BRPI0924123B1 - vetores adenovirais oncolíticos, usos dos mesmos, composição farmacêutica e método para produzir gmcsf em uma célula in vitro - Google Patents

Abstract

VETORES ADENOVIRAIS ONCOLÍTICOS E MÉTODOS E USOS RELACIONADOS AOS MESMOS. A presente invenção refere-se aos campos de ciências da vida e medicina. Especificamente, a invenção refere-se a terapias de câncer. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a vetores adenovirais oncolíticos e células e composições farmacêuticas que compreendem os ditos vetores. A presente invenção refere-se também a um uso dos ditos vetores na fabricação de um medicamente para tratar câncer em um indivíduo e um método para tratar câncer e um indivíduo. Além disso, a presente invenção refere-se a métodos para produzir GM-CSF em uma célula e aumentar a resposta imune específica de tumor em um indivíduo, vem como usos do vetor adenoviral oncolítico da invenção para produzir GM-CSF em uma célula e aumentar a resposta imune específica de tumor em um indivíduo.

Description

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se aos campos de ciências da vida e medicina. Especificamente, a invenção refere-se a terapias de câncer. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a vetores adenovirais oncolíticos e células e composições farmacêuticas que compreendem os ditos vetores. A presente invenção refere-se também a um uso dos ditos vetores na fabricação de um medicamento para tratar câncer em um indivíduo e um método para tratar câncer em um indivíduo. Além disso, a presente invenção refere-se a métodos para produzir GM-CSF em uma célula e aumentar a resposta imune específica de tumor em um indivíduo, bem como uso do vetor adenoviral oncolítico da invenção para produzir GM-CSF em uma célula e aumentar a resposta imune específica de tumor em um indivíduo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] O câncer pode ser tratado com cirurgia, terapias hormonais, quimioterapias e/ou radioterapias, mas em muitos casos, os cânceres que são frequentemente caracterizados por um estágio avançado não podem ser curados com as terapêuticas atuais. Portanto, novas abordagens inusitadas assestadas contra células cancerosas, tais como terapias gênicas, são necessárias.

[0003] Durante os últimos vinte anos, a tecnologia de transferência de genes tem estado sob exame intensivo. A meta das terapias gênicas para câncer é introduzir um gene terapêutico dentro de uma célula tumorosa. Estes genes terapêuticos introduzidos em uma célula-alvo podem, por exemplo, corrigir genes mutados, suprimir oncogenes ativos ou gerar propriedades adicionais para a célula. Os genes terapêuticos exógenos apropriados incluem, porém sem limitações, genes imunoterápicos, antiangiogênicos, quimioprotetores e "suicidas", e eles podem ser introduzidos em uma célula utilizando vetores virais modificados ou métodos não virais que incluem eletroporação, arma de genes e revestimentos lipídicos ou poliméricos.

[0004] Os requisitos de vetores virais ótimos incluem uma capacidade eficiente para encontrar células-alvo específicas e expressar o genoma virai nas células-alvo. Além disso, os vetores ótimos têm de permanecer ativos nos tecidos ou células-alvo. Todas estas propriedades de vetores virais foram desenvolvidas durante as últimas décadas e, por exemplo, vetores virais adenovirais e adenoassociados foram amplamente estudados em biomedicina.

[0005] Para aperfeiçoar ainda mais a penetração no tumor e a amplificação local do efeito antitumoral, agentes seletivamente oncolíticos, por exemplo, adenovirus condicionalmente replicantes foram construídos. Os adenovirus oncolíticos são uma ferramenta promissora para tratamento de cânceres. As células tumorais são exterminadas por adenovirus oncolíticos devido a uma replicação do vírus em uma célula tumorosa, sendo que a última fase da replicação resulta em uma liberação de milhares de virions para dentro dos tecidos que circundam o tumor para penetração eficaz no tumor e reinfecção vascular. As células tumorais permitem a replicação do vírus enquanto que as células normais são poupadas devido a mudanças de engenharia genética no genoma do vírus, que impedem a replicação em células não tumorais.

[0006] Além da exterminação de células mediada pela replicação, os adenovirus oncolíticos podem ser também armados com diferentes transgenes terapêuticos. Esta abordagem combina as vantagens da distribuição de genes convencional com a potência de replicação de agentes competentes. Uma meta de armar vírus é a indução de uma reação imune contra as células que permitem a replicação do vírus. A replicação virai isoladamente, embora imunogênica, não é normalmente suficiente para induzir imunidade antitumoral eficaz. Para fortalecer a indução de imunidade terapêutica, os vírus podem ser armados com proteínas estimuladoras tais como citocinas para facilitação da introdução de antígenos de tumores em células apresentadoras de antígenos tais como células dendríticas, e sua estimulação e/ou maturação. A introdução de genes imunoterápicos dentro de células tumorais e, além disso, a tradução das proteínas, leva à ativação da resposta imune e destruição eficiente de células tumorais. As células imunes mais relevantes a este respeito são células exterminadoras naturais (NK) e células T CD8+ citotóxicas.

[0007] Os adenovirus são vírus icosaédricos não envelopados de tamanho médio (90-100 nm), que têm DNA linear de duplo filamento com cerca de 36 quilobases em pares em um capsídeo de proteína. O capsídeo virai tem estruturas fibrosas que participam na anexação do vírus à célula-alvo. Primeiramente, o domínio da região globular da proteína fibrosa se liga ao receptor da célula-alvo (por exemplo, CD46 ou receptor do adenovirus Coxsackie (CAR)); em segundo lugar, o vírus interage com uma molécula de integrina; e em terceiro lugar, o vírus é endocitosado dentro da célula-alvo. A seguir, o genoma virai é transportado dos endossomas para dentro do núcleo e o mecanismo de replicação da célula-alvo é utilizado também para propósitos virais (Russell, W. C., J. General Virol.81:2573-2604 (2000)).

[0008] O genoma adenoviral tem genes precoces (E1-E4), intermediários (IX e IVa2) e tardios (L1-L5), que são transcritos em ordem sequencial. Os produtos gênicos precoces afetam mecanismos de defesa, o ciclo celular e o metabolismo celular da célula hospedeira. Os genes intermediários e tardios codificam proteínas virais estruturais para a produção de novos virions (Wu e Nemerow, Trends Microbiol. 12:162-168 (2004); Russell, W. C., J. General Virol. 81:2573-2604 (2000); Volpers, C. e Kochanek, S., J. Gene Med. suplemento 6, S164- 71 (2004); Kootstra, N. A. e Verma, I. M., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43:413-439 (2003)).

[0009] Mais do que 50 sorotipos diferentes de adenovirus foram encontrados em seres humanos. Os sorotipos são classificados em seis subgrupos A-F e diferentes sorotipos reconhecidamente estão associados a diferentes condições, isto é, doenças respiratórias, conjuntivite, e gastroenterite. O sorotipo 5 de adenovirus (Ad5) reconhecidamente causa doenças respiratórias e ele é o sorotipo mais comum estudado no campo da terapia gênica. Nos primeiros vetores de Ad5 as regiões E1 e/ou E3 foram deletadas, permitindo a inserção de DNA estranho nos vetores (Danthinne e Imperiale, 2000). Além disso, as deleções de outras regiões bem como mutações adicionais proporcionaram suplementares para os vetores virais. Na realidade, várias modificações de adenovirus foram sugeridas para atingir efeitos antitumorais eficientes.

[00010] Por exemplo, a Patente EP 1377671 B1 (Cell Genesys, Inc.) e o pedido de Patente US 2003/0104625 A1 (Cheg, C. et al.) descrevem um vetor adenoviral oncolítico que codifica uma proteína imunoterápica, fator estimulante de colônias de granulócitos/macrófagos (GM-CSF). Além disso, a Publicação EP 1767642 A1 (Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd.) assinala vetores adenovirais oncolíticos que têm efeitos aperfeiçoados sobre a resposta imune humana.

[00011] Além disso, a transferência de genes mais eficiente e precisa, bem como maior especificidade e capacidade suficiente de exterminação de tumores são garantidas. Os registros de segurança dos vetores terapêuticos também devem ser excelentes. Apresente invenção fornece uma ferramenta terapêutica para câncer com estas propriedades supramencionadas utilizando propriedades oncolíticas e também imunoterápicas de adenovirus de uma maneira inovadora e inventiva.

Breve Descrição da Invenção

[00012] O objetivo da invenção é fornecer métodos inusitados e meios para atingiras propriedades supramencionadas de adenovirus, e assim sendo, solucionar os problemas de terapias de câncer convencionais. Mais especificamente, a invenção fornece métodos inovadores e meios para terapia gênica.

[00013] O presente Pedido de Patente descreve a construção de vetores virais recombinantes, métodos relacionados aos vetores, e seu uso em linhagens de células tumorais, modelos animais e pacientes de câncer.

[00014] A presente invenção refere-se a um vetor adenoviral oncolítico que compreende um esqueleto de ácido nucleico do sorotipo 5 de adenovirus (Ad5), uma deleção de 24 pb (D24) na região constante 2 de ligação Rb da E1 adenoviral e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um fator estimulante de colônias de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) no lugar da gp19k/6.7Kdeletada na região E3 adenoviral.

[00015] A presente invenção refere-se ainda a uma célula que compreende o vetor adenoviral da invenção.

[00016] A presente invenção refere-se também a uma composição farmacêutica que compreende o vetor adenoviral da invenção.

[00017] A presente invenção refere-se também a um uso do vetor adenoviral da invenção na fabricação de um medicamento para tratar câncer em um indivíduo.

[00018] A presente invenção refere-se ainda a um método para tratar câncer em um indivíduo, onde o método compreende a administração do vetor ou da composição farmacêutica da invenção a um indivíduo.

[00019] Além disso, a presente invenção refere-se ainda a um método para produzir GM-CSF em uma célula, onde o método compreende: (a) transportar um veículo que compreende um vetor adenoviral da invenção para uma célula, e (b) expressar GM-CSF do dito vetor na célula. Além disso, a presente invenção refere-se ainda a um método para aumentar a resposta imune específica de tumor em um indivíduo, onde o método compreende: (a) transportar um veículo que compreende um vetor adenoviral da invenção para uma célula ou tecido-alvo, (b) expressar GM-CSF do dito vetor na célula, e (c) aumentar a quantidade de células T citotóxicas e/ou células exterminadoras naturais na dita célula ou tecido-alvo.

[00020] Além disso, a presente invenção refere-se também a um uso do vetor adenoviral oncolítico da invenção para produzir GM-CSF em uma célula.

[00021] Além disso, a presente invenção refere-se ao vetor adenoviral oncolítico da invenção para produzir GM-CSF em uma célula.

[00022] Além disso, a presente invenção refere-se também a um uso do vetor adenoviral oncolítico da invenção para aumentar a resposta imune específica de tumor em um indivíduo.

[00023] Além disso, a presente invenção refere-se ao vetor adenoviral oncolítico da invenção para aumentar a resposta imune específica de tumor em um indivíduo.

[00024] A presente invenção fornece uma ferramenta para o tratamento de cânceres que são refratários às abordagens atuais. Além disso, restrições quanto aos tipos de tumores apropriados para tratamento permanecem sendo poucas em comparação com muitos outros tratamentos. De fato, todos tumores sólidos podem ser tratados com a invenção proposta. Tumores maiores em massa e tumores mais complexos podem ser curados pela presente invenção. O tratamento pode ser dado por via intratumoral, intracavitária, intravenosa e uma combinação destas. A abordagem pode proporcionar eficácia sistêmica apesar da injeção local. A abordagem pode também erradicar células propostas como iniciadoras de tumores ("células-tronco cancerosas").

[00025] Além de possibilitar o transporte do vetor para o local de interesse, o vetor da invenção também assegura a expressão e persistência do transgene. Além disso, a resposta imune contra o vetor bem como o transgene é minimizada.

[00026] A presente invenção soluciona um problema relacionado à resistência terapêutica de tratamentos convencionais. Além disso, a presente invenção fornece ferramentas e métodos para tratamentos seletivos, sem toxicidade ou danos nos tecidos sadios. As vantagens da presente invenção incluem também efeitos colaterais diferentes e reduzidos em comparação com outras terapêuticas. O importante é que a abordagem é sinérgica com muitas outras formas de terapia, incluindo quimioterapia e terapia de radiação, e pode, portanto, ser usada em esquemas combinados.

[00027] A indução de uma resposta imune contra células que permitem a replicação de vírus desarmados não é normalmente intensa o suficiente para levar ao desenvolvimento de imunidade tumoral terapêutica. Para superar esta fraqueza, a presente invenção fornece vírus armados com um indutor potente de imunidade antitumoral. A presente invenção consegue terapia de câncer, onde as células tumorais são destruídas por oncólise causada por virions. Além disso, vários mecanismos diferentes, que ativam a resposta imune humana, incluindo a ativação de células exterminadoras naturais (NK) e células densdríticas (DC), são influenciados.

[00028] Em comparação com as ferramentas adenovirais das técnicas anteriores, a presente invenção fornece uma ferramenta mais simples, mais eficaz, econômica, atóxica e/ou mais segura para a terapia de câncer. Além disso, vírus auxiliares não são necessários.

[00029] Os produtos inovadores da invenção possibilitam aperfeiçoamentos adicionais na terapia de câncer;

Breve Descrição das Figuras

[00030] A figura 1 ilustra um esquema de pAd5-D24-GMCSF. O vírus porta uma deleção de 24 pares de bases na região constante 2 de E1 A, gp19K e 6,7K em E3 foram substituídos pelo cDNA de GM-CSF humano. ADP refere-se à proteína de morte do adenovirus.

[00031] A figura 2 ilustra um esquema da primeira etapa de clonagem para gerar o plasmídeo de ponte (pTHSN) portador de GM-CSF.

[00032] A figura 3 ilustra um esquema da segunda etapa de clonagem para gerar o plasmídeo que contém todos os genes adenovirais com deleção de 24 pares de bases na região E1 (que medeia a replicação seletiva em células cancerosas).

[00033] A figura 4 ilustra um esquema da terceira etapa de clonagem para gerar o plasmídeo que contém os genes adenovirais exceto por gp19K e 6.7K que foram substituídos por GM-CSF (pAd5D24-GM-CSF (SEQ ID NO: 8)). Ad5-RGD-D24-GMCFS (SEQ ID NO: 9), Ad5/3-D24- GMCSF (SEQ ID NO: 7) e Ad5-pK7-D24-GMCSF (SEQ ID NO: 10) foram criados similarmente.

[00034] As figuras 5a-d ilustram que a expressão de GMCSF não prejudica a replicação do vírus e o efeito exterminador de células. A figura 5a representa os resultados do ensaio MTS que ilustra a eficiência exterminadora de células derivadas do câncer pulmonar (A549) do novo vírus gerado, Ad5-D24-GMCSF. A figura 5b representa os resultados do ensaio MTS que ilustra a exterminação de células iniciadoras de câncer JIMT-1 ("células-tronco de câncer") com Ad5-D24-GMCSF. A figura 5c representa os resultados do ensaio MTS que ilustra a eficiência exterminadora de células do câncer de mama (MDA-MB-436) do novo vírus gerado Ad5-D24-GMCSF. A figura 5d representa os resultados do ensaio MTS que ilustra a eficiência exterminadora de MDA-MB-436 dos novos vírus gerados Ad5-D24-GMCSF, Ad5-RGD-D24-GMCSF e Ad5/3-D24-GMCSF.

[00035] A figura 6a ilustra a expressão acoplada ao adenovirus de GMCSF humano. A linhagem de células A549 foi infectada com Ad5D24 ou Ad5D24-GMCSF, o meio foi coletado no decurso do tempo e analisado quanto à expressão de GMCSF por FACSARRAY.

[00036] A figura 6b ilustra que GMCSF expressado em adenovirus retém sua atividade biológica em linfócitos humanos. Células TF1, que requerem GMCSF humano para permanecerem vivas, foram cultivadas na presença de GMCSF recombinante humano (produzido em E. coli, adquirido da Sigma) ou sobrenadante de células infectadas com Ad5- D24-GMCSF.

[00037] As figuras 7a e 7b ilustram a análise in vitroda transdução de um tumor de paciente para testar a infecciosidade de um vírus baseado em Ad5.

[00038] A figura 7c ilustra uma previsão da transdução de tumor com Ad5-D25-GMCSF corando seu receptor CAR (receptor do adenovirus Coxsackie) em espécimes de tumor arquivai.

[00039] A figura 8a ilustra a eficiência in vivo de Ad5-D24-GMCSF em hamsters Sírios (permissivos para replicação de adenovirus humano) portadores de tumores de câncer pancreático. Ad5D24 e também Ad5-D24-GMCSF erradicam os tumores dentro de 16 dias após os tratamentos. 1 x 109 VP do vírus foram administradas nos dias 0, 2 e 4.

[00040] A figura 8b ilustra que a injeção intratumoral de Ad5-D24- GMCSF resultou em altos níveis de hGMCSF no soro de Hamsters Sírios. Os animais tratados com Ad5-D24E3 ou Ad5-D24-GMCSF foram amostrados no dia 4 e a concentração de GMCSF humano no soro foi avaliada por FACSARRAY.

[00041] A figura 8c ilustra que a cura de tumores HapT1 com Ad5- D24-GMCSF (mas não com Ad5D24) protegeu Hamsters Sírios de subsequente novo desafio com HapT1. Isto demonstra que Ad5-D24- GMCSF pode induzir uma resposta imune específica de tumor. Os animais previamente tratados com Ad5D24 ou Ad5-D24-GMCSF (figura 8a) foram desafiados novamente com o mesmo tumor e o crescimento do tumor foi medido no decorrer do tempo.

[00042] A figura 8d ilustra a indução de uma resposta imune específica de tumor por Ad5-D24-GMCSF, cura de tumores HapT 1 com Ad5-D24-GMCSF não protegeu Hamsters Sírios contra tumores Hak. Os animais com tumores HapT1 previamente tratados com Ad5D24 ou Ad5-D24-GMCSF (figura 8a) foram desafiados novamente com um tumor diferente e o crescimento do tumor foi medido no decorrer do tempo.

[00043] A figura 9a ilustra a eficácia de Ad5-D24-GMCSF em combinação com ciclofosfamida oral metronômica. Uma redução de 88% do tumor foi observada por varredura com TC 71 dias após o início do tratamento.

[00044] A figura 9b ilustra a eficácia do tratamento com Ad5-D24- GMCSF em uma paciente com câncer ovariano tratada com Ad5-D24- GMCSF. A varredura por TC indicou desparecimento completo de todos os tumores mensuráveis medido pela seta.

[00045] As figuras 10a-d ilustram que Ad5-D24-GMCSF eliciou uma resposta de células T contra epítopos tumorais e adenovirus (presente em células tumorais). As células T colhidas dos pacientes tratados com Ad5-D24-GMCSF foram analisadas por IFN-gama ELISPOT após estímulo com uma mistura de peptídeo do adenovirus 5 e uma mistura de peptídeo do antígeno tumoral survivina.

[00046] A figura 11 ilustra a indução de células T específicas da hexona de adenovirus. Os leucócitos colhidos de pacientes tratados com Ad5-D24-GMCSF foram corados com CD3, CD8 e anticorpos do tetrámero específico da hexona e analisados por citometria de fluxo antes e depois do tratamento. O tratamento aumentou células T citotóxicas específicas de hexona de 0,21 para 2,72%.

[00047] A figura 12 ilustra uma redução de células T reguladoras circulantes no paciente R73. As PBMCs que são positivas para CD4, negativas para CD127, mas altas em Foxp3 são consideradas células T reguladoras eficazes.

[00048] As figuras 13a-i ilustram o esquema de clonagem para gerar plasmídeo de ponte (pTHSN) portador de GMCSF, para gerar o plasmídeo que contém todos os genes adenovirais com a deleção de 24 pares de bases na região E1 (que medeia a replicação seletiva em células cancerosas) e para gerar o plasmídeo Ad5/3-D24-GMCSF que contém todos os genes adenovirais exceto gp19k e 6.7K que foram substituídos por GM-CSF (pAd5D24-GMCSF).

[00049] A figura 14 ilustra uma sequência de nucleotídeos de Ad5/3- D24-GMCSF. A região em negrito indica a região E1A deletada de D24 (nucleotídeos 563-1694). A região sublinhada indica GMCSF (nucleotídeos 28380-28814). A região em itálico indica a região globular de Ad3 (nucleotídeos 31701-32272). A sequência da figura corresponde à sequência SEQ ID NO: 7.

[00050] A figura 15 ilustra a plotagem da sobrevivência para pacientes tratados com Ad5/3-D24-GMCSF.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Vetor Adenoviral

[00051] Em Ad5, bem como em outros adenovirus, um capsídeo icosaédrico consiste em três proteínas principais: hexona (II), base pentona (III), e uma fibra com defeito de acrossoma (IV), junto com proteínas minoritárias: VI, VIII, IX, IIla, e IVa2 (Russell, W. C., J. General Virol. 81:2573-2604 (2000)). As proteínas VII, peptídeo mu pequeno, e uma proteína terminal (TP) estão associadas com DNA. A proteína V fornece uma ligação estrutural ao capsídeo por intermédio da proteína VI. A protease codificada pelo vírus é necessária para processar algumas proteínas estruturais.

[00052] O vetor adenoviral oncolítico da presente invenção baseia- se em um esqueleto de ácidos nucleicos do sorotipo 5 de adenovirus (Ad5), uma deleção de 24 pb (D24) na região constante 2 de ligação de Rb (CR2) de E1 adenoviral e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um fator estimulante de colônias de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) no lugar das gp19k/6.7K deletadas na região E3 adenoviral (Figura 1). Em uma modalidade preferida da invenção, o vetor adenoviral baseia-se em um adenovirus humano.

[00053] O genoma de Ad5 contém genes precoces (E1-4), intermediários (IX e IVa2 e tardios (L1-5) flanqueados por repetições terminais invertidas esquerda e direita (LITR e RITR, respectivamente), que contêm as sequências necessárias para a replicação do DNA. O genoma contém também sinal de empacotamento (ψ) e promotor tardio principal (MLP).

[00054] A transcrição do gene precoce E1A inicia o ciclo de replicação, e em seguida, expressão de E1B, E2A, E2B, E3 e E4. As proteínas E1 modulam o metabolismo celular de uma maneira que torna uma célula mais suscetível à replicação do vírus. Por exemplo, elas interferem com as proteínas NF-KB, p53 e pRb. E1A e E1B funcionam em conjunto para inibir a apoptose. Os produtos gênicos E2 (E2A e E2B) e E4 medeiam a replicação do DNA e os produtos E4 efetuam também o metabolismo do RNA virai e impedem a síntese de proteína hospedeira. Os produtos gênicos E3 são responsáveis por defender contra o sistema imunológico hospedeiro, intensificar a lise celular, e liberar a progénie do vírus (Russell, W. C., J. General Virol.81:2573- 2604 (2000)).

[00055] Os genes intermediários IX e IVa2 codificam proteínas menores do capsideo viral. A expressão dos genes tardios L1-5, que levam à produção dos componentes estruturais do vírus, a encapsidação e maturação de partículas virais no núcleo, é influenciada por MLP (Russell, W. C., J. General Virol.81:2573-2604 (2000)).

[00056] Em comparação com um genoma de adenovirus do tipo selvagem, o vetor adenoviral da invenção carece de 24 pares de bases de CR2 na região E1, especificamente na região E1A, gp19k e 6.7K na região E3. Em uma modalidade preferida da invenção, além das regiões parciais E1 e E3, o vetor adenoviral oncolítico da invenção compreende ainda uma ou mais regiões selecionadas no grupo que consiste em E2, E4, a regiões tardias. Em uma modalidade preferida da invenção, o vetor adenoviral oncolítico compreende as seguintes regiões: uma ITR esquerda, E1 parcial, pIX, PIVa2, E2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4 E3 parcial, L5, E4 e uma ITR direita. As regiões podem estar em qualquer ordem no vetor, mas em uma modalidade preferida da invenção, as regiões estão em uma ordem sequencial na direção de 5' para 3'. Os quadros de leitura aberta (ORFs) podem estar no mesmo filamento do DNA ou em filamentos de DNA diferentes. Em uma modalidade preferida da invenção, a região E1 compreende um sinal de empacotamento virai.

[00057] Como aqui utilizada, a expressão "esqueleto de ácidos nucleicos do sorotipo 5 de adenovirus (Ad5) refere-se ao genoma ou genoma parcial de Ad5, que compreende uma ou várias regiões selecionadas no grupo que consiste em E1 parcial, pIX, PIVa2, E2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4, E3 parcial, L5, e E4 de origem Ad5. Um vetor preferido da invenção compreende o esqueleto de ácidos nucleicos de Ad5. Em outro vetor preferido, o esqueleto de ácidos nucleicos adenoviral é mormente derivado de Ad5 e combinado com uma parte (por exemplo, uma parte da estrutura capsídica) de Ad3.

[00058] Como aqui utilizado, o termo região "parcial"refere-se a uma região que carece de qualquer parte em comparação com uma região do tipo selvagem correspondente. "E1 parcial"refere-se à região E1 com D24 e "E3 parcial"refere-se à região E3 sem gp19k/6.7K.

[00059] Como aqui utilizados, os termos "VA1" e "VA2"referem-se aos RNAs 1 e 2 associados ao vírus, que são transcritos pelo adenovirus, mas não são traduzidos. VA1 e VA2 têm um papel em combater mecanismos de defesa celulares.

[00060] Como aqui utilizada, a expressão "um sinal de empacotamento virai"refere-se a uma parte do DNA virai que consiste em uma série de sequências ricas em AT e dirige o processo de encapsidação.

[00061] A deleção de 24 pares de bases (D24) de E1 afeta o domínio CR2 que é responsável pela ligação da proteína reguladora do ciclo celular/supressora de tumor Rb, e assim sendo permite a indução da fase de síntese (S), isto é, a síntese de DNA ou fase de replicação. A interação de pRb e E1A requer oito aminoácidos 121 a 127 da região conservada da proteína E1 (Helse, C. et al., Nature Med.6:1134-1139 (2000)), que são deletados na presente invenção. O vetor da presente invenção compreende uma deleção de nucleotídeos correspondentes aos aminoácidos 122-129 do vetor de acordo com Helse, C. et al., (Nature Med.6:1134-1139 (2000)). Os vírus com D24 reconhecidamente têm uma capacidade reduzida de superar o ponto de controle e replicar eficientemente apenas em células nas quais esta interação não é necessária, por exemplo, em células tumorais defeituosas na via de Rb-p6 (Helse, C. et al., Nature Med.6:1134-1139 (2000); Fueyo, J. et al., Oncogene 19:2-12 (2000)).

[00062] A região E3 não é essencial para a replicação viral in vitro, mas as proteínas E3 têm um papel importante na regulação da resposta imune do hospedeiro, isto é, na inibição de respostas imunes inatas e específicas. A deleção de gp19k/6.7K em E3 refere-se a uma deleção de 965 pares de bases da região E3 não virai. Em uma construção adenoviral resultante, os genes gp19k e 6.7K são deletados (Kanerva, A. et al., Gene Therapy12:87-94 (2005)). O produto gênico gp19k reconhecidamente se liga e sequestra moléculas do complexo de histocompatibilidade principal I (MHC1) no retículo endoplasmático, e impedir o reconhecimento de células infectadas por linfócitos T citotóxicos. Como muitos tumores são deficientes em MHC1, a deleção de gp19k aumenta a seletividade pelo tumor dos vírus (o vírus é depurado de células normais mais rapidamente do que o vírus do tipo selvagem, mas não há diferença em células tumorais). As proteínas 6.7K são expressadas sobre as superfícies celulares e eles tomam parte na regulação descendente de apoptose relacionado a TNF que induz o receptor 2 do ligante (TRAIL).

[00063] Na presente invenção, o transgene de GM-CSF está colocado dentro de uma região E3 deletada de gp19k/6.7K, sob o promotor de E3. Isto restringe a expressão do transgene em células tumorais que permitem a replicação do vírus e subsequente ativação do promotor de E3. O promotor de E3 pode ser qualquer promotor exógeno ou endógeno conhecido nessas técnicas, de preferência promotor endógeno. Em uma modalidade preferida da invenção, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica GM-CSF está sob o controle do promotor de E3 virai.

[00064] GM-CSF participa na resposta imune atuando através de vários mecanismos incluindo o recrutamento de células exterminadoras naturais (NK) e estimulação de células apresentadoras de antígenos (APC). APC pode então recrutar, ativar e assestar células T na direção do tumor. A sequência de nucleotídeos que codifica GM-CSF pode ser de qualquer animal, tal como um ser humano, símio, rato, camundongo, hamster, cão ou gato, mas de preferência GM-CSF é codificado por uma sequência humana. A sequência de nucleotídeos que codifica GM-CSF pode ser modificada para melhorar os efeitos de GM-CSF, ou não modificada, isto é, de um tipo selvagem. Em uma modalidade preferida da invenção, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica GM-CSF é de um tipo selvagem.

[00065] O vetor da invenção pode compreender também outras modificações diferentes de deleções parciais de CR2 e E3 e inserção da sequência de GM-CSF mencionada acima. Em uma modalidade preferida da invenção, todas as outras regiões do vetor de Ad5 são de um tipo selvagem. Em outra modalidade preferida da invenção, a região E4 é de um tipo selvagem. Em uma modalidade preferida da invenção, uma região do tipo selvagem fica localizada a montante da região E1. O termo "a montante"refere-se a imediatamente antes da região E1 na direção de expressão. A região E1B também pode ser modificada no vetor da invenção.

[00066] A inserção de elementos exógenos pode intensificar os efeitos de vetores em células-alvo. O uso de tecido exógeno ou promotores específicos de tumores é comum em vetores adenovirais recombinantes e pode ser também utilizado na presente invenção. Por exemplo, a replicação virai pode ser restrita a células-alvo, por exemplo, por promotores que incluem, porém sem limitações, CEA, SLP, Cox-2, Midkine, hTERT, variantes de hTERT, E2F, variantes de E2F, CXCR4, SCCA2 e TTS. Eles são usualmente adicionados para controlar a região E1A, mas adicionalmente ou alternativamente, outros genes tais como E1B ou E4 também podem ser regulados. Isolantes exógenos, isto é, elementos bloqueadores contra intensificadores inespecíficos, a ITR esquerda, o promotor de E1A nativo ou proteínas cromatinas também podem ser incluídas em vetores adenovirais recombinantes. Quaisquer componentes ou modificações adicionais podem ser opcionalmente usados, mas não obrigatoriamente nos vetores da invenção.

[00067] Mais adultos foram expostos ao sorotipo de adenovirus Ad5 mais amplamente usado, e portanto, o sistema imunológico pode produzir rapidamente anticorpos neutralizadores (NAb) contra eles. De fato, a prevalência do NAb anti-Ad5 pode ser de até 50%. Demonstrou- se que NAb pode ser induzido contra a maioria das proteínas imunogênicas múltiplas do capsídeo adenoviral, e por outro lado, demonstrou-se que mesmo pequenas mudanças na região globular da fibra podem escapar da NAb específico do capsídeo. A modificação da região globular é, portanto, importante para reter ou aumentar a distribuição de genes no contato do uso adenoviral em seres humanos.

[00068] Além disso, Ad5 reconhecidamente se liga ao receptor denominado CAR por intermédio da parte da região globular (knob)da fibra, e modificações desta parte da região globular ou fibra podem melhorar a entrada para a célula-alvo e causar oncólise intensificada em alguns cânceres (Ranki, T., et al., Int. J. Cancer 121:165-174 (2007)). Na realidade, os adenovirus modificados no capsídeo são ferramentas vantajosas para melhor distribuição de genes para células cancerosas.

[00069] Em uma modalidade da invenção, o vetor adenoviral oncolítico compreende uma modificação capsídica. Como aqui utilizado, o termo "capsídeo"refere-se à casca da proteína do vírus, que inclui hexona, fibra e/ou proteínas base pentonas conhecidas nessas técnicas, o que melhora a distribuição do vírus para a célula tumorosa, pode ser utilizada na presente invenção. As modificações podem ser modificações genéticas e/ou físicas e incluem, porém sem limitações, modificações para incorporar ligantes, que reconhecem receptores celulares específicos e/ou bloqueiam a ligação do receptor nativo, para substituir a fibra ou domínio da região globular (knob) de um vetor adenoviral por uma região globularde outro adenovirus (quimerimo) e para adicionar moléculas específicas (por exemplo, FGF2) aos adenovirus. Portanto, as modificações capsídicas incluem, porém sem limitações, a incorporação de pequenos modelos peptídicos, peptídeos, quimerismos ou mutações dentro da fibra (por exemplo, dentro da parte da região globular, cauda ou eixo, hexona e/ou base pentona. Em uma modalidade preferida da invenção, a modificação capsídica é quimerismo de Ad5, inserção de uma região ligante de integrina (RGD) e/ou modificação de polilisina ligante de sulfato de heparina dentro da fibra. Em uma modalidade específica da invenção, a modificação capsídica é quimerismo de Ad5.

[00070] Como aqui utilizado, o termo "quimerismo de Ad5/3" do capsídeo refere-se a um quimerismo, onde a parte da região globularda fibra é do sorotipo 3 de Ad, e o resto da fibra é do sorotipo 5 de Ad.

[00071] Como aqui utilizado, o termo "região RGD"refere-se ao motivo de arginina/glicina/ácido aspártico (RGD) que fica exposto sobre a base pentona e interage com integrinas de av celular que suportam a internalização de adenovirus. Em uma modalidade preferida da invenção, a modificação do capsídeo é uma modificação RGD-4C. "Modificação RGD-4C"refere-se a uma inserção de um modelo RGD- 4C ligante de integrina na alça Hl do domínio da região globular da fibra. 4C refere-se às quatro cisteínas que formam pontes de enxofre em RGD-4C. A construção do gene da fibra de Ad5 recombinante que codifica a fibra cm o peptídeo RGD-4C está descrita detalhadamente, por exemplo, no artigo de Dmitriev, I. et al., (Journal of Virology72:9706- 9713 (1998)).

[00072] Como aqui utilizada, a expressão "modificação de polilisina ligante de sulfato de heparina"refere-se à adição de um prolongamento de sete lisinas ao terminal C da região globular da fibra.

[00073] Cassetes de expressão são usados para expressar transgenes em um alvo, tal como uma célula, utilizando vetores. Como aqui utilizado, o termo "cassete de expressão"refere-se ao vetor de DNA ou uma parte dele que compreende sequências de nucleotídeos que codificam cDNAs ou genes, e sequências de nucleotídeos que controlam e/ou regulam a expressão dos ditos cDNAs ou genes. Cassetes de expressão similares ou diferentes podem ser inseridos em um vetor ou vários vetores diferentes. Os vetores de Ad5 da presente invenção podem compreender um ou vários cassetes de expressão. Entretanto, apenas um cassete de expressão é adequado. Em uma modalidade preferida da invenção, o vetor adenoviral oncolítico compreende pelo menos um cassete de expressão. Em uma modalidade preferida da invenção, o vetor adenoviral oncolítico compreende apenas um cassete de expressão.

[00074] Uma célula que compreende o vetor adenoviral da invenção pode ser qualquer célula tal como uma célula eucariótica, célula bacteriana, célula animal, célula humana, célula de camundongo, etc. Uma célula pode ser uma célula in vitro, ex vivo ou in vivo. Por exemplo, a célula pode ser usada para produzir o vetor adenoviral in vitro, ex vivo ou in vivo, ou a célula pode ser um alvo, tal como uma célula de tumor que foi infectada com o vetor adenoviral.

[00075] Em um método para produzir GM-CSF em uma célula, urn veículo que compreende o vetor da invenção é transportado para dentro de uma célula, e, além disso, o gene de GM-CSF é expressado e a proteína é traduzida e secretada de uma maneira parácrina. Um "veículo" pode ser qualquer vetor virai, plasmídeo ou outra ferramenta, tal como uma partícula, que é capaz de distribuir o vetor da invenção para uma célula-alvo. Qualquer método convencional nessas técnicas pode ser usado para distribuir o vetor para a célula.

[00076] A resposta imune específica de tumor pode ser aumentada em um indivíduo pela presente invenção. Células T citotóxicas e/ou células exterminadoras naturais são estimuladas, produzidas e assestadas como uma consequência da expressão de GM-CSF. Em uma modalidade preferida da presente invenção, a quantidade de células exterminadoras naturais e/ou T citotóxicas é aumentada em uma célula ou tecido-alvo. Para acompanhar ou estudar os efeitos da invenção, vários marcadores de resposta imune (por exemplo, marcadores inflamatórios) podem ser determinados. Os marcadores mais comuns incluem, porém sem limitações, aumentar citocinas pró- inflamatórias, células T citotóxicas específicas de tumor ou adenovirus, recrutamento e ativação de células apresentadoras de antígenos ou aumento no tamanho de nodos linfáticos locais. Os níveis destes marcadores podem ser estudados de acordo com quaisquer métodos convencionais conhecidos nessas técnicas, incluindo, porém sem limitações, aqueles que utilizam anticorpos, sondas, iniciadores, etc., tal como o ensaio ELISPOT, análise de tetrâmeros, análise de pentâmeros, e análise de diferentes tipos de células no sangue ou em tumores.

Câncer

[00077] Os vetores de Ad5 recombinantes da invenção têm sido construídos para competência de replicação em células, que têm defeitos na via de Rb, especificamente na via de Rb-p16. Estas células defeituosas incluem todas células tumorais em animais e seres humanos (Sherr, C. J., Science 274:1672-1677 (1996)). Em uma modalidade preferida da invenção, o vetor é capaz de replicar seletivamente em células que têm defeitos na via de Rb. Como aqui utilizada, a expressão "defeitos na via de Rb"refere-se a mutações e/ou mudanças epigenéticas em quaisquer genes ou proteínas da via. Devido a estes defeitos, as células tumorais superexpressam E2F, e assim sendo, a ligação de Rb por E1A CR2, que é normalmente necessária para a replicação eficaz, não é necessária.

[00078] Quaisquer cânceres ou tumores, incluindo tumores malignos e benignos, bem como tumores primários e metástase podem ser alvos de terapias gênicas. Em uma modalidade específica da invenção, o câncer é qualquer tumor sólido. Em uma modalidade preferida da invenção, o câncer é selecionado no grupo que consiste em câncer nasofaríngeo, câncer sinovial, câncer hepatocelular, câncer renal, câncer de tecidos conjuntivos, melanoma, câncer pulmonar, câncer intestinal, câncer colônico, câncer retal, câncer colorretal, câncer cerebral, câncer de garganta, câncer oral, câncer hepático, câncer ósseo, câncer pancreático, coriocarcinoma, gastrinoma, feocromocitoma, prolactinoma, leucemia/linfoma de células T, neuroma, doença de Von Hippel-Lindau, síndrome de Zollinger-Ellison, câncer adrenal, câncer anal, câncer de dutos biliares, câncer de bexiga, câncer de ureter, câncer cerebral, oligodendroglioma, neuroblastoma, meningioma, tumor do cordão espinhal, câncer ósseo, osteocondroma, condrossarcoma, sarcoma de Ewing, câncer de local primário desconhecido, carcinoide, carcinoide do trato gastrointestinal, fibrossarcoma, câncer mamário, doença de Paget, câncer cervical, sarcoma de Kaposi, câncer prostático, câncer pulmonar, câncer testicular, doença de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, câncer oral, câncer de pele, mesotelioma, mieloma múltiplo, câncer ovariano, câncer pancreático endócrino, glucagonoma, câncer pancreático, câncer paratireoide, câncer peniano, câncer hipofisário, sarcoma de tecidos moles, retinoblastoma, câncer do intestino delgado, câncer estomacal, câncer tímico, câncer tireóideo, câncer trofoblástico, mola hidatiforme, câncer uterino, câncer endometrial, câncer de vagina, câncer da vulva, neuroma acústico, micose fungoide, insulinoma, síndrome carcinoide, somatostatinoma, câncer das gengivas, câncer cardíaco, câncer labial, câncer de membranas, câncer bucal, câncer de nervos, câncer de palato, câncer da glândula parótida, câncer do peritônio, câncer da faringe, câncer pleural, câncer das glândulas salivares, câncer lingual, câncer tonsilar.

Composição Farmacêutica

[00079] Uma composição farmacêutica da invenção compreende pelo menos um tipo dos vetores da invenção. Além disso, a composição pode compreende pelo menos dois, três ou quatro vetores diferentes da invenção. Além do vetor da invenção, uma composição farmacêutica pode compreender também quaisquer outros vetores, tais como vetores adenovirais, outros agentes terapeuticamente eficazes, quaisquer outros agentes tais como veículos farmaceuticamente aceitáveis, tampões, excipientes, adjuvantes, antissépticos, agentes de enchimento, estabilizadores ou espessantes e/ou quaisquer componentes encontrados normalmente em produtos correspondentes.

[00080] A composição farmacêutica pode estar em qualquer forma, tal como na forma sólida, semissólida, ou líquida, apropriada para administração. Uma formulação pode ser selecionada no grupo que consiste em, porém sem limitações, soluções, emulsões, suspensões, comprimidos, péletes e cápsulas.

[00081] Em uma modalidade preferida da invenção, o vetor adenoviral oncolítico ou composição farmacêutica atua como uma vacina de câncer in situ.Como aqui utilizado, o termo "vacina de câncer in situ"refere-se a uma vacina de câncer que extermina células tumorais e também aumenta a resposta imune contra células cancerosas. A replicação do vírus é um forte sinal de perigo para o sistema imunológico (= necessário para uma resposta tipo TH1), e assim sendo, atua como um fenômeno coestimulante poderoso para maturação e ativação de APCs mediadas por GM-CSF, e o recrutamento de células NK. A lise de células tumorais também ajuda a apresentar fragmentos e epítopos de tumores para APCs e, além disso, coestimulaçâo é produzida por inflamação. Assim sendo, uma resposta independente de epítopo (isto é, não restrita a HLA) é produzida no contexto de cada tumor e, portanto, ocorre in situ.A resposta imune específica de tumor é ativada na célula- alvo bem como nas células circundantes, por exemplo, no tecido-alvo.

[00082] A dose eficaz de vetores depende de pelo menos um fator entre o indivíduo necessitado de tratamento, tipo de tumor, localização do tumor e estágio do tumor. A dose pode variar, por exemplo, entre cerca de 10e8 partículas virais (VP) e cerca de 10e14 VP, de preferência entre cerca de 5x10e9 VP e cerca de 10e13 VP, e mais preferivelmente, entre cerca de 8x10e9 VP e cerca de 10e12 VP. Em uma modalidade específica da invenção, a dose fica na faixa de cerca de 5x10e10 - 5x10e11 VP.

[00083] As composições farmacêuticas podem ser produzidas por quaisquer processos convencionais conhecidos nessas técnicas, por exemplo, utilizando qualquer um entre os seguintes: batelada, batelada alimentada, e modos de cultura por perfusão, purificação por cromatografia de coluna, purificação com gradiente de CsCI e modos de perfusão com dispositivos de retenção de células sob baixo cisalhamento.

Administração

[00084] O vetor ou composição farmacêutica da invenção pode ser administrada a qualquer indivíduo eucariótico selecionado no grupo que consiste em plantas, animais, e seres humanos. Em uma modalidade preferida da invenção, o indivíduo é um ser humano ou animal. Um animal pode ser selecionado no grupo que consiste em animais de estimação, animais domésticos, e animais de criação.

[00085] Qualquer método convencional pode ser usado para a administração do vetor ou composição a um indivíduo. A via de administração depende da formulação ou forma da composição, da doença, da localização de tumores, do paciente, das comorbidades, e outros fatores. Em uma modalidade preferida da invenção, a administração é conduzida através de injeção intratumoral, intramuscular, intra-arterial, intravenosa, intrapleural, intravesicular, intracavitária, ou peritoneal, ou uma administração oral.

[00086] Apenas uma administração de vetores adenovirais oncolíticos da invenção pode ter efeitos terapêuticos. Entretanto, em uma modalidade preferida da invenção, os vetores adenovirais oncolíticos ou composições farmacêuticas são administrados várias vezes durante o período de tratamento. Os vetores adenovirais oncolíticos ou composições farmacêuticas podem ser administrados, por exemplo, 1 a 10 vezes nas primeiras 2 semanas, 4 semanas, mensalmente ou durante o período de tratamento. Em uma modalidade da invenção, a administração é feita três a sete vezes nas primeiras 2 semanas, e depois em 4 semanas e depois mensalmente. Em uma modalidade específica da invenção, a administração é feita quatro vezes nas primeiras 2 semanas, depois em 4 semanas, e depois mensalmente. A extensão do período de tratamento pode variar, e, por exemplo, pode durar entre 2 e 12 meses ou mais.

[00087] Para evitar anticorpos neutralizadores em um indivíduo, os vetores da invenção podem variar entre tratamentos. Em uma modalidade preferida da invenção, o vetor adenoviral oncolítico, que tem uma região globular de fibra do capsídeo em comparação com o vetor do tratamento anterior, é administrado a um indivíduo. Como aqui utilizado, o termo "região globular de fibra do capsídeo"refere-se à parte da região globular da proteína da fibra (figura 1).

[00088] A terapia gênica da invenção é eficaz isoladamente, mas uma combinação de terapia gênica adenoviral com outras terapias, tal como terapia tradicional, pode ser mais eficaz do que qualquer uma das duas isoladamente. Por exemplo, cada agente da terapia combinada pode funcionar independentemente no tecido tumoral, os vetores adenovirais podem sensibilizar células à quimioterapia ou radioterapia e/ou agentes quimioterápicos podem intensificar o nível de replicação do vírus ou afetar o estado do receptor das células-alvo. Os agentes na terapia combinada podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente.

[00089] Em uma modalidade preferida da invenção, o método ou uso compreende a administração de radioterapia concomitante a um indivíduo. Em outra modalidade preferida da invenção, o método ou uso compreende ainda a administração de quimioterapia concomitante a um indivíduo. Como aqui utilizado, o termo "concomitante" refere-se a uma terapia, que foi administrada antes, depois ou simultaneamente com a terapia gênica da invenção. O período para uma terapia concomitante pode variar de minutos a várias semanas. De preferência, a terapia concomitante dura por algumas horas.

[00090] Os agentes apropriados para terapia combinada incluem, porém sem limitações, a ácido retinoico todo trans , Azacitidina, Azatioprina, Bleomicina, Carboplatina, Capecitabina, Cisplatina, Clorambucil, Ciclofosfamida, Citarabina, Daunorrubiciπa, Docetaxel, Doxifluridina, Doxorrubicina, Epirrubicina, Epotilona, Etoposida, Fluoruracila, Gencitabina, Hidroxiureia, Idarrubicina, Imatinib, Mecloretamina, Mercaptopurina, Metotrexato, Mitoxantrona, Mxaliplatina, Paclitaxel, Pemetrexed, Tomozolomida, Teniposida, Tioguanina, Valrubicina, Vinblastina, Vincristiπa, Vindesina e Vinorelbina.

[00091] Em uma modalidade preferida da invenção, o método ou uso compreende ainda a administração de verapamil ou outro bloqueador de canais de cálcio a um indivíduo. O termo "bloqueador de canais de cálcio" refere-se a uma classe de fármacos e substâncias naturais que rompem a condução de canais de cálcio, e ela pode ser selecionada no grupo que consiste em verapamil, di-hidropiridinas, galopamil, diltiazem, mibefradil, bepridil, fluspirileno e fendilina.

[00092] Em uma modalidade preferida da invenção, o método ou uso compreende ainda a administração de agentes indutores de autofagia a um indivíduo. Autofagia refere-se a um processo catabólico que envolve a degradação de componentes próprios de uma célula através do mecanismo lisossômico. "Agentes indutores de autofagia" referem-se a agentes capazes de induzir autofagia e podem ser selecionados no grupo que consiste em, porém sem limitações, inibidores de mTOR, inibidores de PI3K, lítio, tamoxifeno, cloroquina, bafilomicina, temsirolimus, sirolimus e temozolomida. Em uma modalidade específica da invenção, o método compreende ainda a administração de temozolomida a um indivíduo. A temozolomida pode ser temozolomida oral ou intravenosa.

[00093] Em uma modalidade da invenção, o método ou uso compreende ainda a administração de quimioterapia ou terapia anti- CD20 ou outras abordagens para bloquear anticorpos neutralizadores. "Terapia anti-CD20"refere-se a agentes capazes de exterminar células CD20 positivas, e podem ser selecionados no grupo que consiste em rituximab e outros anticorpos monoclonais anti-CD20. A expressão"abordagens para bloquear anticorpos neutralizadores"refere-se a agentes capazes de inibir a geração de anticorpos antivirais que normalmente resultam de infecção e podem ser selecionados no grupo que consiste em diferentes quimioterápicos, substâncias imunomoduladoras, corticoides e outros fármacos. Estas substâncias podem ser selecionadas no grupo que consiste em, porém sem limitações, ciclofosfamida, ciclosporina, azatioprina, metilprednisolona, etoposida, CD40L, CTLA4lg4, FK506 (tacrolismus), IL-12, IFN-gama, interleucina 10, anti-CD8, anticorpos anti-CD4, mieloablação e proteínas adenovirais orais.

[00094] O vetor adenoviral oncolítico da invenção induz oncólise mediada por virions de células tumorais e ativa resposta imune humana contra células tumorais. Em uma modalidade preferida da invenção, o método ou uso compreende ainda a administração de substâncias capazes de regular de forma descendente células T reguladoras em um indivíduo. A expressão "substâncias capazes de regular de forma descendente as células T reguladoras"refere-se a agentes que reduzem a quantidade de células identificadas como supressoras de T ou células T reguladoras. Estas células têm sido identificadas como consistindo em um ou muitos dos seguintes marcadores imunofenotípicos: CD4+, CD25+, FoxP3+, CD127- e GITR+. Tais agentes que reduzem células supressoras de T ou T reguladoras podem ser selecionadas no grupo que consiste em anticorpos anti-CD25 ou quimioterápicos.

[00095] Em uma modalidade preferida da invenção, o método ou uso compreende ainda a administração de ciclofosfamida a um indivíduo. A ciclofosfamida é um agente quimioterápico comum que foi usado também em alguns distúrbios autoimunes. Na presente invenção, a ciclofosfamida pode ser usada para intensificar a replicação virai e os efeitos de estimulação induzida por GM-CSF de células NK e T citotóxicas para resposta imune intensificada contra o tumor. Ela pode ser usada como doses maciças intravenosas ou administração metronômica oral em dose baixa.

[00096] Qualquer método ou uso da invenção pode ser método ou uso in vivo, ex vivo ou in vitro.

[00097] A presente invenção será ilustrada pelos exemplos que se seguem que não pretendem de forma alguma serem limitativos. Exemplos Exemplo 1. Clonagem de três vírus do tipo D24-GM-CSF - PCR out hGM-CSF, - criar sítios Sunl/Munl => 445 pb (pORF-GM-CSF como modelo) - digestão por Sunl/Munl de produto da PCR e pTHSN - Ligação de extremidade pegajosa => - Pme\ linearizado pShuttle-D24 + pTG3602 => pAd5-D24 - Ad5-D24-GM-CSF (SEQ ID NO 8: região E1A com deleção D24 em posições de nucleotídeos 563-1524 e uma região de fibra em posições de nucleotídeos 30490-32236) Homol recomb: Srfílinearizado pAd5-D24 + Fsp\linearizado pTHSN-GM-CSF => pAd5-D24-GM-CSF Pad linearização &transfecção => Ad5-D24-GM-CSF

[00098] Todas as fases da clonagem foram confirmadas com PCR e múltiplas digestões de restrição. O plasmídeo de ponte pTHSN-GMCSF foi sequenciado. A ausência de E1 do tipo selvagem foi confirmada por PCR. A região E1, o transgene e a fibra foram verificados no vírus final com sequenciamento e PCR, que foi então levado para o laboratório limpo para produção. Para esta finalidade, o DNA virai foi extraído por incubação noturna (ON) com solução de tampão apropriada e depois PCR e a sequência foi realizada Para analisar a integridade da fibra, bem como o DNAc de GMCSF. Todas as fases da produção do vírus, incluindo transfecção, foram feitas em células A549 para evitar o risco de recombinação do tipo selvagem como descrito anteriormente (Kanerva, A. etal., Mol. Ther. 8:449-58 (2003); Baeurschmitz G. J. et al., Mol. Ther. 14:164-74 (2006)). GM-CSF fica sob o promotor de E3 (especificamente sob elementos de controle da expressão do gene de E3A virai endógeno), o que resulta na expressão do transgene associado da replicação, que começa cerca de 8 h depois da infecção. E3 é intacta exceto pela deleção de 6.7K/gp19K.

[00099] Ad5/3-D24-GM-CSF (SEQ ID NO 7) e Ad5-RGD-D24-GM- CSF (SEQ ID NO 9: região E1A com deleção de D24 nas posições de nucleotídeos 580-1541, uma região da fibra nas posições de nucleotídeos 30514-32286 e a modificação RGD nas posições de nucleotídeos 32128-32183) foram construídos identicamente, exceto um plasmídeo de resgate que possui uma região globular do sorotipo 3, ou RGD-4C na alça Hl da fibra de Ad5 foram usados. Ad5-pK7-D24- GMCSF (SEQ ID NO 10: região E1A com deleção de D24 nas posições de nucleotídeos 561-1526, uma região da fibra nas posições de nucleotídeos 30499-32255 e modificação pK7 nas posições de nucleotídeos 32247-32378) também foram criados similarmente (figuras 2-4).

[000100] Ad5/3-D24-GM-CSF foi construído como se segue. Um plasmídeo derivado de A pAdEasy-1 que contém uma fibra 5/3 quimérica, pAdEasy5/3, foi criado por recombinação homóloga em E.coli do genoma virai de Ad5/3luc1 e o fragmento de 8,9 kb digerido por BstX\ de pAdEasy-1. A seguir, um vetor ponte (shuttle) que contém uma deleção de 24 pb em E1A (pShuttleD24) foi linearizado com Pme\ e recombinado com pAdEasy5/3 resultando em pAd5/3-D24. Para inserir o gene de GMCSF humano dentro da região E3, um vetor de clonagem de E3, pTHSN, foi criado inserindo Spel no fragmento Nde\ do genoma de Ad5 no sítio de multiclonagem de pGEM5Zf+ (Promega, Madison, Wl). pTHSN foi digerido ainda mais com Sun\/Mun\ criando uma deleção de 965 pb na região E3 (6.7K e gp19K deletadas). O cDNA de 432 pb que codifica GMCSF humano (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi amplificado com iniciadores que têm sítios de restrição específicos, Sun\/Mun\, que flanqueiam o gene e depois inserido em pTHSN digerido por Sun\/Mun\ (pTHSN-GMCSF). pAd5/3-D24-GMCSF foi gerado por recombinação homóloga em E.coli entre pTHSN-GMCSF linearizado comFspI e pAd5/3-D24 linearizado com Srf\. O genoma do vírus Ad5/3- D24-GMCSF foi liberado por digestão com Pac\ e transfecção para células A549 para amplificação e resgate (figuras 13 e 14, SEQ ID NO 7). Exemplo 2. Análise in vitro de vírus do tipo D24-GM-CSF

[000101] A eficácia in vitro de virus do tipo D24-GM-CSF foi estudada em células de câncer pulmonar (A549), célula de explantes derivadas de células-tronco de câncer de mama (JIMT-1) e células de câncer de mama (MDA-MB-436) utilizando ensaios de exterminação de células MTS. O ensaio MTS é correntemente o método padrão para avaliar a viabilidade de células em publicações de terapia gênica de câncer. Ad5Luc1 é um vírus deficiente em replicação e atua como um controle negativo. Adõwt é um vírus Ad5 do tipo selvagem (cepa Ad300wt) e foi usado como um controle positivo. Ad5-d24-E3 aloja uma deleção de 24 pb isogênica em E1 mas é intacto em E3. VP indica partículas virais.

[000102] Resumindo, Ad5-D24-GMCSF tinha atividade oncolítica similar aos controles positivos in vitro,e, portanto, a produção do transgene não comprometeu a potência oncolítica do vírus (figuras 5a- c). Dados similares foram ilustrados para Ad5/3-D24-GM-CSF e Ad5- RGD-D24-GM-CSF (figura 5d).

[000103] Para testar se Ad5D24-GMCSF era capaz de expressar o transgene, a linhagem de células A549 foi infectada com 1.000 VP/célula e o meio foi coletado no decorrer do tempo. A concentração de GMCSF (figura 6a) no meio foi medida por FACSARRAY (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Além disso, analisou-se se o GMCSF expressado no vírus retinha sua função biológica. Para esta finalidade, a linhagem de células TF1 cujo crescimento e sobrevivência são dependentes estritamente de GMCSF humano foi tratada com meio coletado da linhagem de células A549 infectada anteriormente com Ad5D24-GMCSF. A viabilidade de TF1 foi avaliada no decorrer do tempo pelo ensaio MTS. O resultado deste experimento foi que o GMCSF expressado no vírus era capaz de estimular o crescimento dessa linhagem de células, e nenhuma diferença foi encontrada com a mesma linhagem de células tratada com GMCSF humano recombinante (sigma) (figura 6b). Exemplo 3. Análise pré-tratamento da transdução I. Infecção de células tumorais com Ad5Luc1

[000104] Para verificar que um tumor poderia ser infectado com vírus baseados em Ad5, biópsias retiradas de tecidos foram homogeneizadas, e infectadas com Ad5Lic1 que codifica luciferase de acordo com o protocolo padrão de infecção. Resumidamente, as células semeadas em poços foram lavadas duas vezes com PBS, o vírus foi descongelado e recolocado em suspensão em uma quantidade mínima de meio de crescimento e vertido suavemente sobre as células. A infecção prosseguiu por 30 minutos, e depois disso, as células foram lavadas novamente em PBS e uma quantidade apropriada de meio de crescimento completo foi adicionada. A quantificação de luciferase foi avaliada 24 horas depois. Nota-se que apenas uma quantidade diminuta de tecido foi obtida, e portanto, o número de células não pôde ser calculado, nem a quantidade de vírus normalizada para a quantidade de tecido. Assim sendo, nenhuma análise quantitativa foi feita, mas os dados qualitativos indicaram transferência exitosa de genes nos pacientes 012 e C3 (figuras 7a-b). Os valores de fundo de luciferase (cerca de 200 RLU) foram subtraídos. II. Coloração imunoístoquímica de CAR

[000105] Espécimes arquivais disponíveis de tumores de pacientes (pacientes para tratamento com Ad5-D24-GM-CSF) foram coletados e analisados quanto à expressão de CAR (o receptor do sorotipo 5 de adenovirus) por imunoistoquímica. As colorações do receptor de adenovirus CAR de citoplasmas de células cancerosas (M3), adenocarcinoma de jejuno (C3), carcinoma pancreático (H7), infiltração lobular de carcinoma (R8), metástase de câncer ovariano no fígado (012) e metástase de sarcoma sinovial no pulmão (S23) estão ilustradas na figura 7c. III. Titulações de anticorpos neutralizadores contra o capsídeo de Ad5/3

[000106] Células 293 foram semeadas sobre placas com 96 poços a 1 x 104 células/poço e cultivadas de um dia para o outro. No dia seguinte, as células foram lavadas com DMEM sem FCS. Para inativar o complemento, amostras de soro humano foram incubadas a 56 °C por 90 min. Uma série de diluições de quatro vezes (1:1 até 1:16 384) foi preparada em DMEM isento de soro (Sarkioja, M. et al., Gene Ther. 15(12):921 -9 (2008)). Ad5/3luc1 foi misturado com as diluições de soro e incubado à temperatura ambiente por 30 min. A seguir, as células em triplicatas foram infectadas com 100 VP/célula em 50 pL de mix, e 1 h depois, 100 pL de meio de crescimento com 10% de FCS foram adicionados 24 h depois da infecção, as células foram lisadas e a atividade de luciferase foi medida pelo Sistema de Ensaio de Luciferase (Promega, Madison, Wl) utilizando luminômetro TopCount (PerkinElmer, Waltham, MA). As leituras de luciferase foram plotadas em relação à transferência de gene atingida com Ad5/3luc1 isoladamente para avaliar o efeito de anticorpos neutralizadores no soro de pacientes tratados com Ad5/3-d24-GMCSF. A titulação de anticorpos neutralizadores foi determinada como o grau mais baixo de diluição que bloqueou a transferência de gene em mais do que 80%. Exemplo 4. Análise ex vivo da eficácia de Ad5/3-D24-GMCSF em amostras de ascite e pleurais

[000107] Uma amostra fresca de ascite/efusão pleural foi estocada a +4 °C durante a noite inteira. A amostra foi dividida em tubos Falcon de 50mL e as células foram isoladas por centrifugação a 900rpm, 8 min, +4°C. Para lisar os eritrócitos a amostra foi incubada por 5-10 min à temperatura ambiente com 25 mL de Tampão de Lise ACK (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os tubos Falcon foram enchidos com DMEM a 2% e as células foram centrifugadas (900 rpm, 8 min, +4 °C). A suspensão de células de 100.000 células/mL em 2% de DMEM-fungizona foi preparada (50mL de 2% de DMEM + 200 pL de Fungizona (BMS, Espoo, Finlândia)).

[000108] Para o ensaio de luciferase, para testar o efeito da modificação capsídica sobre a eficácia da transdução, as células foram semeadas dentro de duas placas com 24 poços, 50.000 células/poço. 24 h depois as células em triplicatas foram infectadas com Ad5luc1 ou Ad5/3luc1 em concentrações de 500 VP/célula e 5.000 VP/célula em 2% de DMEM. A expressão de luciferase foi analisada similarmente ao exemplo 3 III (determinação de titulações de anticorpos neutralizadores).

[000109] Amostras de pré-tratamento frescas de ascite e efusão pleural para os pacientes K75 e V136, respectivamente, foram analisadas, e em ambas amostras uma alta transdução com Ad5/3 foi observada

[000110] Para o ensaio MTS, para testar a potência de Ad5/3-d24- GMCSF sobre amostras clínicas, células foram semeadas dentro de duas placas com 96 poços, 10.000 células/poço. As células foram infectadas depois de 24 h de incubação. As infecções foram conduzidas em 2% de DMEM. No dia seguinte, DMEM a 10% foi adicionado. As células foram verificadas diariamente e o meio de cultura foi trocado a cada dois dias. Antes de medir, o meio foi aspirado e 100 pL de DMEM a 10% fresco foi pipetado dentro dos poços. 20 pL de Tampão de Ensaio MTS (Promega, Madison, Wl) foram adicionados e as células foram incubadas por 1,5-4 horas. A absorvância foi medida com Multiscan Ascent e o SoftwareAscent v2.6 (Thermo Labsystems, Helsinki, Finlândia) a 490 nm e a absorvância do fundo foi subtraída da absorvância das amostras.

[000111] As amostras pré-tratamento de efusão pleural de V136 e M137 foram avaliadas quanto á potência oncolítica de Ad5/3-d24- GMCSF. Seis dias depois da infecção havia 62% e 29% menos células viáveis (p<0,001), respectivamente, do que em uma amostra de controle não infectada, sugerindo que Ad5/3-d24-GMCSF era capaz de exterminar células tumorais presentes na efusão.

[000112] Para avaliar a presença de vírus nas amostras obtidas depois do tratamento, as células foram recolocadas em suspensão em 3 mL de DMEM a 2% depois de lisar os eritrócitos e congelar/descongelar quatro vezes a -80 °C. As células 293 foram semeadas em placas com 96 poços a 10.000 células/poço e incubadas por 24 h. A amostra foi centrifugada por 15 min a 4.000 rpm, +4 °C e o sobrenadante foi coletado. As células 293 foram infectadas com 100 pL/poço do sobrenadante. Depois de 10 dias de incubação, os poços foram avaliados quanto á presença de efeito citopático.

[000113] Para avaliar a replicação de Ad5/3-d24GMCSF no tumor, analisou-se também uma amostra de ascite retirada do paciente 082 7 dias depois do tratamento. Isto resultou em 70% das células apresentando efeito citopático, enquanto que as células do controle não infectadas não apresentaram efeitos similares. Exemplo 5. Análise in vivo de vírus do tipo D24-GM-CSF em animais

[000114] A eficácia in vivo de Ad5-D24-GM-CSF foi testada em hamsterssírios imunocompetentes, que são semipermissivos pra replicação de adenovirus (camundongos são não-permissivos) (Ying, B. etal. 2009, Cancer Gene Ther. doi:10.1038/cgt.2009.6.). 7 x 106 células de câncer pancreático HapT1 foram injetadas por via subcutânea e 1 x 109 partículas virais (VP) de Ad5-D24-GM-CSF ou Ad5D24E3 (que não expressa GM-CSF) foram injetadas por via intratumoral no Dia 0, 2 e 4. O grupo simulado recebeu injeção do mesmo volume de meio de crescimento nos mesmos pontos no tempo indicados. A Figura 8b ilustra que as injeções intratumorais de Ad5-D24-GMCSF resultaram em altos níveis de hGM-CSF no soro de hamsters sírios. GM-CSF humano reconhecidamente é ativo em hamsters sírios (Cho, Exp. Toxicol. Pathol.57(4):321-8 (2006)). O interessante é que todos os animais não tinham tumores no dia dezesseis, exceto pelo grupo simulado (figura 8a). Cicatrizes de tumores ainda foram analisadas por mais duas semanas para avaliar se o reaparecimento do tumor poderia ter ocorrido. Entretanto, no dia 32 ainda não havia qualquer sinal de tumor nestes animais, de tal modo que a primeira parte do experimento foi terminada e os animais do grupo simulado foram sacrificados. Os animais tratados remanescentes foram neste ponto desafiados com o mesmo tumor no lado direito do corpo superior por injeção subcutânea de 7 x 106 células HapT1, enquanto que sobre no lado esquerdo eles foram desafiados com um tumor diferente (1 x 106 de tumor HaK) para o qual os animais eram puros. O crescimento de tumores foi medido no decorrer do tempo e está relatado nas figuras 8c-d. O interessante é que os animais que foram tratados anteriormente com Ad5D24GMCSF rejeitaram completamente o desafio com o tumor HapT1, enquanto que os tumores Hak cresceram normalmente, enquanto que os animais que foram tratados anteriormente com Ad5D24E3 desenvolveram independentemente tumores HapT1 e HaK (Figuras 8c-d).

[000115] Resume-se que, os dados indicam que Ad5-D24-GM-CSF tem atividade antitumoral em animais imunocompetentes portadores de tumores, e é capaz de eliciar imunidade específica de tumor até o grau de rejeitar um desafio subsequente do mesmo tumor. Exemplo 6. Análise in vivo de vírus do tipo D24-GM-CSF em pacientes humanos I. Pacientes

[000116] Pacientes com tumores sólidos avançados e refratários a tratamento foram inscritos em um protocolo de tratamento compassivo aprovado pelo governo. As informações sobre os pacientes que receberam Ad5-D24-GM-CSF estão listadas na tabela 1.

[000117] 22 pacientes com tumores sólidos avançados refratários a terapias usuais (tabela 6) foram tratados com uma única rodada de Ad5/3-d24-GMCSF por via intravenosa e intratumoral (tabela 7). A injeção intratumoral foi realizada por via intraperitoneal ou intrapleural no caso de carcinomatose ou metástases pleurais, respectivamente. Os critérios de inclusão foram tumores sódios refratários e terapias convencionais, a pontuação 3 de desempenho da OMS ou menos e nenhuma deficiência importante de função orgânica. Os critérios de exclusão foram transplante de órgãos, HIV, doença cardiovascular, metabólica ou pulmonar grave ou outros sintomas, descobertas ou doenças que impedem o tratamento oncolítico com vírus. Um cosentimento por escrito foi obtido e os tratamentos foram administrados de acordo com a Boa Prática Clínica e a Declaração de Helsinque. II. Tratamentos com vetor adenoviral que codifica GM-CSF a) Tratamentos com Ad5-D24-GM-CSF, Ad5/3-D24-GM-CSF ou Ad5- RGD-D24-GM-CSF

[000118] Ad5-D24-GM-CSF, Ad5/3-D24-GM-CSF e Ad5-RGD-D24- GM-CSF foram então produzidos de acordo com o grau clínico e o tratamento dos pacientes foi iniciado. Este programa de uso compassivo em "fase 0" foi discutido no comitê HUCH Surgical Ethics. O programa foi discutido também em FinOHTA (avaliação nacional de tecnologias médicas) e Ethics Negotiation Board of the Finnish Medical Association. Os aspectos legais foram verificados com o Ministério de Relações Sociais e Saúde, a National Agency of Medicines, o conselho legal na Finnish Medical Association, a autoridade nacional para Assuntos de Medicina Legal e o Parliamentary Board of Social Affairs and Health. Os tratamentos foram aprovados pelo Finnish Gene Technology Board.

[000119] Os pacientes receberam uma única rodada de tratamento no Dia 0. A administração do vírus foi realizada por injeção intratumoral guiada ou ultrassom e cerca de um quinto da dose foi dado por via intravenosa. A dose inicial de 8 x 1010 VP foi escolhida baseado em resultados de segurança publicados por terceiros.

[000120] O vírus foi diluído em solução salina estéril na hora da administração sob condição apropriada. Depois da administração do vírus todos os pacientes foram monitorados de um dia para o outro no hospital e subsequentemente durante as 4 semanas seguintes como pacientes ambulatoriais. A avaliação física e o histórico médico foram feitos em cada consulta e os valores laboratoriais clinicamente relevantes foram acompanhados. Os efeitos colaterais foram registrados e pontuados de acordo com a Terminologia Comum para Episódios Adversos v3.0 (CTCAE).

[000121] Devido ao fato de que muitos pacientes de câncer têm sintomas devido à doença, os sintomas preexistentes não foram pontuados caso eles não tivessem piorado. Entretanto, caso o sintoma se tornasse mais grave, por exemplo, grau de pré-tratamento 1 mudou para grau 2 depois do tratamento, ele foi pontuado como grau 2. Os níveis séricos de GMCSF e outras quatro citocinas (IL-6, IL-8, IL-10 e TNF-alfa) foram analisados por BD Cytometric Bead Array (CBA) Human Soluble Protein Flex Set (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA). O tamanho do tumor foi avaliado por varredura de tomografia computadorizada (TC) intensificada com contraste (CT). Os diâmetros máximos dos tumores foram obtidos. Os Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos (RECIST1.1) foram aplicados para doença global, incluindo lesões injetadas e não injetadas. Estes critérios são resposta parcial PR (redução >30% na soma dos diâmetros dos tumores), doença estável SD (nenhuma redução/aumento), doença progressiva PD (aumento >20%). Decréscimos evidentes dos tumores que não preenchem PR foram pontuados como respostas mínimas (MR). Os marcadores séricos de tumores também foram avaliados quando elevados na linha basal, e as mesmas porcentagens foram usadas.

[000122] Amostras de sangue foram coletadas antes e depois do tratamento para análises. Na tabela 1, está resumida a carga viral no soro de pacientes tratados com Ad5-D24-GMCSF. Uma PCR quantitativa (qPCR) foi usada para essa análise (vide Seção III para obter a descrição dos métodos).

[000123] As Tabelas 2, 3 e 4 resumem todos os episódios adversos que foram registrados durante e depois do tratamento com Ad5-D24- GM-CSF. Todos os episódios adversos foram graduados de acordo com a Terminologia Comum para Episódios Adversos v3.0 (CTCAE). É digno de nota que todos os pacientes manifestaram sintomas semelhantes á gripe grau 1 e/ou grau 2, mas apenas dois sintomas grau 3 foram observados, um caso de constipação em uma paciente com câncer ovariano que tinha sofrido de constipação antes e uma hiponatremia grau 3.

[000124] Na Tabela 5, está relatada a avaliação da eficácia de Ad5- D24-GM-CSF de acordo com os critérios RECIST (Therasse. P. et al., J. Natl. Cancer Inst.92:205-16 (2000)). O interessante é que duas respostas completas (CR) e cinco doenças estáveis (SD) foram observadas em 14 pacientes analisados para uma taxa de benefício clínico de 50%. b) Segurança de Ad5/3-d24-GMCSF em Pacientes de Câncer

[000125] Os tratamentos foram bem tolerados até o mais alto usado: 4 x 1011 VP/paciente. Nenhum episódio adverso grau 4-5 foi observado. Sintomas semelhantes à gripe grau 1 -2 foram comuns com 19/22,17/22 e 8/22 pacientes que experimentaram febre, fadiga ou sintomas respiratórios superiores, respectivamente. Dor no local de injeção (6 pacientes), dor abdominal (10 pacientes) e náusea (9 pacientes) também foram episódios adversos grau 1-2 comuns (Tabela 8). Efeitos colaterais hematológicos grau 3 assintomáticos e autolimitativos foram observados em 4 pacientes: anemia (grau 2 na linha basal), neutropenia, elevação de aspartato aminotrasferase e hiponatremia. O único efeito colateral grau 3 não-hematológico foi colecistite observada três semanas depois do tratamento em um paciente com câncer pancreático H83. Ele teve também elevações grau 3 de alanina aminotrasferase e bilirubina. Em conjunto, estes sintomas sugerem compressão de ditos biliares mediada por tumor. Não está claro se isto foi inchaço inflamatório mediado pelo tratamento ou crescimento do tumor causado por progressão da doença. III. Detecção do vírus a partir do sangue

[000126] Amostras de soro foram coletadas a partir de pacientes tratados com Ad5-D24-GM-CSF ou Ad5/3-D24-GM-CSF (vide Exemplo 6, I.) e uma PCR convencional foi conduzida com iniciadores e condições de acordo com Takayama et al., J. Med. Virol.79:278-284 (2007). Resumidamente, o DNA total foi extraído adicionando 3 pg de DNA carreador (ácido polidesoxiadenílico; Roche, Mannheim, Alemanha) a 400 pL de soro e usando o minikit QIAamp DNA. O DNA extraído foi eluído em 60 pL de água isenta de nuclease e a concentração do DNA foi medida por espectrofotometria. Uma amplificação por PCR baseou-se em indicadores e sonda que assesta a região E1A que flanqueia a deleção de 24 pb (iniciador direto 5'- TCCGGTTTCTATGCCAAACCT-3' (SEQ ID NO 1), iniciador reverso 5'-TCCTCCGGTGATAATGACAAGA-3' (SEQ ID NO 2) e sonda onco 5'FAM-TGATCGATCCACCCAGTGA- 3'MGBNFQ (SEQ IDNO 3)). Além disso, uma sonda complementar a uma sequência incluída na região de 24 pb para deleção foi usada para testar as amostras quanto à presença de infecção por adenovirus do tipo selvagem (sonda wt 5'vlc-TACCTGCCACGAGGCT-3'MGBNFQ (SEQ ID NO 4)).

[000127] As condições de PCR em tempo real para cada reação de 25 pL foram as seguintes: Sondas 2X LightCiclor480 Master Mix (Roche, Mannheim, Alemanha), 800 nM cada iniciador direto e reverso, 200 nM cada sonda e 250 ng de DNA extraído. As reações PCR foram conduzidas em um LightCiclor (Roche, Mannheim, Alemanha) sob as seguintes condições de ciclos: 10 min a 95 °C, 50 ciclos de 10 s a 95 °C, 30 s a 62 °C ed 20 s a 72 °C e 10 min a 40 °C. todas as amostras foram testadas em duplicata. Reagentes de controle positivo interno exógeno TaqMan (Applied Biosystems) foram usados nas mesmas corridas de PCR para testar cada amostra quanto à presença de inibidores da PCR.

[000128] Uma curva padrão de regressão foi gerada usando o DNA extraído de diluições seriais de Ad5/3-D24-Cox2L (1 X 108—10 vp/mL) e soro humano normal. O limite de detecção e o limite de quantificação para o ensaio foram 500 vp/mL de soro.

[000129] As amostras positivas foram confirmadas por PCR em tempo real usando LightCiclor480 SYBR Green I Master mix (Roche, Mannheim, Alemanha) e iniciadores específicos para sequências de adenovirus e GM-CSF (iniciador direto 5'- AAACACCACCCTCCTTACCTG -3' (SEQ ID NO 5) e iniciador reverso 5'- TCATTCATCTCAGCAGCAGTG -3' (SEQ ID NO 6)). IV. Presença de Ad5/3-d24-GMCSF no soro depois do Tratamento

[000130] Todos pacientes eram negativos para Ad5/3-d24-GMCSF antes do tratamento com Ad5/3-d24-GMCSF. No Dia 1,17/19 pacientes tiveram níveis mensuráveis de genomas do vírus no soro, sendo a titulação mais alta 2.061 VP/mL de soro. A partir das amostras retiradas durante os Dias 3-7,12/15 pacientes foram positivos, sendo o título mais alto de 3,36 x 105 vp/mL de soro. As amostras positivas foram observadas até o Dia 58 depois do tratamento (Tabela 9). V. Títulos de GMCSF e anticorpos neutralizadores no soro depois do tratamento

[000131] Não houve mudança significativa nos níveis sistêmicos de GMCSF depois do tratamento com Ad5/3-d24-GMCSF, o que se correlacionou com nenhum efeito significativo observado nos níveis de contagens de leucócitos totais. Isto sugere uma restrição geral da produção de GMCSF para os sítios locais de replicação do vírus nos tumores. Em um paciente, S70, um aumento transiente no GMCSF sérico foi observado no Dia 4 acompanhado de uma elevação transiente da contagem de leucócitos. Isto poderia ter sido relacionado à replicação eficaz do vírus como o paciente teve simultaneamente febre e 3,36 x 105 vp/mL de vírus no soro (Tabela 9). Este paciente não experimentou qualquer episódio adverso sério durante o acompanhamento. Entretanto, uma varredura por TC depois do tratamento sugeriu atividade antitumoral (SD) e por 4 semanas depois do tratamento ela estava se sentindo melhor e suas dores persistentes no peito tinham sumido. A concentração mais alta de GMCSF medida no sangue deste paciente foi 115 pg/m\l, o que é aproximadamente 10 vezes mais baixa do que os níveis tóxicos de GMCSF em humanos.

[000132] Na linha basal, 4/15 pacientes foram completamente negativos para anticorpos neutralizadores contra Ad5/3. Outros 2 pacientes tiveram títulos apenas detectáveis (1-4) enquanto que 8 pacientes tiveram título neutralizador baixo (16-64). Nenhum paciente teve títulos neutralizadores médios ou altos contra Ad5/3 na linha basal. Depois do tratamento o título aumentou em todos pacientes (p<0,005) (Tabela 9). Nenhuma correlação evidente foi observada entre títulos de anticorpos neutralizadores e dose virai, atividade antitumoral ou toxicidade. O intrigante, com relação à carga viral no soro, dois pacientes, Y62 e 079, foram positivos para anticorpos neutralizadores na linha basal e tiveram altos títulos durante as semanas 2-4, mas ainda tinham cargas mensuráveis de vírus presentes no seu soro pelo menos 28 e 58 dias, respectivamente (Tabela 9). Isto indica que mesmo altos títulos de anticorpos não conseguem obstar a replicação virai nos tumores. O interessante é que o título de anticorpos não atingiu o máximo em todos pacientes. Por exemplo, S70, X122 e H83 tiveram grandes quantidades de vírus circulante durante a semana 1 e seu título de anticorpo subiu lentamente. VI. Exterminação de células tumorais diferenciadas

[000133] Varreduras por TC de uma paciente que sofre de câncer ovariano e uma paciente que sofre de mesotelioma (vide Tabela 1) antes e depois do tratamento com Ad5-D24-GM-CSF estão ilustradas nas figuras 9a-b. VII. Eficácia de Ad5/3-D24-GMCSF

[000134] Todos pacientes tinham tumores progressivos antes do tratamento. 12 pacientes puderam ser avaliados para benefício radiológico de acordo com RECIST1.1 (Tabela 9). 2 pacientes tiveram uma resposta pequena, 6 pacientes tinham doença estável, e 4 pacientes tinham doença progressiva (PD). Portanto, a taxa de benefício radiológico foi 67%. Digno de nota, o tumor pancreático rapidamente crescente em H96 interrompe o crescimento, mas uma lesão metastática apareceu nos pulmões e foi então pontuada PD. Similarmente, o paciente 0129 teve uma redução de 6% do tumor injetado, mas teve nova metástase. No paciente V136, que tinha dois cânceres metastáticos, uma lesão hepática não injetada desapareceu, enquanto que os outros tumores permaneceram SD.

[000135] Com relação a marcadores de tumores, avaliados para pacientes que tinham marcadores elevados na linha basal, 2/6 tiveram alguma abaixamento de níveis de marcadores e 4/6 tiveram elevação de níveis de marcadores (Tabela 9).

[000136] A sobrevida global de pacientes depois do tratamento está ilustrada na figura 14.

[000137] Além das medições objetivas da atividade antitumoral observou-se também um benefício clínico e/ou subjetivo em vários casos (Tabela 9). Eles incluíram os pacientes cujo bem-estar global foi melhorado, uma sensação palpável de tumor mais mole e/ou menor e sintomas causados pelo tumor sendo aliviados. É de importância que dois pacientes, que sofriam anteriormente de rápida acumulação de ascite e/ou efusão pleural, tiveram uma clara redução de sua acumulação depois do tratamento com vírus, e este efeito durou por vários meses em ambos casos.

[000138] Na totalidade, os sinais de eficácia antitumoral foram observados em 13/21 pacientes (62%). VIII. Efeitos hematológicos do tratamento

[000139] Os níveis de leucócitos, eritrócitos, Hb, trombócitos, bilirrubina, INR, ALT, AST, ALP, creatinina, K, Na, CRP, CA19-9, GT, D- dímeros de fibrina e CEA foram estudados depois do tratamento com Ad5/3-D24-GM-CSF (Tabelas 3-4). IX. Resposta imune ao vírus a) IL-6, IL-10, TNF-ct e IL-8

[000140] Uma desvantagem potencial da terapia com gene de adenovirus é sua toxicidade precoce devido a componentes virais que podem ser imunogênicos e podem levar ao choque séptico e mesmo à morte (Brunetti-Pierri et al. Gene Ther., 2004; Raper et al., 2002). É, portanto, extremamente importante monitorar sinais de uma possível tormenta de citocinas que podem posteriormente evoluir para falência de órgãos. Para esta finalidade, logo depois do tratamento e em um ponto no tempo indicado, o sangue foi retirado de pacientes e as citocinas pró- inflamatórias foram analisadas por FACSARRAY como descrito no artigo de Cerullo, V. et al. (Mol. Ther. 15:378-85 (2007)). Nenhuma mudança siginificativa foi observada nos pacientes tratados com Ad5- D24-GM-CSF, indicando falta de toxicidade precoce inata.

[000141] Para obter os resultados da falta de toxicidade precoce inata relacionada a Ad5/3-D24-GM-CSF, vide Tabela 10. b) Indução de células T citotóxicas contra tumores e imunidade específica contra epítopo de tumor

[000142] A morte celular oncolítica permite que o sistema imunológico ganhe a capacidade para reconhecer exterminar células tumorais. Isso é potencialmente benéfico para a erradicação de tumores e podem facilitar curas. O adenovirus é depurado para fora do corpo em um tempo relativamente curto após a administração; assim sendo, torna-se de capital importância estimular o sistema imunológico para ser capaz de reconhecer antígeno específico de tumor, de tal modo que o tratamento possa resultar em um efeito benéfico prolongado para o paciente. Além disso, na presença de anticorpo, o vírus é neutralizado de tal modo que ele pode perder sua eficácia para metástases infectantes. Entretanto, células efetoras T ou NK induzidas contra o tumor ficam livres para circular e eventualmente exterminam a metástase longe do tumor infectado. Para demonstrar que o adenovirus que expressa GMCSF-é capaz de eliciar imunidade específica de adenovirus e tumor, PBMCs coletadas a partir pacientes tratados foram analisadas por INF-gama ELISPOT. O ELISPOT foi realizado de uma maneira cega por uma empresa externa que não recebeu informações de qualquer tipo de tratamento que os pacientes sofreram (Proimmune). Nas Figuras 10a-d estão ilustrados os resultados desta análise. É evidente que em alguns pacientes, quando as células T foram estimuladas com uma coleção de peptídeos derivados de qualquer antígeno tumoral (survivina) ou adenovirus (pentona) estas células foram ativadas, e assim sendo, produzem INF-gama (IFN-gama é um marcador de ativação específico de células T estimuladas).

[000143] A figura 11 ilustra a indução de células T específicas de Hexona de Adenovirus. Os leucócitos colhidos a partir de pacientes tratados com Ad5-D24-GMCSF foram corados com anticorpos de tetrâmeros específicos de CD3, CD8 e hexona e analisados por citometria de fluxo antes e depois do tratamento. O tratamento aumentou as células T citotóxicas específicas de hexona de 0,21 para 2,72%. c) Redução de células T reguladoras

[000144] Dados anteriores demonstraram que a administração metronômica de ciclofosfamida reduz células T reguladoras (T-Reg) em cobaias.

[000145] Esta abordagem foi utilizada em pacientes que receberam a administração metronômica de ciclofosfamida antes e depois do tratamento com Ad5-D24-GM-CSF e a análise de T reg foi realizada em PBMCs colhidas a Aprtir destes pacientes. No exemplo ilustrado na figura 12, está ilustrado um exemplo do paciente R73 e ele demonstra uma redução em T reg circulaante. As PBMCs totais foram colhidas dos pacientes e congeladas em um meio apropriado. Na hora da análise todas as amostras foram descongeladas e coradas primeiramente coanticorpos de CD4 e CD127, e em seguida, as células foram impermeabilizadas e coradas com o fator de transcrição Foxp3. As células que resultaram positivas para CD4, negativas para CD 127, mas têm alto teor de Foxp3, são consideradas células T reguladoras eficazes (T reg) (figura 12). Exemplo 7. Análise Estatística

[000146] Um teste t de Student bicaudado foi usado para comparar a atividade de luciferase titulações de anticorpos neutralizadores antes e depois do tratamento, níveis de citocinas e concentrações de GM-CSF. Os dados de sobrevida foram processados com análise de Kaplan- Meier. Tabela 1. Tabela que ilustra a presença de Ad5-D24-GMCSF no soro de pacientes tratados

Tabela 2. Tabela que resume os efeitos colaterais relatados por pacientes tratados com Ad5-D24-GMCSF

L (Dose baixa) = Faixa de dose da coorte 1 8x109<D<3,6x1010 M (dose média) = Faixa de dose da Coorte 2 1x1011<D<2,5x1011 H (dose alta) = Faixa de dose da Coorte 3 3x1011<D<4x1011 Tabela 3. Efeitos colaterais hematológicos após administração de Ad5-D24-GMCSF

L (Dose baixa) = Faixa de dose da coorte 1 8x109<D<3,6x1010 M (dose média) = Faixa de dose da Coorte 2 1x1011<D<2,5x1011 H (dose alta) = Faixa de dose da Coorte 3 3x1011<D<4x1011 Tabela 4. Enximas hepaticas após administração de Ad5-D24-GMCSF

L (Dose baixa) = Faixa de dose da coorte 1 8x109<D<3,6x1010 M (dose média) = Faixa de dose da Coorte 2 1x1011<D<2,5x1011 H (dose alta) = Faixa de dose da Coorte 3 3x1011<D<4x1011 Tabela 5. Eficácia do tratamento com Ad5-D24-GMCSF em pacientes tratados com diferentes doses de Ad5-D24-GMCSF. A análise foi realizada de acordo com os critérios RECIST. CR = resposta completa, PR = resposta parcial, SD = doença estável, PD = doença progressiva, NA = não disponível.

Tabela 6. Resumo de caracterísitcas de pacientes para tratamento com Ad5/3-D24-GM-CSF na linha basal. Os números indicam o número de pacientes entre 22.

Tabela 7.Características de pacientes para tratamento com Ad5/3-D24-GM-CSF na linha basal e descrição do tratamento

aEstado de desempenho na hora do tratamento, escala 0-5. bdose total; vp = partículas virais ci.v.=intravenosa, i.p.=intraperitoneal, i.t.=intratumoral, i.pl.= intrapleura, met.=metastases dciclofosfamida metronômica concomitante 50 mg/d foram dados por via oral na ausência de contraindicações Tabela 8. Episódios adversos. Todos 22 pacientes foram avaliados quanto a episódios adversos (AE) de acordo com os critérios CTCEA v.3.0 por 4 semanas depois do tratamento com Ad5/3-D24-GMCSF. 1 episódio adverso Grau 1 relatado apenas se presente em 2 ou mais pacientes. Todos episódios adversos Graus 2-5 estão relatados. Os números indicam o número de pacientes entre 22.

ALT , alanina aminotransferase; AST, aspartate aminotransferase; * Nem graduável como episódios adversos nos critérios de CTCEA v3.0 Tabela 9: Titulações de anticorpos neutralizadores, carga viral no soro e resposta depois do tratamento com Ad5/3-D24- GMCSF

Tabela 10. Resposta immune a Ad5/3-D24-GM-CSF

Claims (25)

1. Vetor adenoviral oncolítico, caracterizado pelo fato de que compreende um esqueleto de ácidos nucleicos do sorotipo 5 de adenovirus (Ad5), um promotor E1A nativo, uma deleção de 24 pb sequenciais (D24) na região constante 2 de ligação Rb de E1 e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um fator estimulante de colônias de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) humano no lugar de gp19k/6.7K deletada na região E3 e uma modificação do capsídeo, em que a modificação do capsídeo é o quimerismo Ad5/3, inserção de uma região de ligação à integrina (RGD) e/ou modificação da polilisina de ligação ao sulfato de heparina na fibra.

2. Vetor adenoviral oncolítico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ou mais regiões selecionadas no grupo que consiste em regiões E2, e E4.

3. Vetor adenoviral oncolítico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes regiões: uma ITR esquerda, E1 parcial, pIX, PIVa2, E2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4 E3 parcial, L5, E4 e uma ITR direita.

4. Vetor adenoviral oncolítico de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as regiões estão em uma ordem sequencial na direção de 5' para 3'.

5. Vetor adenoviral oncolítico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a região E1 compreende um sinal de empacotamento virai.

6. Vetor adenoviral oncolítico de acordo com qualquer uma das 1 a 5, caracterizado pelo fato de que uma sequência de ácidos nucleicos que codifica GM-CSF está sob o controle do promotor de E3 virai.

7. Vetor adenoviral oncolítico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que uma sequência de ácidos nucleicos que codifica GM-CSF é de um tipo selvagem.

8. Vetor adenoviral oncolítico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a região E4 é de um tipo selvagem.

9. Vetor adenoviral oncolítico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a modificação capsídica é quimerismo de Ad5/3, em que a parte da região globular da fibra é de Ad sorotipo 3 e o restante da fibra é de Ad sorotipo 5.

10. Vetor adenoviral oncolítico de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a modificação capsídica é uma modificação de RGD-4C.

11. Vetor adenoviral oncolítico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um cassete de expressão.

12. Vetor adenoviral oncolítico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende apenas um cassete de expressão.

13. Vetor adenoviral oncolítico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o vetor é capaz de replicar seletivamente em células que têm defeitos na via de Rb.

14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor adenoviral como definido em qualquer uma das reivindicações 1-13.

15. Vetor adenoviral oncolítico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que atua como uma vacina de câncer in situ.

16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que atua como uma vacina de câncer in situ.

17. Uso do vetor adenoviral como definido em qualquer uma das reivindicações 1-13, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar câncer em um indivíduo.

18. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado no grupo que consiste em câncer nasofaríngeo, câncer sinovial, câncer hepatocelular, câncer renal, câncer de tecidos conjuntivos, melanoma, câncer pulmonar, câncer intestinal, câncer colônico, câncer retal, câncer colorretal, câncer cerebral, câncer de garganta, câncer oral, câncer hepático, câncer ósseo, câncer pancreático, coriocarcinoma, gastrinoma, feocromocitoma, prolactinoma, leucemia/linfoma de células T, neuroma, doença de Von Hippel-Lindau, síndrome de Zollinger-Ellison, câncer adrenal, câncer anal, câncer de dutos biliares, câncer de bexiga, câncer de ureter, oligodendroglioma, neuroblastoma, meningioma, tumor do cordão espinhal, câncer ósseo, osteocondroma, condrossarcoma, sarcoma de Ewing, câncer de local primário desconhecido, carcinoide, carcinoide do trato gastrointestinal, fibrossarcoma, câncer mamário, doença de Paget, câncer cervical, câncer de esôfago, câncer de vesícula biliar, câncer de cabeça, câncer de olho, câncer de pescoço, câncer renal, tumor de Wilms, câncer de hepático, sarcoma de Kaposi, câncer prostático, câncer testicular, doença de Hodgkin, linfoma não- Hodgkin, câncer de pele, mesotelioma, mieloma múltiplo, câncer ovariano, câncer pancreático endócrino, glucagonoma, câncer paratireoide, câncer peniano, câncer hipofisário, sarcoma de tecidos moles, retinoblastoma, câncer do intestino delgado, câncer estomacal, câncer tímico, câncer tireoideo, câncer trofoblástico, mola hidatiforme, câncer uterino, câncer endometrial, câncer de vagina, câncer da vulva, neuroma acústico, micose fungoide, insulinoma, síndrome carcinoide, somatostatinoma, câncer das gengivas, câncer cardíaco, câncer labial, câncer de membranas, câncer bucal, câncer de nervos, câncer de palato, câncer da glândula parótida, câncer do peritônio, câncer da faringe, câncer pleural, câncer das glândulas salivares, câncer lingual, câncer tonsilar.

19. Uso de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano ou um animal.

20. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 17- 19, caracterizado pelo fato de que o medicamento vai ser administrado através de uma injeção intratumoral, intramuscular, intra-arterial, intravenosa, intrapleural, intravesicular, intracavitária, ou peritoneal, ou uma administração oral.

21. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 17- 20, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral oncolítico que tem uma região globular da fibra diferente do capsídeo em comparação com o vetor do tratamento anterior, vai ser administrado a um indivíduo.

22. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 18- 22, caracterizado pelo fato de que o medicamento vai ser combinado com administração de radioterapia e/ou quimioterapia concomitante.

23. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 18- 23, caracterizado pelo fato de que o medicamento vai ser combinado com administração de verapamil ou outro bloqueador de canais de cálcio e/ou agentes indutores de autofagia e/ou temozolomida e/ou quimioterapia ou terapia anti-CD20 ou outras abordagens para bloquear anticorpos neutralizadores, substâncias capazes de regular de forma descendente células T reguladoras em um indivíduo e/ou ciclofosfamida a um indivíduo.

24. Método para produzir GM-CSF em uma célula in vitro, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transportar um veículo que compreende um vetor adenoviral oncolítico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13 para uma célula, e (b) expressar GM-CSF do dito vetor na célula.

25. Uso do vetor adenoviral oncolítico como definido em qualquer uma das reivindicações 1-13, caracterizado pelo fato de que é na produção de GM-CASF em uma célula in vitro.

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