KR20110110371A - 비-Ａｄ5 아데노바이러스 벡터 및 이와 관련된 방법 및 용도 - Google Patents

비-Ａｄ5 아데노바이러스 벡터 및 이와 관련된 방법 및 용도 Download PDF

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게르트 바우어슈미츠
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온코스 테라퓨틱스 오와이
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Abstract

본 발명은 의약 분야에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 암 치료법에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 세포 및 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 피검체의 암을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 상기 벡터의 용도 및 피검체의 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 아데노바이러스 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

비-Ａｄ5 아데노바이러스 벡터 및 이와 관련된 방법 및 용도{Non-Ad5 adenoviral vectors and methods and uses related thereto}
본 발명은 의약 분야에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 암 치료법에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 세포 및 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 피검체의 암을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 상기 벡터의 용도 및 피검체의 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 아데노바이러스 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다.
암은 수술, 호르몬 요법, 화학요법 및/또는 방사선요법으로 치료할 수 있으나, 많은 경우에 종종 진행기를 특징으로 하는 암은 현재의 치료 요법으로 치유할 수 없다. 따라서, 유전자요법과 같은 새로운 암 세포 표적화 접근법이 필요하다.
지난 20년 동안 유전자 전달 기술은 예의연구되고 있다. 암 유전자 요법의 목적은 치료 유전자를 종양 세포에 도입시키는 것이다. 이러한 치료 유전자는 표적 세포에 도입되어, 예컨대 돌연변이된 유전자를 교정하거나 활성 종양유전자를 억제하거나 또는 세포에 추가 성질을 발생시킨다. 적당한 외인성 치료 유전자로는 면역치료성, 혈관형성억제성, 화학보호 및 "자살" 유전자를 포함하지만, 이에 국한되지 않고, 변형 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 방법, 예컨대 전기천공, 유전자총 및 지질이나 중합체 코팅 등을 이용하여 세포에 도입시킬 수 있다.
최적 바이러스 벡터에 필요한 요건은 특정 표적 세포를 찾고 이 표적 세포에서 바이러스 게놈을 발현시키는 효능을 포함한다. 더욱이, 최적의 벡터는 표적 조직 또는 세포에서 활성을 유지해야 한다. 바이러스 벡터의 이러한 모든 성질은 지난 10년간 개발되었고, 예컨대 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 관련 바이러스 벡터가 생체의학에서 널리 연구되고 있다.
항종양 효과의 종양 침입 및 국소 증폭을 더욱 증대시키기 위해, 선택적 종양용해제, 예컨대 조건 복제성 아데노바이러스가 작제되었다. 종양용해성 아데노바이러스는 암 치료에 전망이 좋은 도구이다. 종양 세포는 이 세포에서 종양용해성 아데노바이러스의 복제로 인해 이 바이러스에 의해 사멸되며, 이 복제의 말기에는 결과적으로 수천개의 비리온이 주위 종양 조직으로 방출되어 종양 침입 및 혈관 재감염이 유효해진다. 치료 접근법들은 정상 세포와 종양 세포 간에 분자적 차이를 이용한다. 종양 세포는 바이러스의 복제를 허용하지만, 정상 세포는 바이러스 게놈 내의 유전자조작된 변화로 인해 바이러스 복제를 허용하지 않으며, 이는 비-종양 세포에서의 복제를 예방한다. 최적의 종양용해성 아데노바이러스는 암세포에서만 감염 및 복제할 수 있고 면역학적 반응이 상기 바이러스를 중화시키기 전에 모든 암 세포를 사멸시키기에 충분히 강력한 것일 것이다.
특정 결실을 만들거나 조직 특이적 프로모터를 부가하는 것은, 바이러스를 더욱 선택적으로 만들 수 있는 한편, 전이유전자를 부가하는 것은 상기 접근법을 더욱 강력하게 만들 수 있다. 실제로, 복제를 매개로 한 세포 사멸 외에, 종양용해성 아데노바이러스는 또한 다른 치료 전이유전자로 무장할 수 있다. 이 접근법은 복제 컴피턴트 제제의 효능과 종래 유전자 전달의 장점을 병합한 것이다. 무장 바이러스의 1가지 목표는 바이러스 복제를 허용하는 세포쪽으로 면역 반응을 유도하는 것이다. 면역원성이지만, 바이러스 복제만으로는 효과적인 항종양 면역성을 유도하는 것이 일반적으로 불충분하다. 치료 면역성의 유도를 강화하기 위해, 바이러스는 항원 제시 세포, 예컨대 수지상 세포에 종양 항원의 도입을 촉진하여 사이토킨과 같은 자극 단백질로 무장할 수 있다. 종양 세포에 면역치료 유전자의 도입 및 나아가 이 단백질의 해독은 면역반응의 활성 및 종양 세포의 효과적인 파괴를 초래한다.
아데노바이러스는 중간 크기(90-100nm)의 비엔벨로프형 20면체 바이러스로서, 단백질 캡시드 내에 약 36 킬로염기쌍의 이본쇄 선형 DNA를 보유한다. 이 바이러스 캡시드는 표적 세포에 이 바이러스의 부착에 참여하는 섬유 구조를 보유한다. 첫째, 섬유 단백질의 마디(knob) 도메인은 표적 세포의 수용체(예: CD46 또는 콕사키바이러스 아데노바이러스 수용체(CAR))에 결합하고, 둘째, 이 바이러스는 인테그린 분자와 상호작용하며, 셋째, 이 바이러스는 표적 세포 내로 흡수된다. 그 다음, 바이러스 게놈은 엔도좀으로부터 핵 내로 수송되고, 표적 세포의 복제 기구가 바이러스용으로 이용된다(Russell W.C. 2000, J General Virol 81, 2573-2604).
아데노바이러스 게놈은 순차적으로 전사되는 초기(E1-E4), 중기(IX 및 IVa2) 및 후기 유전자(L1-L5)를 보유한다. 초기 유전자 산물은 숙주 세포의 방어 기전, 세포 주기 및 세포 대사에 영향을 미친다. 중기 및 후기 유전자는 새로운 비리온을 생산하기 위한 바이러스 구조 단백질을 암호화한다(Wu and Nemerow, 2004, Trends Microbiol 12: 162-168; Russell W.C. 2000, J. General Virol 81, 2573-2604; Volpers C. and Kochanek S. 2004, J Gene Med 6 suppl 1, S164-71; Kootstra N.A. and Verma I.M. 2003, Annu Rev Pharmacol Toxicol 43, 413-439).
아데노바이러스는 50종 이상의 상이한 혈청형이 사람에서 발견되었다. 혈청형은 6가지 서브그룹 A-F로 분류되고, 상이한 혈청형은 다른 증상, 즉 호흡기 질환, 결막염 및 위장염과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 그럼에도 불구하고, 재조합 아데노바이러스를 이용한 모든 암 실험은 대부분 Ad5였던 서브그룹 C 바이러스를 특징으로 한다. 또한, 다른 혈청형 5 바이러스의 상황에서 혈청형 키메라 캡시드의 이점도 인식하게 되었다. 혈청형 키메리즘(chimerism)이 Ad5에 대항하여 존재하는 중화 항체(Nab)로부터 부분 탈출을 허용할지라도, 대부분의 바이러스 캡시드가 여전히 Ad5 유래라는 사실은 탈출을 불완전하게 한다(Sarkioja, M. et al. 2008, Gene Ther 15: 921-929).
따라서, Ad5에 대항하여 존재하는 Nab로부터 탈출할 수 있는, 완전한 비-Ad5 종양용해성 바이러스가 필요하다. 이러한 바이러스는 Ad5에 대항한 기존 Nab의 환경에서 특히 유용하다. 이러한 상황은 자연 감염의 결과로서 발생하거나 또는 Ad5 기반의 종양용해성 바이러스 처리 후에 발생할 수도 있다.
현재, 유전자 요법의 환경에서 혈청형 3 아데노바이러스에 대해 공개된 것은 거의 없다. 야생형 Ad3은 사람에게 주로 호흡기 감염 및 결막염을 유발하는 것으로 알려져 있다. 전체 DNA 서열은 2005년에 보고되었고, 혈청형 5와 단지 62.75%의 동일성을 보유한다. 게놈 구성은 후기 및 주요 후기 유닛을 비롯하여 초기 및 지연된 초기 전사 유닛을 보유하는 다른 사람 아데노바이러스와 유사하다(Sirena D et al. 2005, Virology 343: 283-298). 몇년전 야생형 Ad3 바이러스는 정상산소 상태 및 저산소 상태 하에서 연구되었다(Shen, B.H. et al. 2006, Gene Ther. 13: 986-990). 최근, 동일한 그룹은 복합 Ad3/Ad11p 키메라 바이러스인 ColoAd1을 공개했다(Kuhn I et al. 2008, PLoS ONE 3: e2409). ColoAd1은 일련의 혈청형을 수집한 뒤, 이 수집물을 혈청형 간에 재조합을 초래하는 조건 하에서 계대배양하여 제조했다. 연구진들은 이 방법을 "지향적 진화"라 부른다. 그 다음, 이러한 매우 다양한 바이러스 수집물을 엄중한 지향적 선택 하에 두어 강력한 제제를 발생시키고 확인했다. 이들 실험을 통해, Ad3/Ad11p 키메라 바이러스가 모 혈청형 또는 가장 임상적으로 진행된 종양용해성 Ad, ONYX-015보다 시험관내에서 2 내지 3 등급 더 강력하고 선택적이라는 것을 발견했다. 이러한 결과는 향후 생체내 및 생체외 연구에 의해 지지되었다. 하지만, 이를 발생시키기 위해 이용된 접근법에 제공된 ColoAd1은 종양 선택성에 대한 합리적인 기준이 없다. 또한, 마우스의 결장암 이종이식편을 특징으로 하는 하나의 동물 모델에서만 연구되었기 때문에 생체내에서의 활성과 안전성은 충분히 해명되지 않았다.
따라서, 비-Ad5 벡터를 기반으로 하는 더욱 효과적이고 정확한 유전자 전이뿐 아니라 비-Ad5 유전자 요법의 특이성 증가 및 충분한 종양 사멸능이 보장된다. 또한, 치료 벡터의 안전성 기록도 우수해야 한다. 본 발명은 종양용해성 사람 비-Ad5 바이러스를 이용하여 전술한 성질을 가진 암 치료 도구를 제공한다.
본 발명의 목적은 전술한 아데노바이러스의 성질을 달성하고, 이에 따라 현행 암 치료의 문제점을 해결하기 위한 신규 방법 및 수단을 제공하는 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 유전자 요법의 새로운 방법과 수단을 제공한다.
본 발명은 종양용해성 사람 Ad3 벡터의 작제 및 종양 세포주 및 동물 모델에서의 이들의 용도를 기술하고, 바이러스요법에서 종양용해성 혈청형 5 아데노바이러스 벡터의 대안을 제공한다. 본 발명의 벡터는 혈청형 3만을 기반으로 하는 최초의 선택적 종양용해성 사람 아데노바이러스이다. 이 벡터는 또한 종양 특이적 프로모터에 의해 조절되는 최초의 비-Ad5 기반의 종양용해성 아데노바이러스이다.
본 발명은 완전한 혈청형 3 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 피검체의 암을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 벡터 또는 약제학적 조성물을 피검체에 투여함을 포함하여, 피검체의 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
i) 적어도 부분 Ad3 DNA와 임의로 하나 또는 다수의 프로모터 및/또는 임의로 하나 또는 다수의 전이유전자를 포함하는 DNA 벡터를 제공하고,
ii) Ad3 게놈의 나머지와 임의로 하나 또는 다수의 프로모터 및/또는 임의로 하나 또는 다수의 전이유전자를 상기 벡터에 삽입함을 포함하여, 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 현행 접근법들에 난치성인 암의 치료 도구를 제공한다. 또한, 치료에 적합한 종양 종류에 관한 제한은 다른 많은 치료들에 비해 본 발명에서는 거의 없다. 사실, 모든 고형암이 제안된 발명에 따라 치료될 수 있다. 이 치료는 종양내, 강내, 동맥내, 정맥내 및 이들의 조합으로 제공할 수 있다.
Ad3 기반의 바이러스는 Ad5 바이러스보다 암 줄기 세포형 세포에 잘 들어갈 수 있다. 본 발명의 바이러스의 효능은 종양 세포주에서 확인했고, 이 바이러스는 사람 암의 여러 쥐 모델에서 적어도 Ad5 또는 Ad5/3 기반의 대조군만큼 강력했다.
벡터를 당해의 부위로 수송할 수 있는 것 외에, 본 발명의 벡터는 전이유전자(들)의 발현과 존속을 보장할 수도 있다. 비무장 바이러스의 복제를 허용하는 세포에 대한 면역 반응의 유도는 일반적으로 치료적 종양 면역을 발생시키기에 충분할 정도로 강하지 않다. 이러한 약점을 극복하기 위해, 본 발명은 항-종양 면역의 강력한 유도인자(예: GM-CSF)를 보유한 무장 바이러스를 제공한다.
본 발명에서, 모든 사람 요오드화나트륨 공동수송자(hNIS) 전이유전자도 방사성요오드를 표적 세포로 표적화하는데 이용된다. 이러한 접근법은 바이러스의 종양용해 효과 및 방사선 유도 세포사로 인하여 종양 세포가 사멸될 수 있게 한다. 또한, 이 접근법은 방사선과 종양용해성 아데노바이러스 복제 간에 상승작용을 이용한다. 방사능요오드 요법은 전이유전자로서 hNIS를 도입하여 비-갑상선 기원의 암을 치료하는데 사용할 수 있다. hNIS의 또 다른 유용한 관점은 바이러스 확산 및 존속의 모니터링을 가능하게 하는, 전이유전자 발현의 비침습적 영상화이다.
또한, 본 발명은 통상적인 치료뿐 아니라 다른 아데노바이러스 치료법의 치료요법적 내성과 관련된 문제를 해결한다. 본 발명의 매우 가능한 피검체 그룹은 항-Ad5 Nab 역가가 높은 환자 또는 이전에 Ad5 제제의 치료를 받은 적인 환자 그룹이다.
나아가, 본 발명은 건강한 조직의 손상이나 독성 없이 선택적 치료를 하기 위한 도구 및 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 장점은 다른 치료제들에 비해 다른 감소된 부작용을 포함할 수 있다. 중요한 점은, 이러한 접근법이 화학요법 및 방사선 요법을 비롯한 다른 많은 형태의 치료법과 상승작용하여, 병용 요법으로 사용될 수 있다는 점이다.
종래 기술의 아데노바이러스 도구에 비해, 본 발명은 더욱 간단하고 더욱 효과적이며 비싸지 않고 비독성이며/이거나 더욱 안전한 암 치료 도구를 제공한다. 더욱이, 헬퍼 바이러스가 필요 없다.
본 발명의 신규 산물은 암 치료법을 더욱 향상시킬 수 있다.
도 1a-e는 Ad3-hTERT-hNIS-E1A(서열번호 14); hNIS(서열번호 15), Ad3-hTERT-GMCSF-E1A(서열번호 16); GM-CSF(서열번호 17); Ad3-hTERT-E1A-E3-hNIS; Ad3-hTERT-E1A-E3-GMCSF; 및 Ad3-hTERT-CD40L-E1A(서열번호 20) 부분; CD40L(서열번호 21)의 도해를 도시한 것이다.
도 2a-k는 도 1a-e에 기술된 바이러스의 클로닝을 도시한 것이다. E1A에 전이유전자를 보유한 바이러스의 클로닝은 도 2a 및 2c-g에 예시했고, 결실된 Ad3 E3gp19k 좌에 전이유전자를 보유한 바이러스의 클로닝은 도 2b 및 2h-k에 예시했다.
도 3은 a) Ad3-hTERT-E1A(서열번호 18); hTERT(서열번호 19)의 구조를 도시한 것이다. 아데노바이러스 3의 E1A 영역 앞에 TATA-박스 대신에 hTERT 프로모터(295bp)를 삽입했다. 화살표는 도 3b에 사용된 PCR 프라이머의 위치를 나타낸다. b) Ad3-hTERT-E1A의 PCR. 이 PCR은 hTERT 프로모터가 우측 위치에 있고 골격이 혈청형 3인 것으로 확인시켜준다. hTERT 프로모터 삽입 영역의 양측으로부터 좌측에서는 270bp의 밴드를 볼 수 있고 우측에서는 210bp 밴드를 볼 수 있다. 이 단편들을 서열분석했고, 예상한 서열이 나타났다. 야생형 아데노바이러스 혈청형 3 및 5 및 Ad5/3 캡시드 변형 바이러스의 존재는 다른 PCR 실험에서 배제되었다. c) Ad3-hTERT-E1A에 의한 진행 감염성 분석. 세포는 96웰 플레이트에 평판배양하고 10-5 내지 10-12의 Ad3-hTERT-E1A 10배 희석물을 각각 10회 반복물로 사용하여 각 행을 감염시켰다. 플레이트를 현미경으로 관찰하고, 바이러스 웰은 모의(mock) 웰과 비교했다. 이 관찰로부터 TCID50(Adeasy manual, Agilent Technologies, Inc. 2008)에서와 유사한 방식으로 pfu/ml를 계산했다. 배지(DMEM, 5% FBS)는 4일 내지 7일마다 교환했다. pfu/ml 역가는 30일 후 안정 상태였고, 이는 Ad3-hTERT-E1A의 느린 시험관내 복제 속도론을 시사한다.
도 4A-D는 암 세포주에 의한 세포 사멸 분석을 도시한 것이다. PC3-MM2(전립선암)(A), A549(폐암)(B), HTC116(결장암)(C) 및 SKOV3.ip1(난소암)(D) 세포를 사용했다. Ad3-hTERT-E1A는 모든 세포주에서 세포 사멸을 나타냈다(P<0.05 vs. Ad5/3luc1, 복제 결손 대조군, 10VP/세포에서). Ad300wt, Ad5/3-hTERT-△gp 및 Ad5/3-△24 사멸 세포는 Ad3 기반 바이러스보다 빠르게 세포를 사멸시켰다. 막대는 SE를 나타낸다.
도 5A-C는 비-악성 및 Ad3 수용체 결손성 세포를 이용한 세포 사멸 분석을 나타낸다. 비-종양 세포의 대표로서 HUVEC(사람 제대혈 정맥 내피 세포) (A) 및 FSH173WE(섬유아세포)(B)를 사용했다. Ad3-hTERT-E1A는 저 용량에서 복제 결손성 Ad5/3-luc1과 다르지 않았고, 0.1, 1 및 10 VP/세포에서 양성 대조군 Ad3wt, Ad300wt, Ad5/3-△24보다 훨씬 적은 세포를 사멸시켰다(P<0.05). LNM-35(폐암)(C) 세포는 Ad3 수용체가 없다는 것은 알려져 있다(Sarkioja, M. et al. 2006, Cancer 107: 1578-1588). Ad3wt 및 Ad3-hTERT-E1A는 상기 세포들에 대하여 어떠한 세포독성도 나타내지 않았다. 막대는 SE를 나타낸다.
도 6은 누드 마우스의 PC3-MM2(고 전이성 호르몬 난치성 전립선 암종) 종양(A)에서 Ad3-hTERT-E1A의 생체내 효능을 도시한 것이다. 109 VP는 매주 각 종양에 총 3회 주사하고, 2 내지 3일마다 종양을 측정했다. Ad3-hTERT-E1A 처리된 종양은 PBS 처리된 종양보다 더 늦게 성장했다(P=0.0035). (B) A549(폐암) 종양을 보유한 마우스에서 유사한 데이터가 관찰되었고, PBS 그룹은 종양 크기가 큰 관계로 일찍 중단해야 했다. 17일째, PBS와 Ad3-hTERT-E1A 간에는 유의성에 근접한 차이(P=0.051)가 관찰되었다. 또한, 30일째, Ad3-hTERT-E1A는 Ad5/3-hTERT-E1A보다 훨씬 양호한 것으로 관찰되었고(P=0.01), 이는 이 모델에 Ad3-hTERT-E1A의 유용성을 시사한다. (C) 루시퍼라제 발현성 SKOV3-luc 난소암 세포는 SCID 마우스에서 복강내 성장했다. 단독 복강내 109 VP 바이러스 주사를 수행하고, 살아있는 동물의 루시퍼라제 영상촬영을 반복하여 시간의 함수로서 종양 세포의 수를 추정했다. 루시퍼라제 시그널의 유의적인 차이는 바이러스 처리된 그룹 전체와 PBS 그룹 간에 관찰되었고(P<0.0001), 바이러스 그룹 간에는 차이가 없었다. Ad300wt 바이러스(야생형 Ad5)만이 C-D에 포함될 수 있음을 유의한다. 막대는 SE를 나타낸다. (D) 생존 분석에서, 바이러스 처리 그룹은 모두 PBS 그룹보다 오래 생존했다(P≤0.01). 본 실험의 유일한 장기 생존자는 Ad3-hTERT-E1A 그룹의 7마리 마우스 중 1마리뿐이었다. 실험이 끝나는 100일째 영상촬영과 부검에서 종양이 없었고 건강했다.
도 7A-C는 CAMA-1(유방암)(A), PANC-1(췌장암)(B) 및 ACHN(신장암)(C) 세포를 이용한 세포 사멸 분석을 도시한 것이다. Ad3-hTERT-E1A는 상기 암 종류 모두에서 세포 사멸을 보여주었다. 모든 실험에서 Ad3-hTERT-E1A는 100VP/세포에서 복제 결손성 대조군 Ad5/3-luc1보다 훨씬 더 효능적이었다(P<0.05).
도 8은 Ad3-hTERT의 생체내 항종양 효능을 도시한 것이다. 생물발광 사진은 28일째 촬영했다.
도 9는 Ad3-hTERT-E1A의 전자현미경 사진이다.
도 10은 Ad3-hTERT-E1의 부분 서열이다. 서열분석된 DNA 는 진하게 표시했다. 밑줄친 것은 펍메드 ( pubmed ) 유래의 hTERT 서열이다. (펍메드 유래의 Ad3 골격과 비교해서, 서열분석된 Ad3-hTERT-E1에서 누락된 염기는 괄호로 표시했다). 대문자는 hTERT 삽입체이다. 사용된 프라이머는 필기체로 표시했다.
도 11은 전립선 암 세포의 Ad5/3-△24-hNIS 매개의 요오드화물 흡수를 도시한 것이다. 세포는 Ad5/3-△24-hNIS 또는 Ad5/3-△24-△gp19K 10VP/세포로 감염시키고 감염 후 24 및 48시간 후 125I에 노출시켰다. 세포는 감마 분광계로 분석하여 세포의 방사성 요오드화물 함량을 측정했다. 비-감염 세포는 음성 대조군으로 사용했다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. * p <0.05; ** p<0.01; *** p<0.001.
도 12는 방사성요오드없이 전립선암 세포에서의 Ad5/3-△24-hNIS 복제와 종양용해를 도시한 것이다. 세포는 다양한 바이러스 용량(0-100 VP/세포)으로 감염시키고, 세포 생존도는 MTS 분석으로 6 내지 9일 후에 측정했다. 복제 결손성 Ad5/3luc1 및 종양용해성 Ad5/3-△24는 대조군으로 사용했다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 13은 생체내 Ad5/3-△24-hNIS 매개의 요오드화물 흡수를 나타낸 것이다. 피하 전립선암을 보유한 마우스는 종양내로 Ad5/3-△24-hNIS(옆구리 아래 종양), Ad5/3-△24-△gp19K(우측 위 종양) 또는 식염수(좌측 위 종양)를 받았고, 정맥내 123I 주사(1.85 MBq/마우스)를 받았다. 요오드화물 흡수는 정맥내 123I-주사 후 A) 2시간 및 B) 13시간 후에 감마 카메라로 촬영했다. 화소 크기는 1.08mm x 1.08 mm였다. C) 123I 주사 후 13시간 후 123I의 생체분포. 막대는 SEM을 나타내고, hNIS 종양의 n=6 외에는 n=3이다.
도 14는 생체내 Ad5/3-△24-hNIS 항종양 효능을 도시한 것이다. 피하 전립선암 보유 마우스(6 마우스/그룹, 12 종양/그룹)는 2일 연속으로 종양내로 Ad5/3-△24-hNIS 또는 성장배지를 받은 다음, 50MBq 131I 또는 식염수를 복강내 주사받았다. 종양 크기는 격일로 측정했다. 종양 성장 속도는 병용 처리된 그룹(Ad5/3-△24-hNIS + 131I)이 다른 어떤 그룹보다 훨씬 늦었다(*** p<0.001). 본 실험은 동물 보호 규제로 인해 요오드화물 주사 후 소정의 시점인 17일째 끝내야 했다.
도 15a-d는 GMCSF 발현이 바이러스 복제와 세포 사멸 효과를 감소시키지 않는다는 것을 보여준다. 도 15a는 새로 제조된 바이러스 Ad5-D24-GMCSF의 폐암 유래(A549) 세포 사멸 효능을 보여주는 MTS 분석 결과이다. 도 15b는 Ad5-D24-GMCSF에 의한 JIMT-1 암 개시 세포("암 줄기 세포")의 사멸을 보여주는 MTS 분석 결과이다. 도 15c는 새로 제조된 바이러스 Ad5-D24-GMCSF에 의한 유방암 세포(MDA-MB-436) 사멸 효능을 보여주는 MTS 분석 결과이다. 도 15d는 새로 제조된 바이러스 Ad5-D24-GMCSF, Ad5-RGD-D24-GMCSF 및 Ad5/3-D24-GMCSF에 의한 MDA-MB-436 사멸 효율을 보여주는 MTS 분석 결과이다.
도 16a는 사람 GMCSF의 아데노바이러스 연계 발현을 도시한 것이다. A549 세포주는 Ad5D24 또는 Ad5D24-GMCSF로 감염시키고, 배지를 시간이 경과함에 따라 수집하고 GMCSF의 발현을 FACSARRAY로 분석했다. 도 16b는 아데노바이러스-발현 GMCSF가 사람 림프구에서 생물학적 활성을 유지한다는 것을 보여준다. 생존하기 위해 사람 GMCSF를 필요로 하는 TF1 세포는 사람 재조합 GMCSF(이.콜라이 생산, 시그마 제품) 또는 Ad5-D24-GMCSF 감염 세포의 상청액의 존재 하에 배양했다.
도 17a는 췌장암 종양을 보유하는 시리아 햄스터(사람 아데노바이러스 복제 허용성)에서 Ad5-D24-GMCSF의 생체내 효능을 보여준다. Ad5D24 및 Ad5-D24-GMCSF는 처리 후 16일 내에 종양을 근절시킨다. 1x109 VP의 바이러스는 0일, 2일 및 4일째 투여했다.
도 17b는 Ad5-D24-GMCSF의 종양내 주사가 시리아 햄스터의 혈청에 고도의 hGMCSF를 초래한다는 것을 보여준다. Ad5D24E3 또는 Ad5-D24-GMCSF 처리된 동물로부터 4일째 샘플을 채취하고, 혈청의 사람 GMCSF 농도를 FACSARRAY로 평가했다. 도 17c는 Ad5-D245-GMCSF(Ad5D24는 아님)로의 HapT1 종양의 치유가 이후 HapT1 재공격으로부터 시리아 햄스터를 보호한다는 것을 보여준다. 이는 Ad5-D24-GMCSF가 종양 특이적 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 증명한다. Ad5D24 또는 Ad5D24-GMCSF로 치료받았던 동물(도 17a)에게 동일한 종양으로 재공격했고 종양 성장을 시간 경과에 따라 측정했다.
도 17d는 Ad5-D24-GMCSF에 의한 종양 특이적 면역 반응의 유도를 보여주며; Ad5-D24-GMCSF에 의한 HapT1 종양의 치료는 HaK 종양으로부터 시리아 햄스터를 보호하지 않았다. Ad5D24 또는 Ad5D24-GMCSF 처리를 받았던 HapT1 종양 보유 동물(도 17a)에게 다른 종양을 재공격하고, 종양 성장을 시간 경과에 따라 측정했다.
도 18a-c는 마우스의 독성학을 보여준다. 독성 연구에서, Ad3-hTERT-E1A는 면역 컴피턴트 쥐 모델에서 Ad5 및 Ad5/3 대조용 바이러스보다 독성이 낮은 것으로 발견되었다. 모든 주요 기관의 조직학과 기본 혈액 값을 분석했다. 8x1010 VP를 정맥내 주입한 후 72시간 후 간 조직검사와 간 효소에서 유의적인 차이가 관찰되었다. 혈청형 3은 일부 마우스에서 비-문맥 정맥 가까이에서 미소한간 염증만을 나타냈다. 동일한 시점 및 용량에서 혈청형 5 및 5/3 그룹은 급성 간 독성의 특징을 나타냈고 간 효소를 상승시켰다. 다른 기관 및 혈액 값은 독성 징후를 나타내지 않았다. 혈액 샘플 그래프와 간 조직검사 사진을 첨부했다(도 18c). 다음은 전체 조직병리 보고서이다: PBS: 5/5 정상. 유사분열 없음. 염증 없음. Ad3wt: 대부분 정상. 5/5 샘플에서 유사분열. 실질 5/5의 정맥(비문맥) 부근에서 미소한 염증. Ad3 - hTERT - E1A: 대부분 정상. 유사분열 없음. 실질의 정맥(비문맥) 부근에서 경계 염증이 3/5 샘플에서 관찰되었다. Ad5wt: 5/5: 실질을 통한 많은 아폽토시스성 간세포, 내피 면역반응 및 중심 정맥의 손상(문맥 부위에서는 관찰할 수 없었다), 중심주위 간세포 파괴 없음, 지방증, 괴사, 문맥 부위에 림프구 없음, 급성 간 손상, 실질 전반의 손상. Ad5 /3- hTERT -△gp19k: 5/5: 거의 정상, 일부 점 괴사(Ad5wt에서만큼 많지 않음), 일부 아폽토시스성 세포, 간세포의 유사분열, 실질의 염증(소엽), 정맥 주위 염증(Ad3과 마찬가지). Ad5 /3-△24: 5/5: 급성 전격 간 부전, 조직의 50% 괴사, 모든 세포가 죽은 문맥 부위 부근에서 더 강한 손상, 지방 생성 가능, 일부 유사분열.
도 19는 Ad3-hTERT-E1A로 처리한, 표준 치료법에 난치성인 진행성 고형암을 보유한 2 사람 환자의 바이러스 속도론을 도시한 것이다. 혈액 세포는 퍼콜 구배로 분리하고 DNA를 추출했다. 샘플은 qPCR로 분석했다. 환자 1에서, 바이러스는 1시간 내에 혈소판 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 제거되는 것으로 나타난다. 환자 2에서, 대부분의 바이러스는 혈액에서 빠른 제거 전에 PMBC와 혈장으로 이동하는 것으로 보인다. 두 환자 모두의 적혈구 세포(RBC)에서는 바이러스가 검출되지 않았다. 결과는 Ad3-hTERT-E1A에 의한 암 환자의 치료가 안전할 것이라는 것을 시사한다. 환자 1은 2개의 소변 샘플에서 바이러스가 없었고, 이는 바이러스가 소변으로 분비되지 않는다는 것을 시사한다.
도 20a-b는 쥐에서의 생체분포를 나타낸다. 5x1010 VP를 정맥내 투여한 후 6시간째 쥐의 생체분포는 대부분의 혈청형 3 바이러스가 비장, 폐 및 간과 같은 혈액 풍부 기관과 혈액에 머무르고 있다는 것을 시사했다. 모든 주요 기관은 qPCR로 분석했다(도 20b). 다른 기관으로의 유입은 감소한 것으로 발견되었다. 이 분석에서, 혈전 β-액틴은 혈청 값에 사용되었다. 혈액 구획에 β-액틴의 부족으로 인해, 혈액 값은 도 20a에서와 같이 절대값으로 가장 잘 비교된다. 결과는 Ad3 바이러스가 RBC 또는 혈청과 연관이 없고 혈전 및 혈장에 많이 존재한다는 것을 시사한다. 따라서, WBC 및 혈소판은 마우스에서 가능한 Ad3 바이러스 운반체이다.
아데노바이러스 벡터
본 발명에서, 혈청형 3을 기반으로 하는 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터가 작제될 수 있고 종양 세포 사멸을 가능하게 한다는 것을 보여준다.
Ad3에서 뿐만 아니라 다른 아데노바이러스에서도 20면체 캡시드는 적어도 3가지 주 단백질: 헥손, 펜톤 염기 및 섬유와 함께 부 단백질, 예컨대 VI, VIII, IX, IIIa 및 IVa2로 이루어져 있다(Russell W.C. 2000, J General Virol 81, 2573-2604; Sirena D et al. 2005, Virology 343: 283-298).
시레나 등(2005, Virology 343: 283-298)은 야생형 Ad3의 전체 뉴클레오타이드 서열을 보고했다(GeneBank 등록번호 DQ086466). Ad3 게놈은 초기(E1-4), 중기(IX 및 IVa2) 및 주요 후기 유닛(MLTU) 영역을 함유하고, 여기에 DNA 복제에 필요한 서열을 함유하는 좌측 및 우측 역말단 반복체(각각 LITR 및 RITR)가 인접해 있다.
본 발명의 한 양태에서, 완전한 혈청형 3 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터는 E1, E2, E3, E4, 중기 및 후기 영역으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 영역을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터는 다음과 같은 영역을 포함한다: 좌측 ITR, E1, pIX, pIVa2, E2, VA1, VA2, 후기 영역, E3 또는 부분 E3, E4 및 우측 ITR.
이 영역들은 벡터에 임의의 순서로 존재할 수 있으나, 본 발명의 한 양태에 따르면 상기 영역들은 5'에서 3' 방향으로 순차적인 순서로 존재한다. 개방 판독 프레임(ORF)은 동일한 DNA 쇄 또는 상이한 DNA 쇄에 존재할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "아데노바이러스 혈청형 3(Ad3)"이란 표현은 Ad3 오리진의 E1, pIX, pIVa2, E2, VA1, VA2, 후기 영역, E3 또는 부분 E3, 및 E4로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 또는 다수의 영역을 포함하는 사람 Ad3의 게놈 또는 부분 게놈을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "부분" 영역이란 표현은 대응하는 야생형 영역과 비교했을 때 임의의 부분이 없는 영역을 의미한다. "부분 E3"은 gp19k가 없는 E3 영역을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "VA1" 및 "VA2"란 표현은 아데노바이러스에 의해 전사되지만 해독되지 않는 바이러스 관련 RNA 1 및 2를 의미한다. VA1 및 VA2는 세포 방어 기전을 퇴치하는데 역할을 한다.
내인성 또는 외인성 인자의 삽입은 표적 세포에서의 벡터의 효과를 증진시킬 수 있다. 외인성 조직 또는 종양-특이적 프로모터의 사용은 재조합 아데노바이러스 벡터에서 일반적이며, 본 발명에도 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 복제는 프로모터, 예컨대 hTERT, hTERT의 변이체, CEA, SLP, Cox-2, Midkine, E2F, E2F의 변이체, CXCR4, SCCA2 및 TTS 등(이에 국한되지 않는다)에 의해 표적 세포에 제한될 수 있다. 이것은 보통 E1A 영역을 조절하기 위해 부가되지만, 추가로 또는 대안적으로 다른 유전자, 예컨대 E1B 또는 E4도 조절될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터는 hTERT 프로모터 하에 Ad3 E1A 영역을 포함한다. Ad3-hTERT-E1A는 종양 특이적 복제를 위한 E1A 전사 부위의 상류에 사람 텔로머라제 촉매 도메인 프로모터를 함유한다.
최근 수십년 동안 텔로미어 및 텔로머라제에 대한 연구는 빠르게 진행되었다. 텔로머라제 활성화는 사람 암발생에서 중요한 단계이며, 대부분의 사람 종양은 텔로머라제의 활성을 특징으로 한다. 이 특징은, 대부분의 사람 종양에서 활성인 것으로 제안되어 있고 이에 따라 유용한 종양 특이적 프로모터를 나타내는 hTERT 프로모터의 활성과 가깝게 연관되어 있다. 본 발명의 한 양태에서, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터는 텔로머라제 활성이 있는 세포에서만 복제할 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 종양용해성 아데노바이러스 벡터는 복제 활성화된 Ad3 E3 프로모터 하에 Ad3 E3 영역을 포함한다. 본 발명의 1가지 구체적 양태에서, 전이유전자는 E3 프로모터 하에 gp19k 결실된 E3 영역에 위치한다. 이것은 전이유전자 발현을, 바이러스의 복제를 허용하고 이어서 E3 프로모터의 활성화를 허용하는 종양 세포에 제한시킨다. E3 프로모터는 당업계에 공지된 임의의 외인성 또는 내인성 프로모터일 수 있고, 내인성 프로모터가 바람직하다.
외인성 격리자, 즉 비특이적 인핸서에 대한 차단 인자, 좌측 ITR, 자연의 E1A 프로모터 또는 염색질 단백질도 재조합 아데노바이러스 벡터에 포함될 수 있다. 임의의 추가 성분 또는 변형이 임의로 사용될 수 있으나, 본 발명의 벡터에 필수적인 것은 아니다.
E3 영역은 시험관내 바이러스 복제에 필수적인 것은 아니나, E3 단백질은 숙주 면역 반응의 조절에, 즉 선천적 면역반응 및 특이적 면역반응 모두의 억제에 중요한 역할을 한다. 본 발명의 벡터는 E3에 gp19k 영역의 결실이 있을 수 있다. gp19k 유전자 산물은 소포체에서 주 조직적합성 복합체 1(MHC1) 분자에 결합하여 격리하고, 세포독성 T-림프구에 의한 감염 세포의 인식을 방해하는 것으로 알려져 있다. 많은 종양은 MHC1 결손성이기 때문에, gp19k의 결실은 바이러스의 종양 선택성을 증가시킨다(이 바이러스는 야생형 바이러스보다 정상 세포로부터 더 빠르게 제거되지만, 종양 세포에서는 차이가 없다).
본 발명의 한 양태에서, 종양용해성 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 전이유전자를 포함한다. 본 발명의 한 양태에서, 전이유전자는 hTERT 프로모터 하에 E1 및/또는 복제 활성화된 Ad3 E3 프로모터 하에 E3에 위치한다. 본 발명의 한 양태에서, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터는 E3 영역의 결실된 gp19k 위치에 전이유전자를 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 종양용해성 아데노바이러스 벡터는 전이유전자와 E1A 영역 사이에 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함한다. IRES는 단백질 합성 시에 메신저 RNA 서열 중간에서 해독 개시를 가능하게 하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명의 한 양태에서, IRES는 Clontech 벡터 pIRES2-DsRed2에서 입수한 뇌심근염 바이러스(EMCV) 유래인 것이다. 본 발명의 한 양태에서, 종양용해성 아데노바이러스 벡터는 hTERT 프로모터, 전이유전자, IRES 및 E1A를 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 전이유전자는 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 사람 요오드화나트륨 공동수송자(hNIS), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 종양 괴사 인자 알파, CD40L, 트라스투주마브 및 다른 모노클로날 항체로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
GM-CSF는 천연 킬러(NK) 세포의 동원 및 항원 제시 세포(APC)의 자극을 비롯한 다양한 기전으로 통해 작용하여 면역 반응에 참여한다. 그 다음, APC는 종양쪽으로 T-세포를 동원, 활성화 및 표적화할 수 있다. GM-CSF를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 임의의 동물, 예컨대 사람, 원숭이, 래트, 마우스, 햄스터, 개 또는 고양이에서 유래한 것일 수 있으나, GM-CSF는 사람 서열에 의해 암호화되는 것이 바람직하다. GM-CSF를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 GM-CSF의 효과를 향상시키기 위해 변형될 수 있고, 또는 미변형된, 즉 야생형 서열일 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, GM-CSF를 암호화하는 핵산 서열은 야생형인 것이다.
본 발명의 한 양태에서, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터는 방사성요오드화물을 표적 세포로 표적화하는 hINS(서열번호 15)를 포함한다. 전이유전자로서 요오드화나트륨 공동수송자(hNIS)의 발현은 전신 적용가능한 방사성동위원소, 예컨대 방사성요오드화물을 종양으로 표적화하기 위한 전략이다. 이 접근법은 바이러스의 종양용해 효과 및 방사선 유도 세포사로 인하여 종양 세포가 사멸되게 하고, 이 접근법은 또한 방사선과 종양용해성 아데노바이러스 복제 간에 상승작용을 이용한다. hNIS의 또 다른 유용한 관점은 바이러스 분포와 존속을 모니터할 수 있게 하는 전이유전자 발현의 비침습적 영상화이다.
hNIS는 갑상선 소포 세포에서 주로 발현되는 통합 원형질막 당단백질이다(Dohan O et al. 2003, Endocr Rev. 24: 48-77). hNIS의 생물학적 기능은 갑상선 호르몬 생합성의 중요한 성분인 요오드의 능동 수송을 매개하는 것이다. 이러한 hNIS의 수송능은 반세기 동안 갑상선 암종의 방사성요오드화물 요법에 사용되어 왔고, 여기서, 방사능 요오드화물 분자(131I)는 갑상선 기원의 암 세포에 내부에서 방사하는데 사용된다.
본 발명에서, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 종양괴사인자, CD40L, 트라스투주마브 및/또는 다른 모노클로날 항체는 예컨대 자연 킬러 세포, T-세포 및/또는 대식세포를 활성화시켜, 종양세포에 대해 환자의 면역계를 유도하기 위한 전이유전자로서 이용될 수 있다.
본 발명의 벡터는 또한 앞에서 언급한 바와 같은 전이유전자 및/또는 프로모터의 삽입 및 E3의 부분 결실 외에 다른 변형을 포함할 수도 있다. 임의의 캡시드 변형, 즉 당업계에 공지된 헥손, 섬유 및/또는 펜톤 염기 단백질의 변형은, 종양 세포로 바이러스의 전달을 향상시키는 것으로, 역시 본 발명에 이용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "캡시드"는 헥손, 섬유 및 펜톤 염기 단백질을 포함하는, 바이러스의 단백질 외피를 의미한다. 변형은 유전자 변형 및/또는 물리적 변형일 수 있고, 예컨대 특이적세포 수용체를 인식하고/하거나 자연 수용체 결합을 차단하는 리간드 혼입을 위한 변형, 아데노바이러스 벡터의 섬유 또는 마디(knob) 도메인을 다른 아데노바이러스의 마디로 교체하기 위한 변형(키메리즘) 및 특정 분자(예컨대, FGF2)를 아데노바이러스에 첨가하기 위한 변형을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 따라서, 캡시드 변형은 섬유(예컨대, 마디, 꼬리 또는 줄기 부분), 헥손 및/또는 펜톤 염기에 작은 펩타이드 모티프(들), 펩타이드(들), 키메리즘(들) 또는 돌연변이(들)의 혼입을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
발현 카세트는 벡터를 이용하여 세포와 같은 표적에서 전이유전자를 발현시키는데 사용된다. 본 명세서에 사용된 "발현 카세트"란 용어는 cDNA 또는 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 상기 cDNA 또는 유전자의 발현을 제어하고/하거나 조절하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 벡터 또는 이의 일부를 의미한다. 유사하거나 상이한 발현 카세트는 하나의 벡터에 삽입되거나 다수의 상이한 벡터에 삽입될 수 있다. 본 발명의 Ad3 벡터는 다수의 발현 카세트 또는 하나의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 하지만, 하나의 발현 카세트만이 적당하다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함한다. 본 발명의 다른 양태에서, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터는 하나의 발현 카세트만을 포함한다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터를 포함하는 세포는 진핵생물 세포, 세균 세포, 동물 세포, 사람 세포, 마우스 세포 등과 같은 임의의 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 시험관내 또는 생체외에서 아데노바이러스 벡터를 생산하는데 사용될 수 있고, 또는 세포는 아데노바이러스 벡터로 감염된 표적, 예컨대 종양 세포일 수 있다.
암
임의의 암 또는 종양, 예컨대 악성 및 양성 종양뿐 아니라 원발성 종양 및 전이암은 유전자요법의 표적일 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 암은 임의의 고형암이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 암은 비인두암, 윤활막암, 간세포암, 신장암, 결합조직암, 흑색종, 폐암, 내장암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 뇌암, 인후암, 구강암, 간암, 골암, 췌장암, 융모막암종, 가스트린종, 크롬친화세포종, 프로락틴분비종양, T-세포 백혈병/림프종, 신경종, 폰히펠-린다우병, 졸링거-엘리슨 증후군, 부신암, 항문암, 담관암, 방광암, 요관암, 뇌암, 희소돌기아교세포종, 신경모세포종, 수막종, 척수암, 골암, 골연골종, 연골육종, 유잉 육종, 미지의 원발성 부위의 암, 유암종, 위장관의 유암종, 섬유육종, 유방암, 파제트병, 자궁경부암, 결장직장암, 직장암, 식도암, 담낭암, 두부암, 안구암, 경부암, 신장암, 빌름 종양, 간암, 카포시 육종, 전립선암, 폐암, 고환암, 호지킨병, 비-호지킨병, 구강암, 피부암, 중피종, 다발골수종, 난소암, 내분비 췌장암, 글루카곤종, 췌장암, 부갑상선암, 음경암, 뇌하수체암, 연조직 육종, 망막모세포종, 소장암, 위암, 흉선암, 갑상선암, 영양막암, 포상기태, 자궁암, 자궁내막암, 질암, 음문암, 청신경종, 균상식육종, 인슐린종, 유암종 증후군, 소마토스타틴종, 치은암, 심장암, 입술암, 수막암, 구강암, 신경암, 입천장암, 이하선암, 복막암, 인두암, 흉막암, 침샘암, 혀암 및 편도암으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
약제학적 조성물
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 벡터 중 적어도 1종을 포함한다. 또한, 상기 조성물은 본 발명의 적어도 2종, 3종 또는 4종의 다른 벡터를 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터 외에, 약제학적 조성물은 임의의 다른 벡터, 예컨대 다른 아데노바이러스 벡터, 다른 치료 유효 제제, 임의의 다른 제제, 예컨대 약제학적으로 허용되는 담체, 완충액, 부형제, 보강제, 방부제, 충전제, 안정제 또는 점증제, 및/또는 대응 제품에서 통상 발견되는 임의의 성분을 포함할 수도 있다.
약제학적 조성물은 투여하기에 적합한 임의의 형태, 예컨대 고체, 반고체 또는 액체 형태일 수 있다. 제형은 용액, 유탁액, 현탁액, 정제, 펠릿 및 캡슐(이에 국한되지 않음)로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 종양용해성 아데노바이러스 벡터 또는 약제학적 조성물은 원위치(in situ) 암 백신으로 작용한다. 본원에 사용된 "원위치 암 백신"은 종양 세포를 사멸시키고 종양 세포에 대한 면역 반응을 증가시키기도 하는 암 백신을 의미한다. 바이러스 복제는 면역계에 대한 강한 위험 시그널(= TH1형 반응에 필요함)이고, 따라서 GM-CSF 매개 성숙 및 APC 활성화 및 NK 세포 동원에 강력한 공동자극 현상으로 작용한다. 종양 세포 용해는 또한 APC에 종양 단편 및 에피토프의 제시를 돕고, 나아가 염증에 의해 공동자극이 나타난다. 따라서, 에피토프 독립적(즉, HLA 비제한적) 반응이 각 종양의 환경에서 생산되어 원위치에서 일어난다. 종양 특이적 면역 반응은 표적 세포뿐 아니라 주위 세포, 예컨대 표적 조직에서 활성화된다.
벡터의 유효 용량은 적어도 치료를 요하는 피검체, 종양 종류, 종양 위치 및 종양 단계에 의존적이다. 용량은 예컨대 약 108 바이러스 입자(VP) 내지 약 1014 VP, 바람직하게는 약 5 X 109 VP 내지 약 1013 VP, 더욱 바람직하게는 약 8 X 109 VP 내지 약 1012 VP로 다양할 수 있다.
약제학적 조성물은 당업계에 공지된 임의의 통상적인 과정에 의해, 예컨대 회분식, 유가식 및 관류 배양 방식, 컬럼 크로마토그래피 정제, CsCl 구배 정제 및 저전단 세포 잔류 장치를 구비한 관류 방식 중 어느 하나를 이용하여 생산할 수 있다.
투여
본 발명의 벡터 또는 약제학적 조성물은 식물, 동물 및 사람으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 임의의 진핵생물 피검체에게 투여할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 피검체는 사람 또는 동물이다. 동물은 애완동물, 가축 및 축산 동물로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
대부분 성체가 가장 널리 사용되는 아데노바이러스 혈청형 Ad5에 노출되었고, 이에 대해 면역계는 중화 항체(NAb)를 빠르게 생산할 수 있다. 실제, 항-Ad5 NAb의 우세는 최고 50%일 수 있다. NAb는 아데노바이러스 캡시드의 다수 면역원성 단백질 대부분에 대하여 유도될 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 본 발명의 한 양태에서, 피검체는 다량의 항-Ad5 중화 항체를 보유한다. 본 발명의 한 양태에서, 피검체는 Ad5로 이미 처리된 적이 있는 피검체이다.
피검체에 벡터 또는 조성물을 투여하는 데에는 모든 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 투여 경로는 조성물의 제형 또는 형태, 질환, 종양 위치, 환자, 동반질병 및 다른 요인에 따라 달라진다. 본 발명의 한 양태에서, 투여는 종양내, 근육내, 동맥내, 정맥내, 흉막내, 소포내, 강내 또는 복막 주사 또는 경구 투여를 통해 수행된다.
본 발명의 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터는 1회 투여만으로 치료 효과를 나타낼 수 있다. 하지만, 본 발명의 한 양태에 따르면, 종양용해성 아데노바이러스 벡터 또는 약제학적 조성물은 치료 기간 동안 여러 번 투여한다. 종양용해성 아데노바이러스 벡터 또는 약제학적 조성물은 예컨대 처음 2주, 4주, 매달 또는 치료 기간 동안 1 내지 10회 투여할 수 있다. 본 발명의 한 양태에 따르면, 투여는 처음 2주까지 3 내지 7회, 그 다음 4주째, 그 다음 매달 수행된다. 치료 기간의 길이는 다양할 수 있고, 예컨대 2 내지 12개월 또는 그 이상 지속할 수 있다.
그럼에도 불구하고, 진행성 종양 덩어리인 경우에 1회 치료는 종양을 근절시킬 수 없다. 따라서, 바이러스의 재투여는 효능을 증가시키는데 필요한 것 같다. 전신 재투여를 제한하는 주요 인자는 바이러스에 의해 유도된 중화 항체(NAb) 반응이다. 피검체의 중화 항체를 피하기 위해, 본 발명의 벡터는 치료마다 달라질 수 있다.
본 발명의 유전자요법은 단독으로 효과가 있지만, 임의의 다른 치료법, 예컨대 통상적인 치료법과 아데노바이러스 유전자요법의 병용이 단독 요법보다 더욱 효과적일 것이다. 예를 들어, 병용 요법의 각 제제는 종양 조직에서 독립적으로 작용할 수 있어, 아데노바이러스 벡터는 화학요법 또는 방사선요법에 대해 세포를 민감해지게 할 수 있고/있거나, 화학요법제는 바이러스 복제의 수준을 증진시키거나 또는 표적 세포의 수용체 상태에 영향을 미칠 수 있다. 병용 요법의 제제는 동시에 또는 연속해서 투여할 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 당해 방법 또는 용도는 추가로 피검체에 대한 병행 방사선요법 또는 방사성요오드화물의 처치를 포함한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 당해 방법 또는 용도는 추가로 피검체에 대한 병행 화학요법의 처치를 포함한다. 본원에 사용된 "병행"은 본 발명의 유전자요법 전이나 후 또는 동시에 처치되는 치료법을 의미한다. 병행 요법의 기간은 수분에서 수주까지 다양할 수 있다. 병행 요법은 수시간 동안 지속하는 것이 바람직하다.
병용 요법에 적합한 제제는 올-트랜스(All-trans) 레티노산, 아자시티딘, 아자티오프린, 블레오마이신, 카르보플라틴, 카페시타빈, 시스플라틴, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 다우노루비신, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에피루비신, 에포틸론, 에토포사이드, 플루오로우라실, 젬시타빈, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이마티니브, 메클로레타민, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉시드, 테모졸로마이드, 테니포사이드, 티오구아닌, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 비노렐빈을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
아데노바이러스 벡터를 생산하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 모든 방법을 포함한다. 보통, 전이유전자(들)는 셔틀 플라스미드에 삽입되고, 그 다음 셔틀 플라스미드와 바이러스 게놈의 나머지를 함유하는 플라스미드("구제 플라스미드(rescue plasmid)") 간에 상동 재조합이 수행된다. 그 후, 플라스미드로부터 새로운 게놈이 절단되어 바이러스 생산 세포에 형질감염될 수 있다. 대안적으로, 구제 플라스미드는 상기 세포들에서 재조합하기 위해 생산자 세포에 공동형질감염될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 플라스미드 작제물은 전이유전자(들)를 아데노바이러스 벡터로 위치시키는데 사용된다.
본 발명의 한 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 세포주 내에서 생산한다. 보통, 진핵생물 세포는 아데노바이러스 벡터로 형질감염하고, 그 다음 바이러스-생산 세포를 선택하여, 증대시킨 후 검사한다. 본 발명의 바이러스 벡터는 또한 동물 또는 사람에게 투여하기 전에 광범위한 정제를 필요로 한다.
본 발명은 다음 실시예에 의해 예시되지만, 이는 어떤 방식으로도 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예
세포배양
293 세포는 마이크로빅스(Microbix; 캐나다 토론토 소재)에서 구입했다. 293-2v6-11 세포는 포나스테론-유도성 E4orf6 영역을 함유한다(Mohammadi E.S. et al. 2004, Nucleic Acids Res 32: 2652-2659). 911-1c11 세포는 1mg/ml G418에서 유지되었다(Sirena, D. et al. 2005, Virology 343: 283-298). SKOV3.ip1 난소 선암종 세포주는 Price 박사(M.D.Anderson Cancer Center, Houston, TX)로부터 입수했다. 반딧불이 루시페린-발현 난소 선암종 세포주 SKOV3-luc는 Negrin 박사(Stanford Medical School, Stanford, CA)가 친절하게 제공해주었다. PC-3MM2 고전이성 호르몬 난치성 전립선 암종 하위계열은 Isaiah J. Findler(MD Anderson Cancer Center, Houson, TX)의 친절한 선물이었다. 폐의 사람 거대세포 암종의 고 림프형성 전이성 하위계열인 LNM35/EGFP는 Takashi Takahashi(The Honda Research Institute, Japan)에게서 받았다. HUVEC로 알려진 사람 제대 정맥 내피 세포는 Lonza(Basel, Switzerland)에서 구입했다. 다음 세포주는 ATCC(Manassas, VA)에서 입수했다: ACHN 신장 세포 암종, A549 폐 선암종, FHS173WE 사람 섬유아세포 세포주, HTC116 결장직장 암종, CAMA-1 유방 선암종, PANC-1 췌장 상피모양 암종. 모든 세포주는 권장된 조건 하에 배양했다.
Ad3 - hTERT - E1 의 작제
Ad3-hTERT-E1을 클로닝하기 위해 3가지 다른 PCR을 Ad3-wt 플라스미드 pKSB2Ad3wt(Sirena, D. et al. 2005, Virology 343: 283-298)에 수행했고, 이 중 2가지는 Ad3wt 서열로부터 본래 TATA-박스를 제거했다(도 1-3). 처음 PCR 산물은 TATA-박스까지 MluI 분해 분위를 보유한 LITR을 포함했고(정방향 프라이머: 5'-CAT GGT ACC CAA GTG TGT CGC TGT CGA GT-3'(서열번호 1), 역방향 프라이머: 5'-CAT GAT ATC AGC GAT CAG CTG ACA CCT AC-3'(서열번호 2); 앞에 KpnI 부위가 부가되고 끝에 EcoRV 부위가 부가됨); 두번째는 TATA-박스 이후 E1A 영역의 처음 절반까지 직접 시작했다(정방향 프라이머: 5'-CAT GAT ATC GTG CCA GCG AGA AGA GTT TT-3'(서열번호 3), 역방향 프라이머 5'-CAT TCT AGA GCG AGC ACA ATA GTT CTT TCA-3'(서열번호 4); 앞에 EcoRV 부위 및 끝에 XbaI을 부가함). 세번째 PCR은 RITR을 포함한 아데노바이러스 타입 3의 말단 1600bp를 증폭시켰다. 첫번째 두 PCR 산물은 TATA-박스 주위를 각각 분해하여 KpnI/XbaI 분해된 pUC19 클로닝 벡터에 클로닝하여, Ad3 서열의 TATA-박스 배제된 개시부를 포함하는 pGBAd3E1을 산출했다. pBT255 유래의 hTERT 프로모터는 KpnI/XhoI로 분해하고, 평활말단화한 뒤, pGBAd3E1의 EcoRV 분해로 E1 영역 앞에 클로닝하여 pGBAd-3hTERT-E1을 수득했다.
Ad3 서열의 말단을 보유한 세번째 PCR 산물은 이제 NotI/평활말단화된 pShuttle에 클로닝한 뒤, HindIII으로 분해하고, 이어서 HindIII 분해된 pGBAd3-hTERT-E1에 클로닝하여, 아데노바이러스 3 게놈의 말단 및 변형 개시부를 보유한 셔틀 벡터로서 pSGBAd3-hTERT-E1을 산출했다. 마지막으로, pSGBAd3-hTERT-E1은 XhoI/MscI으로 분해하여 아데노바이러스 3 서열의 변형 개시부와 보존된 말단 사이가 열려있고 MluI 분해되어 골격이 없는 pKSB2Ad3wt와 상동 재조합된 플라스미드를 산출하여, 동일한 내성 유전자로 인한 배경을 감소시키고 Ad3-hTERT-E1 서열을 보유한 플라스미드(pKGB-Ad3-hTERT-E1)를 수득했다.
재조합 Ad3-hTERT-E1A 바이러스는 911-1c11 세포를 MluI-분해된 pKGB-Ad3-hTERT-E1로 형질감염시켜 구제했다. 이어서, 첫번째 큰 Ad3-hTERT-E1A 바이러스 스톡의 증폭은 293-2v6-11 세포에서 수행했고, 그 다음 A549 세포에서 2차 증폭시켰다. 증폭 후, 바이러스는 이중 염화세슘 구배에서 정제했다. 스톡은 PCR(표준 방법은 Kanerva, A. et al. 2003, Mol Ther 8: 449-458 참조)에 의해 혈청형 5 오염이 없는 것으로 확인되었다. 그 다음, E1A 앞에 hTERT 프로모터의 존재가 확인되었다(도 3b). 270bp 밴드를 얻기 위해 사용한 프라이머는 5'-GGT TAT GCC AGG GTG GAG TA-3'(정방향, 서열번호 5) 및 5'-AAG GTG AAG GGG CAG GAC-3' 역방향(서열번호 6)이었다. 210bp 밴드를 위해, 사용한 프라이머는 5'-AGC CCC TCC CCT TCC TTT-3' 정방향(서열번호 7) 및 5'-CCC GGT CTC ACT GGA GAT AA-3' 역방향(서열번호 8)이었다. 그 다음, PCR 밴드는 서열분석하고, 예상한 서열을 수득했다(서열번호 9 및 도 10 참조).
마지막으로, Ad3-hTERT-E1A는 전자현미경으로 관찰했다(도 9 참조).
다른 아데노바이러스
본 발명에 관련된 아데노바이러스는 표 1을 참조한다.
Figure pct00001
진행 감염성 분석
Ad5 기반 바이러스에 대해 확립된 방법론은 복제가 더 느린 Ad3 야생형 및 Ad3-hTERT-E1A를 위해 최적화되어야 한다. 기능성 역가를 예측하기 위해, 보통 10일 세포변성 효과 분석은 충분하지 않았고, 따라서 더욱 역동적인 진행 감염성 분석(도 3c)을 개발했고, 여기서 세포변성 효과는 역가가 안정상태에 이를 때까지 발생하게 했다. 이것은 바이러스의 실제 기능성 역가를 나타낸다.
세포는 96웰 플레이트에서 10000 세포/웰로 배양하고, 다음 날 각 행을 10-5 내지 10-12의 Ad3-hTERT-E1A 10배 감소 희석물로 각 희석물당 10 반복으로 하여 감염시켰다. 감염은 DMEM, 2% FBS에서 수행했다. 플레이트는 현미경으로 관찰하고, 바이러스 웰을 모의(mock) 웰과 비교했다. 이 관찰로부터 pfu/ml를 TCID50(Adeasy manual, Agilent Technologies, Inc. 2008)와 유사한 방식으로 계산했다. 배지(DMEM, 5% FBS)는 4 내지 7일마다 교환했다.
시험관내에서, 상기 바이러스는 최대 역가에 도달하는데 더 느려서, 기능성 감염성 분석에 35일을 필요로 했다.
시험관내 세포독성 분석
세포는 96웰 플레이트에서 10000 세포/웰로 평판배양했다. 다음 날, 3반복 또는 4반복으로 세포를 0.1 내지 100 VP/웰의 상기 바이러스로 감염시켰다. 감염은 2% 소 태아 혈청(FBS)에서 수행했다. 플레이트는 정기적으로 관찰하고 성장배지는 3 내지 5일마다 교환했다. 6일 내지 20일 후, 각 세포주에 최적일 때, 세포 생존도를 MTS 분석으로 분석했다(Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega). MTS 분석은 다음과 같은 날에 수행했다: PC-3MM2(8일), A549(17일), HTC116(6일), SKOV3.ip1(18일), HUVEC(11일), FSH174WE(13일), LNM-35/EGFP(10일), CAMA-1(11일), PANC-1(20일) 및 ACHN(11일). 결과는 도 4A-D에 제시했다.
두 완전한 Ad3 바이러스는 세포독성 분석에서 사실상 모든 암세포를 사멸시켰지만, 5/3 혈청형 키메라를 비롯한 Ad5 기반의 종양용해성 인자보다 더 느린 것으로 보였다. 비-암세포에서, Ad3-hTERT-E1A는 야생형 Ad3을 비롯한 대조용 바이러스보다 독성이 적었다. Ad3-hTERT-E1A는 Ad3 수용체가 없는 세포를 사멸시킬 수 없었다.
시험관내에서 암 세포주에 미치는 Ad3 - hTERT - E1A 의 종양용해 효능
시험관내에서 암 세포를 사멸시키는 Ad3-hTERT-E1A의 능력은 여러 다른 종양 종류를 나타내는 단층을 감염시켜 분석했다(도 4A-D 및 도 7A-C). 모든 악성 세포주에서 Ad3-hTERT-E1A는 완전한 종양용해를 나타낸 반면, 비-복제성 Ad5/3luc1 바이러스는 어떠한 세포 사멸도 나타내지 않았다(p<0.05). 하지만, 바이러스의 성장 및 적정 실험을 기반으로 하여 예상된 것처럼, Ad3-hTERT-E1A는 혈청형 5 바이러스보다 다소 더 느렸다.
Ad3 - hTERT - E1A 의 종양 선택성
종양 선택성을 분석하기 위해, 본 발명자들은 HUVEC(사람 제대 정맥 내피 세포) 및 FSH173WE(섬유아세포)를 동일 바이러스로 감염시키고 세포 사멸 분석을 수행했다(도 5). 낮은 바이러스 농도와 높은 용량에서는 세포 사멸이 관찰되지 않았다. Ad3-hTERT-E1A는 대조용 바이러스 Ad3wt, Ad5wt, Ad5/3-hTERT-E1A, Ad5/3-△24(0.1, 1 및 10 VP/세포 P<0.05)보다 독성이 적었다. Ad5/3 키메라를 이용한 종래 연구에서, 본 발명자들은 LNM-35/EGFP가 Ad5/3으로 감염될 수 없어 Ad3 수용체가 없을 수 있다는 것을 알았다(Sarkioja, M. et al. 2006, Cancer 107: 1578-1588). 적합하게, Ad3-hTERT-E1A 또는 Ad3 야생형에 의해 어떠한 세포 사멸도 관찰되지 않았다.
동물 실험
모든 동물 실험은 헬싱키 대학 실험 동물 위원회 및 남핀란드 지방 정부의 승인을 받았다. 마우스의 건강 상태는 자주 모니터했고, 통증이나 곤란의 징후가 확인되자마자 즉시 안락사시켰다. 피하 모델로, 암컷 NMRI 누드 마우스를 사용했다(Charles River, Germany). 이들 마우스는 3 내지 4주령 정도를 주문했고 2주 동안 검역했다. 복강내 모델로, 암컷 폭스체이스 SCID 마우스(Charles River, Germany)를 사용했다. 이들 마우스는 6 내지 7주령을 주문했고, 4개월 동안 검역했다.
생체내 종양용해 효능
본 발명자들은 PC-3MM2 전립선암 이종이식편을 보유하는 마우스에서 Ad3-hTERT-E1A의 효능을 검사했다(도 6A). Ad3-hTERT-E1A는 PBS 주사에 비해 종양 성장을 유의적으로 감소시킬 수 있었다(P=0.0035). 흥미롭게도, 바이러스가 시험관내에서 양성 대조군보다 성장은 느렸지만, 생체내 효능의 차이는 없었다. Ad3-hTERT-E1A는 생체내에서 적어도 Ad5 및 Ad5/3 기반 대조군만큼 종양용해성이었다. A549 이종이식편을 보유한 마우스(도 6B)에서, Ad3-hTERT-E1A 그룹은 17일 이후 최소의 종양을 보유했지만, PBS 그룹의 빠른 종양 성장과 17일째 이 그룹의 중단 때문에, 본 실험은 통계적 검증력을 많이 잃었다. 17일째, 경계 차이(P=0.051)는 Ad3-hTERT-E1A 및 PBS를 비교하여 관찰할 수 있었다. 30일째, Ad3-hTERT-E1A는 매우 강력한 종양용해성 아데노바이러스인 것으로 알려져 있는(Bauerschmitz, G.J. et al. 2008, Cancer Res 68: 5533-5539) Ad5/3-hTERT-E1A보다 유의적으로(P=0.01) 우수하게 종양 성장을 감소시켰다.
피하 종양은 사람 암의 최적 대리물이 아닐 수도 있어서, 루시퍼라제 발현성 SKOV3Luc 세포로 유도된 복강내 파종 암종증을 특징으로 하는 동소 모델을 이용하도록 진행했다(도 6C, D). Ad3-hTERT-E1A는 PBS 처리된 마우스(p<0.0001)에 비해 루시퍼라제 시그널을 현저하게 감소시켰다. 다른 복제 컴피턴트 바이러스 간에 효능 차이는 없었다. Ad3-hTERT-E1A는 마우스의 중간 생존성을 34일에서 46일로 연장시켰고(PBS 대 Ad3-hTERT-E1A), 이것은 카플란-마이어 생존 분석에서 큰 차이를 초래했다(p=0.01). Ad3-hTERT-E1A로 처리한 마우스 7마리 중 1마리는 실험 종료(120일)까지 생존했고, 루시퍼라제 영상화 또는 부검에서 종양 증거를 검출할 수 었었고 행동이 정상이었기 때문에 치유된 것일 수 있다.
피하 동물 실험
마우스에게 2x106 PC-3MM2 또는 5x106 A549 세포를 양 옆구리에 피하 주사했다. 각각 13일 및 11일 후, 종양은 측정가능한 크기로 발달했고, 마우스는 PBS 중의 109 VP 또는 PBS만으로 종양내 치료를 받았다. 종양당 주사 용적은 50 ㎕였다. 주사는 1주 및 2주 후에 반복했다. 종양은 자주 측정했고, 용적은 V = L x H 2 x 0.52로 계산했다. 1차 처리 전에 측정된 용적은 100%로 간주하고, 종양 성장을 이와 비교했다. A549 그룹에서, PBS 처리된 종양 일부는 공격적으로 성장했고, 2주반 후에 마우스를 안락시켜야 했다.
복강내 동물 실험
복강내 파종 난소암의 동소 모델은 SCID 마우스에게 순수 DMEM 300 ㎕ 중의 5x106 SKOV3-luc 세포를 복강내 주사하여 발생시켰다. 3일 후, 마우스(n=7)는 비침습적으로 영상화하고 PBS 또는 PBS 중의 109 VP를 마우스당 주사하여 복강내 치료했다. 마우스는 마우스 내 종양 세포 수를 추정하기 위해 IVIS 100(Xenogen, Alameda, CA, USA)으로 3일, 7일, 14일, 21일, 28일, 35일 및 42일째 영상화했다(도 8). 생물발광 영상화를 위해, 150mg/kg D-루시페린(Promega, Madison, WI, USA)을 복강내 주사하고 10분 후 10초 노출 시간, 1f/정지, 중간 비닝(binning) 및 개방 필터에서 포착했다. 영상화 동안 마우스는 이소플루란 기체 마취 하에 있었다. 영상은 Living Image 2.50(Xenogen)과 중층시켰다. 총 플럭스(광자/초)는 마우스의 복강 부위 둘레에 ROI(region of interest)를 그려서 측정했다. 배경은 감산했다.
마우스의 독성학
독성 연구에서(도 18a-c), Ad3-hTERT-E1A는 면역 컴피턴트 쥐 모델에서 Ad5 및 Ad5/3 대조용 바이러스보다 독성이 적은 것으로 발견되었다. 모든 주요 기관의 조직학과 기본 혈액 값을 분석했다. 8x1010 VP를 정맥내 주입한 후 72시간 후 간 조직검사와 간 효소에서 유의적인 차이가 관찰되었다. 혈청형 3은 일부 마우스에서 비-문맥 정맥 가까이에서 미소한 간 염증만을 나타냈다. 동일한 시점 및 용량에서 혈청형 5 및 5/3 그룹은 급성 간 독성의 특징을 나타냈고 간 효소를 상승시켰다. 다른 기관 및 혈액 값은 독성 징후를 나타내지 않았다. 혈액 샘플 그래프와 간 조직검사 사진을 첨부했다(도 18c). 다음은 전체 조직병리 보고서이다: PBS: 5/5 정상. 유사분열 없음. 염증 없음. Ad3wt: 대부분 정상. 5/5 샘플에서 유사분열. 실질 5/5의 정맥(비문맥) 부근에서 미소한 염증. Ad3 - hTERT - E1A: 대부분 정상. 유사분열 없음. 실질의 정맥(비문맥) 부근에서 경계 염증이 3/5 샘플에서 관찰되었다. Ad5wt: 5/5: 실질을 통한 많은 아폽토시스성 간세포, 내피 면역반응 및 중심 정맥의 손상(문맥 부위에서는 관찰할 수 없었다), 중심주위 간세포 파괴 없음, 지방증, 괴사, 문맥 부위에 림프구 없음, 급성 간 손상, 실질 전반의 손상. Ad5 /3- hTERT -△ gp19k: 5/5: 거의 정상, 일부 점 괴사(Ad5wt에서만큼 많지 않음), 일부 아폽토시스성 세포, 간세포의 유사분열, 실질의 염증(소엽), 정맥 주위 염증(Ad3과 마찬가지). Ad5 /3-△24: 5/5: 급성 전격 간 부전, 조직의 50% 괴사, 모든 세포가 죽은 문맥 부위 부근에서 더 강한 손상, 지방 생성 가능, 일부 유사분열.
사람 환자에서의 바이러스 속도론.
지금까지 표준 치료법에 난치성인 진행성 고형암을 보유한 환자 8명을 Ad3-hTERT-E1A로 치료했다. 안전성은 5x1010 내지 최고 5x1011 바이러스 입자의 용량에서 양호했고, 용량 상승은 계속한다. 종합해보면, 모든 환자는 1-2 등급의 부작용, 일반적으로 열, 오심 및 피로를 경험했다. 등급 3 이상의 부작용은 지금까지 관찰되지 않았다. 전체 분석, 예컨대 효능 및 면역학적 데이터는 처리 중이다.
처음 두 환자로부터 혈액 샘플을 도 19에 도시한 바와 같이 채취했다. 혈액 세포를 퍼콜 구배로 분리하고 DNA를 추출했다. 샘플은 qPCR로 분석했다. 환자 1에서, 바이러스는 1시간 내에 혈소판 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 제거되는 것으로 나타난다. 환자 2에서, 대부분의 바이러스는 혈액에서 빠른 제거 전에 PBMC와 혈장으로 이동하는 것으로 보인다. 두 환자 모두의 적혈구 세포(RBC)에서는 바이러스가 검출되지 않았다. 결과는 Ad3-hTERT-E1A에 의한 암 환자의 치료가 안전할 것이라는 것을 시사한다. 환자 1은 2개의 소변 샘플에서 바이러스가 없었고, 이는 바이러스가 소변으로 분비되지 않는다는 것을 시사한다.
통계학적 분석
비모수 만-휘트니 검사(윈도우용 SPSS 15.0)를 사용하여, 독립된 2 샘플의 시험관내 모든 데이터와 생체내 일부 데이터를 비교했다. 종양 크기 분석은 PROC MIXED(SAS Ver. 9.1)로 반복 측정 모델을 사용하여 수행했다. 모델은 종양 크기 측정을 자연 측정과 로그 변환으로 진행했다. 치료 그룹의 효과, 시간(일) 및 치료 그룹과 시간의 상호작용은 F 검사로 평가했다. 이 모델들의 곡선은 시간에 대한 이차항으로 검사했다. 예상 치료에서 특정 차이의 사전 비교는 시간 경과에 따른 평균을 의미하고 최후 시점에 t-통계학으로 계산했다. A549 실험을 위해, 그룹을 17일과 30일째 비교하고, PC-3MM2는 30일째 비교하고 시간-평균을 구했다. 생존율은 log 등급 회귀와 함께 카플란-마이어 생존 플롯을 이용하여 평가했다(윈도우용 SPSS 15.0). 모든 분석에서 양측 P값 <0.05는 통계적 유의성이 있는 것으로 간주했다.
hNIS 및/또는 GMCSF 및/또는 CD40L 을 포함하는 바이러스 작제물
hNIS 및/또는 GMCSF 전이유전자는 당업계에 공지된 방법을 사용하거나, 상기 실시예 또는 이하 실시예에 기술된 바와 같은 본 발명의 사람 Ad3 기반 벡터에 부가했고, 여기서 본 발명의 비-Ad5 아데노바이러스 벡터, 예컨대 Ad3-hTERT-E1A는 Ad5/3-△24 골격 대신에 사용할 수 있다(도 1 및 2 참조).
I. hNIS 전이유전자
재료 및 방법
세포 배양
안드로겐 독립성 전립선 암 세포주 22Rv1, PC-3, DU-145 및 폐 선암종 세포주 A549는 ATCC(Manassas, VA)에서 구입했다. PC-3MM2 세포는 PC-3의 전이성 호르몬 난치성 하위계열이다(Isaiah J. Fidler, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX의 호의). 사람 배아 신장 상피 293 세포는 Microbix(Toronto, Canada)에서 구입했다. 세포주 911은 Dr Alex J. van der Eb(University of Leiden, The Netherlands)로부터 얻었다. 모든 세포주는 권장 조건 하에 배양했다.
바이러스 작제물
Ad5/3-△24-hNIS를 생성하기 위해, EcoRI-분해되고 평활말단화된 hNIS 단편(pcDNA3-hNIS 유래, Steve Russell(Mayo Clinic, Rochester, MN) 제공)은 BsiWI-MfeI-분해되고 평활말단화된 pTHSN(Kanerva A. et al. Gene Ther 12: 87-94)에 삽입하여 pTHSN-hNIS를 수득했다. 대조용 바이러스 Ad5/3-△24-△gp19K를 만들기 위해, BsiWI-MfeI-분해되고 평활말단화된 pTHSN을 자가연결시켜 pTHSN-△gp19K를 수득했다. pAd5/3-△24-hNIS 및 pAd5/3-△24△gp19k를 수득하기 위해, PmeI-선형화된 pShuttle-△24(Suzuki, K. et al. 2002, Clin Cancer Res 8: 3348-59) 및 pAd5/3-E1-hNIS 또는 pAd5/3-E1-△gp19K는 BJ5183 세포에 전기천공시켰다.
아데노바이러스 플라스미드는 선형화하고 Superfect(Qiagen, Valencia, CA)를 이용해 제조업체의 지시에 따라 911 세포를 형질감염시켰다. 아데노바이러스 콜로니를 채취하고 바이러스를 A549 세포에서 증식시켜 표준 기술을 사용하여 정제했다. Ad5/3-△24 및 Ad5/3luc1 바이러스는 종래와 같이 작제했다(Kanerva, A. et al. 2003, Mol Ther 8: 449-58; Kanerva, A, et al. 2002. Clin Cancer Res 8: 275-80). 바이러스 입자(VP)는 분광광도법으로 측정하고 TCID50 분석으로 플라크 형성 단위(pfu)를 수득했다. 역가는 Ad5/3-△24-hNIS: 1.1x1012VP/ml; 9.0x1010 pfu/ml, Ad5/3-△24-△gp19K: 1.5x1012 VP/ml; 2.8x1011 pfu/ml, Ad5/3-△24: 1.7x1012 VP/ml 및 Ad5/3luc1: 6.9x1011 VP/ml였다.
RT - PCR
전립선 암세포는 +37℃에서 2시간 동안 Ad5/3-△24-hNIS 및 Ad5/3-△24-△gp19K(10VP/세포)로 감염시켰다. 세포는 감염 후 24시간 및 48시간째 수거했다. 총 RNA는 RNeasy Kit(Qiagen)를 사용하여 분리하고 RT-PCR 전에 DNase로 처리했다. 총 RNA 350ng을 각 반응에 사용했다. 증폭(35 사이클, +54℃에서 어닐링)은 OneStep RTPCR Kit(Qiagen)으로 hNIS-특이적 프라이머(정방향 5'-CTT CTG AAC TCG GTC CTC AC-3'(서열번호 10); 역방향 5'-TCC AGA ATG TAT AGC GGC TC-3'(서열번호 11)) 및 β-액틴-특이적 프라이머(정방향 5'-CGA GGC CCA GAG CAA GAC A-3'(서열번호 12); 역방향 5'-CAC AGC TTC TCC TTA ATG TCA CG-3'(서열번호 13))를 사용하여 수행했다. PCR 산물 크기는 hNIS와 β-액틴 각각 453bp와 482bp였다.
요오드화물 흡수
전립선 암세포는 Ad5/3-△24-hNIS 및 Ad5/3-△24-△gp19k(10VP/세포)로 +37℃에서 2시간 동안 감염시켰다. 세포는 감염후 24시간 및 48시간 후에 1x PBS로 세척하고, 7.4 kBq의 요오드화나트륨 [125I]NaI(MAP Medical Technologies Oy, Tikkakoski, Finland)와 실온에서 20분 동안 항온처리했다. 세포는 1x PBS로 2회 세척하고, 그 다음 각 샘플마다 Cell Culture Lysis Reagent(Promega, Madison, WI) 300 ㎕를 사용하여 용해시켰다. 방사능은 다채널 분석기 Atomlab 950(Biodex Medical System, Shirley, NY)과 연결된 웰 계수기로 정량분석했다.
세포 사멸 분석
전립선 암 세포는 Ad5/3-△24-hNIS, Ad5/3-△24-△gp19k, Ad5/3-△24 및 Ad5/3luc1을 0.01, 0.1, 1, 10 및 100 VP/세포로 사용하여 감염시켰다. 성장 배지는 격일로 교환했다. 세포 생존도는 PC-3MM2에 대해서는 감염후(p.i.) 6일째, DU-145 및 PC-3에 대해서는 7일 p.i., 22Rv1 세포에 대해서는 9일 p.i.에 측정했다.
감염후 9일째 CellTiter 96 AQueous One Solution 세포 증식 분석[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시-메톡시페닐)-2(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨[MTS] 분석이라고도 불림; Promega, Madison, WI].
조직 배양 감염 용량( TCID50 ) 분석
세포주 샘플: 5x104 전립선 암세포/웰은 24웰 플레이트의 5% GM 1ml에서 3반복으로 평판배양하고, 밤새 항온배양한 후 Ad5/3-△24-hNIS(5vp/세포)로 +37℃에서 2시간 동안 감염시켰다. 감염 후 8, 24, 48 및 72시간째, 세포와 성장 배지를 수집하고, -80℃에서 동결하고, 3회 동결-해동했다. TCID50을 위해, 세포를 스핀다운시키고, 상청액을 293 세포에 첨가했다.
조직 샘플: Ad5/3-△24-hNIS 및 131I로 처리한 마우스로부터 수집된 기관을 수집하고, 칭량한 뒤, 수동으로 균질화하고 DMEM 800㎕로 희석했다. -80℃에서 3회 동결-해동시켰다. TCID50을 위해, 조직 샘플을 스핀다운시키고 상청액은 293 세포에 첨가했다.
두 실험에서, 104 293 세포는 96웰 플레이트의 5% DMEM 100 ㎕에 평판배양되고, 밤새 항온배양한 뒤, 상기 실험의 상청액으로 감염시켰다. 10일 후 CPE의 발생을 평가하여 역가를 측정했다.
생체내 연구
수컷 NMRI/누드 마우스는 Taconic(Ejby, Denmark)에서 구입했다. 종양은 메데토미딘케타민-0.9% 식염수(1:2:7) 마취 하에 5x106 PC-3MM2 세포를 피하 주사하여 8주령 마우스에 형성시켰다. 영상화 실험에서, 3마리 마우스에게는 종양 세포 접종 후 11일과 12일째 식염수(상부 좌측 종양), 7x108 VP Ad5/3-△24-△gp19K(상부 우측 종양) 및 7x108 VP Ad5/3-△24-hNIS(하부 우측 및 좌측 종양)를 종양내로 제공했다. 최종 바이러스 주사후 1일 후에 마우스에게 1.85 MBq의 요오드화나트륨 [123I]NaI(MAP Medical Technologies Oy, Tikkakoski, Finland)을 정맥내 제공했고, 그 다음 감마 카메라 Toshiba 7200A/UI(Toshiba, Tokyo, Japan)로 요오드화물 노출 후 0.5시간, 1시간, 1.5시간, 2시간, 4시간 및 13시간 후에 영상촬영했다. 동물 규제는 이후 시점에서의 분석을 허용하지 않았다. 감마 에너지 피크 159 keV는 20% 윈도우로 기록했고, 영상당 150 킬로카운트가 수집되었다. 사용된 매트릭스 크기는 256 x 256 x 16이었고, 이는 화소 크기 1.08mm x 1.08mm를 만들었다. 13시간째, 다양한 기관(심장, 폐, 간, 비장, 신장, 갑상선, 위, 근육, 혈액 및 골) 및 종양을 수집하고, 칭량한 뒤, 다중채널 분석기 Atomlab 950(Biodex Medical System, Shirley, NY)이 연결된 웰 계수기로 분석했다. 결과는 조직 g당 초기 요오드화물 용량의 백분율로 표현했다(ID%/g).
치료요법적 실험을 위해, 종양 보유 마우스를 4 그룹(6 마우스/그룹, 2 종양/마우스)으로 무작위로 분류했다: 모의(mock), 131I, Ad5/3-△24-hNIS 및 Ad5/4-△24-hNIS + 131I. 종양 세포 접종 후 6일과 7일 후에, 마우스에게 성장 배지 또는 종양당 7x108 VP의 Ad5/3-△24-hNIS를 종양내로 제공했다. 최종 바이러스 주사 후 1일 후, 마우스에게 50MBq의 무담체 요오드화나트륨([131I]NaI, MAP Medical Technologies Oy, Tikkakoski, Finland)을 복강내로 제공했다. 종양 크기는 격일로 측정하고, 용적은 식(길이 x 너비2 x 0.5)으로 계산했다. 종양 크기로 인해 마우스가 사망했을 때, 기관을 수집하고, 칭량한 뒤, 방사능을 감마 계수기(Wizard 3, PerkinElmer, Turku, Finland)로 180초 동안 측정했다. 결과는 조직 g당 초기 요오드화물 용량의 백분율(ID%/g)로 나타냈다. 전신에서 방출되는 방사능은 9일, 10일, 11일, 13일, 14일, 15일 및 17일에 측정했다. 9 내지 11일째, 측정은 용량 조정기(CRC-120, Capintec, Inc., Ramsey, NJ)에서 수행하고, 11일 후에는 납 측정실 및 요오드화나트륨 섬광 결정을 보유한 UniSpec 튜브-베이스 다중채널 분석기(Canberra Industries, Inc., Meridien, CT)로 이루어진 전신 측정 장치에서 수행했다. 14일째 마우스의 체중을 재고, 이 중량을 전체 실험 동안 계산에 사용했다.
모든 실험에서, 마우스는 동물 규제가 요구하는 바와 같이 종양 크기가 어떤 직경에서든지 15mm에 이르면 사망시켰다. 치료요법적 생체내 실험은 동물 보호 규제로 인해 17일째 중단해야 했다. 모든 동물 실험은 핀란드 국립 동물 실험 위원회(State Provincial Office of Southern Finland, Hameenlinna, Finland)의 승인을 받았다.
통계학적 분석
요오드화물 흡수 분석은 본페로니의 사후 검정과 일원 분산분석(ANOVA)으로 수행했다. 실험 그룹 간에 시간 경과에 따른 종양 용적의 분석은 PROC MIXED(SAS Ver. 9.1, Cary, NC)로 반복 측정 모델을 사용하여 수행했다. 종양 용적 측정은 표준화를 위해 로그 변환했다. 예상 치료에서 특정 차이의 사전 비교는 시간 경과에 따른 평균값을 의미하고, 각 시점에서 t-통계학과 터키-트래머 모델을 조정을 위해 사용했다. 모든 분석에서 양측 p값은 <0.05이면 통계적 유의성이 있는 것으로 간주했다.
결과
hNIS 특이적 mRNA 는 Ad5 /3-△24- hNIS 감염된 전립선 암 세포에서 검출된다.
Ad5 섬유 줄기에 Ad3 마디, E1A 영역에 24bp 결실 및 E3에 삽입된 hNIS를 함유하는 신규 바이러스를 작제했다. 이 바이러스로부터 전이유전자의 발현을 평가하기 위해, 호르몬 난치성 전립선암 세포주 PC-3MM2, 22Rv1, PC-3 및 DU-145는 Ad5/3-△24-hNIS 또는 Ad5/3-△24-△gp19K(전이유전자 없는 양성 대조군)로 감염시키고 감염 후 24시간 및 48시간 후에 RT-PCR로 분석했다. 모든 Ad5/3-△24-hNIS 감염된 세포주는 454bp 크기의 hNIS 특이적 증폭 산물을 특징적으로 나타냈고, 이는 hNIS가 상기 바이러스 게놈으로부터 발현된다는 것을 시사한다. 이에 반해, Ad5/3-△24-△gp19K 감염된 세포 또는 세포 자체는 증폭 산물을 생산하지 않았다.
Ad5 /3-△24- hNIS 는 전립선암 세포에의 효과적인 요오드화물 흡수를 매개할 수 있다.
상기 바이러스로부터 발현된 hNIS의 기능성을 평가하기 위해, 전립선 암세포는 Ad5/3-△24-hNIS 또는 Ad5/3-△24-△gp19K로 감염시킨 후, 125I에 노출시키고 요오드화물 축적을 정량분석했다(도 11). 비감염 세포 또는 대조용 바이러스 처리된 세포와 비교 시, Ad5/3-△24-hNIS는 모든 조사된 세포주에서 상당히 높은 요오드화물 흡수를 초래했다. 모의(mock) 감염에 비해, Ad5/3-△24-hNIS는 PC-3MM2 및 22Rv1 세포에서 각각 최고 2.5(p<0.001) 및 3(p<0.001)배 높은 요오드화물 축적을 유발했다. PC-3 및 DU-145 세포에서는 모의 처리된 세포에 비해 크게 많지 않지만 여전히 훨씬 증가된 축적이 관찰되었다(각각 최고 1.6(p<0.05) 및 1.3(p<0.001)배 높은 수준). Ad5/3-△240△gp19K 처리는 요오드화물 축적을 초래하지 않았고, 이는 요오드화물 흡수가 바이러스 감염이나 복제 자체에 의하기 보다는 Ad5/3-△24-hNIS로부터 발현된 hNIS에 의해 매개되었다는 것을 시사한다.
Ad5 /3-△24- hNIS 는 전립선 암세포에서 복제하여 이의 종양용해를 유발한다.
전립선 암 세포주는 Ad5/3-△24-hNIS, Ad5/3-△24-△gp19k, Ad5/3-△24 및 Ad5/3luc1로 감염시킨 후, 감염 후 6일(PC3-MM2), 7일(PC-3 및 DU-145) 또는 9일(22Rv1)째 세포 생존도를 측정했다(도 12). Ad5/3-△24-hNIS는 검사된 모든 전립선암 세포주에서 효과적인 세포 사멸을 보여주었다. 가장 빠르고 효과적인 종양용해는 PC-3MM2 세포에서 관찰되었고, 여기서는 1VP/세포의 Ad5/3-△24-hNIS 감염 후 6일째 거의 완전한 세포 사멸이 달성되었다. 또한, 종양용해는 Ad5/3-△24-△gp19K에서 관찰되는 것과 유사했다. 다른 전립선암 세포주에서, Ad5/3-△24-hNIS의 종양용해 효능은 Ad5/3-△24-△gp19K보다 약간 적었다. 사실, E3에 부분 결실이 있는 Ad5/3-△24-△gp19K는 검사된 모든 세포주에서 최고의 종양용해 효능을 나타냈다. Ad5/3-△24-hNIS의 큰 게놈 크기가 Ad5/3-△24-△gp19K에 비해 종양용해 속도에 영향을 미칠 수도 있을 것이다. hNIS 전이유전자는 약 2.2 kbp로, 1kbp △gp19K와 함께 게놈 크기를 105% 이하로 유지하고, 이는 바이러스 기능을 유지하는데 중요한 것으로 시사된 바 있다. Ad5/3-△24-hNIS의 복제능은 PC-3 및 22Rv1 세포에서 평가했고, 여기서 TCID50 분석은 시간의 함수로 감염성 입자의 증가를 나타냈다.
Ad5 /3-△24- hNIS 는 전립선암 종양에의 방사성 요오드화물 흡수를 매개할 수 있다.
피하 PC-3MM2 종양은 누드/NMRI 수컷 마우스에 형성시켰다. 하부 종양은 2일 연속으로 7x108 VP/종양의 Ad5/3-△24-hNIS로 종양내 감염시키고, 상부 우측 종양은 동일 용량의 Ad5/3-△24-△gp19k로 감염시켰다(도 13A 및 B). 상부 좌측 종양은 모의 처리했다. 최종 바이러스 감염 후 1일째, 마우스당 1.85 MBq의 123I를 정맥내 투여했고, 123I 주사 후 0.5 내지 13시간 동안 감마 카메라로 마우스를 영상 촬영했다. Ad5/3-△24-hNIS 처리된 종양 내에 약간의 요오드화물 축적이 123I 주사 후 0.5시간째에 이미 관찰되었다. 요오드화물 노출 후 2시간 후에는 Ad5/3-△24-hNIS 처리된 종양 전반에서 강한 요오드화물 축적이 관찰되었고, 대조용 바이러스 또는 식염수 주사된 종양은 요오드화물을 흡수하지 않았다(도 13A). 2시간 후 요오드화물 축적은 안정 상태에 이르렀고, 요오드화물 주사 후 13시간째인 마지막 영상촬영 실험 시점까지 비교적 일정하게 유지되었다(도 13B). 또한, 요오드화물은 갑상선 및 위에 심하게 축적되었는데, 그 이유는 이 기관들의 내인성 NIS 발현 때문이다. 높은 위 흡수는 마우스에서는 일반적으로 관찰되지만 사람에서는 관찰되지 않는다. 환자의 경우, 정상 갑상선은 방사성요오드화물로부터 보호하는 것이 가능하지만, 이 마우스 연구에서는 가능하지 않았다. 방사성 요오드화물의 제거는 소변을 통해 일어나기 때문에 방광내 요오드화물 축적이 관찰되었다.
생체내 123I 생체분포를 정량분석하기 위해, 영상촬영 후 기관 및 종양을 수집하고, 이들의 방사능 함량을 측정했다(도 13C). 내인성 hNIS 발현으로 인해, 갑상선 및 위는 주사된 용량의 약 30%를 포획했다. 그럼에도 불구하고, Ad5/3-△24-hNIS 처리된 종양은 총 요오드화물 용량의 6% 이상을 축적했다. 이것은 종양에 존재하는 다량의 감염성 바이러스와 상관성이 있고, 반면 갑상선 및 위에서는 미량만이 관찰되었다. 바이러스 주사 후 10일 이상 종양을 수집하고 TCID50이 감염성 바이러스를 측정하기 때문에, 높은 TCID50 값은 아마도 바이러스 복제를 반영할 것이다. 아데노바이러스는 세포로 유입될 때 캡시드를 상실하여, 유입된 바이러스는 TCID50에 의해 검출될 수 없고; 새로운 비리온의 생성이 필요하다. 요오드화물 흡수는 모의군 또는 Ad5/3-△24-△gp19K 처리된 종양을 비롯한 다른 기관에서는 낮게 유지되었다(초기 용량의 <1%).
Ad5 /3-△24- hNIS + 131 I는 생체내 종양 성장을 억제한다.
Ad5/3-△24-hNIS의 효능을 생체내에서 평가하기 위해 전립선 종양 보유 마우스를 131I 또는 Ad5/3-△24-hNIS 단독 또는 이들의 조합으로 처리했다(도 14). 종양을 방사성요오드화물 없이 Ad5/3-△24-hNIS로 처리했을 때, 종양 성장은 모의군 또는 131I 단독 그룹(각각 p<0.05)에서보다 훨씬 느렸다. 마우스가 Ad5/3-△24-hNIS 및 131I로 모두 제공받았을 때, 종양 크기는 다른 어떤 그룹에서보다도 훨씬 작았다(모두 p<0.001). 조정된 쌍별 분석은 Ad5/3-△24-hNIS + 131I 대 바이러스 단독, 131I 단독 또는 모의군 간에 이미 2일 째에 유의적인 차이를 나타냈다(모두 p<0.05). 4일, 6일 및 8일째 Ad5/3-△24-hNIS + 131I 대 바이러스 단독, 131I 단독 또는 모의군 간에 조정된 쌍별 p값은 모두 <0.001이었다. 동물 보호 규제로 인해, 본 실험은 일부 마우스가 양호한 상태에 있을지라도 17일째 중단해야 하는 것으로 정해졌다.
전신 방출된 방사능은 요오드화물 주사 후 1일 후부터 측정했다. 방사능은 신장을 통한 제거로 예상되는 바와 같이 다음 3일 동안 빠르게 감소했다.
종양 크기가 어떤 직경에서든지 15mm에 이르면, 마우스를 사망시키고, 방사능 측정을 위해 기관을 수집했다. 방사능은 시간 경과에 따라 감소했고, 대부분의 방사능은 갑상선 및 위에서 관찰되었고, 순간적으로 심장에서도 혈행에 의한 131I의 전파로 인해 관찰되었다. 다른 기관에서 방사능은 낮게 유지되었다. 중요하게도, 바이러스 주사는 요오드화물 생체분포에 영향을 미치지 않았고, 이에 따라 이 접근법의 안전성 프로필은 갑상선암의 방사성요오드화물 요법의 안전성과 유사하다.
II . GM - CSF 전이유전자
3가지 D24 - GM - CSF 형 바이러스의 클로닝
- hGM-CSF의 PCR,
- SunI/MunI 부위 형성 ⇒ 445bp(pORF-GM-CSF 주형)
- PCR 산물 및 pTHSN의 SunI/MunI 분해
- 점착성 말단 연결 ⇒
- PmeI 선형화된 pShuttle-D24 + pTG3602 ⇒ pAd5-D24
- Ad5-D24-GM-CSF
상동 재조합: SrfI 선형화된 pAd5-D24 + FspI 선형화된
pTHSN-GM-CSF ⇒ pAd5-D24-GM-CSF
PacI 선형화 및 형질감염 ⇒ Ad5-D24-GM-CSF
클로닝의 모든 단계는 PCR 및 다중 제한효소 분해로 확인했다. 셔틀 플라스미드 pTHSN-GMCSF는 서열분석했다. 야생형 E1의 부재는 PCR로 확인했다. E1 영역, 전이유전자 및 섬유는 서열분석과 PCR로 최종 바이러스에서 점검했고, 그 다음 생산을 위해 클린랩으로 가져갔다. 이 목적을 위해, 바이러스 DNA는 적당한 완충액 용액과 밤새(ON) 항온처리하여 추출하고, PCR 후 서열분석하여 섬유 및 GMCSF cDNA의 완전성을 분석했다. 형질감염을 비롯한 바이러스 생산의 모든 단계는 전술한 야생형 재조합의 위험을 피하기 위해 A549 세포에서 수행했다(Kanerva A et al. 2003, Mol Ther 8, 449-58; Baeurschmitz GJ et al., 2006, Mol Ther 14, 164-74). GM-CSF는 E3 프로모터 하에 있고, 결과적으로 감염 후 약 8시간 후에 발현을 개시하는 복제 관련 전이유전자 발현을 초래한다. E3은 6.7K/gp19K의 결실을 제외하고는 무손상 상태이다. Ad5/3-D24-GM-CSF 및 Ad5-RGDD24-GM-CSF는 혈청형 3의 마디 또는 Ad5 섬유 HI-루프 중의 RGD-4C를 특징으로 하는 구제 플라스미드를 사용한다는 점 외에는 동일하게 작제했다.
D24 - GM - CSF 형 바이러스의 시험관내 분석
D24-GM-CSF형 바이러스의 시험관내 효능은 폐암 세포(A549), 유방암 줄기 세포 유래 체외이식편 세포(JIMT-1) 및 유방암 세포(MDA-MB-436)에서 MTS 세포 사멸 분석을 이용하여 연구했다. MTS 분석은 현재 암 유전자요법 간행물에서 세포 생존도를 평가하는 표준 방법이다. Ad5Luc1은 복제 결손성 바이러스이고 음성 대조군으로 작용한다. Ad5wt는 야생형 Ad5 바이러스(균주 Ad300wt)이고 양성 대조군으로 이용했다. Ad5-d24-E3은 E1에 동유전자형 24bp 결실을 보유하지만, E3은 무손상이다. VP는 바이러스 입자를 나타낸다.
정리하면, Ad5-D24-GMCSF는 시험관내에서 양성 대조군과 유사한 종양용해 활성을 나타냈고, 따라서 전이유전자 생산은 바이러스의 종양용해 효능을 약화시키지 않았다(도 15a-c). Ad5/3-D24-GM-CSF 및 Ad5-RGD-D24-GM-CSF에서도 유사한 데이터가 관찰되었다(도 15d).
Ad5D24-GMCSF가 전이유전자를 발현할 수 있는지를 시험하기 위해, A549 세포주를 1000개 VP/세포로 감염시키고, 시간이 경과함에 따라 배지를 수집했다. 배지 중의 GMCSF의 농도(도 16a)는 FACSARRAY로 측정했다. 이 외에, 또한 바이러스-발현된 GMCSF가 생물학적 기능을 보유하는지를 분석했다. 이 목적을 위해, 성장과 생존이 사람 GMCSF에 엄격히 의존적인 TF1 세포주를, Ad5D24-GMCSF로 앞서 감염된 A549 세포주로부터 수집한 배지로 처리했다. TF1 생존도는 MTS 분석으로 경시적으로 평가했다. 이 실험 결과, 바이러스 발현-GMCSF가 상기 세포주의 성장을 자극할 수 있었고, 사람 재조합 GMCSF(Sigma)로 처리된 동일 세포주와 어떠한 차이도 발견되지 않았다(도 16b).
동물에서의 D24 - GM - CSF 형 바이러스의 생체내 분석
Ad5-D24-GM-CSF의 생체내 효능은 사람 아데노바이러스 복제를 절반 허용하는 면역 컴피턴트 시리아 햄스터에서 검사했다(마우스는 비허용성이다)(Ying B. et al. 2009, Cancer Gene Ther doi: 10.1038/cgt.2009.6). 7x106 HapT1 췌장 암세포는 피하 주사했고, Ad5-D24-GM-CSF 또는 Ad5D24E3(GM-CSF를 발현하지 않음)은 1x109 바이러스 입자(VP)씩 0일, 2일 및 4일째 종양내 주사했다. 모의 그룹에게는 동일한 용적의 성장 배지를 제시된 동일한 시점에 주사했다. 도 17b는 Ad5-D24-GMCSF의 종양내 주사가 시리아 햄스터 혈청에서 높은 수준의 hGM-CSF를 산출한다는 것을 보여준다. 사람 GM-CSF는 시리아 햄스터에서 활성적인 것으로 알려져 있다(Cho, Exp Toxicol Pathol 2006 vol. 57(4) pp. 321-8). 흥미롭게도, 모의 그룹을 제외한 모든 동물은 16일까지 무종양성이었다(도 17a). 다시 추가 2주 동안 종양 상처를 분석하여 종양의 재발이 발생했는지 평가했다. 하지만, 32일째 상기 동물들에서 종양의 징후가 여전히 없어서, 실험의 제1 파트를 마치고, 모의(Mock) 그룹의 동물은 안락사시켰다. 나머지 처리된 동물들은 이 시점에서 7x106 HapT1 세포를 피하 주사하여 동일한 종양을 상체의 우측으로 항원공격한 반면, 좌측으로는 동물에게 투약된 적이 없는 다른 종양(1x106 HaK 종양)으로 항원공격했다. 종양 성장은 경시적으로 측정하고 도 17c-d에 보고했다. 흥미롭게도, Ad5D24GMCSF로 사전 처리되었던 동물은 HapT1 종양 항원공격을 완전하게 거부한 반면, Hak 종양은 정상적으로 성장했고, Ad5D24E3으로 사전 처리되었던 동물에서는 HapT1 및 HaK 종양이 독립적으로 성장했다(도 17c-d).
요약하면, 데이터는 Ad5-D24-GM-CSF가 면역 컴피턴트 종양 보유 동물에서 종양억제 활성을 나타내며, 이후 동일한 종양의 항원공격을 거부하는 정도로 종양-특이적 면역성을 유도할 수 있다는 것을 시사한다.
III . CD40L 전이유전자
전술한 바와 유사한 방법을 사용하여 Ad3-hTERT-CD40L-EIA를 작제하고 마우스에서 생체분포를 분석했다(도 20a-b). 5x1010 VP를 정맥내 투여 후 6시간 후에 쥐에서의 생체분포(도 20a)는 혈청형 3 바이러스 대부분이 혈액과 혈액 풍부 기관, 예컨대 비장, 폐 및 간에 여전히 머무르고 있다는 것을 시사했다. 모든 주요 기관을 qPCR로 분석했다(도 20b). 다른 기관으로의 유입은 감소한 것으로 발견되었다. 이 분석에서, 혈전 β-액틴은 혈청 값에 사용되었다. 혈액 구획에 β-액틴의 부족으로 인해, 혈액 값은 도 20a에서와 같이 절대값으로 가장 잘 비교된다. 결과는 Ad3 바이러스가 RBC 또는 혈청과 연관이 없고 혈전 및 혈장에 많이 존재한다는 것을 시사한다. 따라서, WBC 및 혈소판은 마우스에서 가능한 Ad3 바이러스 운반체이다.
<110> Oncos Therapeutics OY <120> Non-Ad5 adenoviral vectors and methods and uses related thereto <130> 2090771PC <150> FI 20090030 <151> 2009-02-02 <150> FI 20095751 <151> 2009-07-02 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 1 catggtaccc aagtgtgtcg ctgtcgagt 29 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 2 catgatatca gcgatcagct gacacctac 29 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 3 catgatatcg tgccagcgag aagagtttt 29 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 4 cattctagag cgagcacaat agttctttca 30 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 5 ggttatgcca gggtggagta 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 6 aaggtgaagg ggcaggac 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 7 agcccctccc cttccttt 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 8 cccggtctca ctggagataa 20 <210> 9 <211> 719 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ad3-hTERT-E1 <400> 9 ggcggatgca agtgaaaatt ctccattttc gcgcgaaaac taaatgagga agtgaatttc 60 tgagtcattt cgcggttatg ccagggtgga gtatttgccg agggccgagt agactttgac 120 cgtttacgtg gaggtttcga ttaccgtgtt tttccctaaa tttccgcgta cggtgtcaaa 180 gttctgtgtt tttacgtagg tgtcagctga tcgctgatcg ctgcgctgtc ggggccaggc 240 cgggctccca gtggattcgc gggcacagac gcccaggacc gcgcttccca cgtggcggag 300 ggactgggga cccgggcacc cgtcctgccc cttcaccttc cagctccgcc tcctccgcgc 360 ggaccccgcc ccgtcccgac ccctcccggg tccccggccc agccccctcc gggccctccc 420 agcccctccc cttcctttcc gcggccccgc cctctcctcg cggcgcgagt ttcaggcagc 480 gctgcgtcct gctgcgcacg tgggaagccc tggccgggca tcgtgccagc gagaagagtt 540 ttctcctccg cgccgcaagt cagttctgcg ctttgaaaat gagacacctg cgcttcctgc 600 cacaggaggt tatctccagt gagaccggga tcgaaatact ggagtttgtg gtaaataccc 660 taatgggaga cgacccggaa ccgccagtgc agcctttcga tccacctacg ctgcacgat 719 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 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tgtatcttca tagaaggctg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180 gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240 ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300 aacaaagagg agacgaagaa agaaaacagc tttgaaatgc aaaaaggtga tcagaatcct 360 caaattgcgg cacatgtcat aagtgaggcc agcagtaaaa caacatctgt gttacagtgg 420 gctgaaaaag gatactacac catgagcaac aacttggtaa ccctggaaaa tgggaaacag 480 ctgaccgtta aaagacaagg actctattat atctatgccc aagtcacctt ctgttccaat 540 cgggaagctt cgagtcaagc tccatttata gccagcctct gcctaaagtc ccccggtaga 600 ttcgagagaa tcttactcag agctgcaaat acccacagtt ccgccaaacc ttgcgggcaa 660 caatccattc acttgggagg agtatttgaa ttgcaaccag gtgcttcggt gtttgtcaat 720 gtgactgatc caagccaagt gagccatggc actggcttca cgtcctttgg 770

Claims (32)

  1. 완전한 혈청형 3 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, E1, E2, E3, E4, 중기 및 후기 영역으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 영역을 포함하는, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 좌측 ITR, E1, pIX, pIVa2, E2, VA1, VA2, 후기 영역, E3 또는 부분 E3, E4 및 우측 ITR 영역을 포함하는, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영역들이 5'에서 3' 방향으로 순차적 순서로 존재하는, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, hTERT 프로모터 하에 Ad3 E1A 영역을 포함하는, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 활성화된 Ad3 E3 프로모터 하에 Ad3 E3 영역을 포함하는, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 전이유전자를 포함하는, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 상기 전이유전자가 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 사람 요오드화나트륨 공동수송자(hNIS), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 종양괴사인자, CD40L, 트라스투주마브 및 다른 모노클로날 항체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 전이유전자가 상기 hTERT 프로모터 하에 E1에 및/또는 상기 복제 활성화된 Ad3 E3 프로모터 하에 E3에 위치하는, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자와 상기 E1A 영역 사이에 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함하는, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hTERT 프로모터, 전이유전자, IRES 및 E1A를 포함하는, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터.
  12. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E3 영역의 결실된 gp19k 위치에 상기 전이유전자를 포함하는, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 발현 카세트만을 포함하는, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 텔로머라제 활성이 있는 세포에서만 복제할 수 있는, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포에 방사성요오드화물을 표적화하는 hNIS를 포함하는, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 아데노바이러스 벡터를 포함하는 세포.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 아데노바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
  19. 제1항 내지 제16항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 원위치(in situ) 암 백신으로서 작용하는, 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터 또는 약제학적 조성물.
  20. 피검체의 암을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 아데노바이러스 벡터의 용도.
  21. 제1항 내지 제16항 및 제18항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 약제학적 조성물을 피검체에게 투여함을 포함하여, 피검체의 암을 치료하는 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 암이 비인두암, 윤활막암, 간세포암, 신장암, 결합조직암, 흑색종, 폐암, 내장암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 뇌암, 인후암, 구강암, 간암, 골암, 췌장암, 융모막암종, 가스트린종, 크롬친화세포종, 프로락틴분비종양, T-세포 백혈병/림프종, 신경종, 폰히펠-린다우병, 졸링거-엘리슨 증후군, 부신암, 항문암, 담관암, 방광암, 요관암, 뇌암, 희소돌기아교세포종, 신경모세포종, 수막종, 척수암, 골암, 골연골종, 연골육종, 유잉 육종, 미지의 원발성 부위의 암, 유암종, 위장관의 유암종, 섬유육종, 유방암, 파제트병, 자궁경부암, 결장직장암, 직장암, 식도암, 담낭암, 두부암, 안구암, 경부암, 신장암, 빌름 종양, 간암, 카포시 육종, 전립선암, 폐암, 고환암, 호지킨병, 비-호지킨병, 구강암, 피부암, 중피종, 다발골수종, 난소암, 내분비 췌장암, 글루카곤종, 췌장암, 부갑상선암, 음경암, 뇌하수체암, 연조직 육종, 망막모세포종, 소장암, 위암, 흉선암, 갑상선암, 영양막암, 포상기태, 자궁암, 자궁내막암, 질암, 음문암, 청신경종, 균상식육종, 인슐린종, 유암종 증후군, 소마토스타틴종, 치은암, 심장암, 입술암, 수막암, 구강암, 신경암, 입천장암, 이하선암, 복막암, 인두암, 흉막암, 침샘암, 혀암 및 편도암으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 용도 또는 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피검체가 사람 또는 동물인, 용도 또는 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 종양내, 근육내, 동맥내, 정맥내, 흉막내, 소포내, 강내 또는 복막 주사 또는 경구 투여를 통해 수행되는, 용도 또는 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양용해성 사람 아데노바이러스 벡터 또는 약제학적 조성물이 치료 기간 동안 수회 투여되는, 용도 또는 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법 또는 용도가 피검체에게 방사선요법 또는 방사성요오드화물을 병행 처치함을 추가로 포함하는, 용도 또는 방법.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법 또는 용도가 피검체에게 화학요법을 병행 처치함을 추가로 포함하는, 용도 또는 방법.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피검체가 다량의 항-Ad5 중화 항체를 보유하는, 용도 또는 방법.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피검체가 Ad5로 처치된 적이 있는, 용도 또는 방법.
  30. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 아데노바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서,
    i) 적어도 부분 Ad3 DNA 및 임의로 하나 또는 다수의 프로모터 및/또는 임의로 하나 또는 다수의 전이유전자를 포함하는 DNA 벡터를 제공하고,
    ii) 상기 Ad3 게놈의 나머지 및 임의로 하나 또는 다수의 프로모터 및/또는 임의로 하나 또는 다수의 전이유전자를 상기 벡터에 삽입함을 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 플라스미드 작제물이 전이유전자(들)를 상기 아데노바이러스 벡터에 위치시키는데 사용되는, 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터가 세포주에서 생산되는, 방법.
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