DE69838510T2

DE69838510T2 - Mutationen in atp-abhängigen transpositionsproteinen die die zielortspezifität reduzieren

Info

Publication number: DE69838510T2
Application number: DE69838510T
Authority: DE
Inventors: Nancy L. Baltimore CRAIG
Original assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1998-02-20
Publication date: 2008-07-03
Anticipated expiration: 2018-02-21
Also published as: US20020188105A1; ATE374821T1; EP1036183A1; US6420524B1; WO1998037205A1; DE69838510D1; EP1036183B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung ist insbesondere auf die effiziente, zufällige, einfache Insertion eines Transposons oder eines abgeleiteten, transponierbaren Elements in vivo oder in vitro in DNA gerichtet. Die Erfindung ist insbesondere auf Mutationen in ATP-verwendenden, Regulationstranspositionsproteinen, die eine Insertion mit geringerer Targetsite-Spezifität als der Wildtyp aufweisen, gerichtet. Die Erfindung umfasst gain of function-Mutationen in TnsC, einem ATP-verwendenden Regulationstranspositionsprotein, das das bakterielle Transposon Tn7 aktiviert. Solche Mutationen ermöglichen die Insertion eines Tn7-Transposons oder eines abgeleiteten, transponierbaren Elements auf unspezifische Weise in ein gegebenes DNA-Segment. Die Insertion kann in Plasmid- und cDNA-Bibliotheken, cDNA-Bibliotheken, PCR-Produkten, künstlichen Bakterienchromosomen, künstlichen Hefechromosomen, künstlichen Säugerchromosomen, genomischen DNAs und Ähnlichem ausgeführt werden. Eine solche Insertion ist für Verfahren zur Sequenzierung von DNA, für genetische Analysen mit Hilfe von durch Insertion erfolgende Mutagenese und Änderung der Genexpression durch Insertion einer gegebenen Gensequenz nützlich.
Beschreibung des Standes der Technik
Transponierbare Elemente sind einzelne DNA-Abschnitte, die in der Lage sind, nicht homolog von einem genetischen Ort zu einem anderen zu wandern und üblicherweise die Sequenzinformationen tragen, die für die beiden Hauptfunktionen wichtig sind, die die Fähigkeit zur Mobilisierung verleihen. Sie codieren für die Proteine, die dazu notwendig sind, die mit der Transposition in Verbindung stehende, katalytische Aktivität auszuführen und enthalten die cis-agierenden Sequenzen, die an den Enden des Transposons lokalisiert sind und als Substrate für diese Proteine fungieren. Die gleichen Proteine können an der Auswahl der Targetsites für die Insertion teilnehmen.
Die Auswahl eines neuen Insertionsorts ist in der Regel ein zufälliger Prozess; dafür zeigen viele Transposons charakteristische Vorlieben für bestimmte Arten von Targetsites. Ein allgemeines Merkmal, dass die breite Vielfalt der bekannten, transponierbaren Elemente unterscheidet, ist die Art der Selektivität der Targetsite (1). Ein Bestandteil dieser Selektivität kann die Target-Sequenz selbst sein. Das bakterielle Transposon Tn10 selektiert vorzugsweise ein relativ hoch konserviertes, 9 bp großes Motiv als vorwiegenden Ort für die Insertion des Transposons und selektiert weniger oft andere, entfernter miteinander verwandte Orte in vivo (2). Die Mariner-Elemente Tc1 und Tc3 aus C. elegans inserieren vorzugsweise bei einem TA-Dinukleotid, so dass jedes Ende des Elements von einer TA-Duplikation (3)(4)(5) flankiert wird. Eine Consensus-Sequenz mit geringer Spezifität, N-Y-G/C-R-N wurde aus Populationen von sowohl in vivo als auch in vitro-Insertionen für den Bakteriophagen Mu bestimmt (7). Im Gegensatz zu diesen Elementen zeigt das bakterielle Transposon Tn5 eine erheblich kleinere Spezifität des Insertionsorts, obwohl einige isolierte „Notspots" nachgewiesen wurden (8).
Ein weiterer Selektionsmechanismus beruht auf den strukturellen Merkmalen der Gegenwart von zellulären Proteinkomplexen an den Targetsites. Als Reaktion auf Signale der zellulären Proteine TFIIIB und TFIIIC inseriert das Hefetransposon Ty3 inseriert bevorzugt in den Promotoren der Gene, die mit RNA-Polymerase III transkribiert werden.
Das Verstehen, wie diese Faktoren die Aktivität der Transposase in der Weise anpassen, um bestimmte Vorlieben für Targetsites aufzuzwingen, wird einen Einblick in die Verbreitung von Transposons und Viren führen und kann Möglichkeiten vorschlagen, solche Target-Vorlieben zu manipulieren. Das bakterielle Transposon Tn7 unterscheidet sich dadurch, dass es verschiedene von Elementen codierte, akzessorische Proteine dazu verwendet, die potentiellen Target-DNAs nach positiven und negativen Merkmalen zu beurteilen und eine Targetsite (1) auszuwählen. Tn7 codiert für fünf Gene, wobei deren Genprodukte die Transposition desselben vermitteln (10)(11).
Zwei der Proteine, TnsA und TnsB, erzeugen die Aktivität der Transposase, indem sie dabei zusammenwirken, die katalytischen Schritte des Strang-Aufbrechens und -Verbindens auszuführen (12). Die Aktivität dieser Transposase wird durch die restlichen Proteine, TnsC, TnsD und TnsE sowie durch die Natur der Target-DNA angepasst.
TnsC, TnsD und TnsE Wechselwirken mit der Target-DNA, um die Aktivität der Transposase über zwei verschiedene Wege anzupassen. TnsABC + TnsD steuern die Transposition mit einer großen Häufigkeit zu attTn7, eines einzelnen Orts auf dem Chromosom von E. coli und mit einer geringen Häufigkeit zu locker miteinander verwandten „Pseudo-att"-Orten (13). Die alternative Kombination TnsABC + E steuert die Transposition mit geringer Häufigkeit zu vielen nicht miteinander verwandten Nicht-attTn7-Orten in dem Chromosom (13)(10)(11) und vorzugsweise zu konjugierenden Plasmiden (14). attTn7 und konjugierbare Plasmide enthalten daher positive Signale, die das Transposon zu diesen Target-DNAs ergänzen. Die alternativen Selektionsmechanismen der Targetsite ermöglichen, dass Tn7 eine Vielzahl von potentiellen Targetsites in der Zelle überprüft und diejenigen auswählt, die dessen Überleben am wahrscheinlichsten sicherstellen.
Der Tn7-Mechanismus kann auch Targets erkennen und vermeiden, die für eine Insertion ungünstig sind. Die Tn7-Transposition erfolgt in einem gegebenen Target. Molekül nur einmal; wiederholte Transpositionsereignisse in das gleiche Target werden spezifisch inhibiert (15)(16). Eine bereits bestehende Kopie von Tn7 in einer potentiellen Target-DNA erzeugt daher ein negatives Signal, das das Target gegenüber einer weiteren Insertion „immun" macht. Das negative Target-Signal beeinflusst sowohl die von TnsD als auch die von TnsE aktivierten Transpositionsreaktionen und ist gegenüber irgendwelchen positiven Signalen, die auf einem potentiellen Target-Molekül vorhanden sind, dominant (16). Mehrere andere Transposons, wie beispielsweise Mu und Mitglieder der Tn3-Familie, zeigen ebenso diese Form einer negativen Target-Regulation (17)(18)(19)(7).
Die Auswahl des Targets könnte ein frühes oder ein spätes Ereignis im Ablauf einer Transpositionsreaktion sein. Zum Beispiel könnte ein Transposon konstitutiv aus der Donorposition ausgeschnitten werden und das ausgeschnittene Transposon könnte dann mit verschiedenen Häufigkeiten durch verschiedene Arten an Target-Molekülen eingefangen werden. Tn10 scheint diesen Ereignisablauf in vitro zu befolgen, wobei das Ausschneiden aus dessen Donorposition stattfindet, bevor irgendwelche Wechselwirkungen mit Target-DNA eintreten (20)(21). Alternativ dazu könnte der Vorgang des Ausschneidens des Transposons selbst von der Identifikation einer günstigen Targetsite abhängen. Die Tn7-Transposition zeigt eine frühe Abhängigkeit von den Signalen der Target-DNA in vitro: weder Transpositions-Intermediate noch Insertionsprodukte sind in Abwesenheit eines attTn7- Targets zu sehen (22). Die Natur der Target-DNA scheint daher die Initiierung der Tn7-Transposition in vitro zu regulieren.
Eine wichtige Frage ist, wie die positiven und negativen Signale an die Tn7-Transposase übermittelt werden. Eine Wiederherstellung der TnsABC + TnsD-Reaktion in vitro hat ein nützliches Hilfsmittel für eine ausführliche Analyse der Tn7-Transposition bereitgestellt. Diese Reaktion war dabei behilflich, die Rolle, die jedes einzelne Protein bei der Selektion der Targetsite spielt, zu beschreiben. Die Analyse der TnsABC + D-Reaktion in vitro hat den Zusammenhang erbracht, dass TnsC ein zentrales Verbindungsglied zwischen der TnsAB-Transposase und der Target-DNA ist. TnsC ist ein von ATP abhängiges, DNA bindendes Protein ohne bekannte Sequenzspezifität (24). TnsC kann jedoch über eine Wechselwirkung mit dem ortsspezifischen, DNA bindenden Protein TnsD auf Signale von attTn7 antworten. Bei einer Standard-in vitro-Transpositionsreaktion ist TnsD für die Transposition zu der attTn7-Site auf einem Target-DNA-Molekül erforderlich. Dieser orstspezifische Insertionsvorgang wird fest durch TnsC reguliert, tritt jedoch nicht in Abwesenheit von TnsD auf. Ein zusätzlicher Beweis für eine TnsC-TnsD-Wechselwirkung ergibt sich aus der Analyse des Schutzes der DNA und einer Analyse der Bandenverschiebung mit attTn7-DNA (23). Kürzlich wurde auch eine direkte Wechselwirkung zwischen TnsC und der TnsAB-Transposase beobachtet (25)(26).
TnsC kann somit als „Verbindungsglied" oder „Verknüpfer" zwischen der Transposase und dem TnsD + attTn7-Target-Komplex dienen (23)(27). Diese Verbindung ist nicht konstitutiv, scheint jedoch stattdessen über den ATP-Zustand von TnsC reguliert zu werden. Nur die ATP-gebundene Form von TnsC ist fähig, mit den Target-DNAs wechselzuwirken und die TnsA + B-Transposase zu aktivieren; die ADP-gebundene Form von TnsC besitzt keine dieser Aktivitäten und kann nicht an der Tn7-Transposition teilnehmen (24)(23). TnsC hydrolysiert ATP mit mäßiger Geschwindigkeit (25) und daher kann es von einem aktiven in einen inaktiven Zustand wechseln. Die Anpassung des ATP-Zustands von TnsC kann ein zentraler Mechanismus beim Regulieren der Tn2-Transposition sein.
Die Möglichkeit, dass TnsC die Verbindung zwischen der TnsA + B-Transposase und der Targetsite reguliert, veranlasste den Erfinder zu der Vorhersage, dass TnsC-Mutanten isoliert werden können, die die Tn7-Transposition konstitutiv aktivieren würden.
TnsC wurde daher ein hervorragender Kandidat für eine Mutagenese, um nach einem gain of function-Protein, das in der Lage ist, die Anforderungen nach Targeting-Proteinen zu umgehen, zu suchen. Der Erfinder hat daher gain of function-Mutationen von TnsC identifiziert, die die TnsA + B-Transposase in Abwesenheit von TnsD oder TnsE aktivieren können. Sie haben die Fähigkeit dieser Mutanten, Insertionen in verschiedene Targets zu fördern und auf Regulationssignale auf solchen Targets zu antworten, beschrieben.
Eine Klasse von TnsC-Mutanten aktivieren die Transposition auf eine Weise, die noch für Target-Signale sensitiv ist, wohingegen eine weite Klasse an TnsC-Mutanten die Transposition auf eine Weise aktiviert, die Target-Signale zu umgehen scheint. Wie in vitro beobachtet wurde, scheint die entscheidende Übermittlung zwischen dem Transposon und der Target-DNA ein frühes Ereignis in dem Tn7-Reaktionsweg in vivo zu sein, der dem Aufbrechen der Doppelstränge an den Enden des Transposons, die die Transposition initiieren, vorausgeht.
Eine besondere Mutante, die aus der zufälligen Mutagenese isoliert wurde, ist TnsC^A225V, eine Mutante, die zu einer beeindruckenden Aktivierung der Tn7-Transposition in Abwesenheit von TnsD in der Lage ist (25). Die Substitution einer einzelnen Aminosäure, die zum Erzeugen von TnsC^A225V durchgeführt wurde, hat das Protein verändert, so dass eine Wechselwirkung mit dem Target-assoziierten TnsD nicht länger erforderlich ist, wodurch die sehr effiziente Aktivierung der Transposition zu einer Vielzahl von Target-Molekülen möglich ist (25)(26). Die Erfinder kamen zu dem Schluss, dass TnsC^A225V die Transposition zu Target-DNAs mit geringer Spezifität fördern könnte, was auf den Ergebnissen basierte, wo eine durch den TnsABC^A225V-Mechanismus gesteuerte Transposition auf entweder F-Plasmide, die eine attTn7-Site aufwiesen, F-Plasmide, denen eine attTn7-Site fehlte oder das Chromosom von E. coli ohne offensichtliche Präferenz gerichtet wurde.
Sequenzierung der DNA
Das Sequenzieren von DNA-Fragmenten, die in Vektoren kloniert wurden, erfordert das Bereitstellen von Priming-Sites an verteilten Positionen innerhalb des Fragments von Interesse, wenn das Fragment länger als die Durchlauflänge der Sequenz (der Umfang der Sequenz, der mit einer einzigen Sequenzierungsreaktion bestimmt werden kann) ist. Derzeit gibt es drei allgemein verwendete Verfahren, die diese Priming-Sites bereitstellen:

A) Konstruktion eines neuen Primers aus der Sequenz, die in einem vorhergehenden Durchlauf aus einem von einem Vektor codierten Primer bestimmt wurde oder aus einem anderen vorher bestimmten Primer (Priming und Durchlauf, Primer Walking).
B) Zufällige Fragmentierung und Reklonieren kleinerer Stücke, gefolgt von der Bestimmung der Sequenz der kleineren Stücke aus von einem Vektor codierten (universellen) Priming-Sites, gefolgt von der Anordnung der Sequenzen über eine Überlappung der Sequenzen (zufälliges Shotgun-Sequenzieren).
C) Deletion verschiedener Ausmaße des Fragments von Interesse von einem Ende in der Nähe des Vektors an, um die unbestimmte Sequenz des Fragments nah genug an den von einem Vektor codierten (universellen) Primer zu bringen, um so eine Bestimmung der Sequenz zu ermöglichen.

Alle diese Verfahren weisen Nachteile auf.
Verfahren A ist infolge der Verzögerung, die sich aus der Konstruktion neuer Primer ergibt, und den daraus entstehenden Kosten zeitaufwendig und teuer. Wenn das Fragment DNA-Repeats enthält, die länger als der Sequenzdurchlauf sind, kann es zudem unmöglich sein, einen einzigartigen, neuen Primer zu konstruieren; Sequenzdurchläufe, die mit Primern innerhalb der Repeat-Sequenz durchgeführt wurden, werden zwei oder mehr Sequenzen, die nicht voneinander entwirrt werden können, anzeigen.
Verfahren B erfordert ein Reklonieren; eine zufällige Fragmentierung ist schwierig zu erreichen, da Fragmente, die effizient kloniert werden können (Verdau mit Restriktionsenzymen) keine zufällig verteilten Enden besitzen (Adams, M. D., Field, C. und Vektor, J. C. Herausgeber, Automated DNA Sequencing and Analysis, Academic Press, 1994; Kapitel 6, Bodenteich, K. et al.) und Verfahren zur Fragmentierung, die zufällig verteilte Enden bereitstellen, (Abscheren, Beschallung) keine DNA-Enden bereitstellen, die effizient (mit 5'-Phosphat und 3'-OH-Resten) kloniert werden können. Das Anordnen der Sequenz ist ebenso schwierig oder unmöglich, wenn zwei oder mehr repetitive Sequenzen, die länger als der Sequenzdurchlauf sind, in dem Start-Fragment vorhanden sind.
Verfahren C hängt von dem Bereitstellen zufällig verteilter Endpunkte für enzymatisch bestimmte Deletionen ab. Es gibt viele Verfahren um solche Deletionen zu erzeugen (insbesondere solche, die an Exonuclease-Verdaus, üblicherweise Exonuclease III, beteiligt sind), von denen keines vollständig zufällige Endpunkte bereitstellt und das von der Gegenwart einzigartiger, geeigneter Orte für Restriktionsenzyme an einem oder an beiden Enden des klonierten Fragments abhängt. Da die Deletionsreihen prinzipiell die Konstruktion einer Kartierung (verschachtelter [nested] Längen der übrig bleibenden Fragmente in den Deletionsderivaten), die von der Sequenz selbst unabhängig ist, erlauben, kann dieses Verfahren zulassen, dass eine repetitive Sequenz, die langer als der Sequenzdurchlauf ist, an geeigneten Positionen innerhalb des Fragments angeordnet wird.
Ein Verfahren zum Einschleusen von universellen Priming-Sites an zufällig verteilten Positionen innerhalb eines Fragments von Interesse ist daher ein nützlicher Vorteil bei der Sequenzierungstechnologie.
Transposition und das Problem bei der Sequenzierung
Vorherige Versuche wurden gemacht, um verteilte Priming-Sites mit Hilfe transponierbarer Elemente bereitzustellen. Diese Verfahren verfehlen dieses Ziel in dreierlei Hinsicht: erstens haben die transponierbaren Elemente keine ausreichend zufällige Verteilung von Priming-Sites bereitgestellt; zweitens war das Transpositionsverfahren (das Durchführen der Transposition in vivo, gefolgt von der Rückgewinnung der Target-DNA und der erneuten Reinigung) zeitaufwendig und umständlich; drittens neigten die Systeme dazu, unerwünschte Produkte zu erzeugen. Diese unerwünschten Produkte schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: a) Cointegrate (Fusionen von Replikons) zwischen dem Donor des Transposons und dem Target Plasmid; b) Insertionen, bei denen die beiden Enden des Transposons an verschiedenen Positionen wirken (was zur Deletion des intervenierenden Targets führt); c) Insertionen von high-copy-Transposons in das Target, so dass das Priming von einem Ende des Transposons aus zwei überlagerte Sequenzen erzielt. Das Verfahren war in zweierlei Hinsicht umständlich: Der Hauptteil der Insertionen erfolgte in die chromosomale DNA des Wirts und sogar bei den Insertionen in das Plasmid hat das Verfahren zur Rückgewinnung zu einem Verlust der Unabhängigkeit der Insertionen geführt. In vitro-Verfahren für eine Insertionen haben sowohl an der nicht zufälligen Anordnung der Insertionsorte und den unerwünschten Produkte als auch an einer schlechten Effizienz erlitten, so dass es unmöglich war, ohne übermäßigen Aufwand große Mengen an Insertionen in das Target von Interesse zu erhalten.
Ein zunehmendes Interesse an großtechnischen Sequenzierungsprojekten und eine damit einhergehende Forschung nach Verfahren einer sehr effizienten in vitro-Mutagenese hat die Anpassung mehrerer Transposonsysteme in vitro als Hilfsmittel für die Untersuchung der Genome gefördert. Eine in vivo-Reaktion für das bakterielle Transposon Tn3 wurde dazu verwendet, Plasmid-Inserts mit verschiedener Länge effizient zu sequenzieren; es wurde jedoch gefunden, dass nur annähernd 37% der Nukleotide in der Lage waren, als Orte für die Insertion zu dienen (Davies, 1995, Nr. 419). Ein ähnliches, zufälliger ablaufendes System wurde für das Retro-Transposon Ty1 aus Hefen entwickelt, bei dem synthetische Transposons mit U3-Enden als Substrate verwendet werden und virusartige Ty1-Teilchen die Funktionen der Transposition unterstützen (28), um die Plasmide mit Inserts aus Hefen und humaner DNA zu sequenzieren. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist das Erfordernis der mühsamen Herstellung von VLPs. Eine in vitro-Transposition mit einem MLV-Integrasesystem wurde als Hilfsmittel dazu, einige der Geheimnisse des Verpackens von Chromatin zu lüften (29)(30)(31) und als Hilfsmittel für einen funktionellen, genetischen Fußabdruck (32) verwendet. Die MLV-Insertionen scheinen jedoch nicht komplett zufällig zu sein. Eine Aufgabe der Erfindung ist daher, ein Transposon und eine Transpositionsreaktion mit mehr zufälliger Spezifität zu der Targetsite bereitzustellen. Aus diesem Grund untersuchte der Erfinder selektiv die Targetsite des TnsC^A225V-Mechanismus in vitro und erforschte die Lebensfähigkeit dieser Reaktion als wirksames Hilfsmittel für eine zufällige über Insertion erfolgende Mutagenese.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes, ATP-verwendendes Transpositionsregulationsprotein bereit, wobei das Protein eine Mutation aufweist, die, verglichen mit dem Wildtyp, die Spezifität der Targetsite eines transponierbaren Elements verringert und dadurch gekennzeichnet ist, dass das Protein TnsC (SEQ D No: 2) ist und dass die Mutation ausgewählt ist aus A225V, E273K, E233K, A282T, S401YΔ402 und S401F.
Die Mutation kann ausgewählt sein aus A225V, E273K und E233K uns ist vorzugsweise A225V. Diese Proteine können die TnsA + B-Transposase in Abwesenheit von TnsD oder TnsE aktivieren.
Nachdem der Umfang der vorliegenden Erfindung angegeben wurde, wird er nun in allgemeiner beschrieben und angegeben werden.
Ein allgemeines Merkmal der Erfindung betrifft entsprechend ein transponierbares System, das eine effiziente, einfache, unspezifische oder zufällige Insertion in einen gegebenen DNA-Abschnitt erreicht.
Ein weiteres, allgemeines Merkmal der Erfindung betrifft ein transponierbares System, das eine effiziente, zufällige, über Insertion erfolgende Mutation über eine einfache Insertion erreicht.
Ein spezielleres Merkmal der Erfindung betrifft daher ein transponierbares System, das über eine einfache Insertion eine, verglichen mit dem Wildtyp, verringerte, effiziente Targetsite-Spezifität erreicht und vorzugsweise zufällig ist.
Ein besonders bevorzugtes Merkmal der Erfindung betrifft ein Transposon, das eine Mutation in einem von einem Transposon abgeleiteten Protein, was eine effiziente, einfache Insertion ermöglicht, und eine, verglichen mit dem Wildtyp, verringerte Targetsite-Spezifität aufweist und vorzugsweise zufällig ist.
Ein noch spezielleres Merkmal der Erfindung betrifft ein transponierbares System mit einer Mutation in einem von einem Transposon-abgeleiteten, ATP-verwendenden Regulatorprotein. Die Mutation lässt die effiziente, einfache, unspezifische oder zufällige Insertion des transponierbaren Elements in einen DNA-Abschnitt zu oder stellt zumindest eine, verglichen mit dem Wildtyp, verringerte Targetsite-Spezifität bereit.
Ein bevorzugtes Merkmal der Erfindung betrifft ein transponierbares Tn7-System, das eine einfache, effiziente, unspezifische oder zufällige Insertion in einen gegebenen DNA-Abschnitt oder zumindest eine, verglichen mit dem Wildtyp-Tn7, verringerte Targetsite-Spezifität erreicht.
Ein bevorzugtes Merkmal der Erfindung betrifft eine Mutation im Tn7-Transposon, die eine effiziente, einfache, unspezifische Insertion in ein gegebenes DNA-Segment oder zumindest eine, verglichen mit dem Wildtyp-Tn7, verringerte Targetsite-Spezifität verleiht.
Ein bevorzugtes Merkmal der Erfindung betrifft ein transponierbares Tn7-System mit einer Mutation in dem TnsC-Protein, das in dem Tn7-Transposon codiert wird, wobei die Mutation eine effiziente, einfache Insertion mit einer, verglichen mit dem Wildtyp, verringerten Targetsite-Spezifität zulässt und vorzugsweise eine unspezifische Insertion in einen DNA-Abschnitt zulässt.
Die Aufgaben der Erfindung betreffen auch Verfahren zum Verwenden der obigen Zusammensetzungen.
Ein allgemeines Merkmal der Erfindung betrifft entsprechend ein Verfahren zur effizienten, einfachen, zufälligen Insertion eines transponierbaren Elements in einen gegebenen DNA-Abschnitt.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung betrifft ein Verfahren für eine effiziente, einfache, zufällige, durch Insertion erfolgende Mutagenese mit Hilfe eines transponierbaren Elements.
Ein bestimmtes Merkmal der Erfindung betrifft ein Verfahren zur effizienten, einfachen zufälligen Transposition eines transponierbaren Elements in einen DNA-Abschnitt oder bei dem die Spezifität der Transposition verglichen mit dem Wildtyp verringert ist.
Ein noch spezielleres Merkmal der Erfindung betrifft ein Verfahren zur effizienten, einfachen, zufälligen Transposition eines transponierbaren Elements in einen DNA-Abschnitt, bei dem die Spezifität der Transposition im Vergleich zum Wildtyp verringert ist, unter Verwenden eines transponierbaren Systems, das eine Mutation aufweist, die eine effiziente, einfache Insertion mit einer, verglichen mit dem Wildtyp, verringerten Targetsite-Spezifität verleiht, und vorzugsweise eine zufällige Insertion.
Eine spezielleres Merkmal der Erfindung betrifft ein Verfahren zur effizienten, einfachen, zufälligen Transposition eines transponierbaren Elements in ein DNA-Fragment oder bei dem die Spezifität der Transposition, verglichen mit dem Wildtyp, verringert ist, unter Verwenden eines transponierbaren Systems mit einer Mutation in einem ATP-verwendenden Regulatorprotein, wobei die Mutation die effiziente, einfache, unspezifische Insertion des transponierbaren Elements in ein DNA-Segment zulässt oder zumindest eine, verglichen mit dem Wildtyp, verringerte Targetsite-Spezifität bereitstellt.
Ein bevorzugtes Merkmal der Erfindung betrifft ein Verfahren zur effizienten, einfachen Transposition eines transponierbaren Elements in einen DNA-Abschnitt, bei dem die Spezifität der Transposition, verglichen mit dem Wildtyp, verringert ist, oder vorzugsweise zufällig ist, durch Bereitstellen eines transponierbaren Tn7-Systems, das zu einer unspezifischen Insertion in einen DNA-Abschnitt in der Lage ist, oder zumindest einer, verglichen mit dem Wildtyp-Tn7, verringerten Targetsite-Spezifität.
Eine weiteres Merkmal der Erfindung betrifft ein Verfahren zur effizienten, einfachen Transposition eines Transposons als transponierbares Element in einen DNA-Abschnitt, bei dem die Spezifität der Transposition, verglichen mit dem Wildtyp, verringert ist, oder vorzugsweise zufällig ist, durch Bereitstellen einer Tn7-Mutation, die die Wirksamkeit, Fähigkeit zum Ausführen einer einfachen Insertion und die Zufälligkeit oder verringerte Spezifität verleiht.
Eine weiteres Merkmal der Erfindung betritt ein Verfahren zur effizienten, einfachen, zufälligen Transposition eines transponierbaren Elements in einen DNA-Abschnitt oder bei dem die Spezifität, verglichen mit dem Wildtyp, verringert ist durch Bereitstellen einer Mutation in dem TnsC-Protein, das in dem Tn7-Transposon codiert wird, wobei die Mutation eine, verglichen mit dem Wildtyp, Verringerung der Targetsite-Spezifität zulässt und vorzugsweise eine unspezifische oder zufällige Insertion des transponierbaren Tn7-Elements in einen DNA-Abschnitt zulässt.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Sequenzieren von DNA unter Verwenden eines transponierbaren Systems, um Priming-Sites an zufällig verteilten Positionen innerhalb eines Fragments von Interesse, wenn das Fragment länger ist als die Durchlauflänge der Sequenz, einzuschleusen.
Ein bevorzugtes Merkmal der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Sequenzieren von DNA unter Verwenden eines transponierbaren Systems mit einer Mutation, die eine effiziente und einfache Insertion und eine Selektivität der Targetsite, die verglichen mit dem Wildtyp, verringert und vorzugsweise zufällig ist, zulässt.
Ein bevorzugtes Merkmal der Erfindung betrifft eine Mutation in einem ATP-verwendenden Regulatorprotein. Die Mutation erlaubt die effiziente, einfache, unspezifische Insertion des Transposons in einen DNA-Abschnitt oder stellt zumindest eine gegenüber dem Wildtyp verringerte Targetsite-Spezifität bereit.
Ein ganz besonders bevorzugtes Merkmal der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Sequenzieren von DNA unter Verwenden eines transponierbaren Tn7-Systems, das eine effiziente, einfache, unspezifische Insertion in einen DNA-Abschnitt oder zumindest eine, verglichen mit dem Wildtyp-Tn7, verringerte Targetsite-Spezifität zulässt.
Ein ganz besonders bevorzugtes Merkmal der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Sequenzieren von DNA unter Verwenden eines transponierbaren Tn7-Systems mit einer Mutation in dem TnsC-Protein, wobei die Mutation eine effiziente, einfach Insertion und eine verglichen mit dem Wildtyp, Verringerung der Targetsite-Spezifität zulässt und vorzugsweise eine unspezifische oder zufällige Insertion des transponierbaren Tn7-Elements in den DNA-Abschnitt zulässt.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung betrifft Verfahren, wie sie oben beschrieben sind, die bei einem beliebigen, gegebenen DNA-Abschnitt angewendet werden können. Dieser schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf, Plasmide, Genome aus Zellen, einschließlich prokaryotischer und eukaryotischer Zellen, künstliche Bakterienchromosome, künstliche Hefechromosome und künstliche Säugerchromosome sowie Unterabschnitte all dieser.
Ein Merkmal der Erfindung betrifft diese Verfahren in vitro oder in vivo.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung betrifft Kits zum Durchführen der oben beschriebenen Verfahren unter Verwenden der oben beschriebenen Transposons oder von Teilen derselben.
Der Erfinder hat entsprechend ein transponierbares System und Verfahren entwickelt, die in vitro- oder in vivo-Verfahren zum Übertragen, die vorher beschrieben wurden, dahingehend verbessern, dass diese Verfahren bei einer Transposition effizient sind, eine relativ zufällige Insertion bereitstellen und fast alle rückgewonnen Produkte einfache Insertionen an einem einzigen Ort, die daher nützliche Informationen bereitstellen, sind.
Allgemein betrifft die Erfindung ein transponierbares System, das eine einfache, effiziente, zufällige Insertion in einen gegebenen DNA-Abschnitt erreicht.
Die Erfindung betrifft ferner ein transponierbares System, das zu einer effizienten, zufälligen, durch Insertion erfolgenden Mutagenese, vorzugsweise mit Hilfe einer einfachen Mutation, in der Lage ist.
Die Erfindung betrifft ganz besonders ein transponierbares System mit einer Targetsite-Spezifität, die gegenüber dem Wildtyp verringert und vorzugsweise zufällig ist, das eine einfache und effiziente Insertion zulässt.
Die Erfindung betrifft ferner ein transponierbares System, das eine Mutation aufweist, die eine Targetsite-Spezifität zulässt, die gegenüber dem Wildtyp verringert und vorzugsweise zufällig ist.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise ein transponierbares System mit einer Mutation in einem ATP-verwendenden Regulatorprotein, wobei die Mutation die effiziente, einfache, unspezifische Insertion des Transposons in einen DNA-Abschnitt zulässt oder zumindest die gegenüber dem Wildtyp verringerte Targetsite-Spezifität bereitstellt.
Besonders bevorzugt betrifft die Erfindung ein transponierbares Tn7-System, das eine effiziente, einfache, unspezifische Insertion in einen gegebenen DNA-Abschnitt oder zumindest eine, verglichen mit dem Wildtyp-Tn7, verringerte Targetsite-Spezifität erreicht.
Besonders bevorzugt betrifft die Erfindung eine Mutation in einem Tn7-Transposon, die die Fähigkeit zu einer effizienten, einfachen, unspezifischen Insertion in einen DNA-Abschnitt oder eine, verglichen mit dem Wildtyp-Tn7, verringerte Targetsite-Spezifität verleiht.
Die Erfindung betrifft besonders bevorzugt eine Mutation in dem TnsC-Protein, das in dem Tn7-Transposon codiert wird, wobei die Mutation eine einfache, effiziente Insertion und eine, verglichen mit dem Wildtyp, Verringerung der Targetsite-Spezifität zulässt und vorzugsweise eine unspezifische oder zufällige Insertion der Tn7-TRansposition in einen DNA-Abschnitt zulässt.
In einer bestimmten, offenbarten Ausführungsform der Erfindung ist die Erfindung auf eine als TnsC^A225V bezeichnete Tn7-Mutante gerichtet, die eine Mutante mit einer Substitution von Alanin gegen Valin an der Aminosäure Nummer 225 in dem TnsC-Gen ist.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Verwenden von jeder der obigen Zusammensetzungen. Die Verfahren sind auf die Transposition oder Insertion der oben beschriebenen transponierbaren Elemente gerichtet.
Die Erfindung betrifft entsprechend eine effiziente, einfache, zufällige Insertion eines Transposons in einen gegebenen DNA-Abschnitt oder zumindest eine Insertion mit im Vergleich zum Wildtyp verringerter Spezifität.
Die Erfindung betrifft ferner Verfahren für eine durch Insertion erfolgende Mutagenese unter Verwenden eines transponierbaren Systems, das zu einer Insertion mit im Vergleich zum Wildtyp verringerter Spezifität in der Lage ist.
Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zur Insertion eines transponierbaren Elements in einen DNA-Abschnitt, bei dem die Targetsite-Spezifität gegenüber dem Wildtyp verringert ist und vorzugsweise zufällig ist, wenn die Insertion effizient und einfach ist.
Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Insertion eines transponierbaren Elements in einen DNA-Abschnitt durch Bereitstellen eines transponierbaren Elements, das eine Mutation, die eine effiziente und einfache Insertion zulässt, und eine Targetsite-Spezifität, die gegenüber dem Wildtyp verringert und vorzugsweise zufällig ist, aufweist.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise Verfahren zum Inserieren eines transponierbaren Elements in einen DNA-Abschnitt durch Bereitstellen eines transponierbaren Tn7-Systems, das eine effiziente, einfache, unspezifische Insertion in einen gegebenen DNA-Abschnitt oder zumindest eine, verglichen mit dem Wildtyp-Tn7, verringerte Targetsite-Spezifität zulässt.
Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein transponierbares Tn7-System, mit einer Mutation, die eine einfache, effiziente und unspezifische Insertion eines transponierbarem Elements in einen DNA-Abschnitt zulässt oder zumindest eine gegenüber dem Wildtyp-Tn7 verringerte Targetsite-Spezifität bereitstellt.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise Verfahren zum Inserieren eines transponierbaren Elements in einen DNA-Abschnitt durch Bereitstellen eines transponierbaren Tn7-Systems mit einer Mutation in dem TnsC-Protein, wobei die Mutation eine effiziente und einfache Insertion und eine, verglichen mit dem Wildtyp, Verringerung der Targetsite-Spezifität zulässt und vorzugsweise eine unspezifische oder zufällige Insertion der Tn7-Transposition in einen DNA-Abschnitt zulässt.
Besonders bevorzugt betrifft die Erfindung Verfahren zum Inserieren eines transponierbaren Elements in einen DNA-Abschnitt durch Bereitstellen der Tn7-Mutante TnsC^A225V.
Die Erfindung betrifft auch Kits zum Durchführen der oben beschriebenen Verfahren und der nachstehend beschriebenen Verfahren. Vorzugsweise wird ein Kit geliefert, dessen Bestandteile ein mutantes, ATP-verwendendes Regulatorprotein, das von einem Transposon stammt, umfassen, wobei die Mutation eine effiziente, einfache, unspezifische Insertion des Transposons in einen gegebenen DNA-Abschnitt zulässt. Das Kit kann auch ein transponierbares Element bereitstellen, das als Teil eines größeren DNA-Abschnitts gefunden werden kann; zum Beispiel ein Donor-Plasmid. Das Kit kann ferner einen Puffer umfassen, der mit der Insertion des transponierbaren Elements kompatibel ist. Weiterhin kann das Kit eine Kontroll-Target-Sequenz, wie beispielsweise ein Kontroll-Target-Plasmid, zum Bestimmen, ob alle Bestandteile richtig funktionieren, umfassen. Zur Sequenzierung von DNA kann das Kit ferner Extensionsprimer für die Sequenzierung, die zu einem oder mehreren Orten in dem transponierbaren Element homolog sind, umfassen. Die Primer können eine Homologie zu Sequenzen außerhalb des transponierbaren Elements (d. h. in einem Target-Vehikel) aufweisen.
In diesen Kits kann das mutante Protein als gereinigtes Proteinprodukt zugegeben werden, kann in dem transponierbaren Element codiert werden und von diesem produziert werden oder auf von dem transponierbaren Abschnitt getrennten Vektoren codiert werden, um in vivo produziert werden zu können.
Es versteht sich von selbst, dass die Erfindung transponierbare Systeme mit verschiedenen Ausmaßen der Verringerung der Targetsite-Spezifität gegenüber dem Wildtyp betrifft, die für die hierin beschriebenen Zwecke der Erfindung nützlich sind.
Kurze Beschreibung der Figuren
1. Phänotypen der Papillenbildung der gain of function-Mutanten von TnsC. Die Zellen wurden auf MacConkey-Lactoplatten gesetzt („gepatcht") und nach dreitägiger Inkubation bei 30°C fotografiert. TnsA + B war in jedem Stamm vorhanden; die vorhandene TnsC-Spezies ist unter jedem Fleck angegeben.
2. Änderungen der Aminosäuren in den TnsC-Mutanten. Die Sequenz des TnsC-Proteins (SEQ ID NOS: 1 und 2) ist karikiert, wobei die Reste in den Mutanten der Klasse I oberhalb des Proteins und die Mutanten der Klasse II unterhalb des Proteins angegeben sind. Die schraffierten Kästchen stellen die Walker A- und Walker B-Motive dar.
3. Die TnsC-Mutanten fördern die Transposition zum Chromosom. Die Häufigkeiten der Transposition von minTn7-Km^R von einem λ-Phagen zu dem Chromosom wurden mit Hilfe des λ-Sprungtests („Hop Assay") gemessen. TnsA + B war in jedem Stamm vorhanden; die vorhandene TnsC-Spezies ist unter jeder Säule angegeben.
4. Die TnsC-Mutanten fördern die Transposition zu konjugierbaren Elementen. Die Häufigkeiten der Transposition von minTn7-Km^R von dem Chromosom zu dem konjugierbaren Target-Plasmid pOX-G wurden mit Hilfe des Ausschlusstests („Mating-out-Assay”) gemessen. TnsA + B war in jedem Stamm vorhanden; die vorhandene TnsC-Spezies ist unter jeder Säule angegeben.
5. Effekte der Target-Selektionsfaktoren TnsD und TnsE. Die Häufigkeiten der Transposition von minTn7-Km^R von einem λ-Phagen zu dem Chromosom und/oder pOX-G wurden in Stämmen gemessen, die TnsA + B und die TnsC-Mutante entweder allein oder in einer Kombination mit TnsD oder TnsE enthielten, gemessen. Das bevorzugte Target für TnsD-Reaktionen, attTn7, war in den Chromosomen dieser Stämme vorhanden. Das bevorzugte Target für die TnsE-Reaktionen, pOX-G, wurde mittels Konjugation in Stämme, die die TnsC-Mutanten oder die TnsC-Mutanten + TnsE enthielten, eingeschleust. Die Verteilung der miniTn7-Km^R-Insertionen zwischen dem Chromosom und pOX-G wurde durch Einpassen der pOX-G-Plasmide aus den Km^R-Produkten eines λ-Sprungtests in den Km^S-Stamm CW51 und Überprüfen, ob die Km-Resistenz Plasmid-gebunden war, bestimmt. Es wurde keine Transposition in den Stämmen, die TnsABC^wt allein oder TnsABC^E233K + TnsD enthielt, nachgewiesen.
6. Substrate, Intermediate und Produkte der Tn7-Transposition. Ein Substrat ist ein Donor-Plasmid, das ein miniTn7-Element enthält, das die wesentlichen, cis-agierenden Sequenzen für die Transposition an jedem Ende enthält. Das andere Substrat ist ein Target-Plasmid. Die Transposition startet mit dem Aufbrechen eines Doppelstrangs an jedem Ende des Elements, worauf ein zweiter Bruch an dem anderen Ende erfolgt, um ein ausgeschnittenes, lineares Transposon zu erzeugen. Das ausgeschnittene Transposon wird dann mit der Target-DNA verbunden, um eine einfache Insertion zu bilden.
7. Analyse der Reaktionen Tn7-Transposition auf Agarosegel. Das Donor-Plasmid, ein pBR-Derivat, enthielt ein miniTn7-Element, das ein Kanamycingen enthielt, und das Target-Plasmid enthielt einen attTn7-Ort. Die Reaktionen für die Rekombination wurden so durchgeführt, wie es beschrieben ist, die DNAs wurden mittels Phenolextraktion aus der Reaktionsmischung isoliert, mit einem Restriktionsenzym, das einmal in dem Rückgrat des Donors schneidet, verdaut, mittels Elektrophorese auf einem Agarosegel gezeigt, mittels Elektrotransfer auf eine Membran übertragen und mit einer Sonde, die für das miniTn7-Element spezifisch ist, hybridisiert. Bahn 1: TnsA + B; Bahn 2: TnsA + B + C^wt; Bahn 3: TnsA + B + CE233K; Bahn 4: TnsA + B + CS^401YΔ402; Bahn 5: Tns(A + B) + C^A225V.
8. Die durch TnsA + B + C^A225V vermittelte Tn7-Insertion erfolgt an vielen Orten in einer Target-DNA. Die Reaktionen einer in vitro-Transposition unter Verwenden von TnsA + B + C^A225V wurden durchgeführt und die DNAs mittels Phenolextraktion und Ethanolfällung isoliert. Dann wurde eine PCR-Reaktion unter Verwenden der Transpositionsprodukte als Templat durchgeführt, bei der ein Primer (NLC 209) (SEQ ID NO: 8) zu einer Sequenz auf der Target-DNA komplementär war und ein anderer Primer NLC 95 (SEQ ID NO: 7) zu dem linken Ende von Tn7 komplementär war. Die Länge der PCR-Produkte wird in Abhängigkeit von der Position der Tn7-Insertion variieren, wobei zum Beispiel Insertionen, die näher an dem Target-Primer liegen, kurz sein werden (Insert 1) und diejenigen, die weiter entfernt sind, länger sein werden (Insert 2). Die Produkte dieser in vitro-Reaktion wurden dann mittels Elektrophorese auf einem denaturierenden Acrylamidgel gezeigt, von dem Gel auf Membranen übertragen und über eine Hybridisierung an eine radioaktiv markierte Sonde, die an einem Ende des Transposons an die Tn7-Sequenzen hybridisiert, analysiert.
9. Analyse der Verteilung der Insertionen in verschiedenen Bereichen des Plasmids. Tn7 zeigt in vielen Bereichen eines Targets eine geringe Targetsite-Selektivität. Die Reaktionen der in vitro-Transposition wurden ausgeführt und die Produkte als Templat für PCR-Reaktionen, wie sie oben beschrieben sind, mit Ausnahme der Target-Primer, verwendet. Bei diesen Versuchen wurde ein Primer an einem Ende von Tn7 (NLC 95) (SEQ ID NO: 7) verwendet und in separaten Reaktionen wurden Primer von verschiedenen anderen Positionen in der Target-DNA verwendet.
10A–C. Aufbau eines Tn7-Donor-Plasmids. A. Ein Plasmid enthält ein miniTn7-Element, in dem die wesentlichen, cis-agierenden Sequenzen an den Enden des Elements einen selektierbaren Marker flankieren. Die Translokation des Elements kann leicht mit Hilfe einer Hybridisierung an eine für miniTn-spezifische Sonde verfolgt werden. Viele verschiedene Arten von Informationen könnten innerhalb der Enden als selektierbare oder identifizierbare Marker, zum Beispiel ein Antibiotikaresistenzgen vorliegen. Wenn die Produkte der Transformation in vivo rückgewonnen werden sollen, ist es günstig, die Donor-DNA, die nicht reagiert hat, durch Verdau mit einem Restriktionsenzym, das für das Rückgrat des Donors selektiv ist, zu entfernen; alternativ dazu kann ein gewöhnliches Replikon verwendet werden. B. Sequenz des Donor-Plasmids pEM delta R. neben 1 (SEQ ID NO: 3). Das Plasmid trägt ein 1625 bp großes mini-Tn7-Element: 199 bp von Tn7R und 166 bp von Tn7L flankieren ein Kan-Gen mit SalI-Schnittstellen an den Verbindungsstellen. Das Rückgrat ist pTRC99 (Pharmacia); mini-Tn7 plus flankierende Wirts-DNA wurden in die SmaI-Schnittstelle kloniert. C. Ein allgemein verwendetes Derivat ist pEM-Δ (SEQ ID NO: 4), ein pBR-Plasmid, das ein Kanamycin-mTn7-Element enthält.
11A–B. Tn7-Target-Plasmide. A. Sequenz des Target-Plasmids pER 183 (SEQ ID NO: 5). Dieses 8,9 bp große pACYC184-Derivat trägt eine Chloramphenicol-Resistenz, einen p15A-Replikationsursprung und Inserts, die mcrB, mcrC, hsdS und einen Abschnitt des Phagen f1 tragen. Zum Nachweisen der Präferenz mit mäßiger Komplexität (bis zu vier bp große Präferenzen sollten nachweisbar sein), wurde ein großes Target verwendet. Zudem variieren verschiedene Abschnitte des Plasmids in ihrem G + C-Gehalt zwischen 35% und 68%, so dass jede Präferenz, die das Transpositionssystem für einen bestimmten G + C-Gehalt zeigen könnte, offenbart werden könnte. B. Die in dieser Arbeit verwendeten Haupt-Targets sind Prm2 (SEQ ID NO: 6), ein 3190 bp großes Derivat, das einen attTn7-Abschnitt enthält, und pER183 (SEQ ID NO: 5), ein pACYC-Derivat, das mehrere Gene von E: coli enthält.
12. Diagramm der Durchläufe der Sequenzierung, um die Positionen von 63 Insertionen von mini-Tn7 in pER183 (SEQ ID NO: 5) festzustellen. Die Nummern oben bezeichnen die Koordinaten auf der Sequenz von pER183 (SEQ ID NO: 5), die in 11B gezeigt sind. Die Pfeile zeigen die Richtung der Primer-Extension an; die Schäfte der Pfeile bedecken die Sequenz, die aus dem Durchlauf erhalten wurde. Willkürliche Nummern, die an die Pfeile gekoppelt sind, wurden von dem Sequenzassemblierungsprogramm AUTOASSEMBLE festgelegt.
13. Graph der beobachteten Verteilung der Insertionen in 100 bp großen Intervallen von pER183 (SEQ ID NO: 5) und die erwartungsgemäße Verteilung, wenn die Verteilung zufällig war. Auf der Abszisse ist die Anzahl an Insertionen pro Intervall angegeben; auf der Ordinate ist die Anzahl an Intervallen angegeben, die diese Anzahl an Insertionen aufweisen. Die Kreuzchen zeigen die für eine zufällige (Poisson-)Verteilung der Insertionen entlang der Sequenz erwarteten Werte; die Rauten zeigen die beobachteten Werte.
14. Der Grundaufbau der 5 bp großen Sequenzen, die während des Vorgangs der Tn7-Insertion für die 63 untersuchten Orte verdoppelt wurden. Auf der Abszisse sind die Positionen auf der Sequenz unter Bezugnahme auf das rechte Ende von Tn7 (Tn7R) nummeriert, so dass die Position 1 unmittelbar daneben, die Position 5 5 bp entfernt ist (siehe Diagramm unterhalb des Graphen). Auf der Ordinate ist die Anzahl an Beispielen für eine bestimmte Base an dieser Position angegeben. Alle Basen sind an allen Orten gut repräsentiert.
15. Effekt der vier Verfahren zum Stoppen der Transpositionsreaktion bei der Vorbereitung des Einschleusens in Zellen. Es sind die Ergebnisse für die vierfach durchgeführten Bestimmungen (Abszisse) von jedem der vier Verfahren (z-Achse), die als Anzahl an Transformanten pro 1/50 der Gesamtreaktion (Ordinate) angegeben sind, gezeigt. Die Behandlungen waren: keine Behandlung; Hitzebehandlung bei 65°C für 20 Minuten; Hitzebehandlung bei 75°C für 10 Minuten; und Phenolextraktion und anschließende Ethanolfällung. Die Hitzebehandlung bei 75°C, jedoch nicht diejenige bei 65°C, lässt eine effektive Rückgewinnung zu.
16. Ein zweiter Versuch, der den Effekt von drei Verfahren zum Stoppen der Transpositionsreaktion bei der Vorbereitung des Einschleusens in Zellen zeigt. Es sind die Ergebnisse für die doppelt durchgeführten Bestimmungen von jedem der drei Verfahren zum Stoppen (Abszisse) für vier Dosierungen von zwei verschiedenen Aliquots von TnsB (z-Achse), die als Anzahl an Transformanten pro 1/25 der Reaktion angegeben sind, gezeigt. Die Behandlungen waren: Hitzebehandlung bei 75°C für 10 Minuten; Ethanolfällung allein; oder Hitzebehandlung bei 65°C für 20 Minuten. Auf der z-Achse wurden die beiden Aliquots (1- oder 2-) von TnsB, in vier verschiedenen Dosierungen, 1 μl, 1,5 μl, 2 μl oder 3 μl, verwendet. Die mit 1–2 markierte Reihe verwendete beispielsweise 2 μl des Aliquots 1. Die Hitzebehandlung bei 75°C, jedoch nicht diejenige bei 65°C, lässt eine effektive Rückgewinnung zu. Dieser Versuch veranschaulicht auch die Reaktion auf die Dosis von TnsB.
17. Effekt von zwei Verfahren der Lagerung der Proteine auf die Effizienz der Transpositionsreaktion. Die Abszisse zeigt die getesteten Lagerungsbedingungen: „einzeln", die Proteine TnsA, TnsB und TnsC wurden einzeln in separaten Röhrchen bei –70°C gelagert; „als Mischung (A2a)", die Proteine TnsA, TnsB und TnsC wurden zusammen als Mischung bei –70°C gelagert. Die Ordinate zeigt die Anzahl an Transformanten pro 1/50 der Gesamtreaktion. Jede Behandlung wurde mit vierfach wiederholter Bestimmung getestet.
18. Effekt von drei Verfahren zur Lagerung der Proteine auf die Effektivität der Transpositionsreaktion. Die Abszisse zeigt die getesteten Lagerungsbedingungen: „einzeln", die Proteine TnsA, TnsB und TnsC wurden einzeln in separaten Röhrchen bei –70°C gelagert; „als Mischung ^–70 (A2a)", die Proteine TnsA, TnsB und TnsC wurden zusammen als Mischung bei –70°C gelagert; „als Mischung ^–20 (A2a)", die Proteine TnsA, TnsB und TnsC wurden zusammen als Mischung bei –20°C gelagert. Die Ordinate zeigt die Anzahl an Transformanten pro 1/50 der Gesamtreaktion. Jede Behandlung wurde mit vierfach wiederholter Bestimmung getestet.
19. 19A. Nukleotidsequenz von TnsC (SEQ ID NO: 1), 19B. Aminosäuresequenz von TnsC (SEQ ID NOS: 1 und 2).
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
In der Wissenschaft umfasst der Begriff „Transposon" ein Segment, das von bestimmten, cis-agierenden Orten flankiert ist, die für das Eintreten einer Mobilisierung, zusammen mit den Genen, die die Proteine spezifizieren, die auf diese cis-agierenden Orte wirken, um, unabhängig davon, ob die für das Protein codierende Gene zwischen den angegebenen Orten liegen, den durch sie definierten Abschnitt zu mobilisieren, erforderlich sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Tn7-Transposon dem Wildtyp-Transposon entsprechen, außer, dass das Transposon für ein mutantes TnsC codiert. Dieses Transposon stellt daher die Proteinprodukte bereit, die für die Mobilisierung erforderlich sind. Es ist jedoch kein vollständiges Transposon erforderlich, um die Erfindung ausführen zu können. Der Begriff „Transposonderivat", „transponierbares Element" oder „insertierbares Element", wie er hierin verwendet wird, kann daher auch DNA bezeichnen, die mindestens die cis-agierenden Orte umfassen, an denen die trans-agierenden Proteine wirken, um den durch die Orte definierten Abschnitt zu mobilisieren. Es wird auch verstanden, dass die Orte intervenierende DNA enthalten können.
Der Ausdruck „transponierbares System", wie er hierin verwendet wird, umfasst ein Transposon, der eine Mutation in einem nativen, ATP-verwendenden Regulatorprotein, das, wenn es aus dem Transposon exprimiert wird, eine unspezifische Targetsite-Selektivität oder eine verringerte Targetsite-Selektivität zulässt, wie hierin offenbart ist, enthält. Der Ausdruck umfasst auch die Modifikationen, bei denen die relevanten Proteine nicht auf dem transponierbaren Element codiert werden, nichtsdestotrotz jedoch auf dieses wirken, um die Ziele der Erfindung zu erreichen. Daher umfasst das System Zusammensetzungen, in denen das mutante Protein zu einem transponierbaren Element gegeben wird, das aus einem Transposon abgeleitet ist, wobei das Element jedoch weniger als die volle Anzahl der Gene enthält. Die einzige Einschränkung bei diesem Element ist, dass es die cis-agierenden Sequenzen, auf die das mutante Protein wirkt, das einen Einbau des Elements in eine Target-DNA zulässt, enthalten soll. Das System umfasst daher DNA mit cis-agierenden Orten (die heterologe DNA-Sequenzen enthalten können) und die trans-agierenden Proteine, die diese Orte dazu verwenden, den durch die Orte definierten Abschnitt zu mobilisieren, unabhängig davon, wie sie in der DNA angeordnet sind. Die Proteine können entsprechend in separaten Plasmiden oder in gereinigter Form bereitgestellt werden.
Der Begriff „von einem Transposon abgeleitet", wie er hierin zur Bezeichung des mutanten Proteins verwendet wird, bezieht sich auf ein Derivat eines Proteins, das normalerweise auf dem Transposon zu finden ist. Dies muss jedoch kein natürlich vorkommendes Protein sein, sondern kann das Protein sein, das durch rekombinante oder chemische Syntheseverfahren, die in der Wissenschaft bekannt sind, produziert werden kann.
Der Begriff „transponierbares Element" umfasst sowohl Transposons als auch deren Derivate. Die einzige Einschränkung bei dem Derivat ist, dass es zu einer Insertion in der DNA, die cis-agierenden Sequenzen enthält, die mit trans-agierenden Proteinen Wechselwirken, um den Einbau des Elements zu bewirken, in der Lage sein soll.
Die Erfindung betrifft ein transponierbares System, das einen einfachen Einbau eines transponierbaren Elements in ein gegebenes DNA-Target effizient und mit einem relativ geringen Grad an Spezifität, vorzugsweise einer zufälligen Spezifität, zulässt. Mit „relativ" ist der Grad an Spezifität im Vergleich zu dem Wildtyp gemeint.
Die Effizienz des Einbaus kann je nach der bestimmten Verwendung für die die Insertion gewünscht ist, variieren. Die hierin beschriebenen Mutationen, erhöhen die Effizienz des Einbaus im Vergleich zu der Häufigkeit beim Wildtyp. Die Erfindung umfasst eine Effizienz von einem einfachen Einbauereignis alle 5–10 Kilobasen. Bevorzugte Mengen an Einbauten erlauben in jedem Gen mehrere einfachen Insertionen in verschiedenen Positionen.
Der Einbau wird auch durch den Grad der Spezifität, der durch die Mutation verliehen oder zugelassen wird, bewirkt. Die Spezifität bezieht sich damit auf die Verbindung zwischen einer Target-DNA-Sequenz und dem transponierbaren System.
Ein bevorzugter Grad an Spezifität führt zu einer durchschnittlichen Insertion in jedem Gen. Eine aus praktischen Gründen untere Grenze würde, im Durchschnitt, eine Insertion alle zwanzig Gene betragen.
Bei einer Sequenzierung treten mehr als oder gleich 90% der gescreenten Insertionen an verschiedenen Positionen auf (d. h. die Insertionen betreffen mindestens 9 verschiedene Orte), so dass fast jedes untersuchte Templat neue Informationen liefert. Dies stimmt bei DNAs mit einer Vielzahl an verschiedenen Basenzusammensetzungen, da mögliche Target-DNAs zwischen 20% und 80% G + C variieren können. Ein anderer Weg, die mögliche Zufälligkeit des Systems zu beschreiben ist, anzugeben, dass von 63 Insertionen 62 Insertionsorte gefunden wurden (ungefähr 98% der Insertionen liegen an verschiedenen Positionen vor).
Für eine Mutagenese wurden weitgehend nicht-kommerzielle Systeme verwenden, mit denen eine nur so geringe Menge wie 10% an Insertionen an verschiedenen Orten erreicht wurden (d. h. 9 von 10 Insertionen finden an dem gleichen Ort statt). Die vorliegende Erfindung verbessert diesen Grad der Zufälligkeit.
Des Weiteren sind die Arten der Insertionen, die für die Diskussion der Häufigkeit relevant sind, einfache Mutationen.
Die Erfindung betrifft ein transponierbares System mit einer Mutation, die eine effiziente, einfache Insertion und eine verringerte oder zufällige Targetsite-Spezifität gewährleistet.
Der Begriff „einfache Insertion" bezeichnet das Ereignis des Einbaus einer einzigen Kopie des Elements, die durch Aufbrechen des Doppelstrangs und erneutem Verbinden in das Target eingeschleust wurde.
Obwohl einfache Insertionen (nur eine Kopie des Integranten) bevorzugt sind, kann es bestimmte Ausführungsformen geben, in denen mehr als eine Kopie nicht den Zweck der Anwendung, wie beispielsweise einige Anwendungen einer in vitro-Mutagenese, beeinträchtigt oder sogar gewünscht ist (zum Beispiel wenn mehrere Kopien einer heterologen DNA-Sequenz inseriert werden sollen). Die Erfindung ist entsprechend nicht auf den Fall beschränkt, in dem das transponierbare System nur eine einfache Insertion vorsieht.
In der Erfindung tritt die Mutation in einem von einem Transposon abgeleiteten, ATP-verwendenden Regulatorprotein auf. Ein solches Protein kann über seine Ähnlichkeit mit dem TnsC-Protein von Tn7, das heißt über seine Sequenzhomologie, dadurch, dass es ein Element eines Sequenzmotivs des Proteins besitzt, das einem Motiv des ATP-Bindungsorts in anderen von ATP abhängenden Proteinen ähnelt, oder durch Wiederherstellung eines in vitro-Transpositionssystems und Darstellung der in diesem in vitro-Transportsystem erforderlichen Nukleotide erkannt werden.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform tritt die Mutation in dem TnsC-Gen (SEQ ID NO: 1) auf, das für das TnsC-Protein (SEQ ID NOS: 1 und 2) von Tn7 codiert, auf. Diese Mutation stellt ein Tn7-Transposon bereit, das zu einer relativ unspezifischen Insertion in einen gegebenen DNA-Abschnitt in der Lage ist.
Die Erfindung ist daher auf die Insertion des transponierbaren Tn7-Elements gerichtet, jedoch nicht auf dieses transponierbare Element beschränkt. Die Erfindung kann entsprechend ohne mit Tn7 verwandte, transponierbare Elemente ausgeführt werden, da die Transposition mit Hilfe eines über ADP vermittelten Prozesses abläuft. Somit werden in dieser Offenbarung Mutationen in den ATP-verwendenden Proteinen in solchen Transposons ins Auge gefasst. Ebenso werden neben Tn7 Transposons mit ATP-verwendenden Regulatorproteinen ins Auge gefasst. Beispiele für solche Transposons sind Tn5090/Tn420; die durch Transposons codierten Proteine TniA, TniB und TniQ. TniB wäre das ATP-verwendende Protein.
Eine weitere Klasse an Transposons, bei der es möglich ist, die Häufigkeit durch Ändern der ATP-verwendenden Proteine zu erhöhen, schließt Tn552 und IS21 als Beispiele ein.
Die Erfindung betrifft die Insertion transponierbarer Elemente, die hierin beschrieben sind, in einen beliebigen DNA-Abschnitt eines beliebigen Organismus. Zudem betrifft die Erfindung auch die Insertion in einen beliebigen Abschnitt aus synthetischer DNA.
Die Insertion des transponierbaren Elements kann in vivo erfolgen. In diesem Fall wird das transponierbare Element in eine gewünschte Wirtszelle eingeschleust, wo es direkt in die DNA dieser Zelle integriert wird. Die einzige Einschränkung ist, dass das transponierbare Element zu einer Insertion in DNA der spezifischen Wirtszelle in der Lage sein soll. Solange die für die Transposition erforderlichen Proteine in einer gewünschten Zelle exprimiert werden, kann diese Zelle daher einen Wirt für die Insertion des transponierbaren Elements in eine beliebige DNA, die in dieser Wirtszelle gefunden werden kann, bereitstellen.
Das Ziel der Insertion kann die Inaktivierung von Genen sein. Die Inaktivierung von Genen ist für genetische Analysen (z. B. von Genfunktionen) nützlich.
Genanalysen beinhalten:

Beurteilung des Phänotyps eines Nullallels (exprimiert aufgrund einer Unterbrechung des Gens durch den transponierbaren Abschnitt kein funktionelles Protein);
Bestimmung der Folgen durch eine Insertion bestimmter, aktiver DNA-Strukturen oder Sequenzen für genetische Merkmale von Chromosomen oder Teile derselben, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, Zugänglichkeit zu DNAse I oder zu Fußabdruck-Reagenzien, oder Expression oder Silencing benachbarter, transkribierbarer Gene, oder zur Aktivierung genetischer oder epigenetische Prozesse, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, homologe Rekombination, chemische Mutagenese, oxidative DNA-Schäden, Methylierung der DNA, Insertion von Proviren oder Retroposons;
Bestimmung des Aufbaus einer Protein-Domäne mit Hilfe der Erzeugung mehrerer Unterbrechungspunkte innerhalb eines Genes bei einem Protein mit einer Multidomäne, wobei ein Genprodukt, dem eine oder mehrere Domänen der Multidomäne fehlen. eine partielle Aktivität oder partielle Aktivitäten, einschließlich antigener Aktivitäten oder immundominanten Epitope, zeigen könnte; [die Zufälligkeit ist hierbei vorrangig, es sind viele Insertionspositionen erforderlich, wenn Grenzen genau definiert werden sollen];
Bestimmung eines Expressionsmusters durch Erzeugen transkriptionaler Fusionen von einem Promotor in dem Target mit einem Reporter (z. B. beta-Galactosidase oder grünes fluoreszierendes Protein oder Chloramphenicol-Transactylase oder Luciferase) innerhalb des transponierbaren Abschnitts;
Bestimmung eines Expressionsmusters durch Erzeugen translationaler Fusionen von einem Teil eines Genprodukts, das von einem Target codiert wird, mit einem Genprodukt oder einem antigenen Peptid, die von dem transponierbaren Abschnitt codiert werden (z. B. beta-Galactosidase oder ein Epitop-Tag oder einem Affinitäts-Tag);
Bestimmung einer Operon-Struktur, in der die Unterbrechung der Transkription durch die eine Insertion, stromaufwärtig von einem Gen, zu einer geänderten Expression eines Gens führt, ohne dabei die Codiersequenz dieses Gens zu zerstören; unnötige Expression eines Gens, bei dem die Transkription von einem Promotor innerhalb des transponierbaren Abschnitts zur Expression eines Gens stromabwärtig von der Position der Insertion des transponierbaren Abschnitts führt, mit oder ohne Transkription des Promotors innerhalb des transponierbaren Abschnitts; unnötige Expression einer Proteinfusion, bei der die Transkription von einem Promotor innerhalb des transponierbaren Abschnitts zu der Translation eines Proteins, beginnend mit dem transponierbaren Abschnitt und fortlaufend bis außerhalb des Transposons, dann fortfahrend mit dem Gen, in das der transponierbare Abschnitt inseriert wurde, was zur Fusion des von dem Transposon codierten Proteins mit dem Target-Protein führt;
Bestimmung der Folgen aus dem Einschleusen irgendeines Transkripts oder Genprodukts, das vollständig innerhalb des transponierbaren Abschnitts codiert wird, in die Wirtszelle, insbesondere, wenn gewünscht ist, die Positions-Effekte (nicht nur die Folgen der Expression, sondern auch die Folgen der Expression in verschiedenen Positionen innerhalb des Genoms) zu bestimmen.

Eine Insertion kann auch zu dem Zweck erfolgen, heterologe DNA-Sequenzen in die DNA einer Wirtszelle einzuschleusen. Die DNA in der Wirtszelle, in der die Insertion erfolgt, kann die genomische DNA des Wirts oder extrachromosomale Elemente sein. Dies schließt sowohl natürlich vorkommende Elemente als auch Elemente, die exogen eingeschleust wurden, ein.
Heterologe Gene, die mit Hilfe der Insertion eingeschleust werden können, schließen Reportergene ein. Es können auch solche DNA-Sequenzen eingeschleust werden, die physikalische Marker in einem Chromosom bereitstellen. Die Insertion kann auch als einfacher Weg zum Rückgewinnen der Wirts-DNA, die das inserierte Element flankiert, verwendet werden. Die genomische DNA wird mit Restriktionsenzymen geschnitten und die inserierte plus die flankierende DNA wird dann kloniert.
Eine weitere Verwendung oder andere Anwendung ist, die Wechselwirkungen verschiedener, nicht an der Transposition teilnehmender Proteine mit einer DNA-Sequenz zum Beispiel DNA-Fußabdruck von Repressoren, die an DNA gebunden sind, zu analysieren. Eine weitere Verwendung ist, den Aufbau von genomischem Chromatin, d. h. den Zustand, in dem DNA tatsächlich in der Zelle gefunden wird, zu untersuchen.
Ein weiterer Vorteil des Verwendens von Tn7 und ähnlicher Transposons ist der des Verbindens mit doppelten Enden oder des „aufeinander abgestimmten" Verbindens. Tn7 inseriert entsprechend in einer „Ausschneiden und Einsetzen"-Weise, bei der beide Enden des Transposons mit der Target-DNA verbunden werden.
Die Insertion kann auch in vitro erfolgen. Eine in vitro-Insertion stellt gegenüber der Insertion in vivo einen Vorteil bereit. Bei Verwenden der in vitro-Insertion kann das transponierbare Element in einer beliebigen Target-DNA angeordnet werden und das Target kann dann in eine Wirtszelle eingeschleust werden, wo es sich einbauen oder replizieren kann. Dies erweitert den Bereich an Wirtszellen entsprechend in erheblichem Maße.
Targets für eine Insertion schließen entsprechend DNA-Fragmente, Plasmide und andere extrachromosomale Elemente, die zu einer Replikation in prokaryotischen und/oder eukaryotischen Wirtszellen in der Lage sind, ein. Mit dem gegebenen Bereich an verfügbaren Plasmiden, kann potentiell jede Zelle als Wirt für die ein Insertions-Target, das ein transponierbares Element enthält, das in vitro in das Target eingeschleust wurde, verwendet werden. Das Target kann auf einem Bakterienplasmid, einem Bakteriophagen, einem Pflanzenvirus, einem Retrovirus, einem DNA-Virus, einem sich autonom replizierenden, extrachromosomalen DNA-Element, einem linearen Plasmid, DNA aus Mitochondrien oder anderen Organellen, chromosomaler DNA und Ähnlichem basieren.
Wenn das Target in die Wirtszelle eingeschleust wurde, kann es als eine sich autonom replizierende Sequenz oder als extrachromosomales Element beibehalten werden, oder kann in die Wirts-DNA eingebaut werden. Wenn es eingebaut wird, kann der Einbau durch homologe Rekombination oder mit Hilfe spezieller Einbausequenzen, wie beispielsweise jenen, die von Retroviren, DNA-Viren und Ähnlichen stammen, erfolgen.
Es kann, jedoch nicht notwendigerweise, wünschenswert sein, die Replikation des Targets in der Wirtszelle zu erhalten. Eine spezielle Anwendung, bei dies gewünscht ist, ist der Fall, bei dem ein transponierbares Element als Bestandteil zum Einschleusen von Primer-Bindungsstellen für die Sequenzierung von DNA verwendet wird.
Dementsprechend kann ein transponierbares Element in ein Target, das einen DNA-Abschnitt enthält, für den die Sequenz gewünscht ist, eingeschleust werden. Dieses Target wird dann in eine Wirtszelle eingeschleust, in der es sich replizieren gelassen wird, wodurch ausreichende Kopien erzeugt werden, um die Sequenzierung der DNA unter Verwenden eines Primer, der eine Sequenz in dem Target spezifisch erkennt, zuzulassen.
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens erkennen die Primer eines oder beide Enden des transponierbaren Elements, so dass die Sequenzierung in beide Richtungen von dem Insertionsort des transponierbaren Elements aus in die umgebende DNA fortlaufen kann. Das Target kann vollständig aus DNA-Abschnitten, für die die Sequenz erforderlich ist, bestehen, oder kann einfach Untersequenzen enthalten, für die eine Sequenz erforderlich ist. In diesem Aspekt ist die einzige Einschränkung die, dass das Target zu einer Replikation in der Wirtszelle in der Lage sein soll (und daher Sequenzen enthält, die diesen Vorgang erlauben).
Es wird auch ganz besonders gewünscht, dass das Target einen Selektionsmarker aufweist, um den Untergrund in Wirtszellen, die das Target ohne ein darin inseriertes Transposon enthalten, auszuschließen.
Ein alternativer Weg, diesen Untergrund auszuschließen, ist jedoch, ein Verfahren zum Unterdrücken eines Targets, das keine Insertion erhalten hat bereitzustellen, so dass es diesem unmöglich ist, sich in der Wirtszelle zu replizieren und daher während der Kultivierung der Wirtszelle herausverdünnt wird. Das transponierbare Element sollte entsprechend selbst einen Replikationsursprung für die Wirtszelle enthalten. Diejenigen Targets, die keine Insertion erhalten hatten, wären nicht in der Lage, sich zu replizieren. Eine Insertion könnte auch zu der Bildung funktioneller Replikationssequenzen führen. Das Target könnte auch einen heterologen, konditionellen Ursprung, wie beispielsweise den R6K-Ursprung, der sich nicht ohne das pir-Protein replizieren kann, enthalten. Ein Fachmann wäre in der Lage, die verschiedenen Verfahren zum Konstruieren von Targets mit der (Un)fähigkeit, sich in einer speziellen Wirtszelle zu replizieren, zu erkennen.
Es ist jedoch auch möglich, die hierin beschriebenen, transponierbaren Elemente für eine Sequenzierung der DNA ohne die oben beschriebene in vitro-Insertion zu verwenden. Die Insertion könnte direkt in der DNA einer Wirtszelle durchgeführt werden und dann die DNA, die die Insertion enthält, aus dem Wirt entfernt werden. Dieser DNA-Abschnitt könnte dann repliziert werden, obwohl dies nicht notwendigerweise erfolgen muss, wenn der Wirt eine für eine Sequenzierung ausreichende Menge an Kopien produziert hat. Entsprechend könnte dann die ausreichende Anzahl an Abschnitten mit der Insertionssequenz, wie oben angegebenen ist, sequenziert werden.
Ein Beispiel für den Fall, bei dem der DNA-Abschnitt, der eine in vivo-Insertion erhielt, nicht weiter in einem anderen Wirt repliziert werden müsste, ist beispielsweise ein Fall, bei dem die Insertion in einer Sequenz erfolgt, die direkt in der Wirtszelle amplifiziert werden kann. Dies könnte ein Plasmid sein, das einen amplifizierbaren Marker, wie beispielsweise das dhfr-Gen enthält sein, wobei die Zelle in einem selektiven Medium, das Methotrexat enthält, wachsen gelassen würde. Ein Fachmann würde die verschiedenen Verfahren zum Amplifizieren der DNA-Abschnitte unter Verwenden selektierbarer Marker kennen. Der selektierbare Marker könnte in das Transposon eingeschleust werden, dies muss aber nicht notwendigerweise erfolgen.
In einem weiteren Protokoll zur Sequenzierung von DNA erleichtern die verwendeten Primer die Amplifikation des DNA-Abschnitts durch die PCR-Reaktion. Es kann zum Beispiel ein Primer verwendet werden, der ein Ende des transponierbaren Elements erkennt, wobei der zweite Primer in der Target-DNA-Sequenz zu finden ist. Der Primer könnte auf zufälligen Sequenzen oder einer bekannten Sequenz die bewusst in dem Target-Vehikel angeordnet ist, basieren. Das Target-Vehikel könnte daher (als ein Beispiel) ein charakterisiertes Plasmid enthalten, in dem die Sequenzen bekannt sind. In diesem Fall können die Primer so konstruiert sein, dass sie an irgendeine Fläche innerhalb des Plasmids hybridisieren, wobei der zu sequenzierende Abschnitt zwischen dem Transposon und dem zweiten Primer-Ort in dem Target-Vehikel vorliegt.
Gemäß den obigen Ausführungen betrifft die Erfindung auch Kits zum Durchführen der Insertion transponierbarer Elemente in vivo. Wie beschrieben wurde, können solche Insertionen dazu verwendet werden, Priming-Orte für die Bestimmung von DNA-Sequenzen oder Mutationen, die für eine genetische Analyse geeignet sind, oder beide bereitzustellen.
Wesentliche Bestandteile in dem Kit sind Genprodukte, die eine Transposition zulassen und normalerweise auf dem transponierbaren Element oder dessen funktionellen Äquivalenten codiert sind. Ein weiterer Bestandteil ist ein Donor-Vehikel für das transponierbare Element. Dieses Nukleinsäure-Vehikel stellt das transponierbare Element, das in einen gegebenes, spezifisches Target inseriert werden soll, bereit. Der Donor für das transponierbare Element ist vorzugsweise DNA, kann jedoch auch RNA umfassen, die über eine cDNA-Kopie funktionsfähig ist. Bevorzugte DNA-Vehikel schließen bakterielle Plasmide ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Andere Vehikel schließen jede DNA ein, die in Supercoiled-Form isoliert werden kann oder mit Hilfe von Topoisomerasen in einen Supercoiled-Zustand gebracht werden kann, zum Beispiel Bakteriophagen-DNA, sich autonom replizierende Moleküle aus Eukaryoten oder Archaea, oder synthetische DNA, die ligiert werden kann, um einen topologisch geschlossenen Kreis zu bilden.
Optionale Bestandteile des Kits schließen einen oder mehrere der folgenden ein: (1= Pufferbestandteile, (2) Kontroll-Target-Plasmide, (3) Sequenzierungsprimer. Der Puffer kann jeden Puffer einschließen, der dazu geeignet ist, das Auftreten einer Transpositionsaktivität in vitro zuzulassen. Eine bevorzugte Ausführungsform ist HEPES-Puffer. Eine speziell offenbarte Ausführungsform ist in den beispielhaft angegebenen Materialien eingeschlossen.
Bevorzugte Donor-Plasmide müssen vor dem Einschleusen der Transpositionsprodukte in allgemein verwendete Bakterien- und vorzugsweise E. coli-Stämme nicht zerstört werden. Diese Vektoren replizieren sich nicht ohne Regulatorgene, die von der Wirtszelle nicht bereitgestellt werden und einen funktionellen Replikationsursprung ermöglichen. Ein Beispiel dafür ist das pir-Gen, das nur in speziell konstruierten Stämmen vorhanden ist und von dem Plasmid R6K stammt. Auf diese Weise wird der Untergrund des Produkts, der aus Zellen besteht, die sowohl mit der Donor-DNA als auch der Target-DNA, bei der keine Transposition erfolgt war, transformiert sind, ausgeschlossen. Wie hierin erörtert wird, gibt es andere Möglichkeiten, dies zu erreichen, wie beispielsweise ein Restriktionsverdau der Donor-DNA, jedoch nicht des Targets oder des transponierbaren Abschnitts oder die Deletion und Titration der Transpositionreaktion, so dass mehr Zellen als DNA-Moleküle während des Transformationsschritts vorliegen. Diese Möglichkeiten werden jedoch nicht bevorzugt.
Das Kontroll-Target-Plasmid enthält kein transponierbares Element und weist Orte für den Einbau der transponierbaren Elemente auf. Das Ziel dabei ist, sicherzustellen, dass die Reaktion nicht durch eine Kontamination aus Nicht-Bestandteilen des Kits (die durch den Benutzer des Kits eingebracht werden) gehemmt wird; d. h. es wird sichergestellt, dass alle Bestandteile eine optimale Insertion zulassen.
Sequenzierungsprimer schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Primer, die eine Homologie mit beiden Enden des transponierbaren Elements aufweisen, und als solche das Fortlaufen der Sequenzierung in beide Richtungen von den Enden des transponierbaren Elements aus zulassen. Die Primer könnten zu jedem Bereich innerhalb des transponierbaren Elements oder innerhalb des Target-Vehikels selbst erzeugt werden, solange eine Extension in dem zu sequenzierenden DNA-Abschnitt zugelassen wird. Kits, die dazu konstruiert wurden, eine Sequenzierung mit Hilfe der PCR-Reaktion zuzulassen, können auch einen zweiten Primer einschließen, der die Amplifikation der Sequenz zwischen dem ersten und dem zweiten Primer ermöglicht.
Das Kontroll-Target-Plasmid enthält vorzugsweise einen selektierbaren Marker zur Rückgewinnung des gewünschten DNA-Abschnitts aus einer speziellen Wirtszelle. Es versteht sich von selbst, dass, wenn das Kit verwendet wird, die Target-DNA nicht den gleichen selektierbaren Marker wie die Nukleinsäure des Kontroll-Targets trägt.
Ein vierter optionaler Bestandteil eines Kits ist die Target-DNA selbst. Die Target-DNA, die gewünscht sei kann, würde einschließen, ist jedoch nicht beschränkt auf, gereinigte, chromosomale DNA, die gesamte cDNA, cDNA in den Fraktionen, die dem Zustand im Gewebe oder der Expression (z. B. nach Hitzeschockbehandlung oder Behandlung mit Cytokinen oder einer anderen Behandlung) oder der Expressionszeit (nach irgendeiner solchen Behandlung) oder dem Zustand während der Entwicklung entsprechen, oder eine Plasmid-, Cosmid-, BAC-, YAC- oder Phagenbibliothek von irgendeiner der vorher genannten DNA-Proben, insbesondere einer solchen Target-DNA aus Organismen wichtiger Untersuchungen, wie beispielsweise Homo sapiens, Mus domesticus, Mus spretus, Canis domesticus, Bos, Caenorhabditis elegans, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Onchocera volvulus, Brugia malayi, Dirofilaria immitis, Leishmania, Zea maize, Arabidopsis thaliana, Glycine max, Drosophila melanogaster, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Aquifex, Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus, Thermus littoralis, Methanobacterium thermoautotrophicum, Sulfolobus caldoaceticus und anderen.
Andere geeignete, selektierbare Marker schließen eine Chloramphenicolresistenz, Tetracyclinresistenz, Spectinomycinresistenz, Streptomycinresistenz, Erythromycinresistenz, Rifampicinresistenz, Bleomycinresistenz, thermisch angepasste Kanamycinresistenz, Gentamycinresistenz, Hygromycinresistenz, Trimethoprimresistenz, Dihydrofolatreduktase (DHFR), GPT; die Gene URA3, HIS4, LEU2 und TRP1 von S. cerevisiae ein.
Es kann bestimmte Fälle geben, in denen gewünscht ist, Primer-Bindungsorte, die andere sind, als diejenigen, die natürlich in dem transponierbaren Element oder in dem Insertionsvehikel gefunden werden, einzuschleusen. In diesem Fall kann das transponierbare Element als Vehikel zum Einschleusen jedes beliebigen gewünschten Primers oder jeder beliebigen gewünschten Primer verwendet werden. Ein Beispiel für den Fall, dass die Verwendung von exogenen Primern gewünscht sein kann, ist der Fall, in dem die Enden des transponierbaren Elements eine Sekundärstruktur bilden, die die Sequenzierung beeinträchtigt, oder die Fälle, in denen eine Ähnlichkeit der Sequenz zwischen den beiden Enden des transponierbaren Elements besteht, und die Fälle, in denen nur die praktischen Bindungsorte in dem transponierbaren Element so weit im Inneren liegen, dass sie in unerwünschter Weise die Menge an Nukleotiden, die aus dem Ort sequenziert werden können, beschneiden.
Die Erfindung betrifft allgemein auch Zusammensetzungen, die ein von ATP abhängiges, DNA bindendes Protein, das von einem Transposon codiert wird, enthalten, wobei das Protein eine Mutation aufweist, die eine verringerte Targetsite-Spezifität, vorzugsweise eine zufällige Targetsite-Insertion, verleiht.
Das Protein wird aus einer biologischen Zubereitung, die in vivo oder in vitro erzeugt wurde, isoliert. Das Protein ist daher gereinigt oder im Wesentlichen von den Zellbestandteilen, mit denen es in vivo gefunden wird, gereinigt. Wenn das Protein in vitro produziert wird, kann es auch gereinigt sein oder im Wesentlichen von den anderen Bestandteilen, die zu dessen Produktion verwendet wurden, gereinigt sein.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Protein das TnsC-Protein (SEQ ID NO: 1 und 2).
In einer speziell offenbarten Ausführungsform enthält das Protein ein Valin an der Aminosäure Nummer 225.
Die Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen, die das hierin beschriebene Protein und das transponierbare Element als Substrat, auf das das Protein wirkt, um die Insertion zu erreichen, enthalten.
Die Zusammensetzungen können auch Target-DNA einschließen, in die das transponierbare Element inseriert werden kann.
Die mutanten Proteine der vorliegenden Erfindung schließen die natürlich vorkommenden Proteine, die von einem Transposon codiert werden, sowie jegliche im Wesentlichen homologen und/oder funktionellen. äquivalenten Varianten derselben ein. Mit „variantem" Protein wird ein Protein bezeichnet, das durch Deletion (so genannte Trunkierung) oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren von dem N-terminalen und/oder C-terminalen Ende des nativen Proteins; Deletion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren an einem oder mehreren Orten in dem nativen Protein; oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren an einem oder mehreren Orten in dem nativen Protein von dem nativen Protein abgeleitet wurde.
Zum Beispiel können die Varianten in der Aminosäuresequenz des Polypeptids durch Mutationen in der klonierten DNA-Sequenz, die für das native Protein von Interesse codiert, erzeugt werden. Verfahren für die Mutagenese und Änderungen der Nukleotidsequenz sind in der Wissenschaft allgemein bekannt. Siehe beispielsweise (37), (38), (39), (49); U.S. Patent Nr. 4,873,193 ; und die hierin zitierten Druckschriften. Anleitungen für geeignete Aminosäuresubstitutionen, die nicht die biologische Aktivität des Proteins von Interesse beeinträchtigen, können in dem Modell von Dayhoff et al. (1978) (41) in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C.) gefunden werden. Konservative Substitutionen, wie beispielsweise das Austauschen einer Aminosäure gegen eine andere mit ähnlichen Eigenschaften, können bevorzugt sein.
Bei der Gegenüberstellung von Varianten des Proteins von Interesse werden Modifikationen an den Nukleotidsequenzen, die für die Varianten codieren, vorgenommen werden, so dass die Varianten weiterhin die gewünschte Aktivität besitzen. Offensichtlich müssen jegliche Mutationen, die in der DNA, die für das variante Proteine codiert, nicht die Sequenz außerhalb des Leserahmens ersetzen und werden bevorzugt keine komplementären Bereiche erzeugen, die eine sekundäre mRNA-Struktur erzeugen könnten. Siehe EP Patentanmeldung Nr. 75,444 .
Nukleotidsequenzen und die von diesen codierten Proteinen schließen daher die natürlich vorkommenden Formen sowie Varianten derselben ein. Die varianten Proteine werden im Wesentlichen homolog und funktionell äquivalent zu dem nativen Protein sein. Eine Variante eines nativen Proteins kann „im Wesentlichen homolog" zu dem nativen Protein sein, wenn mindestens ungefähr 80%, besonders bevorzugt mindestens ungefähr 90% und ganz besonders bevorzugt mindestens ungefähr 95% der Aminosäuresequenz derselben mit der Aminosäuresequenz des nativen Proteins identisch ist. Eine wesentliche Homologie schließt jedoch eine hohe Homologie in den katalytischen oder anderen konservierten, funktionellen Bereichen mit möglicherweise geringer Homologie außerhalb derselben ein. Mit „funktionell äquivalent" ist gemeint, dass die Sequenz der Variante eine Kette definiert, die ein Protein erzeugt, das im Wesentlichen den gleichen biologischen Effekt wie das native Protein von Interesse besitzt. Für die vorliegenden Zwecke wird eine funktionell äquivalente Variante daher dem Phänotyp der aktivierenden Transposition eine verringerte, vorzugsweise zufällige, Targetsite-Spezifität verleihen. Solche funktionell äquivalenten Varianten, die wesentliche Sequenzvariationen umfassen, werden ebenso umfasst.
Die Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen, die ein transponierbares Element enthalten, das eine DNA-Sequenz enthält, die für ein ATP-verwendendes Regulatorprotein codieren, wobei das Protein eine Mutation aufweist, die eine verringerte Targetsite-Spezifität und vorzugsweise eine zufällige Insertion verleiht.
Das transponierbare Element ist vorzugsweise ein transponierbares Tn7-Element.
In speziell offenbarten Ausführungsformen ist die Mutation Valin als Aminosäure Nummer 225 in dem TnsC-Protein. Die Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen, die das oben beschriebene, transponierbare Element und einen gegebenen DNA-Abschnitt, der das Target für die Insertion des transponierbaren Elements sein soll, enthalten.
Die Erfindung betrifft entsprechend DNA, in die das transponierbare Element inseriert werden soll, das die hierin beschriebene Mutation, die eine einfache, effiziente Insertion mit verringerter Targetsite-Spezifität oder eine zufällige Targetsite-Insertion verleiht, enthält. Die DNA in dieser Zusammensetzung ist in einem Fall in der Lage, in eine Zelle eingeschleust werden zu können, in der sie als ein extrachromosomales Element oder als in die zelluläre DNA zu integrierendes Element vorliegen kann.
Die Erfindung betrifft auch DNA-Abschnitte, die für die hierin offenbarten, mutanten Proteine codieren, Vektoren die diese Abschnitte enthalten und Wirtszellen, die die Vektoren enthalten. Die Vektoren, die die DNA-Abschnitte enthalten, können zur Vermehrung (d. h. Amplifikation) des Abschnitts in einer geeigneten Wirtszelle und/oder zum Zulassen der Expression aus dem Abschnitt (d. h. ein Expressionsvektor) verwendet werden. Ein Fachmann würde die verschiedenen Vektoren, die für die Vermehrung und Expression einer klonierten DNA-Sequenz verfügbar sind, kennen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein DNA-Abschnitt, der für ein mutantes TnsC-Protein codiert, in einem Plasmidvektor enthalten, der die Expression des Proteins und die anschließende Isolierung und Reinigung des Proteins, das mit Hilfe eines rekombinanten Vektors erzeugt wurde, zulässt. Die hierin offenbarten Proteine können entsprechend nach der Expression aus dem nativen Transposon gereinigt werden, durch chemische Synthese erhalten werden oder durch rekombinante Verfahren erhalten werden.
Relevante Zusammensetzung schließen entsprechend Expressionsvektoren für das mutante Protein allein oder in Kombination mit Expressionsvektoren für die anderen Proteine, die für die Insertion eines transponierbaren Elements erforderlich sind, ein. Solche Zusammensetzungen können ferner das transponierbare Element, das auf die Proteine wirken soll, umfassen. Solche Mischungen sind unter anderem zum Erreichen einer in vivo-Insertion nützlich.
Die Erfindung betrifft ferner Kits, die die oben beschriebenen Zusammensetzungen enthalten.
Tn7 kann als Stamm ATCC 29181 erhalten werden; ein K-12-Derivat, das den Resistenzübertragungsvektor R483 trägt; ursprünglich als ein Transposon tragend in Barth et al., J. Bacteriol. 125: 800–810 (1976). Die Sequenz von Tn7 ist der Genbank-Zugang ISTN7TNS, Zugangsnummer X17693; belegt in Flores et al., Nucleic Acids Res., 18: 901–11 (1990).
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird sie im Folgenden unter Bezugsnahme auf bestimmte, spezielle Beispiele, die hier lediglich zu Veranschaulichungszwecken angegeben sind und, soweit nicht anders angegeben ist, in r Weise einschränkend wirken sollen, weiter beschrieben.
Beispiele
Beispiel 1
Materialien und Methoden
Medien, Chemikalien und Enzyme: LB-Brühe und Agar wurden so, wie es beschrieben ist (42) zubereitet. Die Trimethoprim-Selektion erfolgte auf Isosensitest-Agar (Oxoid). Die Lac-Phänotypen wurden auf MacConkey-Lactose-Agar (Difco) beurteilt. Die verwendeten Antibiotika-Konzentrationen waren 100 μg/ml Carbenicillin (Cb), 30 μg/ml Chloramphenicol (Cm), 7,5 μg/ml Gentamycin (Gn), 50 μg/ml Kanamycin (Km), 10 μg/ml Nalidixinsäure (Nal), 20 μg/ml Tetracyclin (Tet) und 100 μg/ml Trimethoprim (Tp).
Hydroxylamin wurde von Sigma erhalten. Die DNA modifizierenden Enzyme wurde von kommerziellen Lieferanten erworben und so, wie es vom Hersteller empfohlen wurde, verwendet.
Bakterienstämme, Phagen und Plasmide: BR293 ist E. coli F^– Δ(lac-pro) thi rpsL Δ(gal – λG) + lacZ pL cI + ₄₃₄pRS₇ (43)(44). BR293 ist mit NK8027 (45) identisch und wurde von Nancy Kleckner zur Verfügung gestellt. NLC51 ist E. coli F^– araD139 Δ(argF-lac) U169 rps150 relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25 rbsR Val^R recA56 (46). CW51 ist E. coli F^– ara arg Δlac-proXIII recA56 Nal^R Rif^R (11). λKK1 ist lambda 780 hisG9424::Tn10 del16 del17::attTn7::miniTn7-Km^R (47). Die Tns-Transpositionsproteine wurden durch pCW15 (tnsABC), pCW23 (tnsD), pCW30 (tnsE) oder pCW4 (tnsABCDE) bereitgestellt (11). Die Target-Plasmide waren Derivate von pOX-G, einem konjugierbaren Derivat des F-Plasmids, das Gn^R trägt (48). pOX-attTn7 trägt eine (–342 bis +165) attTn7-Sequenz (16). Das Immun-Plasmid pOX-attTn7 EP-1::miniTn7-Cm^R wurden durch Transponieren von miniTn7-Cm^R (47) auf pOX-attTn7 unter Verwenden von TnsABC + E zum Steuern der Insertion in eine Nicht-attTn7-Position erzeugt. Die Konstruktion des Immun-Target-Plasmids pOX-G::miniTn7-dhfr ist unten beschrieben. Das Donor-Plasmid für das Transposon für den Test der Papillenbildung war pOX-G::miniTn7lac, das ein promotorloses lacZY zwischen den Ende des Transposons enthält (50). Der in vielen Kopien vorliegende Donor für das Transposon für die Ausschlusstests war pEMΔ, das miniTn7-Km^R (23) enthielt.
Manipulation und Charakterisierung der DNA: Die Phagen- und Plasmid-Isolation, -transformation und die Standard-Klonierungstechniken wurden, wie in (40) beschrieben ist, durchgeführt. Die Sequenzierung der DNA wurde in einer automatisierten ABI-Sequenzierungsvorrichtung durchgeführt. In dieser Arbeit wurden zwei Plasmide konstruiert: (1) pOX-G::miniTn7-dhfr. MiniTn7-dhfr wurde durch Austauschen der Km^R-Kassette in pLA1 (16) gegen eine dhfr-Kassette aus pSD511 (28), die mit Hilfe einer PCR amplifiziert worden war, um flankierende SalI-Schnittstellen anzufügen, konstruiert. Das PCR-Fragment wurde in den TA-Vektor (Invitrogen) ligiert, dann wurde die dhfr-Kassette durch einen SalI-Verdau entfernt und in die SalI-Schnittstelle von pLA1 inseriert, wodurch das Km^R-Gen ersetzt wurde. Das resultierende Plasmid wurde in NLC51 + pCW4 + pOX-G transformiert und für mehrere Tage anwachsen gelassen, um das Eintreten der Transposition zuzulassen. pOX-G-Plasmide, die eine miniTn7-dhfr-Insertion erhalten hatten, wurden durch Einpassen in CW51 und Selektieren auf Tp^R identifiziert.
Mutagenese von tnsC: Das TnsABC-Plasmid pCW15 wurde bei 37°C 20 Stunden lang gegen 1 M Hydroxylaminhydrochlorid in 0,45 M NaOH (End-pH bei annähernd 7,0) ausgesetzt (ROSE et al., 1990). Die DNA wurde mit Hilfe mehrerer Ethanolfällungen rückgewonnen und die PvuII-SphI-Fragmente, die das mutagenisierte tnsC enthielten, wurden in unbehandeltem pCW15 subkloniert, wobei das Wildtyp TnsC (SEQ ID NO: 1) ausgetauscht wurde. Diese Plasmide wurden dann mittels Elektroporation in CW51 + pOX-G::miniTn7lac eingeschleust und die Transformanten wurden auf MacConkey-Lactose-Platten, die Cm enthielten, selektiert. Die Platten wurden 3 bis 4 Tage lang bei 30°C inkubiert und auf das Auftreten von Lac⁺-Papillen, die eine Transposition von miniTn7lac anzeigen, gescrennt.
λ-Sprungtest der Transposition: Die Tn7-Transposition wurde in NLC51-Stämmen beurteilt, in die tns-Funktionen mittels Transformation eingeschleust wurden, und pOX-G wurde mittels Konjugation eingeschleust (siehe 5). Das Protokoll aus (47) war folgendermaßen: Die Zellen wurden bei 37°C in LB und 0,2% Maltose bis zu einer OD₆₀₀ von 0,4–0,6 angezüchtet und dann mit Hilfe einer Zentrifugation und Resuspension in 10 mM MgSO₄ auf 1,6 × 10⁹ Zellen/ml aufkonzentriert. 0,1 ml Zellen wurden mit miniTn7-Km^R enthaltendem 0,1 ml λKK1 mit einer Multiplizität der Infektion von 0,1 Phagen pro Zelle kombiniert. Die Infektion verlief 15 Minuten lang bei 37°C und wurde durch die Zugabe von 10 mM Natriumcitrat in 0,8 ml LB beendet. Die Zellen konnten sich durch eine Belüftung für 60 Minuten bei 37°C erholen und anschließend auf Km und Citrat enthaltenden Platten verteilt werden. Die Häufigkeit der Transposition wird als Anzahl an Km^R-Kolonien/pfu λKK1 ausgedrückt.
Tests des Ausschlusses einer Transposition: Die Tn7-Transposition wurde in den Derivaten von BR293, die zum Überwachen der SOS-Induktion verwendet wurden (Tabelle 3) oder in NLC51-Stämmen, in denen die tns-Funktionen mittels Transformation eingeschleust wurden beurteilt und pOX-G oder pOX-G::miniTn7-dhfr wurden mittels Konjugation eingeschleust. MiniTn7-Km^R war in den NLC51-Stämmen entweder in dem chromosomalen attTn7-Ort (4 und Tabelle 1) oder dem high copy-Plasmid pEMΔ (Tabelle 2) (SEQ ID NO: 4) vorhanden. Das Protokoll wurde aus (11) angepasst: Die oben beschriebenen Donor-Stämme und der Empfängerstamm CW51 wurden unter vorsichtiger Belüftung bei 37°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,4–0,6 angezüchtet. Die Donoren und die Empfänger wurden in einem Verhältnis von 1:5 gemischt und das Wachstum wurde eine Stunde lang fortgesetzt. Das Einpassen wurde durch kräftiges Schütteln auf einer Vortex-Vorrichtung unterbrochen und die Zellen wurden verdünnt und ausplattiert. Die Gesamtanzahl an Exkonjuganten wurde mit einer Selektion auf GnNal-Platten bestimmt. Die Tn7 enthaltenden Exkonjuganten wurden auf TpNal-Platten selektiert und die miniTn7-Km^R-Exkonjuganten wurden auf KmNal-Platten selektiert. Die Häufigkeiten der Transposition sind als Anzahl der Tp^R- oder Km^R-Exkonjugaten/Gesamtanzahl an Exkonjuganten ausgedrückt.
Ergebnisse
Isolierung der gain of function-Mutanten von TnsC: Um sich auf die Verbindung zwischen TnsC und der Target-DNA zu konzentrieren, isolierten die Erfinder die gain of function-Mutanten von TnsC, die die TnsA + B-Transposase in Abwesenheit von TnsD oder TnsE aktivierten. Da eine Überexpression des Wildtyp-TnsC nicht das Erfordernis von TnsD oder TnsE aufhebt (11), wurde vorhergesagt, dass diese gain of function-Mutationen eher die biochemischen Eigenschaften von TnsC beeinträchtigen als dessen Expression oder Stabilität.
Ein visueller Test für eine Tn7-Transposition (50(51) wurde dazu verwendet, die Mutanten zu identifizieren. Dieser Test verwendet ein miniTn7-Element, das promotorlose lacZY-Gene zwischen den cis-agierenden Sequenzen an beiden Enden des Transposons trägt. Das miniTn7lac-Element ist in einer transkriptionellen silent-Position auf einem Donor-Plasmid positioniert; die Zellen, die dieses Plasmid enthalten, sind phänotypisch gesehen Lac^–. Wenn die Tns-Funktionen in trans bereitgestellt werden, kann miniTn7lac zu neuen Orten in dem Chromosom von E. coli transponieren. Einige dieser Transpositionsereignisse ersetzen das Element stromabwärtig von den aktiven Promotoren, was zu einer erhöhten lacZ-Expression führt. Dies wird auf MacConkey-Lactose-Farbindikator-Platten als Auftreten von roten (Lac⁺-)Papillen in einer ansonsten weißen (Lac^–-)Kolonie beobachtet. Die Anzahl an Papillen spiegelt daher das Ausmaß der Transposition wieder, die während des Wachstums der Kolonie auftrat.
Die Zellen, die miniTn7lac und verschiedene Tns-Funktionen enthielten, wurden auf Farbindikator-Platten gesetzt (1). Es waren nahezu keine Lac⁺-Papillen in den Zellen zu sehen, die nur TnsABC^wt enthielten. Die Zellen, die TnsABC^wt + E enthielten, erzeugten viele Lac⁺-Papillen. Ein Southern Blotting zeigte, dass TnsABC^wt + E-Papillen eher aus Translokationen eines miniTn7lac zu einer Vielzahl von chromosomalen Positionen hin stammen, als aus intermolekularen Umlagerungen des Donor-Plasmids (50). Die meisten TnsABC^wt + D-Ereignisse waren silent, da kein in geeigneter Weise ausgerichteter Promotor in der Nähe von attTn7 vorliegt (50)(52).
Dieser visuelle Test wurde zum Screenen nach TnsC-Mutanten, die die Fähigkeit, die Tn7-Transposition in Abwesenheit von TnsD oder TnsE zu aktivieren, erlangt hatten, verwendet. Zufällig mutagenisiertes tnsC wurde in ein Plasmid kloniert, das tnsAB enthielt. Diese tns-Gene wurden in Zellen, die miniTn7lac enthielten, eingeschleust. Es wurden sechs gain of function-Mutationen von TnsC identifiziert (1).
Die durch diese TnsC-Mutanten aktivierte Transposition erforderte nur noch die TnsA + B-Transposase und intakte Transposon-Enden. Die Phänotypen der Papillenbildung der TnsC-Mutanten variierten erheblich, was nahe legt, dass verschiedene Mutanten unterschiedliche Ausmaße der miniTn7lac-Transposition aktivierten. Mehrere TnsC-Mutanten förderten mehr Transpositionen als TnSABC^wt + E. TnsABC^S401YΔ402 erreichten die höchsten Mengen an Transposition.
Die für die Phänotypen der Mutanten verantwortlichen Aminosäureänderungen wurden durch Subklonieren und Sequenzieren der DNA bestimmt. tnsC codiert für ein Protein aus 555 Aminosäuren mit Walker A- und Walker B-Motiven in der aminoterminalen Hälfte des Proteins (53). Aus Analysen der Struktur und der Mutationen wurde impliziert, dass Walker A- und Walker B-Motive direkt an der Nukleotidbindung und/oder Hydrolyse in einer Vielzahl von ATPasen und GTPasen beteiligt sind (37)(55).
Die tnsC-Mutationen führen in erster Linie zu einzelnen Aminosäuresubstitutionen, deren Positionen über die Sequenz des TnsC-Proteins verteilt sind (2). Die TnsC-Mutanten teilen sich in zwei Phänotyp-Klassen auf. Die von den Mutanten der Klasse I aktivierten Transpositionsreaktionen sind für Immun-Targets und die Target-Selektionsfaktoren TnsD, TnsE sensitiv. Die von den Mutanten der Klasse II aktivierten Transpositionsreaktionen sind hinsichtlich ihrer Reaktionen auf diese Signale gehemmt. Die von den beiden Mutanten beeinträchtigten Reste (TnsC^A225V und TnsC^E233K) liegen in oder sehr nahe am Walker B-Motiv.
TnsC-Mutanten fördern die intermolekulare Transposition: Der Pillenbildungstest stellt ein wirkungsvolles Screening nach Transpositionsaktivität dar, er gibt jedoch nicht notwendigerweise die intermolekularen Transpositionsereignisse an. Interne Umlagerungen des miniTn7lac-Donor-Plasmids, die das miniTn7lac-Element stromabwärtig von einem Promotor zufällig ersetzen, würden auch Lac⁺-Papillen erzeugen. Der Erfinder untersuchte daher, ob die TnsC-Mutanten der TnsA + B-Transposase das Ausführen der intermolekularen Rekombination erleichtern oder ob die Mutanten die intermolekulare Transposition fördern.
Der λ-Sprungtest misst die Translokation eines miniTn7-Km^R-Elements von einem bezüglich der Replikation und des Einbaus defekten λ-Phagen zu dem Bakterienchromosom während einer vorübergehenden Infektion. Das miniTn7-Km^R-Element trägt eine Kanamycinresistenzkassette mit einem konstitutiven Promotor. Der λ-Sprungtest gibt daher die Gesamtanzahl an Transpositionsereignissen, die in dem Chromosom auftreten, an. TnsABC^wt wies keine in dem λ-Sprungtest nachweisbare Transpositionsaktivität auf. TnsABC^wt + E erzeugte 2,2 × 10^–7 Km^R Kolonien/pfu (3). Die durch TnsABC^wt + D geförderte Transposition erzeugte 1,8 × 10^–4 Km^R Kolonien/pfu. Alle TnsC-Mutanten konnten die Translokation von miniTn7-Km^R fördern. TnsABC^A225V und TnsABC^S404YΔ402 förderten die Transposition 8- und 50-mal mehr als TnsABC^wt + E. Andere TnsC-Mutanten förderten die Transposition, jedoch nicht in solchen Ausmaßen.
Der Ausschlusstest wurde zum Untersuchen der Fähigkeit der TnsC-Mutanten, Translokationen in verschieden Arten von Target-Molekülen zu fördern, verwendet. Dieser Test misst die Häufigkeit der Transposition von miniTn7-Km^R von dem Chromosom zu pOX-G, einem konjugierbaren Derivat des F-Faktors von E. coli. Der TnsABC^wt + E-Mechanismus selektiert vorzugsweise konjugierbare Plasmide als Targets für die Transposition, während der TnsABC^wt + D-Mechanismus pOX-G solange nicht erkennt, bis es attTn7-Sequenzen enthält (ROGERS et al., 1986, WADDELL und CRAIG, 1988, WOLKOW et al., 1996). Die TnsC-Mutanten konnten die Transposition zu pOX-G fördern (4). Die Ergebnisse zeigen daher, dass die gain of function-Mutanten von TnsC die intermolekulare Transposition fördern können.
Reaktion auf die Target-Selektoren TnsD und TnsE: TnsD und TnsE werden zum Aktivieren des TnsABC^wt-Mechanismus und zum Steuern der Transposition in bestimmte Target-DNAs benötigt (10)(11)(13)(14). Die TnsABC^mutant-Mechanismen erfordern per Definition nicht den Einsatz von TnsD oder TnsE. Der Erfinder untersuchte jedoch, ob TnsD oder TnsE die Häufigkeiten oder die Verteilung der Transpositionsereignisse die von den TnsC-Mutanten gefördert wurden, beeinflussen konnten.
Der λ-Sprungtest wurde dazu verwendet, die Effekte von TnsD und einem verfügbaren attTn7-Ort auf die von den TnsC-Mutanten geförderte Transposition zu beurteilen (5). Jede Reaktion dieser Mutanten war für TnsD + attTn7 responsiv, die Reaktionen variierten jedoch erheblich. Die durch TnsABC^A225V und TnsABC^E273K aktivierten Reaktionen wurden stark durch TnsD + attTn7 stimuliert, wodurch in Gegenwart von TnsD + attTn7 eine 500- bzw. 5000-mal so hohe Transposition gefördert wurde als mit TnsABC^A225V oder TnsABC^E273K allein. Die übrigen Reaktionen der Mutanten wurden weniger stark von TnsD beeinflusst: Die TnsABC^S401F-Reaktionen zeigten eine mäßige (50-fache) Stimulation, Die durch TnsC^E223K, TnsC^S401YΔ402 und TnsC^A282T aktivierten Reaktionen wurden in Gegenwart von TnsD etwas gehemmt.
Die Effekte von TnsE wurden ebenso mit Hilfe des λ-Sprungtests untersucht (5). In Abwesenheit von TnsE war die überwiegende Mehrheit der TnsABC^mutant-Transpositionsereignisse auf das Chromosom als Target gerichtet. In der Gegenwart von TnsE wurde bei einigen der TnsC-Mutanten eine bevorzugte Insertion in pOX-G beobachtet.
Diese unterschiedlichen Reaktionen lassen vermuten, dass die sechs TnsC-Mutanten die Tn7-Transposition nicht durch einen einzigen Mechanismus aktivieren. Basierend auf ihrer Fähigkeit, auf TnsD und TnsE zu reagieren, können die Mutanten stattdessen in zwei Klassen eingeteilt werden. Die von den Mutanten der Klasse I – TnsC^A225V und TnsC^E273K – aktivierte Transposition kann durch TnsD stimuliert werden und durch TnsE gegen pOX-G als Target gerichtet sein. Die durch die Mutanten der Klasse II – TnsC^E233K, TnsC^A282T TnsC^S401YΔ402 und TnsC^S401F – aktivierte Transposition ist für die positiven Effekte von TnsD oder TnsE oder beiden nicht responsiv. Bei diesen Merkmalen wird vorgeschlagen, dass TnsC^S401F ein Mitglied der Klasse II ist: obwohl durch TnsC^S401F aktivierte Reaktionen etwas durch TnsD stimuliert wurden, wird die Verteilung der Insertionen in den durch TnsC^S401F aktivierten Reaktionen nicht durch TnsE beeinflusst. Die Einteilung der TnsC-Mutanten in diese beiden Klassen wird von den unterschiedlichen Reaktionen der TnsABC^mutant-Reaktionen auf Immun-Targets gestützt, wie nachstehend beschrieben wird.
Diskussion
Proteine, die an der Beurteilung der Targets beteiligt sind: Wie wird ein geeignetes Target für Tn7 identifiziert? Der Erfinder hat die Hypothese aufgestellt, dass TnsC als ein „Verbindungsglied" oder „Verknüpfer" dienen kann, da er die Transposase und die Target-DNA in einer durch den ATP-Zustand von TnsC regulierten Weise verknüpft (23) (27). TnsC besitzt die biochemischen Eigenschaften, die für diese Verknüpfung notwendig sind. es kann direkt mit der Target-DNA (24) und mit der TnsA + B-Transposase Wechselwirken (A. STELLWAGEN und N. L. CRAIG, nicht veröffentlichte Ergebnisse). Das Wildtyp-TnsC (SEQ ID NO: 1) reicht jedoch nicht dazu aus, die Transposition zu aktivieren. Die Tn7-Transposition hängt stattdessen von TnsD oder TnsE zur Aktivierung des TnsABC^wt-Mechanismus und Selektion einer Targetsite ab. TnsD ist ein attTn7 bindendes Protein (23), das TnsC zu diesem Target ergänzt. Der resultierende TnsC-TnsD-attTn7-Komplex kann dann die Transposase in vitro anziehen (23). Der Mechanismus, über den TnsE die Transposition aktiviert, ist derzeit noch nicht bekannt. TnsE könnte vorzugsweise an konjugierenden Plasmiden lokalisiert sein und anschließend TnsC zu diesen Molekülen ergänzen oder TnsE könnte TnsC so modifizieren, dass die Bindungsaktivität von TnsC nun gegen diese Targets gerichtet ist. Alternativ dazu könnte TnsE die Transposase direkt, ohne den Ablauf mit TnsC, modifizieren. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass TnsD und TnsE alternative Einsatzmenge in TnsC bereitstellen, was wiederum die TnsA + B-Transposase zu der Target-DNA ergänzt.
Die erfolgreiche Isolierung der gain of function-Mutationen von TnsC macht deutlich, dass der TnsABC-Mechanismus in der Lage ist, an die Target-DNA anzugreifen und die Insertionen ohne TnsD oder TnsE zu fördern. Die Reaktionen haben jedoch nicht die Fähigkeiten von TnsD oder TnsE zur direkten Transposition in bestimmte Targets nachgeahmt: die durch die TnsC-Mutanten aktivierte Transposition zeigt nicht die bevorzugte Insertion in konjugierbare Plasmide, die bei durch TnsE aktivierten Reaktionen zu sehen ist, noch die Spezifität der durch TnsD aktivierten Reaktionen. TnsD und TnsE sind daher wichtig dafür, diese positiven Target-Signale zu erkennen.
TnsC scheint eine Vielzahl von Einsatzmengen – von TnsD, TnsE und von Immun-Targets –, die dessen Aktivität kontrollieren, zu empfangen. Die Aktivität von TnsC kann auch durch eine Mutation beeinflusst werden. Sechs gain of Function-Punktmutationen an TnsC wurden in dieser Arbeit beschrieben, die in zwei Klassen eingeteilt werden können. Die Tatsache, dass verschiedene TnsC-Mutanten mit unterschiedlichen Transpositionsaktivitäten rückgewonnen wurden, stimmt mit der Hypothese überein, dass es verschiedene gibt, TnsC zu aktivieren. Die Mutanten der Klasse I TnsC^A225V und TnsC^E273K ermöglichen, dass der TnsABC-Mechanismus die Transposition ausführt, ohne dabei seine Fähigkeit, auf sowohl positive als auch negative Target-Signale zu reagieren, verliert. Sie sind beide wesentliche gain of function-Mutanten, wobei TnsABC^A225V die Transposition zu den Chromosomen achtmal mehr fördert als TnsABC^wt + E (3). Die durch diese Mutanten der Klasse I aktivierte Transposition kann stark von TnsD + attTn7 stimuliert werden oder durch TnsE gegen konjugierbare gerichtet sein, sowie in der Lage sein, zwischen Immun- und Nicht-Immun-Targets zu unterscheiden. Die gain of function-Phänotypen, die bei den Mutanten der Klasse I zu sehen sind, wurden damit erreicht, während die Fähigkeit dieser TnsC, Informationen zwischen der Target-DNA und der Transposase zu transportieren, bewahrt wurde.
Die TnsC-Mutanten, die in die zweite Klasse fallen, verhalten sich eher wie konstitutiv aktivierte Versionen von TnsC. Einige dieser Mutanten fördern auch ein erhebliches Ausmaß der Transposition: TnsABC^S401YΔ402 führt zu einer 50-mal so hohen Transposition zu den Chromosomen wie TnsABC^wt + E (3). Die Natur der Transpositionsreaktionen, die von den TnsC-Mutanten der Klasse II gefördert wird, unterscheidet sich jedoch ziemlich von denjenigen, die bei den Mutanten der Klasse I zu sehen sind. Immun- und Nicht-Immun-Targets werden in den Reaktionen mit den Mutanten der Klasse II im Wesentlichen äquivalent verwendet und TnsD und TnsE sind nicht in der Lage, die Häufigkeit oder Verteilung dieser Transpositionsereignisse stark zu beeinflussen. Ein ähnlicher Verlust der Responsivität auf die Target-Signale ist zu sehen, wenn die Tn7-Transposition durch nicht-hydrolysierbare ATP-Analoga in vitro aktiviert wird. Die Transposition kann noch auftreten, wenn die ATPase-Aktivität von TnsC mit AMP-PNP blockiert wird, solche Transpositionsereignisse erfordern jedoch nicht länger TnsD und sind nicht länger gegen attTn7 als Target gerichtet (BAINTON et al., 1993). Stattdessen kann jedes DNA-Molekül, einschließlich Immun-Targets, als Target für eine Tn7-Insertion dienen. Die TnsABC-Transposition kann daher konstitutiv durch AMP-PNP oder durch die TnsC-Mutanten der Klasse II aktiviert werden. Es ist bemerkenswert, dass die in TnsC^E233K betroffene Aminosäure in einem der ATP-Motive von TnsC liegt.
Vergleich mit anderen Elementen: Die Verwendung eines von ATP abhängigen Proteins, wie beispielsweise TnsC zum Regulieren der Targetsite-Selektion ist für Tn7 nicht einzigartig. Die Transposition des Bakteriophagen Mu wird auch stark durch das ATP- verwendende Protein MuB beeinflusst. MuB ist ein von ATP abhängiges, DNA bindendes Protein (57) (MAXWELL et al., 1987), das für eine effiziente Transposition in vivo benötigt wird (58)(59). In vitro steuert die MuA-Transposase die Insertionen vorzugsweise in Targets, die von MuB gebunden werden (60)(61)(19). Obwohl keine spezielle Sequenzspezifität für die Bindung an MuB vorliegt, ist dessen Verteilung auf der DNA nicht zufällig: Die Bindung von MuB an Target-Moleküle, die bereits Mu-Sequenzen enthalten, wird insbesondere durch einen von ATP abhängigen Mechanismus destabilisiert (19). Daher erkennt und vermeidet Mu, wie Tn7, Immun-Targets; zudem scheinen MuB und TnsC^A225V funktionell gesehen ähnliche Rollen bei der Regulierung der Transposition zu spielen.
Mu und Tn7 gehören zu einer Familie von Transposons, die für Proteine mit ATP-Bindungs-/-Hydrolyse-Motiven codieren; andere Mitglieder schließen IS21 (35)(62), Tn552 (36), Tn5053 (33) und Tn5090 (34) ein. Die Strategie, ein an ATP bindendes Protein zum Regulieren der Targetsite-Selektion zu verwenden, kann daher auf die gesamte Familie ausgeweitet werden. Tn5053 ist besonders interessant, da es für drei Proteine codiert, die für dessen Transposition erforderlich sind: eine mutmaßliche Transposase, die ein D,D(35)E-Motiv enthält, das für Transposasen und Integrasen charakteristisch ist, ein potentielles Regulatorprotein, das Walker A- und Walker B-Motive enthält und ein drittes Protein mit unbekannter Funktion (33). Tn5053 zeigt ein gewisses Maß an Targetsite-Spezifität, da es vorwiegend in den par-Locus des konjugierbaren Plasmids RP4 inseriert wird. Es ist verlockend zu spekulieren dass das dritte Protein von Tn5053 ein Target-Selektor wie TnsD oder TnsE ist, der die Insertionen in den par-Locus steuert.
Die Arbeit des Erfinders hat die Rolle der Target-DNA beim Kontrollieren der Tn7-Transposition in vivo veranschaulicht und hat in hohem Maße impliziert, dass TnsC eine Zentralfigur in dieser Regulation ist. Einzelne Aminosäureänderungen in TnsC können die Übertragung zwischen dem Transposon und der Targetsite zerstören, wodurch die Strenge der Targetsite-Selektivität von Tn7 verringert wird. TnsD fördert mit großer Häufigkeit die Tn7-Insertion in attTn7, einen sicheren Hafen in dem Bakterienchromosom. wohingegen TnsE den Tn7-Zugang zu konjugierbaren Plasmiden erlaubt und damit ein Mittel, sich in den Bakterienpopulationen zu verteilen. Das Vermeiden von Immun-Targets anstelle eines lokalen Springens fördert auch die Verbreitung des Elements und hindert ein Tn7 daran, sich in ein anderes einzubauen. TnsC kann alle diese Target-Signale zusammenfassen und die Informationen an die Transposase weiterleiten. Tabelle 1 TnsC^A225V fördert die intermolekulare Transposition

Tns-Funktionen Häufigkeit der Transposition

TnsABC^wt < 10^–7

TnsABC^A225V 8,8 (± 8,1) × 10^–6

TnsABC^wtDE 5,5 (± 1,1) × 10^–4
Die Häufigkeiten der Transposition von miniTn7-Km^R eines high-copy-Plasmids zu pOX-G wurden unter Verwenden des Ausschlusstests bestimmt und als die Anzahl an Km^R-Exkonjugaten/Gesamtzahl an Exkonjuganten ausgedrückt. Jeder Wert ist der Mittelwert aus drei voneinander unabhängigen Messungen.
Beispiel 2
Materialien und Methoden
Medien, Chemikalien und Enzyme
Luria-Brühe (LB) und Agar wurden, wie in (42) beschrieben ist, zubereitet. Die Carbenicillin- und Kanamycin-Selektionen wurden mit einer Konzentration von 100 μg/ml durchgeführt. Die DNA modifizierenden Enzyme und die Restriktionsenzyme wurden bei kommerziellen Lieferanten erworben und entsprechend den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die Taq-Polymerase wurde von Boehringer Mannheim Biochemicals erworben.
Bakterienstämme und Plasmide
Die Tn7-Donor-Plasmide enthalten ein miniTn7-Element, in dem die minimalen Endsequenzen von Tn7 (Tn7L 1–666 und Tn7R 1–199) einen selektierbaren Marker flankieren. Es hat sich gezeigt, dass ein pBR-Plasmid, das ein mTn7-Kanamycin-Element mit NotI- und SpeI-Schnittstellen an den Enden der Kanamycinkassette ein effektiver Donor ist. Wenn Transpositionsprodukte mittels Transformation rückgewonnen werden sollen, ist es nützlich, die Transformation eines Donors, der nicht reagiert hat, zu verhindern. Eine Strategie ist, das Rückgrat des Donors mit einem Restriktionsenzym, das nicht innerhalb des Tn7-Elements oder innerhalb der Target-DNA geschnitten wird, zu schneiden. Eine andere Strategie ist, Donor-Plasmide zu verwenden, die sich nicht mit den rückgewonnenen Produkten replizieren. Eine Strategie ist, die Replikation des Donors von einem Protein abhängig zu machen, das nicht in dem Transformationsstamm vorhanden ist. Zum Beispiel kann das Tn7-Element auf einem Plasmid angeordnet sein, das nicht selbst für ein Initiator-Protein der Replikation codiert. Ein besonderes Beispiel ist, ein R5K-Plasmid, das nicht für das Replikatorprotein pir codiert, als Rückgrat des Donors zu verwenden. Das R6Kpir-miniTn7-Plasmid kann dann in einem Stamm, der pir enthält (der zum Beispiel durch ein heterologes Plasmid bereitgestellt wird), angezüchtet und die Transpositionsmischung in einem Stamm, dem pir fehlt, transformiert werden. Durch eine Selektion nach dem Marker auf dem Tn7 werden nur Insertionen in die Target-DNA rückgewonnen. Für die Subklonierung effiziente, kompetente DH5alpha-Zellen wurden von GIBCO BRL erworben und gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.
Das Target-Plasmid pRM2 (SEQ ID NO: 6) enthält die Basen –342 bis +165 von attTn7, der in pUC18 kloniert worden war [47]. Das Donor-Plasmid pEMΔ (SEQ ID NO: 4) trägt ein miniTn7-Element, das aus den 166 terminalen Basen des linken Endes von Tn7 und 199 Basen des rechten Endes, die ein Gen flankieren, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht, bestand [23].
Tns-Proteine
Die Reinigung von TnsA und TnsB-His wurden in (63) beschrieben. TnsA wurde in 25 mM Hepes (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% Glycerin bei –80°C gelagert. TnsB war TnsB-His, ein Derivat, das ein C-terminales Polyhistidin-Tag enthielt, und wurde in 25 mM Hepes (pH 8,0), 500 mM KCl, 2 mM DTT, 1 mg/ml BSA, 25% Glycerin bei –80°C gelagert. Die Reinigung von TnsC und TnsC^A255V ist eine von (24) modifizierte Vorgehensweise (24), die in (25)(26) beschrieben ist. Beide Proteine wurden in 25 mM Hepes (pH 8,0), 1 M NaCl 2,5 mM DTT, 1 mM ATP, 10 mM MgCl₂, 0,1 mM EDTA, 10 mM CHAPS, 10% Glycerin bei –80°C gelagert. TnsD war TnsD-His (P. Sharpe und N. Craig, bei der Zubereitung), ein Derivat, das ein C-terminales Polyhistidin-Tag enthielt, und wurde mittels Ni²⁺-Chromatographie gereinigt, bevor es in 50 mM Tris (pH 7,5), 2 mM DTT, 500 mM KCl, 1 mM EDTA und 25% Glycerin bei –80°C gelagert.
Transpositionsreaktionen in vitro
Die Transpositionsreaktionen wurden aus der Standard-in vitro-Reaktion, die in (23) beschrieben ist, angepasst. Die Reaktionsmischungen, 100 μl Volumen, enthielten (Endkonzentration) 0,25 nM pEMΔ-Donor, 1,9 nM pRM2-Target, 26 mM Hepes, 4,2 mM Tris (pH 7,6), 50 μg/ml BSA, 100 μg/ml Hefe-tRNA, 2 mM ATP (pH 7,0), 2,1 mM DTT, 0,05 mM EDTA, 0,2 mM MgCl₂, 0,2 mM CHAPS, 28 mM NaCl, 21 mM KCl, 1,35% Glycerin, 60 ng TnsA, 25 ng TnsB, entweder 100 ng TnsC^wt oder 100 ng TnsC^A225V und 40 ng TnsD, soweit es nicht anders angegeben ist, in einer 30-minütigen Vorinkubation bei 30°C. (TnsA = 19 nM, TnsB = 3,1 nM, TnsC = 16 nM, TnsD = 6,5 nM). Magnesiumacetat wurde zu einer Endkonzentration von 15 mM gegeben und die Reaktionen wurden weitere 60 Minuten bei 30°C laufen gelassen. Die Produkte wurden mit einer 1:1-Mischung aus Phenol/Chloroform extrahiert, in Ethanol ausgefällt und in Wasser in einer Zubereitung für nachfolgende Analysen resuspendiert.
PCR-Primer und Amplifikation
Die für die verschiedenen PCR-Amplifikationen zur Analyse der Produkte der Transposition verwendeten Oligonukleotide sind:
Zwei Prozent der 100 μl Transpositionsreaktion wurden als Templat in einer gegebenen PCR-Reaktion verwendet. 100 pg des Plasmids pMCB20 wurden verwendet wenn ein Markerprodukt für einen Größenvergleich auf den hochauflösenden Denaturierungsgelen amplifiziert wurde. Bei allen Amplifikationen wurden 30 Temperaturzyklen von 94°C für 1,0 Minuten, 55°C für 1,5 Minuten und 72°C für 1,5 Minuten laufen gelassen, worauf eine einmalige, 5-minütige Inkubation bei 72°C folgte. Die Zusammensetzung des Puffers und die Menge der Taq-Polymerase, die von dem Hersteller (Boehringer Mannheim Biochemicals) empfohlen wurden, wurden bei allen Reaktionen verwendet. Die PCR-Produkte wurden in Ethanol ausgefällt in Wasser resuspendiert und auf ein hochauflösendes Denaturierungsgel geladen.
Markierung der Sonden
Die Oligonukleotidsonden wurden für 45 Minuten bei 37°C am 5'-Ende mit [gamma-³²P]-ATP-Substrat und der Polynukleotidkinase des Bakteriophagen T4 markiert. Die markierten Sonden wurden mittels Größenausschluss durch eine G50-Nick Spin-Säule (Pharmacia) vom nicht eingebauten Marker abgetrennt.
Hochauflösende Denaturierungsgele
Mit den resuspendierten PCR-Produkten wurde entweder auf 5%-igem oder auf 6%-igem, denaturierenden Polyacrylamidgel eine Elektrophorese durchgeführt und diese auf eine Gene Screen Plus-Membran (du Pont) elektrotransferiert. Die resultierenden Blots wurden durch Hybridisierung an eine geeignete Oligonukleotidsonde bei 50°C sichtbar gemacht und über Nacht Phosphorimager-Platten (Molecular Dynamics), die am folgenden Tag ausgelesen wurden, ausgesetzt.
Ergebnisse
TnsC^A225V unterstützt die effiziente Transposition in vitro
In 7 ist ein Diagramm einer Tn7-Transposition gezeigt. Tn7 wandert über einen Schnitt-und-Einfügen-Mechanismus, wodurch beide Enden des Elements durch Aufbrechen des Doppelstrangs zuerst aus dem Rückgrat des Donors ausgeschnitten werden und am wahrscheinlichsten über Transveresterungsreaktionen an die Target-DNA geknüpft werden, um einfache Insertionen mit kurzen Lücken an jedem Ende auszubilden. Andere mögliche Intermediate einer Transpositionsreaktion sind Doppelstrangbrüche (DSB), bei denen ein Ende des Transposons herausgeschnitten wurde, das andere Ende mit dem Donor-Rückgrat verknüpft bleibt, herausgeschnittene, lineare Transposons (excised linear transposons, ELT), b bei denen beide Enden aus dem Donor ausgeschnitten wurden und keines der beiden Enden mit dem Target verknüpft wurde und Doppelstrangbrüche, Verbindungen an einem einzigen Ende (double-strand break, single-end joins, DSB-SEJ), bei denen ein Ende des Transposons in den Donor eingearbeitet und mit dem Target-Molekül verknüpft wurde.
Die Tn7-Transpositionsreaktion wurde in vitro wiederhergestellt, in der gereinigte Tns-Proteine die Transposition eines mini-Tn7-Elements von einem Donor-Plasmid in ein attTn7 enthaltendes Target-Plasmid fördern (Bainton, 1993). TnsABC^wt + D unterstützt mit großer Effizienz diese Reaktion; annähernd_% [einsetzen] der Donor-Moleküle werden in einfache Insertionsprodukte (8, Bahn 4) umgewandelt. In Abwesenheit von TnsD erzeugt TnsABC^wt keine nachweisbare Menge an Insertionsprodukten (Bahn 2), obwohl nach einer verlängerten Inkubation Intermediate aus dem Doppelstrangbruch zu sehen sind. Im Gegensatz dazu zeigen TnsABC^A225V enthaltende Reaktionen eine enorme Ansammlung einfacher Insertionen mit einer Effizienz, die an TnsABC^wt + D-Reaktionen herankommt. Weder die TsnABC^A225V- noch die TnsABC^wt + D-Reaktionen erzeugen erkennbare Mengen an DSB-SEJ-Produkten, was anzeigt, dass die überwiegende Mehrheit der Tn7-Transpositionsereignisse eher zu der vollständigen (d. h. an beiden Enden erfolgenden) Insertions des Transposons in die Target-DNA führen, als zu einem nur an einem einzigen Ende auftretenden Insertionsereignis.
Die TnsABC + D-Transposition ist nicht nur effizient, sie ist auch sehr targetsitespezifisch. Die TnsABC + D-Insertionen erfolgen nahezu ausschließlich in den attTn7-Orten, die auf dem Target-Plasmid vorhanden sind (Bainton et al., 1993, Daten sind nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu sind die TnsABC^A225V-Insertionen nicht auf den attTn7-Ort beschränkt. Eine alternative Restriktionsanalyse der TnsABC^A225V-Reaktion ergibt Schlieren der Produkte auf einem Agarosegel (Daten sind nicht gezeigt), was bei einer Population aus Insertionen, die an vielen verschiedenen Positionen in dem Target-Plasmid lokalisiert sind, nahe liegt. Um die Verteilung dieser Insertionen zu untersuchen, unterzogen wir die TnsABC^A225V-Reaktionsprodukte einer hochauflösenden Analyse, wie unten beschrieben ist.
Die Verteilung der durch TnsABC^A225V vermittelten Insertionen ist sehr unspezifisch
Ein auf einer PCR basierender Ansatz wurde dazu verwendet, die durch Insertionen erfolgten in SV40 und Hefe-TRP1ARS1-Minichromosomen [30, 31] zu analysieren und funktionelle Analysen der durch Insertionen erfolgten Mutationen in dem Hefe-Chromosom V bzw. dem supF-Gen von E. coli durchzuführen [Smith, 1996, Nr. 427] und [32].
Die PCR wurde dazu verwendet, die Verteilung der TnsABC^A225V-Insertionen, die vorher mit hoher Auflösung auf dem Agarosegel zu sehen waren, zu untersuchen. Das Diagramm in 9 veranschaulicht die Strategie der PCR, die zum Amplifizieren der Population an Insertionsprodukten, die in einer TnsABC^A225V-Reaktion vorhanden sind, wobei zwei repräsentative Insertionen als Beispiele gezeigt sind, verwendet wurde. Ein PCR-Primer (NLC95) (SEQ ID NO: 7) hybridisiert innerhalb der cis-agierenden Endsequenz des inserierten Elements und der andere (NLC209) (SEQ ID NO: 8) hybridisiert an eine beliebige Position in dem Target-Molekül. Die Länge der PCR-Produkte spiegelt daher die Positionen der Insertionen in dem Target-Molekül wieder.
Die Amplifikation eines Pools aus Insertionen erzeugte wie erwartet Schlieren der Reaktionsprodukte, wenn sie auf einem Agarosegel gezeigt wurden (Daten sind nicht gezeigt). Die PCR-Produkte wurden auf einem 6%-igen, denaturierenden Polyacrylamidgel laufen gelassen, um eine Auflösung einzelner Nukleotide zu erreichen, und durch Southern Blotting und Hybridisierung an eine für Tn7 spezifische Sonde sichtbar gemacht. Das verblüffende Ergebnis ist, dass die Verteilung der Produkte bemerkenswerter Weise unspezifisch ist. Die Insertionen traten an nahezu jeder Base innerhalb des hochaufgelösten unteren Teils des Gels auf. Die PCR-Produkte mit mehr als annähernd 200 bp Länge sind schlecht aufgelöst. Einige Bereiche mit dichten Signalen sind in diesem Bereich zu finden, die möglicherweise bevorzugte Insertionspunkte angeben. Es konnte jedoch auch eine Verdichtung der Banden für die offensichtlich einzelnen Produkte festgestellt werden; eine Analyse dieser Insertionsprodukte mit anderen Primerpaaren stützte diese letztere Möglichkeit (siehe unten).
Dies bestätigt die Hypothese des Erfinders, dass der TnsABC^A225V-Mechanismus in der Lage ist, die Tn7-Transposition mit hoher Effizienz und geringer Spezifität in das Target-Plasmid zu steuern.
Kontrolle des gesamten Target-Plasmids
Die obigen Versuche waren auf einen relativ kurzen Bereich des Target-Plasmids pRM2 (SEQ ID NO: 6) gerichtet. Es wurde gezeigt, dass TsnABC^A225V Insertionen in nahezu jedes Basenpaar in diesem Bereich steuern kann. Um sicher zu gehen, dass dieses Phänomen nicht spezifisch für den Bereich des Plasmids ist, wurde eine Familie von Primern synthetisiert, von denen jeder mit einem für das Ende von Tn7 spezifischen Primer gepaart wurde, um eine Amplifikation aller Bereiche von pRM2 (SEQ ID NO: 6) zuzulassen. Diese Primer werden mit einem Abstand von annähernd 500 bp großen Intervallen um das Target-Plasmid herum angeordnet und werden die Insertionen in vorwiegend einer Richtung amplifizieren. 9 gibt die Amplikons für jedes Primerpaar an und zeigt den Southern Blot eines denaturierenden Gels der resultierenden PCR-Produkte. Die Ergebnisse geben an, dass die durch ^A225V vermittelten Insertionen in Positionen um das gesamte Plasmid herum auftreten. Wie bei dem ursprünglichen Amplikon, das analysiert wurde, tritt eine erhebliche Variabilität bezüglich der Stärke des Signals für einzelne Proteine der Insertion auf, die Insertionen treten jedoch bis zu einem gewissen Grad an jeder Position auf. Der TnsABC^A225V-Mechanismus scheint jedoch nicht für irgendeinen bestimmten Bereich dieses Target-Plasmids spezifisch zu sein.
In einem Ansatz des Untersuchens einer möglichen Sequenzspezifität der Targetsite-Selektion von TnsABC^A225 wurden 67 voneinander unabhängige Insertionen in ein 12 kb großes Plasmid gesammelt und analysiert. Die TnsABC^A225-Transpositionsreaktionen unter Verwenden eines Target-Plasmids, das Gene von E. coli enthielt, wurden in E. coli transformiert, um kanamycinresistente Kolonien zu selektieren. Die Target-Plasmide wurden dann rückgewonnen und sequenziert, um die Position jeder Insertion zu bestimmen. 62 der 63 Insertionen wurden in verschiedenen Positionen auf dem Target-Plasmid lokalisiert. Ein Vergleich der Sequenzen dieser Insertionen stützte unsere vorigen Beobachtungen, dass nur eine sehr geringe Sequenzspezifität vorhanden ist, um die Selektion der TnsABC^A225-Targetsites zu steuern. Versuche, eine Consensus-Sequenz für die 5 bp große Targetsite-Duplikationssequenz abzuleiten, offenbarten eine leichte Präferenz für NYNRN (SEQ ID NO: 14), die Tendenz ist jedoch nicht sehr zwingend.
Ausnutzen des für eine in vitro-Mutagenese
Die hohe Effizienz und die geringe Target-Spezifität des TnsABC^A225-Transpositionsmechanismus machen dies zu einem nützlichen System für das Mutagenisieren einer Vielzahl von DNA-Targets. Die durch Insertionen erfolgende Mutagenese konnte unter anderem an Cosmid-Bibliotheken, cDNA-Bibliotheken, PCR-Produkten, BAC, YAC und genomischen DNA durchgeführt werden. Der Erfinder hat auf pUC basierende Plasmide, Cosmide, BAC mit einer Größe zwischen 5 und 120 kb (Daten sind nicht gezeigt) und genomischer DNA von H. influenzae (Gwinn et al., 1997) mutagenisiert. Tatsächlich hat der Erfinder keine DNA gefunden, die nicht als Target für die TnsABC^A225-Transposition dienen kann.
Wenn die DNA-Targets erfolgreich in vitro mutagenisiert wurden, werden die einfachen Insertionen rückgewonnen. Damit ein einfaches Insertionsprodukt zu einem stabilen Replikon wird, müssen die nicht-homologen 5'-Überhänge, die von beiden Enden des inserierten Transposon wegstehen, entfernt werden, die Lücken aufgefüllt werden und die Stränge ligiert werden. Ein einfaches Verfahren, solche Bearbeitungsfunktionen auszuführen, ist, den Pool der Transpositionsprodukte in einen Wirt zu transformieren und sich auf den Reparaturmechanismus des Wirts zu verlassen, wobei auf einen Marker selektiert wird, der von dem Transposon getragen wird. Bei E. coli werden die einzelsträngigen 5'-Überhänge und Lücken an jedem Ende des Transposon nach einer einfachen Insertion durch den Wirt leicht repariert (siehe unten). Das Donor-Plasmid für andere Wirte könnte in vielerlei Weise daran angepasst werden, die Rückgewinnung der gewünschten, durch Insertion erhaltenen Mutanten bestmöglich zu erleichtern.
Der Erfinder hat einfache Insertionen in pRM2 in E. coli rückgewonnen, da Tn7-Insertionen in diesem Wirt leicht repariert werden können.
Einfach transformierende Transpositionsreaktionen in Wirtszellen als Verfahren zum Rückgewinnen einfacher Insertionsisolate stellt eine Grundlage dar, zu dem Donor-Moleküle beitragen, die keine Transposition durchlaufen haben und daher weiterhin den selektierbaren Marker auf einem stabilen Replikon tragen. Um die Falsch-Positiven des Untergrunds, die ein Screening auf durch Insertion erhaltene Mutanten erschweren, ausschließen zu können, kann die Fähigkeit des Donors, der nicht reagiert hat, Zellen zu transformieren, verringert werden. Es wurden zwei Verfahren bereitgestellt: 1) Zerstörung der Fähigkeit des Donor-Plasmids, sich zu replizieren, durch einen Restriktionsverdau vor der Transpositionsreaktion und 2) Verwendung eines konditionellen Replikonursprungs in dem Donor-Rückgrat, das den Donor für eine Replikation in den Zellen, die letztlich mit dem Transpositions-Pool transformiert werden, unfähig macht.
Bei dem ersten Verfahren wurden 5 identische TnsABC^A225-Reaktionen an DNA eines linearisierten pMCB31-Donors, die mit Target-DNA des Cosmid-Klons ES#3, einem annähernd 50 kb großen Replikon, das ein Insert aus genomischer DNA aus E. tarda enthält, gepaart war, durchgeführt. Das Linearisieren des Plasmids wird das Donor-Plasmid an einer Replikation hindern, wenn es in den Wirt transformiert wurde. Für die Schritte der Extraktion und der Fällung wurden die Produkte in einem Pool gesammelt und anschließend wurde ein Teil der resultierenden Probe in BRL für die Subklonierung effiziente, kompetente DH5-alpha-Zellen transformiert. Mit der Annahme eines 10%-igen Verlusts bei der Rückgewinnung der DNA nach der Transpositionsreaktion betrug die Effizienz der Transformation, bezogen auf μg des Einsatzes an Donor-DNA, annähernd 3,8 × 10⁴ Kolonien/μg/ml Zellen. Bei einer Reaktion werden üblicherweise 1/10 Mikrogramm Donor-Donor DNA verwendet, so dass, mit Hilfe einer Extension, wenn die gesamte Produkt-DNA aus einer einzigen Transpositionsreaktion transformiert wird, 3800 Kolonien isoliert werden konnten, was eine effiziente Mutagenese darstellt. Es wird angegeben, dass die DH5^alpha-Zellen eine Transformationseffizienz von gleich oder mehr als 1 × 10⁷ Kolonien/μg supercoiled-pUC 19/ml Zellen aufweisen. Einfache Zellen mit höherer Effizienz oder Elektroporationszellen zu verwenden, sollte eine erheblich höhere Anzahl an Isolaten aus einer einzigen Transpositionsreaktion erzielen und wahrscheinlich beim Aufnehmen seltenerer Ereignisse helfen.
Ein anderes Verfahren verwendet einen heterologen Replikationsursprung auf dem Donor-Plasmid, zum Beispiel R6K. Replikons, die auf diesem Ursprung beruhen, müssen in einem Wirt, der eine in diesem enthaltene Kopie des pir-Gens, das für das π-Protein, einen notwendigen Bestandteil für die Initiierung des Replikation an R6K_gamma-Ursprüngen trägt, trägt, beibehalten werden. Es ist daher einfach Falsch-Positive zu bestimmen, die aus Donor-Molekülen, die nicht reagiert haben, stammen, indem einfach die Transpositionsprodukte in pir^–-Zellen transformiert werden und sich bezüglich der Rückgewinnung von einfachen Insertionsisolaten auf den kompetenten Replikationsursprung in dem Target-Molekül verlassen wird. Für die Transformation, wie sie oben beschrieben ist, wurden Transpositionsreaktionen, die diesen Donor verwenden, zubereitet.
Es ist absehbar, dass das längere Plasmid (~50 kb) schwierig zu transformieren sein würde, nachdem es eine Insertion erhalten hatte, da es ein größeres, offenes, kreisförmiges Molekül mit annähernd der 10-fachen Größe des offenen Kreises von pRM2 (3,2 kb) mit einer Insertion wäre. Um einen Einblick in die Möglichkeiten der Beschränkung von Target-Größen unter Verwenden des Transformationsverfahrens zur Rückgewinnung einer einfachen Insertion zu bekommen, wurden die Transpositionen des miniTn7-Elements von pMCB40 in die beiden Plasmide direkt miteinander verglichen. Die Effizienz der Transformationen der beiden Reaktionen war sehr ähnlich. Die unterschiedlichen Targets wurden mit vergleichbaren Konzentrationen in die Transpositionsreaktionen eingeschlossen, sie waren jedoch nicht äquimolar. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass einfache Insertionen in ES#3 die Zellen mit nahezu der gleichen Effizienz wie die einfachen Insertionen in den kleineren pRM2 transformieren können. Es ist schwierig, die Reaktionsbedingungen, bei denen das Cosmid-Target mit der gleichen Molarität wie das pRM2-Target verfügbar ist, zu testen, da erhöhte Mengen an Gesamt-DNA in den Reaktionen die Reproduzierbarkeit, mit der die DNA nach der Transposition rückgewonnen wird, beeinträchtigen kann.
Die hohen Transformationseffizienzen zeigen die Nützlichkeit dieser Reaktion bei einer Mutagenese, in der die einfachen Insertionsprodukte stabil in einem E. coli-Wirt repliziert werden können. Die gleiche Art Protokoll könnte in anderen Bakterien-Spezies und -Stämmen mit Entwicklung der geeigneten DNA-Substrate verwendet werden.
Diskussion
TnsC^A225V umgeht die Anforderungen nach einem vorherbestimmten Protein
Bei der Selektion der Targetsite zeigt Tn7 eine beachtliche Vielfalt. Es besitzt ein kompliziertes System, entweder einen hoch-konservierten „sicheren Hafen", dem Chromosom von E. coli (attTn7) oder einige zufällige Orte im gesamten Genom der Zelle oder darin enthaltener, konjugierbarer Plasmide auszuwählen, wobei diese verschiedenen Selektionen über alternative Targeting-Proteine, die von dem Element codiert werden, vermittelt werden. Tn7 unterscheidet sich daher erheblich von allen anderen, allgemein charakterisierten, transponierbaren Elementen, deren Selektionen der Targetsites vorwiegend über entweder die Transposase allein (z. B. IS10/Tn10) oder in Verbindung mit einem anderen zusätzlichen Protein (Bakteriophage Mu) vermittelt werden. IS10/Tn10 selektiert eine Targetsite über eine direkte Wechselwirkung der Tn10-Transposase mit der Target-DNA. Es wurde gezeigt dass bestimmte Mutationen in der Tn10-Transposase in der Lage sind, die Merkmale der Target-Erkennung zu ändern, während andere Funktionen der Transposase davon nicht beeinträchtigt werden (65). Der Bakteriophage Mu codiert jedoch für eine Transposase Mu und einen von ATP abhängigen Aktivator MuA, MuB. MuB wirkt als zusätzliches Protein, das, wenn es in einem Komplex mit der Target-DNA vorliegt, die MuA-Transposase zu dem Ort der Insertion anzieht. Es ist wahrscheinlich, dass die Beteiligung von mehr Proteinen zugelassen hat, dass Tn7 sich mehr an die Änderungen der Umgebung anpassen kann, wenn es sich neue Aufenthaltsorte sucht, und sein Überleben dadurch sichergestellt wird, dass es in der Lage ist, einen besser angepassten Ansatz dafür zu verwenden, sich selbst zwischen verschiedenen Zellpopulationen zu verteilen.
Dieses Beispiel hat sich auf die Rolle von TnsC in der Selektion einer Targetsite konzentriert. Wie diskutiert wurde, wurde impliziert, dass TnsC das Haupt-Verbindungsglied zwischen der an die Donor-DNA gebundenen TnsAB-Transposase und den vorherbestimmten TnsD- oder TnsE-Proteinen, die mit der Target-DNA in einem Komplex vorliegen, ist. Versuche haben gezeigt, dass TnsC kein Vermögen dazu besitzt, in Abwesenheit von TnsD und TnsE (Ref.) DNA unspezifisch zu binden, Versuche zur Isolierung einfacher Insertionen in vivo und in vitro in Abwesenheit der Targeting-Proteine mit Wildtyp-TnsC waren jedoch nicht erfolgreich (23). Die Isolierung der TnsC^A225V-Mutante hat jedoch dem Erfinder ermöglicht, diese Anforderung zu umgehen und einfach Insertionen aus Reaktionen, denen TnsD und TnsE fehlt, zu isolieren. Die Mutante ermöglicht nicht die die Rückgewinnung einfacher Insertionen, sie ermöglicht sie sogar sehr effizient.
Fähigkeit von TnsC^A225V, sich unspezifisch zu inserieren
Es ist klar, dass TnsC^A225V eine beachtliche gain of function gegenüber dem Wildtyp-TnsC aufweist, wie durch die erhöhte Ausbeute an einfachen Insertionen in einer Standard-in vitro-Reaktion bestätigt wurde (25)(26) (dieses Beispiel). Es war eine detailliertere Beurteilung erforderlich, um die tatsächlichen Orte der Insertion zu bestimmen, da die Restriktionsverdaus der Produkt-Pools anzeigten, dass bei der Selektion des Ortes, bezogen auf die durch TnsC vermittelten Insertionen, die nahezu ausschließlich gegen den Ort der Anlagerung gerichtet sind, eine erhebliche Variabilität vorlag. Die PCR-Amplifikation der Pools aus Transpositionsprodukten, gefolgt von der Analyse verschiedener, voneinander unabhängiger Reaktionen auf hochauflösenden Denaturierungsgelen hat offenbart, dass die Insertionen in das Target-Plasmid pRM2 an jeder Base nachweisbar sind, die innerhalb der gut aufgelösten Abschnitte der Gele sichtbar ist. Obwohl die Selektion der Targetsite nicht vollständig auffällig ist (es treten Unterschiede in den Intensitäten der Banden auf), ist eine Möglichkeit die, dass die Aktivität der unspezifischen Bindung an DNA von TnsC in der TnsC^A225V-Mutante verstärkt war, wodurch dem Protein das Vermögen verliehen wird, die TnsAB-Transposase zu der beobachteten, breiten Vielfalt an Insertionsorten zu steuern.
Es ist möglich, dass die TnsC^A225V-Mutation das TnsC in einer solchen Weise verändert hat, dass es einen TnsC-TnsE-Komplex stimuliert, der zu Insertionen an zufälligeren Orten in der Lage ist. Vielleicht ist die Rolle von TnsE die, die unspezifische Wechselwirkung von TnsC mit der Target-DNA zu verstärken, wodurch Insertionen in die Orte, an denen TnsC und TnsE zufällig einen Komplex bilden, gefördert wird. Die Fähigkeit von TnsE, die Transposition bevorzugt zu konjugierenden Plasmiden hin zu steuern (14) bewahrheitet sich, wenn TnsC^A225V durch Wildtyp-TnsC (SEQ ID NO: 1 und 2) ersetzt wird (25)(26). Dies lässt vermuten, dass diese Mutation in TnsC nicht alle spezifischen Aktivitäten zum Abzielen auf ein Protein als Target ausgleicht. Die TnsC^A225V-Reaktion ist auch auf die Gegenwart des targetsite-spezifischen Proteins TnsD sensitiv, wie durch einen nachweisbaren Anstieg in der Häufigkeit der Insertionen, wenn TnsD vorhanden ist, bewiesen wurde.
Diese Beobachtungen können erklären, warm Tn7 sich ausgewählt hat, einen komplexeren Mechanismus zur Selektion der Targetsite zu konservieren. In einer Zelle, die nur Wildtyp-Proteine enthält, kann eine weitere Regulationsebene ausgeübt werden, wenn zwei Proteine zur Steuerung der Insertionen einen Komplex bilden und das Ergebnis kann für die Zellpopulationen weniger schädlich sein als manch steil ansteigende Mengen an Insertionen, die bei Reaktionen mit dem TnsC^A225V in Abwesenheit vorherbestimmter Proteine zu beobachten sind. Das Auftreten einer Mutation, wie beispielsweise TnsC^A225V, in der Natur würde die Spezifität verringern und die Häufigkeit der Insertionen erhöhen, wobei die Folge davon ziemlich wahrscheinlich mehr Insertionen in den wesentlichen Genen wären.
Es ist vorstellbar, dass TnsC immer die Hauptrolle bei der Steuerung der TnsAB-Transposase zu Inserts spielte und die Targeting-Proteine eher zusätzliche Proteine sind. Der Erfinder hat vorhergesehen, dass TnsD neben dem Ort der Anlagerung an die DNA bindet und dass TnsC als Aktivierungsbrücke zu der Transposase wirkt, eine andere Sichtweise ist, dass die Fähigkeit von TnsC, an DNA zu binden, eine zentralere Rolle bei der Steuerung des Donor-Komplexes zu einem Insertionsort hin spielt und dass TnsD die Rolle des „Lenkens" des TnsAB + TnsC-Komplexes zu einem bestimmten Insertionspunkt hin hat. Die A225V-Punktmutation könnte die Fähigkeit an TnsC verleihen, den Donor-Komplex ohne Hilfe eines Target bindenden Proteins zu dem Insert hin „zu lenken".
Es liegt keine offensichtliche Sequenzpräferenz an dem Insertionspunkt vor
Hierbei wurden zwei Hauptansätze unternommen, um die durch TnsC^A225V vermittelten Insertionen bei der Auflösung der Nukleotide zu analysieren. Der erste umfasst das Auslesen entlang eines kurzen DNA-Abschnitts unter Verwenden von PCR und einer Analyse der hochauflösenden Denaturierungsgele, wodurch die spezifischen Signale an jeder Base in einer fortschreitenden Weise quantifiziert werden und ein Sequenzmotiv, das denjenigen mit den höchsten Signalen oder den niedrigsten Signalen gemeinsam ist, herauszufiltern versucht wird. Das zweite Verfahren konzentriert sich nur auf die Rückgewinnung der häufigsten Insertionen, diejenigen, die durch einfaches Transformieren der Transpositionsprodukte rückgewonnen werden können und sich zur Durchführung einer erfolgreichen Reparatur des Replikons auf den Wirt verlassen. Diese beiden Verfahren stellen verschiedene Sichtweisen eines allgemeinen Prozesses bereit. Da die Rückgewinnung spezifischer Insertionen auf den Vorgang der Transformation angewiesen ist, werden seltene Insertionsereignisse, die mit Hilfe des PCR-/Denaturierungsgel-Verfahrens sichtbar gemacht werden, sehr wahrscheinlich in einer Population von rückgewonnenen Transformanten stark unterrepräsentiert sein, wenn wir annehmen, dass eine höhere Konzentration eines bestimmten Templats ein diagnostisches PCR-Produkt mit größerer Intensität erzeugen wird. Dies sollte die aus den Transformationen eines Transpositionsprodukts angesammelten, repräsentativen Daten dahingehend beeinflussen, mit der Untergruppe an PCR-Produkten, die durch eine Analyse auf Denaturierungsgelen analysiert wurden, mit den größten Intensitäten der Banden zu überschneiden. Auf diese Weise sind beide Arten an Daten dafür zulässig, einen bevorzugten Insertionsort zu bestimmen zu versuchen.
Die Suche des Erfinders nach einem gemeinsamen Motiv des Insertionsorts konnte keine bevorzugten einzelnen Nukleotide oder Gruppen von Nukleotiden aufdecken, die eine größere Häufigkeit unter den am meisten intensiven Signalen auf einem Denaturierungsgel oder unter den Insertionen, die durch Transformation isoliert wurden, zeigten. In ähnlicher Weise waren keine augenscheinlichen Motive vorhanden, die den am wenigsten bevorzugten Orten, die in der Analyse auf den Denaturierungsgelen untersucht wurden, gemeinsam waren. Das Fehlen einer Sequenzpräferenz für Insertionen bei dieser Reaktion ist ein sehr gewünschtes Ergebnis, wenn es als sehr unspezifisches Verfahren zum Mutagenisieren der DNAs verwendet werden soll.
TnsC^A225V: Ein Hilfsmittel für eine in vitro-Mutagenese
Die eindrucksvolle Effizienz und geringe Spezifität der in vitro-Reaktion von TnsC^A225V macht die Reaktion zu einem hervorragenden Werkzeug für eine in vitro-Mutagenese. Die große Effizienz der Reaktion (d. h. der hohe Prozentsatz der Umwandlung des Donor-Substrats in einfache Insertionen mit doppelten Enden) ist entscheidend, wenn überlegt wird, wie die rekombinanten DNAs rückgewonnen werden sollen. Die Beobachtung, dass die Mehrheit der Moleküle, die sich aus einer Reaktion ergeben, die eine Verbindung zwischen der Donor-DNA und der Target-DNA enthalten, einfache Insertionen mit doppelten Enden sind, stellt gegenüber alternativen, auf Transposons basierenden, durch Insertionen erfolgenden Mutagenesesystemen einen Vorteil bereit, da große Abschnitte der Verbindungen, die in diesen Reaktionen zu sehen sind, Verbindungen mit einem einzigen Ende sein können (Rowland, S. J. et al., EMBO J., 14: 196–205 (1995)). Diese Untersuchung hat gezeigt, dass standardmäßig kommerziell erhältliche, kompetente E. coli-Zellen in der Lage sind, die mit charakteristischen Lücken versehenen Moleküle, die infolge einer einfachen Tn7-Insertion gebildet werden, reparieren können, vorausgesetzt, dass die Target-DNA einen Ursprung enthält, der sich in E. coli replizieren kann. Tausende der Isolate können aus einer einzigen Transpositionsreaktion rückgewonnen werden, wobei mit Mengen der Donor- und Target-DNA im Submikrogramm-Bereich begonnen wird. Zellen mit hoher Effizienz sollten sogar noch größere Anzahlen an Isolaten erzielen können. Über Tn7-Insertionen erfolgte Mutanten könnten aus vielen verschiedenen Organismen rückgewonnen werden, solange die Target-DNA die Informationen trägt, die zur Replikation in dem entsprechenden Wirt erforderlich sind, die Lücken können von dem Wirt repariert werden und die DNAs können mit vernünftiger Effizienz erneut in den Wirt eingeschleust werden.
Die Cosmid-Klone wurden mit den soeben beschriebenen Verfahren erfolgreich mutagenisiert und rückgewonnen. Unter Verwenden gereinigter Cosmid-Klone wurden Plotreaktionen durchgeführt. Es würde jedoch sehr einfach sein, eine vollständige Cosmid-Bibliothek zu mutagenisieren und mit dem gleichen Verfahren auf Mutanten zu selektieren. Replikons, die so groß wie 125 kb (ein AC, nicht gezeigt) waren, wurden erfolgreich als Target verwendet und rückgewonnen. Eine frühere Untersuchung des Erfinders zeigte, dass die Fähigkeit des Transpositionsmechanismus, zu erkennen, ob ein potentielles Target-Molekül bereits eine Insertion enthält oder nicht, scheitert, wenn der Abstand zwischen den beiden Insertionsorten zunimmt (52). Es wurde gezeigt, dass der Grad, bis zu dem ein Target-Molekül gegen eine zweite Insertion „immun" ist, eine umgekehrte Beziehung zu der Länge des Abstands der Insertionsorte voneinander aufweist. TnsC^A225V hat eine Sensitivität gegen Immunitätssignale gezeigt. Bis heute hat der Erfinder sehr wenige Beispiele für Doppelinsertionen in Plasmiden in dem Bereich von 40 bis 50 kb gesehen, was nahe legt, dass dieses Hilfsmittel sehr effektiv für mutagenisierende Cosmide oder Plasmide in dem Bereich von 1 bis 50 kb sein wird.
Beispiel 3
Kit zum Erzeugen von Transposoninsertionen
Das Kit stellt Transposoninsertionen in DNA in vitro bereit. Diese Insertionen können zum Bereitstellen von Priming-Sites für die Bestimmung einer DNA-Sequenz oder Mutationen, die für eine genetische Analyse geeignet sind, oder beides bereitgestellt werden.
Abschnitt A: Bestandteile der Reaktion
A1) PROTEINE

TnsA 30 μg/ml in 10% Glycerin
TnsB 20 μg/ml in 25% Glycerin
TnsC₁₂₇ 100 μg/ml in 10% Glycerin

Die Proteine wurden auf –70°C gehalten. A2) BESTANDTEILE DES PUFFERS

HEPES 0,25 M pH 811

Tris [Cl] 0,25 M pH 7,6 [kann weggelassen werden]

BSA 10 mg/ml

tRNA 50 μg/ml [kann weggelassen werden]

DTT 1 M

ATP 100 mM

Mg-Acetat 375 mM

A3) DONOR PLASMID FÜR DAS TRANSPOSON

100 μg/ml
Die wesentlichen Merkmale des Plasmids sind oben beschrieben, da es das konditionelle R6K-Replikon enthält. A4) KONTROLL-TARGET-PLASMID

pLITMUS28 400 μg/ml
Dieses Plasmid enthält sowohl den pUc- als auch den Mi3-Ursprung, eine lacZ'-MCS und amp. Siehe die Figurenerklärung in 11B.
(New England BioLabs, 32 Tozer Road, Beverly, Massachusetts, 01915) A5) SEQUENZIERUNGSPRIMER

NLC94 (SEQ ID NO: 13) 3 pmol/μl

NLC95 (SEQ ID NO: 7) 3 pmol/μl
Abschnitt B: (Kann von dem Benutzer bereitgestellt werden)
B1) FÜR DIE REAKTION in vitro

Wasser, Millicue oder empfohlenes Äquivalent
Target-DNA, die keine Kanamycinresistenz trägt (0,4–0,5 μg pro Reaktion)
Wasserbad oder Heizblock, 30°C
1,5 ml Mikroröhrchen oder ein anderes Reaktionsgefäß; eins pro Reaktion.

B2) ZUM STOPPEN DER REAKTION

wenn chemisch kompetente Zellen verwendet werden
Wasserbad oder Heizblock, 75°C; Zu beachten: nicht 65°C.
wenn elektrokompetente Zellen verwendet werden
Destilliertes Phenol, das mit TE oder Tris pH 8,0 äquillibriert worden war Chloroform, das mit TE oder Tris pH 8,0 äquillibriert worden war
EtOH zum Ausfällen
Na-Acetat 3 M
Wasser oder 1 mM Tris pH 8 oder TE

B3) ZUM RÜCKGEWINNEN DER INSERTIONEN:
B3a) Transformierbare Zellen:

Es kann jeder Standardstamm von E. coli verwendet werden; wir haben ER1821, ER2502 und MC1061 (New England BioLabs, 32 Tozer Road, Beverly, Massachusetts, 01915) verwendet.

Jeder kanamycin-sensitive Organismus, in dem npt exprimiert werden kann, kann auch mit dem KanR-Donor, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Salmonella, andere entere Organismen, Haemophilus, Rhizobium, und Bacillus verwendet werden, Mit einem in geeigneter Weise veränderten, selektierbaren Marker auf dem Donor-Plasmid für das Transposon kann jeder prokaryotische oder eukaryotische Organismus, in den exogene DNA eingeschleust werden kann, zum Rückgewinnen der Insertionen verwendet werden.
In diesem Beispiel wurden

B3ai) Chemisch kompetente ER1821 New England BioLabs, 32 Tozer Road, Beverly, Massachusetts, 01915 (2 × 10⁷ Transformanten/μg LITMUS oder einem ähnlichen Plasmid) verwendet. Ein Probenprotokoll für die Zubereitung derselben wird unten in Abschnitt D1 bereitgestellt.

In Beispiel 2 zeigten wir die Verwendung von

B3aii) Elektrokompetenten MC1061 (ATCC-Nr.; 53338) (7 × 10⁹ Transformanten/μg pLITMUS-28 oder einem ähnlichen Plasmid). Ein Probenprotokoll für die Zubereitung derselben ist unten in Abschnitt D2 angegeben.

Kommerziell erhältliche kompetente oder elektrokompetente Zellen können ebenso verwendet werden. Das Verfahren zum Bestimmen der Kompetenz dieser Zubereitungen ist unten in Abschnitt D3 angegeben.
B3b) Anzuchtmedien:

An Fett reiche Brühe (D4a unten) oder mSOC (D4d) ohne Arzneimittel, oder ein Äquivalent
0,4 ml pro Reaktion; wir empfehlen drei Reaktionen als Standard-Pilotversuch (siehe Abschnitt C unten).

B3c) Selektive Medien:

An Fett reicher Agar mit Arzneimittel (D4b) oder ein Äquivalent
mindestens 1 Platte pro Reaktion; der in Abschnitt C beschriebene Standard-Pilotversuch erfordert 6 Platten, drei mit zwei Arzneimitteln und drei mit einem Arzneimittel.

Kanamycin ist zum Selektieren der Transposons aus dem vorliegenden Beispiel ERFORDERLICH

Ampicillin wird für die EMPFOHLENE Positivkontrolle verwendet.
Carbenicillin kann ausgetauscht werden.

Für das Beispiel aus Abschnitt C unten werden Rb Kan Amp (3 Platten) und RB nur Amp (3 Platten) verwendet. Wenn das Target-Plasmid irgendeine andere Arzneimittelresistenz trägt, sollte die in einem Versuch durchgeführte Reaktion in dem Pilotversuch auf Kanamycin plus dieses Arzneimittel ausplattiert werden.
B4) FÜR DIE VORBEREITUNG DER DNA ZUR SEQUENZIERUNG (siehe Beispiel 2):
Ein beliebiges Standardverfahren, das gewöhnlich eine DNA mit für die Sequenzierung guter Qualität ergibt. Wir haben Qiagen-Spinsäulen und Gravitationsfluss-Plasmid-Zubereitungen untersucht.
Abschnitt C. Protokoll der in vitro Tn7-Transpositionsreaktion

C1. REAKTIONSVOLUMEN = 100 μl C2. EMPFOHLENER PILOT VERSUCH Es sollte mit 3 Proben durchgeführt werden.

Reaktionsröhrchen 1	für den Versuch (Target-DNA, Protein und Donorplasmid zugegeben)
Reaktionsröhrchen 2	Positivkontrolle für die Reaktion (pLITMUS28, Protein und Donor-Plasmid zugegeben)
Reagenzglas 3	Negativkontrolle für die Reaktion (Target-DNA zugegeben, kein Protein, Donor zugegeben)
Reaktionsröhrchen 2	Reaktionsröhrchen 2 wird auch als Positivkontrolle für die Transformation verwendet

In diesem Beispiel besaßen alle Reagenzgläser pLITMUS28 als Target (die Reagenzgläser 1 und 2 wurden in doppelter Ausführung untersucht). Reaktionsröhrchen 2 muss nicht notwendigerweise in jedem Versuch verwendet werden. C3. HERSTELLEN einer Mischung unter Verwenden der Reagenzien aus Abschnitt A:

Pro Reaktion:
(73.9 μl H₂O) – (Volumen der Target-DNA); in diesem Beispiel beträgt die Target-DNA 1 μl
10 μl	Hepes (250 mM pH 8,1)
1 μl	Tris (250 mM pH 7,6)
0,5 μl	BSA (10 mg/ml)
2,1 μl	tRNA (50 μg/ml)
0,2 μl	DTT (1M)
2 μl	ATP (100 mM)

C4. VERTEILEN der Mischung aus Schritt 3 in jedem Reaktionsröhrchen (89,7 μl) – (Volumen der Target-DNA)/Reaktion; in diesem Beispiel beträgt dies 88,7 μl. C5. ZUGEBEN der Target-DNA aus Abschnitt B (0,4 μg) zu den Reaktionsröhrchen 1 bis 3. In diesem Beispiel ist dies pLITMUS28, 1 μl. Dies funktioniert für Plasmide als Targets. Bei Cosmiden funktionierten 0,5 μg gut, wenn das Cosmid ungefähr 10-mal so groß wie der Donor (5,2 kb) war, d. h. ein Molverhältnis von ungefähr 2:1 (Donor zu Target) vorlag. Ein Erhöhen des Verhältnisses auf 4:1 verringerte die Effizienz leicht. C6. ZUGEBEN zu jedem Reaktionsröhrchen

	Reaktionsröhrchen 1	Reaktionsröhrchen 2	Reaktionsröhrchen 3
TnsA	1,3 μl	1,3 μl (40 ng)	0
TnsB	3 μl	3 μl (20 ng)	0
TnsC₁₂₇	1 μl	1 μl (100 ng)	0
dH₂O	0	0	5,3 μl

C7. ZUGEBEN von 1 μl Donor-DNA (0,1 μl pMCB40). Gut vermischen durch mehrmaliges Auf- und Ab-Pipettieren.

	Reaktionsröhrchen 1	Reaktionsröhrchen 2	Reaktionsröhrchen 3
pMCB40 als Donor	1 μl	1 μl	1 μl

C8. INKUBIEREN für 10 Minuten bei 30°C (Assemblierungsreaktion) C9. ZUGEBEN von 4 μl MgAc (375 mM) zu jedem Reaktionsröhrchen. Gut vermischen durch mehrmaliges Auf- und Ab-Pipettieren.

	Reaktionsröhrchen 1	Reaktionsröhrchen 2	Reaktionsröhrchen 3
MgAc	4 μl	4 μl	4 μl

C10. INKUBIEREN für 1 Stunde bei 30°C (Transpositionsreaktion)
C11. HITZEINAKTIVIERUNG 75°C 10 Minuten. Zu beachten: 65°C sind nicht ausreichend.
C12. TRANSFORMIEREN unter Verwenden chemisch kompetenter Zellen (siehe Vorgehensweise in Abschnitt D1):

a. Zugeben von 10 μl der Reaktionsmischung zu 100 μl der auf Eis aufgetauten, kompetenten Zellen.
b. Inkubieren für 1 Stunde auf Eis.
c. Erhitzen für 45 Sekunden auf 37°C.
d. Abkühlen für 2 min auf Eis.
e. Verdünnen der Transformationsmischung in 0,4 ml RB (Gesamtvolumen 0,5 ml).
f. Inkubieren bei 37°C für 40 min.
g. Ausplattieren von 100 μl der Reaktionsröhrchen 1 bis 3 auf Kanamycin enthaltendem, selektivem Medium.
h. Ausplattieren der Verdünnungen aus Reaktionsröhrchen 2 auf Medium, das nur für das Target-Plasmid selektiv ist: 100-fach (10 μl/ml) und 1000-fach (1 μl/ml) verdünnen und ausplattieren von 100 μl des Unverdünnten und jeder Verdünnung (3 Platten).

In diesem Beispiel war das Selektivmedium RB Kan (20 μg/ml) Amp (110 μg/ml) (Reaktionsröhrchen 1 bis 3) und B Amp (100 μg/ml, Reaktionsröhrchen 2). Die kompetenten Zellen waren ER1821, chemisch kompetent (Abschnitt D1). C13. Ergebnisse der Transformation: Auf Kan Amp:

Reaktionsröhrchen 1 285 Kolonien

Reaktionsröhrchen 2 600 Kolonien

Reaktionsröhrchen 3 0 Kolonien

Auf Amp allein:

Reaktionsröhrchen 2 konfluent (unverdünnt)
Abschnitt D: Rezepte und hilfreiche Vorgehensweisen
D1) chemisch kompetente Zellen (E. coli):

a. Animpfen einer einzelnen Kolonie von einer RB-Agarplatte (siehe D4b) in 2 ml RB (D4a) in einem Röhrchen zum Ausplattieren. Über Nacht schütteln bei 37°C.
b. Subkultur über Nacht: 1:100 in 1 Volumeneinheit RB + 20 mM MgSO₄ (üblicherweise 250 ml). Anzüchten bis zur OD₅₉₀ = 0,4–0,6 oder Klett = 60 (~2–3 h).
c. Zentrifugieren mit 5.000 rpm für 5 min bei 4°C.
d. Vorsichtig resuspendiertes Pellet in 1/2,5 Volumeneinheiten eiskaltem TFBI (siehe unten, D4f). Alle Schritte auf Eis durchführen und alle Pipetten, Reaktionsröhrchen, Kolben usw. von diesem Zeitpunkt an abkühlen.
e. Inkubieren für 5 min auf Eis.
f. Zentrifugieren mit 5.000 rpm für 5 min bei 4°C.
g. Vorsichtig resuspendiertes Pellet in 1/25 des ursprünglichen Volumens des kalten TFB2 (D4g). Für 250 ml der ursprünglichen Subkultur 10 ml TFB2 verwenden.
h. Inkubieren auf Eis für 15–60 min, bevor Aliquots von 100 μl/Reaktionsröhrchen für eine Lagerung bei –70°C genommen werden. Die Reaktionsröhrchen schnell einfrieren.
i. Zum Transformieren ein Aliquot auf Eis auftauen; DNA zugeben; 1 h auf Eis inkubieren; 45 Sekunden bei 37°C mittels Hitzeschock behandeln; 2 min auf Eis inkubieren; 5-fach in RB ohne Arzneimittel verdünnen (zur Expression des Phänotyps); unter kräftigem Belüften bei 37°C 20 min anzüchten; auf Selektivmedium ausplattieren.

Diese Vorgehensweise funktioniert bei den meisten Stämmen gut und sollte routinemäßig > 10 cfu/μg pLITMUS28 ergeben (bei Verwenden von 0,1 ng/Transformation). Die eingefrorenen Zellen reichen für mindestens ein Jahr.
D2) Elektrokompetente Zellen (E. coli)
D2a. Gründe und Anmerkungen
Mit dieser Vorgehensweise werden Zellen zur Verwendung bei einem Gentransfer unter Verwenden einer Elektroporationsvorrichtung, wie beispielsweise derjenigen von BioRad, zubereitet. Die DNA wird mit Hilfe eines elektrischen Feldes in die Zellen eingeschleust.
Eine erfolgreiche Elektroporation erfordert eine geringe Elektrolytenkonzentration, um einen Funkendurchschlag (und das Abtöten der Zellen) in der Vorrichtung zu vermeiden. Die Zellen werden bis zur Mitte der exponentiellen Phase angezüchtet, ausgiebig in destilliertem Wasser und sterilem 10%-igen Glycerin gewaschen, in Glycerin auf das 500-Fache aufkonzentriert, aliquotiert und bei –70°C gelagert.
Für diesen Zweck kann jeder Stamm verwendet werden, obwohl bekannt ist, dass einige Stämme eine größere Anzahl an Transformanten ergeben. Für die besten Ergebnisse sollten diese resuspendierten Zellen gut dispergiert sein. Manche Stämme können in den Lösungen mit geringer Elektrolytkonzentration gleichmäßiger resuspendiert werden; manche Stämme lysieren unter diesen Bedingungen einer rauen Behandlung.
Die Vorgehensweise der Elektroporation selbst beinhaltet die Übertragung der aufgetauten Zellen in eine Elektroporationsküvette (die Drähte aufweist, die in geeigneter Weise mit der Vorrichtung in Kontakt stehen), Zugabe der DNA, Anlegen des elektrischen Feldes, Rückgewinnung aus dieser Behandlung (durch Inkubation in Brühe) und das selektive Ausplattieren.
Die Effizienz der Transformation bei diesem Verfahren ist 100–500-mal größer als bei einer Standard-Transformation. Sie ist daher besonders geeignet, wenn eine geringe Transformationseffizienz erwartet wird oder großen Mengen an Transformanten gewünscht sind. Es ist bekannt, dass das Verfahren insbesondere für das Einschleusen von großen DNA-Molekülen geeignet ist.
D2b. Zubereitung elektrokompetenter E. coli-Zellen (von BioRad empfohlenen Vorgehensweise)

i. Materialien für 2 ml elektrokompetente Zellen (20 Aliquots, 100 μl):

Über-Nacht-Kultur des gewünschten Stamms	1 ml
(in an Fett angereicherter Brühe-Brühe (D4a) oder Luria-Brühe (D4c))
Luria-Brühe (D4c)	1 l
dH₂O, steril, 4°C oder 0°C	1,5 l
10% (w/v) Glycerin, steril (D4h)	22 ml
1 l-Seitenarmkolben	2
250 ml-Zentrifugenflasche	6
50 ml-Zentrifugenröhrchen von Oak Ridge	2
1,5 ml-Mikroröhrchen, Polypropylen	20
Pipettenspitzen (steril) für P200 oder ein Äquivalent	20
Sterile Glas- oder Plastik-Pipetten, 25 ml	3
Kolorimeter von Klett-Summerson
Hochgeschwindigkeitszentrifuge (z. B. Beckman J21)
Mikropipettiervorrichtung, z. B. Gilson Pipetman P200
Gestell für ein Wasserbad, das zum Eintauchen der Röhrchen in flüssigen Stickstoff verwendet werden kann.
Bad mit flüssigem Stickstoff zum schnellen Einfrieren

ii. Vorgehensweise zum Herstellen der elektrokompetenten Zellen

Sicherstellen, dass das dH2O und das 10%-ige Glycerin kalt sind.
Falls nötig, die Luria-Brühe auf Seitenarmkolben, 500 ml-Kolben aufteilen.
Jeden Kolben mit 0,5 ml der Über-Nacht-Kultur animpfen.
Unter Schütteln bis zu Klett = 60 (5 × 10⁸ cfu/ml) inkubieren. Schnelle Umrechnung, wenn Klett nicht verfügbar ist: 1 OD = 150 Klett-Einheiten: 10⁹ Zellen/1,1 OD).
Unter Verwirbelung auf Eis abkühlen, bis sie kalt sind. Es ist sehr wichtig, von diesem Zeitpunkt an alles kalt zu halten.
In Zentrifugenflaschen, 167 ml/Flasche oder nach Wunsch, übertragen.
Mit 4.000 rpm 15 min lang bei 5°C in einem JA14-Rotor in einer Beckman-Zentrifuge zentrifugieren. Überstand abgießen.
Vorsichtig in gleichen Volumina (1 l insgesamt) an kaltem, sterilem, destillierten Wasser resuspendieren. Während des Resuspendierens in einem Eisbad halten.
Wiederholtes Pipettieren wird dabei helfen; bei dieser Verwendung Pipetten abkühlen. MC1061-Zellen (ER1709) können in dieser Phase für wenigstens eine Stunde auf Eis gehalten werden. Mit 4.000 rpm 15 min lang bei 5°C in einem JA14-Rotor in einer Beckman-Zentrifuge zentrifugieren; Überstand abgießen.
Vorsichtig in 1/2 Volumen kaltem, sterilem, destilliertem Wasser (0,5 l insgesamt) resuspendieren. Während des Resuspendierens in einem Eisbad halten. Die Zellen können nun, wenn gewünscht, in drei Flaschen vereinigt werden.
Mit 4.000 rpm 15 min lang bei 5°C in einem JA14-Rotor in einer Beckman-Zentrifuge zentrifugieren. Überstand abgießen. In 1/50 des Volumens des kalten, sterilen Glycerins (20 ml insgesamt) resuspendieren. Während des Resuspendierens kalt halten.
Gesamtmenge in ein 50 ml-Röhrchen von Oak Ridge (35 ml Fassungsvermögen) übertragen.
Mit 4.000 rpm 15 min lang bei 5°C in einem JA14-Rotor in einer Beckman-Zentrifuge mit einem Röhrchen fürs Gleichgewicht zentrifugieren. Überstand abgießen.
In 1/500 des Volumens (2 ml insgesamt) des eiskalten, 10%-igen Glycerins resuspendieren. Kalt halten.
100 μl/Zentrifugenröhrchen auf Mikroröhrchen in einem Gestell für ein Eiswasserbad verteilen; Gestell in flüssigen N2 eintauchen; in eine Box übertragen; bei –70°C lagern.

D2c. Vorgehensweise bei der Elektroporation porierbarer E. coli-Zellen (von BioRad empfohlene Vorgehensweise)
D2ci. Materialien (pro Elektroporationsreaktion)

Elektrokompetente Zellen 100 μl

18 × 150 mm Kulturröhrchen 1

Elektroporationsküvetten (BioRad Kat-Nr. 1652086 oder ein Äquivalent) 1

mSOC (siehe D4d) 1 ml

Pasteurpipetten, steril 1

Zu transformierende DNA; in einem Medium mit geringer Innenstärke, z. B. dH₂O oder TE (siehe D4i).
Elektroporationsvorrichtung (BioRad Gene Pulser oder ein Äquivalent)
Eisbad-Einsätze für Küvetten und Überwuchs-Röhrchen
In einer Inkubationsvorrichtung bei 37°C oder einer anderen Vorrichtung zum Inkubieren von Kulturrörchen rolltrommeln.
Selektive Agarplatten und Materialien zum Ausplattieren
Inkubationsvorrichtung bei 37°C oder einer anderen geeigneten Temperatur

D2cii. Vorgehensweise

Sicherstellen, dass alle Materialen bereits eingesetzt sind, bevor die Zellen aus dem Gefrierschrank genommen werden. Die DNA muss zugegeben werden und die Elektroporation durchgeführt werden, sobald die Zellen aufgetaut sind; die Zellen werden nach kurzer Zeit lysieren, was zu einem Funkendurchschlag führt, wenn die Leitfähigkeit des Mediums zunimmt.
Küvetten abkühlen und auf Eis (> 5 min) halten, Die Transformationseffizienz nimmt um mindestens das 100-Fache ab, wenn die Küvetten Raumtemperatur haben.
BioRad-Gene Pulser auf 25 μF Kapazität und 2,5 kV und die Kontrollvorrichtung des Impulses auf 200 Ω (maximale Spannung) einstellen.
Elektrokompetente Zellen bei Raumtemperatur auftauen und auf Eis übertragen.
In einer Küvette 40 μl der Zellen mit 0,4 pg bis 0,3 μg der DNA vermischen. Die Suspension bis zum Boden der Küvette schütteln, auf die Tischplatte klopfen, um Luftblasen herauszuschütteln.
Küvetten in die Halterung einstellen.
Impuls anlegen durch Drücken der roten Knöpfe, bis ein Piepton zu hören ist. Dies wird zu einem Impuls von 125 kV/cm mit einer Zeitkonstante von 4–5 sec führen.
Unmittelbar danach 1 ml mSOC zu der Küvette geben und die Zellen vorsichtig aber schnell resuspendieren. Dafür können eine P1000-Pipette mit sterilen blauen Spitzen oder sterile Pasteurpipetten verwendet werden. Eine Verzögerung bei der Zugabe des Mediums von 1 min führt zu einer Abnahme der Transformationseffizienz um das 3-Fache.
Zellen in das Kulturröhrchen übertragen.
1 Stunde lang bei 37°C inkubieren.
Auf selektive Medien aufbringen.

D3) Standardisierung der Transformation oder Elektroporation
D3a. Gründe und Anmerkungen
Um sicherzustellen, dass der Gentransfer erfolgreich ist, empfehlen wir, dass die oben zubereiteten Zellen (D1 oder D2) oder die kommerziell erworbenen Zellen vor der Verwendung in den Versuchen mit einer Standard-DNA-Verdünnungsreihe transformiert werden. Unten ist ein Beispiel für eine solche Standardisierung für elektrokompetente Zellen (D2) angegeben. Chemisch kompetente Zellen werden 100–150-mal weniger Transformanten erzielen, so dass die unten angegeben Verdünnungen entsprechend angepasst werden sollten.
D3b. Materialien für einen Standardisierungsversuch

Verdünnungen der Standard-DNA, üblicherweise kleine high copy-Plasmide (z. B. LITMUS28) in TE:

A	1 ng/μl
B	10 pg/μl
C	1 pg/μl
D	100 fg/μl

Selektive Agarplatten; RB 1,5% Amp 100 μl/ml für LITMUS 28	12
Verdünnungsmedium, üblicherweise 0,85% Kochsalzlösung	7 ml
Verdünnungsröhrchen, gewöhnlich 13 × 100 mm	7
Sterile Plastik- oder Glaspipetten, 0,1 ml	10
Sterile Plastik- oder Glaspipetten, 0,2 ml	1
Sterile Plastik- oder Glaspipetten, 1 ml	1

Mikropipetten, z. B., P200 und P20 oder P10, für die Übertragung der DNA und die Verdünnungsreihe
Pipettenspitzen für P200 und P20 oder P10
Verteilvorrichtung
Ethanol oder Isopropanol zum Abflammen der Verteilvorrichtung
Inkubationsvorrichtung bei 37°C

D3c. Vorgehensweise für Standardisierungsversuche
D3ci. Einstellen der unten angegebenen Verdünnungsröhrchen und Markieren der Platten vor oder während des Auswachsens der Kulturen. D3cii. Durchführen der Elektroporation wie oben (D2) mit den DNA-Verdünnungen A bis D D3ciii. Einstellen der Kulturen in Eis, um ein weiteres Wachstum während des Herstellens der Verdünnungen und Ausplattierens, wie es unten angegeben ist, zu verhindern. D3iv. Verdünnen in Kochsalzlösung:

Probe A 10^–1, 10^–2, 10^–3, 10^–4

Probe B 10^–1, 10^–2

Probe C 10^–1

Probe D keine Verdünnung

Dies kann durchgeführt werden als:
10^–1-Verdünnung: 100 μl Probe + 900 μl Kochsalzlösung
10^–2-Verdünnung: 10 μl Probe + 1 ml Kochsalzlösung
10^–3-Verdünnung: 10 μl der 10^–1-Verdünnung + 1 ml Kochsalzlösung
10^–4-Verdünnung: 10 μl der 10^–2-Verdünnung + 1 ml Kochsalzlösung D3cv. Ausplattieren auf selektiven Medien durch Verteilen; Abflammen der Verteilvorrichtung nach jeder Platte:

Verdünnungen:	unverdünnt	10^–1	10^–2	10^–3	10^–4
Proben:
A		0,1 ml	0,1 ml	0,1 ml	0,1 ml
B	0,1 ml	0,1 ml	0,1 ml
C	0,1 ml	0,1 ml
D	0,1 ml
	0,2 ml
	0,5 ml

D3vi. Beispiel für ein Ergebnis:

Probe	zugegebene	Verdünnung/ausplattiertes	Kolonien	Transformanten
	DNA	Volumen		pro ml	pro μg
A	1 ng	1/0,1	konfluent
		2/0,1	sehr zahlreich
		3/0,1	~1000
		4/0,1	71	7 × 10⁶	7 × 10⁹
B	10 pg	0/0,1	sehr zahlreich
		1/0,1	405
		2/0,1	49	4 × 10⁴	4 × 10⁹
C	1 pg	0/0,1	sehr zahlreich
		1/0,1	106	1 × 10⁴	1,1 × 10¹⁰
D	100 fg	0/0,1	~500
		0/0,2	173
		0/0,5	75	8 × 10²	8 × 10⁹

Mittlere Anzahl an Transformanten/μg 7,6 × 10⁹

D4) Rezepte

Bakteriologisch

D4a) RB, pro Liter

Trypton (Difco) 10 g

Hefeextrakt (Difco) 5 g

NaCl 5 g

NaOH (1 N) 2 ml

Autoklav

D4b) RB-Agar mit Arzneimittel, pro Liter

Trypton (Difco) 10 g

Hefeextrakt (Difco) 5 g

NaCl (Baker) 5 g

NaOH (1 N) 2 ml

Agar (Difco) 15 g
Autoklav
Arzneimittel: nach dem Autoklavieren zugeben und auf 55°C abkühlen, pro Liter:

Kanamycin (ERFORDERLICH) 20 mg
Andere Arzneimittel, die dazugegeben werden KÖNNEN, pro Liter; die Auswahl hängt von dem Target-Plasmid ab:

Ampicillin oder Carbenicillin 100 mg

Chloramphenicol 15 mg

Tetracyclin 15 mg
Andere Arzneimittel, die nicht getestet wurden, aber wahrscheinlich in einem geeigneten Wirtsstamm verwendet werden können:
Spectinomycin
Streptomycin
Gentamycin
Erythromycin
Rifampicin (rezessiver Marker)
Bleomycin
Andere kleine antibakterielle Moleküle D4c) Luria-Brühe, pro Liter

Trypton (Difco) 10 g

Hefeextrakt (Difco) 5 g

NaCl 10 g

MgCl₂·6H₂O 1 g

Glucose 1 g

Aliquotieren und autoklavieren. Zum Zubereiten elektrokompetenter Zellen (C1) ist es günstig, vor dem Autoklavieren 500 ml/Kolben in 1 l Seitenarmkolben zu aliquotieren.

Luria-Brühe	1 l
MgSO₄, 1 M, steril	10 ml
40% Glucose, steril	6,5 ml
MgSO₄ und Glucose steril zu steriler Luria-Brühe zugeben

NaCl

8,5 g

In geeigneten Aliquots verteilen, autoklavieren.
Puffer und Medien für die Lagerung

D4f) TFBI

30 mM KOAc (Kalium-Acetat)
100 mM RbCl
10 mM CaCl₂
50 mM MnCl₂
15% Glycerin

Einstellen auf pH 5,8 mit Essigsäure und sterilfiltrieren. Es ist günstig, dies als:

5 g RbCl (Alfa)

12,3 ml KOAc 1 M

4,1 ml CaCl₂ 1 M

20,5 ml MnCl₂ 1 M (pinkfarbig)

61,5 g Glycerin; pH mit ≤ 8 ml HOAc 0,1 M auf 5,8 einstellen.

durchzuführen;
bis zu 410 ml herstellen; in 100 ml sterilen Aliquots verteilen; und 1 Aliquot/250 ml Kultur verwenden.
D4g) TFBII

10 mM MOPS
75 mM CaCl₂
10 mM RbCl
15% Glycerin

Mit KOH auf pH 6,5 einstellen und sterilfiltrieren.
Herstellen als
1,5 ml MOPS 1 M pH 6,5 (gelb)
11,25 ml CaCl₂ 1 M
1,5 ml RbCl 1 M
22,5 g Glycerin
pH mit 1 N KOH einstellen; bis zu 150 ml herstellen, filtrieren; 10 ml pro ursprüngliche 250 ml-Kultur verwenden. D4h) 10% Glycerin, pro Liter

Glycerin 100 g

dH₂O 1 l

Aliquotieren und autoklavieren.

1 M Tris pH 8,0	10 ml
0,5 M EDTA pH 8,0	2 ml

Beispiel 4
Zufällige Insertion der Primer für die Sequenzierung
Abschnitt A. Bestandteile, die für die Transpositionsreaktion verwendet werden
A1) PROTEINE

TnsA 40 μg/ml in 10% Glycerin
TnsB 20 μg/ml in 50% Glycerin
TnsC₁₂₇ 100 μg/ml in 50% Glycerin
Lagerung bei –70°C.

A2) PUFFERBESTANDTEILE

HEPES	0,25 M pH 8,1
Tris [Cl]	0,25 M pH 7,6 [kann weggelassen werden]
BSA	10 mg/ml
tRNA	50 μg/ml
DTT	1 M
ATP pH 7	100 mM
Mg-Acetat	375 mM
Puffer für die Lagerung von TnsD	TnsD wird in dem folgenden Puffer gelagert:
	3,3 μl 500 mM KCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 2 mM DTT und 25% Glycerin.

A3) DONOR-PLASMID FÜR DAS TRANSPOSON

pEM delta R. neben 1

50 μG7ML

Die Sequenz ist in 10B als SEQ ID NO: 3 angegeben). A4) TARGET-PLASMID

1) pER183 mini-freigelegtes Lysat	200 μg/ml
2) pER183-CsCl-Zubereitung	400 μg/ml
3) pRM2	400 μg/ml

(Die Sequenz von pER183 ist in der 11A als SEQ ID NO: 5 angegeben).

Abschnitt B. Bestandteile, die für den Ablauf der Reaktion verwendet werden

Phenol/Chloroform wurde mit TE äquillibriert.
Phenol wurde mit Tris pH 8,0 äquillibriert.
Na-Acetat 3 M
Ethanol (EtOH)
BstEII New England BioLabs, 32 Tozer Road, Beverly, Massachusetts, 01915
DNA-Polymerase I-Holoenzym New England BioLabs, 32 Tozer Road, Beverly, Massachusetts, 01915
T4-DNA-Ligase New England BioLabs, 32 Tozer Road, Beverly, Massachusetts, 01915
10 × Fi/L-Puffer (Abschnitt I3)
10 × Puffer 3 (NEB Nr. 007-3) New England BioLabs, 32 Tozer Road, Beverly, Massachusetts, 01915
tRNA 1 mg/ml
DNA-Puffer (Abschnitt I2)
TE (Abschnitt I4)

Abschnitt C: Bestandteile, die zur Rückgewinnung der Insertionen verwendet werden

Elektrokompetente MC1061-Zellen (hergestellt und verwendet wie in Beispiel 3, D2 und D3)
Selektive Medien (hergestellt und verwendet wie in Beispiel 3, D3 und D4)

Abschnitt D: Bestandteile, die zur Bestimmung der Sequenz verwendet wurden
D1) SEQUENZIERUNGSPRIMER
d2) QIA_{PREP SPIN MINIPREP
KIT} (Qiagen Kat.-Nr. 27106)
D3) ABI-Sequenzierungsvorrichtung (Informationen) und Reagenzien
Abschnitt E: Protokoll der in vitro-Transposition
E1) Mischung zur HERSTELLUNG

208,2 μl dH₂O

30 μl Hepes (250 mM pH 8,1)

3 μl Tris (250 mM pH 7,6)

1,5 μl BSA (10 mg/ml)

6,3 μl tRNA (50 μg/ml)

0,6 μl DTT (1 M)

6 μl ATP (100 mM)

E2) VERTEILEN von 85,2 μl auf drei Reaktionsröhrchen E3) ZUGEBEN von Target-DNA aus A4, 2 μl E4) ZUGEBEN zu jedem Reaktionsröhrchen

Reaktionsröhrchen 1 Reaktionsröhrchen 2 Reaktionsröhrchen 3

TnsA 1,3 μl 1,3 μl 1,3 μl

TnsB 1 μl 1 μl 1 μl

TnsC₁₂₇ 1 μl 1 μl 1 μl

D-Puffer 3,3 3,3 3,3 μl

Donor 2 2 2 μl
E5) INKUBIEREN für 30 Minuten bei 30°C (Assemblierungsreaktion)
E6) ZUGEBEN von 4 μl MgAc (375 mM) zu jedem Reaktionsröhrchen
E7) INKUBIEREN für 1 Stunde bei 30°C (Insertion)
Abschnitt F: Reaktionsverlauf
In diesem Beispiel war der Donor für das Transposon in der Lage, sich in dem Wirt, der für die Rückgewinnung der Insertionen verwendet wurde, zu replizieren. Die Transformation der Reaktionsmischung auf Platten, die nach dem Transposon und den Target-Markern selektieren könnte eher gut zu vielen Kolonien mit zwei verschiedenen Plasmiden, als zu solchen mit einem einzigen Plasmid, das beide Marker enthielt, führen. Aus diesem Grund verdauten wir die Reaktion mit einer Restriktionsendonuclease, die in dem Donor-Replikon, jedoch nicht innerhalb des Transposons oder in der Target-DNA schneiden. Daneben untersuchten wir die Folgen des Reparierens der in der Transpositionsreaktion nicht-ligierten Stränge unter Verwenden des DNA-Polymerase I-Holoenzyms und der Ligase.
Vorreaktion (100 μl):
PC-Extrakt:

Zugeben von 100 μl Phenol/Chloroform, schütteln auf einer Vortex-Vorrichtung. 5 Minuten in einer Mikrofuge zentrifugieren.

Rückextrahieren:

Organische Phase entfernen, in ein neues Reaktionsröhrchen mit 100 μl TE geben; auf einer Vortex-Vorrichtung schütteln.
5 Minuten in einer Mikrofuge zentrifugieren,
Wässrige Phasen vereinigen (185 μl insgesamt)

EtOH-Präzipitat

20 μl 3 M NaAc

500 μl EtOH

Auf Trockeneis abkühlen
5 Minuten in einer Mikrofuge zentrifugieren.
Überstand absaugen, lufttrocknen.
In 100 μl DNA-Puffer resuspendieren.

Jede Reaktion zur weiteren Behandlung aufteilen (alle Volumina sind in μl angegeben):

Behandlung:	Reparatur	Verdau
	Verdau
	A	B

1) Reparatur/Ligation

DNA	40	40
10 × Fi/L	5	-
dH₂O	2	-
Pol I (10.000 μ/ml)	2	-

a) Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur
Ligase (400.000 u/ml)	1	-
b) Inkubieren für 4 h bei 16°C

2) Verdau

1 M NaCl	6,0	-
10 × Puffer 3		6,0
BstEII (10.000 u/ml)	1	1

Inkubieren für 1 h bei 60°C

3) Entfernen der Proteine, Austausch des Puffers I

Phenol, äquillibriert	50	50

a) Vermischen, 5 min in einer Mikrofuge zentrifugieren
b) Organische Phase mit DNA-Puffer rückextrahieren
c) Wässrige Phasen vereinigen

Gesamtvolumen, Schritt 3c)	100	100
3 M NaAc	10	10
tRNA 1 mg/ml	1	1
EtOH	120	120

a) Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur
b) Zentrifugieren, Überstand verwerfen
c) Zweimal mit kaltem, 70%-igen EtOH (100 μl)
waschen

DNA-Puffer	50	50

d) Resuspendieren

Gesamtvolumen, Schritt 3d	50	50

4) Austausch des Puffers 2

Erneute Fällung
DNA aus Schritt 3d	35	35
3 M NaAc	5	5
EtOH	137,5	137,5

a) Inkubieren bei –70°C über Nacht
b) Zentrifugieren, Überstand verwerfen
c) Zweimal mit 200 μl 70%-igem EtOH waschen

TE	50	50

d) Resuspendieren

Abschnitt G: Rückgewinnung der Insertionen

Gemäß der Vorgehensweise in Beispiel, Abschnitt D3 10 μl der Proben in MC1061 elektroporieren. Tabelle 2 Proben-Codes, Behandlungen und Target-Konzentrationen, die um die Verluste während der Manipulation korrigiert wurden

	Name des Targets	Behandlung	Selektion des Targets	[Target-DNA] (fmol/μl)
1A	pER183	Fi/L, Verd.	Cam	0,015
1B	pER183	verdaut	Cam	0,05
12	pER183	Fi/L, Verd	Cam	0,98
2B	pER183	verdaut	Cam	0,42
3A	pRM2	Fi/L, Verd	Amp	0,66
3B	pRM2	verdaut	Amp	0,56

Tabelle 3: Koloniebildende Einheiten pro ml auf geeigneten, selektiven Platten

Probe	1A	1B	2A	2B	3A	3B
Donor (oder Rekombination)
nur Kan	130	1,8 × 10⁵	5 × 10³	7 × 10³	3,7 × 10⁴	4 × 10⁴
Empfänger
nur Cam	1 × 10⁴	8 × 10⁵	4 × 10⁴	6 × 10⁶
nur Amp					3 × 10	4 × 10⁷
Kolonien/fmol	6 × 10⁴	1,6 × 10⁶	4 × 10³	1,4 × 10⁶	4,5 × 10⁶	7 × 10⁶
Rekombinante
Kan Cam	16	2,7 × 10³	880	1 × 104
Kan Cam					1,1 × 10⁵	4 × 10⁴
Rekomb/Empf	1 × 10^–3	3 × 10^–3	2 × 10²	1 × 10^–3	4 × 10^–3	1 × 10^–3

Es wurden 75 rekombinante Kolonien, 31 aus den Proben 2A und 44 aus den Proben 2B, zur weiteren Charakterisierung ausgewählt.
H. Bestimmung der Position auf der Sequenz.
1. Zusammenfassung der Vorgehensweise
75 rekombinante Kolonien wurden in 0,5 ml RB, das auf einem Gestell zur Lagerung angeordnet war, gepickt. Subkulturen dieser Kulturen für die Lagerung wurden mit Selektion (RM Cam Kan) angezüchtet und entsprechend den Anweisungen des Herstellers Minipreps für große Plasmide mit geringer Kopienzahl durchgeführt.
Die DNA-Konzentration der Plasmid-Preps (Plasmid-Zubereitungen) wurde durch Vergleich mit einer Verdünnungsreihe von linearisiertem pLITMUS28 auf Agarosegelen bestimmt. Die Plasmid-Preps wurden zu diesem Zweck mit einem Enzym linearisiert, dass einmal in dem Target-Plasmid und nicht in dem Transposon schneidet (SacII).
Die Primer NLC94 und NLC95 (SEQ ID NOS: 13 bzw. 7) wurden zur Bestimmung der Sequenz verwendet, wobei fluoreszenz-markierte Didesoxynukleotid-Sequenzierungsreagenzien von Applied Biosystems verwendet wurden.
Die Sequenzen wurden auf einer ABI-Sequenzierungsvorrichtung laufen gelassen und die Erfassung, die Bearbeitung und die Assemblierung der Sequenz wurden mit den gelieferten Programmen (SEQED, FACTURA und AUTOASSEMBLE) durchgeführt.
Das Ergebnis ist in 12 gezeigt.
2. Ergebnisse

a. Tabelle 4: Zusammengefasstes Ergebnis der 75 Rekombinanten (CamR KanR-Kolonien), potentielle Tn7-Insertionen in pER183.

Gesamtzahl an DNA-Preps		75
DNA-Konzentration zu gering für Sequenzierungsversuche	7
Transformanten, die zwei Plasmide enthielten, nicht sequenziert	1
Insgesamt nicht sequenziert	8

Sequenzierungsversuche mit den DNA-Preps		67
Sequenz unlesbar (verschiedene Ursachen)	2
Sequenz unlesbar, da 2 Insertionen in einem Plasmid	1
Gesamtzahl an unlesbaren Sequenzen	3

Sequenz aus den DNA-Preps erhalten		64
Sequenz verworfen (Kreuzkontamination
mit benachbarten Vertiefungen)	1
Gesamtmenge an verworfenen Insertionen	1
Voneinander unabhängige Insertionen, für die eine Position erhalten wurde		63
Anzahl an Insertionspositionen		62
Anzahl der Insertionen im Uhrzeigersinn	33
Anzahl der Insertionen gegen den Uhrzeigersinn	30
Anomale Insertionen
Anzahl an inserierten Plasmiden mit strukturellen Anomalitäten	1

Dies war eine weit von der Insertion entfernte Deletion

Anzahl an strukturellen Aberrationen, die mit dem Insertionsort assoziiert sind 0

Anzahl an Insertionen mit einer Unstimmigkeit in der 5 bp großen Duplikation 2
Dies waren:
G--> A-Übergangsmutation in einer Kopie, bezogen auf die Sequenz des Target-Plasmids
G--> T-Transversionsmutation in einer Kopie, bezogen auf die Sequenz des Target-Plasmids
b. Analyse der Verteilung der Insertionen zwischen den Sequenzen und Intervalle.
Um die maximale Sequenz von einem unbekannten Target zu erhalten ist es wünschenswert, dass die Insertionen, hinsichtlich der Bereiche der Sequenz und bezüglich der spezifischen Sequenzen so zufällig wie möglich verteilt werden. Die Zusammenfassung in Tabelle lässt bereits einen sehr zufälligen Prozess vermuten, da 63 voneinander unabhängige Insertionen 62 verschiedene Positionen betreffen; d. h. es wurden keine Insertions-Notspots identifiziert. Im Vergleich dazu belegte die zwanglosere Spezifität eines Derivats von Tns10 (ATS2, untersucht mit in vivo-Insertionen in das lac-Operon) 23 Orte mit 50 Insertionen.

Die wichtigsten Daten für weitere Analysen sind unten in Tabelle 5 zu finden, in der die Position aller Insertionen, ihre Ausrichtung in Bezug auf das Target-Plasmid und die Sequenz unmittelbar neben der Insertion (die fünf bp große Sequenz, die durch den Insertionsmechanismus dupliziert wurde) in einem einheitlichen Bezugsrahmen angegeben sind.

	Richtungen			Sequenz an der Position relativ zu Tn7R					Ausrichtung
Isolat	erhaltene Sequenz	Position	Name des Inserts	1	2	3	4	5	Tn7R im Uhrzeigersinn = +)
1	1	6464	A5	A	G	C	T	C	–
2	2	8428	A6	C	T	G	G	T	–
3	1	8349	A7	C	C	T	G	A	+
4	2	5515	A8	T	A	A	C	T	+
5	2	7822	A9	C	C	C	G	C	+
6	2	365	A10	T	C	A	A	C	+
7	2	5695	A11	T	C	A	C	G	–
9	2	2500	B1	G	G	A	T	G	+
10	1	8286	B2	C	T	T	C	C	+
11	1	2764	B3	C	T	T	T	A	+
12	2	6953	B4	C	G	A	G	G	+
13	2	3414	B5	C	T	T	T	G	+
14	1	3139	B6	T	C	G	T	T	–
15	1	3208	B7	G	C	A	C	T	–
16	2	4208	B8	A	G	A	G	C	–
17	2	3671	B9	G	T	T	T	A	+
18	2	5563	B10	C	C	A	A	C	–
19	1	3539	B11	G	C	T	T	C	+
20	2	3803	B12	A	T	T	C	C	–
21	2	8474	C1	C	C	G	C	C	+
22	2	5661	C2	A	T	G	A	T	+
23	2	7693	C3	C	G	C	G	T	–
24	2	3205	C4	T	C	T	T	C	–
25	2	1650	C5	C	C	T	A	T	–
26	2	8020	C6	G	C	C	G	G	–
27	2	2566	C7	A	T	T	T	T	+
29	2	2275	C9	G	C	C	C	A	+
30	1	6368	C10	G	C	T	A	T	–
32	2	2629	C12	T	A	T	A	C	+
33	2	5988	D1	G	G	C	G	A	+
34	2	3499	D2	A	T	G	T	A	–
35	2	3933	D3	T	T	G	A	T	–
36	2	6077	D4	G	T	T	G	T	+
37	2	6756	D5	T	T	G	A	G	–
38	2	5563	D6	G	T	T	G	G	+
38	2	8224	D7	G	G	A	G	G	–
40	2	3123	D8	C	A	A	A	T	–
41	1	2746	D9	A	A	A	A	C	–
42	1	1646	D10	C	G	A	G	A	+
43	1	5678	D11	A	T	G	T	G	+
44	2	7406	D12	T	G	C	A	T	+
45	2	1744	E1	G	C	C	A	T	–
46	2	3584	E2	T	A	G	G	T	+
47	2	2112	E3	C	C	T	A	C	+
48	2	4205	E4	G	C	A	G	C	–
49	1	2708	E5	G	C	G	G	T	+
50	2	7828	E6	A	C	A	G	A	+
52	2	3873	E8	A	G	T	C	T	–
53	2	3591	E9	C	A	T	G	C	–
56	2	5550	E12	A	T	C	G	C	–
57	2	2702	F1	T	T	C	A	C	+
61	2	4490	F5	G	T	T	A	A	–
62	2	5811	F6	A	C	G	C	G	+
63	2	2024	F7	A	C	T	G	T	–
64	2	1479	F8	A	T	C	G	T	–
66	2	5675	F10	T	T	T	A	T	+
67	2	5208	F11	A	T	A	A	A	+
68	2	6020	F12	G	G	T	A	A	+
69	2	6264	G1	G	A	G	T	A	+
70	2	3881	G2	A	T	T	T	G	–
72	2	2891	G4	A	T	T	C	G	–
74	2	1681	G6	A	C	T	C	T	–
76	2	5315	G7	A	A	T	A	C	+

Tabelle 5 – Legende:

Isolat: Nummer der Kolonie
Sequenzierte Richtungen: 1 = nur eine Richtung von der Insertion aus; 2 = beide Richtungen
Position: Koordinate der ersten Base der 5 bp großen Duplikation auf dem oberen Strang von pER183 (SEQ ID NO: 5)
Name des Inserts: Zugangsnummer im Laborbuch
Sequenz an der Position Nr.: Position 1 ist die Base unmittelbar neben dem oberen Strang von Tn7R
(d. h. es kann entweder der obere oder der untere Strang von pER183 (SEQ ID NO: 5) sein);
Position Nr. 2 ist die übernächste Position zu Tn7R; und so weiter.
Ausrichtung: des Inserts relativ zu dem oberen Strang von pER183 (SEQ ID NO: 5).
+, Tn7R ist vom oberen Strang von pER183 (SEQ ID NO: 5) aus gesehen rechts von Tn7L. –, Tn7R ist links von Tn7L.

i. Die Verteilung der Insertionen gehorcht der Poisson-Verteilung
a. Diese Insertionen sind zufällig verteilt, wie aus dem Anpassen der Verteilung der Intervalle mit der Verteilung, die durch einen Poisson-Prozess vorhergesagt wird, beurteilt wurde.
Die Poisson-Verteilung gibt die Wahrscheinlichkeit für das Beobachten von genau X_i Ereignissen (Insertionen) in einer Einheit (Intervall), wenn die mittlere Anzahl an Ereignissen pro Einheit μ ist (von Zar, J. H., Biostatistical Analysis, Prentice-Hall, Englewood Cliffs, NJ 1974, S. 301).
wobei:

X_i: = exakt X_i Insertionen pro Intervall
μ: = mittlere Anzahl an Insertionen pro Intervall Sei
X_i: = Anzahl an Insertionen in einem Intervall von 100 bp
f_i: = Beobachtete Anzahl an 100 bp großen Intervallen mit X_i Insertionen/Intervall
n: = Anzahl an 100 bp großen Intervallen in der Gruppe (= 73)
μ: = Σf_iX_i/Σf_i = 63/73
P_(xi): = Wahrscheinlichkeit, X_i Insertionen in einem 100 bp großen Intervall zu finden (nach der Poisson-Verteilung, Gl. 1)
F_i: = P_(xi)n = erwartete Anzahl an Intervallen mit i Insertionen.

Aus den Daten in Tabelle 5 und Gl. 1 können wir den folgenden Vergleich zwischen den erwarteten und den beobachteten Daten konstruieren: Tabelle 6. Beobachtete und erwartete Verteilung der Insertionen in 100 bp großen Intervallen

Insertionen pro Intervall	Beobachtete Intervallen mit X_i Insertionen	Wahrscheinlichkeit von X_i Insertionen pro Intervall	Erwartete Anzahl an Intervallen mit X_i Insertionen
X_i	f_i	P(X_i)	F_i
0	34	0,42189	30,80
1	24	0,36410	26,58
²	9	0,15711	11,47
3	3	0,04520	3,299
4	3	0,00975	0,712

Diese Verteilungen sind in 13 veranschaulicht, wobei fi = beobachtete Verteilung, Fi = erwartete Verteilung. Die Anpassung sieht vernünftig aus.
b. Statistische Überprüfung der Anpassung zwischen beobachteten und erwarteten Verteilungen
Um zu überprüfen, ob die beobachtete und die erwartete Verteilung statistisch gesehen ununterscheidbar sind, verwendeten wir einen Chi-Quadrat-Test für die Güte der Anpassung (von Zar, J. H., Biostatistical Analysis, Prentice-Hall, Englewood Cliffs, NJ, 1974, S. 303). Zu diesem Zweck sammeln wird den nachgezogenen Abschnitt der Verteilung in einem Pool so dass keine der erwarteten Anzahl kleiner als 4 ist. Durch Umschreiben der Tabelle 6 erhalten wir
Tabelle 7. Chi-Quadrat-Test der Güte der Anpassung an eine Zufallsverteilung
Die Nullhypothese ist, dass die beobachtete Verteilung aus einer Poisson-verteilten Population gezogen wurde. Bei zwei Freiheitsgraden ergibt die Summe der Chi-Quadrat-Werte eine Wahrscheinlichkeit, dass dies der Fall bei 0,25 < p < 0,5 ist. Die Nullhypothese wird nicht zurückgewiesen.
Insgesamt stimmen die optische (Teil a, 13) und ein statistischer Test (Tabelle 7 und folgende) darin überein, dass die Verteilung der Insertionen in Intervallen entlang der DNA zufällig ist
ii. Analyse der Zusammensetzung der Basen an den Insertionsorten
Präferenz eines Orts von TnsABC₁₂₇ für die Insertion von miniTn7 in pER183
Bestimmte Basen werden an manchen Positionen in der fünf Basen langen Duplikation des Insertionsorts bevorzugt, wie in einem Histogramm der Häufigkeit der Basen gegenüber der Position in dem Ort (14) anhand der aus Tabelle 5 entnommenen Daten gezeigt ist. Beim Zuordnen der Daten für dieses Histogramm wurden den 5 duplizierten Basen Positionsnummern relativ zu Tn7R zugeteilt; Position eins ist die Base unmittelbar neben Tn7R, wenn die die Sequenz mit Tn7R rechts und Tn7L links angezeigt wird. Die Ausrichtung des Transposons relativ zu der Target-Sequenz während der Auswahl des Targets wird somit kontrolliert: das Target wird für alle Insertionsorte in der gleichen Weise relativ zu dem Transposon angezeigt.
Es wurde ein Modell für einen bevorzugten Ort formuliert: NYTRN. Die Elemente dieses Orts wurden einzeln und insgesamt über eine Chi-Quadrat-Analyse auf ihre statistische Signifikanz geprüft (Tabelle 8). Die Nullhypothese war, dass die Orte per Zufallsprinzip aus der Grundgesamtheit der Sequenz, die durch die Sequenz von pER183 (SEQ ID NO: 5) definiert ist, genommen wurde, nachdem die Sequenz, die Gegenstand der Selektion ist (bp 1–250 und 2481–2509, CamR; und 581–1400, Replikationsursprung) deletiert worden war. Die erwarteten Häufigkeiten der vier Basen, der Purine und Pyrimidine, und der Trinukleotide wurden aus den für pER183 (SEQ ID NO: 5), der mit Hilfe des GCG-Programms COMPOSITION kondensiert worden war, abgeleitet.
Tabelle 8. Chi-Quadrat-Tests (Tests, die sich in der Zufallserwartung (p < 0,05) unterscheiden sind fett markiert)

Vier Basen einzeln, alle Orte zusammen (315 bp aus den Versuchen, 7410 bp Kontrolle)

Base	Erwartet	Beobachtet	Chi-Quadrat	Wahrscheinlichkeit
A	78,4	73	0,372
C	74,3	77	0,981
G	76,2	72	0,232
T	85,7	93	0,622
			2,21	0,5 < p < 0,75

Vier Basen einzeln, jede Position einzeln (63 bp aus den Versuchen, 7810 bp Kontrolle)

Position 1
A	15,7	19	0,694
C	14,9	15	0,00066
G	15,2	17	0,213
T	17,1	12	1,52
			2,43	0,25 < p < 0,5

Position 2
A	15,7	8	3,8
C	14,9	22	3,38
G	15,2	11	1,16
T	17,1	22	1,4
			9,74	0,01 < p < 0,025

Position 3
A	15,7	15	0,031
C	14,9	11	1,02
G	15,2	12	0,674
T	17,1	25	3,65
			5,37	0,1 < p < 0,25

Position 4
A	15,7	19	0,693
C	14,9	11	1,02
G	15,2	20	1,52
T	17,1	13	0,983
			4,21	0,1 < p < 0,25

Position 5
A	15,7	12	0,872
C	14,9	18	0,645
G	15,2	12	0,674
T	17,1	21	0,889
			3,08	0,25 < p < 0,5

Purine und Pyrimidine, jede Position einzeln (63 bp aus den Versuchen, 7410 bp Kontrolle)

Base	Erwartet	Beobachtet	Chi-Quadrat	Wahrscheinlichkeit
Position 1
R	30,9	36	0,842
Y	32,1	27	0,810
			1,65	0,1 < p < 0,25

Position 2
R	30,9	19	4,58
Y	32,1	44	4,41
			8,99	0,001 < p < 0,005

Position 3
R	30,9	27	0,49
Y	32,1	36	0,422
			0,914	0,25 < p < 0,5

Position 4
R	30,9	39	2,12
Y	32,1	24	2,04
			4,17	0,025 < p < 0,05

Position 5
R	30,9	24	1,54
Y	32,1	39	1,48
			3,10	0,05 < p < 0,1


T oder Nicht-T,
Position 3
R	17,16	25	3,58
Y	45,84	38	1,34
			4,92	0,025 < p < 0,05

Tripletts, Positionen 234 (63 aus den Versuchen erhaltene Tripletts, 7408 Kontroll-Tripletts zur Bestimmung der Erwartung)

Alle Tripletts	Erwartet	Beobachtet	Chi-Quadrat	Wahrscheinlichkeit
Triplett
YNR	15,96	25	7,54
RNY	15,97	5	5,12
RNR	14,98	14	0,064
YNY	16,07	19	0,534
			13,25	0,001 < p < 0,005

Spezifische Tripletts, Positionen 234

YNR	16	25	5,06
Nicht-YNR	47	38	1,7
			6,78	0,005 < p < 0,01

RNY	16	5	7,56
Nicht-RNY	47	59	3,06
			10,62	0,001 < p < 0,005

YTR	3,93	10	9,38
Nicht-YTR	59,07	53	0,623
			10,0	0,001 < p < 0,005

Paarbildung zwischen den Positionen 2 und 4 (GNC, CNG, ANT, TNA)

Gepaart		16,95		16		0,053
Ungepaart	46,05		47		0,0196
					0,073		0,75 < p < 0,9

Die Präferenz für diesen Ort war statistisch signifikant (p < 0,005) und die Präferenz für jeden Teil derselben war ebenfalls signifikant (p < 0,05). Die Präferenz ist jedoch nicht besonders stark, da eine Repräsentanz des Orts in den Insertionsorten nur 2,5-mal häufiger war, als aus der Zusammensetzung des Plasmids erwartet wurde; und 53 der 63 Orte entsprechen nicht der Consensus-Sequenz. Jede bevorzugte Position trägt unabhängig zu der Gesamtpräferenz bei, da ein Aufmultiplizieren der Überrepräsentanz jeder Position zu der Überrepräsentanz des Ortes insgesamt führt (Tabelle 9). Tabelle 9: Überrepräsentanz bevorzugter Basen in Tn7-Insertionsorten

Position	Präferenz	Erwartet	Beobachtet	-fache Überrepräsentanz
				(Beob./Erw.)
2	Y	32,1	44	1,37
3	T	17,6	25	1,42
4	R	30,9	39	1,26
Produkt ((B/E)2 × (B/E)3 × (B/E)4)	2,46
Triplett	YTR	3,93	10	2,54

Wir schlossen daraus, dass die durch TnsABC₁₂₇ vermittelte Insertion extrem zufällig ist und eine nur leichte Präferenz für die Orte der Form NYTRN (SEQ ID NO: 15) aufweist. I. Rezepte.

1. 100 × DNA-Puffer pro Liter
Tris-Base	121,1 g

In 700 ml lösen

4 M HCl	~90 ml
Auf pH 7,4 einstellen

Na₂EDTA	37,2
NaCl	29,22 g

~950 ml herstellen
pH einstellen
Auf 1 l auffüllen
Aliquotieren, autoklavieren

2. 1 × DNA-Puffer
100 × DNA-Puffer	1 ml
dH₂O, steril	100 ml

3. 10 × Fi/L-(Einsetzen [Fill-in] Ligation) Puffer
10 × Ligase-Puffer	1500 μl
New England BioLabs, 32 Tozer Road, Beverly, Massachusetts, 01915
100 mM dATP	3,75 μl
New England BioLabs, 32 Tozer Road, Beverly, Massachusetts, 01915
100 mM dCTP	3,75 μl
New England BioLabs, 32 Tozer Road, Beverly, Massachusetts, 01915
100 mM dGTP	3,75 μl
New England BioLabs, 32 Tozer Road, Beverly, Massachusetts, 01915
100 mM dTTP	3,75 μl
New England BioLabs, 32 Tozer Road, Beverly, Massachusetts, 01915

4. TE
1 M Tris pH 8,0	1 ml
0,5 M EDTA pH 8,0	0,2 ml
dH₂O auf	100 ml
Sterilfiltrieren

Beispiel 5
Praktisches Verfahren zum Stoppen einer Transposoninsertionsreaktion
Um DNA-Moleküle mit Transposoninsertionen zu verwenden müssen sie in vivo rückgewonnen werden. Es ist am praktischsten, wenn dies ohne großen Arbeitsaufwand und Verluste, die mit einer Extraktion mit organischen Lösungsmitteln und einer Alkoholfällung verbunden sind, erfolgen kann. Im Stand der Technik wurde jedoch vorgeschlagen, dass die Reaktionsprodukte einer Transposition, die während den Insertionsversuchen in vitro gebildet wurden, DNA:Protein-Komplexe sind, die extrem stabil sind; Anzeichen lassen vermuten, dass eine Chaperon-gleiche Aktivität für das Aufbrechen dieser Produkte erforderlich ist. Dementsprechend gilt eine organische Extraktion als für eine ausreichende Zerstörung der Komplexe erforderlich.
Dieses Beispiel zeigt, dass eine Hitzeinaktivierung bei 75°C für das Aufbrechen dieser Komplexe oder zumindest dafür, sie in eine zu bringen die ohne chemische Transformation in die Zelle eingeschleust werden kann, ausreicht.
Abschnitt A. MATERIALIEN
A1) PROTEINE

Bei –70°C lagern. Es wird eine ausreichende Menge an Protein für 10 Reaktionen bereitgestellt. Zum Zeitpunkt der Verwendung solange auf Trockeneis gefroren halten bis alles bereit ist, um es zu der Reaktion zu geben und solange auf Trockeneis halten, bis es zurück in den Gefrierschrank gestellt wird. A2) PUFFERBESTANDTEILE

HEPES 0,25 M pH 8,1

Tris [Cl] 0,25 M pH 7,6

BSA 10 mg/ml

tRNA 50 μg/ml

DTT 1 M

ATP 100 mM

Mg-Acetat 375 mM

A3) DONOR-PLASMID FÜR DAS TRANSPOSON

100 μg/ml
Dies ist so, wie es für Beispiel 3 beschrieben ist. A4) TARGET-PLASMID

pLITMUS 400 μg/ml
A5) WEITER

Millicue-Wasser
Heizblock, 30°C
1,5 ml-Mikroröhrchen

A6) ZUM STOPPEN DER REAKTION

wenn chemisch kompetente Zellen verwendet werden
Wasserbad oder Heizblock, 75°C
Wasserbad oder Heizblock, 65°C
Destilliertes Phenol mit TE äquillibriert
Chloroform, mit TE äquillibriert
EtOH für die Fällung
NaCl 3 M
Wasser oder 1 mM Tris pH 8

CHEMISCH KOMPETENTE, TRANSFORMIERBARE ZELLEN:
In diesem Beispiel zeigen wir die Verwendung von
chemisch kompetentem ER1821 (2 × 10⁷ Transformanten/μg LITMUS
chemisch kompetentem ER2502 (6 × 10⁶ Transformanten/μg LITMUS
zubereitet wie in Beispiel 3
A8) MEDIEN
An Fett angereicherte Brühe und an Fett angereicherter Agar (Kan, Amp), zubereitet wie in Beispiel 3.
Abschnitt B. Protokoll der Transpositionsreaktion in vitro
1. Versuch 1. Vierstufige Behandlung
Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 3 durchgeführt, wobei bei jeder der vier Behandlungen Proben in vierfacher Ausfertigung verwendet werden. In Schritt 12 wurde eine der beiden Behandlungen ausgetauscht. Für die Transformation wurde ER2502 verwendet.
Behandlung 1: Keine Behandlung
Behandlung 2: Hitzebehandlung bei 65°C für 20 min.
Behandlung 3: Hitzebehandlung bei 75°C für 10 min.
Behandlung 4: Einmal Phenolextraktion, einmal Chloroformextraktion, einmal Ethanolfällung, Resuspension im ursprünglichen Volumen von TE.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle 10 unten angegeben und in 15 veranschaulicht. Tabelle 10: Pro 1/50 des Volumens der Transpositionsreaktion erhaltene Transformanten.

Ausfertigung Nr.

1 2 3 4

nichts 1 0 0 0

65°C, 20 min 1 0 0 0

75°C, 20 min 32 24 22 10

Phenol + Fällung 30 23 20 17
2. Versuch 2: Dreistufige Behandlung
Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 3 durchgeführt, wobei bei jeder der drei Stopp-Behandlungen, für die beiden Aliquots von TnsB, und für drei Volumina von TnsB Proben in zweifacher Ausfertigung verwendet werden. In Schritt 12 wurde eine der beiden Behandlungen ausgetauscht. Für die Transformation wurde ER1821 verwendet.
Behandlung 1: Hitzebehandlung bei 75°C für 10 min
Behandlung 2: Nur Ethanolfällung, Resuspension im ursprünglichen Volumen von TE
Behandlung 3: Hitzebehandlung bei 65°C für 20 min.

Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle 9 unten angegeben und in 16 veranschaulicht. Tabelle 9: Pro 1/50 des Volumens der Transpositionsreaktion erhaltene Transformanten, drei Stopp-Behandlungen.

TnsB		75°C, 10 min		EtOH-Fällung		65°C, 20 min
Aliquot	Volumen (μl)	Nr. 1	Nr. 2	Nr. 1	Nr. 2	Nr. 1	Nr. 2
1	1	158	8	13	3	15	10
1	1,5	186	0	16	0	3	0
1	2	178	170	13	13	30	16
1	3	454	366	47	21	11	8
2	1	324	140	21	3	9	2
2	1,5	506	462	58	44	25	25
2	2	1220	1102	88	37	54	18
2	3	1802	1690	129	126	37	14

Diese beiden Versuche zeigen, dass die Hitzebehandlung bei 75°C für 10 min ein geeignetes Verfahren zum Stoppen der Transpositionsreaktion ist und genauso viele Transformanten wie die Behandlung mit Phenol, Chloroform und Ethanolfällung ergibt; wohingegen keine Behandlung, Ethanolfällung allein und Hitzebehandlung bei 65°C für 20 min nicht geeignet sind, da sie keine Transformanten ergeben oder die Anzahl an Transformanten erheblich verringerten.
Beispiel 6
Lagern von drei Bestandteilen von Tn7-Transposase zusammen
Eine praktische, routinemäßige Verwendung einer in vitro-Transposition als Verfahren in der Mikrobiologie wäre leichter, wenn die Proteinbestandteile der Reaktion in einem einzigen Reaktionsröhrchen gelagert werden könnten. Auf diese Weise würden Schwankungen bei der Messung der Volumina in verschiedenen Versuchen minimiert werden, Zeit und Arbeitsaufwand würden eingespart werden und die Reproduzierbarkeit verbessert werden. Die TnsABC₁₂₇-Transpositionsreaktion, die in den vorhergehenden Beispielen beschrieben wurde, beinhaltet die Zugabe von drei verschiedenen Proteinbestandteilen.
Dieses Beispiel zeigt, dass diese drei Proteinbestandteile der Reaktion miteinander gemischt und zusammen gelagert werden können, ohne die Effizienz der Transpositionsreaktion zu beeinträchtigen.
Abschnitt a. MATERIALIEN
A1) EINZELNE PROTEINE

TnsA 30 μg/ml in 10% Glycerin
TnsB 20 μg/ml in 50% Glycerin
TnsC₁₂₇ 100 μg/ml in 50% Glycerin
Bei –70°C lagern.

A2) GEMISCHTE PROTEINE, UMFASSEND

TnsA 7,36 μg/ml
TnsB 11,3 μg/ml
TnsC ₁₂₇ 18,9 μg/ml
in 40% Glycerin

A2a) Bei –70°C lagern oder
A2b) bei –20°C lagern
A3) ANDERE BESTANDTEILE
Dies sind die gleichen wie in Beispiel 1, Teil A und B; einschließlich chemisch kompetentem ER2502 (6 × 10⁶ Transformanten/μg LITMUS), der wie in Beispiel 1 zubereitet wurde.
Abschnitt B. PROTOKOLL DER Tn7-TRANSPOSITIONSREAKTION in vitro

B1. Reaktionsvolumen = 100 μl B2. Versuchvariationen (Es sind 2 Versuche gezeigt, die Reaktionen wurden in vierfacher Ausfertigung durchgeführt).

Reaktionsröhrchen 1	Proteine von A1 werden in Schritt 6 unten in einem Gesamtvolumen von 5,3 μl einzeln zugegeben.
Reaktionsröhrchen 2	Mischung aus A2a werden zusammen in Schritt 6 unten in einem Gesamtvolumen von 5,3 μl zugegeben.
Reaktionsröhrchen 3	Mischung aus A2b werden zusammen in Schritt 6 unten in einem Gesamtvolumen von 5,3 μl zugegeben.

(nur Versuch 2) B.3 Herstellen einer Mischung wie in Beispiel 1, Abschnitt C B4. Verteilen der Mischung aus Schritt 3 wie in Beispiel 1, Abschnitt C B5. Zugeben der Target-DNA wie in Beispiel 1, Abschnitt C. In diesem Beispiel ist die pLITMUS28, 1 μl B6. Zu jedem Reaktionsröhrchen zugeben:

	Reaktionsröhrchen 1	Reaktionsröhrchen 2	Reaktionsröhrchen 3
TnsA	1,3 μl (40 ng)
TnsB	3 μl (20 ng)
TnsC₁₂₇	1 μl (100 ng)
TnsABC₁₂₇	0	5,3 μl (39 ng A, 59,9 ng B, 100,2 ng C₁₂₇)	5,3 μl (39 ng A, 59,9 ng B, 100,2 ng C₁₂₇)

B7. 1 μl Donor-DNA (0,1 μg pMCB40) zugeben, wie in Beispiel 1C
B8. 10 Minuten lang bei 30°C (Assemblierungsreaktion), wie in Beispiel 1C
B9. 4 μl MgAc (375 mM) zu jedem Reaktionsröhrchen zugeben, wie in Beispiel 1C
B10. 1 Stunde lang bei 30°C inkubieren (Transpositionsreaktion), wie in Beispiel 1C
B11. 10 Minuten lang bei 75°C hitzeinaktivieren.
B12. Mit Hilfe chemisch kompetenter Zellen transformieren, wie in Beispiel 1.
In diesem Beispiel war das selektive Medium RB Kan (20 μg/ml) Amp (100 μg/ml).
Die kompetenten Zellen waren ER2502, chemisch kompetent (Beispiel 1, Abschnitt D1).
C1 Ergebnis der Transformation
Versuch 1. Die Proteine wurden einzeln bei –70°C oder als Mischung bei –70°C (A2a) gelagert. Bei diesem Versuch durchlitt das Protein bei beiden Behandlungen die gleiche Anzahl an Gefrier-Auftau-Zyklen. 10 μl jeder Reaktion wurden transformiert und 100 μl der 500 μl-Überwuchs-Kulturen wurden ausplattiert. Tabelle 10: Transformanten, die pro 1/50 des Volumens der Transpositionsreaktion erhalten wurden, wobei die Transpositionsproteine als Mischung oder einzeln zugegeben wurden. Das Ergebnis ist in Figur 9 dargestellt.

Ausfertigung Nr.

Lagerung 1 2 3 4 Mittelwert Mittelwert pro Reaktion

Einzeln 27 62 59 41 47 2350

als Mischung 47 68 60 23 49 2450

Versuch 2: Die Proteine wurden einzeln bei –70°C, als Mischung bei –70°C (Material aus A2a) oder als Mischung bei –20 C (Material aus A2b) gelagert. Bei diesem Versuch durchlitten die einzeln gelagerten Proteine mehr Gefrier-Auftau-Zyklen als die zusammen gelagerten. 10 μl jeder Reaktion wurden transformiert und 100 μl der 500 μl-Überwuchs-Kulturen wurden ausplattiert. Tabelle 11: Transformanten, die pro 1/50 des Volumens der Transpositionsreaktion erhalten wurden, wobei die Transpositionsproteine als Mischung oder einzeln zugegeben wurden und dann bei –20°C oder bei –70°C gelagert wurden. Das Ergebnis ist in Figur 10 dargestellt.

	Ausfertigung Nr.
Lagerung	1	2	3	4	Mittelwert	Mittelwert pro Reaktion
Einzeln	13	38	17	22	22	1100
als Mischung, –70°C, (A2a)	167	173	117	218	168	8400
als Mischung, –20°C, (A2b)	179	125	219	199	180	9000

Diese beiden Versuche zeugen, dass die drei Tns-Proteine zusammen gelagert werden können. Der Differenz zwischen der Lagerung einzeln und der Lagerung zusammen in Versuch 2 kann der Anzahl an Gefrier-Auftau-Zyklen zugeschrieben werden.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes ATP-verwendendes Transpositionsregulationsprotein, wobei das Protein eine Mutation aufweist, die, verglichen mit dem Wildtyp, die Targetsite-Spezifität eines transponierbaren Elements verringert, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein TnsC (SEQ. ID. NO. 2) ist und dass die Mutation ausgewählt ist aus A225V, E273K, E233K, A282T, S401YΔ402 und S401F.
Protein nach Anspruch 1, wobei die Mutation ausgewählt ist aus A225V, E273K und E233K, und sie bevorzugt A225V ist.
Protein nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei es die TnsA + B-Transposase in Abwesenheit von TnsD oder TnsE aktiviert.