CN102264760B

CN102264760B - 溶瘤性腺病毒载体及与其相关的方法和用途

Info

Publication number: CN102264760B
Application number: CN200980151762.9A
Authority: CN
Inventors: A·海明基; A·卡内尔瓦; V·切鲁洛; S·佩索宁
Original assignee: ONCOS THERAPEUTICS Oy
Current assignee: Tagewakesi Co., Ltd.
Priority date: 2008-12-22
Filing date: 2009-12-21
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2029-12-21
Also published as: JP2016019530A; ES2612889T3; EP2379586A1; RU2011130511A; HUE031689T2; CA2748180A1; WO2010072900A1; PT2379586T; AU2009332883A1; CA2748180C; BRPI0924123B1; LT2379586T; BRPI0924123B8; CN102264760A; JP6280084B2; SI2379586T1; PL2379586T3; RU2520823C2; AU2009332883B2; ZA201104224B

Abstract

本发明涉及生命科学和医药领域。特别地，本发明涉及癌症疗法。更特别地，本发明涉及溶瘤性腺病毒载体以及包含所述载体的细胞和药物组合物。本发明还涉及所述载体在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途，以及治疗受试者中的癌症的方法。此外，本发明涉及在细胞中产生GM‑CSF和在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答的方法，以及涉及本发明的溶瘤性腺病毒载体用于在细胞中产生GM‑CSF和在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答的用途。

Description

溶瘤性腺病毒载体及与其相关的方法和用途

发明领域

本发明涉及生命科学和医药领域。特别地，本发明涉及癌症疗法。更特别地，本发明涉及溶瘤性腺病毒载体以及包含所述载体的细胞和药物组合物。本发明还涉及所述载体在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途，以及治疗受试者中的癌症的方法。此外，本发明涉及在细胞中产生GM-CSF和在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答的方法，以及涉及本发明的溶瘤性腺病毒载体用于在细胞中产生GM-CSF和在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答的用途。

背景技术

可用外科手术、激素疗法、化学疗法和/或放射疗法治疗癌症，但是在许多情况下，通常表征为晚期的癌症不能用目前的疗法治愈。因此，需要新的靶向癌细胞的方法，例如基因疗法。

在过去20年中，基因转移技术得到了密集的检测。癌症基因疗法的目的是将治疗性的基因引入肿瘤细胞中。这些被引入靶细胞中的治疗性基因可以例如，纠正被突变的基因、抑制活跃的致癌基因或对细胞产生其它的性能。适合的外源治疗性基因包括但不限于免疫治疗性基因、抗血管生成性基因、化学保护性基因和“自杀”基因，并且可利用经修饰的病毒载体或非病毒方法(包括电穿孔、基因枪和脂质或聚合物包被)将它们引入细胞。

对最优的病毒载体的要求包括找到特定靶细胞并在靶细胞中表达病毒基因组的有效能力。此外，最优的载体必须在靶组织或细胞中保持是有活性的。在过去的几十年中已经开发了病毒载体的所有这些特性并且在生物医学中广泛地研究了例如逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体。

为了进一步提高肿瘤穿透性和抗肿瘤效果的局部放大，构建了选择性的溶瘤剂，例如条件性复制的腺病毒。溶瘤性腺病毒是用于治疗癌症的有希望的工具。肿瘤细胞是由于溶瘤性腺病毒在肿瘤细胞中的复制而被所述病毒杀死的，复制的最后时期导致数千的病毒粒子被释放到周围的肿瘤组织中用于有效的肿瘤穿透和脉管再次感染。肿瘤细胞允许病毒的复制而正常的细胞由于病毒基因组中经改造的变化而幸免，所述变化防止在非肿瘤细胞中复制。

除了复制介导的细胞杀伤，还可用不同的治疗性转基因装备溶瘤性腺病毒。这一方法结合了常规基因递送的优点与能够复制的试剂的效力。装备病毒的一个目标是诱导针对允许病毒复制的细胞的免疫反应。单独的病毒复制虽然是免疫原性的，但是通常不足以诱导有效的抗肿瘤免疫性。为了强化对治疗性免疫性的诱导，可用激发性蛋白(例如细胞因子)装备病毒，用于促进将肿瘤抗原引入抗原呈递细胞(例如树突细胞)，以及用于它们的激发和/或成熟。将免疫治疗性基因引入肿瘤细胞中以及蛋白质的翻译，导致免疫应答的活化和有效地破坏肿瘤细胞。在这方面最相关的免疫细胞是天然杀伤细胞(NK)和细胞毒性CD8+T细胞。

腺病毒是中等大小(90-100nm)的无包膜二十面体病毒，其在蛋白衣壳中具有约3万6千个碱基对的双链线性DNA。病毒衣壳具有纤毛结构，其参与病毒对靶细胞的附着。首先，纤毛蛋白的节结构域(knob domain)结合靶细胞的受体(例如，CD46或柯萨基病毒腺病毒受体(CAR))；第二，病毒与整联蛋白分子相互作用；和第三，病毒被内吞到靶细胞中。接下来，病毒基因组从胞内体被转运到核中并且还将靶细胞的复制装置用于病毒的目的RussellW.C.2000，J General Virol81，2573-2604)。

腺病毒基因组具有早期(E1-E4)、中期(I X和IVa2)和晚期基因(L1-L5)，它们以顺序次序被转录。早期基因的产物影响宿主细胞的防御机制、细胞周期和细胞代谢。中期和晚期基因编码用于生产新的病毒粒子的结构性病毒蛋白(Wu和Nemerow，2004，TrendsMicrobiol 12：162-168；Rus sell W.C.2000，J General Virol 81，2573-2604；VolpersC.和Kochanek S.2004，J Gene Med 6suppl 1，S164-71；Kootstra N.A.和VermaI.M.2003，Annu Rev Pharmacol Toxicol43，413-439)。

在人中已发现了腺病毒的超过50种不同的血清型。血清型被分为6个亚组A-F并且不同的血清型已知与不同的病况(即呼吸系统疾病、结膜炎和肠胃炎)相关。已知腺病毒血清型5(Ad5)引起呼吸系统疾病并且其是基因疗法领域中所研究的最常见的血清型。在最初的Ad5载体中，缺失了E1和/或E 3区而使得能够将外源DNA插入载体中(Danthinne和Imperiale 2000)。此外，缺失其它区域以及另外的突变为病毒载体提供了另外的特性。的确，已经建议了对腺病毒的各种修饰用于实现有效的抗肿瘤效果。

例如，专利EP1377671B1(CeLL Genesys，Inc.)和专利申请US2003/0104625A1(Cheng C.等人)描述了编码免疫治疗性蛋白粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的溶瘤性腺病毒载体。此外，公开EP1767642A1(Chengdu Kanghong Biotechnologies Co.，Ltd.)指出溶瘤性腺病毒载体在人免疫应答方面具有改善的效果。

此外，保证了基因疗法的更有效和准确的基因递送以及增加的特异性和足够的肿瘤杀伤能力。治疗性载体的安全性记录必须也是出色的。本发明通过以新的和有创造性的方式利用腺病毒的溶瘤和免疫治疗特性，提供了具有前述特性的癌症治疗工具。

发明简述

本发明的目的是提供用于实现腺病毒的上述特性的新的方法和手段，并从而解决常规癌症疗法的问题。更特别地，本发明提供了用于基因疗法的新方法和手段。

本申请描述了重组病毒载体的构建，与所述载体相关的方法和它们在肿瘤细胞系、动物模型及癌症患者中的用途。

本发明涉及包含腺病毒血清型5(Ad5)核酸骨架、在腺病毒E1的Rb结合恒定区2中的24bp的缺失(D24)、和替代腺病毒E 3区中缺失的gp19k/6.7K的编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的核酸序列的溶瘤性腺病毒载体。

本发明还涉及包含本发明的腺病毒载体的细胞。

本发明还涉及包含本发明的腺病毒载体的药物组合物。

本发明还涉及本发明的腺病毒载体在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途。

本发明还涉及治疗受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的载体或药物组合物。

此外，本发明还涉及在细胞中生产GM-CSF的方法，其中所述方法包括：

a)将包含本发明的溶瘤性腺病毒载体的媒介运送至细胞，和

b)在所述细胞中表达所述载体的GM-CSF。

此外，本发明还涉及增加受试者中肿瘤特异性免疫应答的方法，其中所述方法包括：

a)将包含本发明的溶瘤性腺病毒载体的媒介运送至靶细胞或组织，

b)在所述细胞中表达所述载体的GM-CSF，和

c)在所述靶细胞或组织中增加细胞毒性T细胞和/或天然杀伤细胞的量。

此外，本发明还涉及本发明的溶瘤性腺病毒载体用于在细胞中生产GM-CSF的用途。

另外，本发明涉及本发明的溶瘤性腺病毒载体用于在细胞中生产GM-CSF。

此外，本发明还涉及本发明的溶瘤性腺病毒载体用于增加受试者中的肿瘤特异性免疫应答的用途。

此外，本发明涉及本发明的溶瘤性腺病毒载体用于增加受试者中的肿瘤特异性免疫应答。

本发明提供了用于治疗癌症的工具，所述癌症是目前的方法难以治疗的。此外，与许多其它的治疗相比，在适于治疗的肿瘤类型方面的限制很少。实际上所有的实体肿瘤均可以用所提出的发明来治疗。团块较大的肿瘤和较复杂的肿瘤可通过本发明被治愈。治疗可肿瘤内地、腔内地、静脉内地及以这些的组合被给予。尽管是局部注射，所述方法可产生全身性的效力。所述方法也可以清除被提出是发起肿瘤的细胞(“癌症干细胞”)。

除了使得载体能够转运到目的位点，本发明的载体也确保了转基因的表达和持续。此外，针对所述载体和转基因的免疫应答被最小化了。

本发明解决了与对常规治疗的治疗抗性相关的问题。此外，本发明为选择性治疗提供了工具和方法，而在健康组织中没有毒性或损伤。本发明的优势还包括与其它疗法相比不同的和减少的副作用。重要的是，所述方法与许多其它形式的疗法(包括你化学疗法和放射疗法)是协同性的，并因而能够被用于组合方案中。

诱导针对允许未装备的病毒复制的细胞的免疫反应通常强度不足以引起发展治疗性肿瘤免疫性。为了克服这一弱点，本发明提供了具有抗肿瘤免疫性的强效诱导因子的经装备的病毒。本发明实现了癌症的治疗，其中肿瘤细胞通过病毒粒子引起的溶瘤作用被破坏。此外，影响了各种不同的活化人免疫应答的机制，包括活化天然杀伤细胞(NK)和树突细胞(DC)。

与现有技术的腺病毒工具相比，本发明提供了用于癌症治疗的更简单、更有效、不昂贵、无毒的和/或更安全的工具。此外，不需要辅助病毒。

本发明的新产品使得能够进一步改善癌症治疗。

附图说明

图1显示了pAd5-D24-GMCSF的图示。所述病毒在E1A的恒定区2中具有24个碱基对的缺失。E3中的gp19k和6.7K被人GM-CSF的cDNA替代了。ADP指腺病毒死亡蛋白。

图2显示了克隆的第一步的图示，以产生带有GM-CSF的穿梭质粒(pTHSN)。

图3显示了克隆的第二步的图示，以产生含有所有腺病毒基因并带有E1区中的24个碱基对缺失(其介导癌细胞中的选择性复制)的质粒。

图4显示了克隆的第三步的图示，以产生除了被GM-CSF替代的gp19k和6.7K外而含有所有腺病毒基因的质粒(pAd5D24.GM-CSF(SEQID NO 8))。Ad5-RGD-D24-GMCSF(SEQ IDNO 9)，Ad5/3-D24-GMCSF(SEQ ID NO 7)和Ad5-pK7-D24-GMCSF(SEQ ID NO 10)是被类似地产生的。

图5a-d显示了GMCSF的表达不损害病毒复制和细胞杀伤效果。图5a代表了MTS检测的结果，其显示了新产生的病毒Ad5-D24-GMCSF杀伤源于肺癌的(A549)细胞的效力。图5b代表了MTS检测的结果，其显示了用Ad5-D24-GMCSF杀伤JIMT-1癌症起始细胞(“癌症干细胞”)。图5c代表了MTS检测的结果，其显示了用新产生的病毒Ad5-D24-GMCSF杀伤乳腺癌细胞(MDA-MB-436)的效力。图5d代表了MTS检测的结果，其显示了用新产生的病毒Ad5-D24-GMCSF，Ad5-RGD-D24-GMCSF和Ad5/3-D24-GMCSF杀死MDA-MB-436的效力。

图6a显示了腺病毒相伴的(coupled)人GMCSF的表达。用Ad5D24或Ad5D24-GMCSF感染A549细胞系，随时间收集培养基并且通过FACSAR-RAY就GMCSF的表达进行分析。

图6b显示了腺病毒表达的GMCSF在人淋巴细胞中保持其生物学活性。在存在人重组GMCSF(大肠杆菌生产的，购自Sigma)或存在来自经Ad5-D24-GMCSF感染的细胞的上清液时培养需要人GMCSF而存活的TF1细胞。

图7a和7b显示了对患者肿瘤的转导的体外分析以测试基于Ad5的病毒的感染性。

图7c显示了通过在归档的肿瘤样品中对Ad5-D25-GMCSF的受体CAR(柯萨奇-腺病毒受体)进行染色，而对Ad5-D25-GMCSF转导肿瘤的预测。

图8a显示了Ad5-D24-GMCSF在带有胰腺癌肿瘤的叙利亚仓鼠(允许人腺病毒复制)中的体内效力。Ad5D24和Ad5-D24-GMCSF均在治疗后的16天内清除肿瘤。在第0、2和4天施用1x10⁹VP的病毒。

图8b显示了肿瘤内注射Ad5-D24-GMCSF引起了叙利亚仓鼠的血清中高水平的hGMCSF。在第4天对用Ad5D24E3或Ad5-D24-GMCSF处理的动物进行取样并通过FACSARRAY评估血清中人GMCSF的浓度。

图8c显示了以Ad5-D24-GMCSF(而非Ad5D24)治疗HapT1肿瘤保护了叙利亚仓鼠免受随后HapT1的再攻击。这表明了Ad5-D24-GMCSF可诱导肿瘤特异性免疫应答。用相同的肿瘤再攻击之前用Ad5D24或Ad5D24-GMCSF治疗过的动物(图8a)，并且随时间测量肿瘤的生长。

图8d显示了通过Ad5-D24-GMCSF诱导肿瘤特异性免疫应答，用Ad5-D24-GMCSF治愈HapT1肿瘤没有保护叙利亚仓鼠免患Hak肿瘤。用不同的肿瘤再攻击之前用Ad5D24或Ad5D24-GMCSF治疗过的具有HapT1肿瘤的动物(图8a)，并且随时间测量肿瘤的生长。

图9a显示了Ad5-D24-GMCSF与不间断地口服环磷酰胺相组合的效力。在治疗开始后的71天通过CT扫描观察到了88％的肿瘤缩减。

图9b显示了在以Ad5-D24-GMCSF治疗的卵巢癌患者中Ad5D24-GMCSF的治疗效力。如箭头所示，CT扫描显示了所有可测量的肿瘤的完全消失。

图10a-d显示Ad5-D24-GMCSF引起了抗肿瘤表位和腺病毒(存在于肿瘤细胞中)的T细胞应答。在用来自腺病毒5的肽混合物和来自肿瘤抗原存活素的肽混合物刺激后，通过IFN-γELI SPOT分析了收获自以Ad5-D24-GMCSF治疗的患者的T细胞。

图11显示了诱导腺病毒六邻体特异性T细胞。在治疗之前和之后，用CD3、CD8和六邻体特异性四聚抗体对收获自以Ad5-D24-GMCSF治疗的患者的白细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。治疗将六邻体特异性细胞毒性T细胞从0.21％增加到了2.72％。

图12显示了患者R73中循环T调节细胞的减少。PBMCs对于CD4是阳性的，对于CD127是阴性的，但是Foxp 3高，其被认为是有效的T调节细胞。

图13a-i显示了克隆的图示，以产生带有GM-CSF的穿梭质粒(pTHSN)、产生含有所有腺病毒基因并带有E1区中的24个碱基对缺失(其介导癌细胞中的选择性复制)的质粒和产生除了被GM-CSF替代的gp19k和6.7K外而含有所有腺病毒基因的Ad5/3-D24-GMCSF质粒(pAd5D24.GM-CSF)。

图14显示了Ad5/3-D24-GMCSF的核苷酸序列。加粗的区域表示缺失了D24的E1A区(核苷酸563-1694)。加下划线的区域表示GMCSF(核苷酸28380-28814)。斜体的区域表示Ad3节区域(核苷酸31701-32272)。此图的序列对应于序列SEQ I D NO 7。

图15显示了经Ad5/3-D24-GMCSF治疗的患者的存活图。

发明详述

腺病毒载体

在Ad5以及其它腺病毒中，二十面体衣壳由三种主要的蛋白质：六邻体(II)、五邻体基质(III)和有节的(knobbed)纤毛(IV)，和次要的蛋白质VI，VIII，IX，IIIa以及IVa2组成(Russell W.C.2000，JGeneral Virol 81，2573-2604)。蛋白VII、小肽mu和末端蛋白(TP)与DNA相缔合。蛋白V通过蛋白VI向衣壳提供结构性连接。需要病毒编码的蛋白酶用于加工某些结构蛋白。

本发明的溶瘤性腺病毒载体是基于腺病毒血清型5(Ad5)核酸骨架、在腺病毒E1的Rb结合恒定区2(CR2)中的24bp的缺失(D24)、和替代腺病毒E 3区中缺失的gp19k/6.7K的编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的核酸序列的(图1)。在本发明的优选实施方式中，所述腺病毒载体是基于人腺病毒的。

Ad5基因组含有早期(E1-4)，中期(IX和IVa2)以及晚期(L1-5)基因，侧翼是左侧和右侧的反向末端重复(分别为LITR和RITR)，所述反向末端重复含有DNA复制所需的序列。所述基因组还含有包装信号(ψ)和主要晚期启动子(MLP)。

早期基因E1A的转录起始复制循环，继以E1B，E2A，E2B，E3和E4的表达。E1蛋白调节细胞代谢而使得细胞更易于病毒复制。例如，它们干扰NF-κB，p53和pRb蛋白。E1A和E1B在抑制凋亡中共同作用。E2(E2A和E2B)以及E4基因产物介导DNA复制，并且E4的产物还影响病毒RNA代谢并防止宿主蛋白的合成。E3基因产物引起对宿主免疫系统的防御，增加细胞裂解并且释放病毒后代(Rus sell W.C.2000，JGeneral Virol 81，2573-2604)。

中期基因IX和IVa2编码病毒衣壳的次要蛋白。晚期基因L1-5的表达受MLP的影响，所述晚期基因导致病毒结构组分的产生、病毒颗粒在核中的衣壳化和成熟(RussellW.C.2000，J General Virol 81，2573-2604)。

与野生型的腺病毒基因组相比，本发明的腺病毒载体在E1区(特别是在E1A区)的CR2中缺少24个碱基对，以及在E 3区缺少gp19k和6.7K。在本发明的优选实施方式中，除了部分的E1和E 3区外，本发明的溶瘤性腺病毒载体还包含选自E2，E4，和晚期区域的一个或多个区域；在本发明的优选实施方式中，所述溶瘤性腺病毒载体包含下列区域：左ITR、部分E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分E3、L5、E4和右ITR。在所述载体中，所述区域可以以任何顺序，但是在本发明的优选实施方式中，所述区域按照顺次顺序在5′至3′的方向上。开放阅读框(ORFs)可以在相同的DNA链中或不同的DNA链中，在本发明的优选实施方式中，E1区包含病毒包装信号。

如本申请中所用的，表述“腺病毒血清型5(Ad5)核酸骨架”指Ad5的基因组或部分基因组，其包含选自下列的一个或数个区域：Ad5起源的部分E1、plX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L 3、L4、部分E3、L5和E4。本发明的一个优选的载体包含Ad5的核酸骨架。在另一个优选的载体中，腺病毒核酸骨架大部分源自Ad5并且结合了Ad3的一部分(例如，衣壳结构的一部分)。

如本申请中所使用的，表述“部分”区域指与相应的野生型区域相比，缺少任何部分的区域。″部分E1″指具有D24的E1区，“部分E3”指缺少gp19k/6.7K的E3区。

如本申请中所使用的，表述″VA1″和″VA2″指与RNA1和RNA2相关的病毒，所述RNA被腺病毒转录但是不被翻译。VA1和VA2在对抗细胞防御机制中起作用。

如在本申请中所使用的，表述“病毒包装信号“指病毒DNA的一部分，其由一系列富含AT的序列组成并且控制衣壳化过程。

E1的24个碱基对的缺失(D24)影响CR2结构域，其引起与Rb肿瘤抑制因子/细胞周期调控因子蛋白的结合，并因而允许诱导合成(S)期，即DNA合成或复制期。pRb与E1A的相互作用需要E1A蛋白保守区的8个氨基酸121至127(Heise C.等人2000，Nature Med 6，1134-1139)，所述氨基酸在本发明中缺失了。本发明的载体包含相应于根据Heise C.等人(2000，Nature Med 6，1134-1139)的载体的氨基酸122-129的核苷酸缺失。已知具有D24的病毒具有降低的克服G1-S检测点的能力并且仅在此相互作用不是必需的细胞(例如，在Rb-p16通路中有缺陷的肿瘤细胞中)中有效地复制(Heise C.等人2000，Nature Med 6，1134-1139；Fueyo J等人2000，Oncogene 19，2-12)。

E 3区对于病毒的体外复制而言是非必需的，但是E 3蛋白在宿主免疫应答的调节中(即在抑制先天的和特定的免疫应答中)起重要的作用。E 3中的gp19k/6.7K缺失指从腺病毒的E 3A区中缺失965个碱基对。在所产生的腺病毒构建体中，gp19k和6.7K基因均缺失了(Kanerva A等人2005，Gene Therapy 12，87-94)。已知gp19k基因产物在内质网中结合并且螯合主要组织相容性复合物1(MHC1)分子，并且防止被感染的细胞被细胞毒性T淋巴细胞识别。由于许多肿瘤在MHC1中有缺陷，缺失gp19k增加了病毒的肿瘤选择性(与野生型病毒相比，病毒从正常细胞中被更快地清除了，但是在肿瘤细胞中没有区别)。6.7K蛋白在细胞表面表达，并且它们参与TNF相关凋亡诱导配体(TRAI L)受体2的下调。

在本发明中，将GM-CSF转基因置于缺失了gp19k/6.7k的E 3区域中，在E3启动子之下。这将转基因的表达限制在允许病毒复制和随后活化E 3启动子的肿瘤细胞中。E 3启动子可以是任何本领域已知的外源或内源启动子，优选是内源启动子。在本发明的优选实施方式中，编码GM-CSF的核酸序列在病毒E 3启动子的控制下。

GM-CSF通过各种机制(包括募集天然杀伤(NK)细胞和刺激抗原呈递细胞(APC))起作用而参与免疫应答。APC然后可募集、活化和靶向针对肿瘤的T细胞。编码GM-CSF的核苷酸序列可以来自任何动物，例如人、猿、大鼠、小鼠、仓鼠、狗或猫，但是优选地，GM-CSF是由人序列编码的。编码GM-CSF的核苷酸序列可以是经修饰的以改善GM-CSF的效果，或者是未经修饰的(即野生型的)。在本发明的优选实施方式中，编码GM-CSF的核酸序列是野生型的。

本发明的载体还可以包含除上述CR2和E3的部分缺失及GM-CSF序列的插入之外的其它修饰。在本发明的优选实施方式中，Ad 5载体的所有其它区域都是野生型的。在本发明的另一个优选实施方式中，E4区是野生型的。在本发明的优选实施方式中，野生型区域位于E1区的上游。“上游”指在表达的方向上紧邻E1区而在其之前。在本发明的载体中E1B区也可以是经修饰的。

外源元件的插入可增加所述载体在靶细胞中的效果。使用外源的组织或肿瘤特异性启动子在重组腺病毒载体中是常见的并且它们也可被用于本发明中。例如，可通过例如启动子将病毒复制限制在靶细胞中，所述启动子包括但不限于CEA，SLP，Cox-2，肝素结合细胞因子，hTERT，hTERT的变体，E2F，E2F的变体，CXCR4，SCCA2和TTS。通常它们被加入以控制E1A区域，但是此外或备选地，其它基因(例如E1B或E4)也可被调节。重组腺病毒载体中也可包括外源性的绝缘子(即对抗非特异性增强子的阻碍元件)、左I TR、天然E1A启动子或染色质蛋白。任选地，可使用任何其它的组分或修饰但在本发明的载体中不是必须的。

大多数成人都曾被暴露于最广泛使用的腺病毒血清型Ad5，因而免疫系统可以很快地产生针对它们的中和抗体(NAb)。事实上，抗Ad 5NAb的流行率可直至50％。已显示可针对腺病毒衣壳的多个免疫原性蛋白中的大多数诱导NAb，另一方面，已显示即使Ad5纤毛节中的小变化也可以允许逃避衣壳特异性NAb。因此，在人中使用腺病毒的情况下，所述节的修饰对于维持或增加基因递送是重要的。

此外，已知Ad5通过纤毛的节部分结合被称为CAR的受体，并且对所述节部分或纤毛的修饰可改善向靶细胞的进入并在一些癌症中引起增加的溶瘤作用(Ranki T.等人2007，Int J Cancer 121，165-174)。的确，衣壳经修饰的腺病毒对于改善的向癌细胞的基因递送而言是有利的工具。

在本发明的一个实施方式中，所述溶瘤性腺病毒载体包含衣壳修饰。如在本申请中所使用的，“衣壳”指病毒的蛋白质外壳，其包括六邻体、纤毛和五邻体基质蛋白。在本发明中可使用改善病毒向肿瘤细胞的递送的任何衣壳修饰(即本领域已知的对六邻体、纤毛和/或五邻体基质蛋白的修饰)。修饰可以是遗传和/或物理修饰，包括但不限于：整合配体的修饰，所述配体识别特定的细胞受体和/或阻碍天然受体的结合；用其它腺病毒的节替代腺病毒载体的纤毛或节结构域的修饰(嵌合体)；以及向腺病毒添加特定分子(例如FGF2)的修饰。因此，衣壳修饰包括但不限于将小的肽基序、肽、嵌合体或突变整合到纤毛(例如，到节部、尾部或杆部中)、六邻体和/或五邻体基质中。在本发明的优选实施方式中，所述衣壳修饰是Ad5/3嵌合体，将整联蛋白结合(RGD)区和/或结合硫酸肝素的聚赖氨酸修饰插入纤毛中。在本发明的特定实施方式中，所述衣壳修饰是Ad5/3嵌合体。

如在本申请中所使用的，衣壳的“Ad5/3嵌合体”指嵌合体，其中纤毛的节部分来自Ad血清型3而纤毛的其余部分来自Ad血清型5。

如在本申请中所使用的，“RGD区”指精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序，其在五邻体基质上被暴露并且与支持腺病毒内化的细胞av整联蛋白相互作用。在本发明的优选实施方式中，衣壳修饰是RGD-4C修饰。“RGD-4C修饰”指将结合整联蛋白的RGD-4C基序插入纤毛节结构域的HI环中。4C指四个半胱氨酸，其在RGD-4C中形成硫桥。在例如Dmitriev I.等人的文章(1998，Journal of Virology，72，9706-9713)中详细描述了用RGD-4C肽构建编码纤毛的重组Ad5纤毛基因。

如在本申请中所使用的，“结合硫酸肝素的聚赖氨酸修饰”是指向纤毛节的c末端加上一段七个赖氨酸。

表达盒被用于通过利用载体而在靶标(例如细胞)中表达转基因。如在本申请中所用的，表述“表达盒”指包含编码cDNA或基因的核苷酸序列，以及控制和/或调节所述cDNA或基因的表达的核苷酸序列的DNA载体或其部分。相似的或不同的表达盒可被插入一个载体或数个不同的载体中。本发明的Ad5载体可包含数个或者一个表达盒。然而，仅一个表达盒就足够了。在本发明优选的实施方式中，所述溶瘤性腺病毒载体包含至少一个表达盒。在本发明优选的实施方式中，所述溶瘤性腺病毒载体仅包含一个表达盒。

包含本发明的腺病毒载体的细胞可以是任何细胞，例如真核细胞、细菌细胞、动物细胞、人细胞、小鼠细胞等。细胞可以是体外的、离体的或体内的细胞。例如，所述细胞可被用于在体外、离体或在体内产生所述腺病毒载体，或者所述细胞可以是被所述腺病毒载体感染的靶标(例如肿瘤细胞)。

在于细胞中生产GM-CSF的方法中，将包含本发明的载体的媒介运送至细胞内，并且表达GM-CSF基因，且蛋白质被翻译并以旁分泌的方式被分泌。“媒介”可以是能够将本发明的载体递送至靶细胞的任何病毒载体、质粒或其它工具(例如颗粒)。可使用本领域已知的任何常规的方法来将载体递送至细胞。

可通过本发明在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答。作为表达GM-CSF的结果，细胞毒性T细胞和/或天然杀伤细胞被刺激、产生和靶向。在本发明的优选实施方式中，天然杀伤细胞和/或细胞毒性T细胞的量在靶细胞或组织中增加。为了追踪或研究本发明的效果，可测定各种免疫应答的标志物(例如，发炎的标志物)。最常见的标志物包括但不限于促炎性细胞因子的增加、肿瘤或腺病毒特异性细胞毒性T细胞的增加、抗原呈递细胞的募集和活化或局部淋巴结尺寸的增加。可根据本领域已知的任何常规方法来研究这些标志物的水平，所述方法包括但不限于利用抗体、探针、引物等的那些方法，例如ELISPOT检测、四聚体分析、五聚体分析和分析血液或肿瘤中的不同细胞类型。

癌症

为了细胞中的复制能力而构建了本发明的重组Ad5载体，所述细胞在Rb通路，特别是Rb-p16通路中有缺陷。这些缺陷性细胞包括动物和人中的所有肿瘤细胞(SherrC.J.1996，Science 274，1672-1677)。在本发明优选的实施方式中，所述载体能够在Rb通路中有缺陷的细胞中选择性地复制。如本申请中所使用的，“Rb通路中的缺陷”指所述通路的任何基因或蛋白质中的突变和/或后生变化(epigenetic change)。由于这些缺陷，肿瘤细胞过表达E2F，并因此，有效复制通常所需的E1A CR2与Rb的结合是不必要的。

任何癌症或肿瘤，包括恶性与良性肿瘤以及原发肿瘤与转移，均可以是基因疗法的靶标。在本发明的特定实施方式中，所述癌症是任何实体肿瘤。在本发明的优选实施方式中，所述癌症选自：鼻咽癌、滑膜癌、肝细胞癌、肾癌、结缔组织癌、黑色素瘤、肺癌、肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、脑癌、喉癌、口腔癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、绒毛膜癌、胃泌素瘤、嗜铬细胞瘤、催乳素瘤、T细胞白血病/淋巴瘤、神经瘤、成血管细胞瘤病(von Hippel-Lindaudisease)、卓一艾氏综合征(Zollinger-Ellison syndrome)、肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脑癌、少突神经胶质瘤、成神经细胞瘤、脑膜瘤、脊髓肿瘤、骨癌、骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、未知原发位点的癌、良性肿瘤、胃肠道良性肿瘤、纤维肉瘤、乳腺癌、佩吉特氏病(Paget′s disease)、宫颈癌、结肠直肠癌、直肠癌、食道癌、胆囊癌、头癌、眼癌、颈癌、肾癌、维尔姆斯瘤(Wilms′tumor)、肝癌、卡波济氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、前列腺癌、肺癌、睾丸癌、何杰金病(Hodgkin′s disease)、非何杰金淋巴瘤、口腔癌、皮肤癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、内分泌胰腺癌、高血糖素瘤、胰腺癌、副甲状腺癌、阴茎癌、垂体癌、软组织肉瘤、成视网膜细胞瘤、小肠癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、滋养层癌、葡萄胎、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、听神经瘤、蕈样肉芽肿、胰岛瘤、类癌综合征、生长抑制素瘤、牙龈癌、心脏癌、唇癌、脑膜癌、口癌、神经癌、腭癌、腮腺癌、腹膜癌、咽癌、肋膜癌、唾液腺癌、舌癌、扁桃体癌。

药物组合物

本发明的药物组合物包含至少一类本发明的载体。此外，所述组合物可包含至少两种、三种或四种不同的本发明的载体。除了本发明的载体之外，药物组合物还可包含任何其它的载体(例如其它的腺病毒载体)、其它治疗上有效的试剂、任何其它的试剂，例如药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、佐剂、杀菌剂、填料、稳定剂或增稠剂、和/或任何通常在相应产品中被发现的化合物。

所述药物组合物可以是适于施用的任何形式，例如固体、半固体或液体形式。制剂可选自(但不限于)：溶液、乳剂、悬浮液、片剂、丸剂和胶囊。

在本发明的优选实施方式中，所述溶瘤性腺病毒载体或药物组合物作为原位癌症疫苗起作用。如在本申请中所用的，“原位癌症疫苗”指杀死肿瘤细胞并提高抗肿瘤细胞的免疫应答的癌症疫苗。病毒复制对免疫系统而言是强的危险信号(＝TH1型应答所需的)，因此其对于GM-CSF介导的APC的成熟和活化以及NK细胞的募集是强有力的共刺激现象。肿瘤细胞裂解也帮助将肿瘤片段和表位呈递给APC，并且还通过发炎产生共刺激。因此，不依赖于表位(即不受限于HLA的)的应答在各个肿瘤的情境中产生并因此在原位发生。肿瘤特异性免疫应答在靶细胞及周围的细胞(例如在靶组织)中被活化。

载体的有效剂量至少取决于需要治疗的受试者、肿瘤类型、肿瘤的位置和肿瘤的阶段。剂量可变化，例如从约10e8病毒颗粒(VP)至约10e14VP，优选地从约5x10e9VP至约10e13VP并且更优选地从约8x10e9VP至约10e12VP。在本发明的一个特定实施方式中，剂量在约5x10e10-5x10e11VP的范围内。

所述药物组合物可通过本领域已知的任何常规的方法生产，例如通过利用下列中的任何一种：批次、补料批次和灌注培养模式，柱状色谱纯化，CsCl梯度纯化和用低切力细胞保留设备进行的灌注模式。

施用

本发明的载体和药物组合物可被施用于任何真核受试者，所述真核受试者选自：植物、动物和人类。在本发明的优选实施方式中，所述受试者是人或动物。动物可选自宠物、家畜和生产动物(production animal)。

可使用任何常规的方法来将所述载体或组合物施用给受试者。施用途径取决于组合物的制剂或形式、疾病、肿瘤的位置、患者、合并症和其它因素。在本发明的优选实施方式中，所述施用是通过肿瘤内、肌内、动脉内、静脉内、胸膜内、囊内、腔内或腹膜注射进行的，或者是口服施用。

仅施用一次本发明的溶瘤性腺病毒载体便可具有治疗效果。然而，在本发明优选的实施方式中，在治疗期间中施用溶瘤性腺病毒载体或药物组合物数次。溶瘤性腺病毒载体或药物组合物可例如，在前2周、4周、每月或在治疗期间中被施用1至10次。在本发明的一个实施方式中，在前2周中、然后在4周、然后每月进行3-7次施用。在本发明的特定实施方式中，在前2周中、然后在4周、然后每月进行4次施用。治疗期间的长度可变化，例如可持续2-12个月或更长。

为了避免受试者中的中和抗体，本发明的载体在治疗之间可变化。在本发明的优选实施方式中，向受试者施用的溶瘤性腺病毒载体与较早治疗时的载体相比具有不同的衣壳纤毛节。如在本申请中所使用的，“衣壳纤毛节”指纤毛蛋白的节部分(图1)。

本发明的基因疗法单独是有效的，但是腺病毒基因疗法与任何其它疗法(例如传统的疗法)的组合可以比单独的任何一个更有效。例如，组合疗法中的各试剂可单独地在肿瘤组织中起作用，腺病毒载体可使细胞对化学疗法或放射疗法敏感和/或化疗剂可提高病毒复制的水平或影响靶细胞的受体状态。组合疗法的试剂可被同时或顺次施用。

在本申请优选的实施方式中，所述方法或用途还包括向受试者施用并行的放射疗法。在本发明的另一个优选的实施方式中，所述方法或用途还包括向受试者施用并行的化学疗法。如在本申请中所用的，“并行的”指在本发明的基因疗法之前、之后或同时施用的疗法。并行疗法的期间可从数分钟到数周变化。优选地，所述并行疗法持续数小时。

适于组合疗法的试剂包括但不限于：全反式维甲酸、阿扎胞苷、咪唑硫嘌呤、博来霉素、卡波铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、道诺霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、阿霉素、表柔比星、埃博霉素、依托泊甙、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、氮芥、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星(Valrubicin)、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

在本发明的优选实施方式中，所述方法或用途还包括向受试者施用维拉帕米或另一种钙通道阻断剂。“钙通道阻断剂”指一类药物和天然物质，其破坏钙通道的传导，并且其可以选自：维拉帕米、二氢吡啶类、加洛帕米、地尔硫卓、咪拉地尔、苄普地尔、氟司必林和芬地林。

在本发明的优选实施方式中，所述方法或用途还包括向受试者施用诱导自我吞噬的试剂。自我吞噬指涉及通过溶酶体装置而使细胞自身组分降解的分解代谢过程。“诱导自我吞噬的试剂”指能够诱导自我吞噬的试剂，并且可选自但不限于：mTOR抑制剂、PI3K抑制剂、锂、他莫昔芬、氯喹、洛霉素(bafilomycin)、特癌适(temsirolimus)、西罗莫司和替莫唑胺。在本发明的特定实施方式中，所述方法还包括向受试者施用替莫唑胺。替莫唑胺可以是口服的或静脉内的替莫唑胺。

在本发明的一个实施方式中，所述方法或用途还包括施用化学疗法或抗CD20治疗或其它阻断中和抗体的方法。“抗CD20治疗”指能够杀死CD20阳性细胞的试剂，可选自利妥昔单抗和其它抗CD20单克隆抗体。“阻断中和抗体的方法”指能够抑制通常由感染产生的抗病毒抗体的生成的试剂，可选自：不同的化疗剂、免疫调节性物质、肾上腺皮质素和其它药物。这些物质可选自但不局限于：环磷酰胺、环孢菌素、咪唑硫嘌呤、甲基强的松龙(methylprenisolone)、依托泊甙、CD40L、CTLA4I g4、FK506(他克莫司)、IL-12、IFN-γ、白细胞介素10、抗CD8、抗CD4抗体、脊髓抑制(myeloablation)和口服腺病毒蛋白质。

本发明的溶瘤性腺病毒载体诱导病毒粒子介导的对肿瘤细胞的溶瘤作用并活化抗肿瘤细胞的人免疫应答。在本发明的优选实施方式中，所述方法或用途还包括施用能够下调受试者中的调节性T细胞的物质。“能够下调调节性T细胞的物质”指减少被鉴别为T抑制因子或调节性T细胞的细胞的量的试剂。这些细胞被鉴别为含有下列免疫表现型标志物的一种或多种：CD4+，CD25+，FoxP3+，CD127-和GITR+。此类减少T抑制因子或调节性T细胞的试剂可选自：抗CD25抗体或化疗剂。

在本发明的优选实施方式中，所述方法或用途还包括向受试者施用环磷酰胺。环磷酰胺是常见的化学治疗剂，其也被用于一些自体免疫病症中。在本发明中，环磷酰胺可被用于提高病毒的复制和GM-CSF所诱导的对NK和细胞毒性T细胞的刺激对于增加的抗肿瘤免疫应答的效果。其可作为静脉内推注剂量或低剂量的口服不间断施用而被使用。

本发明的任何方法或用途可以是体内的、离体的或体外的方法或用途。

通过下列实施例阐释本发明，所述实施例不欲以任何方式而是限制性的。

实施例

实施例1.克隆三种D24-GM-CSF型病毒

-PCR出hGM-CSF，

-产生SunI/MunI位点＝＞445bp(pORF-GM-CSF作为模板)

-SunI/MunI消化PCR产物和pTHSN

-粘末端连接＝＞

-PmeI线性化的pShuttle-D24+pTG3602＝＞pAd5-D24

-Ad5-D24-GM-CSF(SEQ ID NO 8：E1A区具有核苷酸位置563-1524中的D24缺失和核苷酸位置30490-32236中的纤毛区)

同源重组：SrfI线性化的pAd5-D24+FspI线性化的pTHSN-GM-CSF＝＞pAd5-D24-GM-CSF

PacI线性化&转染＝＞Ad5-D24-GM-CSF

克隆的所有阶段均以PCR和多重限制性消化进行了确认。对穿梭质粒pTHSN-GMCSF进行了测序。用PCR确认了不存在野生型的E1。用测序和PCR检查了最终病毒中的E1区、转基因和纤毛，然后将所述最终病毒带到洁净的实验室用于生产。为此，通过以适当的缓冲溶液过夜(ON)孵育来提取病毒DNA，并且在进行了PCR和测序后分析所述纤毛和GMCSF cDNA的完整性。病毒生产的所有阶段(包括转染)是在A549细胞上进行的以避免之前所述的野生型重组的危险(Kanerva A等人2003，Mol Ther 8，449-58；Baeurschmitz GJ等2006，MolTher14，164-74)。GM-CSF是在E3启动子之下(特别是在内源性的病毒E3A基因表达控制元件之下)，这引起与复制相关的转基因表达，所述表达在感染后大约8h开始。E3是完整的，除了6.7K/gp19K的缺失以外。

相同地构建Ad5/3-D24-GM-CSF(SEQ ID NO 7)和Ad5-RGD-D24-GM-CSF(SEQ ID NO9：E1A区具有核苷酸位置580-1541中的D24缺失，核苷酸位置30514-32286中的纤毛区和核苷酸位置32128-32183中的RGD修饰)，除了使用了以来自血清型3的节或Ad5纤毛H I-环中的RGD-4C为特征的拯救质粒之外。也类似地产生了Ad5-pK7-D24-GMCSF(SEQ ID NO 10：E1A区具有核苷酸位置561-1526中的D24缺失，核苷酸位置30499-32255中的纤毛区和核苷酸位置32247-32378中的pK7修饰)(图2-4)。

如下构建了Ad5/3-D24-GM-CSF。源自pAdEasy-1的、含有嵌合5/3纤毛的质粒pAdEasy5/3通过大肠杆菌中Ad5/3luc1病毒基因组和经Bs tXI消化的pAdEa sy-1的8.9kb片段的同源重组而产生。然后，用PmeI线性化含有E1A中的24-bp缺失的穿梭载体(pShuttleD24)，并使其与pAdEa sy5/3重组，产生pAd5/3-D24。为了将人GMCSF基因插入E 3区中，通过将来自Ad5基因组的SpeI至NdeI片段插入pGEM5Zf+(Promega，Madi son，WI)的多克隆位点而产生E3克隆载体pTHSN。进一步用SunI/MunI消化pTHSN，在E3区中产生了965-bp的缺失(缺失了6.7K和gp19K)。用以基因侧翼的特定限制性位点SunI/MunI为特征的引物扩增了编码人GMCSF(Invitrogen，CarlsbadCA)的432bp cDNA，然后将其插入经SunI/MunI消化的pTHSN(pTHSN-GMCSF)。通过大肠杆菌中FspI-线性化的pTHSN-GMCSF与SrfI-线性化的pAd5/3-D24之间的同源重组产生了pAd5/3-D24-GMCSF。通过PacI消化释放了Ad5/3-D24-GMCSF病毒基因组并转染至A549细胞用于扩增和拯救(图13和14，SEQ ID NO 7)。

实施例2.D24-GM-CSF型病毒的体外分析

在肺癌细胞(A549)、源自乳腺癌干细胞的外植体细胞(J IMT-1)和乳腺癌细胞(MDA-MB-436)中，利用MTS细胞杀伤检测研究了D24-GM-CSF型病毒的体外效力。MTS检测是目前癌症基因疗法出版物中用于评估细胞存活的标准方法。Ad5Luc1是复制缺陷性病毒并作为阴性对照。Ad5wt是野生型的Ad5病毒(株系Ad300wt)并被用作阳性对照。Ad5-d24-E 3在E1中含有等基因的(isogenic)24bp缺失但是在E 3中是完整的。VP表示病毒颗粒。

总之，在体外，Ad5-D24-GMCSF与阳性对照具有相似的溶瘤活性，并且因此转基因的产生并没有危害病毒的溶瘤能力(图5a-c)。对于Ad5/3-D24-GM-CSF和Ad5-RGD-D24-GM-CSF显示了相似的数据(图5d)。

为了测试Ad5D24-GMCSF是否能够表达转基因，以1000VP/细胞感染A549细胞系并随时间收集培养基。根据制造商的说明书通过FACSARRAY(BD Biosciences，San Diego，CAUSA)测量培养基中GMCSF的浓度(图6a)。此外，我们还分析了病毒表达的GMCSF是否保留其生物学功能。为此，用从之前感染了Ad 5D24-GMCSF的A549细胞系收集的培养基处理TF1细胞系，所述TF1细胞系的生长和存活严格地依赖人GMCSF。通过MTS检测随时间评估TF1的存活。此实验的结果是病毒所表达的GMCSF能够刺激所述细胞系的生长，并且没有发现与以人重组GMCSF(Sigma)处理的相同细胞系有区别(图6b)。

实施例3转导的预处理分析

I.用Ad5Luc1感染肿瘤细胞

为了检查肿瘤可以被基于Ad5的病毒感染，将取自组织的活体样本均质化并根据标准的感染方案用编码荧光素酶的Ad5Luc1使其感染。简要地，用PBS将接种于孔中的细胞清洗两次，融化病毒并重悬于最少量的生长培养基中且轻轻地倒在细胞上。感染进行了30分钟，随后在PBS中再次清洗细胞并加入适量的完全生长培养基。24小时后评估荧光素酶定量。需注意仅获得了少量的组织，因此不能计算细胞的数目，也不能计算相对于组织的量校准过的病毒量。因此，没有进行定量的分析，但是定性的数据显示了在患者O12和C3中成功的基因转移(图7a-b)。减去了背景荧光素酶的值(大约200RLU)。

II.CAR的免疫组织化学染色

收集了患者(用于Ad5-D24-GM-CSF治疗的患者)肿瘤的可得归档样本并通过免疫组织化学就CAR(腺病毒血清型5受体)的表达进行了分析。在图7c中显示了对于下列腺病毒受体CAR的染色：癌细胞细胞质(M3)、空肠腺癌(C3)、胰腺癌(H7)、癌小叶浸润(R8)、卵巢癌的肝转移(O12)和滑膜肉瘤的肺转移(S23)。

III.抗Ad5/3衣壳的中和抗体滴度

以1x 10⁴细胞/孔将293细胞接种在96孔板上并培养过夜。次日，用无FCS的DMEM清洗细胞。为了使补体失活，在56℃孵育人血清样品90分钟。在无血清的DMEM中制备四倍稀释的系列(1∶1至1∶16384)(Sarkioja M等人2008，Gene Ther 15(12)：921-9)。将Ad5/3luc1与血清稀释液混合并在室温孵育30分钟。然后，在50μl混合物中，以100VP/细胞一式三份感染细胞，1h后加入100μl含有10％FCS的生长培养基。感染后24h，裂解细胞并利用TopCount光度计(PerkinElmer，Waltham，MA)以荧光素酶检测系统(Promega，Madison，WI)来测量荧光素酶的活性。相对于以单独的Ad5/3luc1实现的基因转移对荧光素酶读数作图，从而评估在经Ad5/3-d24-GMCSF治疗的患者血清中中和抗体的效力。中和抗体的滴度被测定为阻碍基因转移超过80％的最低程度的稀释。

实施例4.对Ad5/3-D24-GMCSF在腹水和胸腔样品中的效力的离体分析

将新鲜的腹水/胸腔积液样品在+4℃储存过夜。将所述样品分到50ml离心管中并通过离心(900rpm，8mi n，+4℃)分离细胞。为了裂解红血细胞，在室温用25ml ACK裂解缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)孵育样品5-10分钟。用2％DMEM填充离心管并离心细胞(900rpm，8min，+4℃)。在2％DMEM-二性霉素中制备100000细胞/ml的细胞悬浮液(50ml 2％DMEM+200μl二性霉素(BMS，Espoo，芬兰))。

对于荧光素酶检测，为了测试衣壳修饰对转导效力的影响，将细胞接种到两个24孔板中，50000细胞/孔。24h后，用Ad5luc1或Ad5/3luc1以2％DMEM中500vp/细胞和5000/vp/细胞的浓度一式三份感染细胞。如同在实施例3III中类似地分析荧光素酶的表达(确定中和抗体滴度)。

分析了分别来自患者K75和V136的腹水和胸腔积液的新鲜的、处理前的样品，在两种样品中均见到了Ad5/3的高转导。

对于MTS-检测，为了测试Ad5/3-d24-GMCSF在临床样品上的效能，以10000细胞/孔将细胞接种在两个96孔板中。孵育24小时后感染细胞。感染在2％DMEM中进行。次日，加入10％DMEM。每天检查细胞，并且隔天更换培养基。测量之前，吸出培养基并向孔中移液加入100μl新鲜的10％DMEM。加入20μl MTS-检测缓冲液(Promega，Madison，WI)并且孵育细胞1.5-4小时。用Multiscan Ascent和Ascent软件v2.6(Thermo Labsystems，赫尔辛基，芬兰)在490nm处测量吸光度，并从样品的吸光度中减去背景吸光度。

就Ad5/3-d24-GMCSF的溶瘤效能评估来自V136和M137的胸腔积液的处理前样品。感染后六天，与未感染的对照样品相比，分别有62％和29％更少的活细胞(p＜0.001)，暗示Ad5/3-d24-GMCSF能够杀死积液中存在的肿瘤细胞。

为了评估治疗后获得的样品中病毒的存在，在裂解红血细胞后将细胞重悬于3ml2％DMEM中并在-80℃冻融四次。将293细胞接种于96孔板中，10000细胞/孔，并孵育24小时。将样品离心(4000rpm，+4℃)15分钟并收集上清液。用所述上清液以100μl/孔感染293细胞。孵育10天后，就细胞病变效果的存在评估所述孔。

为了评估Ad5/3-d24GMCSF在肿瘤处的复制，我们还分析了取自治疗后7天的患者O82的腹水样品。这引起了70％的细胞显示出细胞病变效果，而未被感染的对照细胞没有显示类似的效果。

实施例5.在动物中体内分析D24-GM-CSF型病毒

在免疫活性的叙利亚仓鼠中测试了Ad5-D24-GM-CSF的体内效力，所述仓鼠对于人腺病毒的复制是半容许的(小鼠是不容许的)(Ying B.等人2009，Cancer Gene Ther doi：10.1038/cg t.2009.6.)。皮下注射7*10⁶HapT1胰腺癌细胞并且在第0、2和4天肿瘤内注射1*10⁹个Ad5-D24-GM-CSF或Ad5D24E3(其不表达GM-CSF)的病毒颗粒(VP)。在相同的所示时间点用相同体积的生长培养基注射模拟组。图8b显示肿瘤内注射Ad5-D24-GMCSF引起叙利亚仓鼠血清中高水平的hGM-CSF。已知人GM-CSF在叙利亚仓鼠中是有活性的(Cho，ExpToxicol Pathol2006 vol.57(4)pp.321-8)。有趣地，到第16天，除了模拟组，所有的动物都是没有肿瘤的(图8a)。仍然对肿瘤疤痕分析了额外的两周，以评估是否可能发生肿瘤的再出现。然而，在第32天，在这些动物中仍然没有肿瘤的迹象，因而终止了实验的第一部分并且对模拟组的动物实施了安乐死。此时对于余下的经治疗的动物：在上部身体的右侧通过皮下注射7*10⁶HapT1细胞而用相同的肿瘤进行攻击；而在左侧用不同的肿瘤(1*10⁶的HaK肿瘤)进行攻击，对于所述HaK肿瘤，所述动物是首次用于实验的(naive)。随着时间测量肿瘤的生长并报告在图8c-d。有趣地，之前用Ad5D24GMCSF治疗过的动物完全排斥HapT1肿瘤攻击而Hak肿瘤正常地生长；而之前用Ad5D24E3处理过的动物独立地生长HapT1和HaK肿瘤(图8c-d)。

总之，数据显示了Ad5-D24-GM-CSF在免疫活性的携带肿瘤的动物中具有抗肿瘤活性，并且其能够引起肿瘤特异性的免疫性，以至排斥相同肿瘤的随后攻击的程度。

实施例6.在人患者中体内分析D24-GM-CSF型病毒

I.患者

具有晚期的和难以治疗的实体肿瘤的患者参加了政府批准的同情(compassionate)治疗方案。接受Ad5-D24-GM-CSF的患者的信息在表1中列出。

用一轮Ad 5/3-d24-GMCSF静脉内和肿瘤内地治疗(表7)具有标准疗法难以治疗的晚期实体肿瘤的22名患者(表6)。在癌扩散或胸膜转移的情况下，分别在腹膜内或胸腔内进行肿瘤内注射。入选标准是常规疗法难以治疗的实体肿瘤，WHO表现评分为3或更低并且没有主要的器官功能缺陷。排除标准是器官移植，HIV，严重的心血管、代谢或肺部疾病或者其它防止溶瘤病毒治疗的症状、发现或疾病。获得了书面的知情同意并且根据临床试验管理规范(Good Clinical Practice)和赫尔辛基宣言来施以治疗。

II.用编码GM-CSF的腺病毒载体治疗

a)Ad5-D24-GM-CSF、Ad5/3-D24-GM-CSF或Ad5-RGD-D24-GM-CSF治疗

然后，根据临床级别生产了Ad5-D24-GM-CSF，Ad5/3-D24-GM-CSF和Ad 5-RGD-D24-GM-CSF并开始了对患者的治疗。此“0期”同情使用项目在HUCH外科伦理委员会得到了讨论。此项目也在FinOHTA(国家医学技术评估)和芬兰医学协会伦理谈判委员会(EthicsNegotiation Board of the Finnish Medical Association)被讨论过了。在法律方面与下列相符：社会事务与健康部(Ministry of Social Affairs and Health)、国家药品局(National Agency of Medicines)、芬兰医学协会(Finnish Medical Association)的法律顾问、国家法医事务机关(National authority for Medicolegal affairs)和社会事务与健康的议会委员会(Parliamentary Board of Social Affairs and Health)。所述治疗已得到了芬兰基因技术委员会的许可。

患者在第0天接受一轮的治疗。通过超声引导的肿瘤内注射施用病毒，而大约五分之一的剂量被静脉内施与。基于他人发表的安全性结果选择了8x10¹⁰VP的起始剂量。

施用时在适当的条件下于无菌盐溶液中稀释病毒。施用病毒后，在医院过夜监测所有的患者，并随后在接下来的4周作为门诊病人进行监测。每次就诊都进行身体评估和医疗历史并且追踪临床上相关的实验值。根据不良反应的常见术语v 3.0(CTCAE)记录治疗的副作用并对其评分。

因为许多癌症患者具有由疾病引起的症状，没有对之前存在的症状评分(如果它们没有恶化的话)。然而，如果症状变得更加严重，例如治疗前的1级在治疗后变成了2级，将其评分为2级。通过BD细胞计数珠阵列(CBA)人可溶蛋白Flex Set(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，US)分析了GMCSF和四种其它细胞因子(IL-6，IL-8，I L-10和TNF-α)的血清水平。通过对比增强的计算机断层摄影(CT)扫描评估肿瘤的尺寸。获得了最大的肿瘤直径。将实体肿瘤中的应答评价标准(RECIST1.1)应用于整体疾病，包括经注射的和未注射的损害。这些标准是：部分应答PR(肿瘤直径总和方面＞30％的减少)，稳定的疾病SD(没有减少/增加)，进展性疾病PD(＞20％的增加)。不符合PR的清楚的肿瘤减少被评分为轻微反应(MR)。当在基线评估时，也评估了血清肿瘤标志物并且使用了相同的百分比。

在治疗之前和之后收集了血液样品用于分析。在表1中总结了经Ad5-D24-GMCSF治疗的患者血清中的病毒负荷。使用定量PCR(qPCR)用于所述分析(关于方法的描述参见第III部分)。

表2、3和4总结了在Ad5-D24-GM-CSF治疗过程中和治疗之后所记录的所有不良反应。根据不良反应的常见术语v 3.0(CTCAE)对所有的不良反应进行分级。值得注意的是所有的患者都显示出1级或/和2级类流感的症状，但是仅观察到了两例3级症状，以前曾患便秘的卵巢癌患者中的一例便秘，和一例3级低钠血症。

表5中报导了根据RECIST标准(Therasse P等人2000，J NatlCancer Inst 92，205-16)对Ad5-D24-GM-CSF效力的评价。有趣地，在14位可分析的患者中，观察到了两例完全应答(CR)和五例稳定的疾病(SD)，给出50％的临床获益率。

b)Ad5/3-d24-GMCSF在癌症患者中的安全性

直至所用的最高值4x10¹¹VP/患者，治疗均被良好地耐受。没有见到4-5级的不良反应。1-2级的类流感症状是常见的，有19/22，17/22和8/22的患者分别经历了发烧、疲劳或上呼吸系统症状。注射位点的疼痛(6名患者)、腹痛(10名患者)和恶心(9名患者)也是常见的1-2级不良反应以及(表8)。在4名患者中见到无症状的和自我限制性的3级血液学副作用：贫血(2级在基线处)、中性粒细胞减少、天冬氨酸氨基转移酶升高和低钠血症。唯一的非血液性3级副作用是治疗后3周在胰腺癌患者H83中见到的胆囊炎。他还患有3级丙氨酸氨基转移酶和胆红素升高。综合而言，这些症状表示肿瘤介导的胆管压迫。不清楚这是否是治疗介导的炎性肿胀或由疾病进展引起的肿瘤生长。

III.检测来自血液的病毒

从经Ad5-D24-GM-CSF或Ad5/3-D24-GM-CSF治疗的患者中收集血清样品(见实施例6，I.)并利用根据Takayama等人2007，J.Med.Virol.79：278-284的引物和条件进行常规的PCR。简要地，通过向400μl血清中加入3μg载体DNA(聚脱氧腺苷酸；Roche，曼海姆，德国)并使用QIAamp DNA迷你试剂盒来提取总DNA。在60μl无核酸酶的水中洗脱所提取的DNA并且通过分光光度法测量DNA的浓度。PCR扩增是基于靶向24-bp缺失侧翼的E1A区的引物和探针(正向引物5′-TCCGGTTTCTATGCCAAACCT-3′(SEQ ID NO 1)，反向引物5′-TCCTCCGGTGATAATGACAAGA-3′(SEQ ID NO 2)和探针onco5′^FAM-TGATCGATCCACCCAGTGA-3′^MGBNFQ(SEQ ID NO 3))的。此外，使用了与被包括在24-bp区(被靶向为缺失)中的序列互补的探针(探针wt5′^VIC-TACCTGCCACGAGGCT-3′^MGBNFQ(SEQ ID NO 4))来就野生型腺病毒感染的存在来测试样品。

对于各25μl反应而言，实时PCR的条件如下：2x LightCycler 480Probes MasterMix(Roche，曼海姆，德国)，800nM各正向和反向引物，200nM各探针和250ng所提取的DNA。PCR反应在LightCycler(Roche，曼海姆，德国)中、在下列循环条件下进行：95℃10分钟，50个10秒的循环(95℃)，62℃30秒和72℃20秒，以及40℃10分钟。对所有的样品一式两份进行测试。在相同的PCR操作(PCR run)中使用TaqMan外源性内部阳性对照试剂(AppliedBiosystems)来就PCR抑制剂的存在测试各样品。

使用提取自Ad5/3-D24-Cox2L(1X 10⁸-10vp/ml)在正常人血清中的系列稀释液的DNA来生成回归标准曲线。对于所述检测而言，检测的极限和定量的极限是500vp/ml血清。

使用LightCycler480SYBR Green I Master mix(Roche，曼海姆，德国)以及对于腺病毒和GM-CSF序列为特异性的引物(正向引物5′-AAACACCACCCTCCTTACCTG-3′(SEQ IDNO 5)和反向引物5′-TCATTCATCTCAGCAGCAGTG-3′(SEQ ID NO 6))，通过实时PCR确认阳性的样品。

IV.治疗后血清中Ad5/3-d24-GMCSF的存在

在用Ad5/3-d24-GMCSF治疗前，所有的患者对于Ad5/3-d24-GMCSF都是阴性的。在第1天，17/19患者在血清中具有可测量水平的病毒基因组，最高的滴度为2061VP/ml血清。从在第3-7天中所取的样品来看，12/15名患者是阳性的，最高的滴度是3，36x10⁵vp/ml血清。在治疗后直至第58天都见到了阳性样品(表9)。

V.治疗后血清中GMCSF和中和抗体的滴度

在Ad5/3-d24-GMCSF治疗后，在GMCSF的全身水平上没有显著的变化，这与在总白血细胞计数的水平上没见到显著的影响很好地相关联。这暗示着GMCSF的生产一般性地限制在肿瘤中病毒复制的局部位点。在一名患者(S 70)中，在第4天见到了血清中GMCSF的瞬时增加，伴以白血球计数的瞬时升高。这可能与有效的病毒复制相关，因为患者同时患有发烧并在血清中有3.36x10⁵vp/ml的病毒(表9)。此患者在追踪中没有经历任何严重的不良反应。然而，治疗后的CT扫描暗示抗肿瘤活性(SD)，并且在治疗后的4周中她感觉更好以及她持续的胸痛消失了。在此患者的血液中所测量的最高GMCSF浓度是115pg/ml，这大约比GMCSF在人中的有毒水平低10倍。

在基线，4/15的患者对于抗Ad 5/3的中和抗体完全是阴性的。另外两名患者具有勉强可检测的滴度(1-4)，而8名患者具有低的中和滴度(16-64)。在基线处，没有患者具有抗Ad 5/3的中等或高的中和滴度。在治疗之后，所述滴度在所有的患者中提高了(P＜0.005)(表9)。在中和抗体滴度和病毒剂量、抗肿瘤活性或毒性之间未见到清楚的关联。有趣地，关于血清中的病毒负荷，两名患者(Y62和O79)在基线处对于中和抗体是阳性的并且在2-4周中具有高的滴度，但是分别在至少第28天和第58天时其血清中仍存在可测量的病毒负荷(表9)。这表明甚至高抗体滴度也不能妨碍肿瘤中的病毒复制。有趣地，抗体滴度没有在所有的患者中达到最大值。例如，S 70，X122和H83在第1周具有大量的循环病毒而他们的抗体滴度缓慢地上升。

VI.杀死分化的肿瘤细胞

图9a-b中显示了在Ad5-D24-GM-CSF治疗之前和之后，患有卵巢癌的患者和患有间皮瘤的患者(见表1)的CT扫描。

VII.Ad5/3-D24-GMCSF的效力

在治疗之前，所有的患者均具有进展性的肿瘤。可以根据RECIST1.1就放射受益对12名患者进行评估(表9)。2名患者有轻微的应答，6名患者有稳定的疾病，和4名患者有进展性的疾病(PD)。因此，放射的临床受益率是67％。值得注意的是，H96中快速生长的胰腺肿瘤停止了生长但是在肺中出现了转移性的损害，因此被评为PD。类似地，患者O129的经注射的肿瘤具有6％的缩减，但是有新的转移。在患者V136(其患有两种转移性癌症)中，未经注射的肝损害消失了，而其它的肿瘤保持为SD。

关于肿瘤标志物，对于在基线处具有升高的标志物的患者进行了评估，2/6具有标志物水平的某些降低而4/6具有标志物水平的升高(表9)。

图14中显示了治疗后患者的整体存活。

除了客观地测量抗肿瘤活性之外，我们还在数例中见到了临床的和/或主观的益处(表9)。这些包括患者的整体健康改善了，明显感到肿瘤更柔软了和/或更小了以及由肿瘤引起的症状得到了缓解。重要的是，两名之前遭受腹水和/或胸腔积液快速积聚的患者，在病毒治疗后具有所述积聚的清楚的减少，此效果在两例中均持续了数月。

总体而言，在13/21患者(62％)中见到了抗肿瘤效力的迹象。

VIII.治疗的血液学效果

在Ad5/3-D24-GM-CSF治疗后研究了白血球、红细胞、Hb、血小板、胆红素、INR、ALT、AST、ALP、肌酸酐、K、Na、CRP、CA19-9、GT、纤维蛋白D-二聚体和CEA的水平(表3-4)。

IX.对于病毒的免疫应答

a)IL-6，IL-10，TNF-α和IL-8

腺病毒基因疗法的一个潜在的缺点是可能是免疫原性的病毒组分引起的其早期毒性并可能导致类脓毒症休克甚至死亡(Brunetti-Pierri等人Hum Gene Ther 15(2004)35-46；Raper等人Mol Gen Metab 80(2003)148-158)。因此，监测可能的细胞因子暴发的迹象是极端重要的，所述细胞因子暴发以后可发展为器官衰竭。为此，在治疗后不久并且在所示的时间点从患者中抽取血液并通过FACSARRAY(如在Cerullo等人的文章(2007，Mol Ther15，378-85)中所描述的)分析促炎性的细胞因子。在经Ad5-D24-GM-CSF治疗的患者中未见到明显的变化，这表明缺乏早期先天毒性。

对于缺乏与Ad5/3-D24-GM-CSF相关的早期先天毒性的结果，见表10。

b)诱导抗肿瘤的细胞毒性T细胞和抗肿瘤表位的特异性免疫性

溶瘤性的细胞死亡允许免疫系统获得识别和杀死肿瘤细胞的能力。这对于肿瘤的清除是潜在有益的并且可促进治愈。腺病毒在施用之后相对短的时间内从身体中被清除出去；因此，刺激免疫系统以能够识别特异性的肿瘤抗原有关键的重要性，从而所述治疗对于患者可引起持续的有益效果。此外，在抗体的存在下，病毒被中和，从而其可丧失其感染转移的效力。然而，抗肿瘤而被诱导的效应T细胞或NK细胞自由循环并最终消灭远离经注射的肿瘤的转移。为了表明表达GMCSF的腺病毒能够引起腺病毒和肿瘤特异性免疫性，通过INF-γELI SPOT分析收集自经治疗的患者的PBMC。以盲法(blinded fashion)的方式由外部的公司(Proimmune)进行ELI SPOT，对于所述外部公司没有提供关于患者经历的任何种类的治疗的信息。在图10a-d中显示了此分析的结果。清楚的是在相同的患者中，当用源自肿瘤抗原(存活素)或腺病毒(五邻体)的肽的集合刺激T细胞时，这些细胞被活化，因而产生INF-γ(I FN-γ是经刺激的T细胞的特异性活化标志物)。

图11显示了对腺病毒六邻体-特异性T细胞的诱导。在治疗前和治疗后，用CD 3、CD8和六邻体特异性四聚抗体对从用Ad5-D24-GMCSF治疗的患者收获的白细胞进行染色并通过流式细胞术进行分析。治疗将六邻体特异性细胞毒性T细胞从0.21％增加到了2.72％。

c)调节性T细胞的减少

之前的数据显示了不间断地施用环磷酰胺在实验室动物中减少了调节性T细胞(T-Reg)。

在所述Ad5-D24-GM-CSF治疗之前或之后接受了不间断的施用环磷酰胺的患者中利用了此方法，并在从这些患者中收获的PBMC上进行了T reg分析。在图12中所示的实例中，显示了来自患者R73的一个实例，其显示循环T reg的减少。从患者中收获总的PBMC并在适当的培养基中冷冻。在分析的时候，将所有的样品融化并首先用CD4和CD127抗体对其进行染色，然后使细胞透化并对于转录因子Foxp3进行染色。所产生的对于CD4为阳性、对于CD127为阴性并且Foxp3高的细胞被认为是有效的T调节细胞(T reg)(图12)。

实施例7.统计学分析

使用双侧t分布检验(two tailed Student’s t-test)来比较荧光素酶的活性，以及治疗前和治疗后的中和抗体滴度、细胞因子水平和GM-CSF浓度。用Kaplan-Meier分析处理存活数据。

表1.显示Ad 5-D24-GMCSF在经治疗的患者血清中存在的表

表2.总结由经Ad5-D24-GMCSF治疗的患者所报告的副作用的表

L (低剂量)＝同期组1剂量范围 8×10⁹≤D≤3.6×10¹⁰

M (中等剂量)＝同期组2剂量范围1×10¹¹≤D≤2.5×10¹¹

H (高剂量)＝同期组3剂量范围3×10¹¹≤D≤4×10¹¹

表3.施用Ad5-D24-GMCSF之后的血液学副作用

L(低剂量)＝同期组1剂量范围8×10⁹≤D≤3.6×10¹⁰

M (中等剂量)＝同期组2剂量范围1×10¹¹≤D≤2.5×10¹¹

H(高剂量)＝同期组3剂量范围3×10¹¹≤D≤4×10¹¹

表4.施用Ad5-D24-GMCSF之后肝的酶

L(低剂量)＝同期组1剂量范围8×10⁹≤D≤3.6×10¹⁰

M(中等剂量)＝同期组2剂量范围1×10¹¹≤D≤2.5×10¹¹

H (高剂量)＝同期组3剂量范围3×10¹¹≤D≤4×10¹¹

表5.在用不同剂量的Ad5-D24-GMCSF治疗的患者中Ad5-D24-GMCSF治疗的效力。根据RECIST标准进行分析。CR＝完全应答，PR＝部分应答，SD＝稳定的疾病，PD＝进展性疾病，NA＝不可获得。

表6.对于用于Ad5/3-D24-GM-CSF治疗的患者在基线处特性的总结。数字表示22名中的患者的数目。

性别	患者数目
		男性	11
女性	11
		WHO表现评分
中值	1
		范围	0-3
肿瘤类型
		胆管癌	1
胰腺癌	3
		结肠直肠癌	2
前列腺癌	2
		肺癌	1
卵巢癌	4
		黑色素瘤(脉络膜或皮肤)	3
头颈鳞状细胞癌	1
		肉瘤(骨、滑液或软骨)	3
子宫癌	1
		膀胱癌	1
间皮瘤	1
		以前的治疗
化学疗法	22
		根据患者的中间化学方案
放射疗法	6
		激素治疗	1
外科治疗	15
		Ad5/3中和抗体(基线)
阳性	11
		阴性	4
年龄	岁
		中值	61
平均	56
		范围	17-78

表8.不良反应。在Ad5/3-D24-GMCSF治疗后4周中根据CTCEAv.3.0标准对所有的22名患者就不良反应(AE)进行了评估。仅当在2名或更多的患者中存在时才报导1级AE。报导了所有的2-5级AE。数字表示22名中的患者数目。

Claims

1.溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，其包含：

腺病毒血清型5(Ad5)核酸骨架，

天然E1A启动子，

E1的Rb结合恒定区2中的24bp的缺失(D24)，

替代E3区中缺失的gp19k/6.7K的包含SEQ ID NO 7的核苷酸28380～28814、且编码人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的核酸序列，所述核酸序列在病毒E3启动子的控制之下，和

衣壳修饰，所述衣壳修饰是Ad5/3嵌合体，将整联蛋白结合(RGD)区和/或结合硫酸肝素的聚赖氨酸修饰插入纤毛中。

2.根据权利要求1的溶瘤性腺病毒载体，其特征还在于，其包含选自下列的一个或多个区域：E2、E4和晚期区域。

3.根据权利要求1的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于包括下列区域：左ITR、部分E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分E3、L5、E4和右ITR。

4.根据权利要求3的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，所述区域以顺次顺序在5’至3’的方向上。

5.根据权利要求1～4中任一项的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，野生型区域位于E1区的上游。

6.根据权利要求1～4中任一项的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，E1区包含病毒的包装信号。

7.根据权利要求2或3的溶瘤性腺病毒载体，其中E4区域是野生型的。

8.根据权利要求1的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，所述衣壳修饰是RGD-4C修饰。

9.根据权利要求1～4中任一项的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，包含至少一个表达盒。

10.根据权利要求1～4中任一项的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，仅包含一个表达盒。

11.根据权利要求1～4中任一项的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，所述载体能够在Rb通路中有缺陷的细胞中选择性地复制。

12.根据权利要求1～4中任一项的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，其作为原位癌症疫苗起作用。

13.细胞，其特征在于，包含根据权利要求1～12中任一项的腺病毒载体。

14.药物组合物，其特征在于，包含根据权利要求1～12中任一项的腺病毒载体。

15.根据权利要求14的药物组合物，其特征在于，其作为原位癌症疫苗起作用。

16.根据权利要求1～12中任一项的腺病毒载体在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗人受试者中的癌症或良性肿瘤。

17.根据权利要求16的用途，其特征在于，

所述癌症选自：肺癌、脑癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、乳腺癌、头癌、颈癌、眼癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、间皮瘤、软组织肉瘤、食管癌、胃癌及心脏癌，且

所述良性肿瘤选自胃肠道良性肿瘤。

18.根据权利要求17的用途，其特征在于，

所述肺癌是胸膜癌，

所述肝癌是肝细胞癌，

所述骨癌是骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤或佩吉特氏病，

所述胰腺癌是卓-艾氏综合征、内分泌胰腺癌、胰高血糖素瘤、胰岛素瘤或生长抑素瘤，

所述乳腺癌是催乳素瘤，

所述头癌或所述颈癌是鼻咽癌、喉癌、牙龈癌、唇癌、腭癌、耳下腺癌、咽癌、舌癌或扁桃体癌，

所述眼癌是成视网膜细胞瘤，

所述皮肤癌是黑色素瘤，

所述软组织肉瘤是滑膜癌、结缔组织癌或纤维肉瘤，及

所述胃癌是腹膜癌。

19.根据权利要求16的用途，其特征在于，所述癌症选自：胆管癌、胆囊癌、结直肠癌、肛门癌、小肠癌、肾癌、膀胱癌、输尿管癌、阴茎癌、绒毛膜癌、子宫颈癌、卵巢癌、滋养层癌、子宫内膜癌、阴道癌、嗜铬细胞瘤、肾上腺癌、甲状旁腺癌、垂体癌、胸腺癌、甲状腺癌、少突神经胶质瘤、成神经细胞瘤、脑膜瘤、脊髓肿瘤、维尔姆斯肿瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金氏(Hodgkin's)病、非-霍奇金氏(non-Hodgkin's)淋巴瘤、蕈样肉芽肿、T细胞白血病及多发性骨髓瘤。

20.根据权利要求16的用途，其特征在于，所述癌症选自：口腔癌、子宫癌、外阴癌、神经瘤、成血管细胞瘤病(von Hippel-Lindau disease)、未知的原发位点的癌、卡波西氏肉瘤及葡萄胎。

21.根据权利要求16的用途，其特征在于，所述癌症选自：结肠癌、直肠癌及听神经瘤。

22.根据权利要求16～21中任一项的用途，其特征在于，所述药物将通过肿瘤内、肌内、动脉内、静脉内、胸膜内、囊内、腔内或腹膜注射或者通过口服而被施用。

23.根据权利要求16～21中任一项的用途，其特征在于，将施用于受试者的溶瘤性腺病毒载体与较早治疗时的载体相比具有不同的衣壳纤毛节。

24.根据权利要求16～21中任一项的用途，其特征在于，所述药物将与并行的放射疗法和/或化学疗法的施用相结合。

25.根据权利要求16～21中任一项的用途，其特征在于，所述药物将与向受试者施用维拉帕米或另一种钙通道阻断剂、和/或诱导自我吞噬的试剂、和/或替莫唑胺、和/或化学疗法或抗CD20治疗或其它用于阻断中和抗体的方法、和/或能够下调受试者中的调节性T细胞的物质、和/或环磷酰胺相结合。

26.在人细胞中体外生产人GM-CSF的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)将包含根据权利要求1～12中任一项的溶瘤性腺病毒载体的媒介运送至人细胞，和

(b)在所述人细胞中表达所述载体的人GM-CSF。

27.根据权利要求1～12中任一项的溶瘤性腺病毒载体用于在人细胞中体外生产人GM-CSF的用途。