WO2021194183A1 - 면역 회피성 항종양 아데노바이러스 - Google Patents

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WO2021194183A1
WO2021194183A1 PCT/KR2021/003491 KR2021003491W WO2021194183A1 WO 2021194183 A1 WO2021194183 A1 WO 2021194183A1 KR 2021003491 W KR2021003491 W KR 2021003491W WO 2021194183 A1 WO2021194183 A1 WO 2021194183A1
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tumor
albumin
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antitumor
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최진우
박성훈
찰스고흐너 피터
유중기
최청갑
엄기환
이형빈
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㈜큐리진
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to an antitumor adenovirus capable of evading the immune system in vivo.
  • Cancer is one of the diseases that cause the highest number of deaths worldwide, and the development of innovative cancer treatments can reduce medical costs and create high added value at the same time.
  • molecular therapeutics that can overcome existing anticancer drug resistance accounted for $17.5 billion in 7 major countries (US, Japan, France, Germany, Italy, Spain, UK), and 2018 In the case of 2008, it is expected to occupy a market size of about $45 billion, with a growth rate of 9.5% compared to 2008.
  • Cancer treatment is divided into surgery, radiation therapy, chemotherapy, and biological therapy.
  • chemotherapy is a treatment that suppresses or kills cancer cell proliferation as a chemical substance.
  • Oncorine modified by an E1B-55KD deletion that enables conditional replication in P53-deficient cancer cells. It is a subgroup C adenovirus (H101 is a close analog of ONYX015 described by Bischoff et al. in 1996). Oncorine is administered by intratumoral injection for head and neck cancer. Adenoviruses have been widely used as gene delivery vectors for gene therapy as well as oncolytic agents for cancer treatment. Adenoviruses exhibit several characteristics that make them suitable for this use.
  • adenovirus in terms of safety, does not cause life-threatening diseases in humans, and its viral genome is non-integrative, preventing insertional mutations. Clinical trials using an adenoviral vector have been reported that this virus has a good toxicity and safety profile, although there still remains a need for improved efficacy in the case of systemic administration.
  • systemic administration ie, intravenous or intra-arterial injection into the bloodstream
  • systemic administration is essential to treat disseminated tumors in an advanced or metastatic state.
  • adenovirus shows a significant limitation in reducing the therapeutic effect upon injection into the bloodstream.
  • Adenovirus type 5 (Ad5) undergoes several neutralizing interactions that dramatically reduce the bioavailability of the virus in the bloodstream.
  • liver macrophages mainly liver macrophages referred to as Kupffer cells, as well as liver sinusoidal endothelial cells (LSEC) and liver cells.
  • LSEC liver sinusoidal endothelial cells
  • Ad5 directly binds to blood cells such as red blood cells through CAR receptors, and can bind to platelets through integrins.
  • Antibodies not only directly neutralize the virus, but can also trigger an innate immune response by activating complement and docking viral particles to Fc receptors on monocytes and neutrophils.
  • virus re-administration increases the concentration of anti-Ad neutralizing antibody (NAb), thus enhancing virus neutralization.
  • NAb anti-Ad neutralizing antibody
  • Opsonization of adenovirus by antibodies and complement may also enhance clearance by Kupffer cells. Altogether, these interactions result in a significant shortening of the half-life of Ad in blood to about a few minutes in mice and humans. Significant efforts have been made to avoid neutralization by antibodies and immune cells during systemic administration of adenovirus, but there is still a limit to systemic spread, and it has been reported to be temporary and usually ineffective (Ferguson et al. 2012).
  • adenovirus as a cancer therapeutic agent that is suitable for systemic administration and can evade neutralizing antibodies.
  • the present invention provides an anti-tumor adenovirus comprising a nucleic acid encoding an albumin binding domain.
  • the present invention provides a composition for treating cancer comprising the anti-tumor adenovirus.
  • the adenovirus having high oncolytic ability of the present invention contains a nucleic acid encoding a tumor albumin binding domain, thereby significantly increasing tumor cell infection and killing effects, and increasing binding to albumin.
  • the plasma half-life is increased by avoiding the immune response, and it has a systemic therapeutic effect by being specifically delivered to cancer cells, and it is possible to deliver locally, and it has excellent selectivity and exhibits remarkable anti-tumor efficacy. It can be usefully used as an anticancer adjuvant.
  • FIG. 1 is a diagram showing a vector map of an adenovirus comprising an albumin-binding domain of the present invention.
  • Figure 2 is a diagram confirming the albumin-binding ability of the adenovirus (Hexon and pIX) of the present invention comprising an albumin-binding domain:
  • CA10G control adenovirus
  • Hexon ABD an adenovirus comprising an albumin binding domain in the hexon of an adenoviral vector
  • pIX ABD an adenovirus comprising an albumin binding domain to pIX of an adenoviral vector.
  • Figure 3 is a diagram comparing the binding ability of the existing anti-tumor virus CA10G, which does not contain an albumin-binding domain, with human albumin, of the anti-tumor virus of the present invention, which includes an albumin-binding domain in the hexon region, with human albumin by IP analysis:
  • CA10G control antitumor adenovirus
  • HVR1 Adenovirus (Hexon ABD) comprising an albumin binding domain in the hexon of an adenoviral vector.
  • FIG. 4 is a diagram confirming the tumor cell killing effect by albumin binding of the adenoviruses (Hexon and pIX) of the present invention including an albumin-binding domain as an image:
  • CA10G control adenovirus
  • CA10G-Hexon an adenovirus comprising an albumin binding domain in the hexon of an adenoviral vector
  • CA10G-pIX an adenovirus comprising an albumin binding domain to pIX of an adenoviral vector.
  • Figure 5 is a diagram quantifying the effects of apoptosis (top) and infection (bottom) of bladder cancer cells by albumin binding of the adenoviruses (CA10G-Hexon and CA10G-pIX) of the present invention including an albumin-binding domain.
  • Figure 6 is a diagram quantifying the effects of apoptosis (top) and infection (bottom) of prostate cancer cells and lung cancer cells by albumin binding of the adenovirus of the present invention comprising an albumin-binding domain:
  • CA10G control adenovirus
  • CA10G-A an adenovirus comprising an albumin binding domain in the hexon of an adenoviral vector.
  • FIG. 7 is a diagram confirming in vivo the neutralizing antibody evasion ability (Hexon staining) of the adenovirus of the present invention and the effect of reducing the size and weight of the tumor thereby:
  • CA10G control adenovirus
  • CA10G-a an adenovirus comprising an albumin binding domain in the hexon of an adenoviral vector.
  • nucleic acids are written in a 5' ⁇ 3' direction from left to right.
  • Numerical ranges recited within the specification are inclusive of the numbers defining the range, including each integer or any non-integer fraction within the defined range.
  • the present invention relates to an antitumor adenovirus comprising a nucleic acid encoding an albumin binding domain (ABD).
  • ABSD albumin binding domain
  • a nucleic acid encoding an albumin-binding domain may be included in the coding region of hexon of adenovirus, and the hexon may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO:3.
  • the virus containing the nucleic acid encoding the albumin-binding domain in the coding region of the hexon of the adenovirus vector CA10G which is an anticancer (anti-tumor) virus, is CA10G-Hexon, HVR1, CA10G-a or Hexon ABD. can be marked.
  • the nucleic acid encoding the albumin-binding domain is included in the position between the 154th amino acid (gaa, Glu) and the 155th amino acid (gca, Asp) of the hexon protein encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:3.
  • the nucleotide sequence of the hexon including ABD may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the nucleic acid encoding the albumin-binding domain may be included in the nucleotide sequence encoding pIX (protein IX) of adenovirus, more preferably included at the C-terminus of pIX, encoding the pIX
  • the nucleotide sequence may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13
  • the nucleotide sequence encoding the protein including the albumin-binding domain at the C-terminus of pIX may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14.
  • the nucleic acid encoding the albumin-binding domain may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the albumin binding domain may comprise the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:2.
  • the anti-tumor adenovirus of the present invention may further comprise a human telomere promoter (hTERT) (SEQ ID NO: 7).
  • hTERT human telomere promoter
  • the human telomere promoter may be operably linked to an endogenous gene of an adenovirus, wherein the endogenous gene of the adenovirus has the structure of 5'ITR-C1-C2-C3-C4-C5 3'ITR; wherein C1 comprises E1A (SEQ ID NO: 8), E1B (SEQ ID NO: 9) or E1A-E1B; wherein C2 includes E2B-L1-L2-L3-E2A-L4; wherein C3 does not include E3 or includes E3; wherein C4 includes L5; and C5 may not include E4 or may include E4.
  • operably linked refers to a functional linkage between a gene expression control sequence (eg, an array of promoter, signal sequence, or transcriptional regulatory factor binding sites) and another gene sequence, whereby the Regulatory sequences will control the transcription and/or translation of the other gene sequences.
  • a gene expression control sequence eg, an array of promoter, signal sequence, or transcriptional regulatory factor binding sites
  • the hTERT promoter may be operably linked with E1A and E1B of endogenous genes of adenovirus.
  • an IRES sequence (SEQ ID NO: 10) may be further included between E1A and E1B.
  • the anti-tumor adenovirus of the present invention may further include a hTERT promoter-E1A-IRES-E1B sequence comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the adenovirus of the present invention can be selectively dispersed in a given tissue in vivo, thereby avoiding or significantly reducing its expression in non-target or non-tumor tissues.
  • the replicating adenovirus of the present invention may have modifications in its genomic sequence that confer selective replication in cells.
  • the adenovirus of the present invention may include a tissue-specific promoter or a tumor-specific promoter.
  • the adenovirus further comprises a tissue-specific promoter or a tumor-specific promoter.
  • promoter is used according to the meaning understood in the art. It is intended to mean a region of DNA usually located upstream of the coding sequence of a gene that binds to RNA polymerase and directs the enzyme to the correct transcription initiation site. Promoters control viral genes that initiate replication.
  • tissue-specific is intended to mean that a promoter to which a gene essential for replication is operably linked functions tissue-specifically to proceed with replication in a tissue. This may occur because the positive transcription factor activating the promoter is present in that tissue and not in the non-target tissue. It may also occur due to the absence of transcription inhibitors, which are normally formed in non-target tissues and prevent transcription as a result of promoters. Thus, when transcription is made, it is directed towards a gene essential for replication, so that replication of the vector and its concomitant functions in the target tissue are achieved. Tissue specificity relates particularly to targeting the abnormal counterpart of a specific tissue while avoiding its normal counterpart, or treating abnormal tissue while avoiding other types of surrounding tissue than the abnormal tissue. In certain embodiments, the promoter is “tumor-specific,” meaning that the promoter functions specifically in tumor tissue.
  • an expression cassette expressing a foreign gene of the present invention may be further included, and an expression cassette expressing the foreign gene may be included in the E3 region of the endogenous gene of adenovirus.
  • the antitumor adenovirus of the present invention may further include a CMV promoter (SEQ ID NO: 11) and a GFP-encoding nucleic acid (SEQ ID NO: 12), and may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, CMV A promoter and a GFP encoding nucleic acid may be included in the E3 region of the endogenous gene of the adenovirus.
  • the antitumor adenovirus of the present invention may be selected from the group consisting of human adenovirus serotypes 1 to 57 types.
  • the anti-tumor adenovirus of the present invention may be human adenovirus serotype 5.
  • the gene sequence of human adenovirus serotype 5 can be found in GenBank: AY339865.1 (version of 13th August, 2007).
  • the anti-tumor adenovirus of the present invention may have a higher oncolytic ability than the wild-type adenovirus, and may be an oncolytic adenovirus.
  • the anti-tumor adenovirus of the present invention can be used for cancer gene therapy.
  • promoter refers to an untranslated nucleic acid upstream of a coding region that includes a binding site for RNA polymerase and has transcription initiation activity into mRNA of a gene downstream of the promoter. say sequence.
  • the promoter may be any promoter capable of initiating the expression of shRNA.
  • a promoter constitutive promoter
  • a promoter inducible promoter
  • Examples include U6 promoter, H1 promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, SV40 promoter, CAG promoter (Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991), CaMV 35S promoter (Odell et al., Nature 313: 810-812, 1985), the Rsyn7 promoter (US Patent Application No.
  • the promoter of the present invention may be a U6 promoter, a HI promoter, or a CMV promoter, and according to a preferred embodiment of the present invention, a CMV promoter may be used.
  • adenovirus refers to any virus that can be classified as an adenovirus, that is, Adenoviridae characterized as a non-enveloped virus with an icosahedral nucleocapsid containing a double-stranded DNA genome.
  • Adenoviridae refers to any virus belonging to the family.
  • the term includes any adenovirus capable of infecting humans or animals, including all groups, subgroups and serotypes that use CARs as receptors for infecting target cells.
  • Adenoviruses of the present invention include, but are not limited to, avian, dog, horse, cattle, sheep, swine, human or frog adenoviruses.
  • the adenovirus of the invention is a human adenovirus, ie an adenovirus capable of infecting humans.
  • a "serotype" is each immunologically different type of adenovirus.
  • serotypes classified into several subgroups (A to G).
  • the adenovirus of the present invention is a recombinant adenovirus.
  • the term "recombinant” refers to an adenovirus that is not naturally produced.
  • Such recombinant adenoviruses contain one or more modifications compared to the subtype.
  • modifications include, but are not limited to, modifications to the adenovirus genome that is packed into particles to make an infectious virus.
  • a replication-deficient virus ie, a virus that cannot reproduce
  • modifications include deletions known in the art, such as deletions of one or more of the E1a, E1b, E2a, E2b, E3 or E4 coding regions.
  • adenoviruses are called "gutless" adenoviruses.
  • Chimeric adenoviruses prepared by combining factors derived from different serotypes are also included.
  • the term "recombinant” also includes replication-conditional adenoviruses that replicate preferentially in a particular type of cell or tissue, but with little or no replication in other types. do.
  • it is an adenovirus that replicates in abnormally proliferating tissues such as solid tumors and other neoplasms.
  • viruses include the viruses mentioned in US Pat. No. 5,998,205 and US Pat. No. 5,801,029.
  • Such viruses are sometimes referred to as “cytolytic” or “cytopathic” viruses (or vectors), and “oncolytic” viruses (or vectors) if they have such an effect on neoplastic cells.
  • adenovirus hexon protein or "hexon protein” (previously referred to as “protein II”) is used in adenoviruses, which self-assemble to form hexagonal shaped trimers.
  • hexon protein refers to the capsid major structural protein found. 240 hexon trimers assemble to form an adenovirus capsid.
  • the hexon protein is essential for viral capsid assembly, determination of the icosahedral symmetry of the capsid, and the integrity of the capsid.
  • major structural features of hexon proteins are common among adenovirus serotypes, the size and immunological properties of hexon proteins differ between serotypes.
  • hexon protein is a sequence of the UniProt database of Accession No. P04133, registered on February 19, 2014, corresponding to the hexon protein of human adenovirus C serotype 5, as a non-limiting example.
  • adenovirus C serotype 2 a protein defined by the sequence of the UniProt database with accession number P03277, registered on February 19, 2014, corresponding to the hexon protein of human adenovirus C serotype 2; a protein defined by the sequence of the UniProt database with accession number P42671, registered on February 19, 2014, corresponding to the hexon protein of avian adenovirus gal1 (strain Phelps); and the hexon protein of any adenovirus, such as the protein defined by the sequence of the UniProt database with accession number P11819, registered on February 19, 2014, corresponding to the hexon protein of human adenovirus F serotype 40. .
  • albumin refers to a member of the albumin family of proteins that is a water-soluble globular protein, which is usually dissolved in a concentrated salt solution and undergoes thermal denaturation. Albumin is commonly found in plasma. Serum albumin is produced by the liver, is soluble in plasma, and is the most abundant blood protein in mammals.
  • albumin binding domain refers to any region derived from a native protein capable of binding albumin with sufficient specificity to ensure protection from neutralizing antibodies.
  • the present invention includes functionally equivalent variants of the albumin binding domains described above.
  • the term "functionally equivalent variant” is derived from an albumin binding domain by insertion, deletion or substitution of one or more residues, which substantially retains the ability to interact with albumin as determined above, refers to any polypeptide.
  • the polypeptide comprises at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 100% of the albumin binding capacity of the albumin binding domain of SEQ ID NO:2. If it exhibits albumin binding affinity of , this polypeptide is considered a functional equivalent variant of the albumin binding domain.
  • the polypeptide is an antibody with an efficiency of at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 100% with the albumin binding domain of SEQ ID NO:2. If it can neutralize the polypeptide, it is considered a functional equivalent variant of the albumin binding domain. Suitable functional variants have at least 25% amino acid sequence identity, for example at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, to an albumin binding domain sequence disclosed herein. , at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%.
  • the level of identity between two polypeptides is determined using computer algorithms and methods well known to those of ordinary skill in the art.
  • the identity between two amino acid sequences is preferably determined using the BLASTP algorithm [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)], but other similar algorithms may also be used.
  • BLAST and BLAST 2.0 are used to determine % sequence identity using the parameters mentioned herein. Software for performing BLAST analysis is publicly available through the National Center for Biotechnology Information.
  • Recombinant adenovirus can be obtained via standard molecular biology techniques known in the art (Chillon and Bosch. Adenovirus. Methods and Protocols. 3rd edition. Methods in Molecular Biology, vol. 1089. Springer Protocols. Humana Press. ( 2014)).
  • Adenoviruses comprising the albumin binding domain of the present invention are Chillon and Bosch Adenovirus. Methods and Protocols. 3rd edition. Methods in Molecular Biology, vol. 1089. Springer Protocols. Humana Press. (2014); and Alemany R, Zhang W. Oncolytic adenoviral vectors. As mentioned in Totowa, NJ.: Humana Press, 1999, they are propagated and amplified according to standard methods in the art of adenoviral vectors.
  • A549 cell line is an example of such a cell line.
  • Propagation is performed, for example, as follows: A549 cells are inoculated into plastic cell culture plates, and 100 virus particles per cell are infected. After two days, when the cells detach and form "grape-like" clusters, cytopathic action demonstrates virus production. Cells are harvested in vitro. After centrifugation at 1000 g for 5 minutes, the cell pellet is frozen and thawed 3 times to destroy the cells.
  • the obtained cell extract is centrifuged at 1000 g for 5 minutes, and a cesium chloride concentration gradient is layered on the virus-containing supernatant, followed by centrifugation at 35000 g for 1 hour.
  • the virus bands obtained by concentration gradient are collected and dialyzed against PBS-10% glycerol. Separate the dialyzed virus and store it at -80°C.
  • Virus particle counts and plaque-forming units are quantified according to standard protocols.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • PBS Phosphate buffered saline
  • 5% glycerol is the standard formulation used to store adenovirus.
  • other formulations that improve the stability of the virus are also disclosed.
  • the method for purifying an adenovirus containing an albumin-binding domain for use in the prevention or treatment of cancer is equally applicable to other adenoviruses and adenoviral vectors used in cancer virotherapy and gene therapy.
  • the present invention relates to a composition for treating cancer comprising the antitumor adenovirus of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • composition of the present invention may be administered systemically.
  • composition of the present invention may be for intravenous administration.
  • the composition of the present invention may further include an anticancer agent, for example, acibacin, aclarubicin, acodazole, acronisin, adozelesin, alanosine, aldesleukin, allo Purinol Sodium, Altretamine, Aminoglutethimide, Amonafide, Ampligen, Amsacrine, Androgens, Anguidin, Apidicoline Glycinate, Asaray, Asparaginase, 5-Azacytidine , Azathioprine, Bacillus Calmete-Guerin (BCG), Bakers Antipol, Beta-2-deoxythioguanosine, Bisantrene HCl, Bleomycin Sulfate, Bulsupan, Butionine Sulfoximine, BWA 773U82 , BW 502U83/HCl, BW 7U85 mesylate, cerasemid, carvetimer, carboplatin, carmustine, chloram
  • the cancer is colon cancer, breast cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, prostate cancer, brain tumor, head and neck carcinoma, melanoma, myeloma, leukemia, lymphoma, stomach cancer, lung cancer, pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer , esophageal cancer, small intestine cancer, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, bladder cancer, kidney cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, bone cancer, skin cancer, head cancer, cervical cancer, skin melanoma, intraocular melanoma, endocrine adenocarcinoma, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, central nervous system (CNS) tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, It may be any one selected from the group consisting of glioma
  • composition of the present invention may further include an adjuvant.
  • the adjuvant may be used without limitation as long as it is known in the art, for example, Freund's complete adjuvant or incomplete adjuvant may be further included to increase the effect.
  • composition according to the present invention may be prepared in a form in which the active ingredient is incorporated into a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier includes carriers, excipients and diluents commonly used in the pharmaceutical field.
  • Pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the composition of the present invention include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • composition of the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, or sterile injection solutions according to conventional methods, respectively.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations include at least one excipient in the active ingredient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin. It can be prepared by mixing and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid formulations for oral administration include suspensions, internal solutions, emulsions, syrups, etc.
  • compositions for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used.
  • base of the suppository witepsol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, etc. may be used.
  • the holy material according to the present invention may be administered to an individual by various routes. Any mode of administration may be envisaged, for example, by oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, or intraperitoneal injection, but intravenous administration is most preferred.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention is selected in consideration of the individual's age, weight, sex, physical condition, and the like. It is self-evident that the concentration of the single domain antibody included in the pharmaceutical composition can be variously selected depending on the subject, and is preferably included in the pharmaceutical composition at a concentration of 0.01 to 5,000 ⁇ g/ml. If the concentration is less than 0.01 ⁇ g/ml, pharmaceutical activity may not appear, and if it exceeds 5,000 ⁇ g/ml, it may be toxic to the human body.
  • composition of the present invention can be used for the prevention or treatment of cancer and its complications, and can also be used as an anticancer adjuvant.
  • composition of the present invention is administered in a therapeutically effective amount or a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level depends on the subject type and severity, age, sex, activity of the drug, and the drug. It can be determined according to factors including sensitivity, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, concurrent drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the invention relates to the use of an antitumor adenovirus comprising a nucleic acid encoding an albumin binding domain of the invention for the prevention or treatment of tumors.
  • the present invention relates to a method of treating a tumor with an antitumor adenovirus comprising a nucleic acid encoding an albumin binding domain of the present invention.
  • Example 1 Preparation of anticancer (antitumor) virus containing albumin binding domain
  • Streptococcus sp. The 154th amino acid (gaa, Glu) of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) encoding the albumin binding domain derived from G148 (SEQ ID NO: 1) encoding the hexon of the adenovirus vector (SEQ ID NO: 3) and inserted between the codons expressing the 155th amino acid (gca, Asp) (the nucleotide sequence encoding Hexon-ABD-Hexon: SEQ ID NO: 6), and the hTERT promoter-E1A-IRES-E1B sequence (SEQ ID NO: 4)
  • the CMV promoter and the sequence coding for Dasher GFP (SEQ ID NO: 5) were inserted between SpeI of the E3 region (FIG. 1).
  • nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) encoding the albumin-binding domain was inserted before the stop codon TAA at the C-terminal site of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 13) encoding pIX (protein IX) of adenovirus (pIX-ABD: SEQ ID NO: 14) to construct a viral vector and then a virus was produced.
  • human albumin ELISA analysis was performed using the virus-coated plate. Specifically, the control virus CA10G, each of the pIX-ABD and Hexon-ABD viruses prepared above with ELISA coating buffer (R&D system, DY006) to 1.5 x 10 9 , 7.5 x 10 8 and 3.75 x 10 8 pfu/ml After dilution, 100 ul of this was put into a 96-well plate and incubated at 4° C. overnight.
  • both the pIX-ABD and Hexon-ABD viruses showed significantly higher binding to albumin than the control group, and in particular, the Hexon-ABD virus showed significantly higher binding to albumin (FIG. 2).
  • IP immunoprecipitation
  • the adenovirus containing ABD prepared in Example 1 binds to human serum albumin (HSA) in vivo to avoid antibody attack and kill cancer cells.
  • HSA human serum albumin
  • the bladder cancer cell line 253JBV, the prostate cancer cell line PC3, and the lung cancer cell line A549 were each dispensed in a 96-well plate at 5 and 2.5 x 10 3 cells/well, and then cultured overnight in a CO 2 5% incubator at 37 °C.
  • the ABD-containing adenovirus (Hexon-ABD or pIX-ABD) and the ABD-free control virus (CA10G) prepared in the above Example were mixed with a medium containing 10 mg/ml of HSA (medium not containing FBS).
  • the cells were treated at 100 ⁇ L/well, respectively, and the adenovirus type 5 antibody (Abcam, ab6982) was diluted 100-fold with a medium not containing FBS, followed by an additional 20 in the wells treated with HSA + virus. ul each was treated and then cultured for 72 hours. Thereafter, the degree of virus infection according to the presence or absence of the adenovirus type 5 antibody was visually checked, and the state of the virus-induced cells was photographed at 40 magnification, 3 per group. Cell viability was analyzed compared to the control group by measuring the area of the cells in the pictures taken using the image J program.
  • the adenovirus type 5 antibody Abcam, ab6982
  • viruses containing ABD in pIX or hexon showed a similar degree of apoptosis depending on the presence or absence of antibody. It was found that the ability to do so was significantly higher ( FIGS. 4 and 5 ).
  • the anticancer virus containing ABD in hexon of the present invention evades the antibody and significantly kills the cells ( FIG. 6 ).
  • the anticancer adenovirus of the present invention including ABD, can kill cancer cells by avoiding the attack of the antibody.
  • mice were intraperitoneally (IP) injected with 3.0 x 10 10 vp of wild-type adenovirus (ATCC, VR-1516 TM ), followed by intravenous (IV) injection of the same amount of wild-type adenovirus 7 days later. did. After 7 days, the mouse blood was extracted, centrifuged at 600 g for 5 minutes, serum from the upper layer was collected, heat-inactivated at 55° C., and stored at -80° C. until use.
  • IP intraperitoneally
  • IV intravenous
  • the excised tissue was molded in OCT compound and stored at -80°C for one day, then sectioned to a thickness of 6 ⁇ m with a cryosection and fixed with 4% PFA. Then, it was permeabilized with PBS containing 0.3% triton x-100 for 30 minutes and blocked with PBS containing 5% BSA. Then, after reacting with goat anti-hexon ab (Merck, ab1056) (1:200) at room temperature for 1 hour, washed twice with PBS and anti-goat IgG-conjugated alexa fluor488 antibody (1:500) The images were analyzed by reacting at room temperature for 1 hour and mounting.
  • CA10G-a showed that the anticancer virus significantly inhibited tumor growth compared to CA10G ( FIG. 7 ).
  • the results of the immunochemical staining analysis also showed that CA10G-a proliferated in a larger amount even though the same amount of virus was administered ( FIG. 7 ).
  • the anti-cancer virus of the present invention better avoids the antibody by ABD compared to the existing anti-cancer virus, thereby significantly increasing the tumor growth inhibitory function.

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Abstract

본 발명은 생체 내 면역 체계를 회피할 수 있는 항종양 아데노바이러스에 관한 것으로, 본 발명의 종양살상능이 높은 아데노바이러스는 종양 알부민 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 포함함으로써, 종양 세포 감염 및 사멸 효과가 현저히 증가하였으며, 알부민과의 결합이 증가하므로, 이로 인해, 체내 면역 반응을 회피하여 혈장 반감기가 증가하고, 암세포에 특이적으로 전달되어 전신 치료 효과가 있으며, 국소 전달이 가능하고, 선택성이 뛰어나 항-종양 효능이 현저한 효과를 나타내, 다양한 암종에 항암용 조성물 또는 항암보조제로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

면역 회피성 항종양 아데노바이러스
본 발명은 생체 내 면역 체계를 회피할 수 있는 항종양 아데노바이러스에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 가장 많은 사망자를 내는 질병 중 하나로, 혁신적인 암 치료제의 개발은 이에 대한 치료시 발생되는 의료비를 절감할 수 있음과 동시에 고부가가치를 창출할 수 있다. 또한, 2008년의 통계에 따르면, 기존항암제 내성을 극복 할 수 있는 분자 치료제는 주요 7개국 (US, Japan, France, Germany, Italy, Spain, UK)에서 $17.5 빌리언(billion)을 차지했고, 2018년의 경우 약 $45 빌리언정도의 시장 크기(market size)를 차지하여, 2008년 대비 9.5%의 성장률을 보일 것이라 예측되고 있다. 암의 치료는 수술, 방사선치료, 화학요법, 생물학적 치료로 구분되는데, 이 중에 화학요법은 화학물질로서 암 세포의 증식을 억제하거나 죽이는 치료법으로 항암제에 의하여 나타나는 독성은 상당부분 정상세포에서도 나타나기 때문에 일정 정도의 독성을 나타내며, 항암제가 효과를 나타내다가도 일정 기간의 사용 후에는 효과가 상실되는 내성이 발생하기 때문에 암세포에 선택적으로 작용하고 내성이 생기지 않는 항암제의 개발이 절실하다 (암 정복의 현주소 Biowave 2004. 6(19)). 최근 암에 대한 분자유전정보의 확보를 통해 암의 분자적 특성을 표적으로 한 새로운 항암제의 개발이 진행되고 있으며, 암세포만이 가지고 있는 특징적인 분자적 표적(molecular target)을 겨냥하는 항암제들은 약제 내성이 생기지 않는다는 보고도 있다.
자연 바이러스 감염 또는 바이러스 예방접종 후의 일시적인 암 차도의 입증되지 않은 보고로 인해, 암 치료를 위해 바이러스를 사용한 실험들이 있다. 최초 보고는 광견병을 위해 백신접종된 환자에서의 자궁경부암의 감소에 기인한 1912년으로, 유사한 결과가 천연두 예방접종 또는 천연 바이러스 감염 예컨대 볼거리 또는 홍역이 뒤따르는 암 환자에게서 나타났다. 이들 보고 및 동물 데이터에 기초한 암 치료를 위해 환자에 생 바이러스를 접종한 것은 1940년대 후반 및 1950년대 초반 경의 일이다. 그러나, 때때로 일시적 종양 감소 이후, 종양이 재성장하고 환자가 사망하는 문제들이 발생했다. 이들 접종은 장기-지속적인 차도가 나타나지 않았다. 1957년에, 생경구 소아마비 백신을 개발한 Albert B. Sabin, M.D.는 종양용해성 바이러스가 종양을 사멸시키는 경우에도 바이러스에 대한 개인의 면역 반응이 너무 빨라 그 효과가 급속하게 소진되는 문제가 가장 큰 것으로 언급하였다.
현 시점에서, 수많은 종양용해성 바이러스가 확인되었으나 현재까지 세상 어디에서도 임상 사용을 위해 승인된 유일한 바이러스는 P53-결핍된 암세포에서 조건적 복제를 가능하게 하는 E1B-55KD 결실에 의해 개질된 Oncorine (H101) 하위그룹 C 아데노바이러스이다 (H101은 1996년에 Bischoff 등에 의해 기재된 ONYX015의 밀접한 유사체임). Oncorine은 두경부암에 대한 종양 내 주사에 의해 투여된다. 아데노바이러스는 유전자 테라피를 위한 유전자 전달 벡터로서 뿐 아니라 암 치료를 위한 종양분해제(oncolytic agent)로서 널리 사용되어 왔다. 아데노바이러스는 이러한 용도에 적합한 몇가지 특징들을 나타낸다. 즉, 아데노바이러스의 구조와 생물학적 특성은 널리 연구되어 있어, 이들의 게놈을 용이하게 변형시킬 수 있으며, 이들 바이러스는 복제성 세포 및 복제불가 세포 모두를 감염시킬 수 있으며, 임상적으로 사용하기에 높은 역가 (titer)로 쉽게 생산될 수 있다. 아데노바이러스는, 안전성 측면에서, 인간에게서 생명을 위협하는 질병을 유발하지 않으며, 그 바이러스 게놈은 삽입 돌연변이가 방지되는 비-삽입형 (non-integrative)이다. 아데노바이러스계 벡터를 이용한 임상 실험들은, 이 바이러스가, 전신 투여의 경우에는 효능 개선의 필요성이 아직 남아있긴 하지만, 양호한 독성 및 안전성 프로파일을 가진 것으로 보고되고 있다.
이와 같이, 유전자 테라피 분야에서, 전신 투여, 즉 정맥내 또는 동맥내 혈류로의 주입은, 다수 장기들과 파종성 세포(disseminated cell)들에 도달하기 위해 필요할 수도 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터 및 종양분해성 아데노바이러스를 이용한 암 테라피에서, 진행된 상태이거나 전이성 상태의 파종성 종양들을 치료하기 위해서는 전신 투여가 필수적이다. 그러나, 아데노바이러스는 혈류로의 주입시 테라피 효과를 떨어뜨리는 상당한 한계를 보인다. 아데노바이러스 타입 5 (Ad5)는 혈류에서 바이러스의 생체이용성을 급격하게 떨어뜨리는 여러가지 중화성 상호작용(neutralizing interaction)을 겪게 된다. 주입된 투여량의 >90%가 간, 주로 쿠퍼 세포로 지칭되는 간 대식세포와, 또한 간의 LSEC (liver sinusoidal endothelial cell) 및 간 세포에 체류하기 때문에, 이 테라피의 가장 큰 문제점은 간 격리이다. 혈액 세포 및 단백질과의 직접적인 상호작용 역시 주요한 장애가 된다. Ad5는 CAR 수용체를 통해 적혈구 등의 혈액 세포에 직접 결합하며, 인테그린을 통해 혈소판에 결합할 수 있다. 항체는 바이러스를 직접 중화시킬 뿐만 아니라 보체 활성화 및 단핵세포와 호중구의 Fc 수용체에 바이러스 입자를 도킹(docking)시킴으로써 선천적인 면역 반응을 촉발시킬 수도 있다. 또한, 바이러스 재-투여는 항-Ad 중화 항체(NAb)의 농도를 증가시키며, 따라서, 바이러스 중화도 강화된다. 항체 및 보체에 의한 아데노바이러스의 옵소닌 작용(opsonization) 역시 쿠퍼 세포에 의한 제거(clearance)를 강화할 수 있다. 전체적으로, 이들 상호작용은 마우스 및 인간에서 혈중 Ad의 반감기를 약 수분으로 크게 단축시키는 결과를 발생시킨다. 아데노바이러스의 전신 투여시 항체 및 면역 세포에 의한 중화를 회피하기 위한 상당한 노력들이 행해져왔으나, 아직도 전신 전파에 한계가 있으며, 일시적인 것이면서 대개 비효과적인 것으로 보고되었다 (Ferguson 등 2012).
따라서, 전신 투여에 적합하며 중화 항체를 회피할 수 있는 암 치료제로서의 아데노바이러스에 대한 연구가 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 항종양 아데노바이러스를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 알부민 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 항종양 아데노바이러스를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 항종양 아데노바이러스를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 종양살상능이 높은 아데노바이러스는 종양 알부민 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 포함함으로써, 종양 세포 감염 및 사멸 효과가 현저히 증가하였으며, 알부민과의 결합이 증가하므로, 이로 인해, 체내 면역 반응을 회피하여 혈장 반감기가 증가하고, 암세포에 특이적으로 전달되어 전신 치료 효과가 있으며, 국소 전달이 가능하고, 선택성이 뛰어나 항-종양 효능이 현저한 효과를 나타내, 다양한 암종에 항암용 조성물 또는 항암보조제로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 알부민 결합 도메인을 포함하는 아데노바이러스의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 2는 알부민 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 아데노바이러스 (Hexon 및 pIX)의 알부민 결합능을 확인한 도이다:
CA10G: 대조군 아데노바이러스;
Hexon ABD: 아데노바이러스 벡터의 헥손(Hexon)에 알부민 결합 도메인을 포함하는 아데노바이러스; 및
pIX ABD: 아데노바이러스 벡터의 pIX에 알부민 결합 도메인을 포함하는 아데노바이러스.
도 3은 알부민 결합 도메인을 포함하지 않는 기존의 항종양 바이러스 CA10G와 알부민 결합 도메인을 헥손 영역에 포함하는 본 발명의 항종양 바이러스의 인간 알부민과의 결합능을 IP 분석으로 비교한 도이다:
CA10G: 대조군 항종양 아데노바이러스; 및
HVR1: 아데노바이러스 벡터의 헥손(Hexon)에 알부민 결합 도메인을 포함하는 아데노바이러스 (Hexon ABD).
도 4는 알부민 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 아데노바이러스 (Hexon 및 pIX)의 알부민 결합에 의한 종양 세포 사멸 효과를 이미지로 확인한 도이다:
CA10G: 대조군 아데노바이러스;
CA10G-Hexon: 아데노바이러스 벡터의 헥손(Hexon)에 알부민 결합 도메인을 포함하는 아데노바이러스; 및
CA10G-pIX: 아데노바이러스 벡터의 pIX에 알부민 결합 도메인을 포함하는 아데노바이러스.
도 5는 알부민 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 아데노바이러스 (CA10G-Hexon 및 CA10G-pIX)의 알부민 결합에 의한 방광암 세포의 사멸 (상) 및 감염 (하) 효과를 정량화한 도이다.
도 6은 알부민 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 아데노바이러스의 알부민 결합에 의한 전립선암 세포 및 폐암 세포의, 사멸 (상) 및 감염 (하) 효과를 정량화한 도이다:
CA10G: 대조군 아데노바이러스; 및
CA10G-A: 아데노바이러스 벡터의 헥손(Hexon)에 알부민 결합 도메인을 포함하는 아데노바이러스.
도 7은 본 발명의 아데노바이러스의 중화 항체 회피능 (Hexon staining) 및 이에 의한 종양의 크기 및 무게 감소 효과를 in vivo로 확인한 도이다:
i.v.: 정맥 내 주사;
i.t.: 종양 내 직접 주사;
CA10G: 대조군 아데노바이러스; 및
CA10G-a: 아데노바이러스 벡터의 헥손(Hexon)에 알부민 결합 도메인을 포함하는 아데노바이러스.
이하, 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'→3' 방향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.
일 측면에서, 본 발명은 알부민 결합 도메인(albumin binding domain, ABD)을 코딩하는 핵산을 포함하는 항종양 아데노바이러스에 관한 것이다.
일 구현예에서, 알부민 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 아데노바이러스의 헥손(Hexon)의 코딩 영역에 포함할 수 있으며, 상기 헥손은 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서 알부민 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 항암(항종양) 바이러스인 아데노바이러스 벡터 CA10G의 헥손(Hexon)의 코딩 영역에 포함하는 바이러스는 CA10G-Hexon, HVR1, CA10G-a 또는 Hexon ABD로 혼용하여 표기될 수 있다.
일 구현예에서, 알부민 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 코딩된 헥손 단백질의 154번째 아미노산 (gaa, Glu) 및 155번째 아미노산 (gca, Asp)의 사이 위치에 포함할 수 있으며, ABD를 포함하는 헥손의 염기서열은 서열번호 6의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 알부민 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 아데노바이러스의 pIX(protein IX)를 코딩하는 염기서열에 포함할 수 있으며, pIX의 C-말단에 포함하는 것이 더욱 바람직하고, 상기 pIX를 코딩하는 염기서열은 서열번호 13의 염기서열을 포함할 수 있으며, pIX의 C-말단에 알부민 결합 도메인이 포함된 단백질을 코딩하는 염기서열은 서열번호 14의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 알부민 결합 도메인을 코딩하는 핵산은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 알부민 결합 도메인은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항종양 아데노바이러스는 인간 텔로미어 프로모터(hTERT) (서열번호 7)를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 인간 텔로미어 프로모터는 아데노바이러스의 내재적 유전자와 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 아데노바이러스의 내재적 유전자는 5'ITR-C1-C2-C3-C4-C5 3'ITR의 구조를 가지며; 상기 C1은 E1A (서열번호 8), E1B (서열번호 9) 또는 E1A-E1B를 포함하고; 상기 C2는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4를 포함하며; 상기 C3는 E3가 포함하지 않거나 E3를 포함하고; 상기 C4는 L5를 포함하며; 및 상기 C5는 E4를 포함하지 않거나 E4를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 유전자 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절 인자 결합 위치의 어레이)과 다른 유전자 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 유전자 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
일 구현예에서, hTERT 프로모터가 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E1A 및 E1B와 작동가능하게 연결될 수 있다.
일 구현예에서, E1A 및 E1B 사이에 IRES 서열 (서열번호 10)이 추가로 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항종양 아데노바이러스는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 hTERT 프로모터-E1A-IRES-E1B 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스는 생체내에서 소정의 조직에 선택적으로 분산될 수 있어, 비-표적 또는 비-종양 조직에서의 발현을 회피하거나 또는 현저하게 줄일 수 있다.
본 발명의 복제 아데노바이러스는 세포에 선택적인 복제를 부여하는 변형을 게놈 서열에 가질 수 있다. 아데노바이러스의 발현이 필요한 조직 또는 치료할 종양 조직에 아데노바이러스의 발현을 인가하기 위해, 본 발명의 아데노바이러스는 조직-특이적 프로모터 또는 종양-특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 따라서, 일구현예에서, 아데노바이러스는 조직-특이적 프로모터 또는 종양-특이적 프로모터를 더 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어, "프로모터"는 당업계에서 이해되는 의미에 따라 사용된다. 이는 RNA 중합효소에 결합하여 효소를 올바른 전사 개시 사이트로 향하게 하는, 유전자의 코딩 서열의 통상 상류에 위치한 DNA 영역을 의미하는 것으로 의도된다. 프로모터는 복제를 개시하는 바이러스 유전자를 제어한다.
본 발명에 있어서, 용어, "조직-특이"는, 복제에 필수적인 유전자가 작동가능하게 연결된 프로모터가 조직 특이적으로 기능하여 조직에서 복제를 진행한다는 의미로 의도된다. 이는 프로모터를 활성화하는 파지티브 전사 인자가 그 조직에 존재하고 비-표적 조직에는 존재하지 않음으로써, 발생할 수 있다. 또한, 이는 비-표적 조직에서 정상적으로 형성되어 프로모터의 결과로서 전사를 방지하는, 전사 저해 인자의 부재로 인해 발생할 수 있다. 따라서, 전사가 이루어질 때, 표적 조직에서 벡터의 복제 및 이의 수반 기능이 이루어지도록, 복제에 필수적인 유전자 쪽으로 향하게 된다. 조직 특이성은 특히 조직의 정상적인 대응체 (counterpart)는 회피하면서 특정 조직의 비정상적인 대응체를 표적화하거나, 또는 비정상 조직을 치료하면서 비정상 조직 이외의 다른 타입의 주변 조직을 회피하는 것과 관련 있다. 특정 구현예에서, 프로모터는 "종양-특이적"이며, 이는 프로모터가 종양 조직에서 특이적으로 기능한다는 의미이다.
일 구현예에서, 본 발명의 외래 유전자를 발현하는 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있으며, 외래 유전자를 발현하는 발현 카세트를 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E3 부위에 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항종양 아데노바이러스는 CMV 프로모터 (서열번호 11) 및 GFP 코딩 핵산 (서열번호 12)을 추가로 포함할 수 있으며, 서열번호 5의 염기서열을 포함할 수 있으며, CMV 프로모터 및 GFP 코딩 핵산을 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E3 부위에 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항종양 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 1 내지 57 타입으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항종양 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 5 타입일 수 있다. 인간 아데노바이러스 혈청형 5의 유전자 서열은 GenBank: AY339865.1 (version of 13th August, 2007)에서 찾을 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항종양 아데노바이러스는 야생형 아데노바이러스에 비해 종양살상능이 높을 수 있으며, 종양분해성 아데노바이러스일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항종양 아데노바이러스는 암 유전자 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어, "프로모터"란, RNA 중합효소에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 다운스트림 (downstream) 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열을 말한다. 본 발명의 발현 카세트에 있어서, 상기 프로모터는 shRNA의 발현을 개시할 수 있는 어떤 프로모터도 가능하다. 구체적으로, 본 발명의 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 (inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 U6 프로모터, H1 프로모터, CMV (cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, CAG 프로모터 (Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991), CaMV 35S 프로모터 (Odell et al.,Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터 (미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴 (rice actin) 프로모터 (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터 (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터 등 당업자에게 자명한 공지의 모든 프로모터를 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 프로모터는 U6 프로모터, HI 프로모터, CMV 프로모터일 수 있으며, 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면 CMV 프로모터를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어, "아데노바이러스"는 아데노바이러스로 분류될 수 있는 임의의 바이러스, 즉 이중 가닥 DNA 게놈을 함유한 정20면체 뉴클레오캡시드를 가진 비-외막형 바이러스로 특정되는 아데노비리대 (Adenoviridae) 과에 속하는 임의의 바이러스를 지칭한다. 이 용어는, 표적 세포를 감염시키기 위한 수용체로서 CAR을 이용하는 모든 그룹, 서브그룹 및 혈청형을 비롯해, 인간 또는 동물을 감염시킬 수 있는 임의의 아데노바이러스를 포함한다. 본 발명의 아데노바이러스는, 비제한적인 예로, 조류, 개, 말, 소, 양, 돼지, 인간 또는 개구리 아데노바이러스를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스, 즉, 인간을 감염시킬 수 있는 아데노바이러스이다. 본 발명에 따르면, "혈청형"은 아데노바이러스의 면역학적으로 서로 다른 각각의 타입이다. 인간 아데노바이러스의 경우 몇가지 서브그룹 (A에서 G)으로 분류되는 혈청형은 적어도 57종이다.
본 발명의 아데노바이러스는 재조합 아데노바이러스이다. 본 발명에 있어서, 용어, "재조합"은 천연적으로는 생성되지 않는 아데노바이러스를 지칭한다. 이러한 재조합 아데노바이러스는 아생형과 비교해 하나 이상의 변형을 포함한다. 이러한 변형으로는, 비제한적으로, 감염성 바이러스를 만들기 위해 입자 안에 패킹되는 아데노바이러스 게놈에 대한 변형을 포함한다. 그외 변형들로, 복제에 중요한 유전자를 바이러스 게놈에서 제거함으로써 복제-결핍 바이러스 (즉, 재생산할 수 없는 바이러스)를 수득할 수 있다. 변형의 예로는, E1a, E1b, E2a, E2b, E3 또는 E4 코딩 영역들 중 하나 이상의 결손 등의 통상의 기술 분야에 공지된 결손을 포함한다. 그외 변형으로는 아데노바이러스 게놈의 코딩 영역 전체의 결손을 포함한다. 이런 아데노바이러스를 "gutless" 아데노바이러스라고 한다. 서로 다른 혈청형으로부터 유래된 인자들을 조합하여 제조된 키메라 아데노바이러스도 포함된다.
본 발명에 있어서, 용어, "재조합"은 또한 특정 타입의 세포 또는 조직에서 선호적으로 복제하지만, 다른 타입들에서도 약간 복제하거나 또는 전혀 복제하지 않는, 복제-조건부 (replication-conditional) 아데노바이러스를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 제시된 아데노바이러스들 중, 고형 종양 및 그외 신생물 등과 같이 비정상적으로 증식하는 조직에서 복제하는 아데노바이러스이다. 이러한 것으로는 미국 특허 5,998,205 및 미국 특허 5,801,029에 언급된 바이러스를 포함한다. 이러한 바이러스는 때때로 "세포용해성" 또는 "세포변성 (cytopathic)" 바이러스 (또는 벡터)라 지칭되며, 이것이 신생물 세포에 그러한 효과를 가지는 경우 "종양분해성" 바이러스 (또는 벡터)라 한다.
본 발명에 있어서, 용어, "아데노바이러스 헥손 단백질" 또는 "헥손 단백질 "(종래에는 "단백질 II"로 지칭됨)은, 자가-조립하여, 각각이 6각형 형상인 트리머를 형성하는, 아데노바이러스에서 발견되는 캡시드 주요 구조 단백질을 지칭하다. 240개의 헥손 트리머가 조립하여, 아데노바이러스 캡시드가 된다. 헥손 단백질은 바이러스 캡시드 조립, 캡시드의 20면체 대칭 결정 및 캡시드의 완전성에 필수적이다. 헥손 단백질의 주요한 구조적 특징들은 아데노바이러스 혈청형들 간에 공통되지만, 헥손 단백질의 크기와 면역학적 특성은 혈청형들 간에 차이가 있다.
본 발명에 있어서, 용어, "헥손 단백질"은 비제한적인 예로, 인간 아데노바이러스 C 혈청형 5의 헥손 단백질에 해당하는, 2014년 2월 19일에 등록된 수탁 번호 P04133의 UniProt 데이타베이스의 서열로 정의되는 단백질; 인간 아데노바이러스 C 혈청형 2의 헥손 단백질에 해당하는, 2014년 2월 19일에 등록된 수탁 번호 P03277의 UniProt 데이타베이스의 서열로 정의되는 단백질; 조류 아데노바이러스 gal1 (strain Phelps)의 헥손 단백질에 해당하는, 2014년 2월 19일에 등록된 수탁 번호 P42671의 UniProt 데이타베이스의 서열로 정의되는 단백질; 및 인간 아데노바이러스 F 혈청형 40의 헥손 단백질에 해당하는, 2014년 2월 19일에 등록된 수탁 번호 P11819의 UniProt 데이타베이스의 서열로 정의되는 단백질 등의, 임의의 아데노바이러스의 헥손 단백질을 포괄한다. 이 표현은 다른 서브그룹 또는 혈청형에서 천연적으로 발생하는 헥손 단백질의 모든 천연 변이체들을 포괄한다. 헥손 단백질의 Loop 1 (L1) 및 Loop 2 (L2)는 바이러스 캡소미어 구조의 외면 상에 노출되는 것으로 보고되어 있다.
본 발명에 있어서, 용어, "알부민"은 수용성 구상 단백질 (globular protein)로, 진한 염 용액에 보통 수준으로 용해되며, 열 변성을 겪는, 알부민 패밀리 단백질에 속하는 구성원을 지칭한다. 알부민은 혈장에서 일반적으로 발견된다. 혈청 알부민은 간에서 생산되며, 혈장에 용해되며, 포유류에서 가장 풍부한 혈액 단백질이다.
본 발명에 있어서, 용어, "알부민 결합 도메인"은 중화 항체로부터의 보호를 보장하기 위해 충분한 특이성으로 알부민에 결합할 수 있는 천연 단백질로부터 유래되는 임의 영역을 지칭한다.
본 발명은 상기한 알부민 결합 도메인의 기능적인 등가 변이체를 포함한다. 본 발명에 있어서, 용어, "기능적으로 등가 변이체"는 하나 이상의 잔기의 삽입, 결손 또는 치환에 의해 알부민 결합 도메인으로부터 파생되며, 상기와 같이 결정된 바와 같이 알부민과 상호작용하는 능력을 실질적으로 유지하는, 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드가, 서열번호 2의 알부민 결합 도메인의 알부민 결합력의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 알부민 결합력을 보인다면, 이 폴리펩타이드는 알부민 결합 도메인의 기능적인 등가 변이체로 간주된다. 바람직하게는, 폴리펩타이드가, 서열번호 2의 알부민 결합 도메인과 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 효율로 항체를 중화할 수 있다면, 이 폴리펩타이드는 알부민 결합 도메인의 기능적인 등가 변이체로 간주된다. 적합한 기능 변이체들은, 본 발명에 개시된 알부민 결합 도메인 서열에 대해, 적어도 25%의 아미노산 서열 동일성, 예를 들어 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성 수준을 나타내는 것이다. 2가지 폴리펩타이드 간의 동일성 수준은 통상의 기술 분야의 당업자에게 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘 및 방법을 이용해 결정된다. 2개의 아미노산 서열 간의 동일성은 바람직하게는 BLASTP 알고리즘 [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]을 이용해 결정되지만, 다른 유사한 알고리즘도 사용될 수 있다. BLAST 및 BLAST 2.0을 본원에 언급된 파라미터를 적용해 이용하여, 서열 동일성 %를 결정한다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터를 통해 공개적으로 이용가능하다.
재조합 아데노바이러스는 당해 기술 분야에 공지된 표준 분자 생물 기법을 통해 수득할 수 있다 (Chillon and Bosch. Adenovirus. Methods and Protocols. 3rd edition. Methods in Molecular Biology, vol. 1089. Springer Protocols. Humana Press. (2014)). 본 발명의 알부민 결합 도메인을 포함하는 아데노바이러스는 Chillon 및 Bosch Adenovirus. Methods and Protocols. 3rd edition. Methods in Molecular Biology, vol. 1089. Springer Protocols. Humana Press. (2014); 및 Alemany R, Zhang W. Oncolytic adenoviral vectors. Totowa, NJ.: Humana Press, 1999에 언급된 바와 같이, 아데노바이러스 벡터 분야에서 표준적인 방법에 따라 증식 및 증폭된다. 유전자 테라피 및 바이로테라피 분야에서 일반적으로 사용되는 세포주는 HEK-293 세포주와 A549 세포주이다. 바람직한 증식 방법은 아데노바이러스의 복제를 허용하는 세포주에 감염시키는 것이다. 폐 선암종 A549 세포주가 그러한 세포주의 일예이다. 증식은, 예를 들어, 다음과 같이 수행된다: A549 세포를 플라스틱 세포 배양 플레이트에 접종하고, 세포 당 바이러스 입자 100개를 감염시킨다. 2일 후, 세포가 탈착되어 "포도처럼" 클러스터를 형성할 때, 세포변성 작용은 바이러스 생산을 입증한다. 세포를 시험관에서 회수한다. 이를 5분간 1000 g로 원심분리한 후, 세포 펠렛을 3번 냉동 및 해동하여, 세포를 파괴한다. 수득된 세포 추출물을 5분간 1000 g로 원심분리하고, 바이러스가 함유된 상층액 위에 세슘 클로라이드 농도 구배를 적층하여 1시간 동안 35000 g로 원심분리한다. 농도 구배에 의해 수득되는 바이러스 밴드를 수집하여, PBS-10% 글리세롤로 투석한다. 투석한 바이러스를 분액하여 -80℃에 보관한다. 바이러스 입자 수와 플라그-형성 단위를 표준 프로토콜에 따라 정량한다. 5% 글리세롤이 첨가된 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)는 아데노바이러스를 저장하는데 사용되는 표준 제형이다. 그러나, 바이러스의 안정성을 향상시키는 다른 제형도 개시되어 있다.
암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 알부민 결합 도메인을 포함하는 아데노바이러스의 정제 방법은 암의 바이로테라피와 유전자 테라피에 사용되는 다른 아데노바이러스와 아데노바이러스 벡터에 대해서도 동일하게 적용된다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항종양 아데노바이러스와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암 치료용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 전신으로 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정맥 투여용일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항암제를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어, 아시바이신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로나이신, 아도젤레신, 알라노신, 알데스루킨, 알로푸리놀 소듐, 알트레타민, 아미노글루테티미드, 아모나파이드, 암플리겐, 암사크린, 안드로겐스, 안구이딘, 아피디콜린 글리시네이트, 아사레이, 아스파라기나아제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 바실러스 칼메테-구에린(BCG), 베이커스 안티폴, 베타-2-디옥시티오구아노신, 비스안트렌 HCl, 블레오마이신 설페이트, 불서판, 부티오닌 설폭시민, BWA 773U82, BW 502U83/HCl, BW 7U85 메실레이트, 세라세미드, 카르베티머, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 클로로퀴녹살린-설포나미드, 클로로조토신, 크로모마이신 A3, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티코스테로이드, 코리너박테리움 파르붐, CPT-11, 크리스나톨, 사이클로사이티딘, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 사이템베나, 다비스 말리에이트, 데카르바진, 닥티노마이신, 다우노루바이신 HCl, 디아자유리딘, 덱스라족산, 디언하이드로 갈락티톨, 디아지쿠온, 디브로모둘시톨, 디데민 B, 디에틸디티오카르바메이트, 디클라이코알데하이드, 다이하이드로-5-아자사이틴, 독소루비신, 에치노마이신, 데다트렉세이트, 에델포신, 에플롤니틴, 엘리옷스 용액, 엘사미트루신, 에피루비신, 에소루비신, 에스트라머스틴 포스페이트, 에스트로겐, 에타니다졸, 에티오포스, 에토포사이드, 파드라졸, 파자라빈, 펜레티나이드, 필그라스팀, 피나스테라이드, 플라본 아세트산, 플록스유리딘, 플루다라빈 포스페이트, 5'-플루오로우라실, Fluosol™, 플루타미드, 갈륨 나이트레이트, 겜사이타빈, 고세레린 아세테이트, 헤프설팜, 헥사메틸렌 비스아세트아미드, 호모하링토닌, 하이드라진 설페이트, 4-하이드록시안드로스테네디온, 하이드로지우레아, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 4-이포메아놀, 이프로플라틴, 이소트레티노인, 류코보린 칼슘, 류프로라이드 아세테이트, 레바미솔, 리포좀 다우노루비신, 리포좀 포집 독소루비신, 로머스틴, 로니다민, 마이탄신, 메클로레타민 하이드로클로라이드, 멜팔란, 메노가릴, 메르바론, 6-머캅토푸린, 메스나, 바실러스 칼레테-구에린의 메탄올 추출물, 메토트렉세이트, N-메틸포름아미드, 미페프리스톤, 미토구아존, 마이토마이신-C, 미토탄, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 모노사이트/마크로파아지 콜로니-자극 인자, 나빌론, 나폭시딘, 네오카르지노스타틴, 옥트레오타이드 아세테이트, 오르마플라틴, 옥살리플라틴, 파크리탁셀, 팔라, 펜토스타틴, 피페라진디온, 피포브로만, 피라루비신, 피리트렉심, 피록산트론 하이드로클로라이드, PIXY-321, 플리카마이신, 포르피머 소듐, 프레드니무스틴, 프로카르바진, 프로게스틴스, 파이라조푸린, 라족산, 사르그라모스팀, 세무스틴, 스피로게르마늄, 스피로무스틴, 스트렙토나이그린, 스트렙토조신, 술로페너르, 수라민 소듐, 타목시펜, 탁소레레, 테가푸르, 테니포사이드, 테레프탈아미딘, 테록시론, 티오구아닌, 티오테파, 티미딘 인젝션, 티아조푸린, 토포테칸, 토레미펜, 트레티노인, 트리플루오페라진 하이드로클로라이드, 트리플루리딘, 트리메트렉세이트, TNF(tumor necrosis factor), 우라실 머스타드, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 비노렐빈, 빈졸리딘, Yoshi 864, 조루비신, 사이토신아라비노시드, 에토포시드, 멜파란, 탁솔 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직하게는 시스플라틴, 파클리탁셀, 5-FU(5-fluorouracil), 메토트렉세이트, 독소루비신, 다우노루비신, 사이토신아라비노시드, 에토포시드, 멜파란, 클로람부실, 사이클로포스파마이드, 빈데신, 마이토마이신, 블레오마이신, 타목시펜 및 탁솔이고, 더욱 바람직하게는, 시스플라틴, 파클리탁셀 또는 5-FU(5-fluorouracil)이나, 본 발명의 조성물과 병용 처리하여 항암 효과에 시너지 효과를 나타낼 수 있는 목적을 달성하기 위해서라면, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계(central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 다형성교모세포종 및 뇌하수체선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 조성물에는 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 효과를 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 정맥 투여되는 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 단일 도메인 항체 의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 조성물은 암 및 이의 합병증의 예방 또는 치료에 이용될 수 있으며, 항암보조제로도 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 치료적 유효량 또는 약학으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 알부민 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 항종양 아데노바이러스의 종양 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 알부민 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 항종양 아데노바이러스의 종양 치료 방법에 관한 것이다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 알부민 결합 도메인을 포함하는 항암(항종양) 바이러스 제작
1-1. ABD를 헥손에 삽입한 아데노바이러스 제작
Streptococcus sp. G148 유래 알부민 결합 도메인(albumin binding domain, ABD)을 코딩하는 염기서열 (서열번호 1)을 아데노바이러스 벡터의 헥손(Hexon)을 코딩하는 염기서열 (서열번호 3)의 154번째 아미노산 (gaa, Glu)과 155번째 아미노산 (gca, Asp)을 발현하는 코돈의 사이에 삽입하였으며 (Hexon-ABD-Hexon을 코딩하는 염기서열: 서열번호 6), hTERT 프로모터-E1A-IRES-E1B 서열 (서열번호 4)을 삽입하였고, CMV 프로모터와 Dasher GFP를 코딩하는 서열 (서열번호 5)은 E3 region의 SpeⅠ사이에 삽입하였다 (도 1). 완성된 바이러스 벡터의 서열을 분석하여, 이상이 없을 경우 PacⅠ제한효소를 이용하여 바이러스 유전체를 선형화한 뒤, CaCl2 법을 이용해 293A 세포에 형질도입하여 각 바이러스를 생산하였다.
1-2. ABD를 헥손 pIX에 삽입한 아데노바이러스 제작
상기와 같이 제작하되, 알부민 결합 도메인을 코딩하는 염기서열 (서열번호 1)을 아데노바이러스의 pIX(protein IX)를 코딩하는 염기서열 (서열번호 13)의 C-말단 부위에서 스탑 코돈인 TAA 전에 삽입하여 (pIX-ABD: 서열번호 14) 바이러스 벡터를 제작한 후 바이러스를 생산하였다.
실시예 2. 항암 바이러스의 인간 알부민과의 결합능 확인
상기 실시예에서 제작한 알부민 결합 도메인을 포함하는 아데노바이러스의 알부민과의 결합 정도를 확인하기 위해, 상기 바이러스가 코팅된 플레이트를 이용하여 인간 알부민 ELISA 분석을 수행하였다. 구체적으로, 대조군 바이러스 CA10G, 상기에서 제작한 pIX-ABD 및 Hexon-ABD 바이러스 각각을 ELISA 코팅 버퍼 (R&D system, DY006)로 1.5 x 109, 7.5 x 108 및 3.75 x 108 pfu/ml이 되게 희석한 뒤, 이를 96웰 플레이트에 100 ul씩 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 상기 용액을 버리고 세척 버퍼(Wash buffer) 200 ul를 넣어 세척하는 과정을 3 회 실시하고, 0.5% Tween20가 포함되어 있는 PBS를 이용하여 5 mg/mL BSA를 만들고 이를 100 ul/웰로 첨가하여 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 뒤, 3회 세척하고 1 % BSA 포함 PBS로 만든 5 mg/ml의 HSA (Sigma, A1653)를 웰 당 100 ul씩 넣고 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 뒤, 3회 세척하고 1차 항체로 1% BSA 포함 PBS로 400 배 희석한 ALB 항체 (Santacruz, sc-271604)를 웰 당 100 ul씩 넣고 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 3회 세척하고 2차 항체로 1% BSA 포함 PBS로 1,000 배 희석한 anti-mouse HRP (Santacruz, sc-516102)를 웰 당 100 ul씩 넣고 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 3회 세척하고 Color reagent A 및 B (R&D systems, DY999)를 1 : 1로 혼합한 용액을 웰 당 100 ul씩 넣고 상온에서 15분 동안 반응시켰다. 그 후, 2N 농도의 황산용액 100 ㎕를 첨가하여 발색 반응을 중지시키고 마이크로플레이트 리더기로 450 nm에서의 흡광도를 측정한 뒤, 각각의 바이러스와 인간 알부민의 결합 정도를 비교하였다.
그 결과, pIX-ABD 및 Hexon-ABD 바이러스 모두 대조군에 비해 알부민과의 결합이 현저히 높게 나타났으며, 특히 Hexon-ABD 바이러스가 알부민과의 결합이 현저히 높게 나타났다 (도 2).
실시예 3. 항암 바이러스와 기존 바이러스의 인간 알부민 결합능 비교
항암 바이러스와 인간 알부민의 결합을 기존 바이러스와 비교하기 위해, 면역침강(IP) 분석을 수행하였다. 구체적으로, 알부민 결합 도메인을 포함하지 않는 기존의 항암 바이러스 CA10G와 알부민 결합 도메인을 헥손 영역에 포함하는 항암 바이러스 CA10G-a(HVR1) (Hexon-ABD)를 각각 튜브에 2.0 x 1010 vp(virus particle) 넣고 1 ㎍의 인간 알부민을 각각의 tube에 넣은 뒤, PBS를 이용하여 총 부피가 1 ml이 되게하여 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 1 ㎍의 항-알부민 항체 및 30 ul의 프로테인 A/G 아가로스를 상기의 튜브에 넣고 5 rpm으로 4 시간 동안 4 ℃에서 교반하고 샘플 버퍼를 이용하여 웨스턴 블롯 샘플을 제작하였다. 상기 샘플을 8% SDS-PAGE 젤 (1.0mm plate, 10well comb)에서 100V 조건으로 70분 동안 전기영동하고 PVDF 멤브레인으로 트랜스퍼하고 5% 스킴밀크로 블로킹한 뒤 Ad5 항체를 1차 항체로 이용하여 4 ℃ 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 항-래빗 항체를 이차 항체로 이용하여 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 HRP 기질을 이용하여 밴드를 확인하였다.
ABD 결합 서열을 포함한 본 발명의 항암 바이러스 Hexon-ABD (HVR1)와 인간 알부민의 결합 여부를 밴드에서 확인한 결과, CA10G와 달리, 항암 바이러스가 알부민과 결합하는 것으로 나타나 (도 3), 혈중 투여시 중화 항체와의 반응을 회피함으로써 기존의 항암 바이러스 CA10G보다 우수한 효과를 나타낼 것으로 유추된다.
실시예 4. 항암 바이러스의 중화 항체 회피능 확인
4-1. in vitro
상기 실시예 1에서 제작한 ABD 포함 아데노바이러스가 생체 내에서 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)과 결합함으로써 항체 공격을 피해 암세포를 사멸시키는지 확인하였다. 구체적으로, 96웰 플레이트에 방광암 세포주 253JBV, 전립선암 세포주 PC3 및 폐암 세포주 A549를 각각 5, 2.5 x 103 cells/웰로 분주한 뒤, 37 ℃의 CO2 5% 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하였다. 그 후, 상기 실시예에서 제작한 ABD 포함 아데노바이러스 (Hexon-ABD 또는 pIX-ABD)와 ABD를 포함하지 않은 대조군 바이러스(CA10G)를 HSA 10mg/ml가 포함된 배지 (FBS가 포함되지 않은 배지)로 희석한 후 상온에서 30분간 반응시키고 세포에 각각 100μL/웰로 처리하고, Adenovirus type 5 항체 (Abcam, ab6982)를 FBS가 포함되지 않은 배지로 100배 희석한 뒤 HSA+바이러스를 처리한 웰에 추가적으로 20 ul씩 처리한 뒤 72시간 동안 배양하였다. 그 후, Adenovirus type 5 항체 유무에 따른 바이러스 감염 정도를 육안으로 확인하고, 바이러스에 의한 세포의 상태를 군 당 3 장씩 40 배율로 사진 촬영하였다. image J 프로그램을 이용하여 촬영한 사진에서 세포의 면적을 측정하여 대조군 대비 세포 생존률을 분석하였다.
그 결과, 방광암 세포주의 경우, pIX 또는 헥손에 ABD를 포함하는 바이러스들은 항체의 유무에 따른 세포사멸 정도가 유사한 것으로 나타났으며, 특히, Hexon-ABD가 pIX-ABD보다 항체를 회피하여 세포를 사멸시키는 능력이 현저히 높게 나타났다 (도 4 및 5). 또한, 전립선암 세포주 및 폐암 세포주에서도 본 발명의 헥손에 ABD를 포함하는 항암 바이러스가 항체를 회피하여 세포를 현저히 사멸시키는 것으로 나타났다 (도 6). 이를 통해, ABD를 포함하는 본 발명의 항암 아데노바이러스가 항체의 공격을 피해 암세포를 죽일 수 있는 것을 알 수 있다.
4-2. in vivo
Balb/c 6주령 수컷 마우스에 3.0 x 1010 vp의 야생형 아데노바이러스 (ATCC, VR-1516TM)를 복강 내(I.P.) 주사하고, 7일 후 동일한 양의 야생형 아데노바이러스를 정맥 내(I.V.) 주사하였다. 7일 후, 마우스의 혈액을 추출한 뒤, 600g에서 5분 동안 원심분리하고 상층부의 혈청을 수거하고 55℃에서 열-불활성화(Heat-inactivation)한 후 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다. Balb/c nu-nu 6주령 수컷 마우스에 5.0 x 106개의 방광암 세포주 253J-BV를 이식한 후, 일주일에 두 번씩 크기를 관찰하고, 종양의 크기가 평균 50-100 mm3이 되었을 때, 각 종양의 크기의 평균값이 일정하게 각 군으로 나누고, 상기의 혈청 100 ul을 정맥 내 주사하여 면역화하였다. 면역화 4시간 후 3.0 x 109 vp의 CA10G 및 Hexon-ABD(CA10G-a)를 각각 종양 내 주사 및 정맥 내 주사하였다. 7일 후 마우스를 안락사하여 종양을 적출하여 크기 및 무게를 확인하고, 면역화학염색 분석을 수행하였다. 구체적으로, 적출한 조직을 O.C.T. 화합물에 몰딩하여 -80℃에 하루 보관한 뒤 동결절편기로 6 um의 두께로 섹션하여 4% PFA로 고정하였다. 그 후, 0.3% triton x-100가 포함된 PBS로 30분간 투과화(permeabilization)하고 5 % BSA가 포함된 PBS로 블로킹하였다. 그 뒤, 고트 항-hexon ab (Merck, ab1056) (1:200)와 1시간 동안 상온에서 반응시킨 뒤, PBS로 2회 세척하고 항-고트 IgG 컨쥬게이트된 alexa fluor488 항체 (1:500)와 1시간 동안 상온에서 반응시키고 마운팅하여 이미지를 분석하였다.
종양의 크기 및 무게를 확인한 결과, CA10G에 비해 CA10G-a가 항암 바이러스가 종양성장을 현저히 억제하는 것으로 나타났다 (도 7). 또한, 면역화학염색 분석 결과에서도 CA10G-a가 동일양의 바이러스를 투여했음에도 더 많은 양의 바이러스가 증식한 것으로 나타났다 (도 7). 이를 통해, 본 발명의 항암 바이러스가 ABD에 의해 기존의 항암 바이러스에 비해 항체를 더 잘 회피하여, 종양 성장억제 기능이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있다.

Claims (23)

  1. 알부민 결합 도메인(albumin binding domain, ABD)을 코딩하는 핵산을 포함하는 항종양 아데노바이러스.
  2. 제 1항에 있어서, 알부민 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 아데노바이러스의 헥손(Hexon)의 코딩 영역에 포함하는, 항종양 아데노바이러스.
  3. 제 1항에 있어서, 알부민 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 코딩된 헥손 단백질의 154번째 아미노산 (gaa, Glu) 및 155번째 아미노산 (gca, Asp)의 코돈 사이 위치에 포함하는, 항종양 아데노바이러스.
  4. 제 1항에 있어서, 알부민 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 아데노바이러스의 pIX(protein IX)의 코딩 영역에 포함하는, 항종양 아데노바이러스.
  5. 제 1항에 있어서, 알부민 결합 도메인을 코딩하는 핵산은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는, 항종양 아데노바이러스.
  6. 제 1항에 있어서, 알부민 결합 도메인은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항종양 아데노바이러스.
  7. 제 1항에 있어서, 인간 텔로미어 프로모터(hTERT)를 추가로 포함하는, 항종양 아데노바이러스.
  8. 제 7항에 있어서, 인간 텔로미어 프로모터는 아데노바이러스의 내재적 유전자와 작동 가능하게 연결된, 항종양 아데노바이러스.
  9. 제 8항에 있어서, 아데노바이러스의 내재적 유전자는 5'ITR-C1-C2-C3-C4-C5 3'ITR의 구조를 가지며;
    상기 C1은 E1A, E1B 또는 E1A-E1B를 포함하고;
    상기 C2는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4를 포함하며;
    상기 C3는 E3가 포함하지 않거나 E3를 포함하고;
    상기 C4는 L5를 포함하며; 및
    상기 C5는 E4를 포함하지 않거나 E4를 포함하는, 항종양 아데노바이러스.
  10. 제 9항에 있어서, hTERT 프로모터가 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E1A 및 E1B와 작동가능하게 연결된, 항종양 아데노바이러스.
  11. 제 9항에 있어서, E1A 및 E1B 사이에 IRES 서열이 추가로 포함된, 항종양 아데노바이러스.
  12. 제 1항에 있어서, 외래 유전자를 발현하는 발현 카세트를 추가로 포함하는, 항종양 아데노바이러스.
  13. 제 12항에 있어서, 발현 카세트를 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E3 부위에 포함하는, 항종양 아데노바이러스.
  14. 제 1항에 있어서, 인간 아데노바이러스 혈청형 1 내지 57 타입으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항종양 아데노바이러스.
  15. 제 1항에 있어서, 인간 아데노바이러스 혈청형 5 타입인, 항종양 아데노바이러스.
  16. 제 1항에 있어서, 야생형 아데노바이러스에 비해 종양살상능이 높은, 항종양 아데노바이러스.
  17. 제 1항에 있어서, 종양분해성 아데노바이러스 (oncolytic adenovirus)인, 항종양 아데노바이러스.
  18. 제 1항에 있어서, 암 유전자 치료에 사용되는, 항종양 아데노바이러스.
  19. 제 1항의 항종양 아데노바이러스와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암 치료용 조성물.
  20. 제 19항에 있어서, 전신으로 투여되는 암 치료용 조성물.
  21. 제 19항에 있어서, 정맥 투여용인 암 치료용 조성물.
  22. 알부민 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 항종양 아데노바이러스의 종양 예방 또는 치료 용도.
  23. 알부민 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 항종양 아데노바이러스의 종양 치료 방법.
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