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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung von PsmeI Restriktionsendonuclease,
die von ATCC Nr. 98596 erhältlich
ist, sowie rekombinante DNA, die die PmeI Restriktionsendonuclease
kodiert, und die Herstellung von PmeI Restriktionsendonuclease von
der rekombinanten DNA.
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Restriktionsendonucleasen
des Typs II sind eine Klasse von Enzymen, die natürlich in
Bakterien vorkommen. Wenn sie von anderen Bakterienkomponenten weggereinigt
werden, können
Restriktionsendonucleasen im Labor zum Spalten von DNA-Molekülen in präzise Fragmente
zur molekularen Klonierung und Gencharakterisierung verwendet werden.
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Restriktionsendonucleasen
agieren, indem sie spezielle Sequenzen von Nucleotiden (die "Erkennungssequenz") entlang dem DNA-Molekül erkennen
und sich an sie binden. Nach dem Anbinden spalten sie das Molekül innerhalb
oder an einer Seite der Erkennungssequenz. Unterschiedliche Restriktionsendonucleasen
haben Affinität
zu unterschiedlichen Erkennungssequenzen. Mehr als einhundertundachtzig
Restriktionsendonucleasen mit einzigartigen Spezifitäten wurden
unter den vielen Hunderten von Bakterienspezies identifiziert, die
bisher untersucht worden sind.
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Bakterien
besitzen gewöhnlich
höchstens
eine geringe Anzahl von Restriktionsendonucleasen pro Spezies. Die
Endonucleasen werden typischerweise entsprechend den Bakterien benannt,
von denen sie abstammen. Die Spezies Deinococcus radiophilus synthetisiert
beispielsweise drei verschiedene Restriktionsendonucleasen mit dem
Namen DraI, DraII und DraIII. Diese Enzyme erkennen und spalten
jeweils die Sequenzen TTTAAA, PuGGNCCPy und CACNNNGTG. Escherichia coli
RY13 synthetisiert hingegen nur ein Enzym, nämlich EcoRI, das die Sequenz
GAATTC erkennt.
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Man
geht davon aus, dass Restriktionsendonucleasen in der Natur eine
schützende
Rolle zum Wohle der Bakterienzelle spielen. Sie machen Bakterien
widerstandsfähig
gegen Infektionen durch Fremd-DNA-Moleküle wie Viren und Plasmide,
die sie ansonsten zerstören
oder befallen würden.
Sie übertragen
Widerstandsfähigkeit,
indem sie eindringende Fremd-DNA-Moleküle immer dann spalten, wenn
die Erkennungssequenz auftritt. Durch die stattfindende Spaltung
werden viele der infizierenden Gene deaktiviert, und die DNA wird
für einen
weiteren Abbau durch unspezifische Endonucleasen empfänglich gemacht.
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Eine
zweite Komponente von bakteriellen Schutzsystemen sind die Modifikationsmethylasen.
Diese Enzyme sind komplementär
zu Restriktionsendonucleasen und liefern das Mittel, das Bakterien
dazu befähigt, ihre
eigene DNA zu schützen
und sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen
erkennen und binden sich an die gleiche Erkennungssequenz wie die
entsprechende Restriktionsendonuclease, anstatt aber die DNA zu
spalten, modifizieren sie chemisch das ein oder andere Nucleotid
innerhalb der Sequenz durch Hinzufügen einer Methylgruppe. Im
Anschluss an die Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht mehr
durch die Restriktionsendonuclease gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle
wird aufgrund der Aktivität
ihrer Modifikationsmethylase stets modifiziert. Sie ist daher gegenüber der
Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuclease völlig unempfindlich.
Lediglich unmodifizierte und daher identifizierbare Fremd-DNA reagiert
auf eine Erkennung und Spaltung durch Restriktionsendonuclease empfindlich.
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Seit
dem Beginn der Gentechnologie ist es nun möglich, Gene zu klonieren und
die Proteine und Enzyme, die sie kodieren, in größeren Mengen zu produzieren,
als es mit konventionellen Reinigungstechniken möglich ist. Der Schlüssel zur
Isolierung von Klonen von Restriktionsendonucleasegenen ist die
Entwicklung eines einfachen und zuverlässigen Verfahrens zur Identifizierung
solcher Klone innerhalb komplexer "Bibliotheken", d.h. Populationen von Klonen, die
durch "Shotgun"-Verfahren hergeleitet
werden, wenn sie in geringen Frequenzen von 10–3 bis
10–4 auftreten.
Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so dass die unerwünschte Mehrheit
von Klonen zerstört
wird, während
die erwünschten
seltenen Klone überleben.
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Immer öfter werden
Restriktionsmodifikationssysteme des Typs II kloniert. Die ersten
klonierten Systeme benutzten eine Bakteriophage-Infektion als Mittel
zum Identifizieren oder Selektieren von Restriktionsendonucleaseklonen
(EcoRII: Kosykh et al., Molec. Gen. Genet 178:717-719 (1980); HhaII:
Mann et al., Gene 3:97-112 (1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. 78:1503-1507 (1981)). Da die Anwesenheit von Restriktionsmodifikationssystemen
in Bakterien diese dazu befähigt,
Infektionen durch Bakteriophagen standzuhalten, können Zellen,
die klonierte Restriktionsmodifikationsgene beinhalten, prinzipiell
als Überlebende
von Bibliotheken selektiv isoliert werden, die dem Phage ausgesetzt
wurden. Man hat jedoch festgestellt, dass dieses Verfahren nur von
begrenztem Nutzen ist. Im Speziellen wurde gefunden, dass klonierte
Restriktionsmodifikationsgene nicht immer ausreichend Phagenwiderstand
zeigen, um selektives Überleben
zu gewähren.
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Ein
weiterer Klonierungsansatz schließt das Übertragen von anfänglich als
plasmidbürtig
gekennzeichneten Systemen in E. coli Klonierungsplasmide ein (EcoRV:
Bougueleret et al., Nucl. Acid. Res. 12:3659-3676 (1984); PaeR7:
Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:402-406 (1983);
Theriault und Roy, Gene 19:355-359 (1982); PvuII: Blumenthal et
al., J. Bacteriol. 164:501-509 (1985)).
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Ein
dritter Ansatz, der zum Klonieren einer steigenden Zahl von Systemen
angewendet wird, bezieht sich auf die Selektion nach einem aktiven
Methylasegen (U.S. Patent No. 5,200,333 und BsuRI: Kiss et al., Nucl.
Acid. Res. 13:6403-6421
(1985)). Da Restriktions- und Modifikationsgene oft eng miteinander
gekoppelt sind, können
beide Gene oft simultan kloniert werden. Diese Selektion bringt
jedoch nicht immer ein komplettes Restriktionssystem hervor, sondern
stattdessen nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10:219-225
(1980); Bcn I: Janulaitis et al, Gene 20:197-204 (1982); Bsu RI:
Kiss und Baldauf, Gene 21:111-119 (1983); und Msp I: Walder et al.,
J. Biol. Chem. 258:235-1241 (1983)).
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Ein
weiteres Verfahren zur Klonierung von Methylase- und Endonucleasegenen beruht auf einem
kolorimetrischen Assay hinsichtlich DNA-Schäden (U.S. Patent Nr. 5,498,535).
Beim Screenen nach einer Methylase wird die Plasmidbibliothek in
einen E. coli-Wirtsstamm wie AP1-200 transformiert. Durch die Expression
einer Methylase wird die SOS-Reaktion in einem E. coli-Stamm ausgelöst, der
McrA+, McrBC+ oder
Mrr+ ist. Der AP1-200 Stamm ist temperaturempfindlich
im Hinblick auf die Mcr und Mrr Systeme und beinhaltet ein lac-Z
Gen, das mit dem schadeninduzierbaren dinD Locus von E. coli fusioniert
ist. Der Nachweis rekombinanter Plasmide, die ein Methylase- oder Endonucleasegen
kodieren, basiert auf einer Induktion bei der restriktiven Temperatur
des lacZ Gens. Methylasegene kodierende Transformanten werden auf
X-Gal-haltigen LB-Agarplatten
als blaue Kolonien nachgewiesen. (Piekarowicz, et al., Nucleic Acids
Res. 19:1831-1835 (1991) und Piekarowicz, et al., J. Bacteriology
173:150-155 (1991)). Der E. coli Stamm ER1992 enthält ebenfalls
eine dinD1-LacZ Fusion, ihm fehlen jedoch die methylierungsabhängigen Restriktionssysteme
McrA, McrBC und Mrr. In diesem System (mit der Bezeichnung „Endo-Blue"-Verfahren) kann das Endonucleasegen in
Abwesenheit seiner zugehörigen
Methylase nachgewiesen werden, wenn die Endonuclease die Wirtszell-DNA
beschädigt
und die SOS-Reaktion
auslöst.
Die SOS-induzierten Zellen bilden tiefblaue Kolonien auf LB-Agarplatten,
die mit X-Gal angereichert sind. (Xu et al., Nucleic Acids Res.
22:2399-2403 (1994)).
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Gelegentlich
kann mit dem direkten Methylaseselektionsverfahren aufgrund verschiedener
Hindernisse kein Methylase-(und/oder Endonuclease)-Klon hervorgebracht
werden (siehe z.B. Lunnen, et al., Gene, 74(1):25-32 (1988)). Ein
Hindernis für
die Klonierung von Restriktions-Modifikationsgenen besteht möglicherweise
darin, dass versucht wird, das Endonucleasegen in einen Wirt einzubringen,
der noch nicht durch Modifikation geschützt wurde. Wenn das Methylasegen
und das Endonucleasegen zusammen als ein einzelner Klon eingeführt werden,
dann muss die Methylase die Wirts-DNA schützend modifizieren, bevor die
Endonuclease die Gelegenheit erhält,
sie zu spalten. Gelegentlich können
die Gene daher nur sequentiell kloniert werden, zuerst die Methylase
und dann die Endonuclease.
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Ein
weiteres Hindernis für
das Klonieren von Restriktions-Modifikationssystemen beruht in der
Entdeckung, dass einige Stämme
von E. coli auf eine Cytosin- oder Adenin-Modifikation ungünstig reagieren;
sie besitzen Systeme, die DNA zerstören, die methyliertes Cytosin
(Raleigh und Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:9070-9074 (1986))
oder methyliertes Adenin enthält
(Heitman und Model, J. Bact. 196:3243-3250 (1987); Raleigh, Trimarchi
und Revel, Genetics, 122:279-296 (1989) Waite-Rees, et al., J. Bacteriology, 173:5207-5219
(1991)). Cytosin-spezifische oder Adenin-spezifische Methylasegene
können
nicht ohne weiteres in diese Stämme
kloniert werden, weder alleine, noch zusammen mit ihren entsprechenden
Endonucleasegenen. Um dieses Problem zu umgehen, müssen Mutantenstämme von
E. coli (McrA– und
McrB– oder
Mrr–) verwendet
werden, in denen diese Systeme defekt sind.
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Ein
dritte Schwierigkeit besteht möglicherweise
darin, dass einige Restriktionsendonuclease- und -methylasegene
aufgrund von Differenzen im Transkriptionsmechanismus des Quellorganismus
und E. coli nicht in E. coli exprimieren können, wie z.B. Differenzen
in Promotor- und Ribosomenbindungsstellen. Die Methylaseselektionstechnik
setzt voraus, dass die Methylase in E. coli ausreichend exprimiert,
um wenigstens einige der das Gen tragenden Plasmide vollständig zu
schützen.
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Da
gereinigte Restriktionsendonucleasen und, in geringerem Maße, Modifikationsmethylasen
nützliche
Werkzeuge zum Charakterisieren von Genen im Labor sind, gibt es
einen kommerziellen Anreiz, Bakterienstämme durch DNA-Rekombinationstechniken
zu gewinnen, die diese Enzyme im Überfluss synthetisieren. Solche
Stämme
wären von
Nutzen, da sie die Aufgabe der Reinigung vereinfachen und außerdem das
Mittel zur Herstellung kommerziell nützlicher Mengen bereitstellen
würden.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die Gene für die PmeI
Restriktionsendonuclease (NEB Nr. 560) kodiert, ein Enzym, das die
DNA-Sequenz 5' GTTTAAAC
3' erkennt und in
der Mitte der Erkennungssequenz zwischen dem dritten T und ersten
A Rest spaltet, um Blunt-Enden zu erzeugen, sowie zugehörige Verfahren
zur Herstellung dieses Enzyms von der rekombinanten DNA. Die vorliegende
Erfindung betrifft außerdem
einen transformierten Wirt, der die Restriktionsendonuclease PmeI
exprimiert. PmeI Restriktionsendonuclease, die gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt wird, ist im Wesentlichen rein und frei von
den Kontaminanten, die normalerweise in Restriktionsendonucleasepräparaten
zu finden sind, die durch konventionelle Techniken hergestellt werden.
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BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
ein Photo eines Agarosegels, das die PmeI Restriktionsendonucleaseaktivität in Zellextrakten
von E. coli ER2426 demonstriert, wobei die PmeI Endonuclease auf
dem von pRRS stammenden Plasmid pRRSPmeIR1 und die DraI Methylase
auf dem von pACYC184 stammenden Plasmid pACYC184DraIM10 getragen
wird. 0,5 Gramm Zellpaste wurden in 1,5 ml Beschallungspuffer (20
mM Tris-HCl, 1 mM Dithiothreitol, 0,1 mM EDTA, pH 7,5) suspendiert,
durch Beschallung aufgebrochen und durch Zentrifugation geklärt. Der
Extrakt wurde für
den Verdau von 1 μg λDNA je 50 μl Reaktionsvolumen
in 1X NEBuffer 4, der mit 100 μg/ml
BSA angereichert war, und eine 1-stündige Inkubation bei 37°C verwendet.
Bahnen 1 und 10: HindIII-λ +
HaeIII-ΦX174
Größenstandard;
Bahn 2: 0,01 μl
Rohextrakt; Bahn 3: 5 × 10–3 μl Rohextrakt;
Bahn 4: 2,5 × 10–3 μl Rohextrakt;
Bahn 5: 1,25 × 10–3 μl Rohextrakt;
Bahn 6: 6,25 × 10–4 μl Rohextrakt;
Bahn 7: 3,13 × 10–4 μl Rohextrakt;
Bahn 8: 1,56 × 10–4 μl Rohextrakt;
Bahn 9: 7,81 × 10–5 μl Rohextrakt.
Die PmeI-Gesamtaktivität entspricht
etwa 1 × 107 Einheiten je Gramm Zellpaste.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die PmeI Restriktionsendonuclease
kodiert, sowie Verfahren zur Herstellung von rekombinantem PmeI
Enzym.
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Das
Klonieren des PmeI Restriktionsendonucleasegens von Pseudomonas
mendocina erwies sich als ungewöhnlich
schwierig. Mit dem intensiv ausprobierten Methylaseselektionsverfahren
(U.S. Patent Nr. 5,200,333) konnte kein PmeI Methylase produzierender
Klon erzeugt werden. Selbst nach dem Klonieren des PmeI Endonucleasegens
wurden keine konservierten Methylasemotive neben dem PmeI Endonucleasegen lokalisiert.
Dieses Fehlen eines PmeI Methylasegens verkomplizierte die Klonierung
des entsprechenden Endonucleasegens wesentlich.
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Man
beschloss, zum Klonieren des PmeI Restriktionsendonucleasegens hochgereinigtes
PmeI Restriktionsendonucleaseprotein von Pseudomonas mendocina Zellen
zu erhalten, um die Aminosäuresequenz am
N-Terminus der Endonuclease zu bestimmen. Die Aminosäuresequenz
wurde dann zum Entwerfen von degenerierten Oligonucleotidprimern
zur PCR-Amplifikation dieser DNA-Region von genomischer Pseudomonas
mendocina DNA verwendet. Die Sequenz der kleinen PCR-amplifizierten
DNA wurde dann zum Entwerfen nichtdegenerierter inverser PCR-Primer
verwendet, die zum Amplifizieren von DNA, die den Beginn des PmeI Endonucleasegens
flankiert, unter Anwendung inverser PCR-Technologien verwendet wurden. Zwei
solche amplifizierte Produkte, ein 1,4 kb Produkt einer mit BssHII
verdauten und zirkularisierten Pseudomonas mendocina DNA-Matrize
und ein 900 bp Produkt einer mit BsaWI verdauten und zirkularisierten
Pseudomonas mendocina DNA-Matrize wurden in den Vektor pUC19 kloniert
und sequenziert. Die Sequenzdaten einer etwa 1,6 kb Region des Pseudomonas
mendocina Genoms von den amplifizierten Produkten wurden zum Ermitteln des
PmeI Endonucleasegens verwendet. Es wurde ein offenes Leseraster
von 693 bp mit einer N-terminalen Aminosäuresequenz beobachtet, die
mit der übereinstimmte,
die durch Sequenzieren des N-Terminus des gereinigten PmeI Endonucleaseproteins
bestimmt wurde, und daher als PmeI Endonucleasegen identifiziert.
Es wurden keine offensichtlichen bekannten Methylasemotive in den
jeweiligen 6-Frame-Aminosäuretranslationen
der 700 bp und 190 bp DNA-Sequenz unmittelbar 3' und 5' zum identifizierten PmeI Endonucleasegen
gefunden. Um eine mögliche
PmeI Methylase aufzufinden, mussten DNA-Sequenzdaten über beide Seiten dieser 1,6
kb Region hinaus erhalten werden. Zu diesem Zweck fanden zusätzliche
inverse PCR-Experimente statt. Es wurde eine weitere 1,57 kb DNA-Sequenz 3' zur Endonuclease
und 3,1 kb Sequenz 5' zur
Endonuclease erhalten und keine offensichtlichen bekannten Methylasemotive
gefunden. Es gibt mehrere Möglichkeiten.
Eines der ORFs neben dem Endonucleasegen kodiert möglicherweise
eine PmeI Methylase, enthält
aber keine hochhomologen Methylasemotive, die ihre Identifizierung
als solche zulassen. Die Methylase könnte recht groß sein,
so dass möglicherweise
mehr Sequenz, vor allem 3' zur
Endonuclease, zum Lokalisieren des Gen notwendig ist. Die Methylase
könnte
an irgendeiner anderen Stelle auf der genomischen Pseudomonas mendocina
DNA und nicht neben dem Endonucleasegen vorliegen. Eine andere Möglichkeit
ist, dass Pseudomonas mendocina DNA kein Methylasegen enthält, das
mit der PmeI Endonuclease übereinstimmt.
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Da
kein PmeI Methylasegen zum Exprimieren vorhanden war, um den Wirt
vor dem entsprechenden Endonucleasegen zu schützen, wurden andere Methylasen
untersucht, die die PmeI Restriktionsaktivität möglicherweise blockieren könnten. Man
stellte fest, dass MseI Methylase, die TTAA, die internen vier Basen
der PmeI Erkennungssequenz, erkennt, die PmeI Spaltung nicht blockierte.
Es wurde eine Reihe von Oligonucleotiden, die einen PmeI Ort enthielten,
so konstruiert, dass eines der Adenine oder der Cytosine in der
Erkennungssequenz methyliert wurde, und diese Oligos wurden einer
PmeI Spaltung unterzogen, um festzustellen, ob PmeI durch Methylierung
blockiert werden könnte.
Es wurde gefunden, dass eine Methylierung am dritten Adeninrest
die PmeI Spaltung blockierte, aber nicht die Methylierung am ersten
oder zweiten Adenin, und auch nicht die Methylierung an der C5-Position
des Cytosinrests. N4 Cytosinmethylierung wurde nicht getestet. Die DraI
Methylase erkennt die DNA-Sequenz
5' TTTAAA 3', die internen sechs
Basen des PmeI Ortes 5' GTTTAAAC
3'. Die DraI Methylase
könnte
an einem beliebigen der drei Adenine methylieren und daher den PmeI Restriktionsverdau
blockieren oder auch nicht; folglich musste bestimmt werden, ob
durch DraI Methylase modifizierte DNA gegenüber einem PmeI Restriktionsverdau
resistent ist. Zu diesem Zweck wurden teilweise Sau3AI Subklone
eines DraI Methylase produzierenden Klons, pDraIRM9.7-G2, in den
Vektor pNEB193 kloniert, der einen einzelnen PmeI Ort und vier DraI
Orte enthielt, und DraI Methylase produzierende Klone wurden mit
dem Methylaseselektionsverfahren selektiert. Die Plasmide von diesen
Klonen wurden isoliert, und es zeigte sich, dass sie vor PmeI sowie
DraI Restriktion geschützt
waren. Da durch DraI Methylase geschützte DNA vor PmeI Restriktionsverdau
geschützt
wurde, konnte das PmeI Endonucleasegen dann in einem durch DraI
Methylase zuvor geschützten
Wirt exprimiert werden. DraI Methylase wurde anschließend in
den Vektor pACYC184 kloniert, der mit Expressionsvektoren wie pRRS
oder pAII17 kompatibel war. Dies wurde durch Klonieren von Sau3AI
Teilsubklonen von pDraIRM9.7-G2 in pACYC184 und Selektieren nach
Methylase produzierenden Klonen durch Methylaseselektion erreicht.
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Die
PmeI Endonuclease wurde dann exprimiert, indem das komplette Gen
von Pseudomonas mendocina DNA amplifiziert und in den Expressionsvektor
pRRS kloniert wurde. Dieses Konstrukt wurde in einen Wirt eingeführt, der
an PmeI Orten mit dem auf dem separaten kompatiblen Plasmid pACYC184
getragenen DraI Methylasegen zuvor modifiziert wurde. PmeI Endonuclease
wird durch Wachsenlassen des Wirts, der das PmeI Endonucleasegen
und DraI Methylasegen enthält,
Induzieren mit angemessenen Expressionsbedingungen, Ernten der Zellen
und Reinigen der PmeI Endonuclease produziert.
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Das
hierin beschriebene Verfahren, mit dem die PmeI Restriktionsendonuclease
vorzugsweise kloniert und exprimiert wird, ist in 1 dargestellt
und umfasst die folgenden Schritte:
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1.
Pseudomonas mendocina wird in Flaschen mit modifiziertem LB-Medium
ohne Magnesium bei 37°C
unter Rühren
und Belüften über Nacht
wachsen gelassen. Die Zellen werden geerntet und lysiert und die genomische
DNA wird gereinigt.
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2.
Die PmeI Restriktionsendonuclease wird von Pseudomonas mendocina
Zellen auf nahezu Homogenität
durch eine Kombination von Proteinreinigungstechniken gereinigt,
die bei New England Biolabs, Inc. entwickelt wurden (siehe Beispiel
1, Schritt 2). Die so gereinigte Endonuclease ist nach SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
fast homogen und hat eine scheinbare relative Molekülmasse von
etwa 26 Kilodalton.
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3.
Die aminoterminale Aminosäuresequenz
der Endonuclease wird mit einem 470A Proteinsequenzer (Waite-Rees, et al., J.
Bacteriol. 173:5207-5219 (1991)) von Applied BioSystems Division,
Perkin-Elmer Corporation (Foster City, California) erhalten und
dazu verwendet, die Synthese von degenerierten Oligonucleotidprimern
zur Amplifikation der DNA am Beginn des PmeI Endonucleasegens von
Pseudomonas mendocina Genom-DNA zu lenken und das PmeI Endonucleasegen
in nachfolgenden Studien zu identifizieren.
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4.
Ein Teil des PmeI Endonucleasegens wird mit degenerierten DNA-Primern
auf der Basis der in Schritt 3 erhaltenen Aminosäuresequenz amplifiziert, wobei
einer den Aminosäureresten
1 bis 6 (M)TTNSP (SEQ ID Nr. 1) und einer den Aminosäureresten
10 bis 14 MIDEC (SEQ ID Nr. 2) für
den Rückwärtsstrang
der DNA entspricht. Individuelle Klone der amplifizierten DNA werden
sequenziert.
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5.
Genomische Pseudomonas mendocina DNA wird durch ApoI, BsaHI, BsrFI,
BstYI, EaeI, HaeII, Sau3AI, NlaIII, EagI und BssHII Endonucleasen
verdaut und die resultierenden Fragmente werden bei niedriger DNA-Konzentration ligiert,
um eine intramolekulare Ligation zu begünstigen. Der Primer PmeI-IP1
ist so gestaltet, dass er in der Region zwischen den degenerierten
Primern aus Schritt 4, die den Aminosäureresten Asp-Val-Gly-Met-Ile-Asp
(SEQ ID Nr. 3) entsprechen, und dem ersten Nucleotid G des Glu kodierenden
Codons anlagert, wobei sein 3'-Ende
in Richtung auf die unbekannte Region ausgerichtet ist. Da sich
die DNA-Sequenzen von in Schritt 4 erhaltenen Klonen in der Sequenz
am vierten und fünften
Rest Asn und Ser unterscheiden, werden zwei separate Primer hergestellt,
wobei der Primer PmeI-IP2 mit einer Sequenzklasse und der Primer
PmeI-IP3 mit der zweiten Sequenzklasse hybridisiert. Die zirkularisierten
Fragmente mit DNA, die dem N-Terminus des PmeI Endonucleasegens
entspricht, werden mit den Primern PmeI-IP1 und PmeI-IP2 und den
Primern PmeI-IP1 und PmeI-IP3 amplifiziert. Amplifizierte Produkte
verschiedener Größe werden
produziert und in den Vektor pUC19 kloniert.
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6.
Die verschiedenen pUC19 Konstrukte werden sequenziert. Nur ein Konstrukt,
pUC19BssHII21, mit einem amplifizierten 1400 bp Fragment von mit
BssHII verdauter und zirkularisierter DNA enthält eine DNA-Sequenz, die mit der
N-terminalen Aminosäuresequenz
der PmeI Endonuclease 3' zum
Primer PmeI-IP1 übereinstimmt.
Der Primer PmeI-IP3 hybridisiert jedoch woanders, wahrscheinlich
aufgrund von Fehlpaarungen auf den Primer-Sequenzen. Folglich enthalten
die beiden Primer PmeI-IP2 und PmeI-IP3 wahrscheinlich Fehlpaarungen
an der Sequenz für
den vierten und fünften
Rest Asn und Ser.
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7.
Ein neuer Satz Primer wird auf der Basis der vom pUCBssHII21 Klon
erhaltenen Sequenz gestaltet. Die zirkularisierten Fragmente mit
DNA, die dem N-Terminus des PmeI Endonucleasegens entspricht, werden unter
Verwendung der neuen Primer amplifiziert. Die mit BsaWI verdaute
und zirkularisierte DNA bringt ein 900 bp Produkt hervor, das in
den Vektor pUC19 kloniert wird.
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8.
Das Konstrukt pUC19BsaWI5 mit dem amplifizierten 900 bp Fragment
von der mit BsaWI verdauten zirkulären DNA wird sequenziert. Es
gibt ein offenes Leseraster, das mit den N-terminalen Aminosäuresequenzdaten übereinstimmt
und das die korrekte Größe hat,
um ein Protein von etwa 26 kD zu produzieren. Das BsaWI Produkt
enthält
190 bp 5' zum Endonucleasegen
und 90 bp 3' zum
Endonucleasegen. Das BssHII Produkt enthält 700 bp 3' zum Endonucleasegen. Es werden keine
offensichtlichen Methylasemotive in der das Endonucleasegen flankierenden
sequenzierten Region gefunden. Zur Suche nach einem PmeI Methylasegen wird
DNA, die beide Seiten des Endonucleasegens flankiert, amplifiziert,
kloniert und sequenziert, wie in den folgenden Abschnitten beschrieben
wird.
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9.
Pseudomonas mendocina DNA 5' zum
PmeI Endonucleasegen wird in inversen PCR-Reaktionen mit Primern
amplifiziert, die in der Nähe
des 5' Endes des
Endonucleasegens hybridisieren. Die im Abschnitt 5 präparierte,
mit Restriktionsendonuclease verdaute und zirkularisierte Pseudomonas
mendocina DNA wird als Matrize verwendet. Amplifizierte Produkte
werden in den Vektor pUC19 kloniert.
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10.
Verschiedene pUC19 Konstrukte, die amplifizierte Produkte aus Abschnitt
9 tragen, werden sequenziert. Mit BstYI verdaute und zirkularisierte
DNA bringt ein 3,3 kb Produkt und mit HaeII verdaute und zirkularisierte
DNA bringt ein 0,9 kb Produkt hervor. Es können keine offensichtlichen
Methylasemotive in den 6-Frame-Aminosäuretranslationen
von etwa 3,1 kb sequenzierter DNA 5' zum PmeI Endonucleasegen gefunden werden.
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11.
Pseudomonas mendocina DNA 3' zum
PmeI Endonucleasegen wird in zwei konsekutiven inversen PCR-Experimenten amplifiziert.
Pseudomonas mendocina DNA wird mit AatII, Hinp1I, MscI, MseI, SacI,
StuI und Tsp509I Endonucleasen verdaut und die resultierenden Fragmente
werden bei geringer DNA-Konzentration ligiert, um eine intramolekulare
Ligation zu begünstigen.
Diese zirkulären
Matrizen sowie die mit BsaHI verdaute, zirkuläre Matrize aus Abschnitt 5
werden im ersten inversen PCR-Experiment verwendet. Einer der Primer
hybridisiert mit DNAs gerade außerhalb
des 3' Terminus
des PmeI Endonucleasegens, wobei sein 3' Ende in Richtung auf die unbekannte
Region ausgerichtet ist. Der andere hybridisiert innerhalb und in
der Nähe
des 3'-Endes des
Endonucleasegens und ist in entgegengesetzter Richtung ausgerichtet.
Die mit AatII verdaute, zirkularisierte DNA bringt ein 1,1 kb Produkt
hervor; die mit MscI verdaute, zirkuläre DNA bringt ein 1,4 kb Produkt
hervor und die mit BsaHI verdaute, zirkuläre DNA bringt ein 0,7 kb Produkt
hervor. Diese amplifizierten DNAs werden in pUC19 kloniert und sequenziert.
Zwei weitere Primer auf der Basis der neu gewonnenen DNA-Sequenzinformationen
werden synthetisiert und im zweiten inversen PCR-Experiment verwendet.
Die mit HaeII verdaute, zirkularisierte DNA (Abschnitt 5) bringt
ein 0,7 kb Produkt hervor, das in pUC19 kloniert und sequenziert
wird. Etwa 1,57 kb DNA 3' zum
3''-Ende des so sequenzierten
Endonucleasegens enthalten keine offensichtlichen Methylasemotive.
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12.
Ein DraI Methylase produzierender Klon pDraIRM9.7-G2 wird teilweise
mit Sau3AI verdaut und die resultierenden DNA-Fragmente werden in
den pNEB193 Vektor eingesetzt. Transformanten werden gepoolt, die
Populationen von Plasmiden werden gereinigt und mit DraI Endonuclease
verdaut. Die beschränkten
Plasmide werden zurück
in E. coli transformiert, um unzerschnittene Klone wiederzugewinnen.
Plasmide von neun individuellen Transformanten, die den DraI Verdau überleben,
werden gereinigt. Acht der neun Plasmide werden vor DraI Endonucleaseverdau
sowie vor PmeI Endonucleaseverdau geschützt.
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13. Überexpression
des PmeI Endonucleasegens:
-
A. Allgemeine Überlegungen:
-
Es
gibt eine Reihe von Möglichkeiten
zur Überexpression
des Restriktionsgens. DNA-Sequenz und ausführliche Kartierungsinformationen
sind bei der Bestimmung der besten Methode zur Überexpression des Restriktionsendonucleasegens
behilflich.
-
Eine
Methode zur Überexpression
umfasst den Entwurf von Primern, die direkt am N-Terminus des Restriktionsendonucleasegens
und irgendwo stromabwärts
(3') des Gens hybridisieren,
um die Polymerasekettenreaktion zum Amplifizieren des gesamten Endonucleasegens
anzuwenden. Das resultierende DNA-Fragment kann in einen Expressionsvektor
wie pRRS direkt stromabwärts
eines induzierbaren Promotors (lacUV5) eingesetzt werden.
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Alternativ
kann eine Überexpression
durch Einsetzen eines Promotors, der von E. coli allgemein erkannt
wird, wie Ptac auf pAGR3 (New England Biolabs, Inc.; Beverly, Massachusetts),
direkt vor den Anfang des Restriktionsendonucleasegens erreicht
werden. Dies kann dadurch erreicht werden, dass geeignete Restriktionsorte
in der Nähe
von Anfang und Ende des Restriktionsendonucleasegens und kompatible
Restriktionsorte in der Nähe
des Promotors von pAGR3 gefunden und das Restriktionsgen in Übereinstimmung
mit dem Ptac Promotor in pAGR3 übertragen
wird. Zu anderen regulierten Promotoren, die verwendet werden können, gehören PlacUV5
(Fuller, Gene 19:43-54 (1982)) und IPL (Shimatake und Rosenberg,
Nature 254:128 (1981)) auf pUC19 und pBR322 Derivaten. Darüber hinaus
kann eine starke Ribosomenbindungsstelle (Shine & Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 71:342-1346, (1974)) vor das Gen gesetzt werden, um die Expression zu
erhöhen.
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Für den Erhalt
eines stabilen Klons, der die Restriktionsendonuclease überexprimiert,
wird der Wirt im Allgemeinen zuvor vor einem Restriktionsendonucleaseverdau
geschützt.
In der vorliegenden Erfindung wird dies durch Klonieren der DraI
Methylase auf einem separaten Plasmid erreicht. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung
wird gezeigt, dass durch DraI Methylase modifizierte DNA gegen PmeI
Endonucleaseverdau beständig
ist. Das verwendete Plasmid muss mit dem Expressionsvektor kompatibel
sein. Die Methylase muss außerdem
auf einem Niveau produziert werden, das das Genom des Wirts vor
dem Verdau durch das überexprimierte
Restriktionsendonucleasegen schützt.
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Die
DNA-Sequenz des Gens kann durch ortsgerichtete Mutagenese oder durch
Resynthetisieren des Gens selbst verändert werden, um Codone zu
verwenden, die in E. coli effizienter genutzt werden (Ikemura, J.
Mol. Biol. 151:389-409
(1981)).
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B. Klonieren der DraI
Methylase in einen kompatiblen Vektor:
-
Die
mit Sau3AI teilweise verdauten pDraIRM9.7-G2 DNA-Fragmente aus Abschnitt 12 werden in
den Vektor pACYC184 ligiert, der zuvor mit BamHI gespalten und dephosphoryliert
wurde. Transformanten werden gepoolt, die Populationen von Plasmiden
werden gereinigt und mit DraI Endonuclease verdaut. Die beschränkten Plasmide
werden zurück
in E. coli transformiert, um unzerschnittene Klone wiederzugewinnen.
Plasmide von zwölf
der vierzehn individuellen, im Mini-Prep-Verfahren behandelten Transformanten
werden vor DraI Endonucleaseverdau geschützt. Ein solcher Klon mit der
Bezeichnung pACYC184DraIM10, der ein Insert von etwa 3 kb enthält, wird
zur anschließenden
PmeI Endonucleaseexpression verwendet.
-
C. Expression von PmeI
Endonuclease:
-
DNA-Primer
werden entworfen und synthetisiert, um das PmeI Endonucleasegen
zu amplifizieren. Der Vorwärtsprimer
hat die folgenden Elemente: einen PstI Ort zum Erleichtern der Klonierung,
ein Stoppcodon „in-frame" mit dem lacZ Gen,
eine starke Ribosomenbindungsstelle von E. coli Consensus, 7 Nucleotid-Spacer-Sequenz
zwischen der Ribosomenbindungsstelle und dem ATG Startcodon der
PmeI Endonuclease und 24 Nucleotide, die mit der PmeI Endonuclease-DNA-Sequenz
zur Hybridisierung übereinstimmen.
Der Rückwärtsprimer
hat einen BglII Ort und 21 Nucleotide, die mit Pseudomonas mendocina
DNA 84 bp 3' zum 3''-Ende des PmeI Endonucleasegens zur
Hybridisierung übereinstimmen.
Das Endonucleasegen wird von der genomischen DNA mit diesen Primern
amplifiziert. Die amplifizierte DNA wird durch BglII und PstI gespalten und
in den Expressionsvektor pRRS ligiert, der zuvor durch PstI und
BamHI Endonucleasen gespalten und gelgereinigt wurde. Die Ligationsreaktion
wird in kompetente E. coli ER2426 Zellen transformiert, die pACYC184DraIM10
enthalten. Vektoren mit Inserts der gewünschten Größe werden durch Miniprep-Verfahren identifiziert.
Mehrere Klone werden bis zur mid-log-Phase wachsen gelassen und
mit 0,5 mM IPTG 16 Stunden lang induziert. Die Zellen werden anschließend durch
Zentrifugation geerntet, in Beschallungspuffer resuspendiert, durch
Beschallung lysiert, und der Extrakt wird im Hinblick auf PmeI Endonucleaseaktivität geprüft. Ein solcher
PmeI exprimierender Wirt mit der Bezeichnung pRRSPmeIR1/pACYC184DraIM10
wird vermehrt und zur Herstellung von PmeI Restriktionsendonuclease
verwendet.
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14.
Produktion: Die PmeI Endonuclease kann von Wirtszellen, die das überexprimierte
PmeI Restriktionsendonuclasegen tragen, durch Vermehrung in einem
Fermenter in einem reichhaltigen Medium mit der angemessenen Antibiotikaselektion
und Induktion produziert werden. Die Zellen werden anschließend durch Zentrifugation
geerntet und durch Beschallung aufgebrochen, um einen Rohzellextrakt
herzustellen, der PmeI Restriktionsendonucleaseaktivität enthält.
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15.
Reinigung: Der Rohzellextrakt mit der PmeI-Endonuclease wird durch eine Kombination
von Proteinreinigungstechniken wie Affinitätschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie
gereinigt.
-
Anhand
des folgenden Beispiels werden derzeit bevorzugte Ausgestaltungen
der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. Es ist zu verstehen,
dass dieses Beispiel illustrativ ist und dass die Erfindung mit
Ausnahme der Angaben in den beiliegenden Ansprüchen nicht als darauf beschränkt anzusehen
ist.
-
1. BEISPIEL
-
KLONIERUNG DER PMEI RESTRIKTIONSENDONUCLEASEGENE
-
1. DNA-Reinigung:
-
5
g Pseudomonas mendocina (NEB Nr. 698) Zellpaste wurden durch sanftes
Schütteln
in 20 ml 25% Saccharose, 0,05 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0, 5 ml
0,5 M EDTA, pH 8,0, resuspendiert, 6 ml frisch präpariertes
10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris-HCl, pH 8,0, wurden zugegeben, und
die Lösung
wurde 2 Stunden lang bei 4°C
inkubiert. Es wurden 24 ml Lysegemisch (1 % Triton-X100, 50 mM Tris,
62,5 mM EDTA, pH 8,0) und dann 5 ml 10 % SDS zugegeben, und die
Lösung
wurde über
Nacht bei 4°C
inkubiert. Die Lösung
wurde mit 50 ml äquilibriertem
Phenol extrahiert, die wässrige
Phase wurde gewonnen und zweimal mit 50 ml Choroform extrahiert.
Die wässrige
Lösung
wurde gegen 2 l von 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, (vier Wechsel) über Nacht
dialysiert. Die dialysierte Lösung
wurde dann mit RNase (100 μg/ml)
1 Stunde lang bei 37°C
verdaut. Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen 5 M NaCl und
0,55 Volumen von 2-Propanol präzipitiert und
auf ein Glasstäbchen
gespult. Die DNA wurde an der Luft getrocknet und dann in 10 ml
10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 gelöst.
-
2. Reinigung der PmeI
Restriktionsendonuclease von Pseudomonas mendocina (NEB Nr. 698):
-
PmeI
Restriktionsenzym kann von NEB Nr. 698 durch Vermehren von Pseudomonas
mendocina Zellen in einem modifizierten LB-Medium ohne Magnesium
bei 37°C
unter Rühren
und Belüften über Nacht
produziert werden. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet.
Alle folgenden Vorgänge
fanden auf Eis oder bei 4°C
statt. 196 g Zellpellet (Nassgewicht) wurden in 600 ml Puffer A
(20 mM Tris-HCl, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,1 mM EDTA, 5 % Glycerol,
pH 7,4) mit 50 mM NaCl (Puffer A.05) resuspendiert, woraufhin Phenylmethylsulfonylfluorid
(PMSF) auf eine Endkonzentration von 25 μg/ml zugegeben wurde. Die Zellsuspension wurde
anschließend
durch Beschallung aufgebrochen. Der Extrakt wurde bei 12.000 rpm
90 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand wurde aufgefangen.
Die Pellets wurden mit 50 ml Puffer A.05 gespült und noch einmal bei 15.000
rpm 90 Minuten lang zentrifugiert. Die Überstände wurden miteinander kombiniert
(insgesamt 700 ml) und auf eine 216 ml Q-Sepharose-Säule (Pharmacia;
Piscataway, NJ) geladen, die mit Puffer A.05 äquilibriert wurde. Diese Säule wurde
mit 200 ml Puffer A.05 gewaschen, und die PmeI Aktivität wurde mit
dem Durchfluss und der Waschflüssigkeit
eluiert. PmeI-haltige Fraktionen wurden gepoolt und auf eine 216 ml
Heparin-Sepharose-Säule
(Pharmacia; Piscataway, NJ) geladen, die in Puffer A.05 äquilibriert
wurde, mit 600 ml Puffer A.05 gewaschen, woraufhin ein linearer
Gradient (2 l) von 50 mM bis 800 mM NaCl in Puffer A gebildet wurde.
21 ml Fraktionen wurden aufgefangen. Die Fraktionen wurden im Hinblick
auf PmeI Restriktionsaktivität
mit Lambda-DNA geprüft,
wobei der Mittelpunkt der eluierten Aktivität bei einer Konzentration von etwa
480 mM NaCl lag. Es wurden insgesamt 12 Fraktionen gepoolt, und
die Menge an Enzymaktivität
lag schätzungsweise
bei 750.000 Einheiten. Dieser Heparin-Sepharose-Pool wurde auf eine 12 ml
Hydroxylapatit-(HPT)-Säule (Calbiochem;
LaJolla, CA) aufgetragen, die in Puffer B (20 mM KPO4,
6 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA, 5 Glycerol, pH 6,8) mit 50
mM NaCl (Puffer B.05) äquilibriert
wurde, mit 36 ml Puffer B.05 gewaschen, gefolgt von einem linearen
Gradienten (120 ml) von 50 mM NaCl bis 1 M NaCl in Puffer B. 1,2
ml Fraktionen wurden aufgefangen. Die Fraktionen wurden im Hinblick
auf PmeI Aktivität
mit Lambda-DNA geprüft.
Der Mittelpunkt der Restriktionsenzymaktivität eluierte bei etwa 500 mM
NaCl. Insgesamt 13 Fraktionen wurden gepoolt und gegen Puffer C
(20 mM KPO4, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 5 %
Glycerol, pH 6,8) mit 50 mM NaCl (Puffer C.05) über Nacht dialysiert. Die dialysierte
Lösung
wurde auf eine 1 ml polyCat-A-Säule
(Custom LC, Inc.; Houston, TX) aufgetragen, die in Puffer C.05 äquilibriert
wurde, gefolgt von einem linearen Gradienten (50 ml) von 50 mM NaCl
bis 500 mM NaCl in Puffer C. Es wurden 1 ml Fraktionen aufgefangen
und die Fraktionen wurden im Hinblick auf Restriktionsenzymaktivität mit Lambda-DNA
geprüft.
Die PmeI Aktivität
eluierte bei etwa 270 mM NaCl. 3 Fraktionen wurden gepoolt, mit
5 Volumen Puffer A verdünnt
und auf eine 1 ml Mono-Q-FPLC-Säule
(Pharmacia; Piscataway, NJ) geladen, die mit Puffer A.05 äquilibriert
wurde. Die Säule
wurde mit 2 ml Puffer A.05 gewaschen und die PmeI Aktivität wurde
mit dem Durchfluss und der Waschflüssigkeit eluiert. PmeI-haltige
Fraktionen wurden gepoolt und direkt auf eine 3 ml Heparin-TSK-FPLC-Säule (TosoHaas; Philadelphia,
PA) geladen, die mit Puffer A.05 äquilibriert wurde. Die Säule wurde
mit 2 ml Puffer A.05 gewaschen, gefolgt von einem linearen Gradienten
(60 ml) von 50 mM NaCl bis 500 mM NaCl in Puffer A. 1 ml Fraktionen
wurden aufgefangen und die PmeI Aktivität wurde mit Lambda-DNA geprüft. Der
Peak der Restriktionsenzymaktivität eluierte bei 300 mM NaCl.
Die Menge an gereinigter PmeI Restriktionsenzymaktivität lag bei schätzungsweise
116.000 Einheiten. Die Peakfraktion wurde auf ein SDS-PAGE Proteingel
geladen und einer Elektrophorese unterzogen. Das Gel wurde mit Coomassie-Blau
R-250 gefärbt,
wobei eine auffällige
Bande bei etwa 26 kD beobachtet wurde, die der PmeI Restriktionsendonucleaseaktivität entsprach.
-
3. Aminoterminale PmeI
Proteinsequenz:
-
Die
PmeI Restriktionsendonuclease, die wie im Abschnitt 2 oben präpariert
wurde, wurde der Elektrophorese unterworfen und mit dem Verfahren
von Matsudaira (Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262:10035-10038 (1987))
mit den zuvor beschriebenen Modifikationen (Looney, et al., Gene
80:193-208 (1989)) elektrogeblottet. Die Membran wurde mit Coomassie-Blau
R-250 gefärbt und
die Proteinbande von etwa 26 kD wurde exzidiert und einem sequentiellen
Abbau auf einem Gasphasenproteinsequenzer Modell 407A (Waite-Rees,
et al., J. Bacteriol. 173:5207-5219 (1991)) von Applied BioSystems Division,
Perkin-Elmer Corporation (Foster City, California) unterzogen. Die
ersten 24 Reste des 27 kD Proteins entsprachen (Met)-Thr-Thr-Asn-Ser-Pro-Ser-Asp-Val-Gly-Met-Ile-Asp-Glu-Cys-Leu-Ser-Ile-Val-Xaa-Thr-Xaa-Leu-Ala (SEQ ID Nr.
4).
-
4. Amplifikation von N-terminaler
PmeI DNA:
-
Ein
Teil des PmeI Endonucleasegens wurde mit degenerierten DNA-Primern auf der Basis
der im Schritt 3 erhaltenen Aminosäuresequenz amplifiziert. Zwei
Primer, die den Aminosäureresten
1 bis 6 (M)TTNSP (SEQ ID Nr. 1) entsprachen, wurden synthetisiert:
Pmel-PS1 5'GTTGGATCCATGACNACNAAYTCNCC
3' (SEQ ID Nr. 5)
und Pmel-PS2 5' GTTGGATCCATGACNACNAAYAGYCC
3' (SEQ ID Nr. 6).
Ein Primer, der den Aminosäureresten
10 bis 14 MIDEC entsprach, Pmel-PS3 5' GTTCTGCAGRCAYTCRTCDATCAT 3' (SEQ ID Nr. 7),
wurde synthetisiert, um am Rückwärtsstrang
der DNA zu hybridisieren. Ein Reaktionsgemisch wurde durch Kombinieren
der folgenden Bestandteile hergestellt:
30 μl 10X Vent® Reaktionspuffer
18 μl 4 mM dNTP-Lösung
15 μl Primer
PmeI-PS1
15 μl
Primer PmeI-PS2
3 μl
Pseudomonas mendocina DNA (etwa 600 ng)
219 μl dH2O
6 μl
(12 Einheiten) Vent® Exo-Polymerase (NEB Nr.
257)
-
Das
Gemisch wurde in drei aliquote Teile von 94 μl aufgeteilt; zum ersten wurden
6 μl dH2O gegeben, zum zweiten wurden 3 μl dH2O und 3 μl
100 mM MgSO4 (5 mM Mg++ Endkonzentration)
gegeben und zum letzten wurden 6 μl
100 mM MgSO4 (8 mM Mg++ Endkonzentration)
gegeben. Die PCR-Amplifikationsbedingungen
umfassten: 1 Zyklus bei 95°C
(2 min) und dann 20 Zyklen bei 95°C
(30 sec), 40°C
(30 sec) und 72°C (5
sec). Die PCR-amplifizierte DNA wurde auf einem 3,5 % NuSieve Agarosegel
größenselektiert
und in pUC19 kloniert. Es wurden individuelle Klone der amplifizierten
DNA sequenziert. Es wurden Klone mit sowohl PmeI-PS1 als auch PmeI-PS2
beobachtet, wobei die Codonnutzung für die fünfte Aminosäure, Serin, fraglich blieb.
-
5. Klonieren von DNA neben
dem N-terminalen Ende des PmeI Restriktionsendonucleasegens:
-
Matrizenpräparation
für die
inverse PCR-Amplifikation: 3 μg
Pseudomonas mendocina DNA wurden mit 20 Einheiten ApoI Restriktionsendonuclease
in 100 μl
1X NEBuffer Nr. 3 (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100
mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,9) 1 Stunde lang bei 50°C verdaut. Das Restriktionsverdaugemisch
wurde mit einem Volumen von äquilibriertem
Phenol:Chloroform (50:50, v/v) extrahiert und die wässrige Phase
wurde gewonnen und zweimal mit einem Volumen Chloroform extrahiert.
Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen von 5 M NaCl und 1 Volumen
von 2-Propanol präzipitiert
und mit 70%igem eiskaltem Ethanol gewaschen. Die DNA wurde in 50 μl 1X TE resuspendiert.
10 μl dieser
verdauten Pseudomonas mendocina DNA (etwa 0,5 μg) wurden in 500 μl 1X Ligasepuffer
mit 2000 U T4 DNA-Ligase bei 16°C über Nacht
zirkularisiert. Ein Teil dieser Zirkularisierungsreaktion wurde
als DNA-Matrize für
nachfolgende inverse PCR-Reaktionen verwendet. Zirkularisierte,
mit BsaHI, BsrFI, BstYI, EaeI, HaeII, Sau3AI, NlaIII, EagI und BssHII
verdaute Pseudomonas mendocina DNA wurde in der gleichen Weise präpariert.
-
Ein
Vorwärts-
oder Kodierungsstrangprimer, PmeI-IP1, und zwei Rückwärts- oder
Nichtkodierungsstrangprimer, PmeI-IP2 und PmeI-IP3, der nachfolgend dargestellten
Sequenzen wurden auf der Basis von DNA-Sequenzen synthetisiert,
die in Schritt 4 erhalten wurden. Der Primer PmeI-IP1 wurde so gestaltet,
dass er Nucleotide hybridisierte, die den Aminosäureresten 8 bis 13, Asp-Val-Gly-Met-Ile-Asp
(SEQ ID Nr. 8), entsprachen, sowie das erste Nucleotid G des Codons,
das den Rest 14, Glu, kodierte. Ein BamHI Restriktionsort war in
diesem Primer ebenfalls enthalten, um das Klonieren zu erleichtern.
Der Primer PmeI-IP2 wurde so gestaltet, dass er die letzten beiden
Nucleotide des Codons, das den Rest 2, Thr, kodierte, Nucleotide,
die den Aminosäureresten
3 bis 7, Thr-Asn-Ser-Pro-Ser (SEQ ID Nr. 9), entsprachen, und das
erste Nucleotid des Codons hybridisierte, das den Rest 8, Asp, kodierte.
Ein PstI Restriktionsort war ebenfalls in diesem Primer enthalten,
um das Klonieren zu erleichtern.
-
-
Oftmals
ist es vorteilhaft, PCR-Fragmente direkt in Vektoren einzusetzen,
die zuvor durch Restriktionsenzyme gespalten wurden, die Blunt-Enden
produzieren, wie SmaI. Dies setzt voraus, dass die einzusetzenden
PCR-Fragmente Phosphatgruppen an den 5'-Enden haben. Zu diesem Zweck wurden
15 μl DNA-Primer PmeI-IP1
(200 μM)
durch 20 Einheiten T4 Polynucleotidkinase in 1X T4 Polynucleotidkinasepuffer
(70 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 5 mM Dithiothreitol,
pH 7,6), angereichert mit 1 mM ATP, in einem 100 μl Reaktionsvolumen
bei 37°C
1 Stunde lang phosphoryliert. Die Primer PmeI-IP2 und PmeI-IP3 wurden
ebenfalls am 5'-Ende
wie oben beschrieben phosphoryliert. Die T4 DNA-Polynucleotidkinase
wurde durch 20-minütiges
Inkubieren bei 65°C
hitzeinaktiviert. Die phosphorylierten Primer wurden mit 2 Volumen
1X TE auf eine Endkonzentration von 10 μM verdünnt und in den folgenden PCR-Reaktionen
verwendet.
-
Inverse
PCR-Reaktionen fanden mit verdauter, zirkularisierter Pseudomonas
mendocina DNA als Matrize unter Verwendung der phosphorylierten
Primer PmeI-IP1 und PmeI-IP2 statt. Drei verschiedene Mg++ Konzentrationen wurden in inversen PCR-Reaktionen
gegen eine individuelle DNA-Matrize verwendet. Ein Reaktionsgemisch
wurde durch Kombinieren der folgenden Bestandteile hergestellt:
30 μl 10X Vent® Reaktionspuffer
18 μl 4 mM dNTP-Lösung
15 μl phosphorylierter
Primer PmeI-IP1
15 μl
phosphorylierter Primer PmeI-IP2
36 μl zirkularisierte DNA-Matrize
(etwa 25 ng)
168 μl
dH2O
6 μl (12 Einheiten) Vent® Exo-Polymerase
NEB Nr. 257
-
Das
Gemisch wurde in drei aliquote Teile von 94 μl aufgeteilt; zum ersten wurden
6 μl dH2O gegeben, zum zweiten wurden 3 μl dH2O und 3 μl
100 mM MgSO4 (5 mM Mg++ Endkonzentration)
gegeben und zum letzten wurden 6 μl
100 mM MgSO4 (8 mM Mg++ Endkonzentration)
gegeben. Die PCR-Amplifikationsbedingungen
umfassten: 1 Zyklus bei 95°C
(2 min) und dann 5 Zyklen bei 95°C
(30 sec), 50°C
(30 sec) und 72°C (2,5
min), gefolgt von 20 Zyklen bei 95°C (30 sec), 65°C (30 sec)
und 72°C
(2,5 min). 15 μl
der PCR-Reaktion wurden durch Elektrophorese auf einem 0,8 % Agarosegel
analysiert. Von einem gewissen unspezifischen amplifizierten DNA-Hintergrund
wurden die folgenden Produkte beobachtet: ein 1700 bp Fragment und
zwei eng voneinander beabstandete Fragmente um 1500 bp von mit ApoI
verdauter zirkulärer
Matrize, ein 1500 bp Fragment von mit BstYI verdauter zirkulärer Matrize,
ein 900 bp Fragment und ein 750 bp Fragment von mit BsaHI verdauter
zirkulärer Matrize
und ein 2500 bp Fragment von mit EagI verdauter zirkulärer Matrize.
Diese amplifizierten Produkte wurden gelgereinigt. Gelreinigung:
100 μl PCR-Reaktionen
wurden in 1 % LMP-Agarose der Elektrophorese unterworfen, Banden
wurden aus dem Gel exzidiert, 5 Minuten lang bei 65°C geschmolzen,
5 Minuten lang auf 40°C
gekühlt,
und die Agarose wurde durch Zugabe von 5 Einheiten β-Agarase
(New England Biolabs Nr. 392) mit einer 1-stündigen Inkubation bei 40°C verdaut.
Es folgte eine Extraktion mit einem Volumen von äquilibriertem Phenol:Chloroform
(50:50, v/v), und die wässrige
Phase wurde gewonnen und zweimal mit einem Volumen Chloroform extrahiert.
Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen 5 M NaCl und 2 Volumen
2-Propanol präzipitiert,
mit 70%igem Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in 50 μl 1XTE Puffer
resuspendiert.
-
Inverse
PCR-Reaktionen wurden auch mit den phosporylierten Primern PmeI-IP1
und PmeI-IP3 unter Verwendung der gleichen Matrizensätze in der
gleichen Weise wie oben beschrieben durchgeführt. 15 μl der PCR-Reaktion wurden durch
Elektrophorese auf einem 0,8 % Agarosegel analysiert. Die folgenden
Fragmente wurden gelgereinigt: ein 2000 bp, ein 1800 bp und ein
870 bp Fragment von mit ApoI verdauter zirkulärer Matrize, ein 1350 bp Fragment
von mit BstYI verdauter zirkulärer
Matrize, ein 1200 bp Fragment von mit BsrFI verdauter zirkulärer Matrize,
ein 2100 bp und ein 1400 bp Fragment von mit BssHII verdauter zirkulärer Matrize,
ein 2500 bp Fragment von mit EagI verdauter zirkulärer Matrize
und ein 800 bp Fragment von mit NlaIII verdauter zirkulärer Matrize.
-
Jedes
gelgereinigte amplifizierte DNA-Produkt wurde jeweils in den Vektor
pUC19 wie folgt ligiert: 5 μl gelgereinigte
DNA wurden mit 100 ng pUC19 Vektor ligiert, der zuvor mit SmaI gespalten
und mit Calf Intestinal Alkaline Phospatase (CIP) in einem Endvolumen
von 20 μl
in 1X T4 DNA Ligasepuffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2,
10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 μg/ml
BSA, pH 7,5) mit 400 U T4 DNA-Ligase
dephosphoryliert wurde. 10 μl
des Ligationsgemischs wurden anschließend in den E. coli Stamm ER2267
transformiert und auf L-Nährlösungsplatten
mit 100 μg/ml
Ampicillin, 40 μg/ml
Xgal und 50 μg/ml
IPTG für
individuelle Kolonien plattiert. Weiße Kolonien wurden einzeln
aufgenommen, um 10 ml L-Nährlösung mit
100 μg/ml
Ampicillin zu inokulieren, und über
Nacht bei 37°C
vermehren gelassen. Klone des gewünschten Konstrukts wurden identifiziert,
indem Miniprep-Verfahren durchgeführt wurden, die gereinigte
DNA verdaut und durch Agarosegelelektrophorese analysiert wurde.
-
Miniprep-Verfahren:
Die einzelnen Kulturen wurden bei 8000 rpm 5 Minuten lang zentrifugiert;
der Überstand
wurde verworfen und das Zellpellet wurde in 1,0 ml 25 mM Tris, 10
mM EDTA, 50 mM Glucose, pH 8,0, resuspendiert. Nach 10 Minuten bei
Raumtemperatur wurden 2 ml 0,2 M NaOH, 1 % SDS in jedes Röhrchen gegeben
und die Röhrchen
wurden zum Lysieren der Zellen geschüttelt und dann auf Eis gelegt.
Nachdem die Lösungen
geklärt
waren, wurden 1,5 ml 3 M Natriumacetat, pH 4,8, zu jeder gegeben
und geschüttelt. Die
sich ausbildenden Präzipitate
wurden bei 15.000 rpm, 4°C,
10 Minuten lang geschleudert. Die jeweiligen Überstände wurde abgegossen und vermischt.
Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Röhrchen 10 Minuten lang bei
15.000 rpm geschleudert, um die präzipitierten Nucleinsäuren zu
pelletieren. Die Überstände wurden
verworfen und die Pellets wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur
an der Luft getrocknet. Nach dem Trocknen wurden die Pellets in
850 μl 10
mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA mit 100 μg/ml RNase gelöst und 1
Stunde lang bei 37°C
inkubiert, um die RNA zu verdauen. Die DNA wurde durch Zugabe von
85 μl 5
M NaCl und dann 600 μl
Isopropanol präzipitiert.
Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde die DNA durch Zentrifugation
5 Minuten lang geschleudert, die Überstände wurden verworfen, die Pellets
wurden getrocknet und dann in einer Endlösung aus 150 μl 10 mM Tris,
1 mM EDTA, pH 8,0, (1X TE) wieder gelöst. Die Plasmid-Minipreps wurden
anschließend
durch einen Verdau mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen analysiert.
-
6. DNA-Sequenzierung:
-
Eine
DNA-Sequenzierung wurde mit einem ABI 373 automatisierten Sequenzierungssystem
gemäß Herstelleranweisungen
mit den M13/pUC Primern Nr. 1233 und Nr. 1224 (NEB) durchgeführt. Miniprep-DNA-Präparate verschiedener
pUC19 Konstrukte mit DNA-Fragmenten von inversen PCR-Reaktionen, die
im Abschnitt 5 beschrieben wurden, wurden als Matrizen verwendet.
Nur ein Klon hatte eine Sequenz, die mit der PmeI Endonuclease-Aminosäuresequenz übereinstimmte:
ein 1400 bp Fragment, amplifiziert von mit BssHII verdauter zirkulärer Matrize
in einer inversen PCR-Reaktion unter Verwendung der Primer PmeI-IP1 und
PmeI-IP3. Dieser Klon wurde pUC19BssHII21 genannt. Die DNA-Sequenz
an einem Ende dieses Klons stimmte mit dem Teil der PmeI Endonucleasesequenz
3' vom Primer PmeI-IP1 überein.
Die DNA-Sequenz vom anderen Ende stimmte jedoch nicht mit dem Teil
der PmeI Endonucleasesequenz 3'' vom Primer PmeI-IP3 überein.
Man kam zu dem Schluss, dass der Primer PmeI-IP1 an der gewünschten
Position auf PmeI Genom-DNA hybridisierte und der Primer PmeI-IP3
an einer anderen Stelle auf der PmeI Genom-DNA hybridisierte, wahrscheinlich
aufgrund von Fehlpaarungen auf der Primersequenz. Da es Diskrepanzen
in den Codonsequenzen für
den vierten und fünften
Rest, Asn und Ser, gab, wurde ein neuer Satz inverser PCR-Primer entworfen,
um DNA-Sequenzen auszuschließen,
die diese Reste kodierten.
-
7. Inverse PCR-Amplifikationen
unter Verwendung des neuen Primersatzes zum Amplifizieren und Klonieren von
DNA neben dem N-Terminus des Endonucleasegens:
-
Die
Primer PmeI-IP4
und PmeI-IP5 wurden in Übereinstimmung
mit den im Schritt 6 erhaltenen DNA-Sequenzen gestaltet. Der Primer
PmeI-IP4 enthielt Nucleotide, die den Aminosäureresten Val-Gly-Met-Ile-Asp (SEQ
ID Nr. 13) entsprachen, und die ersten beiden Nucleotide des Codons
für Glu.
Ein BamHI Ort wurde ebenfalls in diesem Primer eingeschlossen, um
die Klonierung zu erleichtern.
-
-
Der
Primer PmeI-IP5 wurde so gestaltet, dass er mit den ersten beiden
Nucleotiden des Codons für Gly
und Nucleotiden hybridisiert, die den Aminosäureresten Val-Asp-Ser-Pro entsprachen.
Ein BamHI Ort wurde ebenfalls in diesem Primer eingeschlossen, um
die Klonierung zu erleichtern.
-
-
Inverse
PCR-Reaktionen fanden mit BsaWI verdauter, zirkularisierter PmeI
DNA als Matrize statt. In der Reaktion, die das Produkt erfolgreich
amplifizierte, wurde ein Reaktionsgemisch durch Kombinieren der folgenden
Bestandteile hergestellt:
10 μl 10X Vent® Reaktionspuffer
6 μl 4 mM dNTP-Lösung
3 μl 100 mM
MgSO4 (5 mM Mg++ Endkonzentration)
5 μl phosphorylierter
Primer PmeI-IP4
5 μl
phosphorylierter Primer PmeI-IP5
12 μl zirkularisierte DNA-Matrize
(etwa 25 ng)
58 μl
dH2O
2 μl (4 Einheiten) Vent® Exo-Polymerase
NEB Nr. 257
-
Die
PCR-Amplifikationsbedingungen waren wie folgt: einen Zyklus bei
95°C (2
min) und anschließend 5
Zyklen bei 95°C
(30 sec), 40°C
(1 min) und 72°C
(2,5 min), gefolgt von 20 Zyklen bei 95°C (30 sec), 60°C (1 min)
und 72°C
(2,5 min). 15 μl
der PCR-Reaktion wurden durch Elektrophorese auf einem 0,8 % Agarosegel analysiert.
-
Es
wurde ein 900 bp Produkt beobachtet, gelgereinigt und in 50 μl 1X TE resuspendiert.
5 μl dieser DNA
wurden mit 20 U BamHI (NEB Nr. 136) in einem Endvolumen von 20 μl in 1X BamHI
Puffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2,
1 mM Dithiothreitol, pH 7,9) 1 Stunde lang bei 37°C verdaut.
Die Restriktionsendonuclease BamHI wurde durch Inkubieren des Reaktionsgemischs
bei 78°C
20 Minuten lang hitzeinaktiviert. 5 μl der verdauten DNA wurden mit
100 ng des Vektors pUC19, der zuvor mit BamHI gespalten, mit CIP dephosphoryliert
und mit Agarose gelgereinigt wurde, unter Verwendung von 400 U T4
DNA Ligase in 20 μl Endvolumen
von 1X T4 DNA-Ligasepuffer bei 16°C
2 Stunden lang ligiert. 10 μl
des Ligationsgemischs wurden in den E. coli Stamm ER2267 transformiert
und auf L-Nährlösungsplatten
mit 100 μg/ml
Ampicillin, 40 μg/ml Xgal
und 50 μg/ml
IPTG für
individuelle Kolonien plattiert. Weiße Kolonien wurden einzeln
aufgenommen, um 10 ml L-Nährlösung mit
100 μg/ml
Ampicillin zu inokulieren, und über
Nacht bei 37°C
vermehren gelassen. Klone des gewünschten Konstrukts wurden identifiziert,
indem Miniprep-Verfahren durchgeführt wurden, die gereinigte
DNA verdaut und durch Agarosegelelektrophorese analysiert wurde.
Ein Klon mit der Bezeichnung pUC19BsaWI5, der das 900 bp Fragment
enthielt, wurde sequenziert.
-
8. DNA-Sequenzierung des
Klons pUC19BsaWI5:
-
Eine
DNA-Sequenzierung
fand mit einem ABI 373 automatisierten Sequenzierungssystem gemäß Herstelleranweisungen
mit den M13/pUC Primern Nr. 1233 und Nr. 1224 (New England Biolabs,
Beverly, MA) und mit einem Miniprep-DNA-Präparat von pUC19BsaWI5 als Matrize
statt. Die DNA-Sequenz an einem Ende dieses Klons stimmte mit dem
Teil der PmeI Endonucleasesequenz überein, der dem Primer PmeI-IP4
entsprach und in 3'-Richtung
zu ihm lag. Die DNA-Sequenz des anderen Endes stimmte auch mit dem
Teil der PmeI Endonucleasesequenz überein, der dem Primer PmeI-IP5
entsprach und in 3'-Richtung
zu diesem lag. Die Codonsequenzen für die Reste 4 (Asn) und 5 (Ser)
erwiesen sich als 5' AAC
3' und 5' TCC 3'. Ein offenes Leseraster
von 693 bp mit einer N-terminalen Aminosäuresequenz, die mit den im
Abschnitt 3 erhaltenen N-terminalen Proteinsequenzdaten übereinstimmte,
wurde als PmeI Restriktionsendonucleasegen ermittelt. Die 6-Frame-Aminosäuresequenz,
translatiert von der 700 bp DNA-Sequenz unmittelbar 3' zum Endonucleasegen,
wurde mit den konservierten Aminosäuremotiven verschiedener bekannter
Methylasetypen verglichen und es konnten keine zu diesen Motiven
homologen Aminosäuresequenzen
identifiziert werden. Ebenso konnten keine offensichtlichen Methylasemotive
anhand der von der 200 bp DNA-Sequenz unmittelbar 5' neben dem Endonucleasegen
translatierten 6-Frame-Aminosäuresequenz
gefunden werden. Zum Lokalisieren eines möglichen PmeI Methylasegens
wurde die DNA-Region, die von beiden Seiten des Endonucleasegens
weiter entfernt gelegen war, in den folgenden Schritten amplifiziert,
kloniert und sequenziert.
-
9. Klonieren von DNA 5' zum PmeI Endonucleasegen:
-
Die
folgende mit Restriktionsendonuclease verdaute, zirkularisierte
Pseudomonas mendocina DNA aus Abschnitt 5 wurde als Matrize zur
inversen PCR-Amplifikation verwendet: Apol, Eagl, BssHII, BsrF,
HaeII und BstYI. Die nachfolgend dargestellten Primer PmeI-IP6 und
PmeI-IP7 wurden so gestaltet, dass sie innerhalb und in Richtung
auf das 5'-Ende des PmeI Endonucleasegens
anlagerten. Beide Primer enthielten einen PstI Ort, um das Klonieren
zu erleichtern.
-
-
In
der Reaktion, die das Produkt erfolgreich amplifizierte, wurde ein
Reaktionsgemisch durch Kombinieren der folgenden Bestandteile hergestellt:
10 μl 10X
Vent® Reaktionspuffer
(mit 2 mM Mg++ Endkonzentration)
6 μl 4 mM dNTP-Lösung
5 μl phosphorylierter
Primer PmeI-IP6
5 μl
phosphorylierter Primer PmeI-IP7
12 μl zirkularisierte DNA-Matrize
(etwa 25 ng)
58 μl
dH2O
2 μl (4 Einheiten) Vent® Exo-Polymerase
NEB Nr. 257
-
Die
PCR-Amplifikationsbedingungen waren wie folgt: 1 Zyklus bei 95°C (2 min)
und anschließend
5 Zyklen bei 95°C
(20 sec), 50°C
(1 min) und 72°C
(2,5 min), gefolgt von 20 Zyklen bei 95°C (30 sec), 65°C (1 min)
und 72°C
(2,5 min). 15 μl
der PCR-Reaktion wurden durch Elektrophorese auf einem 0,8 % Agarosegel analysiert.
-
Von
gewisser unspezifischer amplifizierter Hintergrund-DNA wurden die
folgenden Produkte beobachtet: ein 1,8 kb Produkt in der PCR-Reaktion
mit ApoI zirkulärer
Matrize; ein 1,6 kb Produkt in der PCR-Reaktion mit BssHII zirkulärer Matrize;
ein 3,3 kb Produkt in der PCR-Reaktion mit BstYI zirkulärer Matrize;
ein 1,6 kb Produkt in der PCR-Reaktion mit EagI zirkulärer Matrize
und ein 0,9 kb Produkt in der PCR-Reaktion mit HaeII zirkulärer Matrize.
Diese fünf
Produkte wurden gelgereinigt und in 60 μl 1XTE resuspendiert (das BstYI
Produkt wurde in 20 μl
1XTE resuspendiert). 5 μl
gelgereinigtes ApoI Produkt wurden mit 100 ng Vektor pUC19, der zuvor
mit SmaI gespalten, mit CIP dephosphoryliert und mit Agarose gelgereinigt
wurde, unter Verwendung von 400 U T4 DNA-Ligase in 20 μl Endvolumen
von 1X T4 DNA-Ligasepuffer 2 Stunden lang bei 16°C ligiert. Die gelgereinigten
BssHII, EagI, HaeII und BstYI Produkte wurden ebenfalls wie oben
beschrieben in pUC19 ligiert. 10 μl
jedes Ligationsgemischs wurden in den E. coli Stamm ER2267 transformiert
und auf L-Nährlösungsplatten
mit 100 μg/ml
Ampicillin, 40 μg/ml
Xgal und 50 μg/ml
IPTG für
individuelle Kolonien plattiert. Weiße Kolonien wurden individuell
aufgenommen, um 10 ml L-Nährlösung mit
100 μg/ml
Ampicillin zu inokulieren, und über
Nacht bei 37°C
vermehren gelassen. Klone des gewünschten Konstrukts wurden identifiziert,
indem Miniprep-Verfahren durchgeführt wurden, die gereinigte
DNA verdaut und durch Agarosegelelektrophorese analysiert wurde.
-
10. Sequenzieren von DNA
5' zum Endonucleasegen:
-
Die
Konstrukte mit gewünschten
Inserts aus Abschnitt 9 wurden mit den M13/pUC Primern Nr. 1233 und
Nr. 1224 (NEB) mit dem ABI 373 automatisierten Sequenzierungssystem
gemäß Herstelleranweisungen sequenziert.
Miniprep-DNA-Präparate
der Konstrukte wurden als Matrizen verwendet. Die Enden des amplifizierten
3,3 kb Produkts von der BstYI zirkularisierten Matrize und das amplifizierte
0,9 kb Produkt von der HaeII zirkularisierten Matrize stimmten mit
der bekannten DNA-Region 3' zu
den inversen PCR-Primern PmeI-IP6 und PmeI-IP7 überein. Die komplette Sequenz
wurde durch Primer-Walking und Sequenzierung erhalten. Das 3,3 kb
Produkt enthielt 2,9 kb neue DNA-Sequenz und das 0,9 kb Produkt
enthielt 200 bp neue DNA-Sequenz. Es wurden keine offensichtlichen
Methylasemotive in der neuen DNA-Sequenz beobachtet.
-
11. Amplifizieren und
Klonieren von DNA 3' zum
Endonucleasegen:
-
Es
wurden zwei konsekutive inverse PCR-Amplifikationsexperimente durchgeführt, um
DNA-Informationen
3' zum Endonucleasegen
zu erhalten.
-
A. Inverse PCR-Amplifikation
Nr. 1:
-
Matrizenpräparation
für inverse
PCR-Amplifikation: 3 μg
genomische Pseudomonas mendocina DNA wurden mit 100 U AatII Restriktionsendonuclease
in 1X NEBuffer Nr. 4 (20 mM Tris-Acetat,
10 mM Magnesiumacetat, 50 mM Kaliumacetat, 1 mM DTT, pH 7,9) in
100 μl Reaktionsvolumen
1 Stunde lang bei 37°C
verdaut. Das Restriktionsverdaugemisch wurde mit einem Volumen von äquilibriertem
Phenol:Chloroform (50:50, v/v) extrahiert, und die wässrige Phase
wurde gewonnen und zweimal mit einem Volumen Chloroform extrahiert.
Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen 5 M NaCl und 1 Volumen
2-Propanol präzipitiert
und dann mit 70%igem eiskaltem Ethanol gewaschen. Die DNA wurde
in 50 μl
1XTE resuspendiert. 10 μl
dieser verdauten Pseudomonas mendocina DNA (etwa 0,5 μg) wurden
in 500 μl
1X Ligasepuffer mit 2000 U T4 DNA-Ligase bei 16°C über Nacht zirkularisiert. Zirkularisierte,
mit Hinp1I, MscI, MseI, SacI, StuI und Tsp509I verdaute Pseudomonas
mendocina DNA wurde in der gleichen Weise präpariert. Diese zirkularisierte
DNA sowie die mit BsaHI verdaute, zirkularisierte DNA aus Abschnitt
5 wurden als Matrizen in nachfolgenden inversen PCR-Reaktionen verwendet.
-
Die
Primer PmeI-IP8 und PmeI-IP9 mit den nachfolgend dargestellten Sequenzen
wurden zum Amplifizieren von DNA 3' zum Endonucleasegen verwendet. Beide
Primer enthielten einen PstI Ort, um die Klonierung zu erleichtern:
-
In
einer Reaktion, die erfolgreich das Produkt amplifizierte, wurde
ein Reaktionsgemisch durch Kombinieren der folgenden Bestandteile
hergestellt:
10 μl
10X Vent® Reaktionspuffer
(mit 2 mM Mg++ Endkonzentration)
6 μl 4 mM dNTP-Lösung
5 μl phosphorylierter
Primer PmeI-IP8
5 μl
phosphorylierter Primer PmeI-IP9
12 μl zirkularisierte DNA-Matrize
(etwa 25 ng)
58 μl
dH2O
2 μl (4 Einheiten) Vent® Exo-Polymerase
NEB Nr. 257
-
Die
PCR-Amplifikationsbedingungen waren wie folgt: 1 Zyklus bei 95°C (2 min)
und anschließend
5 Zyklen bei 95°C
(20 sec), 52°C
(30 sec) und 72°C
(2,5 min), gefolgt von 20 Zyklen bei 95°C (30 sec), 65°C (30 sec)
und 72°C
(2,5 min). 15 μl
der PCR-Reaktion wurden durch Elektrophorese auf einem 0,8 % Agarosegel analysiert.
-
Von
gewisser unspezifischer amplifizierter Hintergrund-DNA wurden die
folgenden Produkte beobachtet: ein 1,1 kb Produkt in der PCR-Reaktion
mit AatII zirkulärer
Matrize, ein 1,4 kb Produkt in der PCR-Reaktion mit MscI zirkulärer Matrize
und ein 0,7 kb Produkt in der PCR-Reaktion mit BsaHI zirkulärer Matrize.
Diese Produkte wurden gelgereinigt und in 20 μl 1XTE resuspendiert. 2 μl des gelgereinigten
AatII Produkts wurden mit 100 ng des Vektors pUC19, der zuvor mit
SmaI gespalten, mit CIP dephosphoryliert und mit Agarose gelgereinigt
wurde, unter Verwendung von 400 U T4 DNA-Ligase in einem 20 μl Endvolumen
von 1X T4 DNA-Ligasepuffer 2 Stunden lang bei 16°C ligiert. Die gelgereinigten
MscI und BsaHI Produkte wurden ebenfalls wie oben beschrieben in
pUC19 ligiert. 10 μl
jedes Ligationsgemischs wurden in den E. coli Stamm ER2267 transformiert und
auf L-Nährlösungsplatten
mit 100 μg/ml
Ampicillin, 40 μg/ml
Xgal und 50 μg/ml
IPTG für
individuelle Kolonien plattiert. Weiße Kolonien wurden einzeln
aufgenommen, um 10 ml L-Nährlösung mit
100 μg/ml
Ampicillin zu inokulieren, und über
Nacht bei 37°C
unter Rühren
und Belüften
vermehren gelassen. Klone des gewünschten Konstrukts wurden identifiziert,
indem Miniprep-Verfahren durchgeführt wurden, die gereinigte
DNA verdaut und durch Agarosegelelektrophorese analysiert wurde.
Die amplifizierten Produkte in diesen Klonen wurden mit den M13/pUC
Primern Nr. 1233 und Nr. 1224 (NEB) sequenziert. Die neu erhaltene
DNA-Sequenz wurde zum Entwerfen der nachfolgend dargestellten Primer
PmeI-IP10 und PmeI-IP11 in einer nachfolgenden inversen PCR-Amplifikation verwendet,
um mehr DNA-Sequenzinformationen 3' zu dieser Region zu erhalten.
-
-
B. Inverse PCR-Amplifikation
Nr. 2:
-
Mit
HaeII verdaute und zirkularisierte Pseudomonas mendocina DNA (Abschnitt
5) wurde als Matrize in dieser inversen PCR-Amplifikation mit den
Primern PmeI-IP10 und PmeI-IP11 verwendet. In einer Reaktion, die
das Produkt erfolgreich amplifizierte, wurde ein Reaktionsgemisch
durch Kombinieren der folgenden Bestandteile hergestellt:
10 μl 10X Vent® Reaktionspuffer
(mit 2 mM Mg++ Endkonzentration)
6 μl 4 mM dNTP-Lösung
5 μl phosphorylierter
Primer PmeI-IP10
5 μl
phosphorylierter Primer PmeI-IP11
12 μl zirkularisierte DNA-Matrize
(etwa 25 ng)
58 μl
dH2O
2 μl (4 Einheiten) Vent® Exo-Polymerase
NEB Nr. 257
-
Die
PCR-Amplifikationsbedingungen waren wie folgt: 1 Zyklus bei 95°C (2 min)
und anschließend
5 Zyklen bei 95°C
(20 sec), 60°C
(30 sec) und 72°C
(2,5 min), gefolgt von 20 Zyklen bei 95°C (30 sec), 65°C (30 sec)
und 72°C
(2,5 min). 15 μl
der PCR-Reaktion wurden durch Elektrophorese auf einem 0,8 % Agarosegel analysiert.
Es wurde ein amplifiziertes 0,7 kb Produkt erhalten und in pUC19
kloniert, der zuvor durch SmaI gespalten, mit CIP dephosphoryliert
und mit Agarose gelgereinigt wurde. Miniprep-Verfahren fanden zum
Identifizieren von Plasmidklonen statt, die die gewünschten
Inserts beinhalteten. Das 0,7 kb Produkt wurde mit den M13/pUC Primern
Nr. 1233 und Nr. 1224 (NEB) sequenziert. Eine etwa 1,57 kb DNA-Sequenz
wurde 3' zum Endonucleasegen
erhalten und es konnten keine offensichtlichen Methylasemotive anhand
der 6-Frame-Rminosäuretranslation
dieser DNA gefunden werden.
-
12.
Exprimieren von DraI Methylase im Vektor pNEB193, um zu bestimmen,
ob durch DraI Methylase modifizierte DNA vor PmeI Restriktionsverdau
geschützt
werden kann: Ein DraI Methylase produzierender Klon, pDraIRM9.7-G2,
der das DraI Methylasegen auf einem 5,5 kb Insert im Vektor pBR322
(Jacker Benner, New England Biolabs, Inc.) enthielt, wurde mit Sau3AI
wie folgt teilweise verdaut: 7 μg
pDraIRM9.7-G2 DNA wurde in 350 μl
1X Sau3AI Puffer (100 mM NaCl, 10 mM Bis-Tris-Propan-HCl, 10 mM
MgCl2, 1 mM DTT, pH 7,0) verdünnt. Dieses
Gemisch wurde zum Präparieren
einer seriellen Verdünnung
von Sau3AI Restriktionsendonuclease von 1 Einheit/μg DNA auf
1/64 Einheit/μg
DNA mit einem Faktor von zwei je Verdünnung in einem Endvolumen von
50 μl verwendet.
Diese Reaktionen wurden 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert und die Sau3AI Restriktionsendonuclease
wurde anschließend
20 Minuten lang bei 68°C
durch Hitze abgetötet.
0,5 μg der
verdauten DNA, die durch den Verdau von 1/8 Einheiten von Sau3AI
je μg DNA
erzeugt wurde, wurden mit 200 μg
pNEB193 Vektor, der zuvor mit BamHI gespalten und mit CIP dephosphoryliert
wurde, in 40 μl
1X T4 DNA-Ligasepuffer mit 800 U T4 DNA-Ligase 16 Stunden lang bei
16°C ligiert.
Das Ligationsgemisch wurde in 200 μl kompetente Zellen des E. coli
Stamms ER2426 transformiert und auf L-Nährlösungsplatten mit 100 μg/ml Ampicillin
plattiert. Es wurden etwa 10.000 Kolonien erhalten, die in 6 ml
10 mM Tris, 10 mM MgCl2, pH 7,5, geschabt
wurden. 2 ml dieses Pools wurden in 100 ml L-Nährlösung mit 100 μg/ml Ampicillin
inokuliert und 8 Stunden lang unter Schütteln bei 37°C wachsen
gelassen. Plasmide wurden mit einer 10fachen Maßstabsvergrößerung des Miniprep-Verfahrens
wie in Abschnitt 5 oben beschrieben isoliert. Die Miniprep-DNA wurde in
500 μl 1XTE
resuspendiert und 2 μl
wurden mit 40 Einheiten DraI in 50 μl 1X NEBuffer 4 bei 37°C 2 Stunden lang
verdaut. 10 μl
des Verdaugemischs wurden in 50 μl
kompetente Zellen des E. coli Stamms ER 2426 transformiert und auf
L-Nährlösungsplatten
mit 100 μg/ml
Ampicillin plattiert. Plasmide von 9 individuellen Transformanten
wurden mit dem Miniprep-Verfahren isoliert und mit DraI Restriktionsendonuclease
verdaut. Acht Klone wurden völlig
vor DraI Verdau geschützt.
Diese wurden anschließend
mit PmeI Restriktionsendonuclease verdaut und auch völlig vor
PmeI Restriktionsverdau geschützt.
-
13. Überexpression der PmeI Endonuclease:
-
A. Klonieren der DraI
Methylase auf einem kompatiblen Vektor:
-
Das
DraI Methylasegen wurde durch Einsetzen des Gens in den BamHI Ort
von pACYC184 exprimiert. Um dies zu erreichen, wurden 0,5 μg der im
Abschnitt 12 präparierten
und mit Sau3AI teilweise verdauten pDraIRM9.7-G2 DNA in den Vektor
pACYAC184, der zuvor mit BamHI gespalten und dephosporyliert wurde, in
40 μl 1X
T4 DNA-Ligasepuffer mit 800 U T4 DNA-Ligase 2 Stunden lang bei 16°C ligiert.
Das Ligationsgemisch wurde in 200 μl kompetente Zellen des E. coli
Stammes ER2426 transformiert und auf L-Nährlösungsplatten mit 25 μg/ml Chloramphenicol
plattiert. Es wurden etwa 1600 Kolonien erhalten, die in 4 ml 10
mM Tris, 10 mM MgCl2, pH 7,5 geschabt wurden.
1 ml dieses Pools wurde in 75 ml L-Nährlösung mit 25 μg/ml Chloramphenicol
inokuliert und 8 Stunden lang unter Schütteln bei 37°C wachsen
gelassen. Plasmide wurden mit einer 10fachen Maßstabsvergrößerung des Miniprep-Verfahrens
wie in Schritt 5 oben beschrieben isoliert. Die Miniprep- DNR wurde in 500 μl 1XTE resuspendiert
und 5 Minuten lang bei 14.000 rpm zentrifugiert. 336 μl des geklärten Überstands
wurden mit 64 μl
5 M NaCl und 400 μl
von 13 PEG 8000 vermischt und 1 Stunde lang auf Eis inkubiert. Die
DNA wurde bei 14.000 rpm und 4°C
5 Minuten lang geschleudert, mit eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen
und an der Luft getrocknet. Das DNA-Pellet wurde in 500 μl 1XTE resuspendiert
und 5 μl davon
wurden mit 60 Einheiten DraI in 50 μl 1X NEBuffer 4 1 Stunde lang
bei 37°C
verdaut. 5 μl
dieser mit DraI verdauten DNR wurden in 50 μl kompetente ER2426 Zellen transformiert
und auf L-Nährlösungsplatten
mit 25 μg/ml
Chloramphenicol plattiert, um individuelle Transformanten zu erhalten.
Plasmide von 14 individuellen Transformanten wurden mit dem Miniprep-Verfahren
isoliert und mit DraI Restriktionsendonuclease verdaut, und von
diesen wurden zwölf
Klone völlig
vor DraI Verdau geschützt.
Eine weitere Restriktionsanalyse zeigte, dass zwei Klone, pACYC184DraIM10
und pACYC184DraIM13, identisch waren und das kleinste Insertfragment
von etwa 3 kb enthielten. Der Klon pACYC184DraIM10 wurde zur PmeI
Endonucleaseexpression verwendet.
-
B. Endonucleaseklonierung:
-
Das
Restriktionsendonucleasegen wurde durch Einsetzen des Gens in den
Expressionsvektor pRRS direkt stromabwärts eines starken induzierbaren
Promotors (PlacUV5) und einer allgemein erkannten Ribosomenbindungsstelle
exprimiert. Um dies zu erreichen, wurden zwei Oligonucleotidprimer
unter Verwendung der DNA- Sequenzdaten hergestellt. Der Oligonucleotid-Vorwärtsprimer
enthielt einen PstI Ort zum Erleichtern der Klonierung, ein Stoppcodon „in-frame" mit dem lacZ Gen,
um die Translation des lacZ Proteins zu beenden, eine allgemein
erkannte Ribosomenbindungsstelle, sieben Nucleotid-Spacer zwischen
der Ribosomenbindungsstelle und dem ATG Startcodon des PmeI Endonucleasegens
und 24 Nucleotide, komplementär
zur Pseudomonas mendocina DNA zur Hybridisierung:
-
Der
Rückwärtsprimer
war so gestaltet, dass er mit Pseudomonas mendocina DNA 84 bp 3' zum 3'-Ende des PmeI Endonucleasegens
hybridisierte. Er enthielt einen BglII Ort und einen SalI Restriktionsort
zur Erleichterung der Klonierung und 21 Nucleotide, komplementär zur Pseudomonas
mendocina DNA zur Hybridisierung:
-
Diese
beiden Primer würden
zum Amplifizieren des PmeI Endonucleasegens von Pseudomonas mendocina
Genom-DNA durch Kombinieren der folgenden Bestandteile verwendet:
10 μl 10X Vent® Reaktionspuffer
6 μl 4 mM dNTPs
2 μl (400 ng)
Pseudomonas mendocina Genom-DNA
5 μl (10 μM Stamm) Primer PmeIRexp1
5 μl (10 μM Stamm)
Primer PmeIRexp2
4 μ 100
mM MgSO4
66 μl dH2O
0,6 μl (1,2 Einheiten)
Vent® Polymerase
(2 Einheiten/μl
Stamm)
wobei die Amplifikation 1 Zyklus bei 95°C (3 min)
und dann 4 Zyklen bei 95°C
(30 sec), 60°C
(20 sec), 72°C (50
sec), gefolgt von 20 Zyklen bei 95°C (30 sec), 65°C (20 sec)
und 72°C
(50 sec) umfasste. Das Amplifikationsprodukt von etwa 850 bp wurde
gelgereinigt, mit BglII und PstI gespalten, mit Phenol-Chloroform
extrahiert, präzipitiert,
in TE resuspendiert und in den pRRS Vektor ligiert, der zuvor mit
PstI und BamHI gespalten und gelgereinigt wurde. Die Ligationsreaktion
wurde in den E. coli Stamm ER2426 transformiert, der das DraI Methylasegenkonstrukt
pACYC184DraIM10 trug, und auf L-Nährlösungsplatten mit 25 μg/ml Chloramphenicol und
100 μg/ml
Ampicillin für
individuelle Transformanten plattiert. Sieben individuelle Transformanten
wurden in 10 ml L-Nährlösung mit
25 μg/ml
Chloramphenicol und 100 μg/ml
Ampicillin inokuliert und unter Schütteln bei 37°C bis zur
mid-log-Phase vermehrt und mit 0,5 mM IPTG 16 Stunden lang induziert.
Die Zellpellets wurden bei 5000 rpm und 4°C 5 Minuten lang geschleudert,
in 1,5 ml 20 mM Tris, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, pH 7,5,
resuspendiert und beschallt. Mit den Extrakten wurde Lambda-DNA
in 50 μl
1X NEBuffer Nr. 2 (10 mM Tris, 10 mM MgCl2,
50 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,9) 30 Minuten lang bei 37°C verdaut.
Alle Klone exprimierten PmeI Endonucleaseaktivität. Einer dieser Klone mit der
Bezeichnung pRRSPmeIR1/pACYC184DraIM10 wurde zur Herstellung der
PmeI Endonuclease ausgewählt
und erhielt die Stammbezeichnung NEB Nr. 1081. Eine Titration der
PmeI Restriktionsendonucleaseaktivität, erzeugt von Rohextrakten
von NEB Nr. 1081, ist in 1 dargestellt. Der Enzymtiter
betrug etwa 1 × 107 Einheiten/g Zellen.
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14.
Die PmeI Restriktionsendonuclease kann von NEB Nr. 1081 durch Vermehren
bis zur mid-log-Phase in einem Fermenter mit L-Nährlösungsmedium mit Ampicillin
(100 μg/ml)
und Chloramphenicol (25 μg/ml) hergestellt
werden. Die Kultur wird durch Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration
von 0,3 mM induziert und 16 Stunden lang weiter wachsen gelassen.
Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und können bei –70°C aufbewahrt
oder sofort verwendet werden.
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15.
Die Reinigung der PmeI Restriktionsendonuclease von NEB Nr. 1081
kann durch eine Kombination von standardmäßigen Proteinreinigungstechniken
erfolgen, wie Affinitätschromatographie
oder Ionenaustauschchromatographie, wie in Schritt 2 oben dargelegt.
Die aus dieser Reinigung erhaltene PmeI Restriktionsendonuclease
ist im Wesentlichen rein und frei von unspezifischer Endonuclease-
und Exonucleaseverunreinigung.
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Eine
Probe von E. coli mit pRRSPmeIR1 und pACYC184DraIM10 (NEB NR. 1081)
wurde am 25. November 1997 unter den Bedingungen des Budapester
Vertrags bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung mit der ATCC-Beitrittsnummer 98596
hinterlegt.
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