CN102325887A - 非-Ad5腺病毒载体及与其相关的方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药领域。特别地，本发明涉及癌症疗法。更特别地，本发明涉及溶瘤性人腺病毒载体以及包含所述载体的细胞和药物组合物。本发明还涉及所述载体在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途，以及治疗受试者中的癌症的方法。此外，本发明涉及产生腺病毒载体的方法。
Description
发明领域
本发明涉及医药领域。特别地，本发明涉及癌症疗法。更特别地，本发明涉及溶瘤性人腺病毒载体以及包含所述载体的细胞和药物组合物。本发明还涉及所述载体在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途，以及治疗受试者中的癌症的方法。此外，本发明涉及产生腺病毒载体的方法。
发明背景
可用外科手术、激素疗法、化学疗法和/或放射疗法治疗癌症，但是在许多情况下，通常表征为晚期的癌症不能用目前的疗法治愈。因此，需要新的靶向癌细胞的方法，例如基因疗法。
在过去20年中，基因转移技术得到了密集的检测。癌症基因疗法的目的是将治疗性的基因引入肿瘤细胞中。这些被引入靶细胞中的治疗性基因可以例如，纠正被突变的基因、抑制活跃的致癌基因或对细胞产生其它的性能。适合的外源治疗性基因包括但不限于免疫治疗性基因、抗血管生成性基因、化学保护性基因和“自杀”基因，并且可利用经修饰的病毒载体或非病毒方法(包括电穿孔、基因枪和脂质或聚合物包被)将它们引入细胞。
对最优的病毒载体的要求包括找到特定靶细胞并在靶细胞中表达病毒基因组的有效能力。此外，最优的载体必须在靶组织或细胞中保持是有活性的。在过去的几十年中已经开发了病毒载体的所有这些特性并且在生物医学中广泛地研究了例如逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体。
为了进一步提高肿瘤穿透性和抗肿瘤效果的局部放大，构建了选择性的溶瘤剂，例如条件性复制的腺病毒。溶瘤性腺病毒是用于治疗癌症的有希望的工具。肿瘤细胞是由于溶瘤性腺病毒在肿瘤细胞中的复制而被所述病毒杀死的，复制的最后时期导致数千的病毒粒子被释放到周围的肿瘤组织中用于有效的肿瘤穿透和脉管再次感染。治疗方法利用了正常细胞和肿瘤细胞之间的分子差异。肿瘤细胞允许病毒的复制而正常的细胞由于病毒基因组中经改造的变化而幸免，所述变化防止在非肿瘤细胞中复制。最优的溶瘤性腺病毒将仅在癌细胞中感染和复制并且将是足够有效的以在免疫应答中和病毒之前杀死所有的癌细胞。
制造某些缺失或添加组织特异性启动子可使得病毒更有选择性，而添加转基因可使得方法更有效。的确，除了复制介导的细胞杀伤，还可用不同的治疗性转基因装备溶瘤性腺病毒。这一方法结合了常规基因递送的优点与能够复制的试剂的效力。装备病毒的一个目标是诱导针对允许病毒复制的细胞的免疫反应。单独的病毒复制虽然是免疫原性的，但是通常不足以诱导有效的抗肿瘤免疫性。为了强化对治疗性免疫的诱导，可用激发性蛋白(例如细胞因子)装备病毒，以及通过促进将肿瘤抗原引向树突细胞。将免疫治疗性基因引入肿瘤细胞中和蛋白质的翻译，导致免疫应答的活化和有效地破坏肿瘤细胞。
腺病毒是中等大小(90-100nm)的无包膜二十面体病毒，其在蛋白衣壳中具有约3万6千个碱基对的双链线性DNA。病毒衣壳具有纤毛结构，其参与病毒对靶细胞的附着。首先，纤毛蛋白的节结构域(knob domain)结合靶细胞的受体(例如，CD46或柯萨基病毒腺病毒受体(CAR))；第二，病毒与整联蛋白分子相互作用；和第三，病毒被内吞到靶细胞中。接下来，病毒基因组从胞内体被转运到核中并且还将靶细胞的复制装置用于病毒的目的(Russell W.C.2000，J General Virol 81，2573-2604)。
腺病毒基因组具有早期(E1-E4)、中期(IX和IVa2)和晚期基因(L1-L5)，它们以顺序次序被转录。早期基因的产物影响宿主细胞的防御机制、细胞周期和细胞代谢。中期和晚期基因编码用于生产新的病毒粒子的结构性病毒蛋白(Wu和Nemerow，2004，Trends Microbiol 12：162-168；Russell W.C.2000，J General Virol 81，2573-2604；Volpers C.和Kochanek S.2004，J Gene Med 6 suppl 1，S164-71；Kootstra N.A.和Verma I.M.2003，Annu Rev Pharmacol Toxicol 43，413-439)。
在人中已发现了腺病毒的超过50种不同的血清型。血清型被分为6个亚组A-F并且不同的血清型已知与不同的病况(即呼吸系统疾病、结膜炎和肠胃炎)相关联。然而，所有利用重组腺病毒的癌症试验均以亚组C病毒为特征，其在大多数情况中是Ad5。也认可了血清型嵌合衣壳在否则为血清型5的病毒的情境中的优势。虽然血清型嵌合允许部分地逃避所存在的抗Ad5的中和抗体(Nab)，病毒衣壳的大部分仍然是来自Ad5的这一事实使得所述逃避是不完全的(
M.等人，2008，GeneTher 15：921-929)。
因此，需要完全非-Ad5的溶瘤性病毒，其能够逃避所存在的抗Ad5的Nab。这些病毒特别在预先存在抗Ad5的NAb的情境中是有用的。这种情况可由于下述而产生：天然的感染或用基于Ad5的溶瘤性病毒治疗之后。
目前，在基因治疗的情境中关于血清型3腺病毒的公开发表还很少。野生型Ad3已知在人中主要引起呼吸系统的感染和结膜炎。在2005年报导了其完整的DNA序列而其与血清型5仅有62.75％的同一性。其基因组的组织与其它具有早期和延迟的早期转录单元的人腺病毒相似，包括晚期和主要晚期单元(Sirena D等人，2005，Virology 343：283-298)。数年前，在含氧量正常和含氧量低的条件下研究了野生型Ad3病毒(Shen，B.H.等人，2006，Gene Ther 13：986-990)。最近，同一小组发表了ColoAd1，其为复合的Ad3/Ad11p嵌合病毒(Kuhn I等人2008，PLoS ONE3：e2409)。通过集合大量的血清型、然后在引起血清型间重组的条件下使所述集合体(pools)传代而制造了ColoAd1。所述作者称这一方法为″定向进化″。然后，将这些高度多样性的病毒集合体置于严紧的定向选择之下以产生并鉴别有效的试剂。在他们的实验中，他们发现了在体外，与亲本血清型或临床上最先进的溶瘤性Ad，ONYX-015相比，Ad3/Ad11p嵌合病毒是2-3倍更有效和更有选择性的。这些结果得到了体内和离体研究的进一步支持。然而，基于用来开发ColoAd1的方法，ColoAd1缺少对于肿瘤选择性的合理基础。此外，对其在体内的活性和安全性的了解甚少，因为仅在一种动物模型中对其进行过研究，所述动物模型的特征是小鼠中的结肠癌异种移植。
因此，保证了更有效和准确的基于非-Ad5载体的基因递送以及非-Ad5基因疗法的增加的特异性和足够的肿瘤杀伤能力。治疗性载体的安全性记录必须也是出色的。本发明通过利用溶瘤性人非-Ad5病毒而提供了具有前述特性的癌症治疗工具。
发明简述
本发明的目的是提供用于实现腺病毒的上述特性的新的方法和手段，并从而解决目前癌症疗法的问题。更特别地，本发明提供了用于基因疗法的新方法和手段。
本申请描述了溶瘤性人Ad3载体的构建，及它们在肿瘤细胞系和动物模型及中的用途，并且提供了病毒疗法中对于溶瘤性血清型5腺病毒载体的备选方案。本发明的载体是第一个仅基于血清型3的选择性溶瘤性人腺病毒。本载体也是第一个由肿瘤特异性启动子控制的、基于非-Ad5的溶瘤性腺病毒。
本发明涉及完全血清型3溶瘤性人腺病毒载体。
本发明还涉及包含本发明的腺病毒载体的细胞。
本发明还涉及包含本发明的腺病毒载体的药物组合物。
此外，本发明还涉及本发明的腺病毒载体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中的癌症。
此外，本发明还涉及治疗受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的载体或药物组合物。
另外，本发明还涉及生产本发明的腺病毒载体的方法，其中所述方法包括：
i)提供DNA载体，所述载体包含至少部分Ad3DNA和任选地一个或数个启动子，和/或任选地一个或数个转基因，以及
ii)将Ad3基因组的其余部分、和任选地一个或数个启动子和/或任选地一个或数个转基因插入所述载体。
本发明提供了用于治疗癌症的工具，所述癌症是抗拒目前的方法的。此外，与许多其它的治疗相比，本发明在适于治疗的肿瘤类型方面的限制很少。实际上所有的实体肿瘤均可以用所提出的发明来治疗。治疗可肿瘤内地、腔内地、动脉内地、静脉内地及以这些的组合被给予。
与Ad5病毒相比，基于Ad3的病毒能够更好地进入癌症干细胞类型的细胞。本发明的病毒的效力显示在肿瘤细胞系中并且所述病毒在数个人癌症的鼠类模型中至少与基于Ad5或Ad5/3的对照一样有效。
除了使得载体能够转运到目的位点，本发明的载体也可确保转基因的表达和持续。针对允许未装备的病毒复制的细胞而引起的免疫反应通常不够强而不能引起产生治疗性肿瘤免疫性。为了克服这一弱点，本发明提供了用抗肿瘤免疫性的有效诱导因子(例如GM-CSF)装备的病毒。
在本发明中，在将放射性碘化物靶向靶细胞中，也使用了人钠碘共输送体(hNIS)转基因。此方法允许了肿瘤细胞由于病毒的溶瘤性效应和由于放射诱导的细胞死亡而被杀死。此方法也利用了放射和溶瘤性腺病毒复制之间的协同作用。通过将hNIS作为转基因引入，放射性碘化物疗法可被用于治疗非-甲状腺来源的癌症。hNIS的另一个有用的方面是对转基因表达的非-侵入性成像，这允许了监测病毒的传播和持续。
本发明还解决了与对常规治疗和其它腺病毒疗法的治疗抗性相关的问题。本发明的高度潜在的受试者组是具有高抗-Ad5Nab滴度或之前用Ad5剂治疗过的患者组。
此外，本发明为选择性治疗提供了工具和方法，而在健康组织中没有毒性或损伤。此外，本发明的优势可包括与其它疗法相比不同的和减少的副作用。重要的是，所述方法与许多其它形式的疗法(包括你化学疗法和放射疗法)是协同性的，并因而能够被用于组合方案中。
与现有技术的腺病毒工具相比，本发明提供了用于癌症治疗的更简单、更有效、不昂贵、无毒的和/或更安全的工具。此外，不需要辅助病毒。
本发明的新产品使得能够进一步改善癌症治疗。
附图简述
图1a-e显示了下列的图式：Ad3-hTERT-hNIS-E1A(SEQ ID NO.14)；hNIS(SEQ ID NO.15)，Ad3-hTERT-GMCSF-E1A(SEQ ID NO.16)；GM-CSF(SEQ ID NO.17)，Ad3-hTERT-E1A-E3-hNIS，Ad3-hTERT-E1A-E3-GMCSF，和Ad3-hTERT-CD40L-E1A(SEQ ID NO.20)部分；CD40L(SEQ ID NO 21)。
图2a-k显示了图1a-e中所描述的病毒的克隆。在图2a和2c-g中显示了转基因在E1A中的病毒的克隆，图2b和2h-k中显示了转基因在经缺失的Ad3 E3gp19k位点的病毒的克隆。
图3显示a)Ad3-hTERT-E1A(SEQ ID NO.18)；hTERT(SEQ ID NO.19)的结构。在所述腺病毒3的E1A区域之前插入hTERT启动子(295bp)以代替TATA-盒。箭头表示图3b中所用的PCR引物的位置。b)Ad3-hTERT-E1A的PCR。PCR证实了hTERT启动子在正确的位置以及骨架是血清型3。在左边我们可以看到270bp的条带，而在右边为来自hTERT启动子插入区域两侧的210bp。对这些片段进行了测序且它们给出了预期的序列。作为阴性对照，使用了Ad3wt、Ad5/3-hTERT-Δgp和MilliQ水。在其它PCR实验中排除了野生型腺病毒血清型3和5，以及Ad5/3衣壳经修饰病毒的存在。c)用Ad3-hTERT-E1A进行的进行性感染测试。将细胞铺板于96孔板上，并且用10-5至10-12的Ad3-hTERT-E1A的10倍稀释液感染各列，每一种稀释液一式十份。用显微镜观察平板并且将病毒孔与模拟孔进行比较。由所述观察，以与在TCID50(Adeasy manual，Agilent Technologies，Inc.2008)中相似的方式计算pfu/ml。每4至7天更换培养基(DMEM，5％FBS)。30天后，pfu/ml滴度达到稳定水平，表示Ad3-hTERT-E1A的缓慢体外复制动力学。
图4A-D显示用癌细胞系进行的细胞杀伤测试。使用了PC3-MM2(前列腺癌)(A)，A549(肺癌)(B)，HTC116(结肠癌)(C)和SKOV3.ip1(卵巢癌)(D)细胞。Ad3-hTERT-E1A在所有的细胞系中显示了细胞杀伤(相对于复制缺陷性对照Ad5/3luc1的P＜0.05，以10VP/细胞进行)。与基于Ad3的病毒相比，Ad300wt，Ad5/3-hTERT-Δgp和Ad5/3-Δ24更快地杀死细胞。条形表示SE。
图5A-C显示用非-恶性的和Ad3受体缺陷性细胞进行的细胞杀伤测试。使用了HUVEC(人脐静脉内皮细胞)(A)和FSH173WE(成纤维细胞)(B)来代表非-肿瘤细胞。在低剂量时，Ad3-hTERT-E1A不区别于复制缺陷性Ad5/3-luc1并且与阳性对照Ad3wt，Ad300wt，Ad5/3-Δ24(以0.1，1和10VP/细胞)相比，杀死显著更少的细胞(P＜0.05)。已知LNM-35(肺癌)(C)细胞缺少Ad 3受体(
M.等人2006，Cancer 107：1578-1588)。Ad 3wt和Ad3-hTERT-E1A在这些细胞上没有显示任何细胞毒性。条形表示SE。
图6显示了Ad3-hTERT-E1A在裸小鼠中(A)PC3-MM2(高度转移性激素抗拒性前列腺癌)肿瘤内的体内效力。每周将109VP注射到每个肿瘤中，总共注射三次并且每2-3天测量肿瘤。与用PBS处理的肿瘤相比，用Ad3-hTERT-E1A处理的肿瘤生长得更慢(P＝0.0035)。(B)在具有A549(肺癌)肿瘤的小鼠中观察到了类似的数据，虽然由于大的肿瘤大小必须早早终止PBS组。在第17天，观察到了PBS和Ad3-hTERT-E1A之间在显著性边缘(P＝0.051)的差异。此外，在第30天，发现Ad3-hTERT-E1A比Ad5/3-hTERT-E1A显著(P＝0.01)更好，暗示Ad3-hTERT-E1A在此模型中的作用。(C)在SCID小鼠中腹膜内生长表达荧光素酶的SKOV3-luc卵巢癌细胞。进行了单一的腹膜内109VP病毒注射，并且用活体动物的反复荧光素酶成像评估了作为时间的函数的肿瘤细胞数目。在所有经病毒处理的组和PBS组之间看到了荧光素酶信号的显著差别(P＜0.0001)，而在病毒组之间没有差别。请注意，Ad300wt病毒(野生型Ad5)仅能被包括在C-D中。条形表示SE。(D)在存活分析中，所有经病毒处理的组比PBS组存活得更长(P≤0.01)。此实验中唯一的长期存活者是来自Ad 3-hTERT-E1A组的7只小鼠之一。当实验结束时，在第100天时的成像和尸体解剖中其是健康和无肿瘤的。
图7A-C显示了用CAMA-1(乳腺癌)(A)，PANC-1(胰腺癌)(B)和ACHN(肾癌)(C)细胞进行的细胞杀伤测试。Ad3-hTERT-E1A在所有这些癌症类型中显示了细胞杀伤。在所有的实验中，Ad3-hTERT-E1A比复制缺陷性对照Ad5/3-luc1(以100VP/细胞)显著更有效(P＜0.05)。
图8显示了Ad3-hTERT的体内抗肿瘤效力。在第28天拍摄了生物发光照片。
图9显示了Ad3-hTERT-E1A的电子显微镜照片。
图10显示了Ad3-hTERT-E1的部分序列。经测序的DNA以粗体标记。画下划线的是来自pubmed的hTERT的序列。(在括号中标记了与来自pubmed的Ad3骨架相比，从经测序的Ad3-hTERT-E1中缺失的碱基)。大写字母是hTERT插入。以斜体标记所使用的引物。
图11显示了前列腺癌细胞中Ad5/3-Δ24-hNIS介导的碘化物摄取。用10VP/细胞的Ad5/3-Δ24-hNIS或Ad5/3-Δ24-Δgp19K感染细胞，并使其在感染后24和48小时暴露于125I。用γ分光计分析细胞以测定细胞的放射性碘化物含量。将未感染的细胞用作阴性对照。误差条代表SEM。*p＜0.05；**p＜0.01和***p＜0.001。
图12显示了不含放射性碘化物的前列腺癌细胞中Ad5/3-Δ24-hNIS的复制和溶瘤作用。以各种病毒剂量(0-100VP/细胞)感染细胞，并且在6-9天后通过MTS测试测定细胞存活。复制缺陷性Ad5/3luc1和溶瘤性Ad5/3-Δ24被用作对照。误差条表示SEM。
图13显示了Ad5/3-Δ24-hNIS介导的体内碘化物摄取。带有皮下前列腺肿瘤的小鼠肿瘤内地接受了Ad5/3-Δ24-hNIS(下胁腹肿瘤)，Ad5/3-Δ24-Δgp19K(上右侧肿瘤)或盐水(上左侧肿瘤)，继以静脉内的123I注射(1.85MBq/小鼠)。静脉内123I-注射A)2h和B)13h后，用γ相机对碘化物的摄取进行成像。象素尺寸为1.08mm x 1.08mm。C)123I注射13小时后123I的生物分布。条形表示SEM，n＝3，除了在hNIS肿瘤中n＝6。
图14显示了Ad5/3-Δ24-hNIS在体内的抗肿瘤效力。带有皮下前列腺肿瘤的小鼠(6只小鼠/组，12个肿瘤/组)连续两天肿瘤内地接受了Ad5/3-Δ24-hNIS或生长培养基，随后腹膜内注射50MBq的131I或盐水。每隔一天测量肿瘤大小。与所有其它的组相比，在经组合处理(Ad5/3-Δ24-hNIS+131I)的组中肿瘤生长的速度显著更慢(***p＜0.001)。由于动物饲养的限制，在碘化物注射后17天的预定时间点不得不结束实验。
图15a-d显示了GMCSF的表达不损害病毒复制和细胞杀伤效应。图15a表示MTS测试的结果，显示出新产生的病毒Ad5-D24-GMCSF对源自肺癌的(A549)细胞的杀伤效力。图15b表示MTS测试的结果，显示出Ad5-D24-GMCSF对JIMT-1癌症起始细胞(“癌症干细胞”)的杀伤。图15c表示MTS测试的结果，显示出新产生的病毒Ad5-D24-GMCSF对乳腺癌细胞(MDA-MB-436)的杀伤效力。图15d表示MTS测试的结果，显示出新产生的病毒Ad5-D24-GMCSF、Ad5-RGD-D24-GMCSF和Ad5/3-D24-GMCSF对MDA-MB-436的杀伤效力。
图16a显示了腺病毒相伴的(coupled)人GMCSF的表达。用Ad5D24或Ad5D24-GMCSF感染A549细胞系，随时间收集培养基并且通过FACSARRAY就GMCSF的表达进行分析。图16b显示了腺病毒表达的GMCSF在人淋巴细胞中保持其生物学活性。在存在人重组GMCSF(大肠杆菌生产的，购自Sigma)或存在来自经Ad5-D24-GMCSF感染的细胞的上清液时培养需要人GMCSF而存活的TF1细胞。
图17a显示了Ad5-D24-GMCSF在带有胰腺癌肿瘤的叙利亚仓鼠(允许人腺病毒复制)中的体内效力。Ad5D24和Ad5-D24-GMCSF均在处理后的16天内清除肿瘤。在第0、2和4天施用1x109VP的病毒。
图17b显示了肿瘤内注射Ad5-D24-GMCSF引起了叙利亚仓鼠的血清中高水平的hGMCSF。在第4天对用Ad5D24E3或Ad5-D24-GMCSF处理的动物进行取样并通过FACSARRAY评估血清中人GMCSF的浓度。图17c显示了以Ad5-D24-GMCSF(而非Ad5D24)治疗HapT1肿瘤保护了叙利亚仓鼠免受随后HapT1的再攻击。这表明了Ad5-D24-GMCSF可诱导肿瘤特异性免疫应答。用相同的肿瘤再攻击之前用Ad5D24或Ad5D24-GMCSF治疗过的动物(图17a)，并且随时间测量肿瘤的生长。
图17d显示了通过Ad5-D24-GMCSF诱导肿瘤特异性免疫应答，用Ad5-D24-GMCSF治愈HapT1肿瘤没有保护叙利亚仓鼠免患Hak肿瘤。用不同的肿瘤再攻击之前用Ad5D24或Ad5D24-GMCSF治疗过的具有HapT1肿瘤的动物(图17a)，并且随时间测量肿瘤的生长。
图18a-c显示了小鼠中的毒性。在毒性研究中，发现在有免疫活性的鼠类模型中，Ad3-hTERT-E1A比Ad5和Ad5/3对照病毒的毒性更小。分析了所有主要器官的组织学和基本血液值。静脉内施以8x1010VP后72h，在肝组织学和肝酶方面见到了显著的差别。用血清型3时，仅在某些小鼠中接近非门静脉处见到了轻微的肝发炎。以相同的时间点和剂量，血清型5和5/3的组展现出急性肝毒性和升高的肝酶的特征。其它的器官和血液值没有显示出毒性迹象。附上了血液样品的图表和肝组织学照片(图18c)。下面是完整的组织病理学报告：PBS：5/5正常。无有丝分裂。无发炎。Ad3wt：大部分正常。在5/5样品中发现有丝分裂。在接近薄壁组织中的(非门)静脉处有轻微的发炎5/5。Ad3-hTERT-E1A。大部分正常。无有丝分裂。在3/5的样品中，在接近薄壁组织中的(非门)静脉处见到临界发炎。Ad5wt：5/5：在薄壁组织的各处有许多凋亡的肝细胞，中央静脉(在门管区不能见到相同的情况)中的内皮炎和损伤，没有中心周围肝细胞的破坏，皮脂腺病，坏死，在门管区中没有淋巴细胞，急性肝损伤，薄壁组织各处的损伤。Ad5/3-hTERT-deltagp19k：5/5：几乎正常，一些点坏死(不像Ad5wt中那么多)，一些凋亡的细胞，肝细胞的有丝分裂，薄壁组织中的(小叶)发炎，静脉周围的发炎(如同用Ad 3的情况)。Ad5/3-Δ24：5/5：急性暴发性肝衰竭，50％的组织坏死，靠近门管区的损伤更严重(此处所有的细胞均死亡)，可能的脂肪生成，一些有丝分裂。
图19显示了用Ad3-hTERT-E1A治疗的、患有晚期实体肿瘤(抗拒标准疗法)的2名人患者中的病毒动力学。利用珀可(Percoll)梯度分离血细胞并提取DNA。通过qPCR分析样品。对于患者1，在1小时内，病毒似乎从血小板和外周血单核细胞(PBMC)中被清除了。对于患者2，在从血液中被快速清除之前，许多病毒似乎到达了PBMCs和血浆。对于这两名患者，从红血细胞(RBC)中均没有检测到病毒。结果暗示，用Ad3-hTERT-E1A治疗癌症患者可能是安全的。患者1给出了两份无病毒的尿样，暗示病毒没有被分泌到尿中。
图20a-b显示了小鼠中的生物分布。静脉内施用5x1010VP后6h的鼠类生物分布暗示，许多血清型3病毒仍停留在血液和富含血液的器官中(例如脾、肺和肝)。通过qPCR分析了所有主要的器官(图20b)。发现向其它器官的进入减弱了。在此测试中，对于血清值使用了血凝块β-肌动蛋白。由于在血液区室(compartment)中缺少β-肌动蛋白，最好以绝对值进行血液值的比较，如在图20a中所进行的。结果暗示Ad 3病毒不与RBC或血清相关，但是大量存在于血凝块和血浆中。因此，WBCs和血小板是小鼠中可能的Ad3病毒携带者。
发明详述
腺病毒载体
在本发明中，显示了可构建基于血清型3的溶瘤性人腺病毒载体并且其允许杀死肿瘤细胞。
在Ad3以及其它的腺病毒中，十二面体衣壳由至少三种主要的蛋白质(六邻体、五邻体基质和纤毛)以及次要的蛋白质(例如VI，VIII，IX，IIIa和IVa2)组成(Russell W.C.2000，J General Virol 81，2573-2604；Sirena D等人2005，Virology 343：283-298)。
Sirena等人(2005，Virology 343：283-298)报导了野生型Ad3的完整核苷酸序列(GeneBank登陆号DQ 086466)。Ad3基因组含有早期(E1-4)，中期(IX和IVa2)以及主要晚期单元(MLTU)区域，侧翼是左侧和右侧反向末端重复(分别为LITR和RITR)，其含有DNA复制所需要的序列。
在本发明的一个实施方式中，完全血清型3溶瘤性人腺病毒载体包含选自下列的一个或多个区域：E1、E2、E3、E4、中期和晚期区域。
在本发明的一个实施方式中，溶瘤性人腺病毒载体包含下列区域：左ITR、E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、晚期区域、E3或部分E3、E4和右ITR。
这些区域可以以任何顺序位于载体中，但是在本发明的一个实施方式中，所述区域按照顺次顺序在5’至3’的方向上。开放阅读框(ORFs)可以在相同的DNA链中或不同的DNA链中。
如本申请中所用的，表述“腺病毒血清型3(Ad3)”指人Ad3的基因组或部分基因组，其包含选自下列的一个或数个区域：Ad3来源的E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、晚期区域、E3或部分E3和E4。
如本申请中所使用的，表述“部分”区域指与相应的野生型区域相比，缺少任何部分的区域。″部分E3″指缺少gp19k的E3区域。
如本申请中所使用的，表述″VA1″和″VA2″指与RNA1和RNA2相关的病毒，所述RNA被腺病毒转录但是不被翻译。VA1和VA2在对抗细胞防御机制中起作用。
内源性或外源性元件的插入可增强载体在靶细胞中的效果。在重组腺病毒载体中使用外源性组织或肿瘤特异性启动子是常见的，并且所述启动子也可被用于本发明中。例如，可例如通过启动子而将病毒复制限制在靶细胞中，所述启动子包括但不限于：hTERT、hTERT的变体、CEA、SLP、Cox-2、肝素结合细胞因子、E2F、E2F的变体、CXCR4、SCCA2和TTS。它们通常被添加以控制E1A区域，但此外或备选地，其它的基因(例如E1B或E4)也可被调控。
在本发明的一个实施方式中，溶瘤性人腺病毒载体包含hTERT启动子之下的Ad3E1A区域。Ad3-hTERT-E1A在E1A转录位点的上游含有人端粒酶催化结构域启动子，用于肿瘤特异性复制。
在最近几十年中，关于端粒和端粒酶的研究进展快速。端粒酶活化是人癌发生中的关键步骤，并且大多数人肿瘤有端粒酶活性的特征。这一特征与hTERT启动子的活性紧密关联，所述hTERT启动子被暗示在大多数人肿瘤中有活性并因而代表有用的肿瘤特异性启动子。在本发明的一个实施方式中，溶瘤性人腺病毒载体只能够在具有端粒酶活性的细胞中复制。
在本发明的一个实施方式中，溶瘤性腺病毒载体包含在复制活化的Ad3E3启动子之下的Ad3E3区域。在本发明的一个特定实施方式中，将转基因置于缺失了gp19k的E3区域中，在E3启动子之下。这将转基因的表达限制在允许所述病毒复制和随后活化E3启动子的肿瘤细胞中。所述E3启动子可以是本领域已知的任何外源或内源性的启动子，优选内源性的启动子。
外源性的绝缘子(即抵抗非特异性增强子的阻碍元件)，左ITR，天然的E1A启动子或染色质蛋白也可被包括在重组腺病毒载体中。在本发明的载体中，可任选地使用任何其它的组份或修饰但不是必须的。
E3区域对于病毒的体外复制不是必需的，但是E3蛋白质在调控宿主的免疫应答(即抑制先天的和特异性的免疫应答)方面起重要作用。本发明的载体可在E3中的gp19k区域内具有缺失。已知gp19k基因产物在内质网中结合并且螯合主要组织相容性复合物1(MHC1)分子，并且防止被感染的细胞被细胞毒性T淋巴细胞识别。由于许多肿瘤在MHC1中有缺陷，缺失gp19k增加了病毒的肿瘤选择性(与野生型病毒相比，病毒从正常细胞中被更快地清除了，但是在肿瘤细胞中没有区别)。
在本发明的一个实施方式中，溶瘤性腺病毒载体包含一个或多个转基因。在本发明的一个实施方式中，所述转基因被置于E1中、在hTERT启动子之下，和/或被置于E3中、在复制活化的Ad3 E3启动子之下。在本发明的一个实施方式中，溶瘤性人腺病毒载体包含代替缺失的gp19k而位于E3区域中的转基因。
在本发明的一个实施方式中，溶瘤性腺病毒载体包含转基因和E1A区域之间的内部核糖体进入位点(IRES)。IRES是指在蛋白质合成中，使得能够在信使RNA序列的中间起始翻译的核苷酸序列。在本发明的一个实施方式中，IRES是来自脑心肌炎病毒(EMCV)的，所述IRES获得自Clontech载体pIRES2-DsRed2。在本发明的一个实施方式中，溶瘤性腺病毒载体包含hTERT启动子、转基因、IRES和E1A。
在本发明的一个实施方式中，转基因选自：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、人钠碘共输送体(hNIS)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、肿瘤坏死因子α、CD40L、曲妥珠单抗和其它单克隆抗体。
GM-CSF通过各种机制(包括募集天然杀伤(NK)细胞和刺激抗原呈递细胞(APC))起作用而参与免疫应答。APC然后可募集、活化和靶向针对肿瘤的T细胞。编码GM-CSF的核苷酸序列可以来自任何动物，例如人、猿、大鼠、小鼠、仓鼠、狗或猫，但是优选地，GM-CSF是由人序列编码的。编码GM-CSF的核苷酸序列可以是经修饰的以改善GM-CSF的效果，或者是未经修饰的(即野生型的)。在本发明的优选实施方式中，编码GM-CSF的核酸序列是野生型的。
在本发明的一个实施方式中，溶瘤性人腺病毒载体包含hNIS(SEQID NO.15)，其将放射性碘化物靶向靶细胞。将钠碘共输送体(hNIS)作为转基因表达是用于向肿瘤靶向性系统应用放射性同位素(例如放射性碘化物)的策略。此方法允许肿瘤细胞由于病毒的溶瘤性效应和由于放射诱导的细胞死亡而被杀死，并且此方法还利用了放射与溶瘤性腺病毒复制之间的协同作用。hNIS的另一个有用的方面是对转基因表达的非-侵入性成像，这允许了监测病毒的传播和持续。
hNIS是主要表达在甲状腺滤泡细胞中的整合质膜糖蛋白(Dohan O等人2003，Endocr Rev.24：48-77)。hNIS的生物学功能是介导碘化物的活性转运，碘化物是用于甲状腺激素生物合成的关键组分。hNIS的转运能力被用于甲状腺癌的放射性碘化物治疗已经半个世纪了，其中放射性碘分子(131I)被用于内部放射甲状腺起源的癌细胞。
在本发明中，也可使用干扰素α、干扰素β、干扰素γ、肿瘤坏死因子、CD40L、曲妥珠单抗和/或其它单克隆抗体作为转基因用于诱导患者的免疫系统抵抗肿瘤细胞，例如通过活化天然杀伤细胞、T-cells和/或巨噬细胞。
本发明的载体也可包含除上述E3的部分缺失以及转基因和/或启动子的插入之外的其它修饰。在本发明中可使用改善病毒向肿瘤细胞的递送的任何衣壳修饰(即本领域已知的对六邻体、纤毛和/或五邻体基质蛋白的修饰)。如在本申请中所使用的，“衣壳”指病毒的蛋白质外壳，其包括六邻体、纤毛和五邻体基质蛋白。修饰可以是遗传和/或物理修饰，包括但不限于：整合配体的修饰，所述配体识别特异性的细胞受体和/或阻碍天然受体的结合；用其它腺病毒的节替代腺病毒载体的纤毛或节结构域的修饰(嵌合体)；以及向腺病毒添加特定分子(例如FGF2)的修饰。因此，衣壳修饰包括但不限于将小的肽基序、肽、嵌合体或突变整合到纤毛(例如，到节部、尾部或杆部中)、六邻体和/或五邻体基质中。
表达盒被用于通过利用载体而在靶标(例如细胞)中表达转基因。如在本申请中所用的，术语“表达盒”指包含编码cDNA或基因的核苷酸序列，以及控制和/或调节所述cDNA或基因的表达的核苷酸序列的DNA载体或其部分。相似的或不同的表达盒可被插入一个载体或数个不同的载体中。本发明的Ad3载体可包含一个或数个表达盒。然而，仅一个表达盒就足够了。在本发明一个实施方式中，所述溶瘤性人腺病毒载体包含至少一个表达盒。在本发明的另一个实施方式中，所述溶瘤性人腺病毒载体仅包含一个表达盒。
包含本发明的腺病毒载体的细胞可以是任何细胞，例如真核细胞、细菌细胞、动物细胞、人细胞、小鼠细胞等。例如，所述细胞可被用于在体外或在体内产生所述腺病毒载体，或者所述细胞可以是被所述腺病毒载体感染的靶标(例如肿瘤细胞)。
癌症
任何癌症或肿瘤，包括恶性与良性肿瘤以及原发肿瘤与转移，均可以是基因疗法的靶标。在本发明的特定实施方式中，所述癌症是任何实体肿瘤。在本发明的一个实施方式中，所述癌症选自：鼻咽癌、滑膜癌、肝细胞癌、肾癌、结缔组织癌、黑色素瘤、肺癌、肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、脑癌、喉癌、口腔癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、绒毛膜癌、胃泌素瘤、嗜铬细胞瘤、催乳素瘤、T细胞白血病/淋巴瘤、神经瘤、成血管细胞瘤病(von Hippel-Lindau disease)、卓一艾氏综合征(Zollinger-Ellison syndrome)、肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脑癌、少突神经胶质瘤、成神经细胞瘤、脑膜瘤、脊髓肿瘤、骨癌、骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、未知原发位点的癌、类癌、胃肠道类癌、纤维肉瘤、乳腺癌、佩吉特氏病(Paget′s disease)、宫颈癌、结肠直肠癌、直肠癌、食道癌、胆囊癌、头癌、眼癌、颈癌、肾癌、维尔姆斯瘤(Wilms′tumor)、肝癌、卡波济氏肉瘤(Kaposi′ssarcoma)、前列腺癌、肺癌、睾丸癌、何杰金病(Hodgkin′s disease)、非何杰金淋巴瘤、口腔癌、皮肤癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、内分泌胰腺癌、高血糖素瘤、胰腺癌、副甲状腺癌、阴茎癌、垂体癌、软组织肉瘤、成视网膜细胞瘤、小肠癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、滋养层癌、葡萄胎、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、听神经瘤、蕈样肉芽肿、胰岛瘤、类癌综合征、生长抑制素瘤、牙龈癌、心脏癌、唇癌、脑膜癌、口癌、神经癌、腭癌、腮腺癌、腹膜癌、咽癌、肋膜癌、唾液腺癌、舌癌和扁桃体癌。
药物组合物
本发明的药物组合物包含至少一类本发明的载体。此外，所述组合物可包含至少两种、三种或四种不同的本发明的载体。除了本发明的载体之外，药物组合物还可包含任何其它的载体(例如其它的腺病毒载体)、其它治疗上有效的试剂、任何其它的试剂，例如药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、佐剂、杀菌剂、填料、稳定剂或增稠剂、和/或任何通常在相应产品中被发现的化合物。
所述药物组合物可以是适于施用的任何形式，例如固体、半固体或液体形式。制剂可选自(但不限于)：溶液、乳剂、悬浮液、片剂、丸剂和胶囊。
在本发明的一个实施方式中，所述溶瘤性腺病毒载体或药物组合物作为原位癌症疫苗起作用。如在本申请中所用的，“原位癌症疫苗”指杀死肿瘤细胞并提高抗肿瘤细胞的免疫应答的癌症疫苗。病毒复制对免疫系统而言是强的危险信号(＝TH1型应答所需的)，因此其对于GM-CSF介导的APC的成熟和活化以及NK细胞的募集是强有力的共刺激现象。肿瘤细胞裂解也帮助将肿瘤片段和表位呈递给APC，并且还通过发炎产生共刺激。因此，不依赖于表位(即不受限于HLA的)的应答在各个肿瘤的情境中产生并因此在原位发生。肿瘤特异性免疫应答在靶细胞及周围的细胞(例如在靶组织)中被活化。
载体的有效剂量至少取决于需要治疗的受试者、肿瘤类型、肿瘤的位置和肿瘤的阶段。剂量可变化，例如从约108病毒颗粒(VP)至约1014VP，优选地从约5x109VP至约1013VP并且更优选地从约8x109VP至约1012VP。
所述药物组合物可通过本领域已知的任何常规的方法生产，例如通过利用下列中的任何一种：批次、补料批次和灌注培养模式，柱状色谱纯化，CsCl梯度纯化和用低切力细胞保留设备进行的灌注模式。
施用
本发明的载体或药物组合物可被施用于任何真核受试者，所述真核受试者选自：植物、动物和人类。在本发明的优选实施方式中，所述受试者是人或动物。动物可选自宠物、家畜和生产动物(productionanimal)。
大多数成人曾暴露于被最广泛使用的腺病毒血清型Ad5，因而免疫系统可快速产生抵抗它们的中和抗体(NAb)。事实上，抗Ad5NAb的普遍性可直至50％。已显示，可针对腺病毒衣壳的多个免疫原性蛋白中的大多数而诱导NAb。在本发明的一个实施方式中，受试者具有大量的抗-Ad5中和抗体。在本发明的一个实施方式中，受试者之前经Ad5处理过。
可使用任何常规的方法来将所述载体或组合物施用给受试者。施用途径取决于组合物的制剂或形式、疾病、肿瘤的位置、患者、合并症和其它因素。在本发明的一个实施方式中，所述施用是通过肿瘤内、肌内、动脉内、静脉内、胸膜内、囊内、腔内或腹膜注射进行的，或者是口服施用。
仅施用一次本发明的溶瘤性人腺病毒载体便可具有治疗效果。然而，在本发明的一个实施方式中，在治疗期间中施用溶瘤性腺病毒载体或药物组合物数次。溶瘤性人腺病毒载体或药物组合物可例如，在前2周、4周、每月或在治疗期间中被施用1至10次。在本发明的一个实施方式中，在前2周中、然后在4周、然后每月进行3-7次施用。治疗期间的长度可变化，并且可例如持续2-12个月或更长。
然而，在晚期肿瘤团块的情境中，一轮治疗可能不会清除肿瘤。因此，可能需要再施用病毒以增加效力。限制系统性再施用的关键因素是由病毒引起的中和抗体(NAb)应答。为了避免受试者中的中和抗体，本发明的载体可在治疗之间变化。
本发明的基因疗法单独是有效的，但是腺病毒基因疗法与任何其它疗法(例如传统的疗法)的组合可以比单独的任何一个更有效。例如，组合疗法中的各试剂可单独地在肿瘤组织中起作用，腺病毒载体可使细胞对化学疗法或放射疗法敏感和/或化疗剂可提高病毒复制的水平或影响靶细胞的受体状态。组合疗法的试剂可被同时或顺次施用。
在本发明的一个实施方式中，所述方法或用途还包括向受试者施用并行的放射疗法或放射性碘化物。在本发明的另一个实施方式中，所述方法或用途还包括向受试者施用并行的化学疗法。如在本申请中所用的，“并行的”指在本发明的基因疗法之前、之后或同时施用的疗法。并行疗法的期间可从数分钟到数周变化。优选地，所述并行疗法持续数小时。
适于组合疗法的试剂包括但不限于：全反式维甲酸、阿扎胞苷、咪唑硫嘌呤、博来霉素、卡波铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、道诺霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、埃博霉素、依托泊甙、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、氮芥、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星(Valrubicin)、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。
产生腺病毒载体的方法包括任何本领域已知的常规方法。通常，转基因被插入穿梭质粒中，然后在所述穿梭质粒和含有病毒基因组其余部分的质粒(“拯救质粒”)之间进行同源重组。然后，可从所述质粒中切出新的基因组并用其转染病毒产生细胞。备选地，可将拯救质粒共转染到生产者细胞中用于那些细胞中的重组。
在本发明的一个实施方式中，利用质粒构建体来将转基因置于腺病毒载体中。
在本发明的一个实施方式中，在细胞系中生产腺病毒载体。通常，用所述腺病毒载体转染真核细胞，此后选择、扩增和测试病毒产生细胞。本发明的病毒载体在施用于动物或人类之前，也需要全面纯化。
通过下列实施例阐释了本发明，所述实施例并不意在以任何方式是限制性的。
实施例
细胞培养
293细胞购自Microbix(多伦多，加拿大)。293-2v6-11细胞含有ponasteron可诱导的E4orf6区域(Mohammadi E.S.等人2004，NucleicAcids Res 32：2652-2659)。将911-1c11细胞保持在1mg/ml的G418(Sirena，D.等人2005，Virology 343：283-298)中。SKOV3.ip1卵巢腺癌细胞系获得自Pr ice博士(M.D.Anderson Cancer Center，Houston，TX)。表达萤火虫荧光素的卵巢腺癌细胞系SKOV3-luc是由Negrin博士(Stanford Medical School，Stanford，CA)好意提供的。前列腺癌的高度转移性、激素抗拒性亚系PC-3MM2是Isaiah J.Findler(MD Anderson Cancer Center，Houston，TX)的友好的礼物。人肺大细胞癌的高度成淋巴转移性亚系LNM35/EGFP，是由Takashi Takahashi(The Honda Research Institute，日本)提供的。已知为HUVEC的人脐静脉内皮细胞购自Lonza(Basel，Switzerland)。下列细胞系获得自ATCC(Manassas，VA)：ACHN肾细胞癌、A549肺腺癌、FHS173WE人成纤维细胞细胞系、HTC116结肠直肠癌、CAMA-1乳腺癌、PANC-1胰腺上皮样癌。所有的细胞系都在推荐的条件下培养。
Ad3-hTERT-E1的构建
为了克隆Ad3-hTERT-E1，在Ad3-wt质粒pKSB2Ad3wt(Sirena，D.等人2005，Virology 343：283-298)上进行了三次不同的PCR，其中两次是为了从Ad3wt序列中排除原始的TATA-盒(图1-3)。第一PCR产物包含具有MluI消化位点的LITR直至TATA-盒(正向引物：5’-CAT GGTACC CAA GTG TGT CGC TGT CGA GT-3’(SEQ ID NO：1)，反向引物5’-CAT GAT ATC AGC GAT CAG CTG ACA CCT AC-3’(SEQ ID NO：2)；在前面添加了KpnI位点并在末端添加了EcoRV位点)，第二PCR产物紧接着TATA-盒开始，直至E1A区域的前半部分(正向引物：5’-CAT GAT ATCGTG CCA GCG AGA AGA GTT TT-3’(SEQ ID NO：3)，反向引物5’-CATTCT AGA GCG AGC ACA ATA GTT CTT TCA-3’(SEQ ID NO：4)；在前面添加EcoRV位点并在末端添加Xba I)。第三PCR扩增了腺病毒类型3末端包括RITR的1600bp。将在TATA-盒周围分别消化的前两个PCR产物克隆到经KpnI/XbaI消化的pUC19克隆载体中而产生pGBAd3E1，包括排除了TATA-盒的Ad3序列的起始。用KpnI/XhoI消化源自pBT255的hTERT启动子，将其补平，并通过对pGBAd3E1进行EcoRV消化而克隆到E1区的前面，产生pGBAd-3hTERT-E1。
现在，将含有Ad3序列的末端的第三PCR产物克隆到NotI/补平的pShuttle中，继而用HindIII消化，并随后克隆到经HindIII消化的pGBAd3-hTERT-E1中，产生pSGBAd3-hTERT-E1作为穿梭载体，所述穿梭载体具有腺病毒3基因组的末端和经修饰的起始。最后，用XhoI/MscI消化pSGBAd3-hTERT-E1，产生这样的质粒：其在腺病毒3序列的经修饰的起始和被保留的末端之间被打开，并与经MluI消化因而无骨架的pKSB2Ad3wt同源重组，以减少由于同一抗性基因引起的背景和以得到含有Ad3-hTERT-E1序列的质粒(pKGB-Ad3-hTERT-E1)。
通过用经MluI消化的pKGB-Ad3-hTERT-E1转染911-1c11细胞而拯救重组Ad3-hTERT-E1A病毒。随后在293-2v6-11细胞中进行对第一大Ad3-hTERT-E1A病毒原种(stock)的扩增，继以在A549细胞中的第二次扩增。扩增后，在双氯化铯梯度上纯化病毒。通过PCR确认了原种不具有血清型5污染(关于标准方法，见Kanerva，A.等人2003，Mol Ther 8：449-458)。然后，确认了hTERT启动子存在于E1A之前(图3b)。用于获得270bp条带的引物是5’-GGT TAT GCC AGG GTG GAG TA-3’正向(SEQID NO：5)和5’-AAG GTG AAG GGG CAG GAC-3’反向(SEQ ID NO：6)。对于210bp的条带，所使用的引物是5’-AGC CCC TCC CCT TCC TTT-3’正向(SEQ ID NO：7)和5’-CCC GGT CTC ACT GGA GAT AA-3’反向(SEQID NO：8)。然后对PCR条带进行了测序并获得了预期的序列(见SEQ IDNO：9和图10)。
最后通过电子显微镜观察了Ad3-hTERT-E1A(见图9)。
其它的腺病毒
请见表1中关于与本发明相关的腺病毒。
表1.腺病毒
进行性感染测试
必须对用于基于Ad5的病毒而建立的方法进行优化以适应Ad3野生型和Ad3-hTERT-E1A的更慢的复制。为了估算功能性的滴度，通常的10-天细胞病变效果测试是不充分的，因此我们开发了更加动态的进行性感染测试(图3c)，其中允许细胞病变效果发展直至滴度达到平稳状态。这代表了病毒的实际功能性滴度。
将细胞铺板在96孔板上，10000细胞/孔，并且第二天用10-5至10-12的Ad3-hTERT-E1A以递减的10倍稀释液感染各列，每一种稀释液一式十份。在DMEM，2％FBS中进行感染。用显微镜观察平板并且将病毒孔与模拟孔进行比较。由所述观察，以与在TCID50(Adeasy manual，AgilentTechnologies，Inc.2008)中相似的方式计算pfu/ml。每4至7天更换培养基(DMEM，5％FBS)。
在体外，病毒在达到最大滴度方面更慢而功能性感染测试需要35天。
体外细胞毒性测试
以10000细胞/孔将细胞铺板在96孔板上。第二天，一式三份或一式四份用病毒以0.1至100VP/孔感染细胞。在2％胎牛血清(FBS)中进行感染。经常观察平板并且每3-5天更换生长培养基。六至二十天后(根据对于各个系为最佳时)，用MTS测试(Cell Titer 96AQueous OneSolution Cell Proliferation Assay，Promega)分析细胞存活。在下列的天进行MTS分析：PC-3MM2在第8天，A549在第17天，HTC116在第6天，SKOV3.ip1在第18天，HUVEC在第11天，FSH174WE在第13天，LNM-35/EGFP在第10天，CAMA-1在第11天，PANC-1在第20天和ACHN在第11天。结果显示在图4A-D中。
虽然两种完全Ad3病毒在细胞毒性测试中最终都杀死了所有癌细胞，它们似乎比基于Ad5的溶瘤性试剂(包括5/3血清型嵌合体)更慢。在非癌细胞中，Ad3-hTERT-E1A比对照病毒(包括野生型Ad3)毒性更小。Ad3-hTERT-E1A不能杀死缺少Ad3受体的细胞。
Ad3-hTERT-E1A对于癌细胞系的体外溶瘤性效能
通过感染代表七种不同肿瘤类型的单层分析了Ad3-hTERT-E1A在体外杀死癌细胞的能力(图4A-D和图7A-C)。在所有恶性细胞系中，Ad3-hTERT-E1A显示了完全的溶瘤作用，而非复制性的Ad5/3luc1病毒没显示细胞杀伤(p＜0.05)。然而，如基于生长和滴定病毒的经验所预期的，Ad3-hTERT-E1A比血清型5病毒更慢一些。
Ad3-hTERT-E1A的肿瘤选择性
为了分析肿瘤选择性，我们用相同的病毒感染了HUVEC(人脐静脉内皮细胞)和FSH173WE(成纤维细胞)并进行了细胞杀伤测试(图5)。在低病毒浓度时没有见到细胞杀伤，而在更高的剂量时Ad3-hTERT-E1A比对照病毒Ad3wt、Ad5wt、Ad5/3-hTERT-E1A、Ad5/3-Δ24(0.1，1和10VP/细胞)有更小的毒性(P＜0.05)。由之前用Ad5/3嵌合体进行的工作，我们知道LNM-35/EGFP不能被Ad5/3感染，因此其可能缺少Ad3受体(
M.等人2006，Cancer 107：1578-1588)。相符地，用Ad3-hTERT-E1A或Ad3野生型时没有见到细胞杀伤。
动物实验
所有的动物实验均经过了赫尔辛基大学实验动物委员会和南芬兰地方政府的批准。经常就健康状况监控小鼠，并且一旦注意到疼痛或痛苦的迹象就使其安乐死。雌性NMRI裸小鼠(Charles River，德国)被用于皮下模型。它们在3-4周龄时被订购然后被检疫2周。雌性fox chaseSCID小鼠(Charles River，Germany)被用于腹膜内模型。它们在6-7周龄时被订购然后被检疫4个月。
体内的溶瘤性效能
我们测试了Ad3-hTERT-E1A在带有PC-3MM2前列腺癌异种移植物的小鼠中的效力(图6A)。与PBS注射相比，Ad3-hTERT-E1A能够显著地降低肿瘤生长(P＝0.0035)。有趣地，虽然在体外所述病毒比阳性对照更慢，在体内效力方面没有区别。在体内，Ad3-hTERT-E1A与基于Ad5和Ad5/3的对照至少具有一样的溶瘤性。在具有A549异种移植物的小鼠中(图6B)，Ad3-hTERT-E1A组从第17天起具有最小的肿瘤，但是由于PBS组中快速的肿瘤生长以及那一组在第17天终止了，此实验失去了很多统计学的力量。在第17天，比较Ad3-hTERT-E1A和PBS，可见到临界区别(P＝0.051)。在第30天，Ad3-hTERT-E1A比Ad5/3-hTERT-E1A显著(P＝0.01)更好地降低了肿瘤生长，Ad5/3-hTERT-E1A已知是高度有效的溶瘤性腺病毒(Bauerschmitz，G.J.等人2008，Cancer Res 68：5533-5539)。
皮下肿瘤可能不是人类癌症的最佳替代者，因此，我们利用了以腹膜内弥散性癌转移为特征的原位模型，所述腹膜内播散性癌转移是用表达荧光素酶的SKOV3Luc细胞诱导的(图6C，D)。与经PBS处理的小鼠相比，Ad3-hTERT-E1A显著降低了荧光素酶信号(p＜0.0001)。不同的有复制活性的病毒之间在效力方面没有区别。Ad3-hTERT-E1A将小鼠的存活中值从34天延长到了46天(PBS相对于Ad3-hTERT-E1A)，这在Kaplan-Meier存活分析中产生了显著的区别(p＝0.01)。在经Ad 3-hTERT-E1A处理的7只小鼠中，有一只存活到了实验结束(第120天)并且可能被治愈了，因为在荧光素酶成像或尸体解剖中没能检测到肿瘤的证据并且其行为正常。
皮下动物实验
在小鼠的两侧胁腹皮下注射2x106PC-3MM2或5x106A549细胞。分别在13和11天后，肿瘤发展到了能测量的大小，并且用PBS中的109VP或仅用PBS肿瘤内处理小鼠。注射体积是50μl/肿瘤。1周和2周后重复注射。经常地测量肿瘤并计算体积V＝LxH2x0.52。将第一次处理前所测量的体积认为是100％并将肿瘤生长与之进行比较。对于A549组，一些经PBS处理的肿瘤侵略性地生长，而必须在2.5周后使小鼠安乐死。
腹膜内动物实验
通过向SCID小鼠中腹膜内注射300μl纯DMEM中的5x106SKOV3-luc细胞而产生了腹膜弥散的卵巢癌的原位模型。三天后，非侵入性地对小鼠(n＝7)进行成像，并通过注射PBS或PBS中的109VP/小鼠而腹膜内处理小鼠。使用IVIS 100(Xenogen，Alameda，CA，USA)在第3，7，14，21，28，35和42天对小鼠进行成像以评估小鼠中肿瘤细胞的数目(图8)。对于生物发光成像，腹膜内注射了150mmg/kg的D-荧光素(Promega，Madison，WI，USA)并且10分钟后以10s的曝光时间、1f/停，中等像素混合(binning)和打开的滤镜进行捕获。在成像过程中，小鼠处于异氟烷气体麻醉中。用活体图像2.50(Xenogen)与所述成像相叠加。通过在小鼠的腹膜区域周围画出目的区域(ROI)而测量出总的通量(光子/s)。减去了背景。
小鼠中的毒性。
在毒性研究中(图18a-c)，发现在有免疫活性的鼠模型中，Ad3-hTERT-E1A比Ad5和Ad5/3对照病毒的毒性更小。分析了所有主要器官的组织学和基本血液值。静脉内施以8x1010VP后72h，在肝组织学和肝酶方面见到了显著的差别。用血清型3时，仅在某些小鼠中接近非门静脉处见到了轻微的肝发炎。以相同的时间点和剂量，血清型5以及5/3的组展现出急性肝毒性和升高的肝酶的特征。其它的器官和血液值没有显示出毒性迹象。附上了血液样品的图表和肝组织学照片(图18c)。下面是完整的组织病理学报告：PBS：5/5正常。无有丝分裂。无发炎。Ad3wt：大部分正常。在5/5样品中发现有丝分裂。在接近薄壁组织中的(非门)静脉处有轻微的发炎5/5。Ad3-hTERT-E1A。大部分正常。无有丝分裂。在3/5的样品中，在接近薄壁组织中的(非门)静脉处见到临界度炎。Ad5wt：5/5：在薄壁组织的各处有许多凋亡的肝细胞，中央静脉(在门管区不能见到相同的情况)中的内皮炎和损伤，没有中心周围肝细胞的破坏，皮脂腺病，坏死，在门管区中没有淋巴细胞，急性肝损伤，薄壁组织各处的损伤。Ad5/3-hTERT-deltagp19k：5/5：几乎正常，一些点坏死(不像Ad5wt中那么多)，一些凋亡的细胞，肝细胞的有丝分裂，薄壁组织中的(小叶)发炎，静脉周围的发炎(如同用Ad3的情况)。Ad5/3-Δ24：5/5：急性暴发性肝衰竭，50％的组织坏死，靠近门管区的损伤更严重(此处所有的细胞均死亡)，可能的脂肪生成，一些有丝分裂。
人患者中的病毒动力学。
目前为止用Ad3-hTERT-E1A治疗了8名患有抗拒标准疗法的晚期实体肿瘤的患者。以5x1010直至5x1011病毒颗粒的剂量安全性良好，并且剂量递增继续。总体而言，所有的患者都经历了1-2级的不良事件，通常是发烧、恶心和疲倦。目前为止没有见到3级或更高级别的不良事件。正在进行包括效力和免疫学数据的完整分析。
如图19所示，从前两名患者中取得血液样品。利用珀可梯度分离血细胞并提取DNA。通过qPCR分析样品。对于患者1，在1小时内，病毒似乎从血小板和外周血单核细胞(PBMC)中被清除了。对于患者2，在从血液中被快速清除之前，许多病毒似乎到达了PBMCs和血浆。对于这两名患者，从红血细胞(RBC)中均没有检测到病毒。结果暗示，用Ad3-hTERT-E1A治疗癌症患者可能是安全的。患者1给出了两份无病毒的尿样，暗示病毒没有被分泌到尿中。
统计学分析
使用了非参数Man-Whitney测试(用于Windows的SPSS 15.0)来就所有的体外数据和一些体内数据比较两个独立的样品。使用利用PROCMIXED(SAS Ver.9.1)进行的重复测量模型来分析肿瘤大小。以自然度量的和经log转换的肿瘤大小测量值来运行模型。通过F测试评估治疗组的效果、时间(天)以及治疗组与时间的交互作用。通过时间的二次项测试了模型中的曲率。先验计划的对预测的治疗手段中特异性差别的比较随时间平均，并在最后的时间点由t-统计计算。对于A549实验，我们在第17天和第30天比较了所述组，而对于PC-3MM2在第30天进行了比较，并且进行了时间-平均。使用以log秩次(rank)回归(用于Windows的SPSS 15.0)进行的Kaplan-Meier存活绘图来评估存活。对于所有的分析，＜0.05的两侧P值被认为是统计学上显著的。
包含hNIS和/或GMCSF和/或CD40L的病毒构建体
通过利用本领域已知的方法、或者上面的实施例或下文的实施例中所描述的方法而将hNIS和/或GMCSF转基因加入本发明的基于人Ad3的载体中，其中可使用本发明的非-Ad5腺病毒载体(例如Ad3-hTERT-E1A)来代替Ad5/3-Δ24骨架(也参见图1和2)：
I.hNIS转基因
材料和方法
细胞培养
不依赖于雄性激素(Andorgen)的前列腺癌细胞系22Rv1、PC-3、DU-145和肺腺癌细胞系A549购自ATCC(Manassas，VA)。PC-3MM2细胞是PC-3的转移性、激素抗拒性亚系(Isaiah J.Fidler，MD AndersonCancer Center，Houston，TX的礼赠)。人胚肾上皮293细胞购自Microbix(Toronto，Canada)。细胞系911获得自Alex J.van der Eb博士(University of Leiden，荷兰)。所有的细胞系均是在推荐的条件下培养的。
病毒构建体
为了制造Ad5/3-Δ24-hNIS，将经EcoRI消化并补平的hNIS片段(来自pcDNA3-hNIS，Steve Russell，Mayo Clinic，Rochester，MN的礼赠)插入经BsiWI-MfeI消化并补平的pTHSN(Kanerva A.等人Gene Ther12：87-94)以获得pTHSN-hNIS。为了制备对照病毒Ad5/3-Δ24-Δgp19K，使经Bs iWI-MfeI消化并补平的pTHSN自我连接而产生pTHSN-Δgp19K。为了获得pAd5/3-Δ24-hNIS和pAd5/3-Δ24Δgp19K，将经PmeI线性化的pShuttle-Δ24(Suzuki，K.等人2002，Clin Cancer Res 8：3348-59)和pAd5/3-E1-hNIS或pAd5/3-E1-Δgp19K电穿孔到BJ5183细胞中。
将腺病毒质粒线性化并按照生产商的说明书用Superfect(Qiagen，Valencia，CA)将其转染到911细胞中。挑选腺病毒集落，在A549细胞中增殖腺病毒并使用标准技术对其进行纯化。之前构建了Ad5/3-Δ24和Ad5/3luc1病毒(Kanerva，A.等人2003，Mo1Ther 8：449-58；Kanerva，A，等人2002，Clin Cancer Res 8：275-80)。用分光光度计测定了病毒颗粒(VP)并用TCID50测试测定了噬斑形成单位(pfu)。滴度是：Ad5/3-Δ24-hNIS，1.1x1012VP/ml、9.0×1010pfu/ml；Ad5/3-Δ24-Δgp19K，1.5x1012VP/ml、2.8x1011pfu/ml；Ad5/3-Δ24，1.7x 1012VP/ml以及Ad5/3luc1，6.9x1011VP/ml。
RT-PCR
用Ad5/3-Δ24-hNI S和Ad5/3-Δ24-Δgp19K(10VP/cell)在37℃转染前列腺癌细胞2小时。转染后24和48小时收获细胞。使用RNeasy试剂盒(Qiagen)分离总RNA并在RT-PCR之前用DNA酶处理。将350ng的总RNA用于每一个反应。使用OneStep RTPCR试剂盒(Qiagen)，利用hNIS特异性引物(正向5′-CTT CTG AAC TCG GTC CTC AC-3′(SEQ ID NO：10)；反向5′-TCC AGA ATG TAT AGC GGC TC-3′(SEQ ID NO：11)和β-肌动蛋白特异性引物(正向5′-CGA GGC CCA GAG CAA GAC A-3′(SEQ IDNO：12)；反向5′-CAC AGC TTC TCC TTA ATG TCA CG-3′(SEQ ID NO：13)进行扩增(35个循环，在+54℃退火)。hNI S和β-肌动蛋白的PCR产物的大小分别是453bp和482bp。
碘化物摄取
用Ad5/3-Δ24-hNIS和Ad5/3-Δ24-Δgp19K(10VP/细胞)在37℃感染前列腺癌细胞2小时。感染后24和48小时用1x PBS清洗细胞并用7.4kBq的钠碘[125I]NaI(MAP Medical Technologies Oy，Tikkakoski，芬兰)在室温孵育20分钟。用1x PBS清洗细胞两次，随后对于每一个样品用300μl的细胞培养物裂解试剂(Promega，Madison，WI)进行裂解。用与多通道分析仪Atomlab 950(Biodex Medical System，Shirley，NY)相连的孔计数器对放射性进行定量。
细胞杀伤测试
以0.01、0.1、1、10和100VP/细胞，用Ad5/3-Δ24-hNIS、Ad5/3-Δ24-Δgp19K、Ad5/3-Δ24和Ad5/3luc1转染前列腺癌细胞。每隔一天更换生长培养基。在感染后(p.i.)6天(对于PC-3MM2细胞)、感染后7天(对于DU-145和PC-3细胞)以及感染后9天(对于22Rv1细胞)测定细胞存活，所述测定使用CellTiter 96AQueous One Solution细胞增殖测试(也称为3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑[MTS]测试；Promega，Madison，WI)。
组织培养感染性剂量(TCID50)测试
细胞系样品：一式三份将5x 104前列腺癌细胞/孔铺板在24孔板上、在1ml 5％GM中，孵育过夜并用Ad5/3-Δ24-hNIS(5vp/细胞)在37℃感染2小时。在感染后第8、24、48和72h收集细胞和生长培养基，冷冻于-80℃并冻融三次。对于TCID50，离心沉淀细胞并将上清液加至293细胞。
组织样品：收集经Ad5/3-Δ24-hNIS和131I处理的小鼠的器官并对其进行称重、手工均质化并稀释到800μl的DMEM中。在-80℃对其冻融三次。对于TCID50，离心沉淀组织样品并将上清液加至293细胞。
对于两个实验，将1044293细胞铺板在96孔板内100μl的5％DMEM中，孵育过夜，并用上述实验的上清液转染。10天后，估测CPE的发展以评估滴度。
体内研究
雄性NMRI/裸小鼠购自Taconic(Ejby，丹麦)。在美托嘧啶(medetomid ineket amine)-0.9％盐水(1∶2∶7)麻醉下，通过皮下注射5x106的PC-3MM2细胞而在8周大的小鼠中建立肿瘤。在成像实验中，在肿瘤细胞接种后的11和12天，3只小鼠肿瘤内地接受了盐水(上部左侧肿瘤)、7x108VP Ad5/3-Δ24-Δgp19K(上部右侧肿瘤)和7x108VPAd5/3-Δ24-hNIS(下部右侧和左侧的肿瘤)。最后一次病毒注射之后一天，小鼠静脉内地接受了1.85MBq的钠碘[123I]NaI(MAP MedicalTechnologies Oy，Tikkakoski，芬兰)，随后用γ相机Toshiba7200A/UI(Toshiba，Tokyo，日本)在碘化物暴露后0.5h、1h、1.5h、2h、4h和13h进行成像。动物管理条例不允许在更晚的时间点进行分析。使用20％的窗口记录了γ能量峰值159keV，并且收集了150千计数/图像。所使用的矩阵大小是256x 256x 16，这使得象素尺寸为1.08mmx 1.08mm。在第13h，收集各种器官(心、肺、肝、脾、肾、甲状腺、胃、肌肉、血液和骨头)和肿瘤，对其进行称重并用与多通道分析仪Atomlab950(Biodex Medical System，Shirley，NY)相连的孔计数器进行分析。结果表示为起初的碘化物剂量/g组织的百分比(ID％/g)。
对于治疗试验，将携带肿瘤的小鼠随机分为4组(6只小鼠/组，2个肿瘤/小鼠)：模拟，131I，Ad5/3-Δ24-hNIS和Ad5/3-Δ24-hNIS+131I。肿瘤细胞接种后第6和第7天，小鼠肿瘤内地接受了生长培养基和7x108VP的Ad5/3-Δ24-hNI S/肿瘤。最后一次注射之后的一天，小鼠腹膜内地接受了50MBq的无媒介(carrier-free)钠碘([131I]NaI，MAPMedical Technologies Oy，Tikkakoski，芬兰)。每隔一天测量肿瘤大小并且用公式(长度x宽度2x 0.5)来计算体积。当由于肿瘤大小而杀死小鼠时，收集了器官、进行了称重，并且用γ计数器(Wizard 3，PerkinElmer，Turku，芬兰)对它们的放射性测定了180秒。结果表示为起初的碘化物剂量/g组织的百分比(ID％/g)。在第9、10、11、13、14、15和17天测量了整个身体发出的放射性。在第9-11天，在剂量校准仪(CRC-120，Capintec，Inc.，Ramsey，NJ)上进行了测量，并且在第11天以后在整个身体测量设备上进行测量，所述设备由下列组成：铅测量室和带有钠碘闪烁晶体的Uni Spec管座多通道分析仪(CanberraIndustries，Inc.，Meridien，CT)。在第14天对小鼠进行了称重，并且在整个实验中使用了同一重量来进行计算。
在所有的实验中，如动物管理条例所要求的，当肿瘤大小在任何直径上达到15mm时杀死小鼠。由于动物饲养的限制，在第17天时必须停止体内的治疗实验。所有的动物实验都是由芬兰国家动物实验委员会(南芬兰国家地方办公室，
芬兰)批准的。
统计学分析
对于碘化物摄取的分析是通过单向方差分析法(ANOVA)、用Bonferroni的事后考验(post-hoc test)进行的。使用利用PROC MIXED(SAS Ver.9.1，Cary，NC)的重复测量模型进行了实验组之间随时间的肿瘤体积分析。肿瘤体积测量经log转换用于正态性(normality)。先验计划的对预测的治疗手段中特异性差别的比较随时间平均并在每一个时间点由t-统计计算，而且使用了Tukey-Kramer模型来修正。对于所有的分析，＜0.05的两侧p值被认为是统计学上显著的。
结果
在经Ad5/3-Δ24-hNIS感染的前列腺癌细胞中检测到了hNIS特异性mRNA
构建了新的病毒，其含有：在Ad5纤毛杆中的Ad3节，E1A区域内的24bp缺失和插入E3中的hNIS。为了评估转基因从病毒上的表达，用Ad5/3-Δ24-hNIS或Ad5/3-Δ24-Δgp19K(没有转基因的阳性对照)转然了激素抗拒性前列腺癌细胞系PC-3MM2、22Rv1、PC-3和DU-145，并在感染后24和48h用RT-PCR进行了分析。所有经Ad5/3-Δ24-hNIS感染的细胞系均具有下列特征：454bp大小的hNIS特异性扩增产物，暗示hNIS从病毒基因组表达。相反地，经Ad5/3-Δ24-Δgp19K感染的细胞或细胞本身不产生扩增产物。
Ad5/3-Δ24-hNIS可介导到前列腺癌细胞中的有效碘化物摄取
为了评估由病毒表达的hNIS的功能，用Ad5/3-Δ24-hNIS或Ad5/3-Δ24-Δgp19K感染前列腺癌细胞，随后暴露于125I并定量碘化物的累积(图11)。当与未经感染的或用对照病毒处理的细胞相比时，Ad5/3-Δ24-hNIS在所有检测的细胞系中产生了显著更高的碘化物摄取。与模拟感染相比，Ad5/3-Δ24-hNIS在PC-3MM2和22Rv1细胞中，分别引起了直至2.5(p＜0.001)和3(p＜0.001)倍高的碘化物累积。在PC-3和DU-145细胞中，当与经模拟处理的细胞比较时，见到了较为适度(modest)、但仍然显著提高的累积(分别为直至1.6(p＜0.05)倍高和1.3(p＜0.001)倍高的水平)。Ad5/3-Δ24-Δgp19K处理没有产生碘化物积累，暗示碘化物摄取是由从Ad5/3-Δ24-hNIS表达的hNIS介导的，而不是由于病毒感染或复制本身。
Ad5/3-Δ24-hNIS在前列腺癌细胞中复制并引起前列腺癌细胞的溶瘤作用
用Ad5/3-Δ24-hNIS、Ad5/3-Δ24-Δgp19K、Ad5/3-Δ24和Ad5/3luc1感染前列腺癌细胞系，随后在感染后6(PC3-MM2)、7(PC-3和DU-145)或9(22Rv1)天测定细胞存活(图12)。Ad5/3-Δ24-hNIS在所有检测的前列腺癌细胞系中显示出有效的细胞杀伤。在PC-3MM2细胞中见到了最快速有效的溶瘤作用，其中使用1VP/细胞的Ad5/3-Δ24-hNIS在感染后6天实现了几乎完全的细胞杀伤。此外，溶瘤作用与用Ad5/3-Δ24-Δgp19K时所见到的相似。在其它的前列腺癌细胞系中，Ad5/3-Δ24-hNIS的溶瘤性效能略逊于Ad5/3-Δ24-Δgp19K。事实上，含有E3中的部分缺失的Ad5/3-Δ24-Δgp19K，在所有检测的细胞系中显示出最高的溶瘤性效能。有可能与Ad5/3-Δ24-Δgp19K相比，Ad5/3-Δ24-hNIS的更较大的基因组大小可影响溶瘤作用的速度。hNIS转基因为约2.2kbp，其与1kbp的Δgp19K一起使得基因组的大小保持在105％之下，这被暗示对于保留病毒的功能是重要的。在PC-3和22Rv1细胞中评估了Ad5/3-Δ24-hNI S的复制性，其中TCID50测试显示出为时间的函数的感染性颗粒的增加。
Ad5/3-Δ24-hNIS可介导到前列腺癌肿瘤中的放射性碘化物摄取
在裸/NMRI雄性小鼠中建立了皮下PC-3MM2肿瘤。连续两天用7x108VP/肿瘤的Ad5/3-Δ24-hNIS肿瘤内感染下部的肿瘤并用相同剂量的Ad5/3-Δ24-Δgp19k感染上部右侧的肿瘤(图13A和B)。用模拟处理上部左侧的肿瘤。最后一次病毒注射后的一天，静脉内施用1.85MBq的123I/小鼠并且在123I注射后0.5至13h用γ相机对小鼠进行成像。在123I注射后0.5h已经见到一些碘化物累积到了经Ad5/3-Δ24-hNIS处理的肿瘤中。碘化物暴露后两小时，在经Ad5/3-Δ24-hNIS处理的肿瘤的各处见到了强的碘化物累积，而用对照病毒或盐水注射的肿瘤没有摄取碘化物(图13A)。2h后，碘化物累积达到了平稳状态并且直至注射碘化物后13小时此实验的最后成像时间点保持相对恒定(图13B)。此外，碘化物大量累积到甲状腺和胃中，这是由于这些器官的内源性NIS表达。通常在小鼠中而不在人中见到高的胃摄取。在患者中，将有可能保护正常的甲状腺抵抗放射性碘化物，但是在此小鼠研究中没有这样做。由于放射性碘化物的清除通过尿发生，在膀胱中见到了碘化物累积。
为了定量123I的体内生物分布，在成像后收集了器官和肿瘤并且测定了它们的放射性含量(图13C)。由于内源性的hNI S表达，甲状腺和胃捕获了大约30％的注射剂量。然而，经Ad5/3-Δ24-hNIS处理的肿瘤累积了超过6％的总碘化物剂量。这与肿瘤中存在大量感染性病毒而在甲状腺和胃中仅见到了痕量的所述病毒相关联。因为肿瘤是在病毒注射后超过10天被收集的且TCID50测量感染性的病毒，高的TCID50值可能反应了病毒复制。当腺病毒进入细胞时，它们失去其衣壳，因此输入病毒不能用TCID50检测到；它要求新病毒粒子的产生。碘化物摄取在其它的器官中保持是低的，所述器官包括经模拟或Ad5/3-Δ24-Δgp19K处理的肿瘤(＜1％的起始剂量)。
Ad5/3-Δ24-hNIS随同131I在体内抑制肿瘤生长
为了评估Ad5/3-Δ24-hNIS的体内效力，用单独的131I或Ad5/3-Δ24-hNIS或它们的组合处理携带前列腺肿瘤的小鼠(图14)。当不用放射性碘化物而用Ad5/3-Δ24-hNIS处理肿瘤时，肿瘤生长比单独用模拟或131I处理的组显著更慢(对于两者均是p＜0.05)。当小鼠接受Ad5/3-Δ24-hNIS和131I两者时，肿瘤大小比任何其它组中的显著更小(所有的p＜0.001)。经修正的配对分析在第二天就已经显示出Ad5/3-Δ24-hNIS+131I相对于单独的病毒，单独的131I或模拟之间的显著差别(所有的均为p＜0.05)。在第4、6和8天，Ad5/3-Δ24-hNIS+131I相对于单独的病毒、单独的131I或模拟之间的经修正的p-值也均＜0.001。由于动物饲养的限制，预先确定了实验将在第17天结束，虽然一些小鼠情况仍然良好。
从碘化物注射之后一天开始测量整个身体发出的放射性。在接下来的3天中放射性迅速下降，正如对于通过肾清除所预期的。
当肿瘤大小在任何直径上达到15mm时，杀死小鼠并收集器官用于放射性测量。放射性随时间下降，并且大多数放射性见于甲状腺和胃中，而简短地在心中(这可能是由于131I通过循环的传播)。在其它的器官中，放射性保持是低的。重要地，病毒注射没有影响碘化物的生物分布并且因此所述方法的安全性谱类似于用于甲状腺癌的放射性碘化物疗法的安全性谱。
II.GM-CSF转基因
克隆三种D24-GM-CSF型病毒
-PCR出hGM-CSF，
-产生SunI/MunI位点＝＞445bp(pORF-GM-CSF作为模板)
-SunI/MunI消化PCR产物和pTHSN
-粘末端连接＝＞
-PmeI线性化的pShuttl -D24+pTG 3602＝＞pAd5-D24
-Ad5-D24-GM-CSF
同源重组：SrfI线性化的pAd5-D24+FspI线性化的pTHSN-GM-CSF＝＞pAd5-D24-GM-CSF
PacI线性化&转染＝＞Ad5-D24-GM-CSF
克隆的所有阶段均以PCR和多重限制性消化进行了确认。对穿梭质粒pTHSN-GMCSF进行了测序。用PCR确认了不存在野生型的E1。用测序和PCR检查了最终病毒中的E1区、转基因和纤毛，然后将所述最终病毒带到洁净的实验室用于生产。为此，通过以适当的缓冲溶液过夜(ON)孵育来提取病毒DNA，并且在进行了PCR和测序后分析所述纤毛和GMCSFcDNA的完整性。病毒生产的所有阶段(包括转染)是在A549细胞上进行的以避免如之前所描述的野生型重组的危险(Kanerva A等人2003，Mol Ther 8，449-58；Baeurschmitz G.J.等人2006，Mol Ther 14，164-74)。GM-CSF是在E 3启动子之下，这引起与复制相关的转基因表达，所述表达在感染后大约8h开始。E3是完整的，除了6.7K/gp19K的缺失以外。Ad5/3-D24-GM-CSF和Ad5-RGDD24-GM-CSF被相同地构建，除了使用了以来自血清型3的节或Ad5纤毛HI-环中的RGD-4C为特征的拯救质粒之外。
D24-GM-CSF型病毒的体外分析
在肺癌细胞(A549)、源自乳腺癌干细胞的外植体细胞(JIMT-1)和乳腺癌细胞(MDA-MB-436)中，利用MTS细胞杀伤测试研究了D24-GM-CSF型病毒的体外效力。MTS检测是目前癌症基因疗法出版物中用于评估细胞存活的标准方法。Ad5Luc1是复制缺陷性病毒并作为阴性对照。Ad5wt是野生型的Ad5病毒(株系Ad300wt)并被用作阳性对照。Ad5-d24-E3在E1中含有等基因的(isogenic)24bp缺失但是在E3中是完整的。VP表示病毒颗粒。
总之，在体外，Ad5-D24-GMCSF与阳性对照具有相似的溶瘤活性，并且因此转基因的产生并没有危害病毒的溶瘤性效能(图15a-c)。对于Ad5/3-D24-GM-CSF和Ad5-RGD-D24-GM-CSF显示了相似的数据(图15d)。
为了测试Ad5D24-GMCSF是否能够表达转基因，以1000VP/细胞感染A549细胞系并随时间收集培养基。通过FACSARRAY测量培养基中GMCSF的浓度(图16a)。此外，我们还分析了病毒表达的GMCSF是否保留其生物学功能。为此，用从之前感染了Ad5D24-GMCSF的A549细胞系收集的培养基处理TF1细胞系，所述TF1细胞系的生长和存活严格地依赖人GMCSF。通过MTS测试随时间评估TF1的存活。此实验的结果是病毒所表达的GMCSF能够刺激所述细胞系的生长，并且没有发现与以人重组GMCSF(Sigma)处理的相同细胞系有区别(图16b)。
在动物中体内分析D24-GM-CSF型病毒
在有免疫活性的叙利亚仓鼠中测试了Ad5-D24-GM-CSF的体内效力，所述仓鼠对于人腺病毒的复制是半容许的(小鼠是不容许的)(Ying B.等人2009，Cancer Gene Ther doi：10.1038/cgt.2009.6.)。皮下注射7x106HapT1胰腺癌细胞并且在第0、2和4天肿瘤内注射1x109个Ad5-D24-GM-CSF或Ad5D24E3(其不表达GM-CSF)的病毒颗粒(VP)。在相同的所示时间点用相同体积的生长培养基注射模拟组。图17b显示肿瘤内注射Ad5-D24-GMCSF引起叙利亚仓鼠血清中高水平的hGM-CSF。已知人GM-CSF在叙利亚仓鼠中是有活性的(Cho，Exp Toxicol Pathol 2006vol.57(4)pp.321-8)。有趣地，到第16天，除了模拟组，所有的动物都是没有肿瘤的(图17a)。仍然对肿瘤疤痕分析了额外的两周，以评估是否可能发生肿瘤的再出现。然而，在第32天，在这些动物中仍然没有肿瘤的迹象，因而终止了实验的第一部分并且对模拟组的动物实施了安乐死。此时对于余下的经处理的动物：在上部身体的右侧通过皮下注射7x106HapT1细胞而用相同的肿瘤进行攻击；而在左侧用不同的肿瘤(1x106的HaK肿瘤)进行攻击，对于所述HaK肿瘤，所述动物是首次用于实验的
随着时间测量肿瘤的生长并报告在图17c-d中。有趣地，之前用Ad5D24GMCSF处理过的动物完全排斥HapT1肿瘤攻击而Hak肿瘤正常地生长；而在之前用Ad5D24E3处理过的动物中，HapT1和HaK肿瘤独立地生长(图17c-d)。
总之，数据显示了Ad5-D24-GM-CSF在有免疫活性的携带肿瘤的动物中具有抗肿瘤活性，并且其能够引起肿瘤特异性的免疫性，以至排斥相同肿瘤的随后攻击的程度。
III.CD40L转基因
使用与上文所述的相类似的方法构建了Ad3-hTERT-CD40L-EIA并就在小鼠中的生物分布对其进行了分析(图20a-b)。静脉内注射5x1010VP后6h的鼠类生物分布(图20a)暗示大部分血清型3病毒仍然停留在血液和富含血液的器官(例如脾、肺和肝)中。通过qPCR分析了所有主要的器官(图20b)。发现向其它器官的进入减弱了。在此测试中，对于血清值使用了血凝块β-肌动蛋白。由于在血液区室中缺少β-肌动蛋白，最好以绝对值进行血液值的比较，如在图20a中所进行的。结果暗示Ad3病毒不与RBC或血清相关，但是大量存在于血凝块和血浆中。因此，WBCs和血小板是小鼠中可能的Ad3病毒携带者。
Claims (32)
1.完全血清型3溶瘤性人腺病毒载体。
2.根据权利要求1的溶瘤性人腺病毒载体，其包含一个或多个选自下列的区域：E1、E2、E3、E4、中期和晚期区域。
3.根据权利要求1或2的溶瘤性人腺病毒载体，其包含下列区域：左ITR、E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、晚期区域、E3或部分E3、E4和右ITR。
4.根据权利要求1-3中任一项的溶瘤性人腺病毒载体，其中所述区域以顺次顺序在5’至3’方向上。
5.根据权利要求1-4中任一项的溶瘤性人腺病毒载体，其包含在hTERT启动子之下的Ad3E1A区域。
6.根据权利要求1-5中任一项的溶瘤性人腺病毒载体，其包含在复制活化的Ad3E3启动子之下的Ad3E3区域。
7.根据权利要求1-6中任一项的溶瘤性人腺病毒载体，其包含一个或多个转基因。
8.根据权利要求7的溶瘤性人腺病毒载体，其中所述转基因选自：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、人钠碘共输送体(hNIS)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、肿瘤坏死因子、CD40L、曲妥珠单抗和其它单克隆抗体。
9.根据权利要求7或8的溶瘤性人腺病毒载体，其中所述转基因被置于E1中在hTERT启动子之下和/或被置于E3中在复制活化的Ad3E3启动子之下。
10.根据权利要求1-9中任一项的溶瘤性人腺病毒载体，其包含所述转基因和E1A区域之间的内部核糖体进入位点(IRES)。
11.根据权利要求1-10中任一项的溶瘤性人腺病毒载体，其包含hTERT启动子、转基因、IRES和E1A。
12.根据权利要求7-9中任一项的溶瘤性人腺病毒载体，其包含代替缺失的gp19k而位于E3区域中的转基因。
13.根据前述权利要求中的任一项的溶瘤性人腺病毒载体，其包含至少一个表达盒。
14.根据前述权利要求中的任一项的溶瘤性人腺病毒载体，其仅包含一个表达盒。
15.根据前述权利要求中的任一项的溶瘤性人腺病毒载体，其中所述载体仅在具有端粒酶活性的细胞中能够复制。
16.根据前述权利要求中的任一项的溶瘤性人腺病毒载体，其包含hNIS，所述hNIS将放射性碘化物靶向靶细胞。
17.包含根据权利要求1-16中任一项的腺病毒载体的细胞。
18.药物组合物，其包含根据权利要求1-16中任一项的腺病毒载体。
19.根据前述权利要求中任一项的溶瘤性人腺病毒载体或药物组合物，其作为原位癌症疫苗起作用。
20.根据权利要求1-16中任一项的腺病毒载体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中的癌症。
21.治疗受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括向受试者施用根据权利要求1-16或18中任一项的载体或药物组合物。
22.根据权利要求20或21的用途或方法，其中所述癌症选自：鼻咽癌、滑膜癌、肝细胞癌、肾癌、结缔组织癌、黑色素瘤、肺癌、肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、脑癌、喉癌、口腔癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、绒毛膜癌、胃泌素瘤、嗜铬细胞瘤、催乳素瘤、T细胞白血病/淋巴瘤、神经瘤、成血管细胞瘤病、卓-艾氏综合征、肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脑癌、少突神经胶质瘤、成神经细胞瘤、脑膜瘤、脊髓肿瘤、骨癌、骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、未知原发位点的癌、类癌、胃肠道类癌、纤维肉瘤、乳腺癌、佩吉特氏病、宫颈癌、结肠直肠癌、直肠癌、食道癌、胆囊癌、头癌、眼癌、颈癌、肾癌、维尔姆斯瘤、肝癌、卡波济氏肉瘤、前列腺癌、肺癌、睾丸癌、何杰金病、非何杰金淋巴瘤、口腔癌、皮肤癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、内分泌胰腺癌、高血糖素瘤、胰腺癌、副甲状腺癌、阴茎癌、垂体癌、软组织肉瘤、成视网膜细胞瘤、小肠癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、滋养层癌、葡萄胎、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、听神经瘤、蕈样肉芽肿、胰岛瘤、类癌综合征、生长抑制素瘤、牙龈癌、心脏癌、唇癌、脑膜癌、口癌、神经癌、腭癌、腮腺癌、腹膜癌、咽癌、肋膜癌、唾液腺癌、舌癌和扁桃体癌。
23.根据权利要求20-22中任一项的用途或方法，其中所述受试者是人或动物。
24.根据权利要求20-23中任一项的用途或方法，其中所述施用是通过肿瘤内、肌内、动脉内、静脉内、胸膜内、囊内、腔内或腹膜注射，或通过口服施用而进行的。
25.根据权利要求20-24中任一项的用途或方法，其中所述溶瘤性人腺病毒载体或药物组合物在治疗期间被施用数次。
26.根据权利要求20-25中任一项的用途或方法，其中所述方法或用途还包括向受试者施用并行的放射疗法或放射性碘化物。
27.根据权利要求20-26中任一项的用途或方法，其中所述方法或用途还包括向受试者施用并行的化学疗法。
28.根据权利要求20-27中任一项的用途或方法，其中所述受试者具有大量的抗-Ad5中和抗体。
29.根据权利要求20-28中任一项的用途或方法，其中所述受试者之前经Ad5处理过。
30.用于生产根据权利要求1-16中任一项的腺病毒载体的方法，所述方法包括：
i)提供DNA载体，所述载体包含至少部分的Ad3DNA和任选地一个或数个启动子和/或任选地一个或数个转基因，和
ii)将Ad3基因组的其余部分以及任选地一个或数个启动子和/或任选地一个或数个转基因插入所述载体。
31.根据权利要求30的方法，其中使用质粒构建体来将转基因置于腺病毒载体中。
32.根据权利要求30或31的方法，其中所述腺病毒载体是在细胞系中产生的。
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