TR201802728T4 - Heterolog genlerle donatılmış onkolitik adenovirüsler. - Google Patents

Abstract

Mevcut açıklama, örneğin bir terapötik ve / veya haberci transgeni, özellikle bir serotip 11 adenovirüs gibi bir B grubu virüsü veya Ad11'in fiber, penton ve hekzonlu bir kimerik virüsünü, örneğin bu virüsü ihtiva eden bir farmasötik formülasyon gibi bir kompozisyon içeren en az bir transgen ile donatılan bir modifiye edilmiş adenovirüs ile, özellikle tedavide, daha da özel olarak kanserin tedavisinde virüs ve virüs formülasyonlarının kullanımı ile ilgilidir. Açıklama ayrıca virüs hazırlama proseslerini de kapsar.

Description

TARIFNAME HETEROLOG GENLERLE DONATILMIS ONKOLITIK ADENOVIRÜSLER Mevcut açiklama, örnegin bir terapötik ve / veya haberci transgeni, özellikle bir serotip 11 adenovirüs gibi bir B grubu virüsü veya Ad11'in fiber, penton ve hekzonlu bir kimerik virüsünü, örnegin bu virüsü ihtiva eden bir farmasötik formülasyon gibi bir kompozisyon içeren en az bir transgen ile donatilan bir modifiye edilmis adenovirüs ile, özellikle tedavide, daha da özel olarak kanserin tedavisinde virüs ve virüs formülasyonlarinin kullanimi ile ilgilidir. Açiklama ayrica virüs hazirlama proseslerini de kapsar.

ARKA PLAN Yinelenmesi yetersiz olan adenovirüs vektörleri, transgenlerin verilmesi için birkaç yildir arastirilmaktadir. Çogunlukla, viral genomun bu bölgeleri vektörler için gerekli olmadigindan, genler E1 bölgesine ve / veya E3 bölgesine yerlestirilmistir.

Transgenlerin adenovirüs genomuna sokulmasi için alternatif yerler üzerinde sasirtici bir sekilde nispeten az bir çalisma yapildi. Buna ek olarak, çalismalarin çogu Ad5'te gerçeklestirildi.

Hali hazirda tibbi tedavide, replikasyona elverisli onkolitik adenovirüslerin yeni nesli bulunmaktadir. Bu virüsler, kopyalanmalari için tamamlayici hücre dizilerine ihtiyaç duymaz. E1, viral replikasyon için önemli bir bölgedir ve E3 bölgesi teoride, bir transgenin yerlestirilmesi için bir yer olarak kullanilabilirken, bu konumdan daha fazlasina bir transgenin yerlestirilebilmesi yararli olacaktir. Bununla birlikte, virüsün yasam döngüsü ve / veya virüsün terapötik özellikleri gibi avantajli virüs özelliklerini bozmamaya dikkat edilmelidir. bir onkolitik adenovirüstür, Ad11p'den fiber, penton ve hekzona sahiptir. dolayisiyla bir alt grup B virüsüdür. Ad11p ve Ad3'ten DNA içeren bir kimerik E28 bölgesi vardir.

E3 bölgesinin neredeyse tamami ve E4 bölgesinin bir kismi EnAd`de silinir.

Dolayisiyla, genomda, ek genetik materyal canli kalirken, bunu barindiracak önemli bir alana sahiptir. Dahasi, EnAd bir alt grup B adenovirüs oldugundan, insanlardaki önceden var olan bagisiklik, örnegin Ad5'e göre daha az yaygindir. Adli fiberli, pentonlu ve hekzonlu kimerik onkolitik virüslerin diger örnekleri arasinda OvAd1 ve EnAd, tümör hücrelerini tercih edilen sekliyle enfekte ediyor gibi görünmekte, bu hücrelerde hizla çogalmakta ve hücre Iizisine neden olmaktadir. Bu da, inflamatuar bagisiklik tepkileri üretebilir, böylece vücudu kanserle savasmaya tesvik eder.

EnAd'in basarisinin bir kisminin, virüsün in vivo olarak hizli replikasyonu ile iliskili oldugu hipotezi ortaya atilmistir.

EnAd, seçici olarak tümör hücrelerini parçalarken, virüsün terapötik etkinliginin arttirilmasi ya da bir hücre sinyal proteinini kodlayan bir transgen gibi transgenlerle veya bir hücre sinyal proteinini (veya proteinlerini) uyaran bir varligi kodlayan bir transgeni veya bir antikorla donatilarak virüsün yan etkilerinin azaltilmasi gibi baska yararli özellikleri sunmak da mümkündür.

Avantajli bir sekilde, kanser hücresi içerisinde eksprese edilebilen belirli proteinleri kodlayan DNA ile bir virüs donatmak, örnegin hücreleri bagisiklik sistemi için daha fazla görünür hale getirerek veya tercih edilen sekliyle tümör hücrelerini hedefleyen terapötik bir gen / proteini vererek tüm hücrelere karsi daha etkili bir sekilde mücadele etmek Için vücudun kendi savunmalarinin kullanilmasini saglayabilir.

Dahasi, haberci olan transgenleri genoma ekleyebilme kabiliyeti klinik veya klinik öncesi çalismalara yardimci olabilir.

Transgenlerin ekspresyonunun, virüsün replikasyonunu veya diger avantajli özelliklerini olumsuz bir sekilde etkilememesi önemlidir. Bu nedenle, gen veya genler, virüsün replikasyon yeterliligini ve diger avantajli özelliklerinden ödün vermeyen bir yere yerlestirilmelidir. Buna ek olarak, adenovirüslerin genomu siki bir sekilde sarilmistir ve bu nedenle transgenlerin yerlestirilmesi için uygun bir yer bulmak zor olabilir. Bu da, yerlestirilebilecek transgenlerin boyutunu sinirlar.

Terapötik ürünlerde, etken maddenin özelliklerini tam olarak kontrol etmek önemlidir, böylece iyi tanimlanmis ve tekrarlanabilir sekilde hazirlanabilir. Rasgele yerlestirilen transpozonlari kullanan önceki teknige ait sistemler, farmasötik ürünlerde kullanim için çok uygun degildir, çünkü transgen, rastgele virüs genomuna yerlesir ve ekleme bölgesi, transgenin kendisi tarafindan etkilenebilir. Transpozon ile yerlestirilen genlerin alternatif genlerle degistirilmesi de zor olabilir.

Bu nedenle, çok çesitli transgenlere toleransli olan saglam ve tekrarlanabilir bir silahli adenovirüs üretme araci gelistirmek arzu edilir.

Mevcut bulus sahipleri, tümör hücrelerinde transgeni eksprese eden, canli, stabil, geri kazanilabilir bir virüse yol açan, endojen veya egzojen bir promotörün kontrolü altindaki çok çesitli transgenleri yerlestirmek için uygun bir adenovirüs saglama yöntemi gelistirmistir. Yöntem saglam ve tekrarlanabilir ve kesinlikle kontrol edilebilir.

Transgen, virüsün stabilitesini olumsuz olarak etkilemeyen, genin 5' ucunda ve /veya 3' ucunda, fiber proteinini kodlayan genin yakininda (bitisik) bulunur.

Mevcut bulus sahipleri, antikorlar veya antikor parçalari ve hücre sinyal proteinleri formundaki karmasik proteinlerin adenovirüslerin genomundaki bu lokasyona, örnegin Ad11 ve Ad11'den türetilmis virüsler gibi B grubu virüslere örnegin endojen E4 ya da önemli geç promotörün kontrolü altinda sokulabilecegini ve basarili bir sekilde eksprese edildigini tespit etmistir, böylece protein sentezlenmekte ve virüs replikasyonu tehlikeye atilmamaktadir.

Mevcut bulus sahipleri tarafindan gelistirilen bir plazmid, mevcut bulusun virüslerini temin etmek üzere L5 (fiber) geninin yakininda transgen kasetlerinin sokulmasi için kullanilabilen yeni adenovirüs genomu bölgeleri sunmaktadir. Alternatif olarak, bu yerlestirme yeri mevkilerinde transgenleri veya transgen kasetleri içeren plazmitler, bir klonlama basamagi olmadan ve dolayisiyla kisitlama bölgelerini kullanmak zorunda kalmadan dogrudan tam olarak sentezlenebilir.

Bulusun Kisa Açiklamasi yetkin B grubu onkolitik adenovirüs saglanmaktadir: 'lTR- Bi- Bbir- B2- Bx- BB- BY- B3- 3'ITR (I) 81 bir bagdir veya E1A, E1B veya E1A- E1B içerir; 82 bir bagdir veya ES içerir; Bx bir bag veya bir kisitlama bölgesi, bir veya daha fazla transgen veya her ikisini de içeren bir DNA sekansidir; BB L5 içerir; BY bir transgen ve bir ek yeri alici sekansi içeren bir transgen kasetini içerir; ve Ba bir bagdir ya da E4'ü içerir; burada transgen kaseti, E4 ve büyük geç promotörden olusan gruptan seçilen bir endojen promotörün kontrolü altindadir ve transgen kaseti, bir RNAi sekansi, bir antikoru veya bunun bir baglama fragmanindan, kemokinler, sitokinler, immünomodülatör ve enzimlerden olusan gruptan seçilen bir terapötik gen kodlayici materyali içerir.

Bir düzenlemede Bx Bir kisitlama bölgesi, örnegin 1, 2, 3 veya 4, mesela 1 veya 2 gibi bir kisitlama bölgesi içerir. Bir düzenlemede Bxen az bir transgen, örnegin 1 veya 2 transgen içerir. Bir düzenlemede Bx özellikle de kisitlama bölgelerinin, bunu/bunlari spesifik olarak genomdan kesmesine ve / veya degistirmesine müsaade eden bir geni veya genleri içeren DNA sekansini sikistirdigi yerlerde en az bir transgen, örnegin 1 veya 2 transgen ve bir veya daha fazla kisitlama bölgesi, örnegin 2 veya 3 kisitlama bölgesi ihtiva eder. Alternatif olarak, kisitlama bölgeleri her geni sikistirabilir, örnegin iki transgen oldugu zaman, genlerin seçilerek kesilmesini ve / veya degistirilebilmesini saglamak için üç farkli kisitlama bölgesi gereklidir. Bir düzenlemede, bir veya daha fazla, örnegin tüm transgenler bir transgen kaseti biçimindedir. Bir düzenlemede, Bx SEK ID NO: 10'u kapsar. Bir düzenlemede, SEK (kesilmemektedir). Bir düzenlemede, Bx bir kisitlama alani içermez. Bir düzenlemede, Bx bir bagdir. Bir düzenlemede, Bx bir veya daha fazla transgen ihtiva eder veya bunlardan olusur.

Bir düzenlemede BY Bir kisitlama bölgesi, örnegin 1 veya 2 gibi 1, 2, 3 veya 4 kisitlama bölgesi içerir. Bir düzenlemede BY en az bir transgen, örnegin 1 veya 2 transgen içerir. Bir düzenlemede BY özellikle de kisitlama bölgelerinin, bunu/bunlari spesifik olarak genomdan kesmesine ve / veya degistirmesine müsaade eden bir geni veya genleri içeren DNA sekansini sikistirdigi yerlerde en az bir transgen, örnegin 1 veya 2 transgen ve bir veya daha fazla kisitlama bölgesi, örnegin 2 veya 3 kisitlama bölgesi ihtiva eder. Alternatif olarak, kisitlama bölgeleri her geni sikistirabilir, örnegin iki transgen oldugu zaman, genlerin seçilerek kesilmesini ve / veya degistirilebilmesini saglamak için üç farkli kisitlama bölgesi gereklidir. Bir düzenlemede, bir veya daha fazla, örnegin tüm transgenler bir transgen kaseti biçimindedir. Bir düzenlemede BY SEK lD NO: 11'i içerir. Bir düzenlemede, SEK ID NO: 11, örnegin bir transgen ile kesilir. Bir düzenlemede, SEK lD NO: 11 süreklidir (kesilmemektedir). Bir düzenlemede, BY bir kisitlama alani içermez. Bir düzenlemede, BY bir veya daha fazla transgen ihtiva eder veya bunlardan olusur.

Bir düzenlemede Bx ve BY nin her biri bir kisitlama bölgesi, örnegin 1 veya 2 gibi 1, 2, 3 veya 4 kisitlama bölgesi içerir. Bir düzenlemede Bx ve BY her biri en az bir transgene, örnegin 1 veya 2 transgen ihtiva eder. Bir düzenlemede Bx ve BY 'nin her biri özellikle de kisitlama bölgelerinin, bunu/bunlari spesifik olarak genomdan kesmesine ve /veya degistirmesine müsaade eden bir geni veya genleri içeren DNA sekansini sikistirdigi yerlerde en az bir transgen, örnegin 1 veya 2 transgen ve bir veya daha fazla kisitlama bölgesi, örnegin 2 veya 3 kisitlama bölgesi ihtiva eder.

Alternatif olarak, kisitlama bölgeleri her geni sikistirabilir, örnegin iki transgen oldugu zaman, genlerin seçilerek kesilmesini ve / veya degistirilebilmesini saglamak için üç farkli kisitlama bölgesi gereklidir. Bir düzenlemede, bir veya daha fazla, örnegin tüm transgenler bir transgen kaseti biçimindedir. Bir düzenlemede Bx ve BY sirasiyla SEK içermez. Bir düzenlemede Bx bir bagdir ve BY bir bag degildir.

Bir düzenlemede transgen Bx'te yerlesiktir. Bir düzenlemede transgen veya transgen kaseti BY'de yerlesiktir. Bir düzenlemede bir transgen veya transgen kasedi Bx ve Bv'de konumludur, örnegin, transgenler her konumda ayni veya farkli olabilir.

Avantaj saglayan haliyle, mevcut virüs yapilarindaki transgen, erken genlerden çikarilan bir yere sokulur, çünkü bu durum virüs geni ekspresyonunu veya replikasyon hizini etkileme ihtimalini azaltir.

Bir düzenlemede, serotip 11'in veya bunun virüs türevinin replikasyonuna yetkin bir onkolitik adenovirüs saglanir; burada fiber, hekzon ve kapsid serotip 11'dir, burada virüs genomu bir terapötik antikor veya antikor baglayici fragmani kodlayan bir DNA sekansi içerir, adi geçen DNA sekansi, virüs replikasyonuna müdahale etmeyecek sekilde, E4'den ve büyük geç promotörden seçilen adenovirüs için endojen olan bir promoterin kontrolü altindadir, burada örnegin, terapötik antikor veya antikoru baglayan fragmani kodlayan DNA sekansi, E4 promotörünün kontrolü altinda veya alternatif olarak büyük geç promotörün kontrolü altindadir, özellikle de virüs genom sekansinda L5'den sonra (yani, virüs sekansinin 3' ucuna dogru) yer alan bir antikoru veya antikoru baglayan fragmani kodlayan DNA sekansidir. Avantajli bir sekilde, bir endojen promotörün kullanilmasi transgenlerin yerlestirilmesi için mevcut alan miktarini en üst düzeye çikarmaktadir.

Avantaj saglayan haliyle, bu promotörlerin kontrolü altindayken, virüs çogalmaya elverisli kalir ve antikoru tam uzunlukta bir antikor veya uygun bir baglama fragmani veya baska bir protein olarak eksprese edebilir. Böylece antikor veya seçilen diger protein, kanser hücresi tarafindan eksprese edilecektir. Bir endojen promotör kullanmak, avantajli olabilir, çünkü bu antikoru, fragmani veya baska bir proteini eksprese etmek için dahil edilmesi gereken transgen kasetinin boyutunu azaltir; baska bir deyisle kaset daha küçük olabilir; çünkü egzojen bir promotörün dahil edilmesi gerekmez.

Virüste bir endojen promotörün kullanilmasi, terapötik bir baglamda avantajli olabilir, çünkü transgen sadece, sürekli olarak transgeni kopyalayacak ve antikorun veya fragmanin uygun olmayan bir konsantrasyonuna yol açabilecek yapici bir egzojen promotörün aksine virüs çogaliyorken eksprese edilir.

Bir düzenlemeden, antikorun veya fragmanin ifadesi büyük geç promotörün kontrolü altindadir.

Bir düzenlemede, antikorun veya fragmanin ekspresyonu E4 promotörünün kontrolü altindadir.

Bir yaklasimda, serotip 11'in veya bunun virüs türevinin replikasyonuna yetkin bir onkolitik adenovirüs saglanir; burada fiber, hekzon ve kapsid serotip 11'dir, burada virüs genomu bir terapötik antikor veya virüs çogalma döngüsünde geç eksprese edilen ve transgenin virüs çogalmasi ile çakismadigi sekilde virüs genomunun bir kisminda konumlu antikor baglayici fragmani kodlayan bir DNA sekansi içerir, adi geçen DNA sekansi, virüs replikasyonuna müdahale etmeyecek sekilde, adenovirüs için endojen olan bir promoterin kontrolü altindadir, burada örnegin, terapötik antikor veya antikoru baglayan fragmani kodlayan DNA sekansi, CMW promotörünün kontrolü altindadir, özellikle de bir antikoru veya antikoru baglayan fragmani kodlayan DNA sekansi virüs genom sekansinda L5'den sonra (yani, virüs sekansinin 3' ucuna dogru) yer alir. Bir egzojen promotör kullanmak, avantajli olabilir, çünkü örnegin bazi durumlarda çok yararli olabilen, örnegin hastanin çok yaygin kansere sahip oldugu durumda, antikoru veya fragmani kuvvetli sekilde ve yapisal olarak eksprese edebilir. Bir düzenlemede, antikorun veya fragmanin ekspresyonu bir CMV promotörünün kontrolü altindadir. Bir düzenlemede, egzojen promotör, bu DNA sekansi ile iliskilidir. örnegin antikoru veya fragmani kodlayan ekspresyon kasetinin bir parçasidir.

Bir düzenlemede, antikoru veya fragmanini kodlayan DNA sekansi, virüs sekansinda L5 geninden sonra bulunur. Avantaj saglayan haliyle, mevcut bulus sahipleri, virüsün yasam döngüsünü veya vektörün stabilitesini olumsuz bir sekilde etkilemeksizin bir egzojen ya da endojen promotörün kontrolü altinda Bx ve/veya Bv'ye çesitli transgenlerin eklenebilecegini tespit etmistir.

Bir düzenlemede transgen, en az bir kodlama dizisi (yani, en az bir transgen) ve istege bagli olarak asagidakilerden bagimsiz olarak seçilen bir veya daha fazla öge içeren bir transgen kasetinin parçasidir: i. Bir egzojen promotör veya ek yeri alici gibi bir gen ekspresyon düzenleyicisi; ii. Bir iç ribozom girisi (IRES) DNA sekansi; iii. Yüksek kendiliginden bölünme verimli 2A peptidini kodlayan bir DNA sekansi; iv. Bir poliadenilasyon sekansini kodlayan bir DNA sekansi ve v. Bunlarin kombinasyonlari.

Dolayisiyla, bir yapilanmada, transgen kaseti i) veya ii) veya iii) veya iv) içerir.

Bir düzenlemede transgen kaseti, i) ve ii) veya i) ve iii) veya i) ve iv) veya ii) ve iii) Bir düzenlemede, transgen kaseti i) ve ii) ve iii), veya i) ve ii) ve iv), veya i) ve iii) ve Bir düzenlemede, transgen kaseti i) ve ii)'yi ve iii) ve iv)'ü içerir.

Bir düzenlemede, transgen veya transgen kaseti, örnegin bir protein kodlama sekansinin baslangicinda mRNA'nin translasyonuna yardimci olan bir Kozak sekansi Mevcut açiklamaya göre bir virüs içeren bir kompozisyon, özellikle de tarifnameye göre bir adenovirüs ve bir farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyan içeren bir farmasötik kompozisyon saglanmaktadir.

Mevcut açiklama, bundan baska, tedavide kullanilmak üzere örnegin kanser tedavisinde kullanim için bulusa uygun bir adenovirüs veya kompozisyon ile de Açiklama ayni zamanda, burada tarif edildigi gibi bir virüsün ya da bunu içeren bir kompozisyonun terapötik olarak etkili bir miktarinin ihtiyaç halindeki bir hastaya, özellikle bir insan bir hastaya uygulanmasini kapsayan bir tedavi yöntemi ile ilgilidir.

Detayli Açiklama Burada kullanilan transgen, virüs için dogal olmayan (egzojen) veya normalde virüsün bulundugu yerde bulunmayan bir gen olan genom dizisine eklenen bir geni belirtir. Transgenlerin örnekleri asagida verilmektedir. Burada kullanildigi haliyle transgen ayrica, genin, eklendiginde tam uzunluktaki genin islevini veya islevinin çogunu gerçeklestirmek için uygun oldugu genin bir kismi olan fonksiyonel bir fragmanini da içerir.

Transgene ve kodlama sekansi aksi belirtilmedigi sürece burada viral genom içerisindeki ekler baglaminda birbirlerinin yerine kullanilir. Burada kullanildigi haliyle kodlama sekansi, örnegin fonksiyonel bir RNA, peptit, polipeptit veya proteini kodlayan bir DNA sekansi anlamina gelir. Tipik olarak, kodlama sekansi, ilgilenilen fonksiyonel RNA, peptit, polipeptit veya proteini kodlayan transgen Için cDNA'dir.

Fonksiyonel RNA, peptitler, polipeptit ve ilgili proteinler asagida tarif edilmistir.

Açik bir sekilde, virüs genomu DNA kodlama sekanslarini içermektedir. Virüsün genomik dizilimindeki endojen (dogal olarak olusan genler), bu tarifnamenin baglaminda, dogal olmayan bir yerde ya da bir dogal olmayan bölgede oldugu gibi rekombinant teknikler ile modifiye edilmedigi sürece transjen olarak kabul edilmemektedir.

Bir düzenlemede burada kullanilan haliyle transgen, bir organizmadan izole edilmis ve farkli bir organizmaya yani mevcut açiklamanin virüsüne sokulan bir gen veya cDNA sekansini ihtiva eden bir DNA bölümünü belirtir. Bir düzenlemede DNA'nin bu dogal olmayan segmenti, fonksiyonel RNA, peptit, polipeptit veya protein üretme kabiliyetini koruyabilir.

Dolayisiyla, bir düzenlemede yerlestirilen transgen, bir insan veya hümanize protein, polipeptit veya peptidi kodlar.

Bir düzenlemede, yerlestirilen bu transgen, örnegin bir fare, siçan, tavsan, deve, lama veya benzerinden alinan bir insan disi protein, polipeptit veya peptit (insan olmayan bir memeli proteini, polipeptit veya peptit gibi) veya RNA molekülünü kodlar.

Avantaj saglayan haliyle, mevcut açiklamadaki virüsler, transgenlerin kanserli hücre içinde tasinmasina izin verir. Böylece, insan hasta tarafindan insan disi bir sekansa (örnegin bir protein) karsi olusturulan tepkiler, bu hücre içine verme ile en aza indirilebilir.

Bir DNA dizisi, birden fazla transgeni, örnegin 1 veya 2 gibi 1, 2, 3 veya 4 transgen içerebilir.

Bir transgen kaseti, birden fazla transgeni, örnegin 1 veya 2 gibi 1, 2, 3 veya 4 transgen içerebilir.

Bir veya daha fazla düzenlemede bu kaset, Sekillerin veya örneklerin birinde veya daha fazlasinda gösterildigi gibi düzenlenmektedir.

Bu kullanildigi haliyle, transgen kasedi, bir ya da daha çok kodlama sekansi ve bir ya da daha çok düzenleyici öge biçiminde bir ya da daha çok transgen kodlayan bir Bir transgen kaset, bir veya daha fazla monosistronik ve / veya polisistronik mRNA dizisini kodlayabilir.

Bir düzenlemede, transgen veya transgen kaseti, monosistronik veya polisistronik bir mRNA'yi kodlar ve örnegin, kaset, bir endojen promotör veya egzojen promotör veya bunlarin bir kombinasyonunun kontrolü altinda bir yerde adenovirüs genomuna yerlestirilmeye uygundur.

Burada kullanildigi haliyle, monosistronik mRNA, tek bir fonksiyonel RNA, peptit, polipeptit veya proteini kodlayan bir mRNA molekülünü ifade eder.

Bir düzenlemede, transgen kaseti monosistronik mRNA'yi kodlar.

Bir düzenlemede, monosistronik mRNA'yi kodlayan bir kaset baglaminda transgen kaseti, istege bagli olarak bir egzojen promotör (transgenin aktif oldugu yeri ve zamani belirleyecek bir düzenleyici sekans olan) ya da bir ek yeri bölgesi (bir mRNA molekülünün splaysozom tarafindan ne zaman bölünecegini belirleyen bir düzenleyici sekans olan), bir kodlama sekansi (yani, transgen) içeren bir DNA segmentini ifade eder, genellikle ilgili proteinin cDNA'sindan türetilir, opsiyonel olarak da bir poIiA sinyal sekansi ve bir sonlandirma sekansi içerir.

Bir düzenlemede, transgen kaseti, bir veya daha fazla polisistronik mRNA sekansini kodlar.

Burada kullanildigi haliyle, polisistronik mRNA, iki veya daha fazla fonksiyonel RNA, peptit veya protein veya bunlarin bir kombinasyonunu kodlayan bir mRNA molekülünü ifade eder. Bir düzenlemede, transgen kaseti bir polisistronik mRNA'yi kodlar.

Bir düzenlemede, polokistronik mRNA'yi kodlayan bir kaset baglaminda transgen kaseti, istege bagli olarak bir egzojen promotör (transgenin aktif oldugu yeri ve zamani belirleyecek bir düzenleyici sekans olan) ya da bir ek yeri bölgesi (bir mRNA molekülünün splaysozom tarafindan ne zaman bölünecegini belirleyen bir düzenleyici sekans olan), iki ya da daha kodlama sekansi (yani, transgenler) içeren, genellikle ilgili proteinin cDNA'sindan türetilen, örnegin her kodlama sekansinin ya bir IRES ya da bir 2A peptidi ile ayrildigi bir DNA segmenti içerir. Transkripsiyon yapilacak son kodlama sekansini takiben, kaset istege bagli olarak bir poIiA sekansi ve bir sonlandirma sekansi içerebilir.

Bir düzenlemede transgen kasedi, ardindan bir monosistronik mRNA'yi kodlar, bunu polisistronik mRNA takip eder. Baska bir düzenlemede, transgen kaseti bir polisistronik mRNA'yi, ardindan bir monosistronik mRNA'yi kodlar.

Mevcut açiklama, bir grup B adenovirüsü ile ilgilidir. Grup B adenovirüsü, bir insan adenovirüsüdür. Mevcut açiklamaya göre olan adenovirüs, ayrica, herhangi bir, henüz tanimlanmamis veya siniflandirilmamis adenoviral serotipleri de kapsar.

Su anda 50'den fazla bilinen adenoviral serotipler AF'Ierin ait gruplarina ayrilmistir.

Bakin, örnegin, Tablo 1'de gösterildigi gibi Strauss, "Adenovirus infections in humans," in The Adenoviruses, Ginsberg, ea. , Plenum Press, New York, NY, pp.

Fields Virology, Vol. 2, Fourth Edition, Knipe, 35ea. , Lippincott Williams & Wilkins, Alt Grup Adenoviral serotip A 12, 18, 31 c 1, 2, 5, 6 F 40, 41 Mevcut açiklamada adi geçen adenovirüs, örnegin, Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34 ve Ad51'den olusan ya da bunlari içeren gruptan bagimsiz olarak seçilen, mesela Ad11, özellikle de Ad11p (Slobitski susu) gibi bir alt grup B'dir. Bir düzenlemede bulusa ait adenovirüs, Ad11, özellikle de Ad11p gibi bir alt grup B adenovirüsünün hekzonu ve / veya elyafi gibi kapsid'e sahiptir. Bir düzenlemede adenovirüs, Ad11'dir veya Ad11p gibi, Ad11'in fiberine ve / veya hekzon ve / veya pentonuna sahiptir.

Bir düzenlemede, bu bir grup A virüsü degildir.

Bir düzenlemede bu adenovirüs, bir C grubu virüsü degildir. Bir düzenlemede bu adenovirüs, Ad5 degildir. Burada kullanilan sekliyle Ad5, serotip 5 olarak adlandirilan bilinen adenovirüsleri belirtir, Ad5'in dizilerini içeren genetik olarak islenmis virüsleri kapsamaz. Bir düzenlemede, mevcut açiklamaya ait virüsler bir Ad5 kapsidine sahip degildir.

Bir düzenlemede, mevcut açiklamaya ait adenovirüs, kimeriktir. Bir adenovirüs kimerik oldugu zaman, serotipi belirlemek için dis kapsid karakteristikleri kullanilacaktir. Burada kullanilan haliyle kimerik, ayni grup içinde farkli serotipler de dahil olmak üzere en az iki farkli virüs serotipinden DNA içeren bir virüse karsilik Bir düzenlemede, onkolitik virüs ayni serotipten, örnegin ikincisinin genomik mesela Ad11, özellikle Ad11p'den bir fiber, hekzon ve penton proteinlerine sahiptir, burada nükleotid pozisyonlari gen bankasi lD 217307399 (erisim numarasi: GC689208) ile iliskilidir.

Bir düzenlemede, adenovirüs enadenotucirev'tir (EnAd olarak ve daha önce EnAd olarak da bilinir). Burada kullanilan haliyle enadenotucirev, SEK lD NO: 12'nin kimerik adenovirüsünü belirtir. Bu, yabani tipte adenovirüslere kiyasla arttirilmis terapötik özelliklere sahip olan bir replikasyona yetkin onkolitik kimerik adenovirüstür delesyonlara sahip olan bir kimerik E28 bölgesine sahiptir. Enadenotucirev'deki yapisal degisiklikler, Ad11p'den yaklasik 3. 5 kb daha küçük bir genom ile sonuçlanir, böylece transgenlerin eklenmesi için ek "alan" saglanir.

OvAd1 ve OvAd2 ayrica genomda ilave "alan" bulunan enadenotucirev'e benzer adenovirüs OvAd1 veya OvAd2'dir.

Bir düzenlemede, bu adenovirüs onkolitiktir. Burada kullanilan sekliyle onkolitik adenovirüs, kanserli olmayan hücrelerle karsilastirildiginda tercih edilen sekliyle kanser hücrelerini öldüren bir adenovirüs anlamina gelir.

Bir düzenlemede, onkolitik virüs apoptotiktir. Yani, programlanmis hücre ölümünü hizlandirir.

Bir düzenlemede, onkolitik virüs sitolitiktir. Açiklamanin onkolitik adenovirüslerinin sitolitik aktivitesi, temsili tümör hücre dizilerinde belirlenebilir ve veriler, örnegin, standart olarak kullanilan Ad5 gibi C alt grubuna ait bir adenovirüs ile potansiyelin bir ölçümüne dönüstürülür (yani, bir 1'Iik bir potansiyel verir). Sitolitik aktivitenin belirlenmesi için uygun bir yöntem, bir MTS tahlilidir (bkz. Örnek 4, Sekil 2, W02005 / 118825) Bir düzenlemede, bu onkolitik virüs nekrolitiktir. Yani, hücre nekrozu veya immünojenik hücre ölümüne neden olur veya bunu hizlandirir. Bir düzenlemede, nekrolitik hücre ölümü, hastalarin (konakçi) bagisiklik tepkilerini tetikledigi, Mevcut tarifname baglaminda replikasyona yetkin olma, hücrelerde in vitro ve in vi'vo, çogaltilmasi için gerekli tüm düzenege sahip olan, yani bir sarma hücre hattinin yardimi olmayan bir virüs anlamina gelir. Örnegin, E1 bölgesinde silinmis, tamamlayici bir paketleme hücre dizisinde çogalabilen bir viral vektör mevcut baglamda replikasyona uygun bir virüs degildir.

Viral vektörler replikasyon bakimindan yetersizdir ve replikasyona izin vermek için tamamlayici bir gen saglamak üzere bir paketleme hücresi gerektirir.

Burada kullanilan sekliyle adenovirüs genomu, bir adenovirüsün fonksiyon / yasam döngüsü ile ilgili yapisal proteinleri ve elemanlari kodlayan DNA sekansi anlamina Bugüne kadar incelenen tüm insan adenovirüs genomlari ayni genel organizasyona sahiptir, yani spesifik fonksiyonlari kodlayan genler viral genomda (burada yapisal ögeler olarak anilacaktir) ayni pozisyonda bulunur. Viral genomun her ucu, viral replikasyon için gerekli ters uç tekrari (veya ITR) olarak bilinen kisa bir diziye sahiptir.

Viral genom bes erken transkripsiyon ünitesini (E1A, E18, E2, E3 ve E4), üç gecikmis erken üniteyi (IX, lVa2 ve E2 geç) ve bir geç üniteyi (büyük geç) içerir; bu geç mRNA'larin (L1- L5) bes ailesini olusturmak için islenir. Erken genler tarafindan kodlanan proteinler, en basta, enfeksiyona replikasyon ve konakçi hücrenin yanitinin modülasyonunda yer alirken, geç genler viral yapisal proteinleri kodlar. Erken genlere E harfi ile ön ek olarak eklenir ve geç genlerin önüne L harfi gelir.

Adenovirüslerin genomu siki bir sekilde paketlenir, yani, kodlanmayan sekans azdir ve bu nedenle transgenlerin yerlestirilmesi için uygun bir yer bulmak zor olabilir.

Mevcut bulus sahipleri, transgenlerin tolere edildigi iki DNA bölgesini tespit etmistir; özellikle tespit edilen bu bölgeler, antikorlari kodlayanlar gibi karmasik transgenlerin yerlestirilmesi için uygundur. Yani, transgen, virüsün yasayabilirligini, onkolitik özellikler veya replikasyon gibi dogal özelliklerini olumsuz bir sekilde etkilemeksizin eksprese edilir.

Bir düzenlemede. açiklamaya göre olan onkolitik veya kismen onkolitik virüs, E4 ve/veya E3 bölgesindeki silinmenin bir sonucu gibi, örnegin E4 bölgesinin bir kisminda silinmis veya E3 bölgesinde tamamen silinmis veya alternatif olarak, E4 bölgesinde (örn. , E4orf4) kismen silinmis ve E3 bölgesinde tamamen silinmis gibi, örnegin burada açiklanan sekanslarda örneklendirildigi gibi olabilir.

Bir düzenlemede, açiklamanin onkolitik virüsü kimeriktir. Burada kullanilan kimerik, iki veya daha fazla farkli serotipten DNA içeren ve onkolitik virüs özelliklerine sahip olan virüse karsilik gelir.

Bir düzenlemede, onkolyitik virüs, EnAd veya bunun bir aktif türevi olup, Virüsün esas tam sekans burada SEK ID NO: 12 olarak verilmektedir. Kimerik E28 bölgesi, burada SEK ID NO: 47 olarak açiklanmaktadir. açiklanan OvAd1 ve OvAd2'yi içerir.

Avantaj saglayan haliyle, mevcut açiklamanin adenovirüsleri, in vitro olarak çesitli farkli kolon kanseri hücre dizilerinin enfeksiyonunun ardindan EnAd'a benzer virüs etkinligi, örnegin replikasyon ve / veya enfekte edicilik profilleri sergilemektedir ADENOVIRÜSLERIN YAPISAL ELEMANLARI Mevcut açiklama ayrica, burada açiklanan plazmidler gibi virüslerin veya viral bilesenlerin /yapilarin yeni dizileri ile ilgilidir.

Bir düzenlemede formül (l) 'in bir bilesimi saglanir, burada Bx ve BY bir bag degildir ve bir transgen, bir kisitlama bölgesi veya her ikisini birden içerir, örnegin Bx ve BY Bir bag, bir DNA sekansini baska bir DNA sekansina baglayan, örnegin virüs genomunun bir bölümünü digerine baglayan kovalent bir bagi ifade eder. Dolayisiyla, burada formül (I) 'deki bir degisken bir bagi temsil ettiginde, bag ile temsil edilen özellik veya eleman yoktur, yani silinir.

Adenovirüslerin yapisi genel olarak benzer oldugu için, asagida yer alan ögeler, uzman kisi tarafindan bilinen yapisal elemanlar ve bunlara atifta bulunan yaygin olarak kullanilan nomenklatür açisindan ele alinmaktadir. Burada bir elemana atifta bulunuldugunda, bir adenovirüs içindeki elemanin ayni yapisal proteinini kodlayan bir DNA sekansini veya elemani kodlayan DNA sekansina atifta bulunuruz. Ikincisi, DNA kodunun fazlaligi nedeniyle ilgilidir. Virüslerin kodon kullanimi tercihleri, en iyi sonucu almak için göz önünde bulundurulmalidir.

Mevcut açiklamanin virüslerinde kullanilan bir adenovirüsten herhangi bir yapisal eleman, dogal sekansi içerebilir veya bunlardan olusabilir veya verilen uzunluk olabilir. Orijinal sekans, genetik materyalin % 10, % 9, % 8, % 7, % 6, % 5, % 4, % 3, degisiklik yaparken, yapisal proteinlerin ekspresyonu bozulmayacak sekilde virüsün okuma çerçevelerinin bozulmamasinin gerektiginin farkindadirlar.

Bir düzenlemede belirli eleman, tam uzunlukta bir sekans yani tam uzunluktaki Bir düzenlemede belirli bir eleman, tam uzunlugun altindadir ve tam uzunlukta sekans ile ayni veya karsilik gelen fonksiyonu muhafaza eder.

Bir düzenlemede, mevcut açiklamanin yapilarinda istege bagli olan belirli bir eleman için DNA sekansi tam uzunlugun altinda olabilir ve islevsellik tasimaz.

Adenovirüsün yapisal veya islevsel proteinlerini kodlayan yapisal genler genellikle DNA'nin kodlamayan bölgeleriyle baglantilidir. Dolayisiyla, mevcut açiklamanin virüslerine bir transgenin sokulmasi amaciyla söz konusu yapisal elemanin genomik diziliminin "nerede kesilecegi" (özellikle bunlarin kodlamayan bölgelerini) konusunda bir miktar esneklik vardir. Bu nedenle, mevcut tarifnamenin amaçlari için, eleman, amaç için uygun oldugu ve yabanci malzemeyi kodlamadigi ölçüde, referans yapisal bir unsur olarak düsünülür. Böylece, uygunsa, gen, örnegin virüsün dogal yapisinda oldugu gibi, uygun kodlamayan bölgelerle iliskilendirilecektir.

Dolayisiyla bir düzenlemede bir kisitlama bölgesi ve / veya transgeni kodlayan DNA gibi bir ek, genomik virüs DNA'sinin kodlanmamis bir bölgesine, örnegin bir intron veya intergenik sekansa sokulur. Adenovirüsün bazi kodlamayan bölgelerinin, örnegin alternatif ek yeri, transkripsiyon düzenleme ya da translasyon düzenlemesinde bir isleve sahip olabilecegini söyleyerek bunun dikkate alinmasi gerekebilir.

Burada tanimlanan, L5 bölgesi ile baglantili olan alanlar, RNAi, sitokinler, antikorlar gibi tek Zincirli veya multimerik proteinler gibi kompleks varliklari kodlayan çesitli DNA sekanslarini yerlestirmek için uygundur.

Burada kullanildigi sekliyle gen, kodlama ve bununla baglantili herhangi bir kodlamayan sekansi, örnegin intronlar ve iliskili eksonlari belirtir. Bir düzenlemede bir gen, sadece kodlayici bölge gibi, gerekli yapisal bilesenleri içerir veya bunlardan Asagida, adenovirüslerin spesifik yapisal ögeleri ile ilgili bir tartisma bulunmaktadir.

Ters Çevrilmis Uç Tekrarlama (lTR) sekanslari, bilinen tüm adenovirüslerde ortaktir ve simetrileri yüzünden bu sekilde adlandirilmislardir ve replikasyonun viral kromozom kökenleridir. Bu sekanslarin bir diger özelligi de bir saç tokasi olusturma kabiliyetidir.

Burada kullanildigi haliyle 5'lTR, uygun bir lokasyonda bir adenovirüs içine dahil edildiginde ITR'nin islevini muhafaza eden bir adenovirüsün 5 'ucundan bir ITR'nin bir kismina veya tamamina deginmektedir. Bir düzenlemede, 5'ITR, SEK lD NO: 12'nin yaklasik 1bp ila 138 bp'si arasindaki bir diziyi veya tüm uzunluk boyunca % 90, 95, 96, 97, 98 veya 99 ayni olan bir sekansi içerir ya da bunlardan olusur, özellikle de SEK ID NO: 12'nin yaklasik 1bp ila 138 bp'sinden olusur.

Burada kullanilan sekliyle 3'ITR, uygun bir lokasyonda bir adenovirüs içine dahil edildiginde ITR'nin islevini muhafaza eden bir adenovirüsün 3' ucundan bir ITR'nin bir kismini veya tamamini ifade eder. Bir düzenlemede, 3'ITR, SEK lD NO: 12'nin 81 burada kullanildigi haliyle, bir adenovirüsün bir E1A'sinin bir kismini veya tamamini, bir adenovirüsün E1B bölgesinin bir kismini veya tamamini ve bagimsiz olarak bir adenovirüsün E1A ve E1B bölgesinin bir kismini veya tamamini kodlayan DNA sekansini belirtir.

Burada kullanilan sekliyle E1A, bir adenovirüs E1A bölgesinin bir kismini veya tamamini kodlayan DNA sekansi anlamina gelir. Ikincisi, polipeptit / protein E1A'ya deginmektedir. E1A geni tarafindan kodlanan protein, vahsi tipli (yani karsilik gelen mutasyona ugramamis protein) ile ayni isleve, vahsi tipli proteine kiyasla artmis fonksiyona; örnegin vahsi tipli proteine kiyasla islevsiz olma gibi azaltilmis isleve sahip olacak sekilde konservatif veya konservatif olmayan amino asit degisikliklerine sahip olacak sekilde mutasyona ugratilabilir veya vahsi tipli proteine veya uygun sekilde bunun bir kombinasyona kiyasla yeni birfonksiyona sahiptir.

Burada kullanildigi haliyle E1B, bir adenovirüs E1B bölgesinin (yani, polipeptit veya proteinin) bir kismini veya tümünü kodlayan DNA sekansini ifade eder; E1B geni/bölgesi tarafindan kodlanan protein, vahsi tipli (yani karsilik gelen mutasyona ugramamis protein) ile ayni isleve, vahsi tipli proteine kiyasla artmis fonksiyona; örnegin vahsi tipli proteine kiyasla islevsiz olma gibi azaltilmis isleve sahip olacak sekilde konservatif veya konservatif olmayan amino asit degisikliklerine sahip olacak sekilde mutasyona ugratilabilir veya vahsi tipli proteine veya uygun sekilde bunun bir kombinasyona kiyasla yeni bir fonksiyona sahiptir.

Böylece 81 bir vahsi tip E1A ve / veya E18 gibi bir vahsi tip E1 bölgesine göre modifiye edilebilir veya modifiye edilemez. Tecrübeli kisi, E1A ve / veya E18'nin mevcut olup olmadigini (kismen) silinmis veya mutasyona ugratilmis olup olmadigini kolayca tespit edebilir.

Burada kullanilan sekliyle vahsi tip, bilinen bir adenovirüs anlamina gelir. Bilinen bir adenovirüs, dizinin bulunup bulunmadigina bakilmaksizin tanimlanir ve adlandirilir. sahiptir.

Burada kullanildigi haliyle BA, uygun olan herhangi bir kodlamayan sekansi da kapsayacak sekilde E28- L1- L2- L3- E2A- L4 bölgelerini kodlayan DNA sekansini ifade eder. Genellikle bu dizi, bir transgen içermeyecektir. Bir düzenlemede sekans, bilinen bir adenovirüs'ten, örnegin Tablo 1'de gösterilen bir serotip, özellikle bir B bunlarin Ad3, Ad11 gibi bir kombinasyonu veya bunlarin bir kombinasyonu gibi bir B grubu virüsü bitisik bir sekansla esas olarak benzer veya aynidir. Bir düzenlemede, E28- L1- L2- L3- E2A- L4, bu elementleri ve bölge ile baglantili diger yapisal elementleri içermeyi ifade eder, örnegin BA genel olarak protein lV2a'yi kodlayan diziyi, örnegin asagidaki gibi; IV2A lV2a- E28- L1- L2- L3- E2A- L4'ü içerecektir.

Bir düzenlemede E28 bölgesi kimeriktir. Yani, örnegin Ad3 ve Ad11'den gibi iki veya daha fazla farkli adenoviral serotipten, mesela Ad11p gibi DNA dizileri içerir. Bir arasindaki bir sekansa veya bunun tüm uzunlugu boyunca % 95, % 96, % 97, % 98 veya % 99 ayni olan bir sekansa sahiptir.

Bir düzenlemede bilesen BA'daki E28, SEK ID NO: 47'de gösterilen dizileri içermektedir (W. sahiptir.

Burada kullanildigi haliyle E3B, bir adenovirüs E3B bölgesinin (yani, proteinin / polipeptidin) bir kismini veya tümünü kodlayan DNA sekansini ifade eder; E3B geni/bölgesi tarafindan kodlanan protein, vahsi tipli (yani karsilik gelen mutasyona ugramamis protein) ile ayni isleve, vahsi tipli proteine kiyasla artmis fonksiyona; örnegin vahsi tipli proteine kiyasla islevsiz olma gibi azaltilmis isleve sahip olacak sekilde konservatif veya konservatif olmayan amino asit degisikliklerine sahip olacak sekilde mutasyona ugratilabilir veya vahsi tipli proteine veya uygun sekilde bunun bir kombinasyona kiyasla yeni bir fonksiyona sahiptir.

Bir düzenlemede E3 bölgesi, Tablo 1'de verilen bir adenovirüs serotipinden veya bunlarin bir kombinasyonundan, özellikle bir grup B serotipi, örnegin Ad3, Ad7, Ad11 kombinasyonu, örnegin Ad3, Ad11 (özellikle Ad11p) ya da bunlarin bir kom binasyon undand ir. silindi. Bir düzenlemede B2 E3 bölgesini kodlayan DNA'nin mevcut olmadigi bir bagdir.

Bir düzenlemede E3 bölgesini kodlayan DNA, bir transgen ile degistirilebilir veya kesilebilir. Burada kullanildigi sekliyle "bir transgen ile degistirilen E3 bölgesi", E3 bölgesinin bir kismi veya tamamini içerir, bir transgen ile degistirilir. dizisini içerir.

Burada kullanildigi haliyle Bx, BB'deki L5 geninin 5' ucunun yakinindaki DNA sekansini ifade eder. Burada kullanilan sekliyle L5 geninin 5' ucunun etrafinda veya yakininda L5 geninin 5' ucuna komsu (bitisik) veya bununla dogal olarak baglantili olan, yani L5 geninin 5 'ucuna dayanan veya bitisik olan ya da dogal olarak bununla baglantili olan bir kodlayici olmayan bölge bir kodlamayan bölgeyi ifade eder.

Alternatif olarak, etrafinda ya da yakininda terimleri, L5 genine yakin olmayi ifade eder, öyle ki Bx bölgesi ve L5 geninin 5'ucu arasinda hiç kodlama sekansi bulunmaz.

Bundan dolayi, bir düzenlemede Bx, örnegin L5 geninin bir kodlama dizisinin baslangicini temsil eden bir L5 tabanina dogrudan birlestirilir.

Bu sayede, bir düzenlemede Bx örnegin kodlanmamis bir sekansin baslangicini temsil eden veya L5 ile dogal olarak baglantili olan kodlamayan bir bölgeye dogrudan birlestirilen bir L5 tabanina dogrudan birlestirilir. Burada kullanildigi haliyle dogal olarak L5 ile iliskilendirilen kodlamayan bir bölge, L5 geninin bir parçasi olan veya bununla bitisik olan, ancak baska bir genin bir parçasi olmayan kodlayici olmayan tüm bölgelerin bir kismini ifade eder.

Bir düzenlemede Bx SEK ID NO: 10 dizisini içermektedir. Bu dizi, örnegin bir transgen (veya transgen kasedi), bir kisitlama bölgesi veya bunlarin bir kombinasyonunu içeren bir DNA dizisinin içine sokulabilecegi yapay kodlanmayan bir sekanstir. Bu sekans, virüs stabilitesi ve yasayabilirligi üzerindeki yikici etkileri en aza düsürürken, transgenin tam yeri üzerinde bazi esneklik saglayan bir tampon görevi gördügü için avantajlidir.

Eklemeler herhangi bir SEK ID NO: 10 içinde 5' ucundan, 3' ucuna kadar herhangi bir yerde ya da 1 ila 201 baz çiftleri arasindaki herhangi bir noktada örnegin 1/2, 2/3, 200/201 ortaya çikabilir. 28193bp pozisyonlari arasinda karsilik gelen bir yere sokulan bir DNA sekansina sahip SEK lD NO: 10'u içerir.

Bir düzenlemede eklenti, bir kisitlama bölgesi eklentisidir. Bir düzenlemede, kisitlama bölgesi eklentisi bir veya iki kisitlama bölgesi içerir. Bir düzenlemede kisitlama bölgesi, 2 kisitlama bölgesi içeren bir 19bp kisitlama bölgesi eklentisidir. Bir düzenlemede kisitlama bölgesi eklentisi, 1 kisitlama bölgesi içeren bir 9bp kisitlama bölgesi eklentisidir. Bir düzenlemede kisitlama bölgesi eklentisi bir veya iki kisitlama bölgesi ve en az bir transgene, örnegin bir veya iki transgen içerir. Bir düzenlemede kisitlama bölgesi, 2 kisitlama bölgesi ve en az bir transgene, örnegin bir veya iki transgen ihtiva eden bir 19bp kisitlama bölgesi eklentisidir. Bir düzenlemede kisitlama bölgesi eklentisi, 1 kisitlama bölgesi ve en az bir transgene, örnegin bir, iki veya üç transgen mesela bir ya da iki transgen ihtiva eden bir 9bp kisitlama bölgesi eklentisidir. Bir düzenlemede iki kisitlama bölgesi, bir veya daha fazla mesela, iki transgeni (örnegin bir transgen kasetinde) sikistirir. Bir düzenlemede Bx bahsedilen kisitlama bölgeleri birbirinden farkli oldugunda iki kisitlama bölgesi içermektedir. Bir düzenlemede, Bx 'deki söz konusu bir veya daha fazla kisitlama bölgesi eklendikleri belirli bir adenovirüs genomunda dogal olarak bulunmazlar. Bir düzenlemede, Bx'deki bir veya daha fazla kisitlama bölgesi adenovirüs genomunun herhangi bir yerinde bulunan diger kisitlama bölgelerinden, örnegin dogal olarak olusan kisitlama bölgelerinden ve / veya genomun diger bölümlerine, örnegin Bv'ye dahil edilen bir kisitlama bölgesi farklidir. Dolayisiyla bir düzenlemede kisitlama bölgesi veya bölgeleri, kesitteki DNA'nin spesifik olarak kesilmesine olanak tanir.

Avantaj saglayan haliyle, "benzersiz" kisitlama bölgelerinin kullanilmasi, basitçe uygun kisitlama enzimini kullanarak virüs genomunun kesildigi yerin seçiciligini ve kontrolünü saglar.

Burada kullanilan sekliyle spesifik olarak kesme, kisitlama bölgeleri için spesifik bir enzimin kullanilmasinin, virüsü sadece arzu edilen yerde, genellikle bir konumda kesmesine ve bazen de bir çift konum olabilecegine isaret etmektedir. Burada kullanildigi gibi bir çift konum, ayni enzim tarafindan kesilecek sekilde tasarlanan birbirine yakin iki kisitlama bölgesini (yani, birbirinden ayirt edilemez) ifade eder.

Bir düzenlemede, kisitlama yeri eklentisi, SEK lD NO: 55'tir. sahiptir.

Bir düzenlemede, Bx bir bagdir.

Burada kullanildigi haliyle, BB L5 bölgesi kodlayan DNA sekansini ifade eder. Burada kullanildigi sekliyle, L5 bölgesi, baglamda uygun olarak, fiber polipeptidini / proteinini kodlayan geni ihtiva eden DNA dizisine karsilik gelir. Fiber gen / bölge, adenovirüslerin önemli bir kapsid bilesenini olusturan lif proteinini kodlar. Fiber, reseptör tanimada islev görür ve adenovirüsün hücreleri seçici olarak baglama ve enfekte etme kabiliyetine katkida bulunur.

Mevcut açiklamaya ait virüslerde, fiber bir grup B virüsünden, özellikle Ad11'deni sahiptir.

BY ile iliskili DNA sekansi, burada kullanildigi haliyle, Bs'nin L5 geninin 3' ucunun yakinindaki DNA sekansini ifade eder. Burada kullanilan sekliyle L5 geninin 3' ucunun etrafinda veya yakininda L5 geninin 3' ucuna komsu (bitisik) veya bununla dogal olarak baglantili olan, yani L5 geninin 3' ucuna dayanan veya bitisik olan ya da dogal olarak bununla baglantili olan (yani, L5'e endojen olan kodlayici olmayan bir dizinin tümü veya bir kismi) bir kodlayici olmayan bölge bir kodlamayan bölgeyi ifade eder. Alternatif olarak, etrafinda ya da yakininda terimleri, L5 genine yakin olmayi ifade eder, öyle ki BY bölgesi ve L5 geninin 3' ucu arasinda hiç kodlama sekansi bulunmaz.

Bundan dolayi, bir düzenlemede BY dogrudan bir kodlama sekansinin "ucunu" temsil eden bir L5 tabanina birlestirilir.

Bu sayede, bir düzenlemede BY kodlanmamis bir sekansin "bitisini" temsil eden veya L5 ile dogal olarak baglantili olan kodlamayan bir bölgeye dogrudan birlestirilen bir L5 tabanina dogrudan birlestirilir.

Tabiati geregi ve dogal olarak burada birbirlerinin yerine kullanilirlar. Bir düzenlemede BY SEK ID NO: 11 dizisini içermektedir. Bu dizi, örnegin bir transgen (veya transgen kasedi), bir kisitlama bölgesi veya bunlarin bir kombinasyonunu içeren bir DNA dizisinin içine sokulabilecegi kodlanmayan bir sekanstir. Bu sekans, virüs stabilitesi ve yasayabilirligi üzerindeki yikici etkileri en aza düsürürken, transgenin tam yeri üzerinde bir miktar esneklik saglayan bir tampon görevi gördügü Için avantajlidir.

Eklentiler, SEK lD NO: 11'in içinde 5 'ucundan, 3' ucundan veya bp 1 ila 35 veya 34/35 taban çiftleri arasinda herhangi bir yerde meydana gelebilir.

Bir düzenlemede Bv, bp 12 ve 13 pozisyonlari arasina yerlestirilen bir DNA sahip bir SEK lD NO: 11 ihtiva eder. Bir düzenlemede eklenti, bir kisitlama bölgesi eklentisidir. Bir düzenlemede, kisitlama bölgesi eklentisi bir veya iki kisitlama bölgesi içerir. Bir düzenlemede kisitlama bölgesi, 2 kisitlama bölgesi içeren bir 19bp kisitlama bölgesi eklentisidir. Bir düzenlemede kisitlama bölgesi eklentisi, 1 kisitlama bölgesi içeren bir 9bp kisitlama bölgesi eklentisidir. Bir düzenlemede kisitlama bölgesi eklentisi bir veya iki kisitlama bölgesi ve en az bir transgene, örnegin bir veya iki veya üç transgen, mesela bir veya iki transgen içerir. Bir düzenlemede kisitlama bölgesi, 2 kisitlama bölgesi ve en az bir transgene, örnegin bir veya iki transgen ihtiva eden bir 19bp kisitlama bölgesi eklentisidir. Bir düzenlemede kisitlama bölgesi, 1 kisitlama bölgesi ve en az bir transgene, örnegin bir veya iki transgen ihtiva eden bir 9bp kisitlama bölgesi eklentisidir. Bir düzenlemede iki kisitlama bölgesi. bir veya daha fazla mesela, iki transgeni (örnegin bir transgen kasetinde) sikistirir. Bir düzenlemede By bahsedilen kisitlama bölgeleri birbirinden farkli oldugunda iki kisitlama bölgesi Içermektedir. Bir düzenlemede, BY 'deki söz konusu bir veya daha fazla kisitlama bölgesi eklendikleri belirli bir adenovirüs genomunda dogal olarak (benzersizdirler) bulunmazlar. Bir düzenlemede, Bv'deki söz konusu bir veya daha fazla kisitlama bölgesi adenovirüs genomunun herhangi bir yerinde bulunan diger kisitlama bölgelerinden, örnegin dogal olarak olusan kisitlama bölgelerinden veya genomun diger bölümlerine, örnegin Bx'e dahil edilen bir kisitlama bölgesinden farklidir. Dolayisiyla bir düzenlemede kisitlama bölgesi veya bölgeleri, kesitteki DNA'nin spesifik olarak kesilmesine olanak tanir.

Bir düzenlemede, kisitlama bölgesi eklentisi, SEK ID NO: 54'tür. sahiptir.

Bir düzenlemede, BY bir bagdir.

Bir düzenlemede eklenti, SEK ID NO: 11'de bp 12'den sonra yer alir.

Bir düzenlemede eklenti, SEK ID NO: 12'nin yaklasik 29356 bp'lik bir konumundadir.

Bir düzenlemede eklenti, bir veya daha fazla örnegin 1, 2 veya 3, mesela 1 veya 2 transgen içeren bir transgen kasetidir.

Burada kullanildigi haliyle E4, bir adenovirüs E4 bölgesinin (yani, polipeptit/ protein bölgesinin) bir kismini veya tümünü kodlayan DNA sekansini ifade etmekte olup, bu E4 geni tarafindan kodlanan protein, konservatif ya da konservatif olmayan amino asit degisikliklerine ve vahsi tipli (yani karsilik gelen mutasyona ugramamis protein) ile ayni isleve sahip olacak; vahsi tipli ile kiyaslandiginda arttirilmis fonksiyona; vahsi tipli proteine kiyasla hiç bir isleve sahip olmama gibi azaltilmis fonksiyona ya da vahsi tipli proteine kiyasla yeni bir fonksiyona ya da uygun biçimde bunlarin bir kombinasyonuna sahip olacak sekilde mutasyona ugratilabilir. arasindaki bir diziye sahiptir.

Bir düzenlemede Ba bir bagdir, yani E4 mevcut degildir. Bir düzenlemede Ba SEK lD Burada kullanilan sayi araliklari bitis noktalarini kapsar.

Teknikte uzman kisiler burada formül (I) gibi formüllerde yer alan elementlerin bitisik oldugunu ve burada bahsedilen genlerin ve kodlayici DNA sekanslarinin (yapisal özellikler) yani sira kodlamayan DNA sekanslarini da kapsanabilecegini takdir edeceklerdir. Bir veya daha fazla düzenlemede, mevcut açiklamanin formülleri, adenovirüs genomunda dogal olarak olusan bir sekansi tarif etmeye çalismaktadir.

Bu baglamda, deneyimli bir kisi için formülün, genomun ilgili bölümünü karakterize eden baslica unsurlara atifta bulundugu ve DNA genomik esnemesinin kapsamli bir tarifi olmayi amaçlamadigi açiktir.

Burada kullanilan sekliyle E1A, E1B, E3 ve E4, her biri bagimsiz olarak, burada tarif edildigi gibi her bölgenin vahsi tipini ve bunlarin esdegerlerini, mutasyona ugramis veya kismen silinmis formlarini, bilhassa bilinen bir adenovirüsten bir vahsi tipli diziyi ifade eder.

Burada kullanildigi sekliyle "eklenti", 5' ucunda, 3' ucunda ya da referans sekansini kesecek sekilde veya belirli bir DNA sekansi referans segmentine birlestirilmis bir DNA sekansini ifade eder. Ikincisi, eklentinin yerlestirilmesi ile iliskili referans noktasi olarak kullanilan bir referans dizisidir. Mevcut açiklamanin baglaminda, eklentiler genellikle ya SEK lD NO: 10 ya da SEK ID NO: 11 içinde ortaya çikar. Bir eklenti, ya bir kisitlama bölgesi eklentisi, bir transjen kaseti veya her ikisi olabilir. Dizi kesildiginde, virüs orijinal diziyi hala içerecek, ancak genel olarak eklentiyi sikistiran iki fragman gibi olacaktir.

Bir düzenlemede transgen veya transgen kaseti, TN7 bir transpozon veya bunun bir parçasi gibi yansiz bir yerlestirme transpozonu Içermez. Burada kullanilan haliyle transpozonunu ifade eder.

Kisitlama Bölgeleri Burada açiklanan konumlardaki kisitlama bölgeleri (örnegin Bx ve / veya BY), virüslerde ve mevcut açiklamanin plazmid gibi yapilarinda faydalidir, çünkü bunlar transgenin hizli bir sekilde degistirilmesine ve seçimli olarak transgenin (lerin) etrafindaki kisitlama bölgelerinin benzersiz olacagi zamana olanak tanirlar.

Burada kullanildigi sekliyle benzersiz, virüsün veya yapinin tamaminda yalnizca tek bir olusumu ifade eder.

Bir düzenlemede, transgen veya transgen kaseti her uçta bir kisitlama bölgesi içerir ve böylece kasetin degistirilmesi saglanir.

Bir kisitlama bölgesi, bir kisitlama enzimi, genellikle sekansa özgü bir enzim tarafindan kesilebilen bir DNA sekansindaki bir konumdur. Bir düzenlemede ise tarafindan kesilen kisitlama bölgelerinin örnekleri arasinda bunlarla sinirli olmamak i 5' - GGCC çikintilari birakarak Notl ve CciNl ile kesilen GCGGCCGC sekansi . 3 '- CCGG çikintilari birakarak Fsel ve Rigl tarafindan kesilen GGCCGGCC sekansi . 3 '- AT çikinti birakarak AsiSI, Rgal, ngl ve SfaAI tarafindan kesilen GCGATCGC sekansi - 3'- TGCA çikintilari birakarak Sbfl, Sdal ve Sse83871 tarafindan kesilen CCTGCAGG sekansi i 5 '- GATC çikintilari birakarak Bcll, Fbal, Ksp221 ve BsiQ1 tarafindan kesilen TGATCA sekansi . 3 '- GTGA çikintilari birakarak l- Cre1 tarafindan kesilen CAAAACGTCGTGAGACAGTTTG [SEK ID NO: 74] sekansi . 3 'CTAA çikintilari birakarak I- Ceul tarafindan kesilen TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAA [SEK ID NO: 75] sekansi . 3 'ATAA çikintilari birakarak I- Sce1 tarafindan kesilen TAGGGATAACAGGGTAAT [SEK ID NO: 76] sekansi - kör uçlari birakarak Srfl tarafindan kesilen GCCCGGGC sekansi - kör uçlari birakarak Mssl, Pmel tarafindan kesilen GTTTAAAC sekansi - kör uçlari birakarak Swal, Smil tarafindan kesilen ATTTAAAT sekansi . 5 'CGCG çikintilari birakarak Ascl, PalA1 ve Sgsl tarafindan kesilen GGCGCGCC sekansi Ayni tanima bölgelerini kesen diger kisitlama enzimleri de uygun olabilir.

Bir düzenlemede, Bx ve Bv'deki bir veya daha fazla kisitlama bölgesi burada tarif edilen bir enzim örnegin Notl, Fsel, AsiSl, 8911 ve Sbfl için spesifik bir kisitlama bölgesi arasindan bagimsiz olarak seçilmektedir, özellikle, eklenen kisitlama bölgeleri mesela Notl için spesifik bölgeler ve Bx'te konumlu Fsel ve BY'de konumlu ngI ve Sbfl için spesifik bölgeler tamamen farklidir.

Bir düzenlemede yukarida tartisildigi gibi, bölge Bx ve / veya BY bir kisitlama bölgesi içermez. Avantaj saglayan haliyle, bu açiklamanin virüsleri ve yapilari, örnegin sentetik teknikler kullanilarak kisitlama bölgeleri olmadan hazirlanabilir. Bu teknikler, virüslerin ve yapilarin olusturulmasinda büyük bir esneklik saglar. Dahasi mevcut bulus sahipleri, virüslerin ve yapilarin sentetik tekniklerle hazirlandiklarinda özelliklerinin azalmadigini tespit etmistir.

Düzenleyiciler Burada kullanilan haliyle düzenleyici, belirli bir genin veya genlerin transkripsiyonunu baslatan bir DNA bölgesi anlamina gelir. Düzenleyiciler genelde DNA üzerinde ayni iplikçikte ve kaynak yönünde (yani 5') kopyaladiklari genlerin yakininda bulunurlar.

Bu baglamda kullanildigi sekliyle proksimal, bir düzenleyici olarak islev görmeye yeterince yakin olmayi ifade eder. Bir düzenlemede düzenleyici, transkripsiyon baslangiç bölgesinin 100 bp'si dahilindedir. Dolayisiyla burada kullanilan sekliyle endojen promotör, transgenin sokuldugu adenovirüste (veya yapida) dogal olarak bulunan bir promotöre karsilik gelir (yani dogaldir). Bir veya daha fazla düzenlemede kullanilan endojen promotör, virüste virüs genomundaki orijinal yerinde dogal olarak bulunan promotördür, özellikle de bu, transgenin veya transgenlerin sentezlenmesinde kullanilan primer veya sadece promotördür. Bir düzenlemede, transgenin translasyonunu ve istege bagli olarak transkripsiyonunu tesvik etmek için kullanilan endojen promotör, adenovirüs genomuna entegre edilen ve daha önce rekombinant tekniklerle uygulanmamis bir promotördür.

Burada kullanildigi haliyle, bir endojen promotörün kontrolü altinda, transgen / transgen kasetinin, bahsedilen endojen promotörün kontrolü altina alinacak uygun oryantasyona sokuldugu yeri ifade etmektedir. Yani, promotör genellikle antisens iplikçik üzerinde oldugunda, kaset, örnegin antisens yönünde yerlestirilir.

Bunu söyleyerek, genler iki oryantasyondan birinde eksprese edilebilir. Bununla birlikte, genellikle bir oryantasyon, belirli bir (özel) transgen için, diger oryantasyon üzerinde artan ekspresyon seviyeleri saglar.

Bir düzenlemede bu kaset, duyu yönündedir. Yani, 5' ila 3' yönünde kopyalanir. Bir düzenlemede ise kaset antisens yönündedir. Yani, 3' ila 5' yönünde kopyalanir.

Virüsteki endojen promotörler, örnegin bir transgen ve bir ek yeri alici sekansini kodlayan bir genin kullanilmasiyla kullanilabilir. Dolayisiyla bir düzenlemede kaset, bir endojen promotörün kontrolü altindayken bir ek yeri alici sekansi içerecektir.

Dolayisiyla bir düzenlemede kodlama sekansi, örnegin antikoru veya antikoru baglayan fragmani kodlayan sekans, ayrica bir ek yeri alici sekansi içerir.

Bir düzenlemede transgen, transgenler veya transgen kaseti, bir E4 promotörünün ya da büyük geç promotör (ML promotörü) gibi büyük bir geç promotörün kontrolü altindadir.

Burada kullanildigi sekliyle kontrol altinda olma, belirli bir promotör talimat verdiginde transgenin aktive edildigi, yani kopyalanacagi anlamina gelir.

Burada kullanilan sekliyle Büyük Geç Promotör (ML promotörü veya MLP), L5 geni gibi "geç eksprese edilen" genlerin ekspresyonunu kontrol eden adenovirüs promotörünü ifade etmektedir. MLP bir "duyu iplikçigi" promotörüdür. Yani, promotör, '- 3' yönündeki promotörün asagi yönünde olan genleri etkiler. Burada kullanilan en büyük ilerleyen promotör, virüs genomunda yer alan orjinal büyük geç promotörü belirtir.

Burada kullanilan sekliyle E4 promotörü, E4 bölgesinin adenovirüs promotörünü ifade eder. E4 bölgesi bir antisens bölgedir; bu nedenle promotör de bir antisens promotörüdür. Yani, promotör 3'- 5' yönünde E4 bölgesinin kaynak yönüdür.

Dolayisiyla, E4 promotörünün kontrolü altindaki herhangi bir transgen kaseti uygun sekilde yönlendirilmelidir. Bir düzenlemede, E4 promotörünün kontrolü altindaki kaset antisens yönündedir. Bir düzenlemede kaset, E4 promotörünün kontrolü altinda duyu yönündedir. Burada kullanildigi sekliyle E4 promotörü, virüs genomunda bulunan orijinal E4 promotörünü ifade eder.

Bu nedenle bir düzenlemede, replikasyona yetkin onkolotik bir adenovirüs serotipi 11 (mesela Ad11p gibi) ya da fiber, hekzon ve kapsidin serotip 11 (mesela Ad11p gibi) oldugu bunun bir virüs türevi saglanmaktadir, burada virüs genomu bir terapötik antikoru ya da antikor baglama fragmanini kodlayan bir DNA sekansi içerir, bahsedilen DNA sekansi E4 ve büyük geç promotörden (yani, E4 promotörü veya büyük geç promotör) olusan gruptan seçilen adenovirüs için endojen olan bir promotörün kontrolü altindadir, öyle ki transgen virüs replikasyonunu engellemez, örnegin L5 bölgesi (yani bahsedilen bölgeden önce ya da sonra) ile iliskilidir, mesela örnegin virüs genomunda L5'ten sonra gelir.

Bir düzenlemede, bir endojen promotör, örnegin transgen kasetinde tanitilan, rekombinant teknikler vasitasiyla istenen bir yerde viral genoma dahil edilir. Bununla birlikte, mevcut tarifname baglaminda, bu düzenleme, genellikle, bir egzojen promotör olarak ifade edilecektir.

Bir düzenlemede transgen kaseti, bir egzojen promotör içerir. Burada kullanildigi sekliyle egzojen promotör, transgenin sokuldugu adenovirüste dogal olarak bulunmayan bir promotörü ifade eder. Genellikle egzojen promotörler diger virüslerdendir veya memeli promotörleridir. Burada kullanilan sekilde egzojen promotör, genin transkripsiyonunu düzenleyen, genellikle ilgilenilen genin yukari yönünde yer alan bir DNA elemani anlamina gelir.

Bir düzenlemede gen ekspresyonu düzenleyici, CMV (sitomegalovirüs promotör), CBA (tavuk beta aktin promotörü) veya PGK (fosfogliserat kinaz 1 promotörü) gibi, mesela CMV promotörü gibi egzojen bir promotördür.

Bir düzenlemede, kullanilan CMV egzojen promotör, SEK lD NO: 13'ün nükleotid sekansina sahiptir. Bir düzenlemede, kullanilan PGK egzojen promotör, SEK ID NO: 14'ün nükleotid sekansina sahiptir. Bir düzenlemede, kullanilan CBA egzojen promotör, SEK ID NO: 15'in nükleotid sekansina sahiptir.

Bir düzenlemede, replikasyona yetkin onkolotik bir adenovirüs serotipi 11 (mesela Ad11p gibi) ya da fiber, hekzon ve kapsidin serotip 11 (mesela Ad11p gibi) oldugu bunun bir virüs türevi saglanmaktadir, burada virüs genomu, virüs replikasyon döngüsü içinde geç eksprese edilen ve bu sayede transgenin virüs replikasyonunu engellemedigi bir sekilde virüs genomunun bir kisminda bulunan bir terapötik antikoru ya da antikor baglama fragmanini kodlayan bir DNA sekansi içerir, bahsedilen DNA sekansi adenovirüs (örnegin, CMV promotör) için egzojen bir promotörün kontrolü altindadir. Bir düzenlemede, bir antikoru veya fragmani kodlayan DNA sekansi burada baska yerde tarif edildigi gibi L5 bölgesi ile baglantilidir.

Bir düzenlemede, egzojen promotör, bir antijen sunucu hücre promotörüdür. Burada kullanildigi sekliyle antijen sunucu hücre promotörü, dendritik hücreler veya makrofajlar gibi antijen sunucu hücreler tarafindan seçimli olarak eksprese edilen bir gen için bir promotörü ifade eder. Bu gibi genler arasinda, bunlarla sinirli olmamak CD304; CTIIA veya GlLT gibi antijen isleme ve sunum aracilari bulunur. Dolayisiyla bir düzenlemede, egzojen promotörü, bahsedilen antijen sunucu hücrelerdeki transgenlerin seçimli olarak ekspresyonu için uygundur.

Diger Düzenleyici Sekanslar Burada kullanildigi sekliyle "gen ekspresyon düzenleyicisi" (veya düzenleyici / düzenleyici eleman), gen ekspresyonunda, tipik olarak transkripsiyonu veya translasyonu baslatarak veya zenginlestirerek bir rol oynayan bir promotörü, güçlendiriciyi veya bir ek yeri alici dizisi gibi bir genetik özelligi ifade eder.

Bu kullanildigi haliyle, "ek yeri alici dizisi", "ek yeri alicisi" ya da "ek yeri bölgesi", bir mRNA molekülünün, spliceozom kompleksinin küçük nükleer ribonükleoproteinleri tarafindan ne zaman taninacagini belirleyen bir düzenleyici sekansi ifade eder. Bir kez birlestirildikten sonra, spliceozom, mRNA molekülünün ek yeri alici sahasi ile, bir tekli polipeptit veya protein üretmek üzere dönüstürülebilecek olgun bir mRNA molekülü üreten bir yukari dogru ek yeri verici bölgeye baglanmasini katalize eder.

Mevcut bulusta farkli boyutlu ek yeri alici dizileri kullanilabilir ve bunlar kisa ek yeri alicisi (küçük), ek yeri alicisi (orta) ve dalli ek yeri alicisi (genis) olarak tanimlanabilir.

Burada kullanildigi haliyle SSA, tipik olarak sadece ekleme bölgesini, örnegin 4 bp içeren kisa bir ek yeri alicisi anlamina gelmektedir. Burada kullanildigi haliyle "SA", tipik olarak kisa ek yeri alicisi ve polipirimidin bölgesinden, örnegin 16 bp`den olusan bir ek yeri alicisi anlamina gelmektedir. Burada kullanilan sekilde "bSA", tipik olarak kisa ek yeri alicisi, polipirimidin bölgesi ve dallanma noktasi, örnegin 26 bp'yi içeren dalli bir ek yeri alicisi anlamina gelir.

Bir düzenlemede, açiklamanin yapilarinda kullanilan ek yeri alicisi, SEK ID NO: 16 ila 18'de gösterilmistir. Bir düzenlemede SSA, SEK ID NO: 16'nin nükleotid sekansina sahiptir. Bir düzenlemede SA, SEK lD NO: 17'nin nükleotid sekansina sahiptir. Bir düzenlemede bSA, SEK ID NO: 18'in nükleotid sekansina sahiptir. Bir düzenlemede, ek yeri alici sekansi bagimsiz olarak TGCTAATCTT CCTTTCTCTC TTCAGG (SEK ID NO: 18), CCTTTCTCTCTCTT CAGG (SEK ID NO: 17) ve CAGG (SEK lD NO: 16) içeren gruptan seçilir.

Bir düzenlemede ek yeri bölgesi, CCACC'yi içeren bir konsensüs Kozak dizisi ile hemen ilerletilir (yani, 5' ila 3' yönünde takip edilir). Bir düzenlemede ek yeri bölgesi ve Kozak dizisi, 100 veya daha düsük bp'ye kadar serpistirilir. Bir düzenlemede, Kozak sekansi, SEK ID NO: 45'in nükleotid sekansina sahiptir.

Tipik olarak, endojen veya egzojen bir promotörün (endojen promotör gibi) kontrolü altinda oldugu zaman, kodlama sekansi bir Kozak sekansindan hemen önce gelecektir. Kodlama bölgesinin baslangici, baslatma kodonu (AUG) ile gösterilir, örnegin dizi (gcc) gccRccAUGg [SEK ID NO: 77] 'nin baglami içindedir, kodlayici dizilerin baslangicinin baslangici koyu renkli tabanlarla gösterilir. Küçük harfli bir karakter, bu pozisyondaki ortak tabanlari belirtir (yine de degisebilir) ve büyük harfli karakterler, oldukça korunmus tabanlari belirtir, yani 'AUGG' dizisi sabittir veya nadiren degisir; 'R', bu pozisyonda genellikle bir pürinin (adenin veya guanin) gözlemlendigini ve parantez içindeki sekansin (goc) belirsiz önem tasidigini gösterir.

Dolayisiyla bir düzenlemede AUG baslatma kodonu, bir Kozak dizisine dahil edilir.

Burada kullanildigi haliyle "Dahili Ribozom Giris DNA Sekansi", bir Dahili Ribozom Giris Sekansini (IRES) kodlayan bir DNA dizinine karsilik gelir. Burada kullanilan haliyle "lRES", bir mRNA sekansi içinde baslayan baslatma da dahil olmak üzere, bir haberci RNA (mRNA) sekansinin translasyonun baslatilmasina izin veren bir nükleotid dizisi anlamina gelir. Bu, kaset polisistronik mRNA'yi kodladiginda özellikle faydalidir. Bir IRES'in kullanilmasi, çoklu protein veya peptitlere dönüstürülen bir polisistronik mRNA'ya yol açar. Bir düzenlemede, Dahili Ribozom Giris DNA sekansi, SEK ID NO: 19'un nükleotit sekansina sahiptir. Bir düzenlemede belirli bir IRES, genomda sadece bir kez kullanilir. Bu, genomun kararliligi açisindan fayda saglayabilir.

Burada kullanildigi haliyle, "yüksek kendiliginden bölünme verimliligi 2A peptit" ya da Uygun 2A peptitleri arasinda P2A, F2A, E2A ve T2A bulunur. Mevcut bulus sahipleri, belirli bir 2A peptidini kodlayan spesifik bir DNA sekansi bir kez kullanildiginda, ayni spesifik DNA sekansi ikinci kez kullanilamayacagini kaydetmistir. Bununla birlikte, DNA kodundaki fazlalik, ayni 2A peptidine çevrilen bir DNA sekansi olusturmak için kullanilabilir. 2A peptitlerin kullanilmasi kaset polisistronik mRNA'yi kodlarken özellikle yararlidir. 2A peptitlerin kullanilmasi translasyon sonrasi, birden fazla tek tek protein veya peptit üretmek için translasyona tabi tutulmus tek bir polipeptit zincirine yolaçan Bir düzenlemede, kullanilan kodlanmis P2A peptidi SEK ID NO: 25'in amino asit dizisine sahiptir. Bir düzenlemede, kullanilan kodlanmis F2A peptidi SEK lD NO: 26'nin amino asit dizisine sahiptir. Bir düzenlemede, kullanilan kodlanmis E2A peptidi SEK lD NO: 27'nin amino asit dizisine sahiptir. Bir düzenlemede, kullanilan kodlanmis T2A peptidi SEK lD NO: 28'in amino asit dizisine sahiptir.

Bir düzenlemede transgen tarafindan kodlanan bir mRNA veya her mRNA, örnegin SEK ID NO: 20'de gösterildigi sekilde tipik olarak bir mRNA dizisinin sonundaki gibi bir poliadenilasyon sinyal dizisi içerir. Bu nedenle bir düzenleme, transgen veya transgen kasedi, bir poliadenilasyon sinyal dizisini kodlayan en az bir diziyi içermektedir.

Burada kullanildigi haliyle, "poliA", "poliadenilasyon sinyali" ya da "poliadenilasyon dizisi", genellikle bir AATAAA bölgesi içeren bir DNA dizisi anlamina gelir; bu, bir kez transkribe edilen, ortaya çikan mRNA molekülünü parçalayan ve poliadenilleyen bir çoklu protein kompleksi tarafindan taninabilir.

Bir düzenlemede, poliadenilasyon sekansi, SEK ID NO: 20'in nükleotid sekansina sahiptir.

Bir düzenlemede yapi, bir poliadenilasyon sekansi içermez. Bir düzenlemede, gen ekspresyonunun düzenleyicisi bir ek yeri alici sekansidir.

Bir düzenlemede bir antikor veya antikor fragmani gibi bir protein / polipeptit / peptidi kodlayan sekans ayrica bir poliadenilasyon sinyali içerir.

Transgen Kodlamalari Bir düzenlemede transgen veya transgenler, bir protein, peptit, RNA molekülünü, örnegin bir RNA molekülünü bagimsiz olarak kodlarlar. Avantajli bir sekilde, transgen hücre içi olarak verilebilir ve sonrasinda transkribe edilebilir ve eger uygunsa dönüstürülür. Bir transgen tarafindan kodlanan genetik materyallerin örnekleri arasinda, örnegin antikorlar veya bunlarin baglayici fragmanlari, kemokinler, sitokinler, immün modülatörler, enzimler (örnegin etken madde içerisinde ön ilaci dönüstürme kabiliyeti) ve bir RNAi molekülü bulunur.

Burada kullanildigi haliyle peptit, 2 ila 50 rezidü, örnegin 5 ila 20 rezidü içeren bir amino asit dizisini ifade etmektedir. Burada kullanilan haliyle polipeptit, üçünoül yapi içermeyen, bilhassa ikincil ve üçüncül yapi olmaksizin, 50'den fazla rezidü içeren bir amino asit dizisini belirtir. Protein, ikincil ve /veya üçüncül yapiya, özellikle de ikincil ve üçüncül yapili 50'den fazla rezidü içeren bir amino asit dizisine atifta bulunmaktadir.

Bir düzenlemede, kodlama dizisi, bir terapötik RNA, terapötik peptit, terapötik polipeptit veya terapötik proteini (yani, bir terapötik geni) kodlar.

Burada kullanilan haliyle terapötik gen, hastaligin tedavisinde, iyilestirilmesinde veya önlenmesinde faydali olabilecek bir varligi kodlayan bir geni ifade eder, örnegin gen, kanser gibi bir hastaligi ilerlemesini en azindan yavaslatan, durduran veya tersine çeviren bir terapötik protein, polipeptit, peptit veya RNA'yi eksprese eder.

Bir düzenlemede, transgen tarafindan kodlanan varlik bir kanser hücresi gibi bir hücrede transkribe edildiginde veya dönüstürüldügünde, hücre tarafindan tehlike sinyallerinin üretimini arttirir. Burada kullanildigi sekliyle "tehlike sinyalleri", alarm sinyalleri olarak davranan yaralanma, stres veya apoptotik olmayan ölümle sonuçlanan hücreler tarafindan örnegin dogustan gelen bagisiklik sisteminin hücrelerini direkt olarak tepki vermeye tesvik ederek ve bunun yani sira adaptif bagisiklik sisteminin hücrelerinin aktivasyonunu arttirmak üzere görev yaparak üretilmis çesitli moleküllere karsilik gelir.

Tümörlerin mikrobölgesinin genellikle dogal insan bagisiklik tepkilerinin asagi düzenlendigi sekilde degistigi bilinmektedir. Dolayisiyla, tümör içerisinde bagisiklik tepkilerini yeniden baslatma kabiliyeti, kanser tedavisinde potansiyel olarak çok ilginçtir.

Bir düzenlemede, kodlanmis terapötik peptit veya protein, hücre disi çevreye salgilanacak sekilde tasarlanir. Bir düzenlemede, fonksiyonel RNA, peptit, polipeptit veya protein, örnegin antikor, hücrenin dis mikro çevresine, örnegin kültür süpernatantina veya in vivo olarak; doku, stroma, dolasim, kan ve / veya lenfatik sisteme salinir.

Bir düzenlemede, transgen tarafindan kodlanan peptit, polipeptit veya protein, bir sinyal sekansi içerir. Burada kullanildigi haliyle sinyal peptidi, proteinlerin N- ucunda bulunan, salgilama veya membran ekspresyonu için salgi yoluna girmesine yardimci olan kisa bir 13- 36 rezidülü peptit sekansini ifade eder. Bir düzenlemede, öncü sekans (sinyal peptidi), SEK ID NO: 21 ya da 22'nin amino asit dizisine sahiptir.

Bir baska düzenlemede, kodlanmis terapötik peptit veya protein, örnegin bir antikor hücrenin yüzey zarinda membran ile sabitlenmis bir form olarak, örnegin proteinde bir transmembran bölgesinin ya da bir lipid membran baglantisinin eklenmesine yönelik bir alanin kodlanmasi da dahil edilerek eksprese edilecek biçimde tasarlanir.

Bir düzenlemede, fonksiyonel RNA, peptit, polipeptit veya protein, örnegin bir antikor, örnegin aktif salgilama ile veya hücre lizisinin bir sonucu olarak adenovirüs tarafindan enfekte edilen hücreden salinir. Dolayisiyla bir düzenlemede adenovirüs, hücreyi parçalar ve böylece antikor gibi fonksiyonel RNA, peptit, polipeptit veya protein serbest birakilir.

Baska bir düzenlemede, kodlanmis terapötik peptit veya protein, örnegin bir antikor, bozulmamis hücre içinde tutulacak sekilde tasarlanmistir.

Avantaj saglayan haliyle, mevcut açiklamanin adenovirüsleri tarafindan eksprese edilen fonksiyonel RNA, peptit, polipeptit veya protein, örnegin antikorlar dokuda in vivo olarak hem mRNA (sekil 16, sekil 41C'ye bakiniz) ve hem de antikor proteini (bakiniz sekil 17A, sekil 358) halinde tespit edilebilir. Dahasi, eksprese edilen fonksiyonel RNA, peptit veya protein örnegin antikor, kendi Iigandini ELISA içinde baglayabilir (bakiniz sekil 17B). Bununla birlikte, fonksiyonel RNA, peptit, polipeptit veya protein, örnegin antikor erken tespit edilebilir (enfeksiyonu izleyen 3 gün içinde sekil 18B'ye bakiniz) ve ekspresyon, birkaç hafta boyunca sürdürülür (bakiniz sekiller 17 ve 188).

Bir düzenlemede, mevcut açiklamadaki adenovirüsler yaklasik 3 gün içinde ya da enfeksiyondan daha ziyade, örnegin, yaklasik 36, 48, 60 veya 72 saatte ya da örnegin yaklasik 2, 3, 4, 5 veya 6 günde antikorlar gibi fonksiyonel RNA, peptit, polipeptit veya protein eksprese eder.

Bir düzenlemede, mevcut açiklamaya ait adenovirüsler, birkaç hafta boyunca örnegin, yaklasik 1, 2, 3, 4, 5 veya 6 hafta antikorlar gibi fonksiyonel RNA, peptit, 41 veya 42 gün.

Avantaj saglayan haliyle, antikor ekspresyonu gibi fonksiyonel RNA, peptit veya protein ekspresyonu, kandaki antikor gibi fonksiyonel RNA, peptit, polipeptit veya proteini algilayabilmek için yeterince yüksektir (bakiniz sekil 19, sekil 358).

Bir düzenlemede, mevcut açiklamaya ait adenovirüs tarafindan eksprese edilen fonksiyonel RNA, peptit veya protein örnegin, antikorlar kari dolasimina ve / veya lenfatik sisteme girer.

Bir düzenlemede, mevcut açiklamaya ait adenovirüs, kanser hücreleri için arttirilmis bir terapötik endekse sahip olan bir onkolitik virüstür.

Bir düzenlemede, kodlama sekansi fonksiyonel RNA'yi, örnegin terapötik RNA'yi kodlar.

Burada kullanildigi sekliyle islevsel RNA, bir protein veya peptidi kodlamaktan baska bir fonksiyona sahip olan ve örnegin, shRNA ve miRNA gibi RNAi de dahil olmak üzere gen etkinligini inhibe etmek veya azaltmak için uygun RNA yapilari içeren RNA'ya karsilik gelir. Burada kullanilan sekliyle shRNA, kisa saç tokasi RNA'sini ifade etmekte olup, bu RNA interferansi (RNAi) yoluyla hedef gen ekspresyonunu bastirmak için kullanilabilen siki bir saç tokasi dönüsü yapan bir RNA sekansidir.

Burada kullanilan haliyle, miRNA (mikroRNA), mRNA molekülleri içindeki tamamlayici sekanslarla baz eslestirme yoluyla, transkripsiyonel veya transkripsiyon sonrasi seviyede gen ekspresyonunu düzenleyen küçük bir kodlamayan RNA molekülünü (yaklasik 22 nükleotid içerir) ifade eder. miRNA ile baglanan mRNA iplikleri bastirilir, çünkü artik ribozomlarla proteinlere çevrilemez ve bu gibi kompleksler çogunlukla hücre tarafindan aktif bir sekilde parçalanir.

Bir düzenlemede transgen, bir proteini kodlar. Burada kullanilan sekliyle protein, bir protein Iigandi, bir protein reseptörü veya bir antikor molekülünü içerir.

Burada kullanilan sekliyle protein Iigandi, hücrenin islevini etkilemek üzere hücre reseptörlerine baglanan veya hücrenin reseptörüne yapisan, örnegin hücre içi sinyallemeyi uyararak ve hücre içindeki gen transkripsiyonunu modüle ederek hücre yüzey membranini veya bunun parçalarini baglayan salgilanan proteinleri belirtir. Bir düzenlemede eksprese edilen protein, hücrenin yüzeyinde eksprese olacak ve / veya hücreden salinacak sekilde tasarlanir.

Bir düzenlemede kodlanmis protein, örnegin, bir DNAse, bir kollajenaz, bir matris metalloproteinaz (MMP2 veya 14 gibi) veya benzeri gibi tümörün ekstra hücresel matrisinin bozunmasina yardimci olan bir enzimdir.

Uygun antikorlar ve antikor fragmanlari, agonistik veya antagonistik olabilir ve antikanser etkinligi olanlari ve konakçi hücrenin kansere karsi tepkilerini modüle edenleri içerir, örnegin bir agonist veya antagonistik antikor veya antikor fragmani, vaskülarizasyonu azaltabilir veya tümörün vaskülarizasyonunu normallestirebilir. Bir düzenlemede, agonistik antikorlar veya diger kodlanmis proteinler konakçi hücrenin, konakçinin dogustan gelen ve uyarlanabilir bagisiklik tepkileri için daha görünür olmasini örnegin antijenleri, tehlike sinyallerini, sitokinleri veya kemokinleri çekip onlari aktive etmek için eksprese etme veya uyarlanabilir bagisiklik tepkilerini arttirmak için bunlari birlikte uyarma ya da kontrol noktasi yolu moleküllerine baglama yoluyla saglayabilir.

Burada kullanilan haliyle terapötik antikor veya antikor baglama fragmani, onkolitik virüse eklendiginde, hastadaki bir patoloji üzerinde, örnegin tedavi edilen kanser üzerinde faydali bir etkiye sahip olan antikora veya antikoru baglayan parçaya karsilik gelir.

Burada kullanilan sekliyle, fayda saglayan etki, in vivo olarak eksprese edilen antikorun arzu edilen ve / veya avantajli bir etkisini ifade eder.

Terapötik antikorlarin ve antikor baglama fragmanlarinin siniflari arasinda anti- EGF antikorlari, anti- VEGF antikorlari, anti- PDGF antikorlari, anti- CTLA antikorlari, anti- PD1 antikorlari, anti- PDL1 antikorlari ve anti- FGF antikorlari bulunur.

Mevcut açiklamanin virüslerine dahil edilmek için uygun olan tescilli terapötik antikorlar, absiksimab, adalimumab, alemtzumab, basiliksimab, belimumab, bevacizumab, brentuximab vedotin, canakinumab, setuksimab, certolzumab, daclizumab, denosumab, eculzumab, efaliksumab, gemtuzumab, golimumab, ibritumomab tiuksetan, infliksimab, ipilimumab, muromonab- CD3, ofatumumab, palivizumab, panitumumab, ranibizumab, rituksimab, tocilizumab, tositumom ve trastuzumab içerir.

Bir düzenlemede, kullanilan bir antikorun veya antikor fragmaninin antikor degisken bölgesi sekanslari, bevacizumab'in (Avastin® olarak da bilinir) degisken bölgelerine Mevcut açiklamanin virüslerine dahil edilmek için ayrica uygun olanlar, örnegin, trastuzumab, tositumomab, rituksimab, panitumumab, ofatumumab, ipilimumab, ibritumomab tiuksetan, gemtuzumab, denosumab setuksimab, brentuksimab vedotin, avastin ve adalimumab gibi kanser indikasyonlari için onaylanmis antikorlar ve baglama fragmanlarina yönelik kodlama sekanslaridir.

Bir düzenlemede kullanilan bir antikorun veya antikor fragmaninin antikor degisken bölge sekanslari, bilinen bir antikorun veya burada açiklanan bir antikorun degisken bölgelerine % 95 ve 100 arasinda benzer veya özdestir.

Burada kullanilan sekliyle "antikor molekülü", antikorlari ve bunlarin baglanma fragmanlarini içerir.

Burada kullanilan haliyle antikor genel olarak bir tam uzunluktaki antikora ve bunlari içeren bispesifik veya çok spesifik formatlara karsilik gelir.

Antikor baglayan fragmanlar, türetildigi orijinal "antikor" ile ayni, benzer veya daha iyi özgünlüge sahip antijeni hedefleyebilen bir antikor fragmanini içerir. Antikor fragmanlari, Fab, degistirilmis Fab, Fab ', degistirilmis Fab', F (ab '),2, Fv, tek alanli antikorlar (örn. , VH veya VL veya VHH), scFv, bi, tri veya tetra- valent antikorlar, Bis- scFv, diabodyler, triabodyler, tetrabodyler ve yukaridakilerden herhangi birine ait epitop baglama fragmanlari içerir (örnegin, bakiniz Holliger ve Hudson, 2005, Nature (3), 209- 217). Bu antikor fragmanlarinin olusturulmasi ve üretilmesine yönelik yöntemler teknikte iyi bilinmektedir (örnegin bakiniz Verma ve digerleri, 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165- 181). Mevcut bulusta kullanilmak üzere diger degerli antikorlar. örnegin bispesifik olmak üzere çoklu özgünlük içerebilir veya Burada kullanildigi sekliyle spesifik ifadesi, sadece spesifik oldugu antijeni taniyan bir antikoru veya fragmani ya da spesifik olmadigi antijenlere olan baglanma afinitesi ile karsilastirildiginda spesifik oldugu antijene önemli oranda yüksek baglanma afinitesine, örnegin 5, 6, 7, 8, 9, 10 kat daha büyük bir baglanma afinitesine sahip olan bir antikoru ya da fragmani ifade eder.

Bilinen antikorlar veya antikor baglama fragmanlari, ayni CDR'Ier veya ayni degisken bölgelere sahip alternatif antikor formatlari üretmek için kullanilabilir, örnegin tam uzunluktaki bir antikor bir Fab, Fab' veya scFv fragmanina kolayca dönüstürülebilir.

Insan disi hayvanlar, insan antikor molekülleri, insanlastirilmis antikor molekülleri ve kimerik antikor moleküllerinden gelen antikor molekülleri de dahil olmak üzere mevcut açiklamanin yapilarinda çok çesitli farkli antikor formlari kullanilabilir.

Bir düzenlemede, antikor veya baglama fragmani monoklonaldir. Monoklonal antikorlar, teknolojide bilinen herhangi bir yöntemle, örnegin hibridoma teknigi (Kohler teknigi (Kozbor ve digerleri, 1983, Immunology Today, 4:72) ve EBV- hibridoma teknigi (Cole ve digerleri, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, sf77- 96, Alan R Liss, Inc. , 1985) ile hazirlanabilir.

Bir düzenlemede, antikor veya baglama parçasi insan disidir, yani tamamen insan disi kaynaklidir. Antikorlar ve fragmanlar kanser hücresi içine virüs tarafindan verilebildiginden dolayi bu mümkündür.

Bir düzenlemede antikor kimeriktir, örnegin insan sabit bölgesi (leri) ve insan disi degisken bölgeler içerir.

Bir düzenlemede, antikor veya baglama parçasi insanidir, yani tamamen insan kaynaklidir.

Bir düzenlemede, antikor veya baglama fragmani insanlastirilmistir. Insanlastirilmis antikorlar (CDR graftli antikorlari içerir), insan olmayan bir türe ait bir veya daha fazla tamamlayicilik belirleyen bölge (CDR) ve bir insan immünoglobülin molekülünden bir 09967). Takdir edilecegi gibi, sadece CDR'Ierin tamamindan ziyade CDR'Ierin özgünlük belirleyici rezidülerini aktarmak gerekli olabilir (bakiniz örnegin, Kashmiri ve örnegin CDR'Ierin türetildigi insan disi türlerden türetilmisi bir veya daha fazla çerçeve rezidüsü içerebilir.

Bir düzenlemede kodlama sekansi, bir antikor agir zincirini, bir antikor hafif zincirini veya bir antikor fragmanini kodlar. Burada kullanilan sekliyle agir zincir (HC), bir antikorun genis polipeptit altbirimini ifade eder. Burada kullanildigi sekliyle hafif zincir (LC), bir antikorun küçük polipeptit alt birimine karsilik gelir. Bir düzenlemede antikor hafif zinciri, bir CL bölgesi, ya bir kapa veya Iambda içerir.

Mevcut açiklamada kullanilmak üzere antikorlar, teknikte bilinen herhangi bir uygun yöntem kullanilarak elde edilebilir. Polipeptidi (aktiflestirilmis T hücreleri gibi) eksprese eden hücrelerin (rekombinant veya dogal olarak) dahil oldugu füzyon proteinlerini içeren antijen polipeptidi / proteini, antijeni spesifik olarak taniyan antikorlar üretmek için kullanilabilir. Polipeptit, 'olgun' polipeptit veya bunun biyolojik açidan aktif bir fragmani veya türevi olabilir.

Bir konakçi hayvana bagisiklik kazandirmak için kullanilmak üzere polipeptitler, ekspresyon sistemleri içeren genetik olarak islenmis konak hücrelerinden teknikte iyi bilinen yöntemlerle hazirlanabilir veya dogal biyolojik kaynaklardan toplanabilirler.

Mevcut basvuruda, "polipeptitler" terimi peptitleri, polipeptitleri ve proteinleri kapsar.

Aksi belirtilmedikçe bunlar birbirlerinin yerine kullanilir. Antijen polipeptit, bazi durumlarda, örnegin bir afinite etiketine kaynastirilmis bir füzyon proteini gibi daha büyük bir proteinin bir parçasi olabilir.

Antikor polipeptidine karsi üretilen antikorlar, bir hayvanin asilanmasinin gerekli oldugu durumlarda, Iyi bilinen ve rutin protokolleri kullanarak polipeptitlerin bir hayvana, tercih edilen sekliyle bir insan disi hayvana uygulanmasi ile elde edilebilir, örnegin bakiniz Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed. ), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986). Tavsanlar, fareler, siçanlar, koyunlar, inekler, develer veya domuzlar gibi sicakkanli hayvanlara bagisiklik kazandirilabilir. Bununla birlikte, genellikle fareler, tavsanlar, domuzlar ve siçanlar en uygun olanlaridir.

Bulusta kullanilmaya yönelik antikorlar ayrica, spesifik antikorlarin üretimi için seçilen tek lenfositlerden üretilen immünoglobülin degisken bölge cDNA'lari, örnegin, Babcook, J. Ve digerleri, (; tarafindan tarif edilen yöntemlerle klonlama ve eksprese etme yoluyla tek lenfosit antikor yöntemleri kullanilarak üretilebilir. Natl. Acad. Sci. (SILINECEK) USA 93 (15): Antikorlarin taranmasi, antijene baglanmayi ölçmek için tahliller kullanilarak ve/veya reseptörü antagonize etme kabiliyetini ölçmek için tahliller kullanilarak gerçeklestirilebilir. Bir baglanma tahlili örnegi, özellikle, plakalarin üzerinde hareketsiz kilinan bir füzyon proteini (istege bagli olarak bir haberci içeren) kullanan ve füzyon proteinine baglanmis anti- antijen antikorunu saptamak için bir konjuge sekonder antikor kullanan bir ELISA`dir.

Bu bulusun antikor molekülünün, eger mevcutsa, sabit bölge alanlari, antikor molekülünün önerilen fonksiyonu ve özellikle gerekli olabilecek efektör fonksiyonlari dikkate alinarak seçilebilir. Örnegin, sabit bölge alanlari, insan IgA, lgD, IgE, IgG veya IgM alanlari olabilir. Özellikle, antikor molekülü terapötik kullanimlar için tasarlandiginda ve antikor efektör islevleri gerektiginde, insan lgG sabit bölge alanlari, özellikle de lgG1 ve IgGS izotipleri kullanilabilir. Alternatif olarak, IgG2 ve efektör islevleri gerekmediginde, örnegin agonize edici aktivite için veya hedef nötralizasyonu için kullanilabilir. Takdir edilecektir ki, bu sabit bölge alanlarinin sekans varyantlari da kullanilabilir. Örnegin 241 pozisyonundaki serinin, Angal ve haline getirildigi IgG4 molekülleri kullanilabilir.

Bazi antikor islevleri için, örnegin bagisiklik sisteminin hücreleri gibi antikorun hedef molekülünü tasiyan hücrelere aktivasyon sinyalleri vermek için, antikorun membrana sabitlenmis versiyonlarinin kullanilmasi avantaj saglayabilir, böylece antikor, eksprese eden hücrenin yüzeyi üzerinde eksprese edilir. Bu gibi hücre yüzeyinde eksprese edilmis baglanma molekülleri, hedef molekülden alici hücreye aktivasyon sinyallerinin iletilmesini güçlendiren, baska bir hücrenin yüzeyindeki hedef sinyal molekülü arasinda etkili multimerik etkilesimler saglar.

Avantaj saglayan haliyle, bu açiklamanin adenovirüsleri, tam uzunluga sahip ve antikorlarin scFv biçimlerini eksprese edebilmektedir.

Bir düzenlemede antikoru veya antikor parçasini kodlayan sekans, dahili bir ribozom giris sekansi içerir veya bunlardan baskalarini da içerir. Burada kullanilan haliyle dahili ribozom giris dizisi (IRES), bir haberci RNA (mRNA) sekansinin ortasinda translasyon baslatilmasina izin veren bir nükleotid sekansi anlamina gelir.

Bir düzenlemede kodlanmis terapötik proteinler veya peptitler, hedef spesifik proteinler, polipeptitler veya peptitlerdir.

Burada kullanilan haliyle hedefe özgü proteinler veya peptitler, ya hedef proteinlerin kendilerini ya da hedef proteinlerin veya peptitlere direkt olarak baglanan (örn. . hedefe özgü olan) veya bunun disinda, bunlarin seviyelerini degistiren farkli protein veya peptitleri belirtir. Bir öncekine dair bir örnek bir sitokin olurken, ikincisine yönelik bir örnek ise sitokine karsi bir antikor olacaktir.

Ilgilenilen hedefler genellikle hastalikla, özellikle kanser ile iliskili belirli hücreler, hücresel ürünler, antijenler veya sinyal yollari ile ilgilidir. Hedef, baglama bagli olarak, mRNA ile ya da örnegin, RNAI tipi teknoloji ile inhibe edilebilen, protein veya polipeptidi kodlayan genden kopyalanan benzeri ile de ilgilidir. Böylece RNA, mesela RNAI teknolojisi baglaminda, söz konusu hedef hedefin geni tarafindan kodlanan mRNA'dir.

Ilgilenilen hedeflerin örnekleri arasinda uyarici T hücresi ortak reseptörleri ve bunlara yönelik ligandlar, kontrol noktasi engelleyici T hücresi ortak reseptör molekülleri ve bunlara yönelik ligandlar, reseptörler ve düzenleyici T hücreleri tarafindan eksprese edilen ligandlar, miyeloid türevi baskilayici hücreler ve Immünosüpresif bagisiklik hücreleri, dendritik hücre ve antijen sunan hücre reseptörleri ve bunlara yönelik ligandlar, antijen isleme ve sunum aracilari, sitokinler ve sitokin reseptörleri, kemokinler ve kemokin reseptörleri, transkripsiyon faktörleri ve regülatörleri, hücre içi alisveris molekülleri ve hücre fonksiyonunun düzenleyicileri, tümör hücresi ve tümör mikro çevre reseptörleri ve ürünleri, IDO gibi hücre içi tümör hücresi enzimleri, bagisiklik hücreleri tarafindan taninma için antijenler bulunur, ancak bunlarla sinirli degildirler.

Dolayisiyla bir düzenlemede burada kullanilan haliyle hedef, burada uygun bir sekilde örnegin, burada bir antikor veya baglayici fragman tarafindan inhibe edilebilen, nötralize edilebilen veya aktive edilebilen bir protein veya polipeptidi ifade eder. Hedef, sitokinler baglaminda, tek basina bir sitokini veya sitokine özgü bir antikoru veya bunun bir baglama parçasini belirtir. Böylece, virüs sitokinin kendisini kodlayabilir ve eksprese edebilir, çünkü bunun salinmasi "konakçi" bagisiklik tepkilerini uyarabilmektedir. Ligand baglaminda, ligandin mutasyona ugratilmis biçimleri, reseptörü baglamak için dogal ligand ile yarisan virüs tarafindan kodlanabilir. Mutasyona ugramis Iigand, reseptör için artan baglanma afinitesine sahip olabilir, örnegin, yavas bir kapanma hizina sahiptir, bu yüzden reseptörü isgal eder ve buradan sinyali arttirir veya azaltir. Alternatif olarak, mutasyona ugramis ligandin aktivitesi, vahsi tipli liganda kiyasla azaltilabilir ve böylece dogal liganddan reseptör araciligiyla baglanma ve genel aktivite azaltilir.

Bir düzenlemede, mevcut açiklamaya uygun virüs veya yapi, bir ön ilaç, bir bagisiklik düzenleyiciyi ve /veya bir enzimi kodlar.

Burada kullanildigi sekliyle ön- ilaç, daha sonra genellikle normal metabolik islemler vasitasiyla vücutta etken bir farmakolojik maddeye dönüstürülen aktif olmayan (veya tam olarak aktif olmayan) türev olarak verilen bir molekül anlamina gelir. Bir ön ilaç, istenen ilaca bir öncül türü olarak hizmet eder. Bir ön ilaç dönüstürme enzimi, bir ön ilaci farmakolojik olarak aktif formuna dönüstüren enzim olarak islev görür.

Burada kullanilan bagisiklik düzenleyici, bagisiklik tepkisinin bir düzenleyicisi anlamina gelir. Bagisiklik düzenleyiciler, bagisikligin güçlenmesinde, bagisikligi baskilanmasinda ya da immünolojik toleransin indüklenmesindeki gibi, bagisiklik tepkisinin istenilen bir seviyeye ayarlanmasinda islev görür.

Burada kullanildigi haliyle enzim, canli organizmalarda bir katalizör görevi gören ve kimyasal reaksiyonlarin sürecin kendisinde degisiklik yapilmadan hizlanma oranini düzenleyen bir madde anlamindadir.

Asagida, örnek hedef peptitler / polipeptitler ve proteinlerin kapsamli olmayan bir tartismasi bulunmaktadir.

Bir düzenlemede, hedef bir veya daha fazla CTLA- 4, PD- 1, PD- L1, PD- L2, VISTA, B7- H3, BT- H4, HVEM, ILT- 2, ILT- 3, ILT- 4, TIM- 3, LAG- 3, BTLA, LIGHT veya CD160'i içeren gruptan, örnegin CTLA- 4, PD- 1, PD- L1 ve PD- L2'clen bagimsiz olarak seçilir. Bir düzenlemede, bunlardan birine özgü bir antikor veya bunun bir baglama fragmani saglanmistir. Bu nedenle bir düzenlemede, bir transgen veya transgen kasedi, CTLA- 4, PD- 1, PD- L1 veya PD- L2'ye özgü bir antikoru veya antikor parçasini kodlar. Bir düzenlemede, adenovirüs CTLA- 4, PD- 1, PD- L1 veya PD- L2'ye özgü bir antikor veya antikor fragmanini ifade eder.

Bir düzenlemede antikor, bir kontrol noktasi inhibitörü antikorudur, örnegin anti- PD- L1'dir. Bir düzenlemede, adenovirüs, tam uzunluga sahip anti- insan PD- L1 antikorunu ifade eder. Bir düzenlemede tam uzunluga sahip anti- insan PD- Li antikorunun ekspresyonu, özellikle BY pozisyonunda, büyük geç promoter (MLP) gibi bir endojen promotörün kontrolü altindadir. Bir düzenlemede adenovirüs, anti- insan PD- L1 antikorunun scFv formunu eksprese eder. Bir düzenlemede bir anti- insan PD- L1 antikorunun bir scFv formunun ekspresyonu, özellikle BY pozisyonunda, büyük geç promotör gibi bir endojen promotörün kontrolü altindadir.

Bir düzenlemede, bir virüs veya mevcut açiklamanin yapisi tarafindan kodlanan anti- PD- L1 antikoru VH zincirinin amino asit sekansi, SEK ID NO: 30'dur. Bir düzenlemede anti- PD- L1 antikor sabit agir zincirinin amino asit sekansi SEK lD NO: 33veya 34'dür. Bir düzenlemede, anti- PD- L1 antikoru VL zincirinin amino asit sekansi, SEK ID NO: 32'dir. Bir düzenlemede, anti- PD- L1 antikor sabit hafif zincirinin amino asit sekansi, SEK ID NO: 35'tir. Bir düzenlemede, anti- PD- L1 scFv antikor fragmaninin amino asit sekansi, SEK lD NO: 37'dir.

Bir düzenlemede, mevcut açiklamaya uygun, burada örneklendigi gibi CTLA- 4'e özgü tam uzunlukta bir antikor veya scFv için bir antikor veya bunun bir baglama parçasini kodlayan bir virüs veya yapi saglanmaktadir.

CD162, CD30'Ia, CD301b ve Galektin- 3 içeren gruptan bagimsiz olarak seçilen biri ya da ikisidir. Bir düzenlemede, bir antikor ya da buna özgü olan bir baglama antikoru, örnegin bir tam uzunluklu antikor ya da bir scFv saglanmaktadir.

Bir düzenlemede, örnegin bir antikor ya da baglama fragmani tarafindan hedeflenen bir hedef, FLT- 3, FLT- 3 ligandi, TLRs, TLR ligandlari, CCR7, CD1a, CD1c, CD11b, CLEC9a, XCR1 ve CD304 içeren gruptan bagimsiz olarak seçilen biri ya da ikisidir.

Bazi TLR ligandlari, bagisiklik tepkilerini uyarma kabiliyetine sahiptir ve örnegin, adjuvanlar olarak kullanilirlar. Bir düzenlemede virüs, bir TRL ligandini kodlar ve salgilar.

Bir düzenlemede hedef, bir antijen islemcisi ve antijen sunum aracisindan, örnegin CTIIA veya GlLT arasindan seçilir.

Bir düzenlemede, örnegin bir antikor veya baglama parçasi tarafindan hedeflenebilen hedef, bir kanser hedefidir. bagimsiz olarak seçilen biri ya da daha fazlasidir, örnegin CD40 ve CD40 Iigandidir.

Bir düzenlemede transgen kaseti, CD40 veya CD40 Iigandi veya CD40 veya CD40 kodlar. Bir düzenlemede adenovirüs, CD40 veya CD40 Iigandi veya CD40 veya CD40 Iigandini hedefleyen (bunlara özgü) bir antikor, antikor fragmani veya shRNA içeren bir Iigandi eksprese eder. seçilen biri ya da daha fazlasidir. Interlökin- 2 (lL- 2), IL- 4, lL- 5, IL- 7, IL- 10, lL- 15, fragmanini kodlar. Bir düzenlemede, adenovirüs, IL- 12, lL- 18, IL- 22, lL- 7, lL- 15, Bir düzenlemede, IFNy'nin amino asit dizisi SEK ID NO: 41'dir. Bir düzenlemede, asidi dizisi, SEK lD NO: 40'tir.

Bir düzenlemede hedef, bir kemokindir, örnegin lL- 8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CCR2, CCR4, CCR5, CCRG, CCR7, CCR8, CXCR3, CXCR4, CXCRS ve CRTH2'yi içeren gruptan bagimsiz olarak seçilen biri ya da daha fazlasidir.

Bir düzenlemede, transgen kaseti, CCL5, CXCL9, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, CXCR2, CCR2, CCR4 ya da CXCR4'e özgü bir antikor veya antikor fragmanini kodlar. Kemokinler baglaminda hedef, örnegin kansere karsi konak bagisiklik tepkilerini indüklemek veya arttirmak Için virüslerin kemokini kodladigi ve eksprese ettigi yeri içerir.

Bir düzenlemede adenovirüs, CCL5, CXCL9, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, CXCR2, CCR2, CCR4 ya da CXCR4'e özgü bir antikor veya antikor fragmanini eksprese eder.

Bir düzenlemede hedef, STAT3, STAT1, STAT4, STAT6, CTlIA, MyD88 ve NFKB aile üyelerinden olusan gruptan bagimsiz olarak seçilen biri veya daha fazlasidir, örnegin protein, bir inhibitör, örnegin bir antikor veya bunun bir baglama fragmani ile hedeflenir, veya ilgili genden kopyalanan mRNA, RNAi gibi bir mekanizma tarafindan engellenir.

Bir düzenlemede hedef, HSp70'dir veya hücre hayatta kalimi ve mesela survivin gibi ölümüne dair bir düzenleyicidir, örnegin protein, bir inhibitör, örnegin bir antikor veya bunun bir baglama fragmani ile hedeflenir veya ilgili genden kopyalanan mRNA, RNAi gibi bir mekanizma, örnegin tarafindan engellenir.

Bir düzenlemede hedef, amfiregülin, BTC, NRGta, NRG1b, NRG3, TGFa, LRIG1, LRIG3, EGF, EGF- L6, Epigen, HB- EGF, EGFR, Her2, Her3 ve Her4 içeren gruptan bagimsiz olarak seçilen biri veya daha fazlasidir, örnegin protein, bir inhibitör, örnegin bir antikor veya bunun bir baglama fragmani ile hedeflenir, veya ilgili genden kopyalanan mRNA, RNAi gibi bir mekanizma tarafindan engellenir.

Bir düzenlemede hedef, hedgehog, FGF, IGF, Wnt, VEGF, TNF, TGFß, PDGF ve Notch içeren gruptan bagimsiz olarak seçilen birine veya daha fazlasina yönelik bir ligand veya reseptördür.

Bir düzenlemede adenovirüs, VEGF'ye özgü bir antikor veya antikor fragmani eksprese eder. Bir düzenlemede, antikor bir anti- VEGF antikorudur. Örnegin, antikor Bevacizumab'in amino asit sekansina sahip olan bir antikor veya bunun esdegeri gibi. Bir düzenlemede, adenovirüs, tam uzunluga sahip anti- insan VEGF antikorunu ifade eder. Bir düzenlemede tam uzunluga sahip anti- insan VEGF antikorunun ekspresyonu, özellikle BY pozisyonunda, büyük geç promoter (MLP) gibi bir endojen promotörün kontrolü altindadir. Bir düzenlemede adenovirüs, anti- insan VEGF antikorunun scFv formunu eksprese eder. Bir düzenlemede bir anti- insan VEGF antikorunun bir scFv formunun ekspresyonu, özellikle B Ypozisyonunda, büyük geç promotör gibi bir endojen promotörün kontrolü altindadir. Bir düzenlemede, anti- VEGF antikoru VH zincirinin amino asit sekansi, SEK ID NO: 29'dur. Bir düzenlemede anti- VEGF antikor sabit agir zincirinin amino asit sekansi SEK ID NO: 33 veya 34'dür. Bir düzenlemede, anti- VEGF antikoru VL zincirinin amino asit sekansi, EQ ID NO: 31'dir. Bir düzenlemede, anti- VEGF antikoru sabit hafif zincirin amino asit sekansi, SEK ID NO: 35'tir. Bir düzenlemede, anti- VEGF scFv antikor fragmaninin amino asit sekansi, SEK lD NO: 36'dir.

Bir düzenlemede, hedef IDO'dur.

Bir düzenlemede hedef, Sitomegalovirüs antijenleri, grip antijenleri, hepatit B yüzey ve çekirdek antijenleri, difteri toksoidi, Crm197, tetanoz toksoidi gibi bulasici organizmalar; T hücresi olarak bilinen böyle antijenlerden veya antikor epitoplardan, ya da bu antijenlerin genetik olarak islenmis kompozitlerinden ya da multimerlerinden türetilen peptitler; antijenler olarak tümör türevi proteinler; T hücresi olarak bilinen bu tip antijenlerden ya da epitoplardan türetilen peptitler ve genetik olarak islenmis bu tip antijenlerin kompozitler veya multimerler örnegin, WT1, MUC1, LMP2, idiotype, HPV E6&E7, EGFvalI, HER- 2/neu, MAGE A3, p53 nonmutant, p53 mutant, NY- ESO- 1, GD2, PSMA, PCSA, PSA, gp100, CEA, MelanA/MART1, Ras mutant, proteinazß (PR1), bcr- abl, tyrosinase, survivin, PSA, hTERT, özellikle WT1, MUC1, HER- 2/neu, NY- ESO- 1, survivin ya da hTERT içeren gruptan bagimsiz olarak seçilen bir ya da daha fazla protein ya da peptit için bagisiklik hücreleri tarafindan taninmaya yönelik bir antijendir.

Teknikte uzman kisiler, kodon artikligina bagli olarak belirli bir amino asit dizisini kodlayan nükleik asit sekanslari için birçok olasiligin oldugunu, sessiz nükleik asit baz çiftinin mutasyonlarinin tolere edildigini ve belirli bir amino asit dizisini kodlayan tüm nükleik asit dizilerinin SEK ID NO:'larinin mevcut açiklama tarafindan öngörüldügünü takdir edecektir.

Bir düzenlemede, bir transgen ile kodlanan peptit, polipeptit veya protein bir mimotoptur. Burada kullanilan haliyle bir mimotop, bir epitopun yapisini taklit eden bir molekül, çogunlukla bir peptittir. Ikinci özellik, epitop tarafindan ortaya çikarilana benzer bir antikor tepkisine neden olur. Belirli bir epitop antijeni için bir antikor, o epitopu taklit eden bir mimotopu taniyacaktir. Mimotoplar, yaygin sekilde biopanning yoluyla faj görüntüleme kütüphanelerinden elde edilir. Mimotoplari kullanan asilar gelistirilmektedir. Bu nedenle, bilinen özgünlüklerin antikorlari, kütüphanelerin taranmasi için kullanilabilir (örnegin, faj gösteriminde peptit kütüphaneleri - örnegin Ab sekans kütüphaneleri veya antikor olmayan peptit kütüphaneleri, özellikle daha kararli 3D yapilara sahip peptitlerin üretilmesi için optimize edilmis olanlar) - Mimotoplarin üretilmesi teknikte iyi açiklanmistir (bkz. Tribbick G, Rodda S. Antikor benzeri moleküllere baglanan peptit ligandlarinin kesfi için kombine yöntemler. J Mol Takechi M, Hashimoto Y. Yesil flüoresan proteine kaynastirilmis hedef molekülleri eksprese eden transfektanlar ile bagisiklik kazandirilmis siçanlar kullanilarak saglam bir strateji ile zar onkoproteinlerine yönelik terapötik antikorlara dogru. Cancer Sci.

Bir düzenlemede, bir mimotop veya diger tasarlanmis asi antijenleri bir transgen ile kodlanir ve alici hastada bir antikor tepkisi uyandirmak için eksprese edilir, burada indüklenen antikorlar istenen terapötik etkiye sahiptir. Bir düzenlemede, istenen insan hedef antikor tepkilerini indüklemek için kullanilir, örnegin hedef molekül PD- 1'e baglanmak için önemli olan PD- L1'in bir peptit bölgesi, GFP veya diger yüksek derecede immünojenik yabanci tasiyici proteinlerle genetik olarak baglantili olabilir, böylece peptite karsi bir immün antikor tepkisi, dogal PDL1 molekülü ile çapraz reaksiyona giren ve dolayisiyla PD- L1: PD- 1 etkilesimlerini bir anti- PDL1 antikorunu dogrudan kodlayarak yapanla ayni sekilde engellemeyi içerir. Kendine karsi terapötik antikor tepkilerini indükleyen asilar için kavramlar teknikte iyi tarif edilmistir (bkz. Spohn G, Bachmann MF. Reseptör- ligand etkilesimlerini bloke etmek MF. Immunodrugs; terapötik antisidokin asilariyla B- hücresi toleransini bozma, Assier E, Semerano L, Bessis N, Boissier MC. Antitokokin asilarinin yeni ortaya Bir veya daha fazla düzenleme, kullanilan transgen, SEK ID NO: 29 ila 44, 67 & 70- 71'in herhangi birinde gösterilen bir sekansi kodlar.

Avantaj saglayan haliyle, mevcut açiklamadaki adenovirüsler antikor formlarini ve bir transgende kodlanan sitokinler gibi diger proteinleri kültür süpernatana in vitro olarak veya tümör dokusu stromasina in vivo olarak eksprese eder ve salar (bakiniz sekiller Öncü sekanslar, kanser hücresinden çikan kodlanmis protein / polipeptit veya peptite yardimci olabilir. Dolayisiyla, bir düzenlemede kodlanmis "protein", bir öncü sekans içerir. Burada kullanildigi haliyle, öncü sekans, promotör sekans ve kodlama bölgesi arasinda bulunan, transkripsiyon ya da translasyon seviyesinde gen ekspresyonunu düzenleyen bir polinükleotid dizisine karsilik gelir.

Bir düzenlemede kodlama sekansi, bir peptidi kodlar. Burada kullanilan sekliyle peptit, tam bir fonksiyonel protein olmayan bir amino asit zincirine karsilik gelir. Tipik olarak proteinin islevinin bir kismini veya tamamini tutan bir fragman, T- hücreleri tarafindan taninabilen ya da bagisiklik sistemi tarafindan taninabilen 8 ya da daha fazla amino asitlik peptitlerin bir fragmanidir.

Bir düzenlemede transgen, örnegin Iusiferaz, GFP veya eGFP veya kirmizi flüoresan proteini gibi biyolojik olarak parlak, floresan görüntüleme ajanlari (aktive edilebilir fluoresan görüntüleme ajanlari dahil) içeren bir görüntüleme ajanini kodlayan bir haberci gendir.

Burada kullanilan haliyle haberci gen veya haberci sekansi, ökaryotik hücrelerde kolayca tespit edilen bir ürün üreten bir gen veya DNA sekansi anlamina gelir ve DNA'sinin yakindan baglantili veya birlestirildigi baska bir genin aktivitesini belirlemek için bir markör olarak kullanilabilir. Haberci genler, onlari kolaylikla tanimlayan ve ölçülen hücreler veya organizmalar üzerinde özellikleri sunar veya bunlar, seçilebilir isaretlerdir. Haberci genler, belirli bir genin hücre ya da organizma popülasyonundan alinip alinmadiginin ya da bunlarda sentezlenip sentezlenmediginin göstergesi olarak siklikla kullanilir. Yaygin haberci genlerin örnekleri bunlarla sinifli olmamak kaydiyla LacZ, Iusiferaz, GFP, eGFP, neomisin fosfotransferaz, kloramfenikol asetiltransferaz, sodyum iyodür simportör (NIS), nitroreduktaz (örnegin, NfsA, NfsB) hücre içi metaloproteinler, HSV1- tk veya östrojen reseptörünü içerir.

Bir düzenlemede, genetik materyal (özellikle transgene), bir görüntüleme ajani.

Bir düzenlemede, NIS 'in amino asidi sekansi, SEK lD NO: 67'tir.

Mevcut açiklamaya uygun virüsler, tümör hücrelerinin bir panelinde Iitik potansiyelinin incelenmesiyle spesifik bir tümör türüne yönelik tercihleri için arastirilabilir, örnegin, HCT116, SW48 ve Colo320DM bulunur. Mevcut herhangi bir kolon tümör hücre dizisi böyle bir degerlendirme için esit derecede yararli olacaktir.

Prostat hücre dizileri, DU145 ve PC- 3 hücrelerini içerir. Pankreas hücre hatlari arasinda Panc- 1 hücreleri bulunur. Meme tümör hücre hatlarini, MDA231 hücre dizisini içerir ve yumurtalik hücre dizileri OVCAR- 3 hücre hatlarini içerir. Hemopoietik hücre hatlari arasinda, bunlarla sinirli olmaksizin, Raji ve Daudi B- lenfoid hücreleri, K562 eritroblastoid hücreler, U937 miyeloid hücreleri ve HSB2 T- lenfoid hücreleri bulunur. Mevcut diger tümör hücre çizgileri de esit derecede yararlidir.

Mevcut açiklama, burada açiklanan yeni dizileri de kapsar. Bir düzenlemede, virüs burada açiklanan sekanslardan herhangi birinde, örnegin SEK ID NO:'lar: 1 ila 9, SEK ID NO: 72- 73'te gösterilir.

Formülasyonlar Mevcut açiklama, burada tarif edildigi gibi bir virüsün farmasötik bir formülasyonunu da kapsar.

Bir düzenlemede, mevcut açiklamaya göre çogalmaya elverisli bir onkolitigin örnegin. infüzyonu ya da enjeksiyonu için bir sivi parenteral formülasyon saglanir, burada temin eder.

Parenteral formülasyon, GI (gastrointestinal) yol vasitasi ile verilmeyecek sekilde tasarlanmis bir formülasyon anlamindadir. Tipik parenteral uygulama yollari arasinda enjeksiyon, implantasyon veya infüzyon bulunur. Bir düzenlemede formülasyon, bolus verilmesine yönelik bir formda saglanir.

Bir düzenlemede, parenteral formülasyon bir enjeksiyon formundadir. Enjeksiyon intravenöz, deri altina, intra- tümöral veya intramüsküler enjeksiyonlari içerir. Burada kullanilan haliyle enjeksiyon, bir siringa yoluyla sivinin vücuda sokulmasi anlamina gelir. Bir düzenlemede, mevcut açiklamaya ait yöntem, tümör içi enjeksiyonu içermez.

Bir düzenlemede, parenteral formülasyon bir infüzyon formundadir.

Burada kullanildigi sekliyle infüzyon, sivilarin damla, infüzyon pompasi, siringa sürücüsü veya esdeger cihaz ile daha yavas bir hizda uygulanmasi anlamina gelir.

Bir düzenlemede infüzyon, 1. 5 dakika ila 120 dakika arasindaki bir periyot boyunca, uygulanir.

Bir düzenlemede, formülasyonun bir dozu, bir siringa sürücüsü tarafindan uygulanan sekilde örnegin 100 ml'den azdir, örnegin 30 ml'dir.

Bir düzenlemede, enjeksiyon, yavas bir enjeksiyon olarak, örnegin 1. 5 ila 30 dakikalik bir periyot boyunca uygulanir.

Bir düzenlemede formülasyon, intravenöz (i. v.) uygulama içindir. Bu yol, onkolitik virüsün verilmesinde özellikle etkilidir, çünkü organ ve doku çogunluguna hizli erisim saglar ve metastazlarin, örnegin özellikle karaciger ve akcigerler gibi yüksek oranda vaskülarize bölgelerde konumlu bulunan metastazlarin tedavisi için özellikle yararlidir.

Terapötik formülasyonlar, tipik olarak, üretim ve muhafaza kosullari altinda steril ve kararli olacaktir. Bilesim, bir insana uygulamak için uygun bir çözelti, mikroemülsiyon, lipozom veya baska parenteral formülasyon olarak formüle edilebilir ve bir siringa veya tüp gibi önceden doldurulmus bir cihaz, özellikle tek bir doz olarak formüle edilebilir.

Formülasyon genel olarak farmasötik açidan kabul edilen bir seyreltici veya tasiyici, örnegin virüsle uyumlu olan ve virüsün gerekli süre boyunca kararli oldugu toksik olmayan, izotonik bir tasiyiciyi içerir.

Tasiyici, örnegin su, etanol, poliol (mesela, gliserol, propilen glikol ve sivi polietilen glikol ve benzeri) ve bunlarin uygun karisimlarini içeren bir çözücü veya dagitma ortami olabilir. Uygun akiskanlik, örnegin, lesitin gibi bir dagitici (dispersan) veya yüzey aktif madde ya da polisorbat 80 veya 40 gibi iyonik olmayan bir yüzey aktif madde kullanilarak muhafaza edilebilir. Dispersiyonlarda, istenen parçacik boyutunun korunmasi bir yüzey aktif maddenin varligi ile desteklenebilir. izotonik maddelerin örnekleri arasinda, sekerler, mannitol, sorbitol gibi polialkoller veya bilesim içinde sodyum klorür bulunmaktadir.

Bir düzenlemede, kullanilan parenteral formülasyonlar asagidakilerden bir veya daha fazlasini içerebilir: örnegin 4- (2- hidroksietil) - 1- piperazinetansülfonik asit, bir fosfat tamponu ve / veya bir Tris tamponu gibi bir tampon; örnegin, bir dekstroz, manoz, sükroz ya da benzerleri gibi bir seker; sodyum klorür, magnezyum klorür ya da potasyum klorür gibi bir tuz; briji, PS- 80, PS- 40 ya da benzerleri gibi iyonik olmayan bir yüzey aktif madde benzeri bir deterjan. Formülasyon ayni zamanda, EDTA veya etanol veya bir EDTA ve etanolün kombinasyonu gibi bir koruyucu ihtiva edebilir ve bunun da muhtemel bozulmalarin bir veya daha fazla yolunu önledigi düsünülür.

Bir düzenlemede, formülasyon mevcut açiklamaya göre saflastirilmis onkolitik virüs içerecektir, örnegin doz basina 1x101° ila 1x1014viral partikül, mesela doz basina 1x'lO10 ila 1x1012 viral partikül içerecektir. Bir düzenlemede, formülasyon içindeki Bir düzenlemede, parenteral formülasyon gliserol içerir.

Bir düzenlemede formülasyon, burada tarif edildigi gibi onkolitik adenovirüs, HEPES (N- 2- hidroksietilpiperazin- N'- 2- etansülfonik asit), gliserol ve tampon içerir.

Bir düzenlemede, parenteral formülasyon, bulusun virüsünden, örnegin 5 mM HEPES'ten, örnegin % 5- 20 (v/v) gliserolden, örnegin pH'i 7- 8 araligina ayarlamak için hidroklorik asitten ve enjeksiyon için sudan olusur.

Bir düzenlemede, 2 x 1012 vp/mL'lik bir konsantrasyonda bulusa ait 0. 7 mL virüs, 7. 8'Iik bir nihai pH'Ia, 5 mM HEPES, % 20 gliserol içinde formüle edilir.

Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilarin kapsamli bir tartismasi Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Yayincilik Sirketi, NJ 1991 )'da bulunabilir.

Bir düzenlemede, formülasyon, solunum dahil topikal uygulamalar için bir formülasyon halinde saglanir.

Uygun solunabilir preparatlar, solunabilir tozlari, itici gazlar içeren ölçüm aerosollerini veya itici gazlar içermeyen solunabilir solüsyonlari içerir. Açiklamaya uygun solunabilir tozlar genel olarak burada tarif edildigi gibi bir fizyolojik olarak kabul edilebilir eksipiyan içeren bir virüs ihtiva edecektir.

Bu solunabilir tozlar, monosakaritler (örnegin, glukoz veya arabinoz), disakkaritler (örnegin, laktoz, sakkaroz, maltoz), oligo- ve polisakkaritler (örnegin, dekstranlar), polialkoller (örnegin, sorbitol, manitol, ksilitol), tuzlar (örnegin, sodyum klorür, kalsiyum karbonat) veya bunlarin birbirleriyle karisimlarini içerebilir. Mono- veya disakaritler uygun sekilde kullanilmaktadir, özellikle laktoz veya glukozun kullanimi söz konusudur, ancak yalnizca bunlarin hidratlari seklinde degildir.

Akcigerde birikim için parçaciklar 10 mikrondan küçük, örnegin 1- 9 mikron, örnegin 0.1 ila 5 pm, özellikle 1 ila 5 pm gibi bir parçacik boyutu gerektirir. Virüs tasiyan parçacik boyutu, birincil önem tasimaktadir ve bu nedenle, bir düzenlemede, mevcut açiklamaya uygun virüs emdirilebilir veya verilen boyuttaki bir laktoz parçacigi gibi bir parçacik üzerinde emilebilir.

Solunabilir aerosollerin hazirlanmasi için kullanilabilen itici gazlar teknikte bilinmektedir. Uygun itici gazlar, n- propan, n- bütan veya izobutan gibi hidrokarbonlar ve metan, etan, propan, bütan, siklopropan veya siklobütanin klorlu ve / veya florlanmis türevleri gibi halohidrokarbonlar arasindan seçilir. Yukarida bahsedilen itici gazlar kendi basina veya bunlarin karisimlari içinde kullanilabilir. halojenlenmis alkan türevleridir. Yukarida belirtilen halojenli hidrokarbonlarin heptafluoropropan) ve bunlarin karisimlari uygundur.

Itici gaz içeren solunabilir aerosoller ayrica yardimci çözücüler, dengeleyiciler, yüzey aktif maddeler (sürfaktanlar), antioksidanlar, kayganlastiricilar ve pH ayarlama vasitalari gibi diger katki maddelerini de içerebilir. Bütün bu malzemeler teknikte bilinmektedir.

Bulusa göre itici gaz içeren solunabilir aerosoller agirlikça % 5'e kadar aktif madde içerebilir. Bulusa uygun aerosoller, etken maddenin örnegin agirlikça % 0.002 ila 5, 2 veya agirlikça % 0. 5 ila 1 'ini içerir.

Alternatif olarak, akcigere yapilan topikal uygulamalar, bir sivi solüsyon veya süspansiyon formülasyonunun örnegin, bir nebülizör gibi bir cihaz, mesela bir kompresöre bagli bir nebülizör kullanilarak uygulanmasi ile olabilir (örn. , Pari Respiratory Equipment, lnc. , Richmond, VA tarafindan imal edilen bir Pari Master (R) kompresörüne bagli Pari LC- Jet PIus(R) nebülizör).

Bulusa ait virüs bir çözücü içinde, örnegin bir solüsyon veya bir süspansiyon halinde, örnegin parenteral formülasyonlar için yukarida halihazirda tarif edildigi gibi, dagitilmis olarak verilebilir. Bu, uygun bir fizyolojik çözelti içinde, örnegin salin veya farmakolojik olarak kabul edilebilir baska bir çözücü veya tamponlanmis bir çözelti içerisinde süspansiyon haline getirilebilir. Teknikte bilinen tamponlanmis çözelti, içerebilir.

Terapötik süspansiyonlar veya çözelti formülasyonlari ayrica bir veya daha fazla yardimci madde (eksipiyan) içerebilir. Yardimci maddeler teknikte iyi bilinmektedir ve tampon maddeleri (örnegin, sitrat tamponu, fosfat tamponu, asetat tamponu ve bikarbonat tamponu), amino asitler, üre, alkoller, askorbik asit, fosfolipidler, proteinler (örn. , serum albümini), EDTA, sodyum klorür, Iipozomlar, manitol, sorbitol ve gliserol içerir. Çözeltiler veya süspansiyonlar, Iipozomlar veya biyolojik olarak parçalanabilir mikroküreler içine kapsüllenebilir. Formülasyon genellikle steril imalat prosesleri kullanilarak büyük ölçüde steril bir formda temin edilecektir.

Bu, formülasyon için kullanilan tampon çözücü / solüsyonun filtrasyonu, steril tamponlanmis çözücü solüsyonunda antikorun aseptik süspansiyonu ve sanayide siradan tecrübeye sahip kisilerce bilinen yöntemlerle formülasyonun steril kaplara dagitilmasi yoluyla imalat ve sterilizasyon içerebilir.

Mevcut açiklamaya uygun nebülize edilebilir formülasyon, örnegin, folyo zarflarla paketlenmis tekli doz üniteleri (örn. sizdirmaz plastik kaplar veya tüpler) olarak saglanabilir. Her tüp, bir hacim, örnegin 2 mL, çözücü / solüsyon tamponunda bir birim doz içerir.

Tedavi Mevcut bulus, bir baska açidan, tedavide, bilhassa kanser tedavisinde kullanilmak üzere burada tarif edilen bir virüsü veya bunun birformülasyonunu da kapsar.

Bir düzenlemede tedavi yöntemi, bir tümörün tedavisinde kullanilmak içindir.

Burada kullanilan haliyle tümör, neoplazm olarak da adlandirilan, kontrolsüz ve ilerleyici asiri hücre bölünmesinden kaynaklanan anormal bir doku kütlesine atifta bulunmayi hedeflemektedir. Tümörler iyi huylu (kanserli degil) veya kötü huylu olabilir. Tümör, kanser ve metastazlarin her biçimini kapsar.

Bir düzenlemede, tümör kati bir tümördür. Kati tümör, lokalize veya metastatik olabilir.

Bir düzenlemede, tümör epitel kaynaklidir.

Bir düzenlemede tümör, kolorektal kanser, hepatom, prostat kanseri, pankreas kanseri, meme kanseri, yumurtalik kanseri, tiroid kanseri, böbrek kanseri, mesane kanseri, bas- boyun kanseri veya akciger kanseri gibi bir malignansidir.

Bir düzenlemede tümör, bir kolorektal malignansidir.

Burada kullanilan malignansi, kanserli hücreler anlamina gelir.

Bir düzenlemede, onkolitik adenovirüs metastazin tedavisinde veya önlenmesinde kullanilir.

Bir düzenlemede buradaki yöntem veya formülasyon, ilaca dirençli kanserlerin tedavisinde kullanilir.

Bir düzenlemede virüs, bir baska kanser tedavisi veya terapisinin uygulanmasi ile Bir düzenlemede, kanseri, örnegin yukarida tarif edilen bir kanseri tedavi etmek için bir ilacin üretiminde kullanilmak üzere mevcut açiklamaya uygun bir virüs veya formülasyon saglanmistir.

Bir baska yönüyle, mevcut açiklamaya uygun bir virüsün veya formülasyonun terapötik olarak etkili bir miktarinin ihtiyaci olan bir hastaya, örnegin bir insan hastaya uygulanmasini içeren bir kanser tedavisi yöntemi sunulmaktadir.

Bir düzenlemede, buradaki onkolitik virüs veya formülasyon baska bir terapi ile Burada kullanildigi sekliyle "kombinasyon" terimi, onkolitik virüsün kanser tedavisi veya terapisinin öncesinde, es zamanli olarak ve / veya sonrasinda uygulandigi yerleri kapsamayi hedefler.

Kanser terapisi, cerrahi, radyasyon terapisi, hedeflenmis terapi ve / veya kemoterapiyi içerir. Burada kullanilan haliyle, kanser tedavisi terapötik bir bilesik veya biyolojik ajanin, örnegin kanseri tedavi etmeyi ve / veya bunun idame terapisini sürdürmeyi amaçlayan bir antikor ile tedaviyi ifade eder.

Bir düzenlemede, kanser tedavisi, bir kemoterapötik ajan, hedeflenen bir anti kanser ajani, radyoterapi, radyo- izotop terapisi veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu dahil olmak üzere herhangi bir baska anti- kanser tedavisinden seçilir.

Bir düzenlemede, mevcut açiklamanin virüsü mesela bir onkolitik virüs, tümörün küçültülmesi, metastazin tedavi edilmesi ve / veya metastazin veya daha ileri metastazin önlenmesi için ameliyat (neoadjuvan terapi) gibi terapi açisindan ön tedavi olarak kullanilabilir. Onkolitik adenovirüs, örnegin ameliyat (adjuvan terapisi) gibi bir terapiden sonra metastazi tedavi etmek ve / veya metastazi veya daha ileri metastazi önlemek için kullanilabilir.

Burada kullanilan haliyle es zamanli olma, ek kanser tedavisinin onkolitik adenovirüs formülasyonu ile ayni zamanda veya yaklasik olarak ayni zamanda uygulanmasidir.

Tedavi, ayni formülasyon içerisinde bulunabilir veya ayri bir formülasyon halinde uygulanabilir.

Bir düzenlemede, virüs, bir kemoterapötik ajanin uygulanmasiyla kombinasyon halinde uygulanir.

Burada kullanilan haliyle kemoterapötik ajan, habis hücreler ve dokular için seçimli olarak tahrip edici olan spesifik antineoplastik kimyasal ajanlari veya ilaçlari ifade etmeyi amaçlamaktadir. Örnegin, alkilleyici ajanlar, antimetabolitler, antrasiklinler, bitki alkaloidleri, topoizomeraz inhibitörleri ve diger antitümör ajanlar. Kemoterapinin diger örnekleri arasinda doksorubisin, 5- fluorourasil (5- FU), paklitaksel, kapesitabin, irinotekan ve örnegin, cisplatin ve oksaliplatin gibi platinler bulunur. Tercih edilen doz, tedavi edilen kanserin niteligine göre uygulayici kisi tarafindan seçilebilir.

Bir düzenlemede, terapötik madde, bagisiklik tepkilerinin ve / veya tümör vaskülarizasyonunun kontrol edilmesine yardimci olabilen gansiklovirdir.

Bir düzenlemede, buradaki yöntemde kullanilan bir veya daha fazla terapi metronomiktir, yani düsük doz anti kanser ilaçlari ile kesintisiz veya devamli tedavidir, genellikle diger tedavi yöntemleriyle birlikte verilir.

Alt grup B onkolitik adenovirüsler, özellikle Ad11 ve EnAd gibi bunlardan türetilenler özellikle kemoterapötiklerle sinerjik olabilirler, çünkü bunlarin çogunlukla apoptozdan bagimsiz bir etki mekanizmasina sahip olduklari ve agirlikli olarak nekrolitik bir mekanizma ile kanser hücrelerini öldürdügü görülmektedir. Dahasi, kemoterapi sirasinda ortaya çikan bagisiklik bastirma, onkolitik virüsün daha büyük bir etki ile çalismasina izin verebilir.

Burada kullanilan haliyle terapötik doz, uygun bir tedavi rejiminde kullanildiginda amaçlanan terapötik etkiyi saglamak için uygun, örnegin hastaligin semptomlarini veya durumlarini iyilestiren onkolitik adenovirüs gibi virüs miktarini belirtir. Bir doz, viral parçaciklarin sayisi asagidaki sonuçlara yani, tümör veya metastatik büyümenin yavaslatilmasi veya durdurulmasi ya da tümör veya metastaz boyutunda küçülmenin bulunmasina ve / veya hastanin ömrü uzatilmasina neden oldugunda, kanser veya metastazlarin tedavisinde terapötik bir doz olarak düsünülebilir. Uygun terapötik dozlar genellikle terapötik etki ve tolere edilebilir toksisite arasinda örnegin yan etki ve toksisitenin, terapi ile elde edilen fayda göz önüne alindiginda tolere edilebildigi durumda bir dengedir.

Bir düzenlemede, mevcut açiklamaya uygun bir virüs veya terapötik yapi (bunu içeren bir formülasyon da dahil olmak üzere) haftalik olarak uygulanir, örnegin bir hafta 1, doz 1, 3, 5. günlerde, bunu takiben her bir haftada bir kez uygulanir.

Bir düzenlemede, mevcut açiklamaya uygun bir virüs veya terapötik yapi (bunu içeren bir formülasyon da dahil olmak üzere) iki veya üç haftalik olarak uygulanir, örnegin 1. haftada 1, 3 ve 5. günlerde uygulanir ve 2 ve 3. hafta da bunun 1, 3 ve 5. günlerinde uygulanir. Bu doz rejimi, uygun oldugu sürece çok kez tekrarlanabilir.

Bir düzenlemede, mevcut açiklamaya uygun bir virüs veya terapötik yapi (bunu içeren birformülasyon da dahil olmak üzere) ayda bir uygulanir.

Bir düzenlemede, mevcut açiklamaya ait virüsler ve yapilar rekombinant tekniklerle hazirlanir. Teknikte uzman kisiler, temin edilmis adenovirüs genomunun, genomun tamamen veya tüm genomun bir bölümünü içeren bir plasmidin sentezlenmesi de dahil olmak üzere, diger teknik vasitalarla üretilebilecegini takdir edeceklerdir. Uzman kisiler, genomun sentezlenmesi durumunda ekleme bölgesinin, sonraki, klonlama yöntemleri kullanilarak genlerin sokulmasini takip eden artefaktlar oldugu için kisitlama bölgesi nükleotidlerini içermeyebilecegini takdir edecektir.

Bir düzenlemede, temin edilmis adenovirüs genomu örnegin, SEK ID NO: 63'e göre tamamen sentetik olarak üretilir.

Buradaki açiklama ayrica, bir transgen veya transgen kasetinin sokulmasiyla elde edilen veya elde edilebilen bir formül (I) adenovirüsünü veya bir alt formülünü de Burada kullanildigi anlamiyla "var" anlamina gelir.

Bu sartnamenin içeriginde "içeren", "dahil" olarak da yorumlanacaktir.

Bulusun belirli özellikleri / unsurlari içeren düzenlemelerinin, ilgili elemanlarin / özelliklerden "olusan" veya "esasen olusan" alternatif düzenlemeleri kapsamasi da hedeflenmektedir.

Teknik açidan uygun oldugunda, bulusun düzenlemeleri birlestirilebilir.

Burada spesifik ve açikça belirtilen tüm düzenlemeler, tek basina veya bir veya daha fazla baska düzenlemede kombinasyon halinde bir feragatnamenin temelini olusturabilir.

Mevcut bulus ayrica, ekteki sekillere atifta bulunan asagidaki örneklerde sadece örnekleme yoluyla açiklanmaktadir; bu sekillerde SEKILLERIN AÇIKLAMASI NG- 135 virüs genomuyla transfeksiyon sonrasi HEK293 hücrelerinde NG- 135 virüs parçaciklarinin transfeksiyonunu ve amplifikasyonunu gösterir. HEK293 hücreleri, saflastirilmis NG- gözlemlenerek virüs üretimi açisindan izlendi. Mikroskopik görüntüler (A- E), hücre tek katmaninda plak olusumu ile karakterize edilen CPE'yi gösterir, transfeksiyondan 144 saat sonra görülebildi; virüs, enfeksiyondan 216 saat sonra hasat edildi (E).

Hasat edilen virüs, HEK293 hücrelerinde çogaltildi, 72 saat sonra CPE gözlendiginde (F- G) hasat edildi ve ikinci kez çogaltildi, 48 saat sonra CPE gözlendiginde hasat NG- 74 virüs genomuyla transfeksiyon sonrasi HEK293 hücrelerinde NG- 74 virüs parçaciklarinin transfeksiyonunu ve amplifikasyonunu gösterir. HEK293 hücreleri, saflastirilmis NG- 74 genomik DNA'si ile transfekte edildi ve sitopatik etki (CPE) gözlemlenerek virüs üretimi açisindan izlendi. Mikroskopik görüntüler (A- J), hücre tek katmaninda plak olusumu ile karakterize edilen CPE'yi gösterir, transfeksiyondan 336 saat sonra görülebildi; virüs, enfeksiyondan 384 saat sonra hasat edildi (J).

Hasat edilen virüs, HEK293 hücrelerinde (K- R) çogaltildi, 240 saat sonra CPE gözlendiginde hasat edildi (R) ve daha sonra ikinciye (S- V), üçüncüye (W- X), dördüncüye (Y- Z) ve besinciye (@) çogaltildi, büyük oranda CPE gözlendiginde hasat edildi.

NG- 73 virüs genomuyla transfeksiyon sonrasi HEK293 hücrelerinde NG- 73 virüs parçaciklarinin transfeksiyonunu ve amplifikasyonunu gösterir. HEK293 hücreleri, saflastirilmis NG- 73 genomik DNA'si ile transfekte edildi ve sitopatik etki (CPE) gözlemlenerek virüs üretimi açisindan izlendi. Mikroskopik görüntüler (A- G), hücre tek katmaninda plak olusumu ile karakterize edilen CPE'yi gösterir, transfeksiyondan 144 saat sonra görülebildi; virüs, enfeksiyondan 192 saat sonra hasat edildi. Hasat edilen virüs, HEK293 hücrelerinde (H) çogaltildi ve daha sonra ikinci bir (IL) ve üçüncü kez (M) çogaltildi, önemli oranda CPE gözlendiginde hasat edildi.

NG- 135 ile enfekte edilmis HEK293 hücrelerinden salgilanan Anti- VEGF antikorunun ELlSA bulgulamasini gösterir. HEK293 hücreleri, ya bir kontrol virüsü, NG- 47 ya da anti- VEGF antikoru eksprese eden virüs, NG- 135 ile 72 saat süreyle in vitro enfekte edildi. Kültür süpernatantlanndaki insan lgG1 anti- VEGF antikor seviyeleri, insan VEGF kapli plakalar ve bir anti- insan lgG- Fc algilama antikoru (A) kullanilarak ELISA ile ölçüldü. Antikor seviyeleri, saflastirilmis insan anti- VEGF antikoru bevacizumab'in (B) standart bir egrisi kullanilarak nicellestirildi.

NG- 135 ile enfekte edilmis HEK293 hücrelerinden salgilanan Anti- VEGF antikorunun ELISA bulgulamasini gösterir. HEK293 hücreleri, anti- VEGF antikoru eksprese eden virüs, NG- 135 ile 24 saat boyunca in vitro olarak enfekte edildi. Kültür süpernatanlarindaki insan IgG1 anti- VEGF antikoru, bir anti- insan IgG tespit antikoru ile western blotlama yoluyla degerlendirildi. saflastirilmis insan anti- VEGF antikoru, bevacizumab, standart egrisini gösterir.

Saflastirilmis insan anti- VEGF antikoru, bevacizumab, seri olarak seyreltildi ve insan VEGF kapli plakalar kullanilarak ELISA ile nicellestirildi. Bu, ELlSA'da kullanilacak bir bevacizumab standart egrisinin üretimi için gerekli konsantrasyonlari belirledi.

NG- 76 ile enfekte edilmis HEK293 hücrelerinden salgilanan anti- VEGF antikorunun western blot bulgulamasini gösterir. HEK293 hücrelerine NG- 76 virüsü ile enfekte edilmis, 24 ya da 44 saat boyunca kültürlenmis ve daha sonra kodlanmis ScFv ürününün saptanmasi için bir anti- His etiketli antikor kullanilarak Western- blot ile anti- VEGF ScFv ekspresyonu bakimindan degerlendirilmistir.

NG- 76 veya NG- 78 ile enfekte olmus kolon karsinom hücrelerinden salgilanan anti- VEGF ScFv'nin western blot bulgulamasini gösterir. HT- 29 kolon karsinoma saat süreyle kültürlenmis daha sonra kodlanmis ScFv ürününün (A) saptanmasi Için bir anti- His etiketli antikor kullanilarak Western- blot ile anti- VEGF ScFv ekspresyonu bakimindan degerlendirilmistir.

HT- 29 hücrelerinde enfeksiyondan 48 saat sonra NG- 76 virüs replikasyonunu gösterir. HT- 29 kolon karsinom hücreleri, hücre basina (ppc) 10 veya 1 NG- 76 virüs parçacigi ile enfekte edildi, 48 saat süreyle kültürlendi ve daha sonra qPCR ile virüs genomu ekspresyonu için degerlendirildi. anti- VEGF antikoru transgen kasetlerinin yapisini özetleyen sematik çizgileri göstermektedir. Tam (agir ve hafif zincirler) sekanslar veya anti- VEGF antikorlarinin ScFv versiyonlari, virüs L5 (Fiber) geninin akis asagisinda yer alan Sbf ve ng kisitlama bölgeleri arasindaki EnAd2. 4 genomuna yerlestirildi.

NG- 135 virüs replikasyonunu ve gen ekspresyonunun, kolon karsinoma hücre dizilerinde EnAd ile karsilastirilabilir oldugunu gösterir. HT- 29 ve DLD insan kolorektal karsinoma hücre hatlari, in vitro olarak ya EnAd ya da NG- 135 ile enfekte edildi ve 3 gün boyunca kültürlendi. Virüs replikasyonu (qPCR kullanilarak viral DNA ölçümü ile ölçülmüstür) ve virüs geni (hekzon) ekspresyonu (RTqPCR kullanilarak viral RNA ölçümü ile ölçülmüstür) degerlendirildi. Benzer veriler, her iki virüsle (A & NG- 135 ile enfekte olmus kolon karsinoma hücre hatlarinda saptanabilir anti- VEGF antikor geni ekspresyonunu göstermektedir. HT- 29 ve DLD insan kolorektal karsinoma hücre hatlari in vitro olarak ya EnAd ya da NG- 135 ile enfekte edilmis, 3 gün süreyle kültürlenmis ve daha sonra hücrelerden RNA'nin RTqPCR'si ile anti- VEGF antikorunun ekspresyonu açisindan degerlendirilmistir. anti- VEGF antikorunun, NG- 135 ile enfekte olmus kolon karsinoma hücre çizgilerinin süpernatanlarinda mevcut oldugunu ve hVEGF- 165'e baglanabildigini gösterir. HT- 29, DLD ve HCT- 116 insan kolorektal karsinoma hücre hatlari, in vitro olarak ya EnAd ya da NG- 135 ile enfekte edildi ve 3 gün boyunca kültürlendi. Kültür süpernatantlarindaki insan IgG1 anti- VEGF antikor seviyeleri, insan VEGF kapli plakalar ve bir anti- insan IgG- Fc algilama antikoru (A) kullanilarak ELISA ile ölçüldü.

Antikor seviyeleri, saflastirilmis insan anti- VEGF antikoru bevacizumab'in (B) standart bir egrisi kullanilarak nicellestirildi. anti- VEGF ScFv'nin. NG- 76 ile enfekte olmus kolon karsinoma hücre hatlarinin süpernatanlarinda mevcut oldugunu ve hVEGF- 165'e baglanabildigini gösterir. HT- 29 kolon karsinoma hücreleri, EnAd, NG- 76 ya da NG- 78 virüsleriyle enfekte edilmis, 22, 46 ya da 70 saat süreyle kültürlenmis daha sonra kodlanmis ScFv ürününün (A) saptanmasi için bir anti- His etiketli antikor kullanilarak Western- blot ile anti- VEGF ScFv ekspresyonu bakimindan degerlendirilmistir. Insan embriyonik böbrek hücrelerinde ScFv ekspresyonu, VEGF baglayici ELISA ile degerlendirildi.

VEGF için ifade edilen ScFv'nin özgüllügü, saflastirilmis insan anti- VEGF antikoru bevacizumab'in ELISA'da (B) düsük bir konsantrasyonda dahil edilmesiyle VEGF baglanmasinin inhibisyonu ile teyit edildi.

NG- 135 virüs replikasyonu, DLD hücreleri ile implante edilen subkütan bir ksenograft modelinde EnAd ile karsilastirilabilir. DLD insan kolon karsinom hücreleri, CD1 nu / nu farelerinde subkütan bir ksenograft olarak implante edildi ve olusturulan tümörlere 5x109 EnAd veya NG- 135 virüs parçaciklari enjekte edildi. Tümörlerde virüs replikasyonu qPCR ile 3, 7. günlerde (A, n = 4 / zaman noktasi basina) veya enfeksiyondan sonra 28. günde (B, n = 10) degerlendirildi. anti- VEGF antikor geni ekspresyonunun NG- 135 ile tedavi edilen subkütan DLD tümör modelinde tespit edildigini gösterir. DLD insan kolon karsinom hücreleri, CD1 nu / nu farelerinde subkütan bir ksenograft olarak implante edildi ve olusturulan tümörlere 5x109 EnAd veya NG- 135 virüs parçaciklari enjekte edildi. Tedavi sonrasi 3. ve 7. günlerde, virüs hekzon geni (A) ve kodlanmis anti- VEGF antikor agir zincir geni ekspresyonu (B) (mRNA), tümör dokusu RNA'nin RTqPCR'si ile degerlendirildi.

Anti- VEGF antikorunun, NG- 135 ile tedavi edilen subkütan DLD tümör modelinde eksprese edildigini gösterir. DLD insan kolon karsinom hücreleri, CD1 nu / nu farelerinde subkütan bir ksenograft olarak implante edildi ve olusturulan tümörlere 5x109 EnAd (n=4) veya NG- 135 (n=8) virüs parçaciklari enjekte edildi. Tümörler, enfeksiyondan 28 gün sonra kesilip çikartildi, homojen hale getirildi ve çözülebilir özütler, toplam insan IgG1 içerigi (A) ve anti- VEGF antikoru (B) ELISA ile degerlendirildi. EnAd tümörlerinin birinden alinan özütler, her ELlSA'da pozitif bir kontrol olarak 8ng / ml insan anti- VEGF antikoru (bevacizumab) ile aniden yükseltildi.

Subkütan bir ksenograft modelinin NG- 135 enfeksiyonu, HCT- 116 tümörlerinde anti- VEGF antikor ekspresyonunu ve virüs replikasyonunu gösterir. HCT- 116 insan kolon karsinom hücreleri, CD1 nu / nu farelerinde subkütan bir ksenograft olarak implante edildi ve olusturulan tümörlere 5x109 EnAd veya NG- 135 virüs parçaciklari enjekte edildi. Tümörler 3, 7 ve 14. günlerde (n = 5 zaman noktasi basina) kesilip çikartildi.

Virüs replikasyonu qPCR (A) ile degerlendirildi ve anti- VEGF antikorunun (insan anti- VEGF antikoru, bir ksenograft tümör modelinde NG- 135 tedavisinden 28 gün sonra çevresel dolasimda tespit edilebilir. DLD insan kolon karsinom hücreleri, CD1 nu / nu farelerinde subkütan bir ksenograft olarak implante edildi ve olusturulan tümörlere 5x109 EnAd veya NG- 135 virüs parçaciklari enjekte edildi. Tümör tasiyan farelerin çevresel dolasimindaki anti- VEGF antikor seviyeleri, insan IgG1 ELISA tahlilleri ile degerlendirildi. 450 nm'deki arka plandan çikarilan emilim (A) 'da gösterilmektedir ve anti- VEGF antikorunun konsantrasyonu saflastirilmis insan anti- VEGF antikoru bevacizumab'in (B) bir standart egrisi kullanilarak nicellestirilmistir. transgen kasetinde mevcut olabilecek örnek elemanlarin sematik görünüsüdür. transgen kasetlerinde kodlanmis örnek elemanlarin sematik görünüsüdür. haberci genleri kodlayan transgen kasetlerinin sematiklerini göstermektedir. sitokinleri kodlayan transgen kasetlerinin sematiklerini göstermektedir. antikorlari veya antikor alanlarini kodlayan transgen kasetlerinin sematiklerini göstermektedir.

NG- 47 ve NG- 61 virüsleri ile enfekte edilmis kolon karsinoma hücre hatlarindaki virüs replikasyonunu ve islevsel haberci protein ekspresyonunu gösterir. HT- 29 insan kolorektal karsinoma hücre hatlari, sirasiyla haberci proteinler GFP'yi veya 96 saat süresince enfekte edilmistir. Virüs replikasyonu, her zaman noktasinda qPCR ile degerlendirildi ve EnAd (A- B) ile mukayese edildi. GFP ekspresyonu, hücre lizatlarindaki saptanabilir floresan düzeyine göre degerlendirildi (C).

NG- 47 ve NG- 61 virüsünün onkolitik potensinin EnAd ile karsilastirilabilir oldugunu gösterir. HT- 29 insan kolorektal karsinoma hücre çizgileri EnAd, NG- 47 veya NG- 61 virüs parçaciklari ile enfekte edildi. Enfekte edildikten 72 saat sonra hücre yasayabilirligi nicellestirildi ve %'ce hücre sagkalimi (A- B) çizildi. Hem NG- 47 hem de NG- 61 virüsü potansi, HT29 hücre hatlarinda (A- B) ve HT29, WI38 ve MRC5 hücre hatlarinda (C) EnAd'e esdegerdir. haberci genlerini eksprese eden bir EnAd virüsleri panelinde, virüs replikasyonunu ve transgen ekspresyonunu gösterir. HT- 29 insan kolorektal karsinom hücre çizgileri, EnAd veya bir dissal promotör, CMV, endojen büyük geç promotörü (MLP) veya endojen E4 promotörü altinda GFP eksprese eden bir virüs paneli ile enfekte edildi. 24, 48, 72 veya 96 saat sonra virüs replikasyonu qPCR ile degerlendirildi (A) ve GPF ekspresyonu, bir plaka okuyucuda flüoresans algilamasi ile nicellestirildi (B).

NG- 135 ile enfekte olmus kolon ve akciger karsinoma hücre çizgilerinde anti- VEGF antikor üretimini gösterir. HT- 29 insan kolorektal karsinomu veya A549 akciger karsinom hücre hatlari, 24, 48 veya 72 saat boyunca NG- 135 virüs partikülleri ile enfekte edildi. Her zaman noktasinda, hücresel süpernatanin antikor üretimi, IgGl ELISA ile 5 dakika, 1 saat veya 3 saat boyunca degerlendirildi (HT- 29 verileri A'da, üretilen lgG1 miktarinin hesaplanmasi tablo (C)'de gösterilmektedir.

NG- 139 virüsü üretimi ve virüs NG- 139 ile enfekte edilmis kolon karsinoma hücre dizilerinde TNFa'nin ekspresyonunu göstermektedir. Virüs üretimi, CPE'nin görsellestirilmesi ve virüs kapsid proteini Hexon'in Imünohistokimyasal (IHC) (A- B) ile üretilmesi için boyama ile degerlendirilmesinden önce, HT- 29 hücreleri 36 saat boyunca NG- 139 virüsü ile enfekte edilmistir. NG- 139 ile enfekte edilmis hücre süpernatantinda TNFd üretimi, ELISA ile degerlendirildi ve (C)'de gösterilen tabloda nicellestirildi. DLD insan kolon karsinom hücreleri, CD1 nu / nu farelerinde subkütan bir ksenograft olarak implante edildi ve olusturulan tümörler 3 defa 5x109 EnAd veya NG- 135 virüs parçaciklari tedavi edildi. Tedaviden 15 gün sonra tümörlerdeki TNF seviyeleri ELISA ile degerlendirildi (D).

Adenovirüslerin genom mimarisinin bir haritasini gösterir.

DLD hücreleri ile implante edilen subkütan bir ksenograft modelinde tedavi sonrasi 3. gün ve 7. günde NG- 61 virüs replikasyonunu göstermektedir.

DLD hücreleri ile implante edilen subkütan bir ksenograft modelinde tedavi sonrasi 7. günde tümörlerdeki Iüsiferaz transgen ekspresyonunu göstermektedir. kolon, akciger ve yumurtalik karsinoma hücre hatlarindaki NG- 135 virüs replikasyonunu ve anti- VEGF antikoru ekspresyonunu gösterir. HT- 29, HCT- 116, DLD (kolon), SKOV (yumurtalik) veya A549 (akciger) karsinoma hücre hatlari, 24- 120 saat boyunca NG- 135 veya EnAd virüs partikülleri ile enfekte edilmistir. Virüs replikasyonu, her 24 saatte bir qPCR ile degerlendirildi ve zaman periyodu boyunca maksimum replikasyon (A)'da çizildi. Anti- VEGF antikoru üretimi de her 24 saatte bir toplam antikor, (B)'de gösterildi. bir tümör ile baglantili antijen, antikorlar veya antikor alanlarini kodlayan transgen kasetlerinin sematiklerini göstermektedir. tümörlerinin ex vivo kültür eksplantlarinda NG- 135 virüs replikasyonunu ve anti- VEGF antikor ekspresyonunu gösterir. HCT- 116 insan kolon karsinom hücreleri, CD1 nu/nu farelerinde subkütan bir ksenograft olarak implante edildi ve olusturulan tümörlere 5x109 NG- 135 virüs parçaciklari enjekte edildi. 10 gün sonra tümörler kesilerek çikartildi ve ex vivo kültürden 7 gün önce veya sonra virüs genomu (A) ve anti- VEGF antikoru (B) seviyeleri için test edildi. Sera'da anti- VEGF antikor seviyeleri. farelerdeki bir in vivo A549 hücre akciger tümörü modelinde, NG- 135 virüs replikasyonunu ve tümör dokulari üzerindeki etkiyi göstermektedir. Akcigerlerde nodüler tümörler olusturmak için insan A549 hücreleri intravenöz olarak SClD farelerine enjekte edildi. 8 haftada, tümörler olusturuldugunda, EnAd veya NG- 135 virüsleri (5e9 parçacik) intravenöz olarak enjekte edildi ve tümör üzerindeki etkiler, farkli zaman noktalarinda izlendi. Dozaj rejimi (A)'da gösterilmistir. Akcigerlerde (insan geni PTGER2 için qPCR ile ölçüldügünde) NG- 135'in tümör yükü üzerindeki etkisi, doz uygulamasindan sonra 3. ve 25. günlerde farkli fareler için (B)'de gösterilmistir. (C), virüs genomlarinin (qPCR) tümör seviyeleri ile iliskili seviyelerini gösterir (insan PTGER2 qPCR). Görünür tümör nodüllerine ayrilmis akcigerler ve kalan akciger dokusu virüs genomu seviyeleri için de degerlendirildi (D). intraperitoneal enjeksiyon (5e6 hücre / fare) yoluyla CB17- SCID farelerine implante edilmis lusiferazi istikrarli bir sekilde eksprese eden insan SKOV- 3 yumurtalik karsinoma hücreleri kullanilarak, yumurtalik kanserinin mürin ortotopik ksenograft modelinde NG- 135 ve EnAd aktivitesini gösterir. Implantasyondan 22 gün sonra, fareler intraperitoneal enjeksiyon yoluyla verilen PBS (kontrol) veya 5e7 EnAd, NG- 135 veya NG- 78 virüs partikülleri ile tedavi edildi ve zamanla, tümör büyümesi lüsiferaz aktivitesi olarak izlendi. bir biyoreaktörde kültürlenen HEK293 hücrelerinden virüs materyalinin artan üretimini ve saflastirilmasini takiben, NG- 135 virüsünün karakterize edilmesini ve eksprese edilen anti- VEGF antikorunu gösterir. NG- 135, potens (A) ve replikasyon (B) bakimindan bir EnAd virüs standardiyla mukayese edildi ve kültür süpernatantlarinda zamanla artan antikor seviyeleri (C) tespit edildi. Saflastirilmis antikorun Western blotu (D) ve Biacore (E) karakterizasyonu, ticari olarak üretilen anti- VEGF antikoru (Avastin) ile karsilastirilabilirlik göstermektedir. kendiliginden bölünebilir P2A peptit (NG- 165) ile baglanmis anti- VEGF antikor H & L Zincirlerini kodlayan EnAd virüslerinin üretimini ve karakterizasyonunu, EnAd ve NG- karsilastirmali veriler ile birlikte gösterir. endojen veya egzojen promotörlerin kontrolü altindaki anti- VEGF antikor ScFv'lerini kodlayan EnAd virüsleri NG- 76 ve NG- 78'in karakterizasyonunu gösterir. Her iki virüs de standart EnAd virüsüne (A & B) karsi benzer bir onkolitik potens göstermistir.

NG- 78 için, ScFv'nin hem supernatantta hem de hücre Iizati fraksiyonlarinda VEGF'ye dogrudan baglanma aktivitesi (C)'de gösterilmis ve ticari anti- VEGF antikoru (bevacizumab) ile VEGF baglanmasi için rekabet (D)' de gösterilmistir. virüs replikasyonu (A), hekzon mRNA (B) ve ScFv mRNA (C) ölçümleri ile tümör tasiyan farelerde EnAd'a karsi NG- 76 virüs aktivitesinin bir karsilastirmasini gösterir.

HT- 29 hücrelerinde NG- 135 ile hem antikor replikasyonunun hem de ekspresyonunun sürecini gösterir. Salgilanan antikor, test edilen tüm MOl'Ier için 72 saatte tespit edilebilir, ancak antikor ekspresyon seviyesi, MOI girdisine baglidir (A). 1 veya 10 virüs ppc ile enfeksiyonu takiben 24, 48 ve 72 saatte antikor üretimi ve replikasyonu (8- D) 'de gösterilmistir.

HT- 29 karsinomunda ve WI38 ve MRC5, stromal fibroblast hücrelerinde NG- 135 replikasyonunu (A), anti- VEGF antikorunu (B) ve bulasici virüs parçaciklarinin (C) üretimini gösterir.

(B)'de gösterilen bir egzojen (CMV) promotörün (NG- 47) ya da (D)'de gösterilen endojen MLP (NG- 107)'nin kontrolü altinda birincil insan dendritik hücrelerinde eksprese edilen bir eGFP haberci transgenin seçimli ekspresyonunu gösterir. EnAd'a maruz birakilan dendritik hücreler için eGFP haberci transgen ekspresyonu (A)'da gösterilmektedir ve enfekte edilmemis kontrol hücreleri için olansa (C)'de gösterilmistir. tümörlerde lüsiferaz transgen ekspresyonunu ve transgen ekspresyonu bir egzojen (CMV) promotörünün (NG- 61) veya endojen MLP promoterinin (NG- 63) kontrolünün altindayken, BALB / c farelerindeki transgen, virüs veya tümöre karsi fonksiyonel bagisiklik tepkisini gösterir. Immünolojik olarak bozulmamis BALB / c farelerinin bögründe yetistirilen CT- 26 tümörlerine, virüslerin her biri ile tümör içine enjekte edildi ve zamanla Iüminesans görüntüleme (A) ile lüsiferaz ifadesi izlendi ve lusiferaza (B), EnAd'ye (C) veya tümör (D) antijenlerine karsi T- hücresi tepkileri ELISPOT tahlili ile ölçüldü. antikorlari (NG- 190) ya da ScFv antikor varyantini (NG- 221) kodlayan virüslerin, standart bir karsilastirici olarak EnAd virüsü ile karsilastirmali olarak, bagisiklik kontrol noktasi inhibitörü yol proteini PD- L1'e karsi onkolitik potensini (A, B) ve replikasyonunu (C, D) gösterir.

NG190 ve NG- 221 ile enfekte HT- 29 hücrelerinin süpernatantlarinda anti- PD- L1 antikorunun veya ScFv üretiminin (A) ve PD- L1 Iigand baglama aktivitelerinin (B, C, D) karakterizasyonunu, özgüllük kontrolü olarak anti- VEGF lgG1 antikoru üreten NG- 165 için baglama ve lgG1 üretimi ile karsilastirmali olarak gösterir.

NG- 190 ile enfekte olmus A549 hücrelerinin süpernatantinda eksprese edilen anti- PD- L1 antikorunun fonksiyonel aktivitesinin, kültür süpernatanlarinda lL- 2 olarak ölçülen, karisik bir lenfosit reaksiyonunda T hücresi aktivasyonunun derecesi ile degerlendirildigini göstermektedir. Iki farkli donörün PBMC'lerinden farklilastirilmis dendritik hücreler, üçüncü bir donörden saflastirilmis CD4 T- hücrelerine sahip uyarici hücreler olarak kullanildi. NG- 190 süpernatantlari ile T hücresi tepkisinin güçlendirilmesi, saflastirilmis bir anti- PDL1 monoklonal antikoru ve NG- 165 kültürlerinden süpernatantlar ile karsilastirildi.

NG- 177 ile enfekte olmus 293 hücrenin süpernatantinda eksprese edilen anti- PD- L1 antikorunun fonksiyonel aktivitesini, antikor özgüllük kontrolü olarak NG- 135'Ie karsilastirmali olarak göstermektedir. Her iki virüs, 293 hücrede benzer lgG1 seviyeleri üretmistir (A). NG- 177 süpernatantlari, NG- ile kiyasla seçimli olarak PD- L1'in Iigand PD1'e baglanmasini engelledi ve bu ayni NG- 177 süpernatantlari, bir MLR tahlilinde pozitif kontrol (C) olarak saflastirilmis monoklonal anti- PD- L1 ile IL- 2 üretimini arttirabilmistir. saflastirilmis monoklonal anti- PD- L1 antikorunun ve NG- 135 üst fazlarinin baglanmasiyla karsilastirmali olarak, IFNg ile uyarilan A549 hücreleri üzerindeki NG- 177 süpernatantlarinin hücresel PD- L1 baglanma aktivitesinin FACS analizini göstermektedir. antikoru bagisiklik kontrol noktasi inhibitörü yol protein CTLA- 4'e (NG- 242) kodlayan EnAd virüsünün karakterizasyonunu gösterir. Virüs replikasyonu, EnAd kontrolü ile mukayese edildi (A). NG- 242 ile IgG1 üretimi, NG- 135 ile karsilastirildi (B). NG242 süpernatantlarindaki anti- CTLA4 antikorunun islevsel aktivitesi, NG- 165 kontrol süpernatantlari ile karsilastirmali olarak dogrudan ligand baglama (C) ve bunun yani sira ELlSA deneylerinde rekombinant CTLA4- Fc'nin kendi Iigandi B7- 1'e baglanmasinin engellenmesi (D) ile gösterildi. antijen TAA, NY- ESO- 1 (NG- 220) ile iliskili tümörü kodlayan virüslerin karakterizasyonunu gösterir. NG- için virüs replikasyonu EnAd kontrolü ile karsilastirildi. NY- ESO- 1, NG- 220 ile enfekte edilmis hücrelerin lizatinda western leke ile tespit edilebilmis, ancak EnAd kontrol hücrelerinde (C) tespit edilememistir. genomun (NG- 185) Bx ve By bölgelerinde eklenmis özgün kisitlama alanlarina sahip EnAd virüsünün karakterizasyonunu gösterir. Hücre canliligi analizi (A) ve virüs replikasyonu (B) ile karsilastirildiginda virüs onkolitik aktivitesi, EnAd kontrolüyle mukayese edildi. birden fazla ScFvs, shRNA veya sodyum iyodür simporatör proteinini kodlayan transgen kasetlerinin sematiklerini gösterir.

SEKANSLAR SEKID NO:1 BY bölgesine eklenen bir anti- VEGF tam uzunlukta antikoru kodlayan bir transgen kasetine sahip EnAd genomunu içeren NG- 77 virüs genom sekansi. Transgen kaseti, 5' dalli ek yeri alici sekansi (bSA), 5' öncüsüne sahip ab agir zincir sekansi, bir IRESi 'öncüsüne sahip bir ab hafif zincir sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva eder.

BY bölgesine eklenen bir anti- VEGF tam uzunlukta antikoru kodlayan bir transgen kasetine sahip EnAd genomunu içeren NG- 135 virüs genom sekansi. Transgen kaseti, 5' kisa ek yeri alici sekansi (SSA), 5' öncüsüne sahip ab agir zincir sekansi, bir IRES, ' öncüsüne sahip bir ab hafif zincir sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva eder.

BY bölgesine eklenen bir anti- VEGF tam uzunlukta antikoru kodlayan bir transgen kaseti içeren bir virüs genomu sekansi.

Transgen kaseti, bir SSA, 5' öncüsüne sahip ab agir zincir sekansi, bir SSA ve 5' öncüsüne sahip ab hafif zincir sekansi içerir.

BY bölgesine eklenen bir anti- VEGF tam uzunlukta antikoru kodlayan bir transgen kaseti içeren bir virüs genomu sekansi.

Transgen kaseti, bir SSA. 5' öncüsüne sahip ab agir zincir sekansi, bir SSA ve 5' öncüsüne sahip ab hafif zincir sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva eder.

Bv bölgesine eklenen bir anti- VEGF ScFv'yi kodlayan bir transgen kasedine sahip bir EnAd genomunu içeren NG- 74 virüs genom sekansi. Transgen kaseti, bir bSA, 5' öncüsüne sahip anti- VEGF ScFv sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva eder.

BY bölgesine eklenen, bir C- ucu Hisö etiketli bir anti- VEGF ScFv'yi kodlayan bir transgen kasedine sahip bir EnAd genomunu içeren NG- 78 virüs genom sekansi. Transgen kaseti, bir bSA, 5` öncüsüne sahip anti- VEGF ScFv sekansi ve 3' 6 x histidin sekansi ve poli (A) sekansi ihtiva eder.

BY bölgesine eklenen, bir C- ucu Hisö etiketli bir anti- VEGF ScFv'yi kodlayan bir transgen kasedine sahip bir EnAd genomunu içeren NG- 76 virüs genom sekansi. Transgen kaseti, bir CMV promotötü, 5' öncüsüne sahip anti- VEGF ScFv sekansi ve 3' 6 x histidin sekansi ve poli (A) sekansi ihtiva eder.

BY bölgesine eklenen bir anti- VEGF ScFv'yi kodlayan bir transgen kasedine sahip bir EnAd genomunu içeren NG- 73 virüs genom sekansi. Transgen kaseti, bir CMV promotötü, 5' öncüsüne sahip anti- VEGF ScFv sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva eder.

BY bölgesine eklenen bir anti- VEGF tam uzunlukta antikoru kodlayan bir transgen kasetine sahip EnAd genomunu içeren NG- 134 virüs genom sekansi. Transgen kaseti, bir CMV promotörü, 5' öncüsüne sahip ab agir zincir sekansi, bir lRES, 5 'öncüsüne sahip bir ab hafif zincir sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva eder. içeren Bx DNA sekansi. içeren BY DNA sekansi.

EnAd genomu.

CMV egzojen promotör.

PGK egzojen promotör.

CBA egzojen promotör.

Kisa ek yeri alicisi (SSA). Null sekans ek yeri alicisi (SA). dalli ek yeri alicisi (bSA).

Dahili Ribozom Giris sekansi (IRES). poliadenilasyon dizisi. Öncü sekans (HuVH). Öncü dizi (HGS).

Histidin etiketi.

V5 etiketi.

P2A peptidi.

F2A peptidi.

E2A peptidi.

T2A peptidi. anti- VEGF ab VH zinciri amino asit sekansi. anti- PD- L1 antikoru VH zinciri amino asit sekansi. anti- VEGF ab VL zinciri amino asit sekansi. anti- PD- L1 antikoru VL zinciri amino asit sekansi. insan lgGi sabit agir zincir amino asit sekansi. insan IgG1 modifiye edilmis sabit agir zincir amino asit sekansi. insan kappa sabit hafif zincir amino asit dizisi. anti- VEGF ScFv amino asit sekansi. anti- PD- L1 ScFv amino asit sekansi.

Yesil floresan protein amino asit sekansi.

Lusiferaz amino asit sekansi.

Insan Tümörü nekroz faktörü alfa (TNFa) amino asit sekansi.

Insan Interferon gama (lFNy) amino asit sekansi.

Insan Interferon alfa (IFNa) amino asit sekansi. insan kanseri /testis antijeni 1 (NY- ESO- 1) amino asit sekansi. insan MUC- 1 amino asit sekansi.

Bir Kozak sekansi. gccaccatg (Null sekans) BY bölgesine eklenen bir anti- PD- L1 tam uzunlukta antikoru kodlayan bir transgen kasetine sahip EnAd genomunu içeren NG- 177 virüs genom sekansi. Transgen kaseti, bir CMV promotörü, 5' öncüsüne sahip ab agir zincir sekansi, bir lRES, 5 'öncüsüne sahip bir ab hafif zincir sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva eder.

EnAd genomunun E28 bölgesine karsilik gelen DNA sekansi (bp 10355- 5068).

By bölgesine eklenen, bir C- ucu Hisö etiketli bir anti- VEGF ScFv'yi kodlayan bir transgen kasedine sahip bir EnAd genomunu içeren NG- 167 virüs genom sekansi. Transgen kaseti, bir 5' SSA, ' öncüsüne sahip anti- VEGF ScFv sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva eder.

BY bölgesine eklenen sitokini, IFNy'yi kodlayan bir transgen kasetini içeren NG- 95 virüs genom dizisi. Transgen kaseti, bir 5' CMV promotörü, lFNy CDNA sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva BY bölgesine eklenen sitokini, lFNa'yi kodlayan bir transgen kasetini içeren NG- 97 virüs genom dizisi. Transgen kaseti, bir 5' CMV promotörü, IFNa CDNA sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva By bölgesine eklenen sitokini, IFNy'yi kodlayan bir transgen kasetine sahip EnAd genomunu içeren NG- 92 virüs genom dizisi.

Transgen kaseti, bir 5' CMV promotörü, IFNy CDNA sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva eder.

BY bölgesine eklenen sitokini, lFNd'yi kodlayan bir transgen kasetine sahip EnAd genomunu içeren NG- 96 virüs genom dizisi.

Transgen kaseti, bir 5' bSA, IFNci CDNA sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva eder.

BY bölgesine eklenen sitokini, TNFoi'yi kodlayan bir transgen kasetine sahip EnAd genomunu içeren NG- 139 virüs genom dizisi.

Transgen kaseti, bir 5' SSA, TNFci CDNA sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva eder.

Kisitlama bölgesi eklentisi (BY).

Kisitlama bölgesi eklentisi (Bx).

BY bölgesine eklenen tümörle iliskili antijeni, NY- ESO- 1'i kodlayan bir transgen kasetine sahip EnAd genomunu içeren NG- 220 virüs genom dizisi. Transgen kaset, bir 5 'PGK promotörü, NY- ESO- 1 CDNA sekansi ve 3' poli (A) sekansi içerir.

BY bölgesine eklenen tümörle iliskili antijeni, NY- ESO- 1'i kodlayan bir transgen kasetine sahip EnAd genomunu içeren NG- 217 virüs genom dizisi. Transgen kaset, bir 5' CMV promotörü, NY- ESO- 1 cDNA sekansi ve 3' poli (A) sekansi içerir.

BY bölgesine eklenen bir anti- CTLA- 4 tam uzunlukta antikoru kodlayan bir transgen kasetine sahip EnAd genomunu içeren NG- 242 virüs genom sekansi. Transgen kaseti, bir SSA, 5' öncüsüne sahip ab agir zincir sekansi, bir IRES, 5' öncüsüne sahip bir ab hafif zincir sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva eder.

BY bölgesine eklenen bir anti- VEGF tam uzunlukta antikoru kodlayan bir transgen kasetine sahip EnAd genomunu içeren NG- 165 virüs genom sekansi. Transgen kaseti, bir SSA, 5' öncüsüne sahip ab agir zincir sekansi, bir P2A peptit sekansi, 5' öncüsüne sahip ab hafif zincir sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva eder.

BY bölgesine eklenen bir anti- PD- L1 tam uzunlukta antikoru kodlayan bir transgen kasetine sahip EnAd genomunu içeren NG- 190 virüs genom sekansi. Transgen kaseti, bir SSA, 5' öncüsüne sahip ab agir zincir sekansi, bir P2A peptit sekansi, 5' öncüsüne sahip ab hafif zincir sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva eder.

By bölgesine eklenen, bir C- ucu Hisö etiketli bir anti- PD- L1 ScFv'yi kodlayan bir transgen kasedine sahip bir EnAd genomunu içeren NG- 221 virüs genom sekansi. Transgen kaseti, bir 5' SSA, ' öncüsüne sahip anti- PD- L1 ScFv sekansi ve 3' 6 X histidin sekansi sonra poli (A) sekansi ihtiva eder.

BY bölgesine eklenen bir anti- VEGF tam uzunlukta antikoru kodlayan bir transgen kasetine sahip EnAd genomunu içeren NG- 258 virüs genom sekansi. Transgen kaseti, bir CMV promotörü, 5' öncüsüne sahip ab agir zincir sekansi, bir P2A peptit sekansi, 5' öncüsüne sahip ab hafif zincir sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva vae By bölgesine eklenen benzersiz kisitlama bölgeleri olan EnAd genomunu içeren NG- 185 virüs genom dizisi. bakteri kökenli bir replikasyon (p15A), bir antibiyotik direnç geni (KanR) ve BY bölgesinde eklenmis benzersiz kisitlama bölgelerine sahip EnAd genom sekansi içeren pNG- 33 (pColoAd2. 4) DNA plasmidi. bakteri kökenli bir replikasyon (p15A), bir antibiyotik direnç geni (KanR) ve vae Bybölgesinde eklenmis benzersiz kisitlama bölgelerine sahip EnAd genom sekansi içeren pNG- 185 (pColoAd2. 6) DNA plasmidi.

BY bölgesine eklenen GAPDH'ye bir shRNA'yi kodlayan bir transgen kasetini içeren NG- sh01 virüs genom sekansi. Transgen kaseti, bir U6 RNA pollll promotörü ve bir shRNA'yi kodlayan DNA Sodyum iyodür simportör (NlS) amino asit sekansi.

BY bölgesine eklenen sodyum iyodür simpotörünü (NlS) kodlayan bir transgen kaset içeren NG- 280 virüs genom dizisi. Transgen kaseti, bir 5' SSA, NIS CDNA sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva BY bölgesine eklenen bir anti- VEGF ScFv'yi ve bir anti- PD- L1 ScFv'yi kodlayan bir transgen kasetine sahip EnAd genomu içeren NG- 272 virüs genom dizisi. Transgen kaseti, bir SSA, 5' öncüsüne ve 3' 6 X his etiketine sahip anti- PD- L1 ScFv sekansi, P2A peptit dizisi, 5' öncüsüne ve 3' V5- etiketine sahip anti- VEGF ScFv sekansi ve 3' poli (A) sekansi ihtiva eder. anti- CTLA- 4 VH zincir amino asit sekansi. anti- CTLA- 4 VL zincir amino asit sekansi.

Bx bölgesine eklenen bir anti- VEGF ScFv'yi kodlayan bir transgen kasetine sahip EnAd genomu içeren NG- 257 virüs genom dizisi.

Transgen kaseti, bir bSA, 5' öncüsüne ve 3' 6 x his etiketine sahip anti- VEGF ScFv sekansi ve daha sonra 3' poli (A) sekansi ihtiva Bx bölgesine eklenen bir anti- VEGF ScFv'yi kodlayan bir transgen kasetine ve BY bölgesine eklenen bir anti- PD- L1 ScFv'yi kodlayan bir ikinci transgen kasetine sahip EnAd genomunu içeren NG- 281 virüs genom sekansi. Transgen kaseti, bir bSA, 5' öncüsüne ve 3' 6 x his etiketine sahip anti- VEGF ScFv sekansi ve daha sonra 3' poli (A) sekansi ihtiva eder.

Kisitlama bölgesi I- Cre1 enzimi tarafindan taninir ve kesilir.

Kisitlama bölgesi I- Ceul enzimi tarafindan taninir ve kesilir.

Kisitlama bölgesi I- Scel enzimi tarafindan taninir ve kesilir. primerleri gösterir. ÖRNEKLER Yapilarin isimlendirilmesinde bir önek olarak kullanilan ""p, yapinin bir plazmid oldugunu gösterir. Örnekler 1- 6 Virüsler, asagida tarif edilen yöntemler kullanilarak SEK ID NO: 2, 5, 6, 7 ve 8'de gösterilen sekanslarla hazirlanmistir.

Hücre kültürü 2mM Sodyum piruvat, 1mM zorunlu olmayan amino asitler (PAA: M11- 003) ve kalem / strep bulunan DMEM yüksek glikozda kültürlendi. Bu ortam, "AD293 ortami" transfeksiyonlar ve enfeksiyonlar için % 2 FBS ilave edilir. Transfeksiyondan 24 saat transfeksiyondaki yogunluk"% 75 birlesti.

Virüs Genom Transfeksiyonu DNA konsantrasyonu ölçüldü (Tablo 2) ve 7.0 ug veya daha sonra her biri 2 saat boyunca 37 derecede kisitlama enzimi Ascl ile dogrusallastirildi. Parçalanan DNA, 50 ul'lik nükleaz içermeyen su ile seyreltildi ve daha sonra fenol / kloroform ekstraksiyonu ile saflastirildi. Çikarilan DNA, daha sonra, 300 ul % 95'ten büyük moleküler biyoloji dereceli etanol ve 10 ul'lik 3M Sodyum Asetat içerisinde 16 saat, - °C'de çöktürüldü. Çökeltilmis DNA, 14000 rpm'de, 5 dakika santrifüjle pelet haline rpm'de, 5 dakika yikandi. Temiz DNA pelleti hava ile kurutuldu, 15 pl'lik lipofektamin transfeksiyon reaktifi içeren 500 ul OptiMEM içinde yeniden süspanse edildi ve oda sicakliginda 30 dakika inkübe edildi. Transfeksiyon karisimi daha sonra AD293 hücrelerini içeren T- 25 sisesine damla damla ilave edildi. 37 °C'de 2 saat süreyle transfeksiyon karisimi ile hücrelerinin inkübe edilmesinden sonra, % 5 COz 4 mI'Iik hücre ortami (% 2 FBS ile takviye edilmis glutaminli DMEM yüksek glikoz) hücrelere ilave edildi ve siseler 37 °C'de, % 5 002 inkübe edildi. Hücreler sitopatik etkinin (CPE) varligi bakimindan günlük olarak izlendi (Sekil 1A- E, Sekil 2A- J, Sekil 3A- G).

Büyük CPE gözlendiginde, virüs hasat edildi ve hasat zamani Tablo 2'ye kaydedildi.

Ortamdaki hücreler sisenin altindan pipetle alindi ve 15 ml'lik bir falcon tüpüne aktarildi. Hücreler, 5 dk boyunca, 1500 rpm'de santrifüjle pelet haline getirildi ve süpernatant toplandi ve saklandi ("4 ml). Hücre peleti, 1 ml'lik AD293 ortami içerisinde yeniden askiya alindi ve virüs, üç dondurma- çözme döngüsü kullanilarak hasat edildi. Bunun için hücre topaklari sivi azot içerisinde dondurulduktan sonra 1200 rpm`de 10 dakika süreyle santrifüje tabi tutulmadan ve virüs ihtiva eden süpernatanin toplanmasindan önce 37 °C'Iik bir su banyosu içinde eritildi. Hasat edilen virüsler, virüs stoklarini çogaltmak için AD293 hücrelerini tekrar enfekte etmek için kullanildi. Amplifikasyon esnasinda uygun virüs üretimi, hücre tek katmaninda belirgin CPE (Sekil 1F- G, Sekil 2K- R, Sekil 3H) gözlenmesi ile dogrulandi. CPE bir kez gözlendiginde, virüs 293 hücreden üç donma- çözülme döngüsü ile hasat edildi.

AD293 hücrelerindeki amplifikasyon, enfeksiyonun 48 saat içinde hücre tek katmanlarinda belirgin CPE üreten virüs stoklari üretilinceye kadar 5 kez tekrarlandi (Sekil 1H- I, Sekil 28- Z, Sekil 2@ Sekil 3l- M, Tablo 2).

Virüs Saflastirma Güçlü virüs stoklari bir kez büyütüldügünde, virüsler, NG- 135, NG- 73, NG- 74, NG- 76 ve NG- 78 virüs stoklari üretmek için çift sezyum klorür bantlamasi ile saflastirildi.

Bu stoklar, Abs 260/280 nm ölçülerek titrelenmistir. (titreler Tablo 2'de kaydedilmistir).

Virüs SEK ID [plazmid Önemli CPE Amplifikasyon CsCI Bantli virüs 135 No:2 Örnek 7 VEGF Baglayici ELISA: Tam uzunlukta antikorun, bir SSA- Bev- PA geni (NG- 135) içeren EnAd tarafindan enfekte edilmis ve enzime bagli immünosorbent analiz (ELlSA) ile degerlendirilen hücrelerden salgilanan Bevacizumab'in amino asit dizisi ile VEGF baglanma aktivitesi.

AD293 hücreleri, 3. 25e5 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda tohumlandi ve 20 saat boyunca büyümesine izin verildi. Hücreler ya SSA- Bev- PA transgen kasedi içeren EnAd ya da bir SSA- GFP- PA (NG- 107) transgen kasedi (Kontrol) içeren bir EnAd kontrol virüsü ile enfekte edildi. Enfeksiyondan44 saat sonra, enfekte olmus hücrelerden süpernatanlar toplandi ve santrifüjle berrak hale getirildi.

ELISA plakalari (A Nunc Immuno MaxiSorp 96 oyuklu bir mikroplaka), karbonat / bikarbonat tamponu içinde gece boyunca 4 °C'de insan VEGF- 165 (0. 5 ug/ml, R ve D Sistemleri, 293- VE- 050) ile kaplanarak hazirlandi. Plakalar, sonraki tüm baglanma adimlari arasinda PBS % 0.05 Tween 20 ile yikandi. Plakalar, PBS % 0.05 Tween 20 içinde % 3 BSA ile oda sicakliginda 1 saat bloke edildi. Berraklastirilan Bevacizumab numuneleri ayni zamanda kontrol enfeksiyon süpernatanlarina katildi.

Tüm numuneler, VEGF- 165 kapli plakalara ilave edildi ve 1 saat oda sicakliginda inkübe edildi. Daha sonra, HRP substrat çözeltisi 3. 3. 5. 5'- terametiletilendiamin (TMB, Thermo- Fisher) ile HRP saptama gerçeklestirilmeden önce, oda sicakliginda 1 saat boyunca saptama antikoru HRP'ye konjüge edilmis anti- insan- Fc (Abcam, ab97225) uygulandi. Reaksiyonu durdurmak için 1M HCI kullanildi ve gelisen renk 450 nm'de bir plaka okuyucu üzerinde ölçüldü. 450 nm'deki emilim, NGAd- 135 ile enfekte edilmis hücrelerin süpernatantinda salgilanmis anti- VEGF antikorunun spesifik baglanmasini gösteren EnAd ve Kontrol enfeksiyon süpernatantlari (Sekil 4A) için çizilmistir. Bevacizumab standart egrisi çizildi (Sekil 6) ve standart egriden (Sekil 48) interpolasyon yapilarak VEGF'ye baglanan salgilanan anti- VEGF antikoru veya yükselen Bevacizumab numunelerinin konsantrasyonlari belirlendi. Örnek 8: Üretim Nihat virüs anti- VEGF antikorlari veya anti- VEGF ScFv'leri kodlayan EnAd virüslerin üretimi Plazmid pEnAd2. 4 (ayni zamanda pCoIoAd2. 4 SEK lD NO: 64 olarak da adlandirilir), transgen kasetlerinin L5 ve E4 genleri arasinda konumlu pEnAd2. 4 benzersiz kisitlama bölgelerine dogrudan eklenmesi ile pNG- 135, pNG- 73, pNG- 74, pNG- 76, pNG- 78 ve pNG- 167 plazmidlerini üretmek için kullanildi. Plazmid üretme yöntemleri, Örnek 31'de verilmektedir.

Hazirlanan virüsler pNG- , bir antikor sabit agir zincirinin (SEK ID NO: 33), bir anti- VEGF VL zincirinin (SEK lD NO: 31) ve bir antikor sabit hafif zincirinin (SEK ID NO: 35) dahil edilmesi ile kodlanan bir anti- VEGF antikoru kodlayan bir transgen kaset içerir. pNG- 73 ve pNG- 74, ya bir egzojen promoter, CMV (SEK lD NO: 13) ya da EnAd endojen majör geç promotörün (MLP) kontrolü altinda anti- VEGF ScFv'leri kodlayan transgen kasetleri (SEK ID NO: 36) ihtiva eder. pNG- 76, pNG- 78 ve pNG- 167, ya bir egzojen promoter, CMV (SEK Histidin peptit etiketleri (SEK ID NO: 23) olan anti- VEGF ScFvs'yi (SEK ID NO: 36) ve pNG- 167 plasmidlerine yerlestirilen transgen kasetlerinin sematikleri, Sekil 24'te gösterilmektedir. Plazmidlerin yapisi DNA dizilimi ile teyit edildi.

Virüs Üretimi (SEK ID NO: 7) ve NG- 78 (SEK ID NO: 6) virüs genomlarini üretmek üzere enzim Ascl'ye sahip kisitlayici sindirimi ile pNG- 135, pNG- 73, pNG- 74, pNG- 76 ve pNG- 78 plazmidleri lineer hale getirildi. Kisitlayici sindirim reaksiyonlari Tablo 3'e göre olusturuldu ve 2 saat boyunca 37 °C'de gerçeklestirildi: Reaktif Hacim (pl) Tedarikçi plazmid DNA (`7ug) ~15 Ascl 2. 5 NEB R05588 Tampon 4 5 NEB B7004S Parçalanan DNA, 50 ul'lik nükleaz içermeyen su ile seyreltildi ve daha sonra fenol / kloroform ekstraksiyonu ile saflastirildi. Çikarilan DNA, daha sonra, 300 ul % 95'ten büyük moleküler biyoloji dereceli etanol ve 10 ul'lik 3M Sodyum Asetat içerisinde 16 saat boyunca, - 20 °C'de çöktürüldü. Çökeltilmis DNA, 14000 rpm'de, 5 dakika santrifüjle pelet haline getirildi ve tekrar santrifüje tabi tutulmadan önce 500 pl % 70 etanol içinde 14000 rpm'de, 5 dakika yikandi. Temiz DNA pelleti hava ile kurutuldui ul'lik Iipofektamin transfeksiyon reaktifi içeren 500 ul OptiMEM içinde yeniden süspanse edildi ve oda sicakliginda 30 dakika inkübe edildi. Transfeksiyon karisimi daha sonra % 70 hücre doluluk oranina yetisen HEK293 hücrelerini içeren T- 25 sisesine damla damla ilave edildi. 37 °C'de 2 saat süreyle transfeksiyon karisimi ile hücrelerinin inkübe edilmesinden sonra, % 5 C02 4 ml'lik hücre ortami (% 2 FBS ile takviye edilmis glutaminli DMEM yüksek glikoz) hücrelere ilave edildi ve siseler 37 °C'de, % 5 002 inkübe edildi. Transfekte edilmis HEK293 hücreleri her 24 saatte bir izlendi ve her 48- 72 saatte bir ilave ortam ile takviye edildi. Virüs üretimi, hücre tek tabakasinda belirgin bir sitopatik etki (CPE) gözlemleyerek izlendi (Sekil 1A- E, Sekil 2A- J ve Sekil 3A- G). CPE bir kez gözlendiginde, virüs 293 hücreden üç donma- çözülme döngüsü ile hasat edildi. Hasat edilen virüsler, virüs stoklarini çogaltmak için 293 hücreyi tekrar enfekte etmek için kullanildi. Amplifikasyon esnasinda uygun virüs üretimi, hücre tek katmaninda belirgin CPE (Sekil 1F- G, Sekil 2K- RH, Sekil 3H) gözlenmesi ile dogrulandi. CPE bir kez gözlendiginde, virüs 293 hücreden üç donma- çözülme döngüsü ile hasat edildi. 293 hücrelerindeki amplifikasyon, 48 saatlik enfeksiyon içinde hücre tek katmanlarinda belirgin CPE üreten virüs stoklari üretilinceye kadar 5 kez tekrarlandi (Sekil 1H- I, Sekil 28- Z, Sekil 2@ Sekil 3l- M).

Güçlü virüs stoklari bir kez büyütüldügünde, virüsler, NG- 135, NG- 73, NG- 74, NG- 76 ve NG- 78 virüs stoklari üretmek için çift sezyum klorür bantlamasi ile saflastirildi. Örnek 9: Kolon karsinoma hücre hatlarinda EnAd ile karsilastirilan NG- 135 virüs aktivitesinin karakterizasyonu NG- , gen ekspresyonu (RTqPCR ile degerlendirildi) ve anti- VEGF antikoru ekspresyonu (VEGF baglayici ELISA ile degerlendirildi), kolon karsinoma hücre hatlarinda karsilastirildi. NG- 'ten sonra bir anti- VEGF antikoru transgen kasedi içeren EnAd'den türemis bir virüstür. Takilan kasetin bir sematigi, Sekil 1OA ve Sekil 24'te gösterilmektedir. NG- 135 virüsünün üretimi, Örnek 8'de detaylandirilmistir. HCT- 116, DLD veya HT- 29 kolon karsinoma hücre hatlari, 6 oyuklu plakalarda HCT- 116 ve DLD hücreleri için 7. 5e5 hücre/oyuk hücre yogunluklarinda veya HT- 29 hücreleri için 2. e6 hücre/oyuk yogunlugunda tohumlandi. Hücrelere hücre basina (ppc) 100 ya da 10 EnAd ya da NG- 135 virüs parçaciklari bulastirilmadan önce ya da enfekte edilmemis halde birakilmadan önce plakalar 18 saat boyunca, 37 °C'de, % 5 C02 ile inkübe edildi. Analizler, enfeksiyondan 24, 48 veya 72 saat sonra gerçeklestirildi. qPCR ile viral DNA'nin ölçülmesi 72 saat boyunca 10ppc EnAd ya da NG- 135 ile enfekte edilen ya da enfekte edilmeden birakilan HT- 29 ve DLD hücreleri, qPCR ile viral DNA'nin ölçülmesi için kullanildi. Hücre süpernatantlari toplandi ve 5 dakika boyunca 1200 rpm'de santrifüjle temizlendi. Hücreler bir kez PBS ile yikandi ve 400 ul/oyuklu 1 x haberci Iiziz tamponu (Promega: E3971) içinde - 20 °C'de dondurularak çözülme yolu ile çözüldü. Üreticinin protokolüne göre Sigma Genelute DNA ekstraksiyon Kiti kullanilarak 3 ul'lik hücre Iizati veya 10 ul'lik süpernatanttan DNA ekstrakte edildi. EnAd virüs partikülleri (2. 5e10- 2. 5e5vp) kullanan standart bir egri hazirlandi ve de Sigma Genelute Kit kullanilarak çikarildi. Çikarilan her numune veya standart, Tablo 4'te ayrintili olarak verilen reaksiyon karisiminda bir EnAd E3 genine özgü primer- prob seti kullanilarak qPCR ile analiz edildi Reaktif Hacim / oyuk (pl) Taqman hizli ilerleme master karisimi (Lifetech) 5 EnAd Ileri primer 0.08 EnAd Tersine primer 0.08 Oyuk Hacmi 10 qPCR, Tablo 5'deki programa göre gerçeklestirildi: Hayir. Döngüler Sicaklik( °C) Süre (saniye) 1 50 120 1 95 20 40 95 1 Hücre basina tespit edilen virüs genomlarinin sayisinin nicelendirilmesi, NG- 135 ve EnAd virüs replikasyonunun hem HT- 29 hem de DLD hücre hatlarinda karsilastirilabilir oldugunu ortaya koymustur (Sekil 11A). Enfekte edilmemis hücrelerde hiçbir virüs genomu tespit edilememistir (veriler gösterilmemistir).

RTqPCR ile viral (hekzon) veya anti- VEGF antikoru gen ekspresyonunun 10ppc EnAd veya NG- 135 ile 72 saat enfekte edilmis veya enfekte edilmemis halde birakilmis HT- 29 ve DLD hücre hatlari, RTqPCR ile hekzon veya anti- VEGF antikor geni ekspresyonunun analizi için kullanilmistir. Süpernatant her kuyudan çikarildi ve hücreler PBS ile yikandi ve sonra [3- merkaptoetanol (1: 100) içeren 600 uI/oyuk RLT tamponu (QlAgen) içinde eritildi. Hücre lizatlari 3 dakika süreyle 13000 rpm'de santrifüje tabi tutularak berraklastirildi ve daha sonra, 200 ul Iizat RNA üreticisinin protokolüne göre Allprep DNA / RNA/ protein ekstraksiyon kiti (QlAgen) kullanilarak ekstraksiyon amaciyla kullanilmistir. Her numuneden çikarilan RNA konsantrasyonu ölçülmüs ve üreticinin protokolüne göre qRT- PCR (Life Technologies; 11752- 050) için SuperScript III First Strand Synthesis SuperMix kullanilarak 800ng CDNA sentezine yönelik kullanilmistir. Her bir sentezlenmis 1ul DNA numunesinden, asagida ayrintili olarak verilen reaksiyon karisiminda bir EnAd hekzon spesifik primer- prob seti veya anti- VEGF antikor spesifik primer- prob seti kullanilarak qPCR ile analiz için kullanildi, Tablo 6.

Reaktif Hacim I oyuk (pl) Taqman hizli ilerleme master karisimi (Lifetech) 5 Ileri primer 0.08 EnAd Tersine primer 0.08 Oyuk Hacmi 10 qPCR, Tablo 5'deki programa göre gerçeklestirildi. qPCR tarafindan tespit edilen DNA kopyalarinin sayisinin nicelendirilmesi, NG- 135 veya EnAd ile enfekte edilmis HT- 29 veya DLD hücrelerinde virüs geç geni Hexon'un karsilastirilabilir ekspresyonunu gösterdi (Sekil 11B). Bununla birlikte, anti- VEGF antikor geni ekspresyonu, anti- VEGF antikoru transgen kasedi içeren NG- 135 virüsüyle enfekte olan HT- 29 veya DLD hücrelerinde tespit edilmistir (Sekil 12).

VEGF baglayici ELISA ile anti- VEGF antikoru ekspresyonunun analizi VEGF baglayici ELISA ile antikor ekspresyonunun analizi için, 100ppc EnAd veya NG- 135 ile 24, 48 veya 72 saat süreyle enfekte edilmis veya enfekte edilmemis halde bulunan HT- 29, DLD ve HCT- 116 hücreleri kullanilmistir. Kültür süpernatanlari, her oyuktan çikarildi ve hücre döküntülerini gidermek için 5 dakika 1200rpm'de santrifüje tabi tutuldu. ELISA plakalari (Nunc lmmuno MaxiSorp 96 ile kaplandi ve Örnek 7'de ayrintilandirilan yöntemlere göre bloke edildi. Enfeksiyon saflastirilmis anti- VEGF antikorunun (1000ng / ml - 0.0128ng / ml) seri seyreltilmesi hazirlandi. Tüm numuneler, VEGF- 165 kapli plakalara ilave edildi ve Örnek 7'de ayrintilandirilan yöntemlere göre analiz edildi. VEGF'ye baglanan salgilanan anti- VEGF antikor konsantrasyonlari, standart egrilerinden interpolasyon yoluyla tespit edildi. Anti- VEGF antikor ekspresyonu, 72 saate kadar HT- 29, DLD ve HCT hücrelerinde zamanla artmis ve bu noktada, karsilastirilan antikor ekspresyonu, tahlil edilen tüm hücre hatlarinin süpernatanti içinde tespit edilmistir (Sekil 13). Örnek 10: Kolon karsinomu ve akciger karsinom hücre çizgilerinde anti- VEGF antikor ekspresyonunun ölçülmesi HT- 29 kolon karsinomu ve A549 akciger karsinoma hücre çizgileri, HT- 29 için 1e6 hücre/oyuk ve A549 hücreleri için 5e5 hücre/oyuk yogunlugunda 12 oyuklu plakalarda kaplanmistir. Hücrelere hücre basina (ppc) 100 EnAd ya da NG- 135 virüs parçaciklari bulastirilmadan önce ya da enfekte edilmemis halde birakilmadan önce plakalar 24 saat boyunca, 37 °C'de, % 5 CO2 ile inkübe edildi. Analizler, enfeksiyondan 24, 48 veya 72 saat sonra gerçeklestirildi.

Her zaman noktasinda, kültür süpernatantlari her bir oyuktan çikarildi ve 400 pl hücre kültürü ortami ile yer degistirildi. Daha sonra, ortamlar her bir oyuktan toplanmadan önce plakalar 5 dakika, 1 saat veya 3 saat inkübe edildi ve hücre artiklarini temizlemek için 5 dakika, 1200 rpm'de santrifüje tabi tutuldu. ELISA plakalari (Nunc lmmuno MaxiSorp 96 oyuklu mikroplaka), karbonat / bikarbonat tamponu içinde seyreltilmis fare monoklonal anti- insan lgGl Fc antikoru (2 pl / ml, ile yikanmadan önce oda sicakliginda PBS % 0.05 Tween 20 içinde % 3 BSA ile 1 saat süreyle bloke edildi. Plakalar, daha sonraki tüm baglanma asamalari arasinda 3 kez PBS % 0.05 Tween 20 ile yikandi.

Berraklastirilan enfeksiyon süpernatantlari, % 3 BSA /PBS % 0.05 Tween 20 (112, 1:& 1:32) içine seyreltildi. Saflastirilan Bevacizumab'in (200 ng / ml - 0.1 ng / ml) seri seyreltilmesi de PBS /% 3 BSA /% 0.05 Tween 20'de hazirlandi. Numuneler ve standartlar kaplanmis plakalara ilave edildi ve 1 saat oda sicakliginda inkübe edildi.

Daha sonra, HRP substrat çözeltisi 3. 3. 5. 5'- terametiletilendiamin (TMB, Thermo- Fisher) ile HRP saptama gerçeklestirilmeden önce, oda sicakliginda 1 saat boyunca saptama antikoru HRP'ye konjüge edilmis anti- insan- Fc (0. 5pg/ml Abcam, ab87422) uygulandi. Reaksiyonu durdurmak için 1M HCI kullanildi ve gelisen renk 450 nm'de bir plaka okuyucu üzerinde ölçüldü. HT- 29 hücrelerinde (Sekil 28A) ve A549 hücrelerinde (Sekil 28B) salgilanan anti- VEGF antikor konsantrasyonlari, standart egrilerden interpolasyon yoluyla belirlendi. 1e6 HT- 29 veya A549 hücreleri tarafindan 24, 48 ve 72 saat boyunca eksprese edilmesi öngörülen toplam protein Sekil 280'de özetlenmistir. Örnek 11: Kolon karsinomu hücre hattinda anti- VEGF ScFv ekspresyonu NG- 76 (SEK ID NO: 7), NG- 78 (SEK lD NO: 6) ve EnAd anti- VEGF ScFv ekspresyonu, HT29 kolon karsinomu hücrelerinde western blot ile karsilastirildi. NG- 76 ve NG- 78, EnAd geç geni L5'ten (Fiber) sonra anti- VEGF ScFv transgen kasetleri içeren EnAd'den türetilen virüslerdir. Eklenen kasetlerin sematikleri, Sekil 108 ve C'de gösterilmekte ve virüslerin üretimi Örnek 8'de açiklanmaktadir. HT- 29 hücreleri 6 oyuklu kültür plakalarina 4e6 hücre / oyuk yogunlugunda ekildi ve 5 saat boyunca, hücre basina 50 NG- 76, NG- 78 veya EnAd virüs partikülleri ile enfekte edildi. Ortam, oyuklardan çikarildi ve hücreler, anti- proteaz inhibitörü kokteyl III içinde Iizizden önce PBS ile bir kez yikandi. Lizatlara, genomik DNA'yi indirgemek üzere benzonaz ile muamele edildi ve NuPAGE LDS numune tamponu ve NuPAGE indirgeyici madde (Life Technologies) ihtiva eden liziz tamponu içinde 1: 4 oraninda seyreltildi. Numuneler, üreticinin protokolüne göre % 4- 12 Bis- Tris NuPAGE jelleri (Life Technologies) kullanilarak SDS- PAGE gerçeklestirilmeden önce 10 dakika, 70 °C'de isitildi. Proteinler, Xcell Il Blot Modülü (Life Technologies) kullanilarak western blot ile PVDF zarlarina aktarildi.

Bloke etme ve imünoblotlama % 5 süt tozu ile takviye edilmis PBS % 0.1 Tween- 'de gerçeklestirildi ve tüm yikama adimlari PBS % 0.1 Tween- 20'de gerçeklestirildi. Anti- VEGF ScFv'ler, ScFv'nin C- ucunda His- etiketine karsi fare monoklonal anti- Ct- Hisx6 antikoru kullanilarak tespit edildi ve ikincil antikor tespiti, Tavsan anti- fare lgG- HRP kullanilarak gerçeklestirildi. Proteinler gelismis kemilüminesans ile görsellestirildi. ScFv ekspresyonu, NG- 76 veya NG- 78 ile enfekte edilmis HT- 29 hücre Iizatlarinda tespit edilebildi, ancak EnAd ile enfekte edilmis hücrelerde (sirasiyla, 76, 78 ve Sekil 14A'da Ad1 olarak etiketlenmis) tespit edilemedi. ScFv ekspresyonu, ScFv ekspresyonunun bir endojen büyük geç promotörün kontrolü altinda oldugu NG- 78 virüsüne kiyasla ScFv ekspresyonunun bir egzojen promotörün kontrolü altinda oldugu NG- 76 virüsü ile enfekte edilmis hücrelerde 22 saat, erken tespit edilebildi. Örnek 12: VEGF baglayici ELISA ile tespit edilen anti- VEGF ScFv ekspresyonu NG- 76 (SEK ID NO: 7) ve EnAd, anti- VEGF ScFv ekspresyonu, insan embriyonik böbrek hücre hatlarinda, VEGF baglayici ELlSA veya Western blot ile karsilastirildi.

AD293 hücreleri, 6 oyuklu kültür plakalarina, oyuk basina 5e5 hücre yogunlugunda ekildi. Ekimden 24 saat sonra, AD293 hücreleri, hücre basina 100 virüs parçaciginda NG- 76 veya EnAd ile enfekte edildi. Hücreler, süpernatantlar oyuklardan toplanmadan önce 72 saat boyunca kültürlendi ve hücre artiklarini çikarmak için 5 dakika 1200 rpm'de santrifüje tabi tutuldu. Berraklastirilmis süpernatantlar daha sonra ya VEGF baglayici ELlSA ya da Western blot analizi için kullanildi. ELlSA için süpernatanlar % 3 BSA/ PBS % 0.05 Tween içinde 1: 2 oraninda seyreltildi ve daha sonra ya 8 ng/ml anti- VEGF antikoru yükseltildi ya da antikor birakildi. ELISA plakalari VEGF ile kaplandi ve Örnek 7'de ayrintilandirilan yönteme göre bloke edildi.

Numuneler, plakalara 100 ul / oyuk ve deneyde eklenmistir. Daha sonra, HRP substrat çözeltisi 3. 3. 5. 5'- terametiletilendiamin (TMB, Thermo- Fisher) ile HRP saptama gerçeklestirilmeden önce, oda sicakliginda 1 saat boyunca saptama antikoru HRP'ye konjüge edilmis poliklonal anti- His (Abcam, ab1187) uygulandi.

Reaksiyonu durdurmak için 1M HCl kullanildi ve gelisen renk 450 nm'de bir plaka okuyucu üzerinde ölçüldü. 450 nm'de emilim, EnAd, NG- 76 ve NG- 76 + 8ng / ml anti- VEGF antikoru enfeksiyonu süpernatantlari için çizildi (Sekil 14B). NG- 76 ile enfekte olmus hücrelerin süpernatantlarindaki VEGF için eksprese edilen ScFv'nin özgüllügü, 8 ng/ml saflastirilmis insan anti- VEGF antikoru bevacizumabin eklenmesi ile VEGF baglanma kismen inhibe edilerek teyit edildi. Western blot için süpernatanlar hazirlandi ve Örnek 11'de detaylandirilan yöntemlere göre test edildi.

ScFv ekspresyonu, enfeksiyondan 24 saat sonra düsük seviyelerde tespit edilebildi ve ekspresyon 44 saat boyunca önemli ölçüde artti (Sekil 7). Örnek 13: Tümör tasiyan farelerde EnAd ile karsilastirildiginda NG- 135 virüs aktivitesinin karakterizasyonu DLD veya HCT- 116 kolon karsinom hücreleri, CD1 nu/nu farelerinde subkütan bir ksenograft olarak implante edildi. Tümörler ~100mm3 ulastiginda, fareler gruplandirilmis ve tek intra- tümöral enjeksiyon yoluyla verilen 5e9 EnAd veya NG- 135 virüs partikülleri ile muamele edilmistir. Her çalismaya, bir grup enfekte edilmemis kontrol faresi de dahil edilmistir. Tedaviden 3, 7 veya 28 gün sonra DLD tümörleri kesip çikartildi ve tedavi sonrasi 3, 7 veya 14. gün HCT- 116 tümörlerinden kesip çikartildi. qPCR ile virüs genom replikasyonu analizi Kesilip çikartilan tümörler tartildi ve 25 mg tümör basina 100 pl tampon konsantrasyonunda 1: içeren 1X haberci Iiziz tamponu (Promega E3971) içinde homojenize edildi. Muamele edilmemis tümör homojenatlari, bir EnAd virüs standart egrisi (2. 5e10- 2. 5e5 vp / tümör Iisat numunesi) hazirlamak için kullanildi. Üreticinin protokolüne göre Sigma Genelute DNA ekstraksiyon kiti kullanilarak her muamele edilmis tümör numunesinin 2 ul'sinden veya her bir standardin 100 pl'sinden DNA ekstrakte edildi. Çikarilan numuneler ve standartlar, Örnek 8'de detaylandirilan qPCR yöntemlerine göre bir EnAd E3 genine özgü primer- prob seti kullanilarak qPCR ile analiz edildi. Tümör basina virüs genomlarinin sayisinin nicelendirilmesi, tedavi sonrasi 3. gün veya 7. gün (Sekil 15A) veya tedavi sonrasi 28. gün (Sekil 158) DLD tümörleri için gösterilmistir. Enab veya NG- 135 ile tedaviden sonra 3. gün, 7. gün veya 14. gün HCT tümörleri için tümör basina virüs genomlarinin sayisinin nicelendirilmesi gösterilmektedir (Sekil 18A). Toplanan veriler, HCT veya DLD tümörlerinde EnAd ve NG- 135 virüs replikasyonu arasinda belirgin bir fark göstermemektedir.

RTqPCR ile viral (hekzon) veya anti- VEGF antikoru gen ekspresyonunun Alinan tümörler tartildi ve 20 mg tümör basina 350 ul'lik bir tampon konsantrasyonunda ß- merkaptoetanol (Sigma) içeren RLT liziz tamponu (QIAgen) içinde homojenize edildi. RNA, AlIPrep DNA / RNA / Protein Mini kiti (QIAgen) kullanilarak tümör numunelerinden çikarildi ve üreticinin protokollerine göre RNAz içermeyen DNAz seti (QIAgen) ile muamele edildi. Her numuneden çikarilan RNA konsantrasyonu ölçüldü ve 800 ng, Örnek 8'de ayrintili olarak açiklanan RTqPCR yöntemlerine göre CDNA sentezi ve qPCR için kullanilmistir. qPCR tarafindan tespit edilen RNA kopyalarinin sayisinin nicelendirilmesi, tedavi sonrasi 3. gün veya 7. günde NG- 135 veya EnAd ile tedavi edilen DLD tümörlerinde virüs geç geni, hekzonun karsilastirilabilir ekspresyonunu gösterdi (Sekil 16A). Aksine, anti- VEGF antikor geni ekspresyonu (RNA), sadece NG- 135 virüsü ile tedavi edilen DLD hücrelerinde tespit edildi (Sekil 1GB).

Anti- insan !961 veya VEGF baglayici ELISA ile tespit edilen anti- VEGF antikor ekspresyonu Anti- insan lgG1 ELISA (Abcam Kit) veya VEGF baglayici ELISA ile anti- VEGF antikoru ekspresyonunun analizinde, qPCR (yukarida) için hazirlanan çikartilmis tümör Iizatlari kullanilmistir. Tümör rezeksiyonu noktasinda alinan kan örneklerinden alinan serumlar ayrica insan lgG1'i için ELISA ile test edildi. Muamele edilmis ve kontrol farelerindeki tümör Iizatlari analiz edilmeden önce, % 2 Triton X- 100 ihtiva eden 150 pl 1X haberci veya liziz tamponu (Promega) içinde 1: 2 oraninda seyreltildi, kisa süre vortekslendi ve sonikasyon yapan bir su banyosu içinde 5 dakika sonike edildi. Kan örnekleri 5000 rpm'de 5 dakika santrifüje tabi tutuldu ve serum toplandi.

Saflastirilmis anti- VEGF antikoru, bevacizumab'in (1000ng / ml - 0.0128ng / mi) seri dilüsyonlari hazirlandi ve muayene standart egrileri üretmek üzere toplanan kontrol farelerinin lizatlarina ya da muamele edilmemis farelerdeki serum numunelerine katilmistir.

Insan lgG1 ELISA (Abcam) NG- 135 veya EnAd ile muamele edilen tümörlerden alinan ses dalgalarina maruz birakilmis Iizatlar, ayrica 1: 2 oraninda tahlil tamponuna seyreltildi ve pozitif bir kontrol olarak, EnAd ile muamele edilmis fare tümörü lizati numunesi, 8 ng/ml saflastirilmis bevacizumab ile yükseltildi. Serum numuneleri 1: 2 veya 1: 5 oraninda tahlil tamponuna seyreltildi. Daha sonra tüm numuneler ve standartlar, üreticinin protokolüne göre Abcam ELlSA Kiti kullanilarak anti- insan IgG1 için denendi.

Tümörlerdeki antikor konsantrasyonlari, standart egrilerden interpolasyon yoluyla belirlendi. Insan IgG1 antikoru ekspresyonu, NG- 135 ile muamele edilen DLD tümörlerinde tespit edilebildi ve tedaviden 28 gün sonra analiz edildi (Sekil 17A) ve bir NG- 135 ile muamele edilmis fareden alinan bir serum numunesinde tedaviden 28 gün sonra analiz edildi (Sekil 19). Antikor ayrica, NG- 135 ile tedavi edilen tüm HCT- 116 tümörlerinde tespit edildi ve tedaviden 3, 7 veya 14 gün sonra analiz edildi (Sekil 188). EnAd ile tedavi edilen farelerin herhangi bir tümöründe veya kan örneginde antikor ekspresyonu tespit edilemedi.

VE GF baglayici ELISA NG- 135 veya EnAd ile muamele edilen tümörlerden alinan ses dalgalarina maruz birakilmis lizatlar, ayrica 1: 2 oraninda tahlil tamponuna seyreltildi ve pozitif bir kontrol olarak, EnAd ile muamele edilmis fare tümörü lizati numunesine, 1. 6 ng/ml saflastirilmis bevacizumab katildi. ELISA plakalari (Nunc lmmuno MaxiSorp 96 oyuklu mikro plaka), insan VEGF- ile Örnek 7'de ayrintilandirilan yöntemlere göre kaplandi. Numuneler ve standartlarin süpernatantlari, VEGF- 165 kapli plakalara ilave edildi ve Örnek 7'de detaylandirilan yöntemlere göre analiz edildi. Tümörlerdeki anti- VEGF baglayici antikor konsantrasyonlari, standart egriden interpolasyon yoluyla belirlendi. hVEGF- 165'e baglanabilen anti- VEGF antikoru, NG- 135 ile tedavi edilen DLD tümör numunelerinde saptanabildi, ancak EnAd ile muamele edilmis numunelerde saptanamadi (Sekil 17B). Örnek 14: Haberci genleri kodlayan EnAd virüslerinin üretimi ve karakterizasyonu GFP ya da lusiferaz eksprese eden haberci virüslerin bir paneli üretilmis olup, transgen ekspresyonu egzojen bir viral promotör olan CMV'nin (NG- 47, NG- 61, bir egzojen memeli promotörü, PGK (NG- 159)), endojen virüs büyük geç promotörün endojen virüs erken promotör E4'ün (NG- 109, NG- 110) kontrolü altindadir. Tüm açiklanmaktadir) kullanilarak türetildi ve EnAd geç gen L5'ten sonra yerlestirilen transgen kasetlerine sahipti.

Virüs Üretimi Plasmid pEnAd2. 4, L5 ve E4 genleri arasinda bulunan pEnAd2. 4 benzersiz restriksiyon bölgelerine yesil fluoresan proteini (GFP, SEK ID NO: 38) kodlayan transgen kasetlerinin dogrudan sokulmasi ile pNG- 47, pNG- 62, pNG- 93, pNG- 105, transgen kasetlerinin sematikleri Sekil 22'de gösterilmektedir. Plazmid pEnAd2. 4 (SEK ID NO: 64) ayrica, Iüminesan proteini, lusiferazi (SEK ID NO: 39) kodlayan transgen kasetlerinin pEnAd2. 4 benzersiz restriksiyon bölgelerine dogrudan sokulmasi ile pNG- 61 ve pNG- 63 plasmidlerini üretmek için de kullanilmistir. pNG- 61 ve pNG- 63 plazmidlerine yerlestirilen transgen kasetlerinin sematikleri Sekil 22'de gösterilmektedir. Tüm plazmidler DNA dizilimi ile teyit edildi. Haberci genlerini kodlayan plasmidler, Örnek 8'de ayrintili olarak açiklanan 'virüs üretimi' yöntemlerine göre virüs parçaciklari üretmek üzere lineer hale getirildi ve HEK293 hücrelerine transfekte edildi. Güçlendirilmis virüs partikülleri, virüs stoklari NG- 47, NG- 62, NG- üretmek üzere çift sezyum klorür bantlamasi ile saflastirildi.

Virüs Karakterizasyonu veya EnAd virüs replikasyonu (qPCR ile degerlendirilir) ve GFP gen ekspresyonu (floresans tahlili ile degerlendirildi), kolon karsinoma hücre hatti HT- 29'da karsilastirilmistir. HT- 29 kolon karsinoma hücre hatlari, 12 oyuklu plakalara 1e6 hücre / oyuk hücre yogunluklarinda ekildi. Hücreler yukarida ayrintili olarak verilen virüslerin her birinde hücre basina 1 virüs partikülü (ppc) enfekte edilmeden önce veya enfekte edilmemis olarak birakilmadan önce plakalar, 24 saat boyunca, 37 sonra gerçeklestirildi. qPCR ile viral DNA 'nin ölçülmesi Hücre süpernatantlari toplandi ve 5 dakika boyunca 1200 rpm'de santrifüjle temizlendi. Hücreler bir kez PBS ile yikandi ve 400 pI/oyuklu 1 x haberci liziz tamponu (Promega: E3971) içinde - 20 °C'de dondurularak çözülme yolu ile eritildi. Üreticinin protokolüne göre Sigma Genelute DNA ekstraksiyon Kiti kullanilarak 1 ul'lik hücre Iizati veya 10 pl'lik süpernatanttan DNA ekstrakte edildi. EnAd virüs partikülleri (2. 5e10- 2. 5e5vp) kullanan standart bir egri hazirlandi ve de Sigma Genelute Kit kullanilarak çikarildi. Çikarilan her numune veya standart, örnek 9'da detaylandirilan qPCR yöntemlerine göre bir EnAd E3 genine özgü primer- prob seti kullanilarak qPCR ile analiz edildi. Hücre basina virüs genomlarinin sayisinin Floresan ile transgen ekspresyonunun nicellestirilmesi Yukarida hazirlanan hücre Iizatlari, ya 25pl çözülmüs düzgün parçalanmis ya da 1: 2 1x haberci liziz tamponu (Promega: E971) ile seyreltilmis Iizat kullanilarak test edilmistir. Her kuyucuktaki GFP floresan seviyesi, bir plaka okuyucu (BioTek Synergy HT) üzerinde ölçüldü. 24, 48, 72 veya 96 saat boyunca enfekte olmus numuneler için ölçülen, arka plani çikarilmis, flüoresan, Sekil 27B'de çizilmistir. Örnek 15: Egzojen promotör CMV'nin kontrolü altinda haberci genleri kodlayan EnAd virüslerinin karakterizasyonu NG- 47 ve NG- 61 haberci virüsleri için virüs replikasyonu (qPCR ile degerlendirildi), onkolitik aktivite (hücre yasayabilirlik tahlili ile degerlendirildi) ve haberci gen ekspresyonu (floresan ile degerlendirildi), EnAd ile karsilastirildi. NG- 47 ve NG- 61 virüslerinin üretimi ve tasarimi, Örnek 14'te detaylandirilmistir.

Virüs replikasyonu ve transgen ekspresyonunun karakterizasyonu HT- 29 kolon karsinoma hücreleri. Wl38 fibroblast hücre hatti veya MRC5 fibroblast hücre hatti, 6 oyuklu plakalarda, 2. e6 hücre/oyuk hücre yogunlugu ile tohumlandi.

Hücreler, hücre basina (ppc) 1 EnAd, NG- 47 ya da NG- 61 virüs partikülleri ile enfekte edilmeden önce plakalar 18 saat boyunca, 37 °C, % 5 COziIe inkübe edildi.

Analizler, enfeksiyondan 24, 48, 72 veya 96 saat sonra gerçeklestirildi. Hücre süpernatantlari toplandi ve 5 dakika boyunca 1200 rpm'de santrifüjle temizlendi.

Hücreler bir kez PBS ile yikandi ve 400 pI/oyuklu 1 x haberci liziz tamponu (Promega: E3971) içinde - 20 °C'de dondurularak çözülme yolu ile eritildi. Üreticinin protokolüne göre Sigma Genelute DNA ekstraksiyon Kiti kullanilarak hücre lizatindan veya süpernatanttan DNA ekstrakte edildi. EnAd virüs partikülleri (2. 5e10- 2. 5e5vp) kullanan standart bir egri hazirlandi ve de Sigma Genelute Kit kullanilarak çikarildi. Çikarilan her numune veya standart, bir EnAd E3 genine özgü primer- prob kullanilarak qPCR ile analiz edildi. Hücre basina tespit edilen virüs genomlarinin hücre hatlarinda (Sekil 26C) NG- 47 ve NG- 61 çogalmasinin EnAd (Sekil 25 ve 26'da EnAd olarak isaretlenmistir) ile karsilastirilabilir oldugunu gösterdi. Yukarida hazirlanan NG- 47 ve EnAd hücre lizatlari, ayrica transgen ekspresyonunu degerlendirmek için kullanildi. Bagil GFP floresansi, ya düz bir lizat ya da 1X haberci (BioTek) ölçüldü (Sekil 25C).

Virüs onkolitik potensinin karsilastirilmasi HT- 29 kolon karsinoma hücreleri, 96 oyuklu plakalara 2. 5e4 hücre /oyuk olan bir hücre yogunlugunda ekildi. Hücrelere ya hücre basina 100- 0. 39 partikül (ppc) enfeksiyon yogunlugu araliginda EnAd, NG- 47 ya da NG- 61 virüs partikülleri ile enfekte edilmeden önce plakalar, 4 saat boyunca, 37 °C'de, % 5 COzile inkübe edildi.

HT- 29 hücre yasayabilirligi, enfeksiyondan 72 saat sonra Cell Titre 96 MTS Reagent (Promega: G3581) kullanilarak degerlendirildi. Her enfeksiyon yogunlugunda % 'ce hücre sagkaliminin nicelestirilmesi, NG- 47 ve NG- 61'in onkolitik potensinin, HT29 hücrelerinde EnAd ile karsilastirilabilir oldugunu ortaya koymustur (Sekil 26A ve 268). Örnek 16: Bagisiklik kontrol noktasi inhibitörü yol proteinlerine yönelik antikorlari kodlayan EnAd virüslerinin üretimi pEnAd2. 4 (SEK lD NO: 64) plazmidi, bir anti- insan PD- L1 antikorunu (YW243. 551870) kodlayan bir transgen kasetinin L5 ve E4 genleri arasinda bulunan pEnAd2. 4 benzersiz kisitlama bölgeleri arasina dogrudan yerlestirilmesi ile pNG- 177 plasmidinin üretilmesinde kullanildi. PNG- 177 plazmidi, bir anti- PD- L1 VH zincirini (SEK ID NO: 30), bir antikor sabit agir zincirini (SEK ID NO: 34), bir anti- VEGF VL zincirini (SEK ID NO: 32) ve bir antikor sabit hafif zincirini (SEK ID NO: 35) kodlar.

NG- bulunan eklenmis anti- PD- L1 antikor kasetinin bir semasi Sekil 24'te gösterilmektedir. Örnek 17: Sitokinleri kodlayan EnAd virüslerinin üretimi ve karakterizasyonu Virüs Üretimi pEnAd2. 4 plazmidi, insan interferon- y (lFNy (SEK ID NO: 41; pNG- 92 ve pNG- 95), insan lnterferon- d (lFNoi SEK ID NO: 42; pNG- 96 vepNG97) ya da insan tümör nekroz faktörü alfayi (hTNFd SEK ID NO: 40; pNG- 139) kodlayan transgen kasetlerinin L5 ve E4 genleri arasinda bulunan (BY bölgesi) pEnAd2. 4 benzersiz kisitlama bölgelerine dogrudan yerlestirilmesi ile pNG- 92, pNG- 95, pNG- 96, pNG- pNG- 96, pNG- 97 ve pNG- 139 plazmitlerine yerlestirilen transgen kasetlerinin sematikleri Sekil 23'te gösterilmektedir. Plazmidlerin yapisi DNA dizilimi ile teyit pNG- 92, pNG- 95 ve pNG- NG- 95 (SEK ID NO: 49) ve NG- genomlarini üretmek için lineer hale getirildi. Örnek 8'de detaylandirilan 'virüs üretimi' yöntemlerine göre virüs parçaciklari üretmek için genomlar HEK293 hücrelerine transfekte edildi. Güçlendirilmis virüs parçaciklari, NG- 92, NG- 95 ve NG- 139 virüs stoklarini üretmek için çift sezyum klorür bantlamasi ile saflastirildi. Yükseltme sirasinda canli NG- 139 virüs partiküllerinin üretimi, EnAd kapsid proteini Hexon için immün boyama ile teyit edildi. HT- 29 hücreleri 48 saat boyunca virüs Iizati ile enfekte edildi, daha sonra ortam hücrelerden uzaklastirildi, hücreler 1: 1 MeOH: Aseton içinde sabitlendi ve oda sicakliginda 1 saat boyunca anti- adenovirüs antikoru (Abcam: ab7428) ile boyandi. Hücreler daha sonra yikandi ve ikincil antikor tespiti, HRP konjüge anti- fare IgG (Abcam: ab6728) kullanilarak gerçeklestirildi. Hexon proteini, 25 dakika boyunca DAB substrati eklenerek görsel hale getirildi. Hekzon boyama, hücre tek katmanlarinda tespit edilebilir (Sekil 29A ve Sekil 298).

Kolon karsinoma hücre hatlarinda TNFa üretiminin nicelendirilmesi ve bir kolon karsinomu subkütan ksenograft tümör modeli HT- 29 kolon karsinoma hücre hatlari, 595 hücre/oyuk bir yogunlugunda 6 oyuklu plakalarda kaplanmistir. Hücreler, hücre basina (ppc) 100 NG- 139 virüs partikülü ile enfekte edildi veya enfekte edilmemis olarak birakildi. Analizler, enfeksiyondan 24 veya 36 saat sonra gerçeklestirildi.

Her zaman noktasinda, kültür süpernatanlari her oyuktan çikarildi ve hücre döküntülerini gidermek için 5 dakika 1200rpm'de santrifüje tabi tutuldu.

Berraklastirilmis süpernatantlar tahlil tamponuna seyreltildi ve üreticinin protokolüne göre TNFoi ELlSA içinde kullanildi. Salgilanan TNFd konsantrasyonlari, standart egrilerden interpolasyon yoluyla belirlendi ve Sekil 29C'de gösterildi.

DLD kolon karsinom hücreleri, CD1 nu/nu farelerine subkütan bir ksenograft olarak implante edildi. Tümörler ~100mm3'e ulastiginda, fareler gruplandirildi ve 0, 3 ve 6. günlerde bir tekli tümör içine enjeksiyon yoluyla verilen 5e9 EnAd veya NG- 139 virüs partikülleri ile tedavi edildi. Her çalismaya, bir grup enfekte edilmemis kontrol faresi de dahil edilmistir. DLD tümörleri tedaviden sonra 15. günde kesilip çikartildi ve üreticinin protokolüne göre ELISA ile TNFoi üretimi için analiz edildi. Tümör içinde tespit edilen TNFoi konsantrasyonlari, standart egriden interpolasyon yoluyla belirlendi ve Sekil 29D'de gösterildi. Örnek 18: Kolon, yumurtalik ve akciger karsinom hücre hatlarinda virüs replikasyonu ve anti- VEGF antikor ekspresyonu NG- ve EnAd, virüs replikasyonu ve anti- VEGF antikoru ekspresyonu kolon (HT- 29, HCT ya da yumurtalik (SKOV3) karsinom hücre hatlarinda hlgG1 ELISA ile karsilastirildi. Hücreler, 12 oyuklu kültür plakalarina, oyuk basina 5e5- 1e6 hücre yogunlugunda ekildi. Ekimden 24 saat sonra, hücre basina 100 virüs partikülü ile hücre hatlari NG- 135 veya EnAd ile enfekte edildi. Hücreler, süpernatantlar oyuklardan toplanmadan önce 24, 48, 72, 96 ya da 120 saat boyunca kültürlendi ve hücre artiklarini çikarmak için 5 dakika 1200 rpm'de santrifüje tabi tutuldu. Süpernatanin yarisi antikor üretimini degerlendirmek için kullanildi ve diger yarisi ise virüs genomlarini degerlendirmek için kullanildi. Daha sonra her kuyucuktaki hücreler 1xPBS ile yikandi ve 1X haberci liziz tamponu (Promega) içinde eritildi. Lizatlar dondurularak çözüldü ve daha sonra virüs replikasyonu için degerlendirildi. Üreticinin protokolüne göre Sigma Genelute DNA ekstraksiyon Kiti kullanilarak 1- 5 ul'lik hücre Iizati veya 10 ul'lik süpernatanttan DNA ekstrakte edildi. EnAd virüs partikülleri (2. 5e10- 2. 5e5vp) kullanan standart bir egri hazirlandi ve de Sigma Genelute Kit kullanilarak çikarildi. Çikarilan her numune veya standart, örnek 9'da detaylandirilan yöntemlere göre bir EnAd E3 genine özgü primer- prob seti kullanilarak qPCR ile analiz edildi. Her bir hücre hattindaki tüm zaman noktalarinda maksimum replikasyon, EnAd ve NG- 135 için Sekil 33A'da çizilmistir.

ELISA plakalari (Nunc lmmuno MaxiSorp 96 oyuklu mikroplakalar) gece boyunca 4 °C'de fare monoklonal anti- insan IgG1 FC antikoru (ab1927 Abcam) ile karbonat / bikarbonat tamponunda kaplanarak hazirlandi. Plakalar, sonraki tüm baglanma içinde % 3 BSA ile oda sicakliginda 1 saat bloke edildi. Berraklastirilmis enfeksiyonlu Saflastirilmis Bevacizumab'in seri bir seyreltilmesi (1000 ng / ml - 0.0128ng / ml) hazirlandi ve seyreltildi. 8 ng/ml'lik Bevacizumab örnekleri ayrica kontrol enfeksiyon süpernatanlarina katildi. Tüm numuneler, kaplanmis plakalara ilave edildi ve 1 saat oda sicakliginda inkübe edildi. Daha sonra, HRP substrat çözeltisi 3. 3. 5. 5'- terametiletilendiamin (TMB, Thermo- Fisher) ile HRP saptama gerçeklestirilmeden önce, oda sicakliginda 1 saat boyunca saptama antikoru HRP'ye konjüge edilmis anti- insan- Fab uygulandi. Reaksiyonu durdurmak için 1M HCI kullanildi ve gelisen renk 450 nm'de bir plaka okuyucu üzerinde ölçüldü. Salgilanan anti- VEGF antikor konsantrasyonlari, Bevacizumab standart egrisinden interpolasyon yoluyla tespit edildi (Sekil 338). Örnek 19: NG- 135 ile tedavi edilen tümörlerden antikor üretiminin karakterizasyonu HCT- 116 kolon karsinom hücreleri, CD1 nu/nu farelerine subkütan bir ksenograft olarak implante edildi. Tümörler ”100mm3 ulastiginda, fareler gruplandirilmis ve bir tekli tümör içi enjeksiyon yoluyla verilen 5e9 EnAd veya NG- 135 virüs partikülleri ile muamele edilmistir. Tedaviden 10 gün sonra, bazi hayvanlardan tümörler kesilip alindi, tartildi ve`100mg'lik bölümler halinde kesildi. Her bölüm, 12 oyuklu bir plakada bir filtre kabina (Nunc) yerlestirildi ve daha sonra ex vivo olarak % 10 FBS ile takviye edilmis DMEM ortaminda 7 gün boyunca kültürlendi. Tümör kesitleri ve ex vivo kültür ortami, rezeksiyon sonrasi 0 veya 7. günlerde viral genom replikasyonu veya antikor ekspresyonu için analiz edildi. Dolasimdaki anti- VEGF antikorunun ölçümleri Için diger hayvanlardan serum alindi. qPCR ile virüs genom replikasyonu analizi Kültür ortami filtre kaplarindan ve çevreleyen oyuktan çikarildi. qPCR için, medya numuneleri, Sigma Genelute DNA ekstrasyon kiti yeniden süspansiyon tamponu içerisinde 1: 200 oraninda seyreltildi ve kesilip çikartilan tümörler veya kültürlenmis tümör bölümleri, 1: 200 anti- proteaz inhibitörü kokteyli içeren 1 x haberci Iiziz tamponu (Promega E3971) içinde 25 mg tümör basina 100 ul tampon konsantrasyonunda homojenlestirildi. EnAd standartlari hazirlandi ve örnek 13'te ayrintili olarak açiklanan yöntemlere göre DNA ekstraksiyonu ve qPCR gerçeklestirildi. Rezeksiyon sonrasi 0 veya 7. günlerde tümör basina virüs genomlarinin sayisinin nicelendirilmesi, hem EnAd hem de NG- 135 için 7. günde toplam viral genomlarda bir artis gösterdi; ex vivo kültür süresince viral genom üretiminin devam ettigini düsündürdü. NG- 135 için veriler Sekil 35A'da gösterilmektedir.

Anti- insan [961 ile anti- VEGF antikoru ekspresyonunun analizi Homojenize edilmis tümör numuneleri veya qPCR için hazirlanmis temiz ortam numuneleri, anti- insan IgG1 ELISA ile antikor ekspresyonunun analizi için kullanildi.

Numuneler 1: 2 oraninda % 3 BSA / PBS % 0.05 Tween içine seyreltildi ve daha sonra Örnek 18'de detayli olarak açiklanan yöntemlere göre gerçeklestirildi. HCT- 116 tümörlerinde rezeksiyon noktasinda (gün 0) antikor tespit edilebildi, ancak 7 günlük ex vivo kültürün ardindan tümörler tarafindan üretilen saptanabilir antikor miktari belirgin sekilde artis gösterdi (Sekil 358). Anti- insan IgG1 ELlSA ile test edilen, NG- 135 ile IT enjeksiyonundan sonra 7. veya 14. günde alinan farelerden alinan serum, saptanabilir seviyelerde antikoru 14. günde gösterdi (Sekil 350).

Serumda veya EnAd ile tedavi edilmis farelerden alinan ex vivo kültür numunelerinde hiçbir antikor tespit edilemedi. Örnek 20: Akciger kanseri olan bir mürin ortotopik ksenograft modelinde NG- 135 virüs aktivitesinin karakterizasyonu A549 akciger karsinom hücreleri, intravenöz olarak CB17 SCID farelerine enjekte edildi ve tümörlerin, akcigerlerde gelismesine izin verildi. Enjeksiyondan 8 hafta sonra fareler gruplandi ve intravenöz uygulama yoluyla verilen 599 EnAd veya NG- 135 virüs partikülleri ile muamele edildi veya sadece PBS enjeksiyonu yapilarak muamele edilmemis sekilde birakildi. Akcigerler ve karacigerler, muameleden 3, 11, 18 veya 25 gün sonra farelerin hasat edildi (Sekil 36A). Her zaman noktasinda, akcigerde görünen herhangi bir tümör nodülü kesilerek çikartildi ve hem her akcigerden toplanan nodüller hem de geri kalan akciger dokulari hizla sivi azot içinde donduruldu. Akciger dokusu ve akciger tümörü nodülleri, A549 tümör yükü ve virüs genomlari için qPCR ile degerlendirildi. qPCR ile virüs genom replikasyonu veya A549 hücre yükünün analizi Kesilip çikartilmis akciger dokusu, tümör nodülleri veya karaciger dokulari, 1x haberci liziz tamponunda homojenize edildi. DNA, üreticinin protokolüne göre Sigma Genelute DNA ekstraksiyon kiti kullanilarak 10- 100 pl homojenize numunelerden ekstrakte edildi. Virüs genomunun replikasyonunu degerlendirmek için numuneler ve standart egriler hazirlandi ve örnek 13'te ayrintilandirilan yöntemlere göre analiz hücre) muamele edilmemis homojenize akciger dokusuna eklenmesi ve ardindan toplam DNA'nin Sigma Genelute DNA ekstraksiyon kiti kullanarak ekstrakte edilmesi ile standart bir egri hazirlanmistir. Çikarilan standartlar ve numuneler, bir insan prostaglandin E reseptörü (PTGER2) gen spesifik primer- prob seti ve Örnek 9'da ayrintili olarak anlatilan EnAd qPCR için kullanilan reaksiyon karisimi ve program kullanilarak A549 hücre yükü için qPCR ile analiz edildi. Muamele sonrasi 3. günde A549 tümör yükünün ölçülmesi, NG- 135 ile tedavi edilen ve PBS kontrol farelerinde benzer bir A549 tümör yükü gösterdi. Ancak, 25. günde, NG- 135 ile tedavi edilen farelerde tümör yükü, PBS kontrol grubuna göre belirgin derecede düsüktür (Sekil 368). Bireysel fare akcigerlerinde tümör yükünün kapsami, virüs replikasyonu ile korelasyon göstermistir (Sekil 360) ve virüs replikasyonunun bu seçiciligi, ayrica makroskopik olarak görünür tümör nodülleri tasimayan çevreleyen akciger dokulari ile karsilastirildiginda tümör nodüllerindeki saptanabilir virüs parçaciklarinda ~2 log artis göstermistir (Sekil 36D). Örnek 21: Yumurtalik kanseri olan murin ortotopik ksenograft modelinde NG- 135 ve EnAd aktivitesinin karsilastirilmasi Stabil olarak Iusiferaz eksprese eden SKOV- 3 yumurtalik karsinom hücreleri, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla bir fareye 5e6 hücre CB17- SClD farelerine implante edildi. Implantasyondan 22 gün sonra, farelere intraperitonal enjeksiyon yoluyla verilen ya PBS (kontrol) ya da 5e7 EnAd, NG- 135 veya NG- 78 virüsü partikülleri ile muamele edildi. Fareler, 32 mg lusiferinin intraperitonal enjeksiyonunu takiben bir IVIS görüntüleme kamerasi kullanilarak haftada iki kez görüntülendi. Bagil hafif birimler (RLU), tümör yükünün bir ölçümü olarak, farkli zaman noktalarinda ilgili bir sabit bölge açisindan belirlendi. Veriler, EnAd, NG- 135 ve NG- 78 virüslerinin, bu modeldeki tümör yükünü PBS kontrollerine kiyasla önemli ölçüde azalttigini göstermektedir (Sekil 37). Örnek 22: Bir biyoreaktörden alinan virüs malzemesinin artan üretimini ve saflastirilmasini takiben NG- 135 virüsünün ve eksprese edilmis anti- VEGF antikorunun karakterizasyonu.

HEK293 hücreleri, 5 L'lik bir karistirilmis tarik (cam kap) biyoreaktörü içinde 3 L'lik bir çalisma hacmine yayilmadan önce çalkalama siselerinde eritildi ve yayildi.

Biyoreaktör denetleyicisi, parametreleri 37 °C'ye, pH ayar noktasi 7. 4'e, çözünmüs oksijen (DO) 50'ye, hava akis hizi 100 mL / dakika'ya ve karistirma 100 rpm'e ayarlandi. Biyoreaktör sistemi dengelendikten sonra, 1. 5 L EX- CELL kültür ortaminin bir baslangiç hacmine, 5 x “IO5 hücre/mL canli hücre yogunlugundaki HEK293 hücreleri ekildi ve daha sonra 3 L'lik bir çalisma hacmine genisletildi ve hücreler uygun yogunluga eristikten sonra kültür, 50ppc'lik bir MOl'de NG- 135 ile enfekte edildi. Enfeksiyon sonrasi 48 saatte 3L kültür toplandi ve virüs, üretilen NG- 135 virüsünün önceden üretilmis EnAd virüsü ile karsilastirilabilecegi sekilde, EnAd virüsünün GMP üretimi için daha önce olusturulmus islemler (asagida özetlendi) tarafindan saflastirildi. Virüsün saflastirilmasina ilaveten, enfekte olmus hücreler tarafindan üretilen anti- VEGF antikorunu, bevacizumab klinik ürünü olan Avastin ile karsilastirmak üzere yapisal ve fonksiyonel analizlerin yapilmasina izin vermek için hücre kültürü ortamindan da arindirildi.

NG- 135 virüs saflastirmasi NG- 135 virüsü biyoreaktör hasadindan saflastirilmistir. Hasat edilen materyale, konakçi hücre DNA'sini parçalamak için Benzonase® ile muamele edildi ve daha sonra yogunlastirildi ve 500 kD içi bos elyaf zar kullanilarak tegetsel akis filtrasyonu (TFF) ile tampon degisimi yapildi. Bu asamada, normalde atilacak olan TFF süzüntüsü toplanmis ve anti- VEGF antikorunun saflastirilmasi için kullanilmistir (asagiya bakiniz). NG- 135 virüsünü ihtiva eden konsantre edilmis TFF tutulan materyali bir Sartobind anyon degisim kromatografi reçinesi kullanilarak NG- 135 virüsünün seçici olarak yakalanmasi ve elüsyonu ile saflastirilmistir. Saflastirilan virüsün daha sonra 50 mM Tris- HCI, 2 mM MgCIz, % 5 gliserol tamponu içine tampon degisimi yapildi, HPLC ile titre edildi ve - 80 derecede saklandi.

Saflastirilmis NG- 135 virüs yigini (NG- 135- BR1 olarak anilir) onkolitik aktivitesi (hücre yasayabilirlik tahlili ile degerlendirildi), virüs replikasyonu (qPCR ile degerlendirildi) ve antikor ekspresyonu (ELISA ile degerlendirildi), EnAd veya önceden karakterize edilmis NG- 135 referans malzemesi ile karsilastirildi.

EnAd ile karsilastirmali olarak onkolitik potensin degerlendirilmesi için, Örnek 15'te detaylandirilan yöntemlere göre bir hücre canliligi testi gerçeklestirildi. Saflastirilmis NG- 135- BR1, üretilmis EnAd referans materyali için benzer potens göstermistir (Sekil 38A).

Virüs replikasyonu veya antikor ekspresyonunun degerlendirilmesi için, HT- 29 hücreleri 1e6 hücre/oyuk yogunlugunda 12 oyuklu kültür plakalarina tohumlandi, qPCR için DNA, örnek 18'de ayrintili olarak verilen yöntemlere göre hem hücresel lizatlardan hem de süpernatantlardan enfeksiyon sonrasi 24, 48 veya 72. saatte hasat edildi. Çikarilan DNA numuneleri, Örnek 9'da detayli olarak verilen yöntemlere göre bir EnAd E3 genine özgü primer- prob seti kullanilarak qPCR vasitasi ile EnAd standartlarina karsi analiz edildi. Enfeksiyon süresince saptanan toplam virüs genomlari, test edilen tüm virüsler için aynidir (Sekil 38B).

Anti- VEGF antikoru ekspresyonunun degerlendirilmesi için berraklastirilmis enfeksiyon süpernatantlari PBS /% 3 BSA /% 0.05 Tween 20'ye seyreltildi, daha sonra Örnek 18'de ayrintilariyla verilen yöntemlere göre bir bevacizumab standart egrisine karsi ELISA ile analiz edildi. Antikor konsantrasyonu, standart egriden interpolasyon yoluyla belirlendi (Sekil 380).

Anti- VEGF Antikor Safiastirmasi Anti- VEGF monoklonal antikoru ihtiva eden toplanmis TFF süzüntüsü konsantre edildi ve tampon, 30kD içi bos elyaf zara sahip ikinci bir TFF adimi kullanilarak Protein A diyafiltrasyon tamponuna ( degistirildi. Konsantre edilmis antikor, bir AKTA saflastirici sistem üzerinde bir 1 ml Protein A sütununa sahip Protein A kromatografisi ile saflastirilmistir. Ayrilan antikor fraksiyonu, bir Amicon Ultra 50kD yogunlastirici kullanilarak konsantre edildi ve tampon, bir PD10 kolonu kullanilarak bir saklama tamponuna (50 mM Tris- HCI, % 5 gliserol, pH 7.0) degistirildi. Saflastirilmis antikor konsantrasyonu 0.15 mg / ml olarak OD- ile belirlendi ve saflik SDS- PAGE ile teyit edildi.

Saflastirilmis anti- VEGF antikorunun karakterizasyonu Indirgenmemis veya indirgenmis SDS- PAGE'yi takiben, saflastirilmis anti- VEGF antikorunun yapisi, western blot vasitasi ile klinik Avastin ile karsilastirildi ve antikorun VEGF'ye afinitesi Biacore tarafindan degerlendirildi. Western blot için NuPAGE LDS numune tamponu içinde 7. 5 ug/ml Avastin veya 6 ug/ml saflastirilmis antikor ürünü hazirlandi. Jelleri azaltmak için, tüm numuneler 10 dakika boyunca, 70 °C'de isitilmadan önce her numuneye NUPAGE indirgeme ajani ilave edildi. Üreticinin protokolüne göre % 4- 12 Bis- Tris NuPAGE jelleri kullanilarak SDS- PAGE gerçeklestirildi. Proteinler, Xcell II Blot Modülü kullanilarak western blot ile PVDF zarlarina aktarildi. Bloke etme ve imünoblotlama, % 5 süt tozu ile takviye edilmis PBS % 0.1 Tween- 20 içinde gerçeklestirildi. Anti- VEGF antikorlari, HRP konjüge edilmis poliklonal anti- insan IgG (Promega, W4031) kullanilarak tespit edildi.

Proteinler gelismis kemilüminesans (ECL) ile görsellestirildi. NG- 135 virüs üretim sürecinden üretilen saflastirilmis anti- VEGF antikoru, Avastin olarak indirgenmemis ve indirgenmis lekeler üzerinde karsilastirilabilir tespit edilebilir protein bantlari gösterdi (Sekil 38D).

Saflastirilmis antikor maddesinin VEGF baglanma afinitesinin Avastin'le karsilastirmali analizi için, bu malzeme onaylanmis bir VEGF- baglama Biacore testi (BioOutsource tarafindan gerçeklestirilmistir, Ingiltere) kullanilarak analiz edildi.

Tanimlanan deney protokolünü takiben kinetik analiz (Biacore T200 Degerlendirme Yazilimi), saflastirilmis anti- VEGF antikor numunesinin, Avastin referans standart materyaline benzer kinetik ve afinite ile VEGF165'i baglayabildigini göstermistir (Sekil 38E). Örnek 23: Kendiliginden bölünebilir bir P2A peptidi (NG- 165) ile baglanan anti- VEGF monoklonal antikor Zincirlerini kodlayan EnAd virüslerinin üretilmesi ve karakterizasyonu pEnAd2. 4 plasmidi (SEK ID NO: 64), L5 ve E4 genleri arasinda bulunan pEnAd2. 4 benzersiz kisitlama bölgeleri arasina bir anti- VEGF antikorunu kodlayan bir transgen kasedini dogrudan ekleyerek pNG- plazmidini üretmek için kullanildi. PNG- 165 transgen kaseti, bir anti- VEGF VH zincir sekansinin (SEK lD NO: 29), bir antikor sabit agir zincir sekansinin (SEK ID NO: 33), bir yüksek kendi kendine bölünme verimliligine sahip bir P2A peptit sekansinin (SEK ID NO: 25), bir anti- VEGF VL zincir sekansinin (SEK ID NO: 31) ve bir antikor sabit hafif zincir sekansinin (SEK lD NO: 35) eklenmesi ile bir anti- VEGF antikorunu kodlar. Antikor kodlama dizisi, bir 5' kisa ek yeri alici dizisi (SEK ID NO: 16) ve bir 3' poliadenilasyon dizisi (SEK ID NO: 20) ile çevrelenmistir. Eklenen transgen kasetinin bir semasi Sekil 34'te gösterilmektedir. Plazmitin yapisi, DNA dizilimi ile teyit edildi.

Virüs Üretimi NG- 165 virüsü, Örnek 8'de ayrintilandirilan NG- 135 virüsünün saflastirilmasi için kullanilan yöntemlere göre çogaltildi ve saflastirildi.

Virüs Karakterizasyonu NG- 165 onkolitik aktivitesi (hücre canliligi testi ile degerlendirildi), virüs replikasyonu (qPCR ile degerlendirildi) ve anti- VEGF antikoru ekspresyonu (ELlSA'lar ile degerlendirildi), kolon karsinom hücrelerinde EnAd veya NG- 135 ile karsilastirildi.

EnAd ile karsilastirmali olarak onkolitik potensin degerlendirilmesi için, Örnek 15'te detaylandirilan yöntemlere göre bir hücre canliligi testi gerçeklestirildi. NG- 165 virüsü, üretilmis EnAd referans materyali ile benzer potens gösterdi (Sekil 39A).

Virüs replikasyonu veya antikor ekspresyonunun degerlendirilmesi için, HT- 29 hücreleri 1e6 hücre/oyuk yogunlugunda 12 oyuklu kültür plakalarina tohumlandi, edildi. qPCR için DNA, örnek 18'de ayrintili olarak verilen yöntemlere göre hem hücresel lizatlardan hem de süpernatantlardan enfeksiyon sonrasi 24, 48 veya 72. saatte hasat edildi. Çikarilan DNA numuneleri, Örnek 9'de detayli olarak verilen yöntemlere göre bir EnAd E3 genine özgü primer- prob seti kullanilarak qPCR vasitasi ile analiz edildi. Enfeksiyon süresi zarfinda NG- 165 için tespit edilen toplam virüs genomlari, EnAd referans virüsüne benzerdi (Sekil 39B).

Anti- VEGF antikoru ekspresyonunun degerlendirilmesi için berraklastirilmis enfeksiyon süpernatantlari enfeksiyondan 24, 48 ya da 72 saat sonra PBS /% 3 BSA /% 0.05 Tween 20'ye seyreltildi, daha sonra Örnek 18'de ayrintilariyla verilen yöntemlere göre bir bevacizumab standart egrisine kullanilarak IgG1 ELISA ile analiz edildi. IgG1 antikorunun konsantrasyonu standart egrinin interpolasyonu ile belirlendi ve NG- 165'in NG- 135 referans virüsüne benzer seviyelerde IgG1 eksprese ettigini gösterdi (Sekil 39C). Örnek 24: Endojen veya egzojen promotörlerin kontrolü altinda anti- VEGF ScFv'leri kodlayan EnAd virüslerinin karakterizasyonu Daha önce örnek 8 ve 11'de tarif edilen NG- 76 ve NG- 78 virüsleri, kolon karsinom hücrelerindeki (hücre yasayabilirlik tahlili ile degerlendirildi) onkolitik aktiviteleri ve fonksiyonel anti- VEGF ScFv proteininin ekspresyonu (VEGF baglayici ELlSA ile degerlendirildi) açisindan da karakterize edildi. EnAd ile karsilastirmali olarak onkolitik potensin degerlendirilmesi için, Örnek 15'te detaylandirilan yöntemlere göre hücre canliligi analizleri gerçeklestirildi. Hem NG- 76 hem de NG- 78, üretilmis EnAd referans materyali için benzer onkolitik potens göstermistir (Sekil 40A ve 408).

NG- 76 için, bir egzojen (CMV) promotör altinda eksprese edilen anti- VEGF scFv'nin baglanma aktivitesi, örnek 12'de açiklanmaktadir. NG- 78 için, Endojen virüs büyük geç promotöründen eksprese edilen anti- VEGF scFv'nin baglanma aktivitesi, dogrudan VEGF baglayici ELlSA ile veya VEGF baglanmasi açisindan rekabet etmek üzere bevacizumab klinik ürününün dahil edildigi bir ELlSA ile degerlendirildi.

Her iki ELISA için 293F hücreler 50ppc NG- 78 virüsüyle enfekte edildi ve 70 saat süreyle kültürlendi. Hücreler ve ortam, siseden toplandi ve Süpernatant ve hücreler, 1000 rpm'de 10 dakika santrifüjle ayrildi. Süpernatant toplandi ve kalan hücrelerin pelletleri, hücreleri çözmek için 3 dondurma- çözme döngüsünü gerçeklestirmeden önce 1 ml hücre ortaminda tekrar süspanse edildi. Çözülmeden sonra, hücre artigi ve ortam, ikinci bir santrifüjleme basamagi ile ayrildi ve lizattan gelen Süpernatant toplandi. Süpernatantlar veya Iisatlar, % 3 BSA/PBS % 0.05 tween içinde ile 12 oraninda seyreltildi. Dogrudan baglanan ELISA için, numuneler daha sonra en düsük seyrelme 1024'te 1 olacak sekilde seri olarak seyreltildi. Rekabetçi ELlSA için, numunelere, 0, 0.05, 0. 5 ya da 5ug/ml konsantrasyonlarinda bevacizumab ilave edildi. ELISA plakalari, VEGF ile kaplandi, bloke edildi ve örnek 7'de ayrintili olarak verilen yöntemlere göre yikandi. Numuneler, 100 ul/oyuk olarak plakalara ilave edildi ve 1 saat boyunca VEGF'ye baglandi, ScFv, HRP- konjuge poliklonal anti- His (Abcam ab1187) kullanilarak tespit edildi ve ardindan TMB tespiti yapildi. Emilim, bir plak okuyucu üzerinde 450 nm'de okundu ve arka planda çikarilmis emilim, numunelerin VEGF'ye (Sekil 4OC) dogrudan baglanmasi ve artmakta olan bevacizumab konsantrasyonlarinin (Sekil 40D) varliginda dogrudan baglanmasi için çizildi. Daha önce NG- 76 için gösterildigi gibi, VEGF165'e spesifik olarak baglanan islevsel anti- VEGF ScFv, NG- 78 ile enfekte olmus hücrelerden eksprese edilebilir ve salgilanabilir. Örnek 25. Tümör tasiyan farelerde EnAd ile karsilastirilan NG- 76 virüs aktivitesinin karakterizasyonu DLD kolon karsinom hücreleri, CD1 nu/nu farelerine subkütan bir ksenograft olarak implante edildi. Tümörler “100mm3 ulastiginda, fareler gruplandirilmis ve bir tekli tümör içi enjeksiyon yoluyla verilen 5e9 EnAd veya NG- 76 virüs partikülleri ile muamele edilmistir. Her çalismaya, bir grup enfekte edilmemis kontrol faresi de dahil edilmistir. Tedaviden sonra 7. gün DLD tümörleri kesilerek çikartildi ve (qPCR ile) virüs replikasyonu ve virüs veya anti- VEGF ScFv gen ekspresyonu (RTqPCR ile) açisindan degerlendirildi. qPCR ile virüs genom replikasyonu analizi Kesilerek çikartilan tümörler tartildi, homojen hale getirildi ve Örnek 13'te detaylariyla verilen yöntemlere göre DNA özütlendi. Çikarilan numuneler ve standartlar, Örnek 9'de detaylandirilan qPCR yöntemlerine göre bir EnAd E3 genine özgü primer- prob seti kullanilarak qPCR ile analiz edildi. Tümör basina virüs genomlarinin sayisinin nicelendirilmesi tedavi sonrasi 7. gün DLD tümörleri için gösterildi ve NG- 76 ve EnAd'in girdinin üstünde önemli virüs replikasyonuna sahip oldugunu gösterir (Sekil 41A).

RTqPCR ile viral (hekzon) veya anti- VEGF ScFv antikoru gen ekspresyonunun CDNA, keserek çikartilan tümörlerin RNA'sindan örnek 13'te detaylariyla verilen yöntemlere göre hazirlandi. qPCR tarafindan tespit edilen CDNA kopyalarinin sayisinin nicelendirilmesi, tedavi sonrasi 7. günde NG- 76 veya EnAd ile tedavi edilen DLD tümörlerinde virüs geç geni, hekzonun karsilastirilabilir ekspresyonunu gösterdi (Sekil 41A). Aksine, anti- VEGF ScFv antikor geni ekspresyonu, sadece NG- 76 virüsü ile muamele edilen DLD hücrelerinde tespit edildi (Sekil 41C). ve NG- 107) kullanilarak virüs kodlamali transgenlerin hücrelerinde veya tümörlerinde ekspresyon seçiciligi NG- 135 antikor ekspresyonu virüs replikasyonuna baglidir.

NG- 135 virüsündeki anti- VEGF antikor kaseti, EnAd endojen Büyük Geç Promotörün (MLP) kontrolü altinda kodlanir. Adenovirüs enfeksiyonu esnasinda, büyük geç promotere ait gen ekspresyonunun çogunlugunun virüs replikasyonuna bagli oldugu önceden karakterize edilmistir. EnAd MLP tarafindan kontrol edildiginde antikor ekspresyonunun da virüs replikasyonuna bagli oldugunu göstermek için, NG- ve antikor ekspresyonu (ELISA ile degerlendirildi), farkli MOI'lerde karsilastirildi.

HT- 29 kolon karsinoma hücreleri, 6 oyuklu plakalara 2e6 hücre /oyuk olan bir hücre virüsüyle enfekte edildi.

Anti- VEGF antikoru ekspresyonunun degerlendirilmesi için berraklastirilmis enfeksiyon süpematantlari enfeksiyondan 24, 48 ya da 72 saat sonra PBS /% 3 BSA /% 0.05 Tween 20'ye seyreltildi, daha sonra Örnek 9'da ayrintilariyla verilen yöntemlere göre anti- VEGF baglayici ELISA ile analiz edildi. Antikor konsantrasyonu, standart egriden interpolasyon yoluyla belirlendi. qPCR ile virüs replikasyonunun analizi için örnek 9'de ayrintili olarak verilen yöntemlere göre hem hücresel lizatlardan hem de süpernatantlardan enfeksiyon 24, 48 veya 72 saat sonra DNA hasat edildi. Çikarilan DNA numuneleri, Örnek 9'da detayli olarak verilen yöntemlere göre bir EnAd E3 genine özgü primer- prob seti kullanilarak qPCR vasitasi ile analiz edildi. Enfeksiyondan 72 saat sonra antikor ekspresyonunun analizi, test edilen tüm MOI'ler için saptanabilir salgilanan antikor gösterir, ancak antikor ekspresyon seviyesi, giris MOl'sine baglidir (Sekil 42A).

Antikor ekspresyonunun kinetikleri, enfeksiyon süresi boyunca antikor ekspresyonu artislari gösterir, ancak tespit edilebilir antikor ekspresyonu girdinin üstünde belirgin bir virüs replikasyon seviyesiyle iliskilidir (Sekil 428 ve 420).

Karsinomda, stromal fibroblast ve primer hücreler NG- 135 antikor ekspresyonu NG- 135 enfeksiyonuna ve virüs replikasyonuna olanak taniyan hücrelerde antikorun seçimli olarak eksprese edildigini onaylamak için NG- 135 virüs replikasyonu (qPCR ile degerlendirildi), antikor ekspresyonu (ELISA ile degerlendirildi) ve bulasici virüs partikülleri üretme kabiliyeti (yeniden- enfeksiyon analizi ile degerlendirildi), EnAd enfeksiyonuna müsaade ettigi bilinen kanser hücrelerinde (HT- 29) ve önceden, buna müsaade etmeyen olarak karakterize edilmis fibroblast hücrelerinde (WI- 38 ve MRC- ) belirlendi. Kisaca, hücreler, 12 gözlü plakalara ekildi ve enfeksiyon ortami hücrelerden çikartilmadan ve kültür ortami ile yer degistirmeden önce 4 saat boyunca 100 ppc NG- 135 virüsü ile tohumlamanin ardindan 18 saat süresince enfekte edildi. 4 saatlik enfeksiyon periyodundan sonra 1. saatte veya 72. saatte, hücre süpernatantlari ve lizatlari örnek 18'de ayrintili olarak verilen yöntemlere göre plakalardan hasat edilmistir. qPCR için, DNA çikartilmis ve numuneler, Örnek 9'da detayli olarak verilen yöntemlere göre bir EnAd E3 genine özgü primer- prob seti kullanilarak analiz edilmistir. Anti- VEGF antikoru ekspresyonunun degerlendirilmesi için berraklastirilmis enfeksiyon süpernatantlari enfeksiyondan sonra PBS /% 3 BSA /% 0.05 Tween 20 içinde seyreltildi, daha sonra Örnek 18'de ayrintilariyla verilen yöntemlere göre ELlSA ile analiz edildi.

Enfeksiyonlu virüs partikülünün degerlendirilmesi için toplanan süpernatantlar düzgün biçimde 10 kere seri olarak seyreltilmis ve 96 gözlü plakalarda 3e4 hücre / oyuk yogunlugunda tohumlanmis HT- 29 hücrelerinin taze kültürlerini tekrar enfekte etmek için kullanilmistir. Ortam, enfeksiyondan 72 saat sonra plakalardan çikartildi ve hücreler oda sicakliginda Me: Ac ile 10 dakika süreyle sabitlendi. Oyuklar daha sonra PBS ile yikandi ve hücreler, tavsan anti- hekzon birincil antikoru (800'de 1 seyreltilmis), daha sonra ikincil HRP- çiftli anti- tavsan saptama antikoru ile inkübasyon yoluyla EnAd kapsid proteini ekspresyonu için boyandi. Hekzon proteini, DAB substratinin eklenmesi ve isik mikroskopisi kullanilan görüntüleme yoluyla görsellestirildi. Enfeksiyonlu titre (TClDSO / ml), pozitif kapsid protein boyamasi içeren tüm oyuklarin sayilmasi ile belirlendi.

Veri analizi, yalnizca HT- 29 hücrelerinin, enfeksiyon giris seviyelerinin üstünde NG- 135 virüs replikasyonu gösterdigini (Sekil 43A) veya tespit edilebilir antikor ekspresyonu gösterdigini (Sekil 43B) ortaya koymustur. IgG1 ELlSA testi hassasiyet bilgisini kullanarak, tümör olmayan hücreler tarafindan saptanabilir antikor ekspresyonunun olmamasi, bu hücrelerin, HT- 29 tümör hücreleri için 24 saatte 100 fg/hücre'nin üzerindeki seviyelerle karsilastirildiginda 24 saatte 0. 33 fg'den az hücre ürettigini gösterir. Bu veriler, HT- 29 tümör hücrelerindeki bulasici virüs partiküllerinin yaygin olarak üretilmesi ile baglantiliydi, ancak fibroblast hücre hatlarinda virüs üretimi tespit edilemedi (Sekil 430).

Birinci] bagisiklik hücrelerinde transgenlerin seçici ekspresyonu Birincil dogal immün hücrelerdeki transgenlerin seçici ekspresyonu, sirasiyla bir egzojen (CMV) promotörün veya endojen MLP'nin kontrolü altinda, haberci geri eGFP'yi eksprese eden EnAd virüsleri NG- 47 ve NG- 107 için karakterize edildi. NG- 47 ve NG- 107 virüs karakterizasyonu, örnek 14'te detaylandirilmistir.

Monositler, tam kandan izole edildi ve örnek 28'de ayrintilariyla verilen yöntemlere göre dendritik hücrelere farklilasmasi için kültürlendi. Kültürün 5. gününde farklilasmis monosit türevi dendritik hücreler, 96 oyuklu plakalara ekildi ve 200 ppc EnAd, NG- 47 veya NG- 107'ye maruz birakildi veya muamele edilmemis olarak birakildi. 48 saat sonra hücreler oyuklardan toplandi, yikandi ve PE / Cy5 konjüge anti- CD83 antikoru (CD83- PE / Cy5 (BioLegend)) ile etiketlendi. DC'ler üzerindeki CD83 ve eGFP ekspresyonu, akis sitometrisi (Applied Biosystems) ile degerlendirildi ve veriler FlowJo yazilimi kullanilarak analiz edildi. GFP ekspresyonu ancak, eGFP ekspresyonunun, gen ekspresyonu için viral replikasyona bagimli olmayan egzojen CMV promotörünün altinda oldugu durumda, NG- 47'ye maruz birakilan hücrelerde tespit edilebilir (Sekil 44).

In vivo modellerde transgenlerin seçici ekspresyonu Transgen ekspresyonunun seçiciligini in vivo, olarak arastirmak için EnAd virüs replikasyonuna izin vermedigi bilinen mürin karsinoma hücre tümörlerinde transgen ekspresyonunu belirlemek için haberci virüsler kullanilmistir. Transgen ekspresyonu ve transgene, virüse veya tümöre karsi fonksiyonel bagisiklik yaniti, burada transgen ekspresyonu, ya bir egzojen (CMV) promotörü ya da endojen MLP'nin kontrolü altinda oldugunda degerlendirilir.

Lüminesan proteini, Iusiferazi eksprese eden haberci virüsler NG- 61 ve NG- 63 daha önce tarif edilmis ve Örnek 14`te karakterize edilmistir. BALB / c farelerine 'lessiçan kolon karsinom hücreleri (CT26) deri altindan bögürlerine implante edilmistir. Bir kez yaklasik 100mm3 ortalama boyutuna ulasildiginda, tümörlere ya NG- 61 ya da NG- 63'ten 2. 5e9parçacik enjekte edildi. Fareler 32 mg lusiferinin intraperitoneal enjeksiyonundan sonra bir lVIS görüntüleme kamerasi kullanilarak muamele sonrasi 14 gün boyunca düzenli olarak görüntülendi. Sabit bir boyuta sahip söz konusu bölgeler, her bir tümör için bagil isik ünitelerinin (RLU) ölçülmesine izin vermek için tümörlerin etrafina çekildi. Tedavi edilmeyen tümörlü fareler de görüntüleme arka planini belirlemek için görüntülendi. Tedavi gruplari boyunca transgen ekspresyonunun nicelendirilmesi, Iusiferazin yalnizca NG- 61 virüsü ile tedavi edilen tümörlerde saptanabildigini göstermistir (Sekil 45A), burada lusiferaz egzojen CMV promotörünün kontrolü altindadir. Tedavi sonrasi 14. günde fareler rezeke edildi ve ayrildi. Bir anti- interferon gama antikoru PVDF plakalarina immobilize edildi.

Splenositler ve uyaranlar, ya EnAd virüsü, CT26 hücre lizatlari ya da tripsinle sindirilmis rekombinan Iüsiferaz proteini, PVDF plakalarina ilave edildi ve gece boyunca inkübe edildi. Plakalar daha sonra yikandi ve tekrar yikanmadan önce bir biyotin etiketli anti- interferon gama antikoru ile yikandi ve inkübe edildi ve bir streptavidin- ALP konjügati ile inkübe edildi. Plakalar daha sonra yikandi, BClP / NBT substrati eklendi ve daha sonra plakalar, belirgin noktalar görülebilene kadar gelismeye birakildi. Plakalar tekrar yikandi ve daha sonra, CTL Europe'ta (Almanya) analiz gerçeklestirilmeden önce kurutuldu. Nicemleme, NG- 61 ile muamele edilmis farelerden gelen splenositlerin lusiferaz transgenine karsi spesifik tepkiler gösterdigi, ancak NG- 63 ile muamele edilmis farelerden splenositlerin göstermedigini ortaya çikarmistir (Sekil 458). Bu sonuç, NG- 61 ile muamele edilmis farelerde hem EnAd virüsü hem de CT26 tümör hücrelerine karsi artan tepkilerle baglantilidir (Sekil 450 ve 45D). Örnek 27: Bagisiklik kontrol noktasi inhibitörü yol protein PD- L1'e karsi antikorlari (NG- 190, NG- 177) ya da ScFv antikor varyantlarini (NG- 221) kodlayan EnAd virüslerinin üretimi ve karakterizasyonu pEnAd2. 4 plasmidi (SEK lD NO: 64), L5 ve E4 genleri arasinda bulunan benzersiz kisitlama bölgelerine, ya anti- PD- L1 antikorunu (YW243) ya da YW243 antikorunun anti- PD- L1 ScFv'sini kodlayan transgen kasetlerinin dogrudan yerlestirilmesi ile pNG- plazmitlerini üretmek için kullanilmistir. pNG- 177 transgen kaseti, bir anti- PD- L1 VH zincir sekansinin (SEK ID NO: 30), bir antikor sabit agir zincir sekansinin (SEK ID NO: 34), bir iç ribozom giris sekansinin (SEK lD NO: 19), bir anti- PD- L1 VL zincir sekansinin (SEK lD NO: 32) ve bir antikor sabit hafif zincir sekansinin (SEK lD NO: 35) dahil edilmesiyle bir anti- PD- L1 antikorunu kodlar. pNG- 190 transgen kaseti, bir anti- PD- L1 VH zincir sekansinin (SEK ID NO: ), bir antikor sabit agir zincir sekansinin (SEK ID NO: 34), bir yüksek kendi kendine bölünme verimliligine sahip bir P2A peptit sekansinin (SEK ID NO: 25), bir anti- PD- L1 VL zincir sekansinin (SEK lD NO: 32) ve bir antikor sabit hafif zincir sekansinin (SEK lD NO: 35) dahil edilmesi ile bir anti- PD- L1 antikorunu kodlar. PNG- 221 transgen kaseti, bir anti- PD- L1 ScFv'yi kodlar (SEK lD NO: 37). Antikor ya da ScFv kodlama sekanslari, bir 5' kisa ek yeri alici sekansi (SEK ID NO: 16) ve bir 3' poliadenilasyon sekansi (SEK lD NO: 20) ile Çevrelenmistir. Eklenen transgen kasetlerinin sematikleri, Sekil 34'te gösterilmektedir. Plazmidlerin yapisi DNA dizilimi ile teyit edildi.

Virüs Üretimi saflastirilmasi için kullanilan yöntemlere göre çogaltildi ve saflastirildi.

Virüs Karakterizasyonu Kolon karsinom hücrelerinde (ELlSA ile degerlendirildi), NG- 190 ve NG- 221 onkolitik aktivitesi (hücre canliligi tayini ile degerlendirildi), virüs replikasyonu (qPCR ile degerlendirildi) ve anti- PD- L1 antikoru veya ScFv ekspresyonu, ya EnAd referans virüsü ile ya da daha önce karakterize edilen ve anti- VEGF antikoru eksprese eden NG- 165, NG- 135 virüsleri ile karsilastirildi. EnAd ile karsilastirmali olarak onkolitik potensin degerlendirilmesi için, Örnek 15'te detaylandirilan yöntemlere göre bir hücre canliligi testi gerçeklestirildi. NG- 190 ve NG- 221 virüsleri, EnAd'a benzer bir onkolitik aktivite gösterdi (Sekil 46A, B).

Virüs replikasyonu veya antikor ekspresyonunun degerlendirilmesi için, HT- 29 hücreleri 1e6 hücre/oyuk yogunlugunda 12 oyuklu kültür plakalarina tohumlandi ve edildi. qPCR için DNA, örnek 18'de ayrintili olarak verilen yöntemlere göre hem hücresel lizatlardan hem de süpernatantlardan enfeksiyon sonrasi 24, 48 veya 72. saatte hasat edildi. Çikarilan DNA numuneleri, Örnek 9'da detayli olarak verilen yöntemlere göre bir EnAd E3 genine özgü primer- prob seti kullanilarak qPCR edilen toplam virüs genomlari, EnAd referans virüsü ile enfeksiyon zamani boyunca benzerdi.

NG- 190 veya NG- 165 ile enfekte edilmis hücrelerden salgilanmis antikor ekspresyonunun degerlendirilmesi için enfeksiyondan 24, 48 veya 72 saat sonra hasat edilen berraklasmis enfeksiyon süpernatantlari, PBS /% 3 BSA /% 0.05 Tween 'de seyreltildi ve daha sonra Örnek 18'de detayli olarak verilen yöntemlere göre anti- insan IgG1 ELlSA ile saflastirildi. Benzer sekilde, NG- 177 veya NG- 135 ile enfekte olmus hücrelerden salgilanmis antikor ekspresyonu, enfeksiyondan 72 saat sonra berraklasmis süpernatantlarda degerlendirildi. Numunelerdeki antikor konsantrasyonu analiz standart egrisinden interpolasyon yoluyla tespit edildi ve tespit edilebilir antikorun, NG- 165 karsilastirici virüsüne nazaran NG- 190 ile enfekte olmus hücrelerden karsilastirilabilir seviyelerde salgilandigini (Sekil 47A) ve NG- 135 karsilastirici virüsüne nazaran NG- 177 ile enfekte olmus hücrelerden karsilastirilabilir seviyelerde salgilandigini (Sekil 49A) gösterdi. enfekte hücrelerden eksprese edilen ScFv'nin karakterizasyonu PD- L1 Dogrudan Baglanma Deneyi NG- 190 ve NG- 221 ile enfekte olmus hücrelerden eksprese edilen antikorun veya ScFv'in anti- PD- L1 baglanma aktivitesi, dogrudan PD- L1 baglayici ELISA ile degerlendirildi. 165 ile 72 saat enfekte edildi. Kültür süpernatantlari hasat edildi ve hücre artiklarini gidermek üzere 5 dakika boyunca 300 g'de konsantre edildi. Kültür süpernatantlari daha sonra 9K MWCO protein yogunlastirici spin sütununda (Pierce, 87748) 20 dakika boyunca 4000 g'de santrifüje edilerek 10 kat konsantre hale getirildi. ELISA plakalari (NunC Immuno MaxiSorp 96 oyuklu mikroplakalar) gece boyunca 4 r”C'de Plakalar üç kez PBS- % 0.05 Tween- 20 ile yikandi, daha sonra PBS /% 3 BSA /% 0.05 Tween 20 ile bloke edildi. Konsantre süpernatantlarin seri çift katli seyreltmeleri hazirlandi, daha sonra ELISA plakasina eklendi ve 1 saat oda sicakliginda inkübe yikandi, daha sonra 50 pl 1/8000 Anti- Kappa hafif zincir antikoru (Abcam, ab124727) tüm oyuklara ilave edildi. 1 saat inkübasyondan ve yikamadan sonra, Keçi Anti- Tavsan lgG H & L (HRP) (Abcam, ab6721) kullanilarak ikincil tespit gerçeklestirildi. Plaka daha sonra 50ul / oyuklu 1 Adimli Ultra TMB- ELlSA Substrat HCl'nin eklenmesi ile durduruldu ve 450 nm'de absorbans ölçüldü ve çizildi. Anti- PD- L1 baglanma aktivitesi, NG- 190 ile enfekte edilmis A549 hücrelerinin süpernatantlarinda spesifik olarak tespit edilebildi, ancak NG- 165 ile enfekte edilmis A549 hücrelerinde tespit edilemedi (Sekil 47B).

NG- 221 numuneleri için plakalar üç kez PBS- % 0.05 Tween- 20 ile yikandi, daha sonra 50 pl oda sicakliginda 1 saat süreyle tüm oyuklara ilave edildi ve daha sonra yikandi. Plaka, 50ul 1 Adimli Ultra TMB- ELISA Substrat Çözeltisi (termo, 34028) ilave edilerek gelistirildi. 20 dakika sonra reaksiyon, 50 pl 1M HCl'nin eklenmesi ile durduruldu ve 450 nm'de absorbans ölçüldü. ScFv Anti- PD- L1 baglanma aktivitesi, NG- 221 süpernatanlarinda spesifik olarak tespit edilebilir (Sekil 47C).

PD- L1 Reseptör baglanma inhibisyonu tahlili NG- 190 veya NG- 177 ile enfekte edilmis hücrelerin süpernatanti içerisinde eksprese edilen anti- PD- L1 antikorunun bloke edici aktivitesi bir PD- L1 Iigandi: PD- 1 reseptör etkilesim tahlili ile degerlendirildi. süpernatantlari, hasat edildi ve yukaridaki detayli olarak açiklanan yönteme göre konsantre edildi. ELISA plakalari gece boyunca 4 °C'de PDL1- Fc (2 pg/ml, R&D Systems, 156- B7- 100) ile kaplandi. Plakalar üç kez PBS ile yikandi, daha sonra oda sicakliginda bir saat boyunca PBS /% 3 BSA /% 0.05 Tween 20 ile bloke edildi.

Konsantre süpernatantlarin seri ikiye katlanmis seyreltmeleri PBS içinde hazirlandi, daha sonra her seyreltiden 45ul ELlSA plakasina eklendi. 10 ng rekombinant PD1- Fc (R&D Systems, 1086- PD- 050) her oyuga eklendi ve plaka 1 saat süreyle inkübe edildi. Daha sonra bütün oyuklar PBS /% 0.05 Tween 20 ile üç kez yikandi ve PBS /% 3 BSA /% 0.05 Tween 20 ile 10 dakika bloke edildi. Daha sonra, insan PD- 1 (R & D Systems, BAF1086) için biyotinlenmis afinitesi saflastirilmis antikor, 1 saat süresince O. 4ug/ml'de oyuklara ilave edildi. 1 saat boyunca 1: 200 oraninda streptavidin- HRP (R & D Systems, DY998) dilüsyonunun eklenmesinden önce oyuklar üç kez PBS /% 0.05 Tween 20 ile yikandi. Plaka, 50ul 1 Adimli Ultra TMB- ELISA Substrat Çözeltisi (termo, 34028) ilave edilerek gelistirildi. 20 dakika sonra reaksiyon, 50 pl 1M HCl'nin eklenmesi ile durduruldu ve 450 nm'de absorbans ölçüldü. PD- 1 baglanma yüzdesini belirlemek için, ölçülen absorbans degerleri, anti- PD- L1 antikoru içermeyen kontrol numunelerinin bir yüzdesi olarak ifade edildi. NG- 190 ile enfekte olmus hücrelerden salgilanan anti- PD- L1 antikoru, doza bagimli bir sekilde PD- 1 reseptör baglanmasini inhibe edebildi (Sekil 47D). Benzer sekilde, NG- 135 ile enfekte olmus hücrelerden gelen degil, NG- 177 ile enfekte olmus hücrelerden gelen düzgün süpernatant, PD- 1 reseptörünün PD- L1'e % 50'den daha fazla baglanmasini engelleyebildi.

Karisik Lenfosit reaksiyonu (MLR) NG- 190 veya NG- 177 ile enfekte edilmis hücrelerin süpernatanti içerisinde eksprese edilen anti- PD- L1 antikorunun fonksiyonel aktivitesi, karisik bir lenfosit reaksiyonunda T hücresi aktivasyonunun derecesi ile degerlendirildi. Periferik Kan Mononükleer Hücreleri (PBMC'ler) taze insan kanindan (Clinical Trials Laboratory Services) 1: 2 oraninda seyreltilmis kanin 13 mI'Iik Ficoll- Paque Plus (GE saglik edildi. CD14+ monositleri, üreticinin protokolüne göre insan CD14 Microbeads glutamin (GE Healthcare: M11- 003), 1 mM Sodyum piruvat (GE Healthcare: 811- pen/strep (GE Healthcare: P11- , kültürlendi. Kültürler, kültür hacminin yarisi taze ortam ile degistirilerek her 2 günde bir beslendi.

Monosit türevi dendritik hücreler, kültürün 5. gününde 24 saat boyunca 1 ug/ml LPS (Sigma- Aldrich, L2654) eklenmesiyle olgunlastirildi. Bu hücreler, 6. günde MLR tahlili için kullanildi. Üreticilerin protokollerine göre bir insan CD4 + T Hücre Izolasyon Kiti (Miltenyi, 130- 096- 533) kullanilarak PBMC'lerden (yukarida açiklandigi gibi izole edilmis) CD4 T hücreleri izole edildi. Yalitilmis CD4 + T hücreleri, izolasyon gününde MLR'de kullanildi.

MLR için oyuk basina 1e5 izole CD4 + T hücreleri, 2e4 LPS ile olgunlastirilmis monosit türevi dendritik hücreler ile karistirildi ve daha sonra ya pozitif kontrol anti- (yukarida hazirlanan) test oyuklarina ilave edildi. MLR, 4 gün boyunca 37 °C'de inkübe edildi. Süpernatanlar plaktan çikarildi, berraklastinldi ve sitokin IL- 2 için ELISA ile analiz edildi. Kisaca, ELISA plakalari gece boyunca 4 °C'de insan IL- 2 mAb (R & D Systems, MABöO2) ile kaplandi. Plakalar üç kez PBS ile yikandi, sonra bir saat boyunca oda sicakliginda PBS /% 3 BSA /% 0.05 Tween ile bloke edildi. Bir 2000 pg / ml ila 31. 3 pg /ml araliginda hazirlandi. MLR numuneleri, PBS /% 3 BSA /% 0.05 Tween 20 içinde 4'te 1'in üstünde hazirlanan berraklasmis Süpernatanlar seyreltilerek hazirlandi. Numuneler ve standartlar, 1 saat boyunca oda sicakliginda ELISA plakalarina 50 ul/oyuk ilave edildi, daha sonra biyotinlenmis anti- insan IL- 2 saptama antikoru (R & D Systems, BAF202) ilave edilmeden önce üç kez PBS /% 0.05 Tween 20 ile yikandi. 1 saat inkübasyondan sonra plaka, PBS /% 0.05 Tween ile üç kez daha yikandi ve 1 saat boyunca streptavidin- HRP'nin (R & D Systems, ELISA Substrat Çözeltisi (termo, 34028) ilave edilerek gelistirildi. 20 dakika sonra reaksiyon, 50 pl 1M HCl'nin eklenmesi ile durduruldu ve 450 nm'de absorbans ölçüldü. Bagimsiz deneylerden elde edilen iki farkli DC: T hücre verici seti için artmis edilmis kültür süpernatantlari için tespit edilebilir, ancak NG- 165 ile enfekte edilmis olanlar için tespit edilemez (Sekil 48A ve 488). Benzer sekilde, CD4 T hücresi tepkileri de NG- 177 kültür süpernatantlari için gelistirildi, ancak NG- 135 kültür süpernatantlari için gelistirilmedi (Sekil 490). Birlikte ele alindiginda, bu veriler, fonksiyonel anti- PD- L1 antikorunun NG- 190 ve NG- 177 ile donatilmis virüsler için tümör hücresi enfeksiyonu baglaminda üretildigini göstermektedir.

NG- 177 ile enfekte edilmis hücrelerden eksprese edilen antikorun anti- PD- L1 baglanma aktivitesi, bir membran ortaminda eksprese edilen rekombinant olmayan PD- L1 Iigandini dogrudan akciger karsinom hücrelerinin yüzeyinde (A549) baglama kabiliyeti açisindan degerlendirildi.

A549 hücreleri ya hücre yüzeyinde PD- L1 ekspresyonunun yukari regülasyonunu tesvik etmek için 50 ng/ml insan lFNy'si ile uyarilir ya da uyarilmamis halde birakilir. 24 saat sonra, hücreler tripsinlestirildi ve sadece, ortamla veya 50 ul konsantre NG- 177 veya NG- 135 ile enfekte edilmis hücre süpernatanti (yukarida hazirlanmis) ile 1 saat süreyle 4 °C'de inkübe edildi. Hücreler, 4 °C'de 50u| Alexa- flor 488 etiketli keçi anti- insan lgG (H + L) (LifeTechnoIogies, A11013) ile 30 dakika inkübe edilmeden önce iki kez PBS /% 1 BSA ile yikandi. Hücreler tekrar yikandi, PBS /% 1 BSA içinde yeniden süspanse edildi ve bir Attune akustik odaklama sitometresi (Life Technologies) ile analiz edildi. PE- etiketli saflastirilmis bir anti- PD- L1 kontrol antikorunun baglanmasina benzer bir PD- L1 baglanma aktivitesi (Biolegend'den süpernatanlarinda saptanmamistir (Sekil 50). Örnek 29: Bagisiklik kontrol noktasi inhibitörü yol proteini CTLA- 4'e (NG- 242) yönelik antikorlari kodlayan EnAd virüslerinin üretimi ve karakterizasyonu pEnAd2. 4 plazmidi, L5 ve E4 arasinda bulunan essiz kisitlama bölgelerine bir anti- CTLA- 4 antikorunu (11. 2. 1) kodlayan transgen kasetlerinin dogrudan sokulmasiyla pNG- 242 plazmidini (DIZI ID NO: 58) üretmek için kullanildi. pNG- 242 transgen kaseti, bir anti- CTLA- 4 VH zincir sekansinin (SEK ID NO: 70), bir antikor sabit agir zincir sekansinin (SEK ID NO: 33), bir iç ribozom giris sekansinin (SEK lD NO: 19), bir anti- CTLA- 4 VL zincir sekansinin (SEK lD NO: 71) ve bir antikor sabit hafif zincir sekansinin (SEK ID NO: 35) dahil edilmesiyle bir anti- PD- L4 antikorunu kodlar.

Eklenen transgen kasetinin bir semasi Sekil 34'te gösterilmektedir. Plazmitin yapisi, Virüs Üretimi NG- 242 virüsü, Örnek 8'de ayrintilandirilan NG- 135 virüsünün saflastirilmasi için kullanilan yöntemlere göre çogaltildi ve saflastirildi.

Virüs Karakterizasyonu Anti- VEGF antikorunu eksprese eden EnAd referans virüsü veya NG- 135 referans virüsü ile kolon karsinom hücrelerinde, NG- 242 onkolitik aktivite (hücre canliligi testi ile degerlendirildi) ve anti- CTLA- 4 antikoru ekspresyonu (ELISA ile degerlendirildi) karsilastirildi. EnAd ile karsilastirmali olarak onkolitik potensin degerlendirilmesi için, Örnek 15'te detaylandirilan yöntemlere göre bir hücre canliligi testi gerçeklestirildi.

NG- 242 virüsü, üretilmis EnAd referans materyali ile karsilastirilabilir bir potens gösterdi (Sekil 51A).

Antikor ekspresyonunun degerlendirilmesi için, HT- 29 hücreleri 1e6 hücre/oyuk yogunlugunda 12 oyuklu kültür plakalarina tohumlandi ve yapismanin ardindan veya 72. saatlerde toplanan enfeksiyonlu süpernatantlar PBS /% 3 BSA /% 0.05 Tween 20 içinde seyreltildi, daha sonra Örnek 18'de ayrintili olarak açiklanan yöntemlere göre anti- insan IgG1 ELISA ile denendi. Numunelerdeki antikor konsantrasyonu, analiz standart egrisinden interpolasyon yoluyla tespit edildi ve saptanabilir antikorun NG- 242 ile enfekte olmus hücrelerden karsilastirici virüs NG- 135'e benzer seviyelerde saldigini gösterdi (Sekil 51B).

CTLA- 4 Dogrudan Baglanma Analizi NG- 242 ile enfekte edilmis hücrelerden eksprese edilen antikorun anti- CTLA- 4 baglanma aktivitesi, dogrudan CTLA- 4 baglayici ELISA ile degerlendirildi.

A549 hücreleri, bir IgGl anti- VEGF antikoru ifade eden 100ppc NG- 242 veya NG- 165 kontrol virüsü ile 72 saat enfekte edildi. Kültür süpernatantlari hasat edildi ve hücre artiklarini gidermek üzere 5 dakika boyunca 300 g'de konsantre edildi. ELISA plakalari, 4 °C'de gece boyunca rekombinant CTLA4- FC (0. 5ug/ml, R&D Systems, sonra PBS /% 3 BSA /% 0.05 Tween 20 ile bloke edildi. Konsantre süpernatantlarin içinde hazirlandi, daha sonra ELISA plakasina eklendi ve 1 saat oda sicakliginda inkübe edildi. Bu ELISA, daha sonra örnek 28'de ayrintili olarak açiklanan PD- L1 baglanma yöntemlerine göre islendi. Anti- CTLA- 4 baglanma aktivitesi, NG- 242 ile enfekte edilmis A549 hücrelerinin süpernatantlarinda spesifik olarak tespit edilebildi, ancak NG- 165 ile enfekte edilmis A549 hücrelerinde tespit edilemedi (Sekil 51 C).

CTLA- 4 Reseptör baglama inhibisyonu analizi NG- 242 ile enfekte edilmis hücrelerin süpernataninda eksprese edilen anti- CTLA- 4 antikorunun bloke edici aktivitesi, bir CTLA- 4 ligandi: 87- 1 reseptör etkilesim analizi ile degerlendirildi.

Yukarida açiklanan NG- 242 ile enfekte edilmis hücrelerden gelen kültür süpernatantlari hasat edildi ve örnek 28'de ayrintili olarak verilen yöntemlere göre konsantre edildi. ELlSA plakalari gece boyunca 4 °C'de CTLA4- FC (2ug/ml, R&D Systems, 325- CT- 200) ile kaplandi. Plakalar üç kez PBS ile yikandi, daha sonra oda sicakliginda 1 saat boyunca PBS /% 3 BSA /% 0.05 Tween 20 ile bloke edildi.

Konsantre süpernatantlarin seri ikiye katlanmis seyreltmeleri PBS içinde hazirlandi, daha sonra her seyreltiden 45 pl ELISA plakasina eklendi. 10 ng rekombinant B7- 1- Fc (R & D Systems, 140- B1- 100) her oyuga ilave edildi ve plaka 1 saat inkübe edildi. Sonra tüm oyuklar, PBS /% 0.05 Tween 20 ile üç kez yikandi, daha sonra 10 dakika boyunca PBS /% 3 BSA /% 0.05 Tween 20 ile bloke edildi. 2 pg/ml biyotinlenmis anti- insan 87- 1 antikoru (R & D Systems, BAM- 402) ilave edildi ve plaka 1 saat inkübe edildi. Üç yikama gerçeklestirildi, daha sonra streptavidin- HRP'nin (R & D Systems, DY998) 1: 200 oraninda dilüsyonu ilave edildi. Plaka, 50 pl 1- Adimli Ultra TMB- ELISA Substrat Çözeltisi (termo, 34028) ilave edilerek gelistirildi. 20 dakika sonra reaksiyon, 50 ul 1M HCl`nin eklenmesi ile durduruldu ve 450 nm'de absorbans ölçüldü. Sonuçlar, numunenin emilimini kontrolünkiyle (hiçbir test engelleyici olmadan) bölerek ve maksimum 87- 1 baglanma yüzdesini belirlemek için 100 ile çarpilarak analiz edildi. NG- 242 ile enfekte edilmis hücrelerden salgilanan anti- CTLA- 4 antikoru, 87- 1 reseptör baglanmasini inhibe edebildi (Sekil 51D). Örnek 30: Tümörle iliskili antijenleri (TAA'Iar) (NG- 217, NG- 220) kodlayan EnAd virüslerinin üretimi ve karakterizasyonu pEnAd2. 4 plazmidi (SEK ID NO: 64), tümöre iliskili antijen NY- ESO- 1 'i kodlayan transgen kasetlerinin L5 ve E4 genleri arasinda bulunan benzersiz kisitlama alanlarina dogrudan sokulmasiyla pNG- , pNG- 220 (SEK lD NO: 56) plazmitlerini üretmek için kullanildi. PNG- 217 transgen kaseti, bir CMV promotör sekansi (SEK ID NO: 13) ve bir 3' poliadenilasyon sekansi (SEK lD NO: 20) ile çevrelenen NY- ESO- 1 genini (SEK ID NO: 43) kodlar. PNG- 220 transgen kaseti, bir PGK promotör sekansi (SEK ID NO: 14) ve bir 3' poliadenilasyon sekansi (SEK ID NO: 20) ile çevrelenmis NY- ESO- 1 genini kodlar. Eklenen transgen kasetlerinin sematikleri, Sekil 34'te gösterilmektedir. Plazmidlerin yapisi DNA dizilimi ile teyit Virüs Üretimi saflastirilmasi için kullanilan yöntemlere göre çogaltildi ve saflastirildi.

Virüs Karakterizasyonu Kolon karsinoma hücrelerinde (western blot ile degerlendirildi) NG- 220 ve NG- 217 virüs replikasyonu (qPCR ile degerlendirildi) ve NG- 220 NY- ESO- 1 transgen ekspresyonu, EnAd ile karsilastirildi. Virüs replikasyonunun degerlendirilmesi için, HT- 29 hücreleri 1e6 hücre/oyuk yogunlugunda 12 oyuklu kültür plakalarina tohumlandi ve yapismanin ardindan 100ppc EnAd, NG- 220 ya da NG- 217 ile enfekte edildi. qPCR için DNA, örnek 18'de ayrintili olarak verilen yöntemlere göre hem hücresel Iizatlardan hem de süpernatantlardan enfeksiyon sonrasi 24 veya 48. saatte hasat edildi. Çikarilan DNA numuneleri, Örnek 9'da detayli olarak verilen yöntemlere göre bir EnAd E3 genine özgü primer- prob seti kullanilarak qPCR edilen toplam virüs genomlari EnAd referans virüsüne benzerdi.

NY- ESO- 1 ekspresyonunun degerlendirilmesi için HT- 29 hücreleri 6 oyuklu kültür plakalarina 4e6 hücre / oyuk yogunlugunda ekildi ve 5 saat 37 r”C'de, % 5 COz'de inkübe edildi. Hücreler daha sonra 48 veya 72 saat süreyle, hücre basina 100 NG- 220 veya EnAd virüs partikülleri ile enfekte edildi. Ortam, oyuklardan çikarildi ve hücreler, anti- proteaz inhibitörü kokteyl III (Calbiochem: 539134) ihtiva eden 250 ul )) içinde Iizizden önce PBS ile bir kez yikandi. Lizatlara, genomik DNA'yi indirgemek üzere benzonaz ile muamele edildi ve NuPAGE LDS numune tamponu ve NuPAGE indirgeyici madde (Life Technologies) ihtiva eden Iiziz tamponu içinde 1: 4 oraninda seyreltildi. Numuneler, üreticinin protokolüne göre % 4- 12 Bis- Tris NuPAGE jelleri (Life Technologies) kullanilarak SDS- PAGE gerçeklestirilmeden önce 10 dakika, 70 °C'de isitildi. Proteinler, Xcell II Blot Modülü (Life Technologies) kullanilarak western blot ile PVDF zarlarina aktarildi. Bloke etme ve imünoblotlama % 5 süt tozu ile takviye edilmis PBS % 0.1 Tween- 20'de gerçeklestirildi ve tüm yikama adimlari PBS antikoru (3 tig/ml) kullanilarak tespit edildi ve ikincil antikor tespiti, Tavsan anti- fare görsellestirildi. NY- ESO- 1 ekspresyonu hem enfeksiyon sonrasi 48. hem de 72. saatlerde NG- 220 ile saptanabildi, ancak EnAd kontrolüyle saptanamadi (Sekil 528). Örnek 31: L5, Fiber, genin asagi akisina transgen kasetlerinin sokulmasi için bir EnAd klonlama plasmidinin, pEnAd2. 4'ün olusturulmasi.

Plazmid pEnAd2. 4 (SEK ID NO: 64) bir mekik vektörü, pEnAd2. 4 Mekik ve EnAd genomu arasindaki homolog rekombinasyon ile elde edildi. PEn2. 4 plazmidi, replikasyonun bir bakteriyel p15A kökenini, bir kanamisin direnç geni ve BY bölgesine yerlestirilen benzersiz kisitlama bölgeleri olan EnAd genomu içerir.

PColoAd2. 4 plasmidinin yapisi asagidaki gibidir. Bir“12kb mekik plazmidi, pColoAd1 Mekigi, baslangiçta EnAd genomunun geç gen, L5, bölgesine (BY bölgesi) benzersiz kisitlama alanlarinin sokulabilmesi için yapilmisti. EnAd'in 5' (nt 1- 4632) ve 3' (nt NO: 80] primeri ve sirasi ile 5'- AATGCAAATCTGTGAGGGG- 3' [SEK ID NO: 82] ya fa 5' - CTTAGTGGTGTTGTGGTATTGG- 3' [SEK ID NO: 83] primerleri kullanarak PCR ile EnAd genomundan güçlendirildi. 5' kollu PCR ürünü, EnAd genomunda nt 4626'da PspOMl alanina tekabül eden bir 5' verilmis Ascl bölgesi ve 3 'PspOMl bölgesi içeriyordu. 3' kollu PCR ürünü, EnAd genomunda nt 27837'de PspOMl alanina karsilik gelen bir 5' PspOMl alani ve bir verilmis 3' Ascl bölgesi içeriyordu.

PCR ürünleri, Ascl / PspOMl ile kisitlamali sindirildi ve replikasyonun bir p15A kökeni ve bir kanamisin direnç kaseti bulunan bir Ascl dogrusallastirilmis plazmid içine bir adimli üç yollu Iigasyonda baglandi. Bu, pEnAd Mekigi plasmidini üretti. PspOMl ve genom bölgesine karsilik gelen bir DNA parçasi, By bölgesindeki EnAd nt 29356'ya karsilik gelen pozisyona sokulmus 19bp 5'- GCGATCGCTACCCTGCAGG- 3' [SEK (GCGATCGC ve CCTGCAGG) bulunmayan ve ng ve Sbfl tarafindan kesilebilen iki enzim için kisitlama alanlari içerir. Sentezlenen DNA parçasi, enzimler PspOMl ve Acll ile kisitlamali sindirildi ve plazmid, pColoAd2. 4 mekigi olusturmak için PspOMl / Acll sindirilmis pColoAd1 mekik plazmidindeki karsilik gelen bölgeye klonlandi. pColoAd2. 4 plasmidini homolog rekombinasyonla elde etmek için, pColoAd2. 4 mekik plazmidi enzim PspOMl ile kisitlamali sindirilerek dogrusallastirildi ve 5' fosfatlari çikarmak için alkalin fosfataz ile islemden geçirildi. Dogrusallastirilmis plazmid ve EnAd genomu, üreticinin protokolüne göre elektroporasyon ile BJ5183 hücrelerine birlikte dönüstürüldü ve homolog rekombinasyon ile pColoAd2. 4 plasmidinin üretilmesi, kisitlamali sindirim ile saptandi. Tüm plazmidlerin yapisi DNA dizilimi ile teyit edildi. Örnek 32: Transgen kasetlerinin L5, Fiber, geninin akis yukarisina veya akis asagisina sokulmasi için bir EnAd klonlama plasmidinin, pCoIoAd2. 6 sentezi. pCoIoAd2. 6 plazmidi (pNG- tarafindan sentetik gen segment birlestirme yöntemleriyle üretildi. Plazmidin dogru yapisi, sonraki nesil dizilimi ile teyit edildi (SGl- DNA). pNG- 185 plazmidi, replikasyonun bir bakteriyel p15A kökenini, bir kanamisin direnç geni ve Bx ve BY bölgelerine yerlestirilen benzersiz kisitlama bölgeleri olan EnAd genomu içerir.

Virüs Üretimi NG- 185 virüsü, Örnek 8'de ayrintilandirilan NG- 135 virüsünün saflastirilmasi için kullanilan yöntemlere göre çogaltildi ve saflastirildi.

Virüs Karakterizasyonu NG- 185'in onkolitik aktivitesi (hücre yasayabilirlik tahlili ile degerlendirildi) ve virüs replikasyonu (qPCR ile degerlendirildi), EnAd referans virüsü ile karsilastirildi. EnAd ile karsilastirmali olarak onkolitik potensin degerlendirilmesi için, Örnek 15'te detaylandirilan yöntemlere göre bir hücre canliligi testi gerçeklestirildi. NG- 185 virüsü, EnAd'a benzer bir onkolitik aktivite gösterdi (Sekil 53A).

Virüs replikasyonunun degerlendirilmesi için, HT- 29 hücreleri 1e6 hücre/oyuk yogunlugunda 12 oyuklu kültür plakalarina tohumlandi ve yapismanin ardindan 100ppc EnAd ya da NG- 185 ile enfekte edildi. qPCR için DNA, örnek 18'de ayrintili olarak verilen yöntemlere göre hem hücresel lizatlardan hem de süpernatantlardan enfeksiyon sonrasi 48 veya 72. saatte hasat edildi. Çikarilan DNA numuneleri, Örnek 9'de detayli olarak verilen yöntemlere göre bir EnAd E3 genine özgü primer- prob seti kullanilarak qPCR vasitasi ile analiz edildi. NG- 185 (Sekil 538) için tespit edilen toplam virüs genomlari, EnAd referans virüsü ile enfeksiyon zamani boyunca benzerdi. Örnek 33: Plazmid pCoIoAd2. 6'dan (pNG- 185) EnAd virüslerinin üretilmesi pEnAd2. 6 plazmidi (SEK lD NO: 65), transgen kasetlerinin, Bx ve Bv bölgelerinde bulunan pEnAd2. 6 benzersiz kisitlama alanlarina dogrudan sokulmasi ile pNG- 257 ve pNG- 281 plazmitlerinin üretilmesi için kullanildi. pNG- 257, bir C- ucu His peptit etiketine (SEK ID NO: 23) sahip, Bx bölgesine yerlestirilen 5' bSA (SEK ID NO: 18) ve 3' P0li(A) sekansi (SEK lD NO: 20) ile çevrilmis bir anti- VEGF ScFv'yi (SEK lD NO: 36) kodlayan bir transgen kaseti içerir. pNG- 281, bir C- ucu Histidin peptit etiketlerine (SEK lD NO: 23) sahip, Bx bölgesine yerlestirilen 5' bSA (SEK ID NO: 18) ve 3' P0li(A) sekansi (SEK lD NO: 20) ile çevrilmis bir anti- VEGF ScFv'yi (SEK lD NO: 36) kodlayan transgen kasetleri ve By bölgesine yerlestirilmis 5' SSA (SEK lD NO: 16) ve3' poli(A) sekansi (SEK ID NO: 20) ile çevrilmis V5 etiketli (SEK lD NO: 24) bir anti- PD- L1 ScFv'yi (SEK ID NO: 37) kodlayan ikinci bir transgen kaseti içerir. pNG- 257 ve pNG- 281 plazmidlerine yerlestirilen transgen kasetlerinin sematikleri Sekil 54'de gösterilmektedir. Plazmidlerin yapisi DNA dizilimi ile teyit edildi. Bu plasmitler, EnAd virüs genomlari, NG- ve NG- 281'i (SEK lD NO: 73) ihtiva etmektedir. Örnek 34: Birden fazla ScFv antikor varyanti olan EnAd virüsleri ekspresyonunun üretilmesi pEnAd2. 4 plazmidi (SEK ID NO: 64), L5 ve E4 genlerinin (BY bölgesi) arasinda bulunan benzersiz kisitlama bölgelerine, bir anti- VEGF ScFv ve bir anti- PD- L1 ScFv'yi kodlayan kasetin dogrudan sokulmasi ile pNG- 272 plasmidinin üretilmesi için kullanildi. PNG- 272 transgen kaseti, bir anti- PD- L1 ScFv sekansinin (SEK ID NO: 37), bir yüksek kendi kendine bölünme verimliligine sahip bir P2A peptit sekansinin (SEK ID NO: 25), bir anti- VEGF ScFv sekansinin (SEK lD NO: 36) ve bir 3 ve anti- VEGF ScFv'yi kodlar. Eklenen transgen kasetlerinin sematikleri, Sekil 54'te gösterilmektedir. Plazmidlerin yapisi DNA dizilimi ile teyit edildi.

Virüs Üretimi NG- , Örnek 8'de ayrintilandirilan NG- 135 virüsünü saflastirmak için kullanilan yöntemlere göre çogaltilir ve saflastirilir. Örnek 35: Transmembran proteini, sodyum / iyodür simportorü (NIS) kodlayan EnAd virüslerinin üretimi pEnAd2. 4 plazmidi (SEK ID NO: 64), sodyum iyodür simportörünü (NIS) kodlayan bir transgen kasetinin By bölgesine dogrudan sokulmasi ile pNG- 280 plazmidini üretmek üzere kullanilir. PNG- , NIS cDNA sekansi (SEK ID NO: 67) ve bir 3' poli (A) sekansi (SEK ID NO: 20) ihtiva eder ve NG- kodlar. Eklenen transgen kasetlerinin sematikleri, Sekil 54'te gösterilmektedir. Plazmidlerin yapisi, dizilimi ile teyit edildi. Örnek 36: shRNA'Iari eksprese eden EnAd virüslerinin üretimi pEnAd2. 4 plazmidi (SEK lD NO: 64), sirasiyla ya bir shRNA'yi GAPDH proteinine veya herhangi bir insan geni ile bir sekansi paylasmayan bir kontrol shRNA'sini kodlayan kasetlerin dogrudan eklenmesi ile pNG- sh01 ve pNG- sh02 plazmitlerini üretmek üzere kullanilir. PNG- sh01 kaseti bir U6 insan RNA polimeraz lll promotörü ve bir 29 nt antisens sekansi, bir döngü sekansi, bir 29nt duyu sekansi ve bir 3' TTTTTT sekansindan olusan bir shRNA sekansi içerir. Eklenen transgen kasetlerinin sematikleri, Sekil 54'te gösterilmektedir. Plazmidlerin yapisi, DNA dizilimi ile teyit Virüs Üretimi ve karakterizasyonu NG- sh01 (SEK lD NO: 66) ve NG- sh02 virüsleri, Örnek 8'de detaylandirilan NG- 135 virüsünü saflastirmak için kullanilan yöntemlere göre çogaltilir ve saflastirilir.

Insan hücre hatlarindaki GAPDH ekspresyonu, NG- shO1 ile tedavi edilmis hücrelerde azaldi, ancak NG- sh02 ile tedavi edilen hücrelerde azalmadi.

Claims (18)

ISTEMLER

1. Bir replikasyona uygun grup B onkolitik adenovirüs olup, özelligi; asagidaki formül (l)”in bir sekansini içermesi: 5'lTR- 81- BA- Bz- Bx- BB- BY- Bs- 3'ITR Bi'in E1A, E18 ya da E1A- E1B içermesi; BA,nin - E28- L1- L2- L3- E2A- L4 içermesi; Binin bir bag olmasi veya E3 içermesi; Bx'in bir bag olmasi ya da bir kisitlama bölgesi, bir ya da daha fazla transgen ya da her ikisini içeren bir DNA sekansi olmasi; BB'nin L5 içermesi; Bv”nin, bir transgen ve bir ek yeri alici sekansi içeren bir transgen kaseti içermesi ve Bslün bir bag olmasi ya da E4,ü içermesi, burada transgen kasetinin, E4 ve büyük geç promotörden olusan gruptan seçilen bir endojen promotörün kontrolü altinda olmasi ve transgen kasetinin. bir RNAI sekansi, bir protein, bir antikor ya da bunlarin bir baglama fragmani, bir kemokin, bir sitokin, bir immünomodülatör ve bir enzimden olusan gruptan seçilen bir terapötik gen kodlayici materyali içermesidir.

2. istem 1'e göre replikasyona uygun bir adenovirüs olup, özelligi; burada promotörün, büyük geç promotör olmasidir.

3. istem 1 veya 2'ye göre replikasyona uygun bir adenovirüs olup, özelligi; burada Bv'nin ayni zamanda, SEK lD NO: 11'de gösterilen sekansi veya siki kosullar altinda kendisine hibridlesen bir DNA sekansini içermesidir.

4. Istem 1 ila 3'ten herhangi birine göre replikasyona uygun bir adenovirüs olup, özelligi; burada ek yeri alicisinin, CAGG, SEK ID NO:17 ve SEK lD NO: 18'den seçilmesidir.

5. istem 1 ila 4'ten herhangi birine göre replikasyona uygun bir adenovirüs olup, özelligi; transgen kasetinin ayrica, bir iç ribozom giris sekansi veya yüksek bir kendi kendine bölünme verimliligine sahip 2A peptidi içermesidir.

6. Istem 1 ila 5'ten herhangi birine göre replikasyona uygun bir adenovirüs olup, özelligi; transgenin, ayrica bir Kozak sekansi içermesidir.

7. istem 1 ila 6'dan herhangi birine göre bir adenovirüs olup, özelligi; transgen kasetinin ayrica bir poliadenilasyon sekansi içermesidir.

8. Istem 1 ila 7'den herhangi birine göre bir adenovirüs olup, özelligi; transgen kasetinin ayrica, DNA sekansinin 3' ucunda ve / veya DNA sekansinin 5' ucunda bir

9. istem 1 ila 8'in herhangi birine göre bir adenovirüs olup, özelligi; en az bir transgen kasetinin, monosistronik mRNA'yi veya bir polisistronik mRA'yi kodlamasidir.

10. istem 1 ila 93 göre bir adenovirüs olup, özelligi; antikor veya bunun baglayici CTLA- 4, PD- 1, PD- L1, PD- L2'ye özgü olmasidir.

11. istem 1 ila 10'dan herhangi birine göre bir adenovirüs olup, özelligi; kodlanmis 25, IL- 1RA, lFNci, IFNB, IFNv, TNFoi, TGFß, lenfotoksin ci (LTA) ve GM- CSF içeren gruptan bagimsiz olarak seçilen bir sitokin olmasidir.

12. istem 1 ila 11'den herhangi birine göre bir adenovirüs olup, özelligi; kodlanmis CCR8, CXCR3, CXCR4, CXCR5 ve CRTH2'yi içeren gruptan bagimsiz olarak

13. istem 1 ila 12'den herhangi birine göre bir adenovirüs olup, özelligi; burada transgenin, bir haberci gen, örnegin sodyum iyodür simporatör, hücre içi metaloproteinler, HSV1- tk, GFP, Iusiferaz veya östrojen reseptörü olmasidir.

14. Istem 1 ila 13'ten herhangi birine göre bir adenovirüs olup, özelligi; burada adenovirüsün Ad11 olmasidir.

15. istem 1 ila 13'ten herhangi birine göre bir adenovirüs olup, özelligi; burada adenovirüsün, sekans ID No: 12'de gösterilen EnAd olarak da bilinen virüs olmasidir.

16. istem 1 ila 15'ten herhangi birine göre bir adenovirüs olup, özelligi; burada virüsün, SEK lD NO: 1, SEK ID NO: 2, SEK ID NO: 3, SEK lD NO: 4, SEK ID NO: 5, sekansini içermesidir.

17. Istemler 1 ila 16'dan herhangi birine göre bir adenovirüsü içeren bir kompozisyon.

18. Istemler 1 ila 16'dan herhangi birine ait bir adenovirüs veya istem 17'ye göre bir bilesim olup, özelligi; tedavide kullanima yönelik olmasidir.