiemmin.
Vektorin tai koostumuksen antamisessa kohteeseen voidaan käyt-g 30 tää mitä tahansa tavanomaista menetelmää. Antoreitti riippuu koostumuksen ^ formulaatiosta tai muodosta, taudista, kasvainten sijainnista, potilaasta, liitän- näissairauksista ja muista tekijöistä. Keksinnön eräässä sovellusmuodossa an-g to tapahtuu kasvaimensisäisellä, lihaksensisäisellä, valtimonsisäisellä, laskisi monsisäisellä, keuhkopussinsisäisellä, rakkulansisäisellä, ontelonsisäisellä tai 35 peritoneaalisella injektiolla tai suun kautta.
18
Jo yhdellä keksinnön mukaisen onkolyyttisen adenovirusvektorin antamisella voidaan saada hoitovaikutuksia. Keksinnön eräässä sovellusmuo-dossa onkolyyttisiä adenovirusvektoreita tai farmaseuttisia koostumuksia annetaan kuitenkin useita kertoja hoitojakson aikana. Onkolyyttiset adenovirusvek-5 torit tai farmaseuttiset koostumukset voidaan antaa esimerkiksi 1-10 kertaa kahden ensimmäisen viikon aikana, neljän ensimmäisen viikon aikana, kuukausittain tai hoitojakson aikana. Keksinnön eräässä sovellusmuodossa niitä annetaan 3-7 kertaa kahden ensimmäisen viikon aikana, sitten neljännellä viikolla ja sitten kuukausittain. Hoitojakson pituus voi vaihdella ja kestää esimer-10 kiksi kahdesta 12:een kuukautta tai kauemmin.
Yksi hoitokierros ei kuitenkaan välttämättä poista pitkälle kehittyneitä kasvainmassoja. Tämän vuoksi viruksen uudelleenanto on todennäköisesti tarpeen tehokkuuden lisäämiseksi. Keskeinen systeemistä uudelleenantoa rajoittava tekijä on viruksen aikaansaama neutraloivan vasta-aineen (NAb) tuot-15 tama vaste. Jotta vältetään neutraloivat vasta-aineet kohteessa, keksinnön mukaiset vektorit voivat vaihdella hoitojen välillä.
Keksinnön mukainen geenihoito on tehokas yksinäänkin, mutta adenovirusgeenihoidon yhdistäminen jonkin toisen hoidon, esimerkiksi perinteisen hoidon, kanssa voi olla tehokkaampi kuin kumpikaan yksin. Esimerkiksi 20 yhdistelmähoidon jokainen aine voi toimia itsenäisesti kasvainkudoksessa, adenovirusvektorit voivat herkistää soluja kemoterapialle tai sädehoidolle ja/tai kemoterapia-aineet voivat voimistaa virusreplikaation tasoa tai vaikuttaa koh-desolujen reseptoristatukseen. Yhdistelmähoidon aineet voidaan antaa samanaikaisesti tai peräkkäin.
25 Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi rinnakkaisen sädehoidon antamisen kohteelle. Keksinee 5 nön eräässä toisessa edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö kä- ^ sittää lisäksi rinnakkaisen kemoterapian antamisen kohteelle. Tässä yhteydes- v sä ’’rinnakkainen” tarkoittaa hoitoa, joka on annettu ennen, jälkeen tai saman- 30 aikaisesti keksinnön mukaisen geenihoidon kanssa. Rinnakkaishoidon jakso a voi vaihdella minuuteista useisiin viikkoihin. Edullisesti rinnakkaishoito kestää Q_ joitakin tunteja.
Yhdistelmähoitoon sopivia aineita ovat näihin kuitenkaan rajoittu- o matta All-trans retiinihappo, Azacitidine, Azathioprine, Bleomycin, Carboplatin, o ^ 35 Capecitabine, Cisplatin, Chlorambucil, Cyclophosphamide, Cytarabine, Dauno- rubicin, Docetaxel, Doxifluridine, Doxorubicin, Epirubicin, Epothilone, Eto- 19 poside, Fluorouracil, Gemcitabine, Hydroxyurea, Idarubicin, Imatinib, Mechlo-rethamine, Mercaptopurine, Methotrexate, Mitoxantrone, Oxaliplatin, Paclita-xel, Pemetrexed, Temozolomide, Teniposide, Tioguanine, Valrubicin, Vinblastine, Vincristine, Vindesine ja Vinorelbine.
5 Menetelmät adenovirusvektoreiden tuottamiseksi sisältävät mitä ta hansa tavanomaisia alalla tunnettuja menetelmiä. Yleensä siirtogeeni(t) inser-toidaan sukkula-plasmidiin, minkä jälkeen tehdään homologinen rekombinaatio sukkula-plasmidin ja virusgenomin jäljelle jääneen osan sisältävän plasmidin välille (’’pelastajaplasmidi”). Uusi genomi voidaan sitten leikata plasmidista ja 10 transfektoida virusta tuottaviin soluihin. Vaihtoehtoisesti pelastajaplasmidi voidaan kotransfektoida tuottajasoluihin niissä tapahtuvaa rekombinaatiota varten.
Eräässä keksinnön sovellusmuodossa käytetään plasmidirakennetta siirtogeeni(e)n sijoittamiseksi adenovirusvektoriin.
15 Eräässä keksinnön sovellusmuodossa adenovirusvektori tuotetaan solulinjassa. Yleensä eukaryoottisolut transfektoidaan adenovirusvektorilla, minkä jälkeen viruksia tuottavat solut valitaan, ekspandoidaan ja testataan. Keksinnön mukaiset virusvektorit on myös puhdistettava perusteellisesti ennen niiden antoa eläimille tai ihmisille.
20 Esillä olevaa keksintöä havainnollistetaan seuraavilla esimerkeillä, joita ei ole tarkoitettu millään tavalla rajoittaviksi.
Esimerkit
Soluviljeiy 293-soluja ostettiin Microbix-yhtymältä (Toronto, Kanada). 293-2v6- 25 11-solut sisältävät ponasteroni-indusoituvan E4orf6-alueen (Mohammadi E.S.
5 et ai. 2004, Nucleic Acids Res 32: 2652-2659). 911-1 c11 -soluja pidettiin 1 ^ mg/ml:ssa G418:aa (Sirena D. et ai. 2005, Virology 343: 283-298). Munasarja- V adenokarsinooman solulinja SKOV3.ip1 saatiin tri Price’ilta (M.D. Anderson
Cancer Center, Houston, TX). Tri Negrin (Stanford Medical School, Stanford, | 30 CA) ystävällisesti toimitti tulikärpäs-lusiferiinia ilmentävän munasarja- adenokar- sinooman solulinjan SKOV3-luc. Erittäin metastaattinen hormoneilla huonosti hoidettavissa oleva eturauhaskarsinooman alalinja PC-3MM2 oli ystävällinen o lahja Isaiah J. Findleriltä (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX).
o ^ LNM35/EGFP, erittäin lymfogeeninen metastaattinen ihmiskeuhkojen suurten 35 solujen karsinooman alalinja saatiin Takashi Takahashilta (The Honda Re- 20 search Institute, Japani). Ihmisen umbilikaalisen suonen endoteliaalisia soluja, joista käytetään nimitystä HUVEC, ostettiin Lonzalta (Basel, Sveitsi). Seuraa-vat solulinjat saatiin ATCC:ltä (Manassas, VA): munuaissolukarsinooma ACHN, keuhkoadenokarsinooma A549, ihmisen sidekudossolulinja FHS173WE, kolo-5 rektaalikarsinooma HTC116, rinta-adenokarsinooma CAMA-1, haiman epiteli-oidikarsinooma PANC-1. Kaikkia solulinjoja viljeltiin suositusten mukaisissa olosuhteissa.
Ad3-hTERT-E1:n konstruoiminen
Ad3-hTERT-E1:n kloonaamiseksi tehtiin kolme eri PCR:ää Ad3-wt-10 plasmidille pKSB2Ad3wt (Sirena D. et ai. 2005, Virology 343: 283-298), joista kaksi alkuperäisen TATA-laatikon jättämiseksi pois Ad3wt-sekvenssistä (kuviot 1-3). Ensimmäiseen PCR-tuotteeseen kuului LITR ja sen Mlul-digestio TA-TA-laatikkoon asti (forward-aluke: 5’-CAT GGT ACC CAA GTG TGT CGC TGT CGA GT-3’ (sekvenssitunnistenro 1), reverse-aluke: 5-CAT GAT ATC AGC 15 GAT CAG CTG ACA CCT AC-3’ (sekvenssitunnistenro 2); Kpnl:n lisäys alkuun ja EcoRV-sivun loppuun), toinen alkoi suoraan TATA-laatikolta E1A-alueen ensimmäiseen puoliskoon asti (forward-aluke: 5-CAT GAT ATC GTG CCA GCG AGA AGA GTT TT-3’ (sekvenssitunnistenro 3), reverse-aluke 5-CAT TCT AGA GCG AGC ACA ATA GTT CTT TCA-3’ (sekvenssitunnistenro 4); 20 EcoRV:n lisäys alkuun ja Xbal:in loppuun). Kolmas PCR amplifioi 1600 bp adenovirustyypin 3 lopusta, mukaan lukien RITR. Vastaavasti digestoidut ensimmäiset kaksi PCR-tuotetta TATA-laatikon ympärillä kloonattiin Kpnl/Xbal-digestoituun kloonausvektoriin pUC19, jolloin saatiin pGBAd3E1, jossa on Ad3-sekvenssin alku, josta oli jätetty pois TATA-laatikko. pBT255:stä johdettu 25 hTERT-promoottori digestoitiin Kpnl/Xhol:illa, pyöristettiin ja kloonattiin E1- ° alueen eteen pGBAd3E1 :n EcoRV-digestiolla, jolloin saatiin pGBAd3-3hTERT- 0 w E1.
^ Kolmas PCR-tuote, jonka päässä oli Ad3-sekvenssi, kloonattiin nyt
Notl/pyöristetyksi pShuttle:ksi, jonka jälkeen seurasi digestio Hindllklla, ja 1 30 kloonattiin sitten Hindlll-digestoituun pGBAd3-hTERT-E1:een, jolloin saatiin pSGBAd3-hTERT-E1 sukkulavektoriksi, jonka lopussa ja modifioituna alkuna oli adenovirusgenomi 3. Lopuksi pSGBAd3-hTERT-E1 digestoitiin Xhol/Mscl:llä, g minkä tuloksena plasmidi avautui adenovirus 3 sekvenssin modifioidun alun ja ^ säilytetyn lopun välille, ja rekombinoitiin homologisesti Mlul-digestoidulla ja si- 35 ten pääketjusta vapaalla pKSB2Ad3wt:lla samasta resistenssigeenistä johtu- 21 van taustan vähentämiseksi ja Ad3-hTERT-E1-sekvenssin (pKGB-Ad3-hTERT-E1:n) sisältävän plasmidin aikaansaamiseksi.
Rekombinanttivirus Ad3-hTERT-E1A pelastettiin transfektoimalla 911 -1 c11 -soluja Mlul-digestoidulla pKGB-Ad3-hTERT-E1:lla. Tätä seurannut 5 ensimmäisen suuren Ad3-hTERT-E1A-virusvarannon amplifikaatio tehtiin 293-2v6-11-soluissa, minkä jälkeen seurasi 2. amplifikaatio A549-soluissa. Amplifi-kaation jälkeen virukset puhdistettiin kaksoiscesiumkloridigradienteilla. PCR:llä varmistettiin, että varannoissa ei ollut serotyypin 5 kontaminaatiota (vakiome-netelmän osalta katso Kanerva A. et ai. 2003, Mol Ther 8: 449-458). Seuraa-10 vaksi vahvistettiin hTERT-promoottorin läsnäolo E1A:n edessä (Kuvio 3). 270bp-kaistan saamiseksi käytetyt alukkeet olivat 5-GGT TAT GCC AGG GTG GAG TA-3’ forward (sekvenssitunnusnro 5) ja 5-AAG GTG AAG GGG CAG GAC-3’ reverse (sekvenssitunnusnro 6). 210bp-kaistan osalta käytetyt alukkeet olivat 5’-AGC CCC TCC CCT TCC TTT-3’ forward (sekvenssitun-15 nusnro 7) ja 5’-CCC GGT CTC ACT GGA GAT AA-3’ reverse (sekvenssitunnusnro 8). Seuraavaksi PCR-kaistat sekvensoitiin ja ennakoitu sekvenssi saatiin (katso sekvenssitunnusnro 9 ja kuvio 10).
Lopuksi Ad3-hTERT-E1A:ta havainnoitiin elektronimikroskoopilla (katso kuvio 9).
20 Muut adenovirukset
Keksinnön kannalta olennaiset adenovirukset ovat taulukossa 1. o δ
(M
sj-
(M
X
CC
CL
m h-· m σ> o o
(M
22
Taulukko 1. Adenovirukset
Viruksen nimi Pää- Säieu- E1A Suhde Viite ketjun lok- (VP/pfu) sero- keen tyyppi sero- ___tyypp»____
Ad5wt 5 5 Villityyppi 19 ATCC
(Ad300 wt- ______kanta)_
Ad5/3-hTERT- 5 3 hTERT-promoottorin 10 Bauer- E1A alainen (välittää se- schmitz lektiivisyyden telo- G.J. et ai.
meraasiaktiivisiin 2008, Can- soluihin) cer Res 68: 5533-5539 (Tässä nimellä Ad5/3-hTERT- _______
Ad5/3-A24 5 3 24bp-deleetio (välit- 22 Kanerva A.
tää selektiivisyyden et ai. 2003, p16/Rb-polun mu- Mol Ther 8: ____tanttikasvainsoluille)___449-458.
Ad5/3luc1 5 3 Deletoitu (tekee vi- 5 Kanerva A.
rusreplikaation puut- et ai. 2002, teelliseksi) Clin Cancer
Res 8: 275- ______280_
Ad3 wt 3 3 Villityyppi 9 Sirena D. et ai. 2005, Virology 343: 283- ______290_
Ad3-hTERT- 3 3 hTERT-promoottorin 9 Tämä ha- E1A alainen (välittää se- kemus ° lektiivisyyden telo- o meraasiaktiivisiin .____soluihin)___ i
CM
x Progressiivisen infektiivisyyden määritys
Ad5-pohjaisten virusten osalta vakiintunut metodologia oli optimoi-5 tava Ad3-villityypin ja Ad3-hTERT-E1A:n hitaamman replikaation huomioonot-
LO
§ tamiseksi. Tavanomainen 10 päivän sympaattisen vaikutuksen määritys ei ollut ° riittävä funktionaalisen tiitterin arvioimiseksi, joten kehitimme dynaamisemman progressiivisen infektiivisyyden määrityksen (Kuvio 3c), jossa sympaattisen 23 vaikutuksen annettiin kehittyä kunnes tiitteri tasoittui. Tämä edustaa viruksen varsinaista funktionaalista tiitteriä.
Solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille, 10 000 solua/kuoppa, ja seu-raavana päivänä rivit infektoitiin alentamalla Ad3-hTERT-E1A:n laimennusta 5 arvosta 10'5 arvoon 10'12, ja kukin laimennus tehtiin kymmenenä kappaleena. Infektio tehtiin DMEM:issä, FBS 2 %. Levyjä havainnoitiin mikroskoopilla, ja vi-ruskuoppia verrattiin verrokkikuoppiin. Havainnoista laskettiin pfu/ml samalla tavalla kuin TCIDsoissä (Adeasy manual, Agilent Technologies, Inc. 2008). Väliaine (DMEM, FBS 5 %) vaihdettiin 4-7 päivän välein.
10 In vitro virus saavutti maksimitiitterin hitaammin, ja funktionaalinen infektiivisyyskoe vei 35 päivää.
In vitro -sytotoksisuusmääritykset
Soluja maljattiin 10 000 solua/kuoppa 96 kuoppaisille levyille. Seu-raavana päivänä kolminkertaistuneet tai nelinkertaistuneet solut infektoitiin vi-15 ruksilla, joita oli 0,1-100 viruspartikkelia/kuoppa. Infektio tehtiin 2-prosenttisessa naudan sikiöseerumissa (FBS). Levyjä havainnoitiin säännöllisesti, ja kasva-tusliuos vaihdettiin 3-5 päivän välein. 6-20 päivän kuluttua, kunkin linjan opti-miajan mukaan, solujen elinvoimaisuus analysoitiin MTS-määrityksellä (Cell Titer 96, AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega). MTS-20 analyysit tehtiin seuraavina päivinä: PC-3MM2 päivänä 8, A549 päivänä 17, HTC116 päivänä 6, SKOV3,ip1 päivänä 18, HUVEC päivänä 11, FSH174WE päivänä 13, LNM-35/EGFP päivänä 10, CAMA-1 päivänä 11, PANC-1 päivänä 20 ja ACHN päivänä 11.
Vaikka molemmat kokonaan Ad3:n mukaiset virukset lopulta tappoi-25 vat kaikki syöpäsolut sytotoksisessa määrityksessä, ne vaikuttivat hitaammilta ° kuin Ad5-pohjaiset onkolyyttiset aineet, mukaan lukien 5/3 serotyypin kimeerit.
^ Ei-syöpäsoluissa Ad3-hTERT-E1A oli vähemmän toksinen kuin kontrolliviruk- V set, mukaan lukien Ad3 villityyppi. Ad3-hTERT-E1A ei kyennyt tappamaan so- luja, joissa ei ollut Ad3-reseptoria.
X
30 Ad3-hTERT-E1A:n onkolyyttinen teho syöpäsolulinjoissa in vitro jo Ad3-hTERT-E1A:n kyky tappaa syöpäsoluja in vitro analysoitiin in- σ> fektoimalla seitsemää eri kasvaintyyppiä edustavia monokerroksia (kuvio 4 ja
O
^ kuvio 7). Kaikissa maligneissa solulinjoissa Ad3-hTERT-E1A osoitti täydellistä onkolyysiä, kun taas ei-replikoituva Ad5/3luc1-virus ei tappanut soluja ollen-35 kaan (p<0,05). Kuitenkin, kuten viruksen kasvatuksesta ja titrauksesta saatu- 24 jen kokemuksien perusteella oletettiin, Ad3-hTERT-E1A oli jonkin verran hitaampi kuin serotyypin 5 virukset.
Ad3-hTERT-E1A:n kasvainselektiivisyys
Kasvainselektiivisyyden analysoimiseksi infektoimme ihmisen umbi-5 likaalisen solun endoteliaalisoluja (HUVEC) ja fibroblasteja (FSH173WE) samoilla viruksilla ja teimme soluntappomäärityksiä (kuvio 5). Matalilla viruspitoi-suuksilla soluntappamista ei havaittu, ja korkeammilla annoksilla Ad3-hTERT-E1A oli vähemmän toksinen kuin kontrollivirukset Ad3wt, Ad5wt, Ad5/3-hTERT-E1A, Ad5/3-A24 (0,1, 1 ja 10 VP/solu P<0,05). Aiemman Ad5/3-kimee-10 rien puitteissa tehdyn työn perusteella tiesimme, että LNM-35/EGFP:tä ei voi infektoida Ad5/3:lla, joten siitä voi puuttua Ad3-reseptori (Särkioja M et ai. 2006, Cancer 107: 1578-1588). Niinpä Ad3-hTERT-E1A:n tai Ad3-villityypin yhteydessä ei havaittu soluntappamista.
Eläinkokeet 15 Kaikki eläinkokeet olivat Helsingin yliopiston koe-eläinlautakunnan ja Etelä-Suomen lääninhallituksen hyväksymiä. Hiirten terveydentilaa tarkkailtiin tiheästi, ja niille tehtiin eutanasia heti kun huomattiin merkkejä kivusta tai tuskasta. Ihonalaisessa mallissa käytettiin paljaita NMRI-naarashiiriä (Charles River, Saksa). Ne tilattiin 3-4 viikon ikäisinä ja pidettiin karanteenissa kaksi 20 viikkoa. Intraperitoneaalisessa mallissa käytettiin naaraspuolisia SCID Fox-Chase -hiiriä. Ne tilattiin 6-7 viikon ikäisinä ja pidettiin karanteenissa neljä kuukautta.
Onkolyyttinen teho in vivo o Testasimme Ad3-hTERT-E1A:n tehoa hiirissä, joilla oli PC-3MM2 ° 25 eturauhassyövän ksenografteja (kuvio 6). Ad3-hTERT-E1A kykeni vähentä- ^ mään kasvaimen kasvua merkittävästi verrattuna PBS-injektoihin (P=0,0035).
4- Mielenkiintoista oli, että vaikka virus oli hitaampi kuin positiiviset kontrollit in vit-
CM
x ro, tehokkuudessa in vivo ei ollut eroa. Ad3-hTERT-E1A oli ainakin yhtä onko- lyyttinen kuin Ad5- ja Ad5/3-pohjaiset kontrollit in vivo. Hiirillä, joilla oli A549-£ 30 ksenografteja, Ad3-hTERT-E1A-ryhmässä oli pienimmät kasvaimet päivästä g 17 eteenpäin, mutta koska kasvaimen kasvu oli nopeaa PBS-ryhmässä ja kyti seinen ryhmä lopetettiin päivänä 17, kokeen tilastollista tehoa menetettiin mer kittävästi. Päivänä 17 voitiin nähdä rajatapausero (P=0,051) verrattaessa Ad3-hTERT-E1A:ta ja PBS:ää. Päivänä 30 Ad3-hTERT-E1A oli vähentänyt kasvai- 25 men kasvua merkittävästi (P=0,01) paremmin kuin Ad5/3-hTERT-E1A, joka tiedetään erittäin tehokkaaksi onkolyyttiseksi adenovirukseksi (Bauerschmitz G.J. et ai. 2008, Cancer Res 68: 5533-5539).
Ihonalaiset kasvaimet eivät välttämättä ole optimaalisia korvikkeita 5 ihmisen syöville, joten siirryimme käyttämään ortotopista mallia, jossa oli intra-peritoneaalisesti levinnyt karsinomatoosi, joka oli käynnistetty lusiferaasia ilmentävillä SKOV3Luc-soluilla (Kuviot 6c, d). Ad3-hTERT-E1A vähensi merkittävästi lusiferaasisignaalia PBS:llä hoidettuihin hiiriin (p<0,0001) verrattuna. Eri replikaatiokompetenttien virusten välillä ei ollut mitään tehokkuuseroa. Ad3-10 hTERT-E1A pidensi hiirten henkijäämisen keskiarvoa 34:stä 46 päivään (PSB versus Ad3-hTERT-E1A), jolloin tuloksena oli merkittävä ero Kaplan-Meyerin elonjääntianalyysissä (p=0,01). Yksi seitsemästä Ad3-hTERT-E1A:lla hoidetusta hiirestä pysyi hengissä kokeen loppuun asti (päivä 120) ja mahdollisesti parani, koska mitään todisteita kasvaimesta ei pystytty havaitsemaan lusife-15 raasikuvantamisessa tai koepalassa, ja hiiri käyttäytyi normaalisti.
Subkutaaninen eläinkoe
Hiiret saivat ihonalaisena ruiskeena kumpaankin kylkeen 2 x 106 PC3MM2:ta tai 5 x 106 A549-solua. Kun oli kulunut 13 ja, vastaavasti, 11 päivää, kasvaimet olivat kehittyneet mitattavissa olevaan kokoon, ja hiiriä hoidet-20 tiin kasvaimensisäisesti 109 viruspartikkelilia PBS:ssä tai pelkällä PBS:llä. In-jektiomäärä kasvainta kohti oli 50 μΙ. Injektio toistettiin yhden ja kahden viikon kuluttua. Kasvaimia mitattiin usein, ja volyymi laskettiin V = L x H2 x 0,52. Ennen ensimmäistä hoitoa mitatun volyymin katsottiin olevan 100%, ja kasvaimen kasvua verrattiin tähän. A549-ryhmässä jotkin PBS:llä hoidetut kasvaimet 25 kasvoivat aggressiivisesti, ja hiirille oli tehtävä eutanasia kahden ja puolen vii- ° kon kuluttua, o
(M
^ Intraperitoneaalinen eläinkoe i ^ Kehitettiin ortotooppinen malli peritoneaalisesti laajalle levinneestä x munasarjasyövästä injektoimalla SCID-hiiriin 5 x 106 SKOV3luc solua intraperi- 30 toneaalisesti 300 μητββθ puhdasta DMEM:iä. Kolmen päivän päästä hiiret in (n=7) kuvannettiin ei-invasiivisesti ja niitä hoidettiin intraperitoneaalisesti injek- σ> toimalla PBS:ää tai 109 viruspartikkelia PBS:ssä hiirtä kohti. Hiiret kuvannettiin o ° päivinä 3, 7, 14, 21, 28, 35 ja 42 käyttämällä IVIS 100 (Xenogen, Alameda, CA, USA) kasvainsolujen määrän arvioimiseksi hiirissä (kuvio 8). Biolumine-35 senssilla tapahtuvaa kuvantamista varten injektoitiin 150 mg/kg D-lusiferiiniä 26 (Promga, Madison, Wl, USA) intraperitoneaalisesti ja kuvattiin 10 minuutin kuluttua 10 s:n valotusajalla, aukolla 1, keskitason binnauksella (medium binning) ja suodin auki. Kuvantamisen aikana hiiret olivat isofluraanikaasuanestesiassa. Kuvien päälle ladattiin Living Image 2.50 (Xenogen). Kokonaisvirta (fotoneita/s) 5 mitattiin piirtämällä kohdealueet (regions of interest, ROI) hiirten peritoneaali-sen alueen ympärille. Tausta poistettiin.
Tilastoanalyysi
Non-parametrisellä Man-Whitney -testillä (SPSS 15.0 Windows-käyttö-järjestelmälle) verrattiin kahta itsenäistä näytettä in vitro -datan osalta koko-10 naan ja in vivo -datan osalta osittain. Kasvainkoko analysoitiin toistettavien mittausten mallilla käyttämällä PROC MIXED (SAS Ver. 9.1). Kasvainkoon mittauksilla ajettiin mallit luonnollisen metriikan mukaan ja tehtiin log-muunnos. F-testeillä arvioitiin, mitä vaikutuksia oli käsittelyryhmällä, päivien lukumäärän mukaisella ajalla ja käsittelyryhmän ja ajan keskinäisellä vaikutuksella. Mallien 15 kaarevuus testattiin neliöllisellä termillä ajan suhteen. A priori suunnitellut vertailut ennustettujen hoitokeinojen erityiserojen välillä keskiarvoistuivat ajan myötä, ja viimeisenä ajankohtana ne laskettiin t-tilastona. A549-kokeen osalta vertasimme ryhmiä päivien 17 ja 30 kohdalla ja PC-3MM2:ta päivän 30 kohdalla ja määritimme aikakeskiarvon. Eloonjääminen arvioitiin käyttämällä logrank-20 regression sisältävää Kaplan-Meierin elonjäämiskäyrää (SPSS 15.0 Windows-käyttöjärjestelmälle). Kaikkien analyysien osalta kaksisuuntainen P-arvo, joka oli <0,05, arvioitiin tilastollisesti merkittäväksi.
hNIS:n ja/tai GMCSF:n käsittävät virus rakenteet
Keksinnön mukaiseen Ad3-pohjaiseen vektoriin lisätään hNIS- ja/tai ° 25 GMCSF-siirtogeeni alalla tunnettuja menetelmiä käyttäen tai kuten edellä esi- ^ tetyissä tai seuraavissa esimerkeissä on kuvattu (katso myös kuviot 1 ja 2): i ^ I. hNIS-siirtogeeni
(M
x MATERIAALIT JA MENETELMÄT
cc
Soluviljely 30 Androgeeneista riippumattomia eturauhassyövän solulinjoja 22Rv1,
LO
g PC-3, DU-145 ja keuhkojen adenokarsinooman solulinja A549 ostettiin ° ATCC:ltä (Manassas, VA). PC-3MM2-solut ovat metastaattinen, hormoneilla huonosti hoidettavissa oleva PC-3:n alalinja (jonka Isaiah J. Fidler, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, ystävällisesti luovutti). Ihmissikiön munuais- 27 ten epiteeliin liittyviä 293-soluja ostettiin Microbixiltä (Toronto, Kanada). Solu-linja 911 saatiin tri Alex J. van der Ebiltä (Leidenin yliopisto, Alankomaat). Kaikkia solulinjoja viljeltiin suositusten mukaisissa olosuhteissa.
Virusrakenteet 5 Jotta saatiin aikaan Ad5/3-A24-hNIS, EcoRI-digestoitu ja pyöristetty hNIS-framentti (peräisin pcDNA3-hNIS:stä, jonka Steve Russell, Mayo Clinic, Rochester, MN, ystävällisesti luovutti) insertoitiin BsiWI-Mfel-digestoituun ja pyöristettyyn pTHSN:iin (Kanerva A. et ai. Gene Ther 12: 87-94) pTHSN-hNIS:n saamiseksi. Kontrolliviruksen Ad5/3-A24-Agp19K tekemiseksi, BsiWI-10 Mfel-digestoitu ja pyöristetty pTHSN itse-ligatoitiin, jolloin tuloksena oli pTHSN-Agp19K. Jotta saatiin pAd5/3-A24-hNIS ja pAd5/3-A24Agp19K, Pmel-linearisoitu pShuttle-A24 (Suzuki K. et ai. 2002, Clin Cancer Res 8: 3348-59) ja pAd5/3-E1-hNIS tai pAd5/3-E1-Agp19K elektroporoitiin BJ5183-soluihin.
Adenovirusplasmidit linearisoitiin ja transfektoitiin 911 soluun Super-15 fectilla (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan ohjeiden mukaan. Adenovirus-pesäkkeet poimittiin ja virukset propagoitiin A549-soluisa ja puhdistettiin va-kiomenetelmiä käyttäen. Ad5/3-A24- ja Ad5/3luc1-virukset konstruoitiin aiemmin (Kanerva A. et ai. 2003, Mol Ther 8: 449-58; Kanerva A, et ai. 2002, Clin Cancer Res 8: 275-80). Viruspartikkelit (VP) määritettiin spektrofotometrialla ja 20 plakkia muodostavat yksiköt (plaque forming units, pfu) TCID50-määrityksellä. Tiitterit olivat Ad5/3-A24- hNIS: 1,1 x 1012 VP/ml; 9,0 χ 1010 pfu/ml, Ad5/3-A24-Agp19K: 1,5 x 1012 VP/ml; 2,8 x 1011 pfu/ml, Ad5/3-A24: 1,7 x 1012 VP/ml ja Ad5/3luc1: 6,9 x 1011 VP/ml.
RT-PCR
o 25 Eturauhassyöpäsolut infektoitiin Ad5/3-A24-hNIS:llä ja Ad5/3-A24- ^ Agp19K:lla (10 VP/solu) 2 tunnin ajan +37 °C:ssa. Solut kerättiin 24 ja 48 h in- fektion jälkeen. Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Kit:iä (Qiagen) ja ^ käsiteltiin DNaseJIa ennen RT-PCR:ää. Jokaiseen reaktioon käytettiin 350 ng x kokonais-RNA:ta. Amplifikaatio (35 kierrosta, lämpökäsittely +54 °C:ssa) tehtiin
CC
30 OneStep RTPCR Kit:illä (Qiagen) käyttämällä hNIS-spesifisiä alukkeita (For-lÖ ward 5-CTT CTG AAC TCG GTC CTC AC-3' (sekvenssitunnistenro 10); Re- σ> verse 5-TCC AGA ATG TAT AGC GGC TC-3’ (sekvenssitunnistenro 11)) ja β- o aktiinispesifisiä alukkeita (Forward 5-CGA GGC CCA GAG CAA GAC A -3'
(sekvenssitunnistenro 12); Reverse 5-CAC AGC TTC TCC TTA ATG TCA CG
28 -3' (sekvenssitunnistenro 13)). PCR-tuotekoko hNIS:lle oli 453 bp ja, vastaavasti, β-aktiinille 482 bp.
Jodikertymä
Eturauhassyöpäsoluja infektoitiin Ad5/3-A24-hNIS:llä ja Ad5/3-A24-5 Agp19K:lla (10 VP/solu) 2 h +37 °C:ssa. Solut pestiin 1 x PBS:llä 24 ja 48 h infektioiden jälkeen ja inkuboitiin 7,4 kBq:llä natriumjodia [125l]Nal (MAP Medical Technologies Oy, Tikkakoski, Suomi) 20 minuuttia huoneenlämpötilassa. Solut pestiin kahdesti 1 x PBS:llä, jotka sitten lyysattiin 300 μΜΙθ Cell Culture Lysis Reagentia kutakin näytettä kohti (Promega, Madison, Wl). Radioaktiivisuus 10 kvantifioitiin kuoppalaskurilla, joka oli liitettynä monikanava-analysaattoriin Atomlab 950 (Biodex Medical System, Shirley, NY).
Soi u ntappomääritykset
Eturauhassyöpäsoluja infektoitiin Ad5/3-A24-hNIS:llä, Ad5/3-A24-Agp19K:lla, Ad5/3-A24:llä ja Ad5/3luc1:llä käyttämällä 0,01; 0,1; 1; 10 ja 100 15 VP/solu. Kasvatusliuos vaihdettiin joka toinen päivä. Solujen elinkelpoisuus määriteltiin 6 päivää p.i. (post infection, infektion jälkeen) PC-3MM2:n, 7 päivää p.i. DU-145:n ja PC-3:n ja 9 päivää p.i. 22Rv1-solujen osalta.
-9 päivää infektion jälkeen CellTiter 96 AGueous One Solution -liuoksella solun proliferaatiomääritys [josta käytetään myös nimitystä 3-(4,5-20 dimetyylitiatsol-2-yyli)-5-(3-karboksimetoksifenyyli)-2-(4-sulfofenyyli)-2/-/-tetrat-solium [MTS] -määritys; Promega, Madison, Wl).
Kudosviljelyä infektoivan annoksen (TCID50) määritys
Solulinjanäytteet: 5 x 104 eturauhassyöpäsolua/kuoppa maljattiin o kolminkertaisesti 1 rnhssä 5-prosenttista GM:ää 24-kuoppaisille levyille, inku- ^ 25 boitiin yön yli ja infektoitiin Ad5/3-A24- hNIS:llä (5 vp/solu) 2 h +37 °C:ssa. In- ^ fektion jälkeen 8, 24, 48 ja 72 h kohdalla infektiosolut ja kasvatusväliaine kerät- 4- tiin, pakastettiin -80 °C:ssa ja tehtiin pakastus-sulatus kolme kertaa. TCID50:n
(M
x kudosnäytteet lingottiin ja supernatantti lisättiin 293-soluille.
* Kudosnäytteet: Ad5/3-A24-hNIS:llä ja 131 l:llä hoidettujen hiirten S 30 elimet kerättiin, punnittiin, homogenoitiin manuaalisesti ja laimennettiin h-.
g 800 ^:aan DMEM:iä. Niille tehtiin pakastus-sulatus -80 °C:ssa kolme kertaa, o TCID50-määritystä varten kudosnäytteet lingottiin ja supernatantti lisättiin 293- soluihin.
29
Molemmissa kokeissa 104 293-solua maljattiin 100 ^:ssa 5-pro-senttista DMEM:iä 96-kuoppaisille levyille, inkuboitiin yön yli ja infektoitiin edellisten kokeiden supernatantilla. CPE:n kehitys määritettiin 10 päivän kuluttua tiitterin arvioimiseksi.
5 In vivo -tutkimukset
Uros-NMRI/nude-hiiriä ostettiin Taconilta (Ejby, Tanska). Kahdeksanviikkoisiin hiiriin sijoitettiin kasvaimia injektoimalla subkutaanisesti 5 x 106 PC-3MM2 solua medetomidiini-ketamiini-0,9-prosenttinen suolaliuos (1:2:7) -anestesiassa. Kuvantamiskokeessa kolme hiirtä sai kasvaimensisäisesti suo-10 laliuosta (ylhäällä vasemmalla olevaan kasvaimeen), 7 x 108 VP Ad5/3-A24-Agp19K (ylhäällä oikealla olevaan kasvaimeen) ja 7 x 108 VP Ad5/3-A24-hNIS (alhaalla oikealla ja vasemmalla oleviin kasvaimiin) 11 ja 12 päivää kas-vainsolun inokulaation jälkeen. Viimeisen virusinjektion jälkeisenä päivänä hiiret saivat laskimonsisäisesti 1,85 MBq natriumjodia [123l]Nal (MAP Medical 15 Technologies Oy; Tikkakoski, Suomi), jonka jälkeen seurasi kuvantaminen gammakameralla Toshiba 7200A/UI (Toshiba, Tokio, Japani) 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 4 h ja 13 h jodialtistuksen jälkeen. Eläinsäännösten vuoksi analyysi ei ollut mahdollinen myöhempinä ajankohtina. Gammaenergian huippu 159 keV rekisteröitiin 20-prosenttisella ikkunalla, ja kuvaa kohti kerättiin 150 kilolukemaa. 20 Käytetty matriisikoko oli 256 x 256 x 16, jolloin pikselikooksi tuli 1,08 mm x 1,08 mm. 13 tunnin kohdalla eri elimiä (sydän, keuhkot, maksa, perna, munuaiset, kilpirauhanen, mahalaukku, lihas, veri ja luu) ja kasvaimet kerättiin, punnittiin ja analysoitiin kuoppalaskurilla, joka oli liitetty monikanava-analysaattoriin Atomlab 950 (Biodex Medical System, Shirley, NY). Tulokset on esitetty pro-25 sentteinä kudoksen alkujodiannoksesta grammaa kohti (ID%/g).
2 Hoitokoetta varten hiiret, joilla oli kasvaimia, satunnaistettiin neljään ^ ryhmään (6 hiirtä/ryhmä, 2 kasvainta/hiiri): valeryhmä, 1311, Ad5/3-A24-hNIS ja V Ad5/3-A24-hNIS + 1311. 6 ja 7 päivää kasvainsolun inokulaation jälkeen hiiret saivat kasvaimensisäisesti joko kasvatusliuosta tai 7 x 108 VP Ad5/3-A24-^ 30 hNIS:ää kasvainta kohti. Viimeisen virusinjektion jälkeisenä päivänä hiiret sai- vat intraperitoneaalisesti 50 MBq kantaja-vapaata natriumjodia ([131 IjNal MAP Medical Technologies Oy, Tikkakoski, Suomi). Kasvainkoko mitattiin joka toi-
LO
§ nen päivä ja tilavuus laskettiin kaavalla (pituus x leveys 2 x 0,5). Kun hiiret loci pettiin kasvaimen koon takia, elimet kerättiin, punnittiin ja niiden radioaktiivi- 35 suus määritettiin gammalaskimella (Wizard 3, PerkinElmer, Turku, Suomi) 180 sekunnin ajan. Tulokset on ilmaistu prosentteina alkuperäisestä jodiannokses- 30 tas kudosgramma kohti (ID%/g). Koko ruumiin emittoima radioaktiivisuus mitattiin päivinä 9, 10, 11, 13, 14, 15 ja 17. Päivinä 9-11 mittaukset tehtiin annoska-libraattorilla (CRC-120, Capintec, Inc., Meridien, NJ)ja päivän 11 jälkeen koko kehon mittauslaitteella, joka muodostuu lyijymittauskammiosta ja UniSpecin 5 putkipohjaisesta natrium-jodi-skintillaatiokiteen sisältävästä monikanava-ana-lysaattorista (Canberra Industries, Inc., Meridien, CT). Hiiret punnittiin päivänä 14, ja samaa painoa käytettiin kaikissa kokeen aikana tehdyissä laskutoimituksissa.
Kaikissa kokeissa hiiret lopetettiin, kun kasvain saavutti 15 mm:n 10 koon minkä tahansa halkaisijan osalta, kuten eläinsäännökset edellyttävät. Hoidollinen in vivo -koe oli lopetettava päivänä 17 eläintenpidon rajoitteiden vuoksi. Kaikki eläinkokeet olivat Suomen kansallisen koe-eläinlautakunnan hyväksymiä (Etelä-Suomen lääninvirasto, Hämeenlinna, Suomi).
Tilastoanalyysi
15 Jodikertymä analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANO
VA) Bonferronin post-hoc testillä. Koeryhmien välillä tehtiin kasvaintilavuuden analyysi ajan kuluessa käyttämällä toistettavien mittausten mallia PROC Ml-XED:illä (SAS Ver. 9.1, Cary, NC). Kasvaintilavuuden mittaukset log-muun-nettiin normaaleiksi. A priori suunnitellut vertailut ennustettujen hoitokeinojen 20 erityiserojen välillä keskiarvoistuivat ajan myötä ja jokaisena ajankohtana t-tilastoilla, ja tarkistusten tekemiseen käytettiin Tukey-Kramer-mallia. Kaksisuuntainen p-arvo<0,05 arvioitiin tilastollisesti merkittäväksi kaikissa analyyseissä.
Tulokset hNIS-spesifinen mRNA havaitaan Ad5/3-A24-hNIS-infektoiduissa eturau- ° 25 hassyöpäsoluissa o ^ Koostettiin uusi virus, joka sisälsi Ad3-ulokkeen (knob) Ad5-säie- V varressa, 24 bp-deleetion E1A-alueella ja E3:een insertoidun hNIS:n. Siirtoni geenin ilmentymisen arvioimiseksi viruksesta hormoneilla huonosti hoidettavis- sa olevat eturauhassyövän solulinjat PC-3MM2, 22Rv1, PC-3 ja DU-145 infek-30 toitiin Ad5/3-A24-hNIS:llä tai Ad5/3-A24-Agp19K:lla (positiivinen kontrolli ilman siirtogeeniä) ja analysoitiin RT-PCR:llä 24 ja 48 h infektion jälkeen. Kaikissa
LO
§ Ad5/3-A24-hNIS-infektoiduissa solulinjoissa oli 454 bp:n kokoinen, hNIS-spesi- oj finen amplifikaatiotuote, mikä viittaa siihen, että hNIS ilmentyy viruksen geno- mista. Sitä vastoin Ad5/3-A24-Agp19K-infektoidut solut tai solut per se eivät 35 tuottaneet amplifikaatiotuotetta.
31
Ad5/3-A24-hNIS voi välittää tehokkaan jodikertymän eturauhassyöpä-soluihin
Viruksesta ilmentyneen hNIS:n toiminnallisuuden arvioimiseksi etu-rauhassyöpäsoluja infektoitiin Ad5/3-A24-hNIS:llä tai Ad5/3-A24-Agp19K:lla ja 5 altistettiin sitten 125l:lle ja jodikertymän kvantifioinnille (kuvio 11). Verrattaessa infektoimattomiin tai kontrolliviruksella hoidettuihin soluihin Ad5/3-A24-hNIS antoi tulokseksi merkittävästi korkeamman jodikertymän kaikissa tutkituissa so-lulinjoissa. Vertailuinfektioon verrattuna Ad5/3-A24-hNIS aiheutti jopa 2,5 (p<0,001) ja 3 (p<0,001) kertaa suuremman jodikertymän PC-3MM2- ja, vas-10 taavasti, 22Rv1-soluissa. PC-3-ja DU-145-soluissa nähtiin vaatimattomampi, mutta silti merkittävästi vahvistunut kertymä valehoidettuihin soluihin verrattuna (1,6 (p<0,05) ja, vastaavasti, 1,3 (p<0,001) kertaa korkeampia tasoja). Ad5/3-A24-Agp19K-hoito ei tuottanut jodikertymää, mikä viittaa siihen, että jodikertymän välitti Ad5/3-A24-hNIS:stä ilmentynyt hNIS eikä niinkään virusinfektio tai 15 replikaatio per se.
Ad5/3-A24-hNIS replikoituu eturauhassyöpäsoluissa ja aiheuttaa niiden onkolyysiä
Eturauhassyöpäsoluja infektoitiin Ad5/3-A24-hNIS:llä, Ad5/3-A24-Agp19K:lla, Ad5/3-A24:llä ja Ad5/3luc1:llä, minkä jälkeen määritettiin solujen 20 elinkelpoisuus 6 (PC3-MM2), 7 (PC-3 ja DU-145) tai 9 (22Rv1) päivää infektion jälkeen (kuvio 12). Ad5/3-A24-hNIS:llä soluntappo osoittautui tehokkaaksi kaikissa tutkituissa eturauhassyövän solulinjoissa. Nopein ja tehokkain onkolyysi nähtiin PC-3MM2-soluissa, joissa saavutettiin lähes täydellinen solukuolema 6 päivää infektion jälkeen käyttämällä Ad5/3-A24-hNIS:ää 1 VP/solu. Lisäksi on-25 kolyysi oli samankaltainen kuin Ad5/3-A24-Agp19K:n yhteydessä todettu.
O
5 Muissa eturauhassyövän solulinjoissa Ad5/3-A24-hNIS:n onkolyyttinen teho oli ^ hieman pienempi kuin Ad5/3-A24-Agp19K:n. Itse asiassa Ad5/3-A24-Agp19K, V jolla on osittainen deleetio E3:ssa, osoitti suurinta onkolyyttistä tehoa kaikissa ^ tutkituissa solulinjoissa. On mahdollista, että Ad5/3-A24-hNIS:n suurempi ge- | 30 nomikoko voi vaikuttaa onkolyysin nopeuteen Ad5/3-A24-Agp19K:hon verrat- tuna. hNIS-siirtogeeni on ~2,2 kbp, mikä yhdessä 1 kbp:n Agp19K:n kanssa pi- tää genomin koon alle 105%:ssa, minkä on esitetty olevan tärkeää viruksen o toiminnallisuuden säilymisen kannalta. Ad5/3-A24-hNIS:n replikoituvuutta arvi- o ™ oitiin PC-3- ja 22Rv1-soluissa, joissa TCID50-määritys osoitti infektiopartikke- 35 leiden määrän kasvun ajan funktiona.
32
Ad5/3-A24-hNIS pystyy välittämään radioaktiivisen jodikertymän eturau-hassyöpäsoluihin
Ihonalaisia PC-3MM2-kasvaimia sijoitettiin uros-nude/NMRI-hiiriin. Alemmat kasvaimet infektoitiin kasvaimensisäisesti kahtena peräkkäisenä päi-5 vänä Ad5/3-A24-hNIS:llä 7 x 108 VP/kasvain ja oikealla ylhäällä oleva kasvain samalla annoksella Ad5/3-A24-Agp19K:ta (kuviot 13A ja B). Ylhäällä vasemmalla olevalle kasvaimelle tehtiin vertailuhoito. Viimeistä virusinjektiota seuraa-vana päivänä annettiin laskimonsisäisesti 1,85 MBq 123l:tä hiirtä kohti, ja hiiret kuvannettiin gammakameralla 0,5-13 h 123l-injektion jälkeen. Jonkin verran 10 jodikertymää Ad5/3-A24-hNIS:llä hoidettuihin kasvaimiin nähtiin jo 0,5 h 1231-injektion jälkeen. Kaksi tuntia jodialtistuksen jälkeen nähtiin vahva jodikertymä kaikissa Ad5/3-A24-hNIS:llä hoidetuissa kasvaimissa, kun taas kontorlliviruk-sella tai suolaliuoksella injektoituihin kasvaimiin ei kertynyt jodia (kuvio 13A). 2 tunnin kuluttua jodikertymä tasaantui ja pysyi suhteellisen vakiona kokeen vii-15 meiseen kuvantamisajankohtaan asti 13 h jodi-injektion jälkeen (kuvio 13B). Lisäksi jodi kerääntyi voimakkaasti kilpirauhaseen ja mahalaukkuun näiden elinten endogeenisen NIS-ilmentymisen vuoksi. Voimakas kertyminen vatsalaukkuun on tyypillistä hiirille mutta ei ihmisille. Potilaiden kohdalla normaalia kilpirauhasta olisi mahdollista suoja radiojodilta, mutta tässä hiiritutkimuksessa 20 näin ei tehty. Koska radioaktiivinen jodi poistuu virtsan mukana, jodikertymä rakkoon todettiin.
1231-biojakauman kvantifioimiseksi in vivo elimet ja kasvaimet kerättiin kuvantamisen jälkeen ja niiden radioaktiivinen sisältö määritettiin (kuvio 13C). hNIS:n endogeenisen ilmentymisen vuoksi kilpirauhanen ja mahalaukku 25 ottivat vastaan ~30 % injektoidusta annoksesta. Kuitenkin Ad5/3-A24-hNIS:llä hoidettuihin kasvaimiin kertyi yli 6 % kokonaisjodiannoksesta. Tämä korreloi δ kasvaimissa läsnä olevan infektiivisen viruksen suuren määrän kanssa, kun cv + taas kilpirauhasessa ja mahalaukussa nähtiin vain vähäisiä määriä. Koska ^ kasvaimet kerättiin yli 10 päivää virusinjektion jälkeen, ja TCID50 mittaa infek- ™ 30 tiivistä virusta, korkeat TCID50-arvot luultavasti heijastavat virusreplikaatiota.
X
£ Adenovirukset menettävät kapsidinsa soluihin tullessaan, joten syötettyä virus- ^ ta ei voida havaita TCID50:llä; se edellyttää uusien virionien tuottamista. Jodini kertymä pysyi matalana muissa elimissä, mukaan lukien Ad5/3-A24- cn § Agp19K:lla käsitellyt tai vertailuhoidossa olleet kasvaimet (<1 % alkuperäisestä ^ 35 annoksesta).
33 131 l:n ja Ad5/3-A24-hNIS:n yhdistelmä inhiboi kasvaimen kasvua in vivo
Ad5/3-A24-hNIS:n tehokkuuden arvioimiseksi in vivo hiiriä, joilla oli eturauhaskasvain, hoidettiin pelkästään 131 l:llä tai Ad5/3-A24-hNIS:llä tai niiden yhdistelmällä (kuvio 14). Kun kasvaimia hoidettiin Ad5/3-A24-hNIS:llä il-5 man radiojodia, kasvaimen kasvu oli merkittävästi hitaampaa kuin vertailuhoi-dossa olevissa tai pelkän 1311:n ryhmissä (molemmissa p<0,05). Kun hiiret saivat sekä Ad5/3-A24-hNIS:ää että 131 hää, kasvainkoot olivat huomattavasti pienempiä kuin missään muussa ryhmässä (kaikissa p<0,001). Mukautettu pa-rianalyysi osoitti merkittävän eron Ad5/3-A24-hNIS + 131 l:n ja pelkän viruksen, 10 pelkän 131 l:n tai vertailuhoidon välillä jo päivänä 2 (kaikissa p<0,05). Sovitetut parittaiset p-arvot Ad5/3-A24-hNIS + 131 l:n ja pelkän viruksen, pelkän 131 l:n tai valekäsittelyn välillä päivinä 4, 6 ja 8 olivat myös kaikki <0,001. Eläintenpitoon liittyvien rajoitusten vuoksi etukäteen määritettiin, että koe päättyy päivänä 17, vaikka osa hiiristä oli edelleen hyvässä kunnossa.
15 Koko kehon emittoiman radioaktiivisuuden mittaaminen aloitettiin jodi-injektion jälkeisenä päivänä. Kuten oletettua, radioaktiivisuus aleni nopeasti seuraavien 3 päivän aikana poistumalla munuaisten kautta.
Kun kasvaimen mikä tahansa halkaisija saavutti 15 mm:n koon, hiiret lopetettiin ja elimet kerättiin radioaktiivisuuden mittauksia varten. Radioak-20 tiivisuus aleni ajan myötä, ja korkein radioaktiivisuus todettiin kilpirauhasessa ja mahalaukussa ja hetkellisesti sydämessä, luultavasti 131 l:n verenkierron kautta tapahtuvan kulkeutumisen vuoksi. Muissa elimissä radioaktiivisuus pysyi matalana. Merkittävää on, että virusinjektio ei vaikuttanut biojakaumaan ja niin ollen menetelmän turvallisuusprofiili on samankaltainen kuin kilpirauhas-25 syövän radiojodihoidon.
2 II. GM-CSF-siirtogeeni ™ Kolmen D24-GM-CSF-tyyppisen viruksen kloonaus v - PCR-monista hGM-CSF ulos ^ - Luo Sunl/Munl-kohdat => 445 bp (pORF-GM-CSF templaattina) £ 30 - PCR-tuotteen ja pTHSNin Sunl/Munl-digestio - Toisiinsa tarttuvien päiden ligaatio => - Pmel-linearisoitu pShuttle-D24 + pTG3602 => pAd5-D24
§ - Ad5-D24-GM-CSF
^ Homol. rekomb.: Srfl-linearisoitu pAd5-D24 + Fspl-linearisoitu
35 pTHSN-GM-CSF pAd5-D24-GM-CSF
34
Pacl-linearisaatio ja transfektio => Ad5-D24-GM-CSF.
Kaikki kloonausvaiheet varmistettiin PCR:llä ja useilla restriktiodi-gestioilla. pTHSN-GMCSF-sukkulaplasmidi sekvensoitiin. Villityypin E1 poissaolo varmistettiin PCR:llä. E1-alue, siirtogeeni ja säie tarkistettiin lopullisesta 5 viruksesta sekvensoimalla ja PCR:llä, ja se vietiin sitten puhdaslaboratorioon tuotantoa varten. Tätä varten virus-DNA ekstrahoitiin yön yli inkuboinnilla sopivalla puskuriliuoksella ja PCR:n jälkeen ja sekvensointi tehtiin säikeen ja GMCSF cDNA:n integriteetin analysoimiseksi. Virustuotannon, mukaan lukien transfektio, kaikki vaiheet tehtiin A549-soluilla villityypin rekombinaation riskin 10 välttämiseksi aiemmin kuvatulla tavalla (Kanerva A. et ai. 2003, Mol Ther 8, 449-58; Baeurschmitz G. J. et ai. 2006, Mol Ther 14, 164-74). GM-CSF on E3-promoottorin alainen, mikä johtaa replikaatioon assosioituvan siirtogeenin ilmentymiseen, joka alkaa noin 8 h infektion jälkeen. E3 on koskematon lukuun ottamatta 6.7K/gp19K:n deleetiota. Ad5/3-D24-GM-CSF ja Ad5-RGDD24-GM-15 CSF rakennettiin identtisesti paitsi, että käytettiin pelastajaplasmidia, jossa on joko serotyypin 3 uloke tai RGD-4C Ad5-säikeen Hl-silmukassa.
D24-GM-CSF-tyyppisten virusten in vitro -analyysi D24-GM-CSF-tyypin virusten in vitro -tehoa tutkittiin keuhkosyöpä-soluissa (A549), rintasyöpäkantasoluista saaduissa eksplantaattisoluissa 20 (JIMT-1) ja rintasyöpäsoluissa (MDA-MB-436) käyttämällä MTS-soluntappo-määrityksiä. MTS-määritys on tällä hetkellä vakiomenetelmä solun elinvoimaisuuden tutkimiseksi syövän geenihoitoon liittyvissä julkaisuissa. Ad5Luc1 on replikaatioon kykenemätön virus ja toimii negatiivisena kontrollina. Ad5wt on villityypin Ad5-virus (Ad300wt-kanta) ja sitä käytettiin positiivisena kontrollina. 25 Ad5-d24-E3:ssa on isogeeninen 24 emäsparin deleetio E1:ssä, mutta sen E3 ? on koskematon. VP tarkoittaa viruspartikkeleita.
^ Lyhyesti sanottuna Ad5-D24-GMCSF:llä oli positiivisen kontrollin v kaltaista onkolyyttistä aktiviteettia in vitro ja siksi siirtogeenin tuotanto ei hai- oi tannut viruksen onkolyyttistä tehoa (kuviot 15a-c). Samanlaiset tiedot saatiin £ 30 Ad5/3-D24-GM-CSF:lle ja Ad5-RGD-D24-GM-CSF:lle (kuvio 15d).
CL
Sen testaamiseksi, kykeneekö Ad5D24-GMCSF ilmentämään siirto-geeniä, A549-solulinja infektoitiin 1000 viruspartikkelilla/solu ja kasvatusliuosta
LO
§ kerättiin ajan kuluessa. GMCSF-pitoisuus (kuvio 16a) kasvatusliuoksessa mi-
O
<m tattiin FACSARRAYIIa. Tämän lisäksi me analysoimme myös sen, säilyttikö vi- 35 ruksen ilmentämä GMCSF biologisen toimintansa. Tätä varten TF1-solulinjaa, jonka kasvu ja elinkykyisyys ovat täysin riippuvaisia ihmisen GMCSF:stä, käsi- 35 teltiin aiemmin Ad5D24-GMCSF:llä infektoidusta A549-solulinjasta kerätyllä kasvatusliuoksella. TF1:n elinkykyisyys arvioitiin ajan kuluessa MTS-määri-tyksellä. Tämän kokeen tulos oli, että viruksen ilmentämä GMCSF kykeni stimuloimaan tällaisen solulinjan kasvua, eikä mitään eroa löytynyt verrattuna 5 samaan solulinjaan, jota käsiteltiin ihmisen rekombinantti-GMCSF:llä (Sigma) (kuvio 16b).
D24-GM-CSF-tyypin virusten in vivo -analyysi eläimissä
Ad5-D24-GM-CSF:n in vivo -tehokkuus testattiin immuunikompeten-teissa syyrianhamstereissa, jotka ovat semipermissiivisiä ihmisen adenovirus-10 replikaatiolle (hiiret ovat ei-permissiivisiä) (Ying B. et ai. 2009, Cancer Gene Ther doi:10.1038/cgt.2009.6.). 7*106 HapT1-haimasyöpäsolua injektoitiin ihonalaisesti ja 1*109 viruspartikkelia (VP) Ad5-D24-GM-CSF:ää tai Ad5D24E3:a (joka ei ilmennä GM-CSF:ää) injektoitiin kasvaimensisäisesti päivinä 0, 2 ja 4. Vertailuryhmään injektoitiin sama määrä kasvuliuosta samoina 15 aikoina. Kuvio 17b esittää, että Ad5-D24-GMCSF:n kasvaimensisäiset injektiot johtivat korkeisiin hGM-CSF:n tasoihin syyrianhamstereiden seerumissa. Ihmisen GM-CSF:n tiedetään olevan aktiivinen syyrianhamstereissa (Cho, Exp Toxicol Pathol 2006 voi. 57 (4) s. 321-8). Oli kiinnostavaa, että kaikki eläimet olivat kasvaimettomia päivään 16 mennessä lukuun ottamatta vertailuryhmää 20 (kuvio 17a). Kasvainarpia analysoitiin vielä kahden viikon ajan, jotta nähtäisiin uusiutuisiko kasvain. Päivänä 32 ei näissä eläimissä kuitenkaan edelleenkään ollut merkkejä kasvaimesta, joten kokeen ensimmäinen osa päätettiin ja vertailuryhmän eläimille tehtiin eutanasia. Jäljellä olevat hoidetut eläimet altistettiin tässä vaiheessa samalle kasvaimelle antamalla ihonalainen injektio 7*106 25 HapT1-solua ylävartalon oikealle puolelle, kun taas vasemmalle puolelle an-2 nettiin eri kasvainta (1*106 HaK-kasvainta), joille eläimet olivat naiiveja. Kas- ^ vaimen kasvua mitattiin ajan kuluessa ja tulokset esitetään kuvioissa 17c-d.
V Oli kiinnostavaa, että aiemmin Ad5D24GMCSF:llä hoidetut eläimet torjuivat kokonaan HapT1-kasvaimet mutta Hak-kasvaimet kasvoivat normaalisti, kun £ 30 taas aiemmin Ad5D24E3:lla hoidetuissa eläimissä kasvoi sekä HapT1- että
HaK-kasvaimia (kuviot 17c-d).
£ Lyhyesti sanottuna tulokset osoittavat, että Ad5-D24-GM-CSF:llä on
LO
g antituumorinen aktiivisuus immuunikompetenteissa eläimissä, joilla on kas- ° vaimia, ja se kykenee tuottamaan kasvainspesifisen immuniteetin siinä määrin, 35 että se estää saman kasvaimen kasvun myöhemmin.

Claims (31)

1. Täysin ihmisen serotyyppiä 3 oleva onkolyyttinen adenovirusvek- tori.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää yhden tai useamman alueen, joka valitaan ryhmästä, johon kuuluu E1, E2, E3, E4 ja väli- ja myöhäisen vaiheen alueita.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat alueet: vasen ITR, E1, 10 pIX, plVa2, E2, VA1, VA2, myöhäisvaiheen alue, E3 tai osittainen E3, E4 ja oikea ITR.
4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että alueet ovat peräkkäisessä järjestyksessä 5’-3’-suunnassa.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen onkolyyttinen adenovi rusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää hTERT-promoottorin alaisen Ad3 E1A-alueen.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää replikaatio-aktivoidun Ad3 E3- 20 promoottorin alaisen Ad3 E3-alueen.
7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää yhden tai useamman siirtogeenin.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, 25 tunnettu siitä, että siirtogeeni valitaan ryhmästä, jossa on granulosyytti- ° makrofagien kolonisaatiota stimuloiva tekijä (GM-CSF), ihmisen natriumjo- O ^ disymportteri (hNIS), interferoni-alfa, interferoni-beeta, interferoni-gamma, tuu- T- morinekroositekijä, CD40L, trastutsumabi ja muita monoklonaalisia vastani aineita. ^ 30
9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen onkolyyttinen adenovirus vektori, tunnettu siitä, että siirtogeeni sijoitetaan E1:een hTERT-promoot- torin alaiseksi ja/tai E3:een replikaatio-aktivoidun Ad3 E3-promoottorin alaisek-m § SI.
° 10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen onkolyyttinen adenovi- 35 rusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää sisäisen ribosomaalisen tulo-kohdan (IRES) siirtogeenin ja E1A-alueen välissä.
11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukainen onkolyyttinen adenovi-rusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää hTERT-promoottorin, siirtogeenin, IRES:n ja E1A:n.
12. Jonkin patenttivaatimuksen 7-9 mukainen onkolyyttinen adenovi-5 rusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää siirtogeenin deletoidun gp19k:n paikalla E3-alueella.
13. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää ainakin yhden ekspres-siokasetin.
14. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää ainoastaan yhden eks-pressiokasetin.
15. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että vektori kykenee replikoitumaan ai- 15 noastaan soluissa, joissa on telomeraasi-aktiivisuutta.
16. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori, tunnettu siitä, että se käsittää hNIS:n, joka kohdistaa radiojodin kohdesoluun.
17. Solu, tunnettu siitä, että se tuottaa in vitro jonkin edellisen 20 patenttivaatimuksen 1-16 mukaista adenovirusvektoria.
18. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin edellisen patenttivaatimuksen 1-16 mukaisen adenovirusvektorin.
19. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se 25 toimii in situ -syöpärokotteena.
20. Jonkin patenttivaatimuksista 1-16 mukaisen adenovirusvektorin O ^ käyttö kohteessa olevan syövän hoitoon tarkoitetun lääkkeen valmistuksessa.
^ 21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen käyttö, tunnettu siitä, et- V tä syöpä valitaan ryhmästä, johon kuuluvat nasofaryngeaalinen syöpä, synovi- <m 30 aalinen syöpä, hepatosellulaarinen syöpä, munuaissyöpä, sidekudossyöpä, Er melanooma, keuhkosyöpä, suolistosyöpä, paksusuolen syöpä, peräsuolen syöpä, kolorektaalinen syöpä, aivosyöpä, kurkkusyöpä, suusyöpä, maksasyöpä pä, haimasyöpä, istukkasyöpä, gastrinooma, feokromosytooma, prolaktinoo- o ma, T-soluleukemia/lymfooma, neurooma, von hippel-lindaun tauti, zollinger- o 35 ellisonin oireyhtymä, lisämunuaissyöpä, anaalinen syöpä, sappitien syöpä, virtsarakon syöpä, virtsajohtimen syöpä, oligodendrogliooma, neuroblastooma, meningiooma, selkäydinkasvain, luusyöpä, osteokondrooma, kondrosarkooma, Ewingin sarkooma, tuntemattoman primäärisijainnin syöpä, karsinoidi, maha-suolikanavan karsinoidi, fibrosarkooma, rintasyöpä, Pagetin tauti, kohdunkaulan syöpä, ruokatorven syöpä, sappirakon syöpä, pään syöpä, silmäsyöpä, 5 niskasyöpä, Wilmsin kasvain, Kaposin sarkooma, eturauhassyöpä, keuhkosyöpä, kivessyöpä, Hodgkinin tauti, non-Hodgkinin lymfooma, ihosyöpä, meso-teliooma, multippeli myelooma, munasarjasyöpä, endokriininen haimasyöpä, glukagonooma, paratyroidinen syöpä, penissyöpä, aivolisäkesyöpä, pehmytku-dossarkooma, retinoblastooma, ohutsuolisyöpä, mahalaukkusyöpä, kateenkor-10 vasyöpä, kilpirauhassyöpä, trofoblastisyöpä, rypäleraskaus, kohtusyöpä, en-dometriaalinen syöpä, emätinsyöpä, ulkosynnytinsyöpä, akustikus neurinoo-ma, mucosis fungoides, insulinooma, karsinoidioireyhtymä, somatostatinooma, iensyöpä, sydänsyöpä, huulisyöpä, kalvosyöpä, hermosyöpä, suulakisyöpä, korvasylkirauhassyöpä, vatsakalvosyöpä, nielusyöpä, pleuraalinen syöpä, syl-15 kirauhassyöpä, kielisyöpäja risasyöpä.
22. Patenttivaatimuksen 20 tai 21 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että kohde on ihminen tai eläin.
23. Jonkin patenttivaatimuksen 20-22 mukainen käyttö, tunnet-t u siitä, että anto tapahtuu kasvaimensisäisellä, lihaksensisäisellä, valtimon- 20 sisäisellä, laskimonsisäisellä, keuhkopussinsisäisellä, rakkulansisäisellä, onte-lonsisäisellä tai peritoneaalisella injektiolla tai suun kautta.
24. Jonkin patenttivaatimuksen 20-23 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että kohteelle annetaan onkolyyttisiä adenovirusvektoreita tai farmaseuttisia koostumuksia useita kertoja hoitojakson aikana.
25. Jonkin patenttivaatimuksen 20-24 mukainen käyttö, tunnet- t u siitä, että kohteelle annetaan lisäksi rinnakkaista sädehoitoa tai radiojodia.
? 26. Jonkin patenttivaatimuksen 20-25 mukainen käyttö, tunnet- ™ t u siitä, että kohteelle annetaan lisäksi rinnakkaista kemoterapiaa.
27. Jonkin patenttivaatimuksen 20-26 mukainen käyttö, t u n n etoi 30 t u siitä, että kohteessa on suuria määriä neutraloivia anti-Ad5-vasta-aineita.
£ 28. Jonkin patenttivaatimuksen 20-27 mukainen käyttö, tunnet- CL t u siitä, että kohdetta on aiemmin hoidettu Ad5:llä.
29. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1-16 mukaisen adenovi-g rusvektorin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että o (M i) saadaan aikaan DNA-vektori, joka käsittää ainakin osittaisen Ad3-DNA:n ja valinnaisesti yhden tai useamman promoottorin ja/tai valinnaisesti yhden tai useamman siirtogeenin, ja ii) insertoidaan jäljelle jäävä osa Ad3-genomia ja valinnaisesti yksi 5 tai useampi promoottori ja/tai valinnaisesti yksi tai useampi siirtogeeni vektoriin.
30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että plasmidirakennetta käytetään transgeeni(e)n sijoittamiseksi adenovi-rusvektoriin.
31. Patenttivaatimuksen 29 tai 30 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että adenovirusvektori tuotetaan solulinjassa. o δ (M sj- (M X CC CL m h-· m σ> o o (M
FI20095751A 2009-02-02 2009-07-02 Ei-Ad5 adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä FI121574B (fi)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20095751A FI121574B (fi) 2009-02-02 2009-07-02 Ei-Ad5 adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä
CA2750770A CA2750770A1 (en) 2009-02-02 2010-02-02 Non-ad5 adenoviral vectors and methods and uses related thereto
US13/147,288 US20120063995A1 (en) 2009-02-02 2010-02-02 Non-ad5 adenoviral vectors and methods and uses related thereto
SG2011055563A SG173502A1 (en) 2009-02-02 2010-02-02 Non-ad5 adenoviral vectors and methods and uses related thereto
AU2010209334A AU2010209334A1 (en) 2009-02-02 2010-02-02 Non-Ad5 adenoviral vectors and methods and uses related thereto
KR1020117020181A KR20110110371A (ko) 2009-02-02 2010-02-02 비-Ａｄ5 아데노바이러스 벡터 및 이와 관련된 방법 및 용도
EP10704194.9A EP2391722B1 (en) 2009-02-02 2010-02-02 Non-ad5 adenoviral vectors and methods and uses related thereto
BRPI1008159A BRPI1008159A2 (pt) 2009-02-02 2010-02-02 vetores adenovirais não-ad5 e métodos e usos relacionados aos mesmos
RU2011136280/10A RU2011136280A (ru) 2009-02-02 2010-02-02 HE-Ad5 АДЕНОВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ, СВЯЗАННЫЕ С НИМИ
CN2010800087768A CN102325887A (zh) 2009-02-02 2010-02-02 非-Ad5腺病毒载体及与其相关的方法和用途
JP2011547047A JP2012516682A (ja) 2009-02-02 2010-02-02 非Ａｄ５アデノウイルスベクター並びに前記に関連する方法および使用
PCT/IB2010/050452 WO2010086838A2 (en) 2009-02-02 2010-02-02 Non-ad5 adenoviral vectors and methods and uses related thereto

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20090030A FI20090030A0 (fi) 2009-02-02 2009-02-02 Onkolyyttiset virukset
FI20090030 2009-02-02
FI20095751 2009-07-02
FI20095751A FI121574B (fi) 2009-02-02 2009-07-02 Ei-Ad5 adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI20095751A0 FI20095751A0 (fi) 2009-07-02
FI20095751A FI20095751A (fi) 2010-08-03
FI121574B true FI121574B (fi) 2011-01-14

Family

ID=40404558

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20090030A FI20090030A0 (fi) 2009-02-02 2009-02-02 Onkolyyttiset virukset
FI20095751A FI121574B (fi) 2009-02-02 2009-07-02 Ei-Ad5 adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20090030A FI20090030A0 (fi) 2009-02-02 2009-02-02 Onkolyyttiset virukset

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20120063995A1 (fi)
EP (1) EP2391722B1 (fi)
JP (1) JP2012516682A (fi)
KR (1) KR20110110371A (fi)
CN (1) CN102325887A (fi)
AU (1) AU2010209334A1 (fi)
BR (1) BRPI1008159A2 (fi)
CA (1) CA2750770A1 (fi)
FI (2) FI20090030A0 (fi)
RU (1) RU2011136280A (fi)
SG (1) SG173502A1 (fi)
WO (1) WO2010086838A2 (fi)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112013006669A2 (pt) * 2010-09-24 2019-09-24 Oncos Therapeutics Oy vetores adenovirais oncolíticos e métodos e usos relacionados aos mesmos
AU2014255733B2 (en) * 2013-04-18 2019-05-16 Tilt Biotherapeutics Oy Enhanced adoptive cell therapy
CN104946602A (zh) * 2015-06-11 2015-09-30 华中科技大学同济医学院附属同济医院 具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16及其应用
LT3293201T (lt) * 2016-09-12 2021-03-25 Targovax Oy Adenoviruso ir kontrolinio taško inhibitoriaus derinys vėžio gydymui
CN108261426B (zh) * 2017-01-04 2019-04-05 杭州康万达医药科技有限公司 药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用
CA3052086A1 (en) * 2017-01-30 2018-08-02 Epicentrx, Inc. Tumor selective tata-box and caat-box mutants
WO2019191494A1 (en) * 2018-03-28 2019-10-03 Epicentrx, Inc. Personalized cancer vaccines
MX2020013901A (es) * 2018-06-19 2021-05-27 H Lee Moffitt Cancer Ct & Res Virus oncolítico o antígeno que presenta terapia contra el cáncer mediada por células usando interferón tipo i y lingado de cd40.

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1646717A4 (en) * 2003-07-18 2006-12-20 Onyx Pharma Inc ADENOVIRAL VECTORS OF SUB-GROUP B FOR THE TREATMENT OF DISEASES
WO2005030261A1 (en) * 2003-08-28 2005-04-07 Cell Genesys, Inc. Oncolytic adenoviral vectors encoding gm-csf
US7473418B2 (en) * 2004-03-25 2009-01-06 Cell Genesys, Inc. Pan cancer oncolytic vectors and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI1008159A2 (pt) 2016-03-29
JP2012516682A (ja) 2012-07-26
FI20095751A (fi) 2010-08-03
WO2010086838A2 (en) 2010-08-05
EP2391722B1 (en) 2014-06-11
CA2750770A1 (en) 2010-08-05
SG173502A1 (en) 2011-09-29
US20120063995A1 (en) 2012-03-15
WO2010086838A3 (en) 2010-11-25
KR20110110371A (ko) 2011-10-06
CN102325887A (zh) 2012-01-18
EP2391722A2 (en) 2011-12-07
FI20095751A0 (fi) 2009-07-02
FI20090030A0 (fi) 2009-02-02
AU2010209334A1 (en) 2011-09-08
RU2011136280A (ru) 2013-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI121574B (fi) Ei-Ad5 adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä
JP6639412B2 (ja) アルブミン結合部分を含んでなるアデノウイルス
RU2520823C2 (ru) Аденовирусные векторы и способы и применения, связанные с ними
JP5618896B2 (ja) 新規アデノウイルス、それをコードする核酸及びその使用
US8168168B2 (en) Infectivity-enhanced conditionally-replicative adenovirus and uses thereof
US9345787B2 (en) Adenoviral vectors and methods and uses related thereto
US20240191255A1 (en) Adenoviral Vectors
JP7558808B2 (ja) 組換えアデノウイルスおよびこれを含む幹細胞
EP1196616B1 (en) Replication-competent anti-cancer vectors
JP2004033186A (ja) 腫瘍細胞において選択的に増殖する腫瘍融解ウイルス
JP4327844B2 (ja) 改善された癌細胞特異性と活性を有する変形されたテロメア逆転写酵素のプロモーターおよびこれを含む組み換えベクター
FI121508B (fi) Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä
US20180296701A1 (en) Adenovirus complex for gene delivery and gene therapy
FI124926B (fi) Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjä
Särkioja Adenoviral gene therapy for non-small cell lung cancer
Armstrong Generation and functionality of a novel, Cox2-controlled, conditionally-replicating, adenovirus expressing interferon alpha for pancreatic cancer therapy.

Legal Events

Date Code Title Description
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: ONCOS THERAPEUTICS OY

Free format text: ONCOS THERAPEUTICS OY

FG Patent granted

Ref document number: 121574

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed