JPH11206394A - ＰｍｅＩ制限エンドヌクレア―ゼのクロ―ニング方法および製造法 - Google Patents
ＰｍｅＩ制限エンドヌクレア―ゼのクロ―ニング方法および製造法Info
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- JPH11206394A JPH11206394A JP10315808A JP31580898A JPH11206394A JP H11206394 A JPH11206394 A JP H11206394A JP 10315808 A JP10315808 A JP 10315808A JP 31580898 A JP31580898 A JP 31580898A JP H11206394 A JPH11206394 A JP H11206394A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 制限エンドヌクレアーゼPmeＩの製造
【解決手段】 PmeI制限エンドヌクレアーゼと修飾メチ
ラーゼとをコードする組換えDNA、および該組換えDNAか
らのPmeI制限エンドヌクレアーゼの製造。
ラーゼとをコードする組換えDNA、および該組換えDNAか
らのPmeI制限エンドヌクレアーゼの製造。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、シュードモナス・
メンドシナ（Pseudomonas mendocina）（NEB#698）から
入手可能なPmeI制限エンドヌクレアーゼの同定、PmeI制
限エンドヌクレアーゼをコードする組換えDNA、および
該組換えDNAからのPmeI制限エンドヌクレアーゼの製造
に関する。
メンドシナ（Pseudomonas mendocina）（NEB#698）から
入手可能なPmeI制限エンドヌクレアーゼの同定、PmeI制
限エンドヌクレアーゼをコードする組換えDNA、および
該組換えDNAからのPmeI制限エンドヌクレアーゼの製造
に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】II型
制限エンドヌクレアーゼは、細菌内に天然に存在する酵
素のクラスである。それを他の細菌成分から精製する場
合には、分子クローニングおよび遺伝子の特徴づけのた
めの厳密な断片にDNA分子を切断するために、制限エン
ドヌクレアーゼを実験室内で使用することができる。
制限エンドヌクレアーゼは、細菌内に天然に存在する酵
素のクラスである。それを他の細菌成分から精製する場
合には、分子クローニングおよび遺伝子の特徴づけのた
めの厳密な断片にDNA分子を切断するために、制限エン
ドヌクレアーゼを実験室内で使用することができる。
【０００３】制限エンドヌクレアーゼは、DNA分子に沿
った特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識し
それに結合することにより作用する。それは、一旦結合
すると、認識配列内の分子またはその一方の側の分子を
切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは、異なる認
識配列に対する親和性を有する。現在までに調べられて
いる数百の細菌種のうち、特有の特異性を有する180個
を超える制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
った特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識し
それに結合することにより作用する。それは、一旦結合
すると、認識配列内の分子またはその一方の側の分子を
切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは、異なる認
識配列に対する親和性を有する。現在までに調べられて
いる数百の細菌種のうち、特有の特異性を有する180個
を超える制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
【０００４】細菌は、1種あたり大目に見ても少数の制
限エンドヌクレアーゼしか有さない傾向がある。エンド
ヌクレアーゼは、典型的には、それが由来する細菌に基
づき命名される。例えば、デイノコッカス・ラジオフィ
ルス（Deinococcus radiophilus）なる種は、Dral、Dra
IIおよびDraIIIと称される3つの異なる制限エンドヌク
レアーゼを合成する。これらの酵素は、それぞれ配列TT
TAAA、PuGGNCCPyおよびCACNNNGTGを認識し切断する。一
方、大腸菌（Escherichia coli）RY13は、配列GAATTCを
認識する酵素EcoRIを唯一合成する。
限エンドヌクレアーゼしか有さない傾向がある。エンド
ヌクレアーゼは、典型的には、それが由来する細菌に基
づき命名される。例えば、デイノコッカス・ラジオフィ
ルス（Deinococcus radiophilus）なる種は、Dral、Dra
IIおよびDraIIIと称される3つの異なる制限エンドヌク
レアーゼを合成する。これらの酵素は、それぞれ配列TT
TAAA、PuGGNCCPyおよびCACNNNGTGを認識し切断する。一
方、大腸菌（Escherichia coli）RY13は、配列GAATTCを
認識する酵素EcoRIを唯一合成する。
【０００５】実際には、制限エンドヌクレアーゼは、細
菌細胞の繁殖において防御的な役割を果たしていると考
えられる。制限エンドヌクレアーゼのおかげで、細菌は
ウイルス、プラスミドなどの外来DNA分子による感染に
抵抗することができ、もしそれが無ければ、細菌は該外
来DNA分子に破壊されるか寄生されることとなろう。制
限エンドヌクレアーゼは、認識配列が生じるたびに侵入
性外来DNA分子を切断することにより抵抗性を付与す
る。生じる切断は、該感染遺伝子の多数を不能にし、該
DNAを非特異的ヌクレアーゼによる更なる分解に感受性
にする。
菌細胞の繁殖において防御的な役割を果たしていると考
えられる。制限エンドヌクレアーゼのおかげで、細菌は
ウイルス、プラスミドなどの外来DNA分子による感染に
抵抗することができ、もしそれが無ければ、細菌は該外
来DNA分子に破壊されるか寄生されることとなろう。制
限エンドヌクレアーゼは、認識配列が生じるたびに侵入
性外来DNA分子を切断することにより抵抗性を付与す
る。生じる切断は、該感染遺伝子の多数を不能にし、該
DNAを非特異的ヌクレアーゼによる更なる分解に感受性
にする。
【０００６】細菌の防御系のもう1つの成分は、修飾メ
チラーゼである。これらの酵素は、制限エンドヌクレア
ーゼを補完するものであり、細菌がそれ自身のDNAを保
護しそれを外来感染性DNAから識別するのを可能にする
手段を、修飾メチラーゼは提供する。修飾メチラーゼ
は、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列を
認識しそれに結合するが、該DNAを切断することはな
く、メチル基の付加により配列内のいずれかのヌクレオ
チドを化学修飾する。メチル化後にはもはや、該認識配
列は制限エンドヌクレアーゼに切断されない。細菌細胞
のDNAは、その修飾メチラーゼの活性により常に修飾さ
れる。したがって、それは、内因性制限エンドヌクレア
ーゼの存在には不感受性である。制限エンドヌクレアー
ゼの認識および切断に対して感受性なのは、未修飾であ
り従って識別されうる外来DNAのみである。
チラーゼである。これらの酵素は、制限エンドヌクレア
ーゼを補完するものであり、細菌がそれ自身のDNAを保
護しそれを外来感染性DNAから識別するのを可能にする
手段を、修飾メチラーゼは提供する。修飾メチラーゼ
は、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列を
認識しそれに結合するが、該DNAを切断することはな
く、メチル基の付加により配列内のいずれかのヌクレオ
チドを化学修飾する。メチル化後にはもはや、該認識配
列は制限エンドヌクレアーゼに切断されない。細菌細胞
のDNAは、その修飾メチラーゼの活性により常に修飾さ
れる。したがって、それは、内因性制限エンドヌクレア
ーゼの存在には不感受性である。制限エンドヌクレアー
ゼの認識および切断に対して感受性なのは、未修飾であ
り従って識別されうる外来DNAのみである。
【０００７】遺伝子工学技術の出現に伴い、遺伝子をク
ローニングしたり、それがコードするタンパク質および
酵素を、通常の精製技術で得られるより多量に製造する
ことが、現在では可能となっている。制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子のクローンを単離する際に鍵となるのは、
複雑な「ライブラリー」（すなわち、「ショットガン」
法により誘導されるクローンの集団）内の該クローン
を、それが10-3~10-4の頻度でしか存在しない場合に同
定するための簡便かつ信頼しうる方法を開発することで
ある。好ましくは、望ましくない大部分のクローンが破
壊され、望ましい希少クローンが生存するように、その
ような方法は選択的であるべきである。
ローニングしたり、それがコードするタンパク質および
酵素を、通常の精製技術で得られるより多量に製造する
ことが、現在では可能となっている。制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子のクローンを単離する際に鍵となるのは、
複雑な「ライブラリー」（すなわち、「ショットガン」
法により誘導されるクローンの集団）内の該クローン
を、それが10-3~10-4の頻度でしか存在しない場合に同
定するための簡便かつ信頼しうる方法を開発することで
ある。好ましくは、望ましくない大部分のクローンが破
壊され、望ましい希少クローンが生存するように、その
ような方法は選択的であるべきである。
【０００８】II型制限−修飾系は、頻度を増加させてク
ローニングされている。クローニングされた最初の系で
は、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択
するための手段としてバクテリオファージの感染が用い
られた（EcoRII: Kosykhら,Molec. Gen. Genet 178:717
-719 (1980); HhaII: Mannら, Gene 3:97-112 (1978);
PstI: Walderら, Proc. Nat. Acad. Sci. 78:1503-1507
(1981)）。細菌内の制限−修飾系の存在により該細菌
はバクテリオファージの感染に抵抗することができるた
め、クローニングされる制限−修飾遺伝子を保持する細
胞は、原則として、ファージにさらされたライブラリー
からの生存体として選択的に単離することができる。し
かしながら、この方法は、限られた価値しか有していな
いことが判明している。特に、クローニングされる制限
−修飾遺伝子は、選択的な生存性を付与するのに十分な
ファージ抵抗性を常に現すわけではないことが判明して
いる。
ローニングされている。クローニングされた最初の系で
は、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択
するための手段としてバクテリオファージの感染が用い
られた（EcoRII: Kosykhら,Molec. Gen. Genet 178:717
-719 (1980); HhaII: Mannら, Gene 3:97-112 (1978);
PstI: Walderら, Proc. Nat. Acad. Sci. 78:1503-1507
(1981)）。細菌内の制限−修飾系の存在により該細菌
はバクテリオファージの感染に抵抗することができるた
め、クローニングされる制限−修飾遺伝子を保持する細
胞は、原則として、ファージにさらされたライブラリー
からの生存体として選択的に単離することができる。し
かしながら、この方法は、限られた価値しか有していな
いことが判明している。特に、クローニングされる制限
−修飾遺伝子は、選択的な生存性を付与するのに十分な
ファージ抵抗性を常に現すわけではないことが判明して
いる。
【０００９】クローニングのためのもう１つのアプロー
チは、プラスミドを保持することが初めに確認された系
を大腸菌（E. coli）クローニングプラスミド中に導入
することを含むものである（EcoRV: Bougueleretら, Nu
cl. Acid. Res. 12:3659-3676 (1984); PaeR7: Gingera
sおよびBrooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:402-4
06 (1983); TheriaultおよびRoy, Gene 19:355-359 (19
82); PvuII: Blumenthalら, J. Bacteriol. 164:501-50
9 (1985)）。
チは、プラスミドを保持することが初めに確認された系
を大腸菌（E. coli）クローニングプラスミド中に導入
することを含むものである（EcoRV: Bougueleretら, Nu
cl. Acid. Res. 12:3659-3676 (1984); PaeR7: Gingera
sおよびBrooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:402-4
06 (1983); TheriaultおよびRoy, Gene 19:355-359 (19
82); PvuII: Blumenthalら, J. Bacteriol. 164:501-50
9 (1985)）。
【００１０】ますます多数の系のクローニングに用いら
れているもう1つのアプローチは、活性メチラーゼ遺伝
子に関する選択を含むものである（米国特許第5,200,33
3号およびBsuRI: Kissら, Nucl. Acid. Res. 13:6403-6
421 (1985)）。制限遺伝子と修飾遺伝子とは、しばし
ば、密接に連鎖しているため、両遺伝子を同時にクロー
ニングできることが多い。しかしながら、この選択は、
常に完全な制限系を与えるわけではなく、メチラーゼ遺
伝子しか与えないことがある（BspRI: Szomolanyiら, G
ene 10:219-225 (1980); Bcn I: Janulaitisら, Gene 2
0:197-204 (1982); Bsu RI: KissおよびBaldauf, Gene
21:111-119 (1983);およびMsp I: Walderら, J. Biol.
Chem. 258:235-1241 (1983)）。
れているもう1つのアプローチは、活性メチラーゼ遺伝
子に関する選択を含むものである（米国特許第5,200,33
3号およびBsuRI: Kissら, Nucl. Acid. Res. 13:6403-6
421 (1985)）。制限遺伝子と修飾遺伝子とは、しばし
ば、密接に連鎖しているため、両遺伝子を同時にクロー
ニングできることが多い。しかしながら、この選択は、
常に完全な制限系を与えるわけではなく、メチラーゼ遺
伝子しか与えないことがある（BspRI: Szomolanyiら, G
ene 10:219-225 (1980); Bcn I: Janulaitisら, Gene 2
0:197-204 (1982); Bsu RI: KissおよびBaldauf, Gene
21:111-119 (1983);およびMsp I: Walderら, J. Biol.
Chem. 258:235-1241 (1983)）。
【００１１】メチラーゼ遺伝子およびエンドヌクレアー
ゼ遺伝子をクローニングするためのもう1つの方法は、D
NA損傷に関する比色アッセイに基づくものである（米国
特許第5,498,535号）。メチラーゼに関するスクリーニ
ングの場合には、該プラスミドライブラリーを、AP1-20
0などの宿主大腸菌（E. coli）株中に形質転換する。メ
チラーゼの発現は、McrA+、McrBC+またはMrr+である大
腸菌（E. coli）株内でSOS応答反応を誘導するであろ
う。AP1-200株は、McrおよびMrr系に関して温度感受性
であり、損傷で誘導されうる大腸菌（E. coli）dinD遺
伝子座と融合したlac-Z遺伝子を含む。メチラーゼ遺伝
子またはエンドヌクレアーゼ遺伝子をコードする組換え
プラスミドの検出は、lacZ遺伝子の制限温度での誘導に
基づく。メチラーゼ遺伝子をコードする形質転換体は、
X-galを含有するLB寒天プレート上で青色コロニーとし
て検出される（Piekarowiczら, Nucleic Acids Res. 1
9:1831-1835 (1991)およびPiekarowicaら, J. Bacterio
logy 173:150-155 (1991)）。同様に、大腸菌（E. col
i）ER1992株は、dinD1-Lac Z融合体を含有するが、メチ
ル化に依存する制限系であるMcrA、McrBCおよびMrrを欠
いている。この系（「エンドブルー（endoblue）」法と
称される）では、エンドヌクレアーゼが宿主細胞DNAを
損傷してSOS応答を誘導する場合には、該エンドヌクレ
アーゼ遺伝子を、その対応（cognate）メチラーゼの不
存在下で検出することができる。SOS誘導された細胞
は、X-galで補足されたLB寒天プレート上に濃青色のコ
ロニーを形成する（Xuら, Nucleic Acids Res. 22:2399
-2403 (1994)）。
ゼ遺伝子をクローニングするためのもう1つの方法は、D
NA損傷に関する比色アッセイに基づくものである（米国
特許第5,498,535号）。メチラーゼに関するスクリーニ
ングの場合には、該プラスミドライブラリーを、AP1-20
0などの宿主大腸菌（E. coli）株中に形質転換する。メ
チラーゼの発現は、McrA+、McrBC+またはMrr+である大
腸菌（E. coli）株内でSOS応答反応を誘導するであろ
う。AP1-200株は、McrおよびMrr系に関して温度感受性
であり、損傷で誘導されうる大腸菌（E. coli）dinD遺
伝子座と融合したlac-Z遺伝子を含む。メチラーゼ遺伝
子またはエンドヌクレアーゼ遺伝子をコードする組換え
プラスミドの検出は、lacZ遺伝子の制限温度での誘導に
基づく。メチラーゼ遺伝子をコードする形質転換体は、
X-galを含有するLB寒天プレート上で青色コロニーとし
て検出される（Piekarowiczら, Nucleic Acids Res. 1
9:1831-1835 (1991)およびPiekarowicaら, J. Bacterio
logy 173:150-155 (1991)）。同様に、大腸菌（E. col
i）ER1992株は、dinD1-Lac Z融合体を含有するが、メチ
ル化に依存する制限系であるMcrA、McrBCおよびMrrを欠
いている。この系（「エンドブルー（endoblue）」法と
称される）では、エンドヌクレアーゼが宿主細胞DNAを
損傷してSOS応答を誘導する場合には、該エンドヌクレ
アーゼ遺伝子を、その対応（cognate）メチラーゼの不
存在下で検出することができる。SOS誘導された細胞
は、X-galで補足されたLB寒天プレート上に濃青色のコ
ロニーを形成する（Xuら, Nucleic Acids Res. 22:2399
-2403 (1994)）。
【００１２】直接メチラーゼ選択方法は、種々の障害の
ため、メチラーゼ（および／またはエンドヌクレアー
ゼ）クローンを産生しないことがある。例えば、Lunnen
ら, Gene, 74(1):25-32 (1988)を参照されたい。修飾に
よる保護が未だなされていない宿主内にエンドヌクレア
ーゼ遺伝子の導入を試みるにあたり、制限−修飾遺伝子
をクローニングする場合に1つの考えられる障害があ
る。メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子と
を、単一のクローンとして一緒に導入する場合には、エ
ンドヌクレアーゼが宿主DNAを切断する機会を得る前
に、メチラーゼが宿主DNAを保護的に修飾しなければな
らない。したがって、場合によっては、まずメチラー
ゼ、ついでエンドヌクレアーゼというように遺伝子を順
次クローニングすることだけが可能かもしれない。
ため、メチラーゼ（および／またはエンドヌクレアー
ゼ）クローンを産生しないことがある。例えば、Lunnen
ら, Gene, 74(1):25-32 (1988)を参照されたい。修飾に
よる保護が未だなされていない宿主内にエンドヌクレア
ーゼ遺伝子の導入を試みるにあたり、制限−修飾遺伝子
をクローニングする場合に1つの考えられる障害があ
る。メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子と
を、単一のクローンとして一緒に導入する場合には、エ
ンドヌクレアーゼが宿主DNAを切断する機会を得る前
に、メチラーゼが宿主DNAを保護的に修飾しなければな
らない。したがって、場合によっては、まずメチラー
ゼ、ついでエンドヌクレアーゼというように遺伝子を順
次クローニングすることだけが可能かもしれない。
【００１３】制限−修飾系をクローニングする場合のも
う1つの障害は、いくつかの大腸菌（E. coli）株が、シ
トシンまたはアデニンの修飾と不利に反応することが認
められることにある。それらは、メチル化シトシン（Ra
leighおよびWilson, Proc.Natl. Acad. Sci., USA 83:9
070-9074 (1986)）またはメチル化アデニン（Heitmanお
よびModel, J. Bact. 196:3243-3250 (1987); Raleigh,
TrimarchiおよびRevel, Genetics, 122:279-296 (198
9), Waite-Reesら, J. Bacteriology, 173:5207-5219
(1991)）を含有するDNAを破壊する系を有する。シトシ
ン特異的またはアデニン特異的なメチラーゼ遺伝子を、
これらの株中に、それら単独で又はそれらの対応エンド
ヌクレアーゼ遺伝子と共に容易にクローニングすること
はできない。この問題を避けるためには、これらの系が
欠損している大腸菌（E. coli）の突然変異株（McrA−
およびMcrB−またはMrr−）を使用する必要がある。
う1つの障害は、いくつかの大腸菌（E. coli）株が、シ
トシンまたはアデニンの修飾と不利に反応することが認
められることにある。それらは、メチル化シトシン（Ra
leighおよびWilson, Proc.Natl. Acad. Sci., USA 83:9
070-9074 (1986)）またはメチル化アデニン（Heitmanお
よびModel, J. Bact. 196:3243-3250 (1987); Raleigh,
TrimarchiおよびRevel, Genetics, 122:279-296 (198
9), Waite-Reesら, J. Bacteriology, 173:5207-5219
(1991)）を含有するDNAを破壊する系を有する。シトシ
ン特異的またはアデニン特異的なメチラーゼ遺伝子を、
これらの株中に、それら単独で又はそれらの対応エンド
ヌクレアーゼ遺伝子と共に容易にクローニングすること
はできない。この問題を避けるためには、これらの系が
欠損している大腸菌（E. coli）の突然変異株（McrA−
およびMcrB−またはMrr−）を使用する必要がある。
【００１４】もう1つの考えられる問題は、起源生物と
大腸菌（E. coli）とで転写装置（例えば、プロモータ
ーおよびリボソーム結合部位）が異なるため、いくつか
の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子およびメチラーゼ遺伝
子が大腸菌（E. coli）内で発現されない可能性がある
ことである。メチラーゼ選択技術においては、該メチラ
ーゼが、該遺伝子を保持するプラスミドの少なくともい
くつかを完全に保護するのに十分な程度で大腸菌（E. c
oli）内で発現されることが必要である。
大腸菌（E. coli）とで転写装置（例えば、プロモータ
ーおよびリボソーム結合部位）が異なるため、いくつか
の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子およびメチラーゼ遺伝
子が大腸菌（E. coli）内で発現されない可能性がある
ことである。メチラーゼ選択技術においては、該メチラ
ーゼが、該遺伝子を保持するプラスミドの少なくともい
くつかを完全に保護するのに十分な程度で大腸菌（E. c
oli）内で発現されることが必要である。
【００１５】精製された制限エンドヌクレアーゼおよび
修飾メチラーゼ（尤も、これはより低度ではあるが）
は、実験室内で遺伝子を特徴づけるための有用な手段で
あるため、これらの酵素を多量に合成する組換えDNA技
術により細菌株を入手することが商業的に要請されてい
る。そのような株は、精製作業を単純化し、商業的に有
用な量での製造手段を提供するため、有用であろう。
修飾メチラーゼ（尤も、これはより低度ではあるが）
は、実験室内で遺伝子を特徴づけるための有用な手段で
あるため、これらの酵素を多量に合成する組換えDNA技
術により細菌株を入手することが商業的に要請されてい
る。そのような株は、精製作業を単純化し、商業的に有
用な量での製造手段を提供するため、有用であろう。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明は、DNA配列5’ G
TTTAAAC 3’を認識し該認識配列の中央（3番目のT残基
と最初のA残基との間）で切断して平滑末端を与える酵
素であるPmeI制限エンドヌクレアーゼ（NEB#560）の遺
伝子をコードする組換えDNA、および該組換えDNAからこ
の酵素を製造するための関連方法に関する。本発明はま
た、制限エンドヌクレアーゼPmeIを発現する形質転換宿
主に関する。本発明に従い製造されたPmeI制限エンドヌ
クレアーゼは、実質的に純粋であり、通常の技術で製造
された制限エンドヌクレアーゼ調製物中で通常見出され
る混入物を含まない。
TTTAAAC 3’を認識し該認識配列の中央（3番目のT残基
と最初のA残基との間）で切断して平滑末端を与える酵
素であるPmeI制限エンドヌクレアーゼ（NEB#560）の遺
伝子をコードする組換えDNA、および該組換えDNAからこ
の酵素を製造するための関連方法に関する。本発明はま
た、制限エンドヌクレアーゼPmeIを発現する形質転換宿
主に関する。本発明に従い製造されたPmeI制限エンドヌ
クレアーゼは、実質的に純粋であり、通常の技術で製造
された制限エンドヌクレアーゼ調製物中で通常見出され
る混入物を含まない。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明は、PmeI制限エンドヌクレ
アーゼをコードする組換えDNA、および組換えPmeI酵素
の製造法に関する。
アーゼをコードする組換えDNA、および組換えPmeI酵素
の製造法に関する。
【００１８】シュードモナス・メンドシナ（Pseudomona
s mendocina）からPmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
をクローニングすることは、著しく困難であることが判
明した。メチラーゼ選択方法（米国特許第5,200,333
号）が精力的に試みられたが、PmeIメチラーゼ産生クロ
ーンは得られなかった。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子
をクローニングした後でさえ、保存されたメチラーゼモ
チーフは、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接して位
置していなかった。PmeIメチラーゼ遺伝子がこのように
欠けていたため、対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子の
クローニングは著しく複雑なものとなった。
s mendocina）からPmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
をクローニングすることは、著しく困難であることが判
明した。メチラーゼ選択方法（米国特許第5,200,333
号）が精力的に試みられたが、PmeIメチラーゼ産生クロ
ーンは得られなかった。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子
をクローニングした後でさえ、保存されたメチラーゼモ
チーフは、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接して位
置していなかった。PmeIメチラーゼ遺伝子がこのように
欠けていたため、対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子の
クローニングは著しく複雑なものとなった。
【００１９】PmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクロ
ーニングするために、高度に精製されたPmeI制限エンド
ヌクレアーゼタンパク質をシュードモナス・メンドシナ
（Pseudomonas mendocina）細胞から入手して、該エン
ドヌクレアーゼのN末端のアミノ酸配列を決定すること
にした。ついで、そのアミノ酸配列を使用して、シュー
ドモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）ゲノ
ムDNAからこのDNA領域をPCR増幅するための縮重オリゴ
ヌクレオチドプライマーを設計した。ついで、PCR増幅
された小さなDNA配列を使用して、非縮重逆PCRプライマ
ーを設計し、それを使用して、逆PCR技術によりPmeIエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子の出発点に隣接するDNAを増幅
した。そのような2個の増幅産物［BssHIIで消化され環
化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas me
ndocina）DNA鋳型からの1.4kbの産物、およびBsaWIで消
化され環化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudo
monas mendocina）DNA鋳型からの900bpの産物］を、ベ
クターpUC19中にクローニングし、配列決定した。該増
幅産物に由来するシュードモナス・メンドシナ（Pseudo
monas mendocina）ゲノムの約1.6kbの領域の配列データ
を用いて、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子を同定した。
693bpのオープンリーディングフレームは、精製されたP
meIエンドヌクレアーゼタンパク質のN末端の配列決定か
ら確認したものと符合するN末端アミノ酸配列を有する
ことが認められ、したがって、PmeIエンドヌクレアーゼ
遺伝子であることを確認した。同定したPmeIエンドヌク
レアーゼ遺伝子に対し直ぐ3’側および5’側のそれぞれ
700bpおよび190bpの両DNA配列の6フレームアミノ酸翻訳
物においては、明らかな公知メチラーゼモチーフは見出
されなかった。可能なPmeIメチラーゼを見出すために、
この1.6kbの領域の両側から外のDNA配列データを入手す
る必要があった。この目的のために、追加的な逆PCR実
験を行なった。該エンドヌクレアーゼに対し3’側の追
加的な1.57kbのDNA配列および該エンドヌクレアーゼに
対し5’側の3.1kbの配列を得たが、明らかな公知メチラ
ーゼモチーフは見出されなかった。いくつかの可能性が
存在する。該エンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接するORF
の1つは、PmeIメチラーゼをコードしているかもしれな
いが、そのようにそれが同定されるのを可能にする高度
に相同なメチラーゼモチーフを含有していないのかもし
れない。該メチラーゼは非常に巨大である可能性がある
ため、該遺伝子を位置づけるためには、より多くの配列
（特に、該エンドヌクレアーゼに対し3’側の配列）が
必要となるかもしれない。該メチラーゼは、ゲノムシュ
ードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNA
上で該エンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接していない他の
位置に存在する可能性がある。もう1つの可能性は、シ
ュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）D
NAが、PmeIエンドヌクレアーゼに対応するメチラーゼ遺
伝子を含有していないことである。
ーニングするために、高度に精製されたPmeI制限エンド
ヌクレアーゼタンパク質をシュードモナス・メンドシナ
（Pseudomonas mendocina）細胞から入手して、該エン
ドヌクレアーゼのN末端のアミノ酸配列を決定すること
にした。ついで、そのアミノ酸配列を使用して、シュー
ドモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）ゲノ
ムDNAからこのDNA領域をPCR増幅するための縮重オリゴ
ヌクレオチドプライマーを設計した。ついで、PCR増幅
された小さなDNA配列を使用して、非縮重逆PCRプライマ
ーを設計し、それを使用して、逆PCR技術によりPmeIエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子の出発点に隣接するDNAを増幅
した。そのような2個の増幅産物［BssHIIで消化され環
化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas me
ndocina）DNA鋳型からの1.4kbの産物、およびBsaWIで消
化され環化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudo
monas mendocina）DNA鋳型からの900bpの産物］を、ベ
クターpUC19中にクローニングし、配列決定した。該増
幅産物に由来するシュードモナス・メンドシナ（Pseudo
monas mendocina）ゲノムの約1.6kbの領域の配列データ
を用いて、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子を同定した。
693bpのオープンリーディングフレームは、精製されたP
meIエンドヌクレアーゼタンパク質のN末端の配列決定か
ら確認したものと符合するN末端アミノ酸配列を有する
ことが認められ、したがって、PmeIエンドヌクレアーゼ
遺伝子であることを確認した。同定したPmeIエンドヌク
レアーゼ遺伝子に対し直ぐ3’側および5’側のそれぞれ
700bpおよび190bpの両DNA配列の6フレームアミノ酸翻訳
物においては、明らかな公知メチラーゼモチーフは見出
されなかった。可能なPmeIメチラーゼを見出すために、
この1.6kbの領域の両側から外のDNA配列データを入手す
る必要があった。この目的のために、追加的な逆PCR実
験を行なった。該エンドヌクレアーゼに対し3’側の追
加的な1.57kbのDNA配列および該エンドヌクレアーゼに
対し5’側の3.1kbの配列を得たが、明らかな公知メチラ
ーゼモチーフは見出されなかった。いくつかの可能性が
存在する。該エンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接するORF
の1つは、PmeIメチラーゼをコードしているかもしれな
いが、そのようにそれが同定されるのを可能にする高度
に相同なメチラーゼモチーフを含有していないのかもし
れない。該メチラーゼは非常に巨大である可能性がある
ため、該遺伝子を位置づけるためには、より多くの配列
（特に、該エンドヌクレアーゼに対し3’側の配列）が
必要となるかもしれない。該メチラーゼは、ゲノムシュ
ードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNA
上で該エンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接していない他の
位置に存在する可能性がある。もう1つの可能性は、シ
ュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）D
NAが、PmeIエンドヌクレアーゼに対応するメチラーゼ遺
伝子を含有していないことである。
【００２０】対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子から該
宿主を保護するために発現されるPmeIメチラーゼ遺伝子
が存在しないため、PmeI制限活性を潜在的に阻止しうる
他のメチラーゼに関して研究した。PmeI認識配列の内部
の4塩基TTAAを認識するMseIメチラーゼは、PmeI切断を
阻止しないことが判明した。PmeI部位を含有する一連の
オリゴヌクレオチドを構築して、該認識配列内のアデニ
ンまたはシトシンの1つがメチル化されるようにし、メ
チル化によりPmeIが阻害されうるか否かを確かめるため
に、これらのオリゴをPmeI切断に付した。第3アデニン
残基でのメチル化はPmeI切断を阻止するが、第1または
第2アデニンでのメチル化や、該シトシン残基のC5位で
のメチル化は阻止しないことが判明した。N4でのシトシ
ンのメチル化は、試験しなかった。DraIメチラーゼは、
PmeI部位5’GTTTAAAC3’の内部の6塩基であるDNA配列
5’TTTAAA3’を認識する。DraIメチラーゼは、それらの
3つのアデニンの任意の1つをメチル化するため、PmeI制
限消化を阻止するか阻止しないかのどちらの可能性も生
じてしまう。したがって、DraIメチラーゼにより修飾さ
れたDNAがPmeI制限消化に抵抗性であるか否かを判定す
る必要があった。この目的には、DraIメチラーゼ産生ク
ローンpDraIRM9.7-G2の部分Sau3AIサブクローンを、単
一のPmeI部位と4つのDraI部位とを含有するベクターpNE
B193中にクローニングし、DraIメチラーゼ産生クローン
をメチラーゼ選択方法により選択した。これらのクロー
ンからのプラスミドを単離したところ、それらはPmeIお
よびDraI制限から保護されていることが示された。DraI
メチラーゼにより修飾されたDNAはPmeI制限消化から保
護されていたため、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子は、
DraIメチラーゼにより予め保護された宿主中で発現され
ることが可能であった。ついでDraIメチラーゼを、pRR
S、pAII17などの発現ベクターと和合性のベクターpACYC
184中にクローニングした。これは、pDraIRM9.7-G2のSa
u3AI部分サブクローンをpACYC184中にクローニングし、
メチラーゼ選択によりメチラーゼ産生クローンに関して
選択することにより行なった。
宿主を保護するために発現されるPmeIメチラーゼ遺伝子
が存在しないため、PmeI制限活性を潜在的に阻止しうる
他のメチラーゼに関して研究した。PmeI認識配列の内部
の4塩基TTAAを認識するMseIメチラーゼは、PmeI切断を
阻止しないことが判明した。PmeI部位を含有する一連の
オリゴヌクレオチドを構築して、該認識配列内のアデニ
ンまたはシトシンの1つがメチル化されるようにし、メ
チル化によりPmeIが阻害されうるか否かを確かめるため
に、これらのオリゴをPmeI切断に付した。第3アデニン
残基でのメチル化はPmeI切断を阻止するが、第1または
第2アデニンでのメチル化や、該シトシン残基のC5位で
のメチル化は阻止しないことが判明した。N4でのシトシ
ンのメチル化は、試験しなかった。DraIメチラーゼは、
PmeI部位5’GTTTAAAC3’の内部の6塩基であるDNA配列
5’TTTAAA3’を認識する。DraIメチラーゼは、それらの
3つのアデニンの任意の1つをメチル化するため、PmeI制
限消化を阻止するか阻止しないかのどちらの可能性も生
じてしまう。したがって、DraIメチラーゼにより修飾さ
れたDNAがPmeI制限消化に抵抗性であるか否かを判定す
る必要があった。この目的には、DraIメチラーゼ産生ク
ローンpDraIRM9.7-G2の部分Sau3AIサブクローンを、単
一のPmeI部位と4つのDraI部位とを含有するベクターpNE
B193中にクローニングし、DraIメチラーゼ産生クローン
をメチラーゼ選択方法により選択した。これらのクロー
ンからのプラスミドを単離したところ、それらはPmeIお
よびDraI制限から保護されていることが示された。DraI
メチラーゼにより修飾されたDNAはPmeI制限消化から保
護されていたため、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子は、
DraIメチラーゼにより予め保護された宿主中で発現され
ることが可能であった。ついでDraIメチラーゼを、pRR
S、pAII17などの発現ベクターと和合性のベクターpACYC
184中にクローニングした。これは、pDraIRM9.7-G2のSa
u3AI部分サブクローンをpACYC184中にクローニングし、
メチラーゼ選択によりメチラーゼ産生クローンに関して
選択することにより行なった。
【００２１】ついで、シュードモナス・メンドシナ（Ps
eudomonas mendocina）DNAからの完全な遺伝子を増幅
し、それを発現ベクターpRRS中にクローニングすること
により、PmeIエンドヌクレアーゼを発現させた。別の和
合性プラスミドpACYC184上に保持されたDraIメチラーゼ
遺伝子によりPmeI部位で予め修飾された宿主中に、この
構築物を導入した。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子とDr
aIメチラーゼ遺伝子とを含有する宿主を増殖させ、適当
な発現条件で誘導し、該細胞を収穫し、PmeIエンドヌク
レアーゼを精製することにより、PmeIエンドヌクレアー
ゼを製造する。
eudomonas mendocina）DNAからの完全な遺伝子を増幅
し、それを発現ベクターpRRS中にクローニングすること
により、PmeIエンドヌクレアーゼを発現させた。別の和
合性プラスミドpACYC184上に保持されたDraIメチラーゼ
遺伝子によりPmeI部位で予め修飾された宿主中に、この
構築物を導入した。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子とDr
aIメチラーゼ遺伝子とを含有する宿主を増殖させ、適当
な発現条件で誘導し、該細胞を収穫し、PmeIエンドヌク
レアーゼを精製することにより、PmeIエンドヌクレアー
ゼを製造する。
【００２２】PmeI制限エンドヌクレアーゼを好ましくク
ローニングし発現させるための本明細書中に記載の方法
は、図1に示されており、以下の工程を含む。
ローニングし発現させるための本明細書中に記載の方法
は、図1に示されており、以下の工程を含む。
【００２３】1．シュードモナス・メンドシナ（Pseudom
onas mendocina）を、マグネシウムの添加無しの修飾LB
培地を含有するフラスコ内で、攪拌・通気しながら37℃
で一晩増殖させる。該細胞を収穫し、溶解し、ゲノムDN
Aを精製する。
onas mendocina）を、マグネシウムの添加無しの修飾LB
培地を含有するフラスコ内で、攪拌・通気しながら37℃
で一晩増殖させる。該細胞を収穫し、溶解し、ゲノムDN
Aを精製する。
【００２４】2．New England Biolabs, Inc.（実施例
1、工程2を参照されたい）で開発されたタンパク質精製
技術の組合せにより、PmeI制限エンドヌクレアーゼを、
シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocin
a）細胞からほぼ均一になるまで精製する。このように
して精製したエンドヌクレアーゼは、SDSポリアクリル
アミドゲル電気泳動上でほぼ均一であり、約26キロダル
トンの見掛け分子量を有する。
1、工程2を参照されたい）で開発されたタンパク質精製
技術の組合せにより、PmeI制限エンドヌクレアーゼを、
シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocin
a）細胞からほぼ均一になるまで精製する。このように
して精製したエンドヌクレアーゼは、SDSポリアクリル
アミドゲル電気泳動上でほぼ均一であり、約26キロダル
トンの見掛け分子量を有する。
【００２５】3．Applied BioSystems Division, Perkin
-Elmer Corporation（Foster City,California）470A P
rotein Sequencer（Waite-Reesら, J. Bacteriol. 173:
5207-5219 (1991)）を用いて該エンドヌクレアーゼのア
ミノ末端アミノ酸配列を得、これを使用して、シュード
モナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）ゲノムD
NAからPmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点のDNAを
増幅するための縮重オリゴヌクレオチドプライマーを直
接合成し、後続の研究においてPmeIエンドヌクレアーゼ
遺伝子を同定した。
-Elmer Corporation（Foster City,California）470A P
rotein Sequencer（Waite-Reesら, J. Bacteriol. 173:
5207-5219 (1991)）を用いて該エンドヌクレアーゼのア
ミノ末端アミノ酸配列を得、これを使用して、シュード
モナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）ゲノムD
NAからPmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点のDNAを
増幅するための縮重オリゴヌクレオチドプライマーを直
接合成し、後続の研究においてPmeIエンドヌクレアーゼ
遺伝子を同定した。
【００２６】4．工程3で得たアミノ酸配列に基づく縮重
DNAプライマー［アミノ酸残基1〜6の(M)TTNSP（配列番
号1）に対応するもの、およびDNAの逆鎖に関するアミノ
酸残基10〜14のMIDEC（配列番号2）に対応するもの］を
使用して、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部を増幅
する。増幅されたDNAの個々のクローンを配列決定す
る。
DNAプライマー［アミノ酸残基1〜6の(M)TTNSP（配列番
号1）に対応するもの、およびDNAの逆鎖に関するアミノ
酸残基10〜14のMIDEC（配列番号2）に対応するもの］を
使用して、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部を増幅
する。増幅されたDNAの個々のクローンを配列決定す
る。
【００２７】5．シュードモナス・メンドシナ（Pseudom
onas mendocina）ゲノムDNAをApol、BsaHI、BsrFI、Bst
YI、EaeI、HaeII、Sau3AI、NlaIII、EagIおよびBssHII
エンドヌクレアーゼにより消化し、得られた断片を、分
子内連結を促進するために低いDNA濃度で連結する。ア
ミノ酸残基Asp-Val-Gly-Met-Ile-Asp（配列番号3）に対
応する工程4の縮重プライマーと、Gluをコードするコド
ンの第1ヌクレオチドGとの間の領域内でアニーリングす
るように、プライマーPmeI-IP1を設計する（その3’末
端は未知領域に配向する）。工程4で得たクローンのDNA
配列は、第4および第5残基（AsnおよびSer）の配列にお
いて異なるため、プライマーPmeI-IP2が1つのクラスの
配列にハイブリダイズしプライマーPmeI-IP3が第2のク
ラスの配列にハイブリダイズするように、別個の2つの
プライマーを作製する。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子
のN末端に対応するDNAを含有する環化断片を、プライマ
ーPmeI-IP1およびPmeI-IP2とプライマーPmeI-IP1および
PmeI-1P3とを使用して増幅する。種々のサイズの増幅産
物を産生させ、pUC19ベクター中にクローニングする。
onas mendocina）ゲノムDNAをApol、BsaHI、BsrFI、Bst
YI、EaeI、HaeII、Sau3AI、NlaIII、EagIおよびBssHII
エンドヌクレアーゼにより消化し、得られた断片を、分
子内連結を促進するために低いDNA濃度で連結する。ア
ミノ酸残基Asp-Val-Gly-Met-Ile-Asp（配列番号3）に対
応する工程4の縮重プライマーと、Gluをコードするコド
ンの第1ヌクレオチドGとの間の領域内でアニーリングす
るように、プライマーPmeI-IP1を設計する（その3’末
端は未知領域に配向する）。工程4で得たクローンのDNA
配列は、第4および第5残基（AsnおよびSer）の配列にお
いて異なるため、プライマーPmeI-IP2が1つのクラスの
配列にハイブリダイズしプライマーPmeI-IP3が第2のク
ラスの配列にハイブリダイズするように、別個の2つの
プライマーを作製する。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子
のN末端に対応するDNAを含有する環化断片を、プライマ
ーPmeI-IP1およびPmeI-IP2とプライマーPmeI-IP1および
PmeI-1P3とを使用して増幅する。種々のサイズの増幅産
物を産生させ、pUC19ベクター中にクローニングする。
【００２８】6．種々のpUC19構築物を配列決定する。Bs
sHIIで消化され環化されたDNAからの1400bpの増幅断片
を含有する1つの構築物pUC19BssHII21だけが、プライマ
ーPmeI-IP1に対し3’側のPmeIエンドヌクレアーゼのN末
端アミノ酸配列と符合したDNA配列を含有する。しかし
ながら、プライマーPmeI-IP3は、おそらく該プライマー
配列上のミスマッチにより、他の部位とハイブリダイズ
する。当然のことながら、PmeI-IP2およびPme-IP3の両
プライマーは、第4および第5残基（AsnおよびSer）の配
列に対するミスマッチを含有する可能性がある。
sHIIで消化され環化されたDNAからの1400bpの増幅断片
を含有する1つの構築物pUC19BssHII21だけが、プライマ
ーPmeI-IP1に対し3’側のPmeIエンドヌクレアーゼのN末
端アミノ酸配列と符合したDNA配列を含有する。しかし
ながら、プライマーPmeI-IP3は、おそらく該プライマー
配列上のミスマッチにより、他の部位とハイブリダイズ
する。当然のことながら、PmeI-IP2およびPme-IP3の両
プライマーは、第4および第5残基（AsnおよびSer）の配
列に対するミスマッチを含有する可能性がある。
【００２９】7．pUCBssHII21クローンから得た配列に基
づいて、新たなプライマーセットを設計する。PmeIエン
ドヌクレアーゼ遺伝子のN末端に対応するDNAを含有する
環化断片を、それらの新たなプライマーを用いて増幅す
る。BsaWIで消化され環化されたDNAは、900bpの産物を
与え、これをベクターpUC19中にクローニングする。
づいて、新たなプライマーセットを設計する。PmeIエン
ドヌクレアーゼ遺伝子のN末端に対応するDNAを含有する
環化断片を、それらの新たなプライマーを用いて増幅す
る。BsaWIで消化され環化されたDNAは、900bpの産物を
与え、これをベクターpUC19中にクローニングする。
【００３０】8．BsaWIで消化された環状DNAからの900bp
の増幅断片を含有する構築物pUC19BsaWI5を配列決定す
る。N末端アミノ酸配列データと符合し、約26kDのタン
パク質を産生するのに妥当なサイズを有するオープンリ
ーディングフレームが存在する。BsaWI産物は、該エン
ドヌクレアーゼ遺伝子に対し5’側に190bpを含有し、該
エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し3’側に90bpを含有す
る。BssHII産物は、該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し
3’側に700bpを含有する。該エンドヌクレアーゼ遺伝子
に隣接する配列決定された領域内に、明らかなメチラー
ゼモチーフは認められない。PmeIメチラーゼ遺伝子を探
索するために、以下の節に記載のとおりに、該エンドヌ
クレアーゼ遺伝子の両側に隣接するDNAを増幅し、クロ
ーニングし、配列決定する。
の増幅断片を含有する構築物pUC19BsaWI5を配列決定す
る。N末端アミノ酸配列データと符合し、約26kDのタン
パク質を産生するのに妥当なサイズを有するオープンリ
ーディングフレームが存在する。BsaWI産物は、該エン
ドヌクレアーゼ遺伝子に対し5’側に190bpを含有し、該
エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し3’側に90bpを含有す
る。BssHII産物は、該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し
3’側に700bpを含有する。該エンドヌクレアーゼ遺伝子
に隣接する配列決定された領域内に、明らかなメチラー
ゼモチーフは認められない。PmeIメチラーゼ遺伝子を探
索するために、以下の節に記載のとおりに、該エンドヌ
クレアーゼ遺伝子の両側に隣接するDNAを増幅し、クロ
ーニングし、配列決定する。
【００３１】9．PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子に対し
5’側のシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas men
docina）DNAを、該エンドヌクレアーゼ遺伝子の5’末端
付近とハイブリダイズするプライマーを使用する逆PCR
反応で増幅する。制限エンドヌクレアーゼで消化され環
化された第5節で調製したシュードモナス・メンドシナ
（Pseudomonas mendocina）DNAを、鋳型として使用す
る。増幅産物をpUC19ベクター中にクローニングする。
5’側のシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas men
docina）DNAを、該エンドヌクレアーゼ遺伝子の5’末端
付近とハイブリダイズするプライマーを使用する逆PCR
反応で増幅する。制限エンドヌクレアーゼで消化され環
化された第5節で調製したシュードモナス・メンドシナ
（Pseudomonas mendocina）DNAを、鋳型として使用す
る。増幅産物をpUC19ベクター中にクローニングする。
【００３２】10．第9節からの増幅断片を保持する種々
のpUC19構築物を配列決定する。BstYIで消化され環化さ
れたDNAは3.3kbの産物を与え、HaeIIで消化され環化さ
れたDNAは0.9kbの産物を与える。PmeIエンドヌクレアー
ゼ遺伝子に対し5’側の配列決定DNAの約3.1kbからの6フ
レームアミノ酸翻訳物においては、明らかなメチラーゼ
モチーフを認めることができない。
のpUC19構築物を配列決定する。BstYIで消化され環化さ
れたDNAは3.3kbの産物を与え、HaeIIで消化され環化さ
れたDNAは0.9kbの産物を与える。PmeIエンドヌクレアー
ゼ遺伝子に対し5’側の配列決定DNAの約3.1kbからの6フ
レームアミノ酸翻訳物においては、明らかなメチラーゼ
モチーフを認めることができない。
【００３３】11．PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子に対し
3’側のシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas men
docina）DNAを、2つの連続した逆PCR実験において増幅
する。シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mend
ocina）DNAを、AatII、Hinp1I、MscI、MseI、Sacl、Stu
lおよびTsp509Iエンドヌクレアーゼで消化し、得られた
断片を、分子内連結を促進するために低いDNA濃度で連
結する。第1逆PCR実験においては、これらの環状鋳型と
第5節からのBsaHIで消化された環状鋳型とを使用する。
該プライマーの1つは、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子
の3’末端の直ぐ外側のDNAとハイブリダイズし、その
3’末端は未知領域に配向している。もう一方は、エン
ドヌクレアーゼ遺伝子内またはその3’末端付近でハイ
ブリダイズし、逆方向に配向している。AatIIで消化さ
れ環化されたDNAは1.1kbの産物を与え、MscIで消化され
た環状DNAは1.4kbの産物を与え、BsaHIで消化された環
状DNAは0.7kbの産物を与える。これらの増幅されたDNA
をpUC19中にクローニングし、配列決定する。新たに導
き出されたDNA配列情報に基づいて、もう2つのプライマ
ーを合成し、第2逆PCR実験で使用する。HaeIIで消化さ
れ環化されたDNA（第5節）は、0.7kbの産物を与え、そ
れをpUC19中にクローニングし、配列決定する。このよ
うにして配列決定された該エンドヌクレアーゼ遺伝子の
3’末端に対し3’側のDNAの約1.57kbは、明らかなメチ
ラーゼモチーフを含有していない。
3’側のシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas men
docina）DNAを、2つの連続した逆PCR実験において増幅
する。シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mend
ocina）DNAを、AatII、Hinp1I、MscI、MseI、Sacl、Stu
lおよびTsp509Iエンドヌクレアーゼで消化し、得られた
断片を、分子内連結を促進するために低いDNA濃度で連
結する。第1逆PCR実験においては、これらの環状鋳型と
第5節からのBsaHIで消化された環状鋳型とを使用する。
該プライマーの1つは、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子
の3’末端の直ぐ外側のDNAとハイブリダイズし、その
3’末端は未知領域に配向している。もう一方は、エン
ドヌクレアーゼ遺伝子内またはその3’末端付近でハイ
ブリダイズし、逆方向に配向している。AatIIで消化さ
れ環化されたDNAは1.1kbの産物を与え、MscIで消化され
た環状DNAは1.4kbの産物を与え、BsaHIで消化された環
状DNAは0.7kbの産物を与える。これらの増幅されたDNA
をpUC19中にクローニングし、配列決定する。新たに導
き出されたDNA配列情報に基づいて、もう2つのプライマ
ーを合成し、第2逆PCR実験で使用する。HaeIIで消化さ
れ環化されたDNA（第5節）は、0.7kbの産物を与え、そ
れをpUC19中にクローニングし、配列決定する。このよ
うにして配列決定された該エンドヌクレアーゼ遺伝子の
3’末端に対し3’側のDNAの約1.57kbは、明らかなメチ
ラーゼモチーフを含有していない。
【００３４】12．DraIメチラーゼ産生クローンpDraIRM
9.7-G2をSau3AIで部分消化し、得られたDNA断片をpNEB1
93ベクター中に挿入する。形質転換体を一緒にプール
し、プラスミド集団を精製し、DraIエンドヌクレアーゼ
で消化する。制限されたプラスミドを、再び大腸菌（E.
coli）中に形質転換して、未切断クローンを回収す
る。DraIの消化に抗して生存した9個の形質転換体のプ
ラスミドを精製する。それら9個のプラスミドのうちの8
個は、DraIエンドヌクレアーゼ消化およびPmeIエンドヌ
クレアーゼ消化から保護される。
9.7-G2をSau3AIで部分消化し、得られたDNA断片をpNEB1
93ベクター中に挿入する。形質転換体を一緒にプール
し、プラスミド集団を精製し、DraIエンドヌクレアーゼ
で消化する。制限されたプラスミドを、再び大腸菌（E.
coli）中に形質転換して、未切断クローンを回収す
る。DraIの消化に抗して生存した9個の形質転換体のプ
ラスミドを精製する。それら9個のプラスミドのうちの8
個は、DraIエンドヌクレアーゼ消化およびPmeIエンドヌ
クレアーゼ消化から保護される。
【００３５】13．PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の過剰
発現： A．一般的な考慮点 多数の方法により、制限遺伝子を過剰発現させることが
できる。DNA配列および詳細なマッピング情報は、制限
エンドヌクレアーゼ遺伝子の過剰発現のための最善のア
プローチを決定する助けとなる。
発現： A．一般的な考慮点 多数の方法により、制限遺伝子を過剰発現させることが
できる。DNA配列および詳細なマッピング情報は、制限
エンドヌクレアーゼ遺伝子の過剰発現のための最善のア
プローチを決定する助けとなる。
【００３６】過剰発現のための1つのアプローチは、全
エンドヌクレアーゼ遺伝子の増幅にポリメラーゼ連鎖反
応を用いるために、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のN
末端および該遺伝子の下流（3’側）のいずれかの部位
で直接ハイブリダイズするプライマーを設計することを
含む。得られたDNA断片を、pRRSなどの発現ベクター中
の誘導プロモーター（lacUV5）の直ぐ下流に挿入するこ
とができる。
エンドヌクレアーゼ遺伝子の増幅にポリメラーゼ連鎖反
応を用いるために、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のN
末端および該遺伝子の下流（3’側）のいずれかの部位
で直接ハイブリダイズするプライマーを設計することを
含む。得られたDNA断片を、pRRSなどの発現ベクター中
の誘導プロモーター（lacUV5）の直ぐ下流に挿入するこ
とができる。
【００３７】あるいは、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
の開始点の直前にpAGR3（New England Biolabs, Inc.;
Beverly, Massachusetts）上のPtacなどの大腸菌（E. c
oli）に強く認識されるプロモーターを挿入することに
より、過剰発現を達成することができる。また、これ
は、該制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点および末
端付近の通常の制限部位とpAGR3のプロモーター付近の
和合性制限部位とを見つけ、Ptacプロモーターと調和さ
せて該制限遺伝子をpAGR3中に導入することにより行な
うことができる。使用しうる他の調節プロモーターとし
ては、pUC19およびpBR322誘導体上のPlacUV5（Fuller,
Gene 19:43-54 (1982)）およびIPL（ShimatakeおよびRo
senberg, Nature 254:128 (1981)）が挙げられる。ま
た、発現を増強するために、強力なリボソーム結合部位
（Shine & Dalgarno, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 71:3
42-1346 (1974)）を遺伝子の直前に配置することができ
る。
の開始点の直前にpAGR3（New England Biolabs, Inc.;
Beverly, Massachusetts）上のPtacなどの大腸菌（E. c
oli）に強く認識されるプロモーターを挿入することに
より、過剰発現を達成することができる。また、これ
は、該制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点および末
端付近の通常の制限部位とpAGR3のプロモーター付近の
和合性制限部位とを見つけ、Ptacプロモーターと調和さ
せて該制限遺伝子をpAGR3中に導入することにより行な
うことができる。使用しうる他の調節プロモーターとし
ては、pUC19およびpBR322誘導体上のPlacUV5（Fuller,
Gene 19:43-54 (1982)）およびIPL（ShimatakeおよびRo
senberg, Nature 254:128 (1981)）が挙げられる。ま
た、発現を増強するために、強力なリボソーム結合部位
（Shine & Dalgarno, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 71:3
42-1346 (1974)）を遺伝子の直前に配置することができ
る。
【００３８】該制限エンドヌクレアーゼを過剰発現する
安定なクローンを得るために、一般には、制限エンドヌ
クレアーゼの消化から宿主を予め保護する。本発明で
は、これは、別のプラスミド上でDraIメチラーゼをクロ
ーニングすることにより行なう。DraIメチラーゼにより
修飾されたDNAがPmeIエンドヌクレアーゼの消化に抵抗
性であることを、本出願中で示す。使用するプラスミド
は、発現ベクターと和合性でなければならない。また、
メチラーゼは、過剰発現される制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子による消化から宿主ゲノムを保護するレベルで産
生されなければならない。
安定なクローンを得るために、一般には、制限エンドヌ
クレアーゼの消化から宿主を予め保護する。本発明で
は、これは、別のプラスミド上でDraIメチラーゼをクロ
ーニングすることにより行なう。DraIメチラーゼにより
修飾されたDNAがPmeIエンドヌクレアーゼの消化に抵抗
性であることを、本出願中で示す。使用するプラスミド
は、発現ベクターと和合性でなければならない。また、
メチラーゼは、過剰発現される制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子による消化から宿主ゲノムを保護するレベルで産
生されなければならない。
【００３９】大腸菌（E. coli）内でより効率的に利用
されるコドンを使用するために、該遺伝子のDNA配列
を、部位特異的突然変異誘発により又は該遺伝子自体の
再合成により改変することができる（Ikemura, J. Mol.
Biol. 151:389-409 (1981)）。
されるコドンを使用するために、該遺伝子のDNA配列
を、部位特異的突然変異誘発により又は該遺伝子自体の
再合成により改変することができる（Ikemura, J. Mol.
Biol. 151:389-409 (1981)）。
【００４０】B．和合性ベクター中へのDraIメチラーゼ
のクローニング Sau3AIで部分消化されたpDraIRM9.7-G2 DNA断片（第12
節からのもの）を、予めBamHIで切断され脱リン酸化さ
れたベクターpACYC184中に連結する。形質転換体を一緒
にプールし、プラスミド集団を精製し、DraIエンドヌク
レアーゼで消化する。制限されたプラスミドを、再び大
腸菌（E. coli）中に形質転換して、未切断クローンを
回収する。ミニプレップに付した14個中12個の形質転換
体のプラスミドを、DraIエンドヌクレアーゼの消化から
保護する。約3kbの挿入断片を含有するpACYC184DraIM10
と称されるそのような1つのクローンを、後続のPmeIエ
ンドヌクレアーゼの発現のために使用する。
のクローニング Sau3AIで部分消化されたpDraIRM9.7-G2 DNA断片（第12
節からのもの）を、予めBamHIで切断され脱リン酸化さ
れたベクターpACYC184中に連結する。形質転換体を一緒
にプールし、プラスミド集団を精製し、DraIエンドヌク
レアーゼで消化する。制限されたプラスミドを、再び大
腸菌（E. coli）中に形質転換して、未切断クローンを
回収する。ミニプレップに付した14個中12個の形質転換
体のプラスミドを、DraIエンドヌクレアーゼの消化から
保護する。約3kbの挿入断片を含有するpACYC184DraIM10
と称されるそのような1つのクローンを、後続のPmeIエ
ンドヌクレアーゼの発現のために使用する。
【００４１】C．PmeIエンドヌクレアーゼの発現 PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅するために、DNA
プライマーを設計し、合成する。フォワードプライマー
は、以下の要素を有する：クローニングを容易にするた
めのPstI部位、lacZ遺伝子に対しインフレームである停
止コドン、大腸菌（E. coli）の強力なコンセンサスリ
ボソーム結合部位、該リボソーム結合部位とPmeIエンド
ヌクレアーゼのATG開始コドンとの間の7ヌクレオチドの
スペーサー配列、およびハイブリダイゼーションのため
のPmeIエンドヌクレアーゼDNA配列と符合した24ヌクレ
オチド。リバースプライマーは、BglII部位と、ハイブ
リダイゼーションのためのPmeIエンドヌクレアーゼ遺伝
子の3’末端に対し84bp 3’側のシュードモナス・メン
ドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAと符合する21ヌク
レオチドとを有する。これらのプライマーを使用して、
該エンドヌクレアーゼ遺伝子をゲノムDNAから増幅す
る。増幅されたDNAをBglIIおよびPstIで切断し、予めPs
tIおよびBamHIエンドヌクレアーゼで切断されゲル精製
された発現ベクターpRRS中に連結する。該連結反応物
を、pACYC184DraIM10を含有する大腸菌（E. coli）ER24
26コンピテント細胞中に形質転換する。所望のサイズの
挿入断片を含有するベクターを、ミニプレップ法により
同定する。いくつかのクローンを中期対数期まで増殖さ
せ、0.5mM IPTGで16時間誘導する。ついで該細胞を遠心
分離により収穫し、超音波処理緩衝液中に再懸濁し、音
波処理により溶解し、該抽出物をPmeIエンドヌクレアー
ゼ活性に関してアッセイする。pRRSPmeIR1/pACYC184Dra
IM10と称される、PmeIを発現するそのような1つの宿主
を増殖させ、PmeI制限エンドヌクレアーゼの製造に使用
する。
プライマーを設計し、合成する。フォワードプライマー
は、以下の要素を有する：クローニングを容易にするた
めのPstI部位、lacZ遺伝子に対しインフレームである停
止コドン、大腸菌（E. coli）の強力なコンセンサスリ
ボソーム結合部位、該リボソーム結合部位とPmeIエンド
ヌクレアーゼのATG開始コドンとの間の7ヌクレオチドの
スペーサー配列、およびハイブリダイゼーションのため
のPmeIエンドヌクレアーゼDNA配列と符合した24ヌクレ
オチド。リバースプライマーは、BglII部位と、ハイブ
リダイゼーションのためのPmeIエンドヌクレアーゼ遺伝
子の3’末端に対し84bp 3’側のシュードモナス・メン
ドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAと符合する21ヌク
レオチドとを有する。これらのプライマーを使用して、
該エンドヌクレアーゼ遺伝子をゲノムDNAから増幅す
る。増幅されたDNAをBglIIおよびPstIで切断し、予めPs
tIおよびBamHIエンドヌクレアーゼで切断されゲル精製
された発現ベクターpRRS中に連結する。該連結反応物
を、pACYC184DraIM10を含有する大腸菌（E. coli）ER24
26コンピテント細胞中に形質転換する。所望のサイズの
挿入断片を含有するベクターを、ミニプレップ法により
同定する。いくつかのクローンを中期対数期まで増殖さ
せ、0.5mM IPTGで16時間誘導する。ついで該細胞を遠心
分離により収穫し、超音波処理緩衝液中に再懸濁し、音
波処理により溶解し、該抽出物をPmeIエンドヌクレアー
ゼ活性に関してアッセイする。pRRSPmeIR1/pACYC184Dra
IM10と称される、PmeIを発現するそのような1つの宿主
を増殖させ、PmeI制限エンドヌクレアーゼの製造に使用
する。
【００４２】14．製造：PmeIエンドヌクレアーゼは、過
剰発現されるPmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を保持
する宿主細胞から、適当な抗生物質での選択および誘導
を伴う豊富な培地中で発酵槽内にて増殖させることによ
り製造することができる。ついで該細胞を遠心分離によ
り収穫し、音波処理により破壊して、PmeI制限エンドヌ
クレアーゼ活性を含有する粗製細胞抽出物を得る。
剰発現されるPmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を保持
する宿主細胞から、適当な抗生物質での選択および誘導
を伴う豊富な培地中で発酵槽内にて増殖させることによ
り製造することができる。ついで該細胞を遠心分離によ
り収穫し、音波処理により破壊して、PmeI制限エンドヌ
クレアーゼ活性を含有する粗製細胞抽出物を得る。
【００４３】15．精製：アフィニティークロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのタンパク質
精製技術の組合せにより、PmeIエンドヌクレアーゼを含
有する粗製細胞抽出物を精製する。
ィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのタンパク質
精製技術の組合せにより、PmeIエンドヌクレアーゼを含
有する粗製細胞抽出物を精製する。
【００４４】前記で大まかに説明した工程は、本発明を
実施するための好ましい態様を代表するものであるが、
前記のアプローチが当該技術分野で公知の技術に従い変
更可能であることは当業者には明らかである。
実施するための好ましい態様を代表するものであるが、
前記のアプローチが当該技術分野で公知の技術に従い変
更可能であることは当業者には明らかである。
【００４５】以下の実施例は、実施するのに現在好まし
い本発明の実施態様を例示するものである。本実施例は
例示的であり、本発明は実施例に限定されるものではな
く、添付の請求の範囲に示されるとおりに限定されるに
すぎないと理解されるであろう。
い本発明の実施態様を例示するものである。本実施例は
例示的であり、本発明は実施例に限定されるものではな
く、添付の請求の範囲に示されるとおりに限定されるに
すぎないと理解されるであろう。
【００４６】前記および後記で引用している参照文献
は、参考として本明細書に組入れることとする。
は、参考として本明細書に組入れることとする。
【００４７】実施例1 PmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング 1．DNAの精製：5gのシュードモナス・メンドシナ（Pseu
domonas mendocina）（NEB#698）細胞ペーストを、20ml
の25％ショ糖、0.05M Tris-HCl、1mM EDTA（pH8.0）中
に、穏やかに振とうすることにより再懸濁した。5mlの
0.5M EDTA（pH8.0）および新たに調製した10mg/mlリゾ
チーム［0.25M Tris-HCl（pH8.0）中］6mlを加え、該溶
液を4℃で2時間インキュベートした。24mlの溶解混合物
（1％Triton-X100、50mM Tris、62.5mM EDTA, pH8.
0）、ついで5mlの10％SDSを加え、該溶液を4℃で一晩イ
ンキュベートした。該溶液を50mlの平衡化フェノールで
抽出し、該水相を回収し、50mlのクロロホルムで2回抽
出した。該水性溶液を、4回交換する2Lの10mM Tris、1m
M EDTA（pH8.0）に対して一晩透析した。ついで、透析
された溶液をRNアーゼ（100μg/ml）で37℃で1時間消化
した。該DNAを、1/10容量の5M NaClおよび0.55容量の2-
プロパノールの添加により沈殿させ、ガラス棒に巻き付
けた。該DNAを風乾し、ついで10mlの10mM Tris、1mM ED
TA（pH8.0）中に溶解した。
domonas mendocina）（NEB#698）細胞ペーストを、20ml
の25％ショ糖、0.05M Tris-HCl、1mM EDTA（pH8.0）中
に、穏やかに振とうすることにより再懸濁した。5mlの
0.5M EDTA（pH8.0）および新たに調製した10mg/mlリゾ
チーム［0.25M Tris-HCl（pH8.0）中］6mlを加え、該溶
液を4℃で2時間インキュベートした。24mlの溶解混合物
（1％Triton-X100、50mM Tris、62.5mM EDTA, pH8.
0）、ついで5mlの10％SDSを加え、該溶液を4℃で一晩イ
ンキュベートした。該溶液を50mlの平衡化フェノールで
抽出し、該水相を回収し、50mlのクロロホルムで2回抽
出した。該水性溶液を、4回交換する2Lの10mM Tris、1m
M EDTA（pH8.0）に対して一晩透析した。ついで、透析
された溶液をRNアーゼ（100μg/ml）で37℃で1時間消化
した。該DNAを、1/10容量の5M NaClおよび0.55容量の2-
プロパノールの添加により沈殿させ、ガラス棒に巻き付
けた。該DNAを風乾し、ついで10mlの10mM Tris、1mM ED
TA（pH8.0）中に溶解した。
【００４８】2．シュードモナス・メンドシナ（Pseudom
onas mendocina）（NEB#698）からのPmeI制限エンドヌ
クレアーゼの精製：マグネシウムの添加無しの修飾LB培
地を含有するフラスコ内で、攪拌・通気しながら37℃で
シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocin
a）細胞を一晩増殖させることにより、PmeI制限酵素を
製造することができる。該細胞を遠心分離により収穫し
た。以下のすべての操作は、氷上または4℃で行なっ
た。196g（湿重量）の細胞ペレットを、50mM NaClを含
有する（緩衝液A.05）600mlの緩衝液A（20mM Tris-HCl,
1mMジチオトレイトール(DTT), 0.1mM EDTA, 5%グリセ
ロール, pH7.4）に再懸濁し、ついでフェニルメチルス
ルホニルフルオリド（PMSF）を最終濃度25μg/mlで加え
た。ついで該細胞懸濁液を音波処理により破壊した。該
抽出物を12Krpmで90分間遠心分離し、上清を集めた。該
ペレットを50mlの緩衝液A.05でリンスし、再び15Krpmで
90分間遠心分離した。該上清を合わせ（合計700ml）、
緩衝液A.05で平衡化された216mlのQ-セファロースカラ
ム（Pharmacia; Piscataway, NJ）上にローディングし
た。このカラムを200mlの緩衝液A.05で洗浄し、流出お
よび洗浄によりPmeI活性を溶出した。PmeIを含有する画
分を一緒にプールし、緩衝液A.05中で平衡化された216m
lのヘパリン-セファロースカラム（Pharmacia; Piscata
way, NJ）上にローディングし、600mlの緩衝液A.05で洗
浄し、ついで2Lの直線勾配（緩衝液A中の50mM〜800mMの
NaCl）を得た。21mlの画分を集めた。PmeI制限活性に関
してλDNAで画分をアッセイし、溶出された活性の中間
点は約480mMのNaCl濃度であることが判明した。合計12
個の画分をプールした。酵素活性の量は750,000単位で
あると推定された。このヘパリン-セファロースプール
を、50mM NaCl（緩衝液B.05）を含有する緩衝液B（20mM
KPO4, 6mM 2-メルカプトエタノール, 0.1mM EDTA, 5%
グリセロール, pH6.8）中で平衡化された12mlのヒドロ
キシルアパタイト（HPT）カラム（Calbiochem; LaJoll
a, CA）に適用し、36mlの緩衝液B.05、ついで120mlの直
線勾配（緩衝液B中50mM NaCl〜1M NaCl）で洗浄した。
1.2mlの画分を集めた。PmeI活性に関してλDNAで画分を
アッセイした。制限酵素活性の中間点は、約500mMのNaC
lで溶出した。合計13個の画分をプールし、50mM NaCl
（緩衝液C.05）を含有する緩衝液C（20mM KPO4, 1mM DT
T, 0.1mM EDTA, 5%グリセロール, pH6.8）に対して一晩
透析した。透析された溶液を、緩衝液C.05中、ついで50
mlの直線勾配（緩衝液C中50mM NaCl〜500mM NaCl）中で
平衡化された1mlのpolyCat Aカラム（Custom LC, Inc.;
Houston, TX）に適用した。1mlの画分を集め、制限酵
素活性に関してλDNAで該画分をアッセイした。PmeI活
性は、約270mM NaClで溶出した。3つの画分を一緒にプ
ールし、5容量の緩衝液Aで希釈し、緩衝液A.05で平衡化
された1mlのMono Q FPLCカラム（Pharmacia; Piscatawa
y, NJ）上にローディングした。該カラムを2mlの緩衝液
A.05で洗浄し、流出および洗浄によりPmeI活性を溶出し
た。PmeIを含有する画分を一緒にプールし、緩衝液A.05
で平衡化された3mlのヘパリン-TSK FPLCカラム（TosoHa
as; Philadelphia, PA）上に直接ローディングした。該
カラムを2mlの緩衝液A.05、ついで60mlの直線勾配（緩
衝液A中50mMNaCl〜500mM NaCl）で洗浄した。1mlの画分
を集め、PmeI活性をλDNAでアッセイした。制限酵素活
性のピークは、300mM NaClで溶出した。精製されたPmeI
制限酵素活性の量は、116,000単位であると推定され
た。該ピーク画分をSDS-PAGEタンパク質ゲル上にローデ
ィングし、電気泳動に付した。該ゲルをクーマシーブル
ーR-250で染色し、PmeI制限エンドヌクレアーゼ活性に
対応する約26kDの顕著なバンドが認められた。
onas mendocina）（NEB#698）からのPmeI制限エンドヌ
クレアーゼの精製：マグネシウムの添加無しの修飾LB培
地を含有するフラスコ内で、攪拌・通気しながら37℃で
シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocin
a）細胞を一晩増殖させることにより、PmeI制限酵素を
製造することができる。該細胞を遠心分離により収穫し
た。以下のすべての操作は、氷上または4℃で行なっ
た。196g（湿重量）の細胞ペレットを、50mM NaClを含
有する（緩衝液A.05）600mlの緩衝液A（20mM Tris-HCl,
1mMジチオトレイトール(DTT), 0.1mM EDTA, 5%グリセ
ロール, pH7.4）に再懸濁し、ついでフェニルメチルス
ルホニルフルオリド（PMSF）を最終濃度25μg/mlで加え
た。ついで該細胞懸濁液を音波処理により破壊した。該
抽出物を12Krpmで90分間遠心分離し、上清を集めた。該
ペレットを50mlの緩衝液A.05でリンスし、再び15Krpmで
90分間遠心分離した。該上清を合わせ（合計700ml）、
緩衝液A.05で平衡化された216mlのQ-セファロースカラ
ム（Pharmacia; Piscataway, NJ）上にローディングし
た。このカラムを200mlの緩衝液A.05で洗浄し、流出お
よび洗浄によりPmeI活性を溶出した。PmeIを含有する画
分を一緒にプールし、緩衝液A.05中で平衡化された216m
lのヘパリン-セファロースカラム（Pharmacia; Piscata
way, NJ）上にローディングし、600mlの緩衝液A.05で洗
浄し、ついで2Lの直線勾配（緩衝液A中の50mM〜800mMの
NaCl）を得た。21mlの画分を集めた。PmeI制限活性に関
してλDNAで画分をアッセイし、溶出された活性の中間
点は約480mMのNaCl濃度であることが判明した。合計12
個の画分をプールした。酵素活性の量は750,000単位で
あると推定された。このヘパリン-セファロースプール
を、50mM NaCl（緩衝液B.05）を含有する緩衝液B（20mM
KPO4, 6mM 2-メルカプトエタノール, 0.1mM EDTA, 5%
グリセロール, pH6.8）中で平衡化された12mlのヒドロ
キシルアパタイト（HPT）カラム（Calbiochem; LaJoll
a, CA）に適用し、36mlの緩衝液B.05、ついで120mlの直
線勾配（緩衝液B中50mM NaCl〜1M NaCl）で洗浄した。
1.2mlの画分を集めた。PmeI活性に関してλDNAで画分を
アッセイした。制限酵素活性の中間点は、約500mMのNaC
lで溶出した。合計13個の画分をプールし、50mM NaCl
（緩衝液C.05）を含有する緩衝液C（20mM KPO4, 1mM DT
T, 0.1mM EDTA, 5%グリセロール, pH6.8）に対して一晩
透析した。透析された溶液を、緩衝液C.05中、ついで50
mlの直線勾配（緩衝液C中50mM NaCl〜500mM NaCl）中で
平衡化された1mlのpolyCat Aカラム（Custom LC, Inc.;
Houston, TX）に適用した。1mlの画分を集め、制限酵
素活性に関してλDNAで該画分をアッセイした。PmeI活
性は、約270mM NaClで溶出した。3つの画分を一緒にプ
ールし、5容量の緩衝液Aで希釈し、緩衝液A.05で平衡化
された1mlのMono Q FPLCカラム（Pharmacia; Piscatawa
y, NJ）上にローディングした。該カラムを2mlの緩衝液
A.05で洗浄し、流出および洗浄によりPmeI活性を溶出し
た。PmeIを含有する画分を一緒にプールし、緩衝液A.05
で平衡化された3mlのヘパリン-TSK FPLCカラム（TosoHa
as; Philadelphia, PA）上に直接ローディングした。該
カラムを2mlの緩衝液A.05、ついで60mlの直線勾配（緩
衝液A中50mMNaCl〜500mM NaCl）で洗浄した。1mlの画分
を集め、PmeI活性をλDNAでアッセイした。制限酵素活
性のピークは、300mM NaClで溶出した。精製されたPmeI
制限酵素活性の量は、116,000単位であると推定され
た。該ピーク画分をSDS-PAGEタンパク質ゲル上にローデ
ィングし、電気泳動に付した。該ゲルをクーマシーブル
ーR-250で染色し、PmeI制限エンドヌクレアーゼ活性に
対応する約26kDの顕著なバンドが認められた。
【００４９】3．アミノ末端PmeIタンパク質の配列決
定：前記第2節に記載のとおりに調製したPmeI制限エン
ドヌクレアーゼを電気泳動に付し、文献記載（Looney
ら, Gene 80:193-208 (1989)）のとおりに改変したMats
udaira（Matsudaira, P., J. Biol.Chem. 262:10035-10
038 (1987)）の方法に従いエレクトロブロットした。該
メンブレンをクーマシーブルーR-250で染色し、約26kD
のタンパク質のバンドを切り出し、Applied BioSystems
Division, Perkin-Elmer Corporation（Foster City,
California）Model 407A気相タンパク質シークエンサー
（Waite-Reesら, JBacteriol. 173:5207-5219 (1991)）
上の連続的な分解に付した。27kDのタンパク質の最初の
24残基は、(Met)-Thr-Thr-Asn-Ser-Pro-Ser-Asp-Val-Gl
y-Met-IIe-Asp-Glu-Cys-Leu-Ser-IIe-Val-Xaa-Thr-Xaa-
Leu-Ala（配列番号4）に相当した。
定：前記第2節に記載のとおりに調製したPmeI制限エン
ドヌクレアーゼを電気泳動に付し、文献記載（Looney
ら, Gene 80:193-208 (1989)）のとおりに改変したMats
udaira（Matsudaira, P., J. Biol.Chem. 262:10035-10
038 (1987)）の方法に従いエレクトロブロットした。該
メンブレンをクーマシーブルーR-250で染色し、約26kD
のタンパク質のバンドを切り出し、Applied BioSystems
Division, Perkin-Elmer Corporation（Foster City,
California）Model 407A気相タンパク質シークエンサー
（Waite-Reesら, JBacteriol. 173:5207-5219 (1991)）
上の連続的な分解に付した。27kDのタンパク質の最初の
24残基は、(Met)-Thr-Thr-Asn-Ser-Pro-Ser-Asp-Val-Gl
y-Met-IIe-Asp-Glu-Cys-Leu-Ser-IIe-Val-Xaa-Thr-Xaa-
Leu-Ala（配列番号4）に相当した。
【００５０】4．N末端PmeI DNAの増幅：工程3で得たア
ミノ酸配列に基づく縮重DNAプライマーを使用して、Pme
Iエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部を増幅する。アミノ
酸残基1〜6の(M)TTNSP（配列番号1）に対応する以下の2
つのプライマーを合成する：PmeI-PS1 5’ GTTGGATCCAT
GACNACNAAYTCNCC 3’（配列番号5）およびPmeI-PS2 5’
GTTGGATCCATGACNACNAAYAGYCC 3’（配列番号6）。DNAの
逆鎖にハイブリダイズさせるために、アミノ酸残基10〜
14のMIDECに対応するプライマーPmeI-PS3 5’GTTCTGCAG
RCAYTCRTCDATCAT 3’（配列番号7）を合成する。反応混
合物は、 30μlの10X Vent（登録商標）反応緩衝液 18μlの4mM dNTP溶液 15μlのプライマーPmeI-PS1 15μlのプライマーPmeI-PS2 3μlのシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mend
ocina）DNA (約600ng)219μl dH2O 6μl (12単位)のVent（登録商標） Exo−ポリメラーゼ
(NEB#257) を合わせることにより調製した。
ミノ酸配列に基づく縮重DNAプライマーを使用して、Pme
Iエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部を増幅する。アミノ
酸残基1〜6の(M)TTNSP（配列番号1）に対応する以下の2
つのプライマーを合成する：PmeI-PS1 5’ GTTGGATCCAT
GACNACNAAYTCNCC 3’（配列番号5）およびPmeI-PS2 5’
GTTGGATCCATGACNACNAAYAGYCC 3’（配列番号6）。DNAの
逆鎖にハイブリダイズさせるために、アミノ酸残基10〜
14のMIDECに対応するプライマーPmeI-PS3 5’GTTCTGCAG
RCAYTCRTCDATCAT 3’（配列番号7）を合成する。反応混
合物は、 30μlの10X Vent（登録商標）反応緩衝液 18μlの4mM dNTP溶液 15μlのプライマーPmeI-PS1 15μlのプライマーPmeI-PS2 3μlのシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mend
ocina）DNA (約600ng)219μl dH2O 6μl (12単位)のVent（登録商標） Exo−ポリメラーゼ
(NEB#257) を合わせることにより調製した。
【００５１】該混合物を94μlの3つのアリコートに分割
し、最初のアリコートには6μlのdH 2Oを加え、2つ目の
アリコートには3μlのdH2Oおよび3μlの100mM MgSO4（5
mMの最終Mg++濃度）を加え、最後のアリコートには6μl
の100mM MgSO4（8mMの最終Mg ++濃度）を加えた。PCR増
幅条件は、95℃で2分間の1サイクル、ついで95℃で30秒
間、40℃で30秒間および72℃で5秒間の20サイクルであ
る。PCRで増幅されたDNAを3.5％NuSieveアガロースゲル
上でサイズ選択し、pUC19中にクローニングする。増幅
されたDNAの個々のクローンを配列決定する。PmeI-PS1
およびPmeI-PS2の両方を含有するクローンが認められ、
第5アミノ酸Serに関するコドン使用頻度は未知のままで
ある。
し、最初のアリコートには6μlのdH 2Oを加え、2つ目の
アリコートには3μlのdH2Oおよび3μlの100mM MgSO4（5
mMの最終Mg++濃度）を加え、最後のアリコートには6μl
の100mM MgSO4（8mMの最終Mg ++濃度）を加えた。PCR増
幅条件は、95℃で2分間の1サイクル、ついで95℃で30秒
間、40℃で30秒間および72℃で5秒間の20サイクルであ
る。PCRで増幅されたDNAを3.5％NuSieveアガロースゲル
上でサイズ選択し、pUC19中にクローニングする。増幅
されたDNAの個々のクローンを配列決定する。PmeI-PS1
およびPmeI-PS2の両方を含有するクローンが認められ、
第5アミノ酸Serに関するコドン使用頻度は未知のままで
ある。
【００５２】5．PmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のN
末端に隣接するDNAのクローニング：逆PCR増幅のための
鋳型調製：3μgのシュードモナス・メンドシナ（Pseudo
monas mendocina）DNAを、100μlの1×NE緩衝液#3（50m
M Tris-HCl, 10mM MgCl2, 100mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.
9）中の20単位のApoI制限エンドヌクレアーゼで50℃で1
時間消化した。該制限消化混合物を1容量の平衡化フェ
ノール：クロロホルム（50：50, v/v）で抽出し、該水
相を回収し、1容量のクロロホルムで2回抽出した。1/10
容量の5M NaClおよび1容量の2-プロパノールを加えるこ
とにより該DNAを沈殿させ、70％氷冷エタノールで洗浄
した。該DNAを50μlの1×TEに再懸濁した。16℃で一
晩、2000UのT4 DNAリガーゼを使用して、10μlのこの消
化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas me
ndocina）DNA（約0.5μg）を500μlの1×リガーゼ緩衝
液中で環化させた。この環化反応の一部を、後続の逆PC
R反応のためのDNA鋳型として使用した。BsaHI、BsrFI、
BstYI、EaeＩ、HaeII、Sau3AI、NlaIII、EagIおよびBss
HIIで消化され環化されたシュードモナス・メンドシナ
（Pseudomonas mendocina）DNAを、同様にして調製し
た。
末端に隣接するDNAのクローニング：逆PCR増幅のための
鋳型調製：3μgのシュードモナス・メンドシナ（Pseudo
monas mendocina）DNAを、100μlの1×NE緩衝液#3（50m
M Tris-HCl, 10mM MgCl2, 100mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.
9）中の20単位のApoI制限エンドヌクレアーゼで50℃で1
時間消化した。該制限消化混合物を1容量の平衡化フェ
ノール：クロロホルム（50：50, v/v）で抽出し、該水
相を回収し、1容量のクロロホルムで2回抽出した。1/10
容量の5M NaClおよび1容量の2-プロパノールを加えるこ
とにより該DNAを沈殿させ、70％氷冷エタノールで洗浄
した。該DNAを50μlの1×TEに再懸濁した。16℃で一
晩、2000UのT4 DNAリガーゼを使用して、10μlのこの消
化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas me
ndocina）DNA（約0.5μg）を500μlの1×リガーゼ緩衝
液中で環化させた。この環化反応の一部を、後続の逆PC
R反応のためのDNA鋳型として使用した。BsaHI、BsrFI、
BstYI、EaeＩ、HaeII、Sau3AI、NlaIII、EagIおよびBss
HIIで消化され環化されたシュードモナス・メンドシナ
（Pseudomonas mendocina）DNAを、同様にして調製し
た。
【００５３】1つのフォワードまたはコード鎖プライマ
ーPmeI-IP1および2つのリバースまたは非コード鎖プラ
イマーPmeI-IP2およびPmeI-IP3（以下に示す配列を有す
る）を、工程4で得たDNA配列に基づき合成した。アミノ
酸残基8〜13のAsp-Val-Gly-Met-IIe-Asp（配列番号8）
に対応するヌクレオチドと残基14のGluをコードするコ
ドンの最初のヌクレオチドGとにハイブリダイズするよ
うに、プライマーPmeI-IP1を設計した。また、クローニ
ングを容易にするために、このプライマー内にBamHI制
限部位を含めた。残基2のThrをコードするコドンの最後
の2つのヌクレオチド、アミノ酸残基3〜7のThr-Asn-Ser
-Pro-Ser（配列番号9）に対応するヌクレオチドおよび
残基8のAspをコードするコドンの最初のヌクレオチドに
ハイブリダイズするように、プライマーPmeI-IP2を設計
した。また、クローニングを容易にするために、このプ
ライマー内にPstI制限部位を含めた。 プライマーPmeI-IP1 5’ GTTGGATCCGACGTCGGCATGATCGACG-3’（配列番号10） プライマーPmeI-IP2 5’ GTTCTGCAGCTGAGGGGCTGTTCGTTG-3’（配列番号11） プライマーPmeI-IP3 5’ GTTCTGCAGCTGAGGGCGAATTCGTTG-3’（配列番号12） SmaIなどの平滑末端を与える制限酵素により予め切断さ
れているベクター中にPCR断片を直接挿入するのが簡便
なことが多い。この場合には、挿入するPCR断片が5’末
端にリン酸基を有する必要がある。この目的には、100
μlの反応容量中の1mM ATPで補足された1×T4ポリヌク
レオチドキナーゼ緩衝液（70mM Tris-HCl,10mM MgCl2,
5mMジチオトレイトール, pH7.6）中の20単位のT4ポリヌ
クレオチドキナーゼにより、15μlのDNAプライマーPmeI
-IP1（200μM）を37℃で1時間リン酸化した。また、プ
ライマーPmeI-IP2およびPmeI-IP3を、前記のとおり5’
末端でリン酸化した。65℃で20分間インキュベートする
ことにより、T4 DNAポリヌクレオチドキナーゼを熱不活
性化した。リン酸化されたプライマーを、2容量の1×TE
で最終濃度10μMにまで希釈し、以下のPCR反応で使用し
た。
ーPmeI-IP1および2つのリバースまたは非コード鎖プラ
イマーPmeI-IP2およびPmeI-IP3（以下に示す配列を有す
る）を、工程4で得たDNA配列に基づき合成した。アミノ
酸残基8〜13のAsp-Val-Gly-Met-IIe-Asp（配列番号8）
に対応するヌクレオチドと残基14のGluをコードするコ
ドンの最初のヌクレオチドGとにハイブリダイズするよ
うに、プライマーPmeI-IP1を設計した。また、クローニ
ングを容易にするために、このプライマー内にBamHI制
限部位を含めた。残基2のThrをコードするコドンの最後
の2つのヌクレオチド、アミノ酸残基3〜7のThr-Asn-Ser
-Pro-Ser（配列番号9）に対応するヌクレオチドおよび
残基8のAspをコードするコドンの最初のヌクレオチドに
ハイブリダイズするように、プライマーPmeI-IP2を設計
した。また、クローニングを容易にするために、このプ
ライマー内にPstI制限部位を含めた。 プライマーPmeI-IP1 5’ GTTGGATCCGACGTCGGCATGATCGACG-3’（配列番号10） プライマーPmeI-IP2 5’ GTTCTGCAGCTGAGGGGCTGTTCGTTG-3’（配列番号11） プライマーPmeI-IP3 5’ GTTCTGCAGCTGAGGGCGAATTCGTTG-3’（配列番号12） SmaIなどの平滑末端を与える制限酵素により予め切断さ
れているベクター中にPCR断片を直接挿入するのが簡便
なことが多い。この場合には、挿入するPCR断片が5’末
端にリン酸基を有する必要がある。この目的には、100
μlの反応容量中の1mM ATPで補足された1×T4ポリヌク
レオチドキナーゼ緩衝液（70mM Tris-HCl,10mM MgCl2,
5mMジチオトレイトール, pH7.6）中の20単位のT4ポリヌ
クレオチドキナーゼにより、15μlのDNAプライマーPmeI
-IP1（200μM）を37℃で1時間リン酸化した。また、プ
ライマーPmeI-IP2およびPmeI-IP3を、前記のとおり5’
末端でリン酸化した。65℃で20分間インキュベートする
ことにより、T4 DNAポリヌクレオチドキナーゼを熱不活
性化した。リン酸化されたプライマーを、2容量の1×TE
で最終濃度10μMにまで希釈し、以下のPCR反応で使用し
た。
【００５４】消化され環化されたシュードモナス・メン
ドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを鋳型として使用
しリン酸化プライマーPmeI-IP1およびPmeI-IP2を使用し
て、逆PCR反応を行なった。逆PCR反応においては、個々
のDNA鋳型に対して3つの異なるMg++濃度を使用した。反
応混合物は、 30μlの10X Vent（登録商標）反応緩衝液 18μlの4mM dNTP溶液 15μlのリン酸化プライマーPmeI-IP1 15μlのリン酸化プライマーPmeI-IP2 36μlの環化DNA鋳型（約25ng） 168μlのdH2O 6μl (12単位)のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼ(N
EB#257) を合わせることにより調製した。
ドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを鋳型として使用
しリン酸化プライマーPmeI-IP1およびPmeI-IP2を使用し
て、逆PCR反応を行なった。逆PCR反応においては、個々
のDNA鋳型に対して3つの異なるMg++濃度を使用した。反
応混合物は、 30μlの10X Vent（登録商標）反応緩衝液 18μlの4mM dNTP溶液 15μlのリン酸化プライマーPmeI-IP1 15μlのリン酸化プライマーPmeI-IP2 36μlの環化DNA鋳型（約25ng） 168μlのdH2O 6μl (12単位)のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼ(N
EB#257) を合わせることにより調製した。
【００５５】該混合物を94μlの3つのアリコートに分割
し、最初のアリコートには6μlのdH 2Oを加え、2つ目の
アリコートには3μlのdH2Oおよび3μlの100mM MgSO4（5
mMの最終Mg++濃度）を加え、最後のアリコートには6μl
の100mM MgSO4（8mMの最終Mg ++濃度）を加えた。PCR増
幅条件は、95℃で2分間の1サイクル、ついで95℃で30秒
間、50℃で30秒間および72℃で2.5分間の5サイクル、つ
いで95℃で30秒間、65℃で30秒間および72℃で2.5分間
の20サイクルであった。15μlの該PCR反応を、0.8％ア
ガロースゲル上の電気泳動により分析した。いくつかの
非特異的な増幅されたDNAバックグラウンドのうち、以
下の産物が認められた：1700bpの断片、および接近して
位置する2つのApoIで消化された環状鋳型からの約1500b
pの断片、BstYIで消化された環状鋳型からの1500bpの断
片、BsaHIで消化された環状鋳型からの900bpの断片およ
び750bpの断片、およびEagIで消化された環状鋳型から
の2500bpの断片。これらの増幅産物をゲル精製した。ゲ
ル精製：100μlのPCR反応を1％LMPアガロース中に電気
泳動し、バンドを該ゲルから切り出し、65℃で5分間溶
融し、40℃に5分間冷却し、40℃で1時間インキュベート
すると共に5単位のβ-アガロース（New England Biolab
s #392）を加えることにより該アガロースを消化した。
ついで、それを1容量の平衡化フェノール：クロロホル
ム（50：50, v/v）で抽出し、該水相を回収し、1容量の
クロロホルムで2回抽出した。1/10容量の5MNaClおよび2
容量の2-プロパノールを加えることにより該DNAを沈殿
させ、70％エタノールで洗浄し、風乾し、50μlの1×TE
緩衝液中に再懸濁した。
し、最初のアリコートには6μlのdH 2Oを加え、2つ目の
アリコートには3μlのdH2Oおよび3μlの100mM MgSO4（5
mMの最終Mg++濃度）を加え、最後のアリコートには6μl
の100mM MgSO4（8mMの最終Mg ++濃度）を加えた。PCR増
幅条件は、95℃で2分間の1サイクル、ついで95℃で30秒
間、50℃で30秒間および72℃で2.5分間の5サイクル、つ
いで95℃で30秒間、65℃で30秒間および72℃で2.5分間
の20サイクルであった。15μlの該PCR反応を、0.8％ア
ガロースゲル上の電気泳動により分析した。いくつかの
非特異的な増幅されたDNAバックグラウンドのうち、以
下の産物が認められた：1700bpの断片、および接近して
位置する2つのApoIで消化された環状鋳型からの約1500b
pの断片、BstYIで消化された環状鋳型からの1500bpの断
片、BsaHIで消化された環状鋳型からの900bpの断片およ
び750bpの断片、およびEagIで消化された環状鋳型から
の2500bpの断片。これらの増幅産物をゲル精製した。ゲ
ル精製：100μlのPCR反応を1％LMPアガロース中に電気
泳動し、バンドを該ゲルから切り出し、65℃で5分間溶
融し、40℃に5分間冷却し、40℃で1時間インキュベート
すると共に5単位のβ-アガロース（New England Biolab
s #392）を加えることにより該アガロースを消化した。
ついで、それを1容量の平衡化フェノール：クロロホル
ム（50：50, v/v）で抽出し、該水相を回収し、1容量の
クロロホルムで2回抽出した。1/10容量の5MNaClおよび2
容量の2-プロパノールを加えることにより該DNAを沈殿
させ、70％エタノールで洗浄し、風乾し、50μlの1×TE
緩衝液中に再懸濁した。
【００５６】また、リン酸化プライマーPmeI-IP1および
PmeI-IP3を使用し、前記と同じ鋳型セットを前記と同様
に使用して、逆PCR反応を行なった。15μlの該PCR反応
を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分析し
た。以下の断片をゲル精製した：ApoIで消化された環状
鋳型からの2000bp、1800bpおよび870bpの断片、BstYIで
消化された環状鋳型からの1350bpの断片、BsrFIで消化
された環状鋳型からの1200bpの断片、BssHIIで消化され
た環状鋳型からの2100bpおよび1400bpの断片、EagIで消
化された環状鋳型からの2500bpの断片、ならびにNlaIII
で消化された環状鋳型からの800bpの断片。
PmeI-IP3を使用し、前記と同じ鋳型セットを前記と同様
に使用して、逆PCR反応を行なった。15μlの該PCR反応
を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分析し
た。以下の断片をゲル精製した：ApoIで消化された環状
鋳型からの2000bp、1800bpおよび870bpの断片、BstYIで
消化された環状鋳型からの1350bpの断片、BsrFIで消化
された環状鋳型からの1200bpの断片、BssHIIで消化され
た環状鋳型からの2100bpおよび1400bpの断片、EagIで消
化された環状鋳型からの2500bpの断片、ならびにNlaIII
で消化された環状鋳型からの800bpの断片。
【００５７】ゲル精製された各増幅DNA産物を、それぞ
れ以下のとおりにベクターpUC19中に連結した。予めSma
Iで切断され仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIP）で
脱リン酸化された100ngのpUC19ベクターに5μlのゲル精
製DNAを、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液（50mM Tris-HCl, 1
0mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM ATP, 25μg/ml BSA, pH7.
5）の最終容量20μl中、400UのT4 DNAリガーゼで連結し
た。ついで10μlの該連結混合物を大腸菌（E. coli）ER
2267株中に形質転換し、100μg/mlアンピシリン、40μg
/ml Xgalおよび50μg/ml IPTGを含有するL-ブロスプレ
ート上で個々のコロニーについてプレーティングした。
白色コロニーを個々に拾い、100μg/mlアンピシリンを
含有する10mlのL-ブロスに接種し、37℃で一晩増殖させ
た。ミニプレップを行ない、該精製DNAを消化し、それ
をアガロースゲル電気泳動により分析することにより、
所望の構築物のクローンを同定した。
れ以下のとおりにベクターpUC19中に連結した。予めSma
Iで切断され仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIP）で
脱リン酸化された100ngのpUC19ベクターに5μlのゲル精
製DNAを、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液（50mM Tris-HCl, 1
0mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM ATP, 25μg/ml BSA, pH7.
5）の最終容量20μl中、400UのT4 DNAリガーゼで連結し
た。ついで10μlの該連結混合物を大腸菌（E. coli）ER
2267株中に形質転換し、100μg/mlアンピシリン、40μg
/ml Xgalおよび50μg/ml IPTGを含有するL-ブロスプレ
ート上で個々のコロニーについてプレーティングした。
白色コロニーを個々に拾い、100μg/mlアンピシリンを
含有する10mlのL-ブロスに接種し、37℃で一晩増殖させ
た。ミニプレップを行ない、該精製DNAを消化し、それ
をアガロースゲル電気泳動により分析することにより、
所望の構築物のクローンを同定した。
【００５８】ミニプレップ法：各培養を8000rpmで5分間
遠心分離し、上清を棄て、細胞ペレットを1.0mlの25mM
Tris、10mM EDTA、50mMグルコース（pH8.0）に再懸濁し
た。室温で10分後、2mlの0.2M NaOH、1%SDSを各管に加
え、該管を振とうして該細胞を溶解し、ついで氷上に配
置した。溶液が清澄化したら、1.5mlの3M酢酸ナトリウ
ム（pH4.8）をそれぞれに加え、振とうした。生成した
沈殿物を15,000rpm、4℃で10分間遠心沈殿させた。各上
清を注ぎ、混合した。室温で10分後、該管を15,000rpm
で10分間遠心して、沈殿した核酸をペレット化した。上
清を棄て、該ペレットを室温で30分間風乾した。乾燥し
たら、該ペレットを、100μg/ml RNアーゼを含有する85
0μlの10mM Tris（pH 8.0）、1mM EDTAに溶解し、37℃
で1時間インキュベートして、該RNAを消化した。85μl
の5M NaCl、ついで600μlのイソプロパノールを加える
ことにより、該DNAを沈殿させた。室温で10分間後、該D
NAを5分間の遠心分離により遠心沈殿させ、上清を棄
て、該ペレットを乾燥し、ついで10mM Tris、1mM EDTA
（pH 8.0）（1×TE）の150μlの最終溶液に再溶解し
た。ついで該プラスミドミニプレップを、種々の制限エ
ンドヌクレアーゼでの消化により分析した。
遠心分離し、上清を棄て、細胞ペレットを1.0mlの25mM
Tris、10mM EDTA、50mMグルコース（pH8.0）に再懸濁し
た。室温で10分後、2mlの0.2M NaOH、1%SDSを各管に加
え、該管を振とうして該細胞を溶解し、ついで氷上に配
置した。溶液が清澄化したら、1.5mlの3M酢酸ナトリウ
ム（pH4.8）をそれぞれに加え、振とうした。生成した
沈殿物を15,000rpm、4℃で10分間遠心沈殿させた。各上
清を注ぎ、混合した。室温で10分後、該管を15,000rpm
で10分間遠心して、沈殿した核酸をペレット化した。上
清を棄て、該ペレットを室温で30分間風乾した。乾燥し
たら、該ペレットを、100μg/ml RNアーゼを含有する85
0μlの10mM Tris（pH 8.0）、1mM EDTAに溶解し、37℃
で1時間インキュベートして、該RNAを消化した。85μl
の5M NaCl、ついで600μlのイソプロパノールを加える
ことにより、該DNAを沈殿させた。室温で10分間後、該D
NAを5分間の遠心分離により遠心沈殿させ、上清を棄
て、該ペレットを乾燥し、ついで10mM Tris、1mM EDTA
（pH 8.0）（1×TE）の150μlの最終溶液に再溶解し
た。ついで該プラスミドミニプレップを、種々の制限エ
ンドヌクレアーゼでの消化により分析した。
【００５９】6．DNA配列決定：ABI 373自動配列決定シ
ステムを製造業者の指示に従い使用し、M13/pUCプライ
マー#1233および#1224（NEB）を使用して、DNA配列決定
を行なった。第5節に記載の逆PCR反応からのDNA断片を
含有する種々のpUC19構築物のミニプレップDNA調製物
を、鋳型として使用した。唯一のクローンが、PmeIエン
ドヌクレアーゼのアミノ酸配列（プライマーPmeI-IP1お
よびPmeI-IP3を使用する逆PCR反応において、BssHIIで
消化された環状鋳型から増幅した1400bpの断片）と符合
する配列を有していた。このクローンをpUC19BssHII21
と称することにした。このクローンの一方の末端のDNA
配列は、プライマーPmeI-IP1から3’側のPmeIエンドヌ
クレアーゼ配列の部分と符合した。しかしながら、もう
一方の末端からのDNA配列は、プライマーPmeI-IP3から
3’側のPmeIエンドヌクレアーゼ配列の部分とは符合し
なかった。プライマーPmeI-IP1は、PmeIゲノムDNA上の
所望の位置でハイブリダイズし、プライマーPmeI-IP3
は、おそらく該プライマー配列上のミスマッチのため、
PmeIゲノムDNA上の他の位置でハイブリダイズする、と
結論した。第4および第5残基（AsnおよびSer）に関して
コドン配列の相違があったため、これらの残基をコード
するDNA配列を排除するように逆PCRプライマーの新たな
セットを設計した。
ステムを製造業者の指示に従い使用し、M13/pUCプライ
マー#1233および#1224（NEB）を使用して、DNA配列決定
を行なった。第5節に記載の逆PCR反応からのDNA断片を
含有する種々のpUC19構築物のミニプレップDNA調製物
を、鋳型として使用した。唯一のクローンが、PmeIエン
ドヌクレアーゼのアミノ酸配列（プライマーPmeI-IP1お
よびPmeI-IP3を使用する逆PCR反応において、BssHIIで
消化された環状鋳型から増幅した1400bpの断片）と符合
する配列を有していた。このクローンをpUC19BssHII21
と称することにした。このクローンの一方の末端のDNA
配列は、プライマーPmeI-IP1から3’側のPmeIエンドヌ
クレアーゼ配列の部分と符合した。しかしながら、もう
一方の末端からのDNA配列は、プライマーPmeI-IP3から
3’側のPmeIエンドヌクレアーゼ配列の部分とは符合し
なかった。プライマーPmeI-IP1は、PmeIゲノムDNA上の
所望の位置でハイブリダイズし、プライマーPmeI-IP3
は、おそらく該プライマー配列上のミスマッチのため、
PmeIゲノムDNA上の他の位置でハイブリダイズする、と
結論した。第4および第5残基（AsnおよびSer）に関して
コドン配列の相違があったため、これらの残基をコード
するDNA配列を排除するように逆PCRプライマーの新たな
セットを設計した。
【００６０】7．該エンドヌクレアーゼ遺伝子のN末端に
隣接したDNAを増幅しクローニングするための、新たな
プライマーセットを使用する逆PCR増幅：工程6で得たDN
A配列に従い、プライマーPmeI-IP4およびPmeI-IP5を設
計した。プライマーPmeI-IP4は、アミノ酸残基Val-Gly-
Met-IIe-Asp（配列番号13）に対応するヌクレオチド
と、Gluのコドンの最初の2つのヌクレオチドとを含んで
いた。また、クローニングを容易にするために、このプ
ライマーにはBamHI部位を含めた。 プライマーPmeI-IP4 5’ GTTGGATCCGTCGGCATGATCGACGA-3’（配列番号14） プライマーPmeI-IP5は、Glyのコドンの最初の2つのヌク
レオチドとアミノ酸残基Val-Asp-Ser-Proに対応するヌ
クレオチドとにハイブリダイズするように設計した。ま
た、クローニングを容易にするために、このプライマー
にはBamHI部位を含めた。 プライマーPmeI-IP5 5’ CATGGATCCGACGTCTGAGGG-3’（配列番号15） BsaWIで消化され環化されたPmeI DNAを鋳型として使用
して、逆PCR反応を行なった。該産物の増幅を成功させ
た反応においては、 10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液 6μlの4mM dNTP溶液 3μlの100mM MgSO4（5mMの最終Mg++濃度） 5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP4 5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP5 12μlの環化DNA鋳型（約25ng） 58μlのdH2O 2μl（4単位）のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼNE
B#257 を合わせることにより、反応混合物を調製した。
隣接したDNAを増幅しクローニングするための、新たな
プライマーセットを使用する逆PCR増幅：工程6で得たDN
A配列に従い、プライマーPmeI-IP4およびPmeI-IP5を設
計した。プライマーPmeI-IP4は、アミノ酸残基Val-Gly-
Met-IIe-Asp（配列番号13）に対応するヌクレオチド
と、Gluのコドンの最初の2つのヌクレオチドとを含んで
いた。また、クローニングを容易にするために、このプ
ライマーにはBamHI部位を含めた。 プライマーPmeI-IP4 5’ GTTGGATCCGTCGGCATGATCGACGA-3’（配列番号14） プライマーPmeI-IP5は、Glyのコドンの最初の2つのヌク
レオチドとアミノ酸残基Val-Asp-Ser-Proに対応するヌ
クレオチドとにハイブリダイズするように設計した。ま
た、クローニングを容易にするために、このプライマー
にはBamHI部位を含めた。 プライマーPmeI-IP5 5’ CATGGATCCGACGTCTGAGGG-3’（配列番号15） BsaWIで消化され環化されたPmeI DNAを鋳型として使用
して、逆PCR反応を行なった。該産物の増幅を成功させ
た反応においては、 10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液 6μlの4mM dNTP溶液 3μlの100mM MgSO4（5mMの最終Mg++濃度） 5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP4 5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP5 12μlの環化DNA鋳型（約25ng） 58μlのdH2O 2μl（4単位）のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼNE
B#257 を合わせることにより、反応混合物を調製した。
【００６１】PCR増幅条件は、95℃で2分間の1サイク
ル、ついで95℃で30秒間、40℃で1分間および72℃で2.5
分間の5サイクル、ついで95℃で30秒間、60℃で1分間お
よび72℃で2.5分間の20サイクルであった。15μlの該PC
R反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分析
した。
ル、ついで95℃で30秒間、40℃で1分間および72℃で2.5
分間の5サイクル、ついで95℃で30秒間、60℃で1分間お
よび72℃で2.5分間の20サイクルであった。15μlの該PC
R反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分析
した。
【００６２】900bpの産物が認められ、それをゲル精製
し、50μlの1×TEに再懸濁した。5μlのこのDNAを、1×
BamHI緩衝液（150mM NaCl, 10mM Tris-HCl,10mM MgCl2,
1mMジチオトレイトール, pH7.9）の最終容量20μl中、
20UのBamHI（NEB#136）で37℃で1時間消化した。該反応
混合物を78℃で20分間インキュベートすることにより、
制限エンドヌクレアーゼBamHIを熱不活性化した。消化
されたDNA 5μlを、予めBamHIで切断されCIPで脱リン酸
化されアガロースゲルで精製された100ngのベクターpUC
19に、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液の最終容量20μl中、40
0UのT4 DNAリガーゼを使用して16℃で2時間連結した。1
0μlの該連結混合物を大腸菌（E. coli）ER2267株中に
形質転換し、100μg/mlアンピシリン、40μg/ml Xgalお
よび50μg/ml IPTGを含有するL-ブロスプレート上で個
々のコロニーについてプレーティングした。白色コロニ
ーを個々に拾い、100μg/mlアンピシリンを含有する10m
lのL-ブロスに接種し、37℃で一晩増殖させた。ミニプ
レップを行ない、該精製DNAを消化し、それをアガロー
スゲル電気泳動により分析することにより、所望の構築
物のクローンを同定した。その900bpの断片を含有するp
UC19BsaWI5と称される1つのクローンを配列決定した。
し、50μlの1×TEに再懸濁した。5μlのこのDNAを、1×
BamHI緩衝液（150mM NaCl, 10mM Tris-HCl,10mM MgCl2,
1mMジチオトレイトール, pH7.9）の最終容量20μl中、
20UのBamHI（NEB#136）で37℃で1時間消化した。該反応
混合物を78℃で20分間インキュベートすることにより、
制限エンドヌクレアーゼBamHIを熱不活性化した。消化
されたDNA 5μlを、予めBamHIで切断されCIPで脱リン酸
化されアガロースゲルで精製された100ngのベクターpUC
19に、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液の最終容量20μl中、40
0UのT4 DNAリガーゼを使用して16℃で2時間連結した。1
0μlの該連結混合物を大腸菌（E. coli）ER2267株中に
形質転換し、100μg/mlアンピシリン、40μg/ml Xgalお
よび50μg/ml IPTGを含有するL-ブロスプレート上で個
々のコロニーについてプレーティングした。白色コロニ
ーを個々に拾い、100μg/mlアンピシリンを含有する10m
lのL-ブロスに接種し、37℃で一晩増殖させた。ミニプ
レップを行ない、該精製DNAを消化し、それをアガロー
スゲル電気泳動により分析することにより、所望の構築
物のクローンを同定した。その900bpの断片を含有するp
UC19BsaWI5と称される1つのクローンを配列決定した。
【００６３】8．クローンpUC19BsaWI5のDNA配列決定：A
BI 373自動配列決定システムを製造業者の指示に従い使
用し、M13/pUCプライマー#1233および#1224（New Engla
nd Biolabs, Beverly, MA）ならびに鋳型としてpUC19Bs
aWI5ミニプレップDNA調製物を使用して、DNA配列決定を
行なった。このクローンの一方の末端のDNA配列は、プ
ライマーPmeI-IP4から3’側の及びそれに対応するPmeI
エンドヌクレアーゼ配列の部分と符合した。また、もう
一方の末端からのDNA配列は、プライマーPmeI-IP5から
3’側の及びそれに対応するPmeIエンドヌクレアーゼ配
列の部分と符合した。残基4（Asn）および残基5（Ser）
のコドン配列は、5’ AAC 3’および5’ TCC 3’である
ことが判明した。第3節で得たN末端タンパク質の配列デ
ータと符合するN末端アミノ酸を有する693bpのオープン
リーディングフレームがPmeI制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子であると確認した。エンドヌクレアーゼ遺伝子に対
し直ぐ3’側の700bpのDNA配列から翻訳された6フレーム
のアミノ酸配列を、種々の型の公知メチラーゼの保存ア
ミノ酸モチーフと比較したが、これらのモチーフと相同
なアミノ酸配列を同定することはできなかった。同様
に、該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し直ぐ5’側に隣
接した200bpのDNA配列から翻訳された6フレームのアミ
ノ酸配列からは、明らかなメチラーゼモチーフを見出す
ことができなかった。可能なPmeIメチラーゼ遺伝子を位
置づけるために、該エンドヌクレアーゼ遺伝子の両側か
ら更に離れて位置するDNA領域を、後続の工程において
増幅し、クローニングし、配列決定した。
BI 373自動配列決定システムを製造業者の指示に従い使
用し、M13/pUCプライマー#1233および#1224（New Engla
nd Biolabs, Beverly, MA）ならびに鋳型としてpUC19Bs
aWI5ミニプレップDNA調製物を使用して、DNA配列決定を
行なった。このクローンの一方の末端のDNA配列は、プ
ライマーPmeI-IP4から3’側の及びそれに対応するPmeI
エンドヌクレアーゼ配列の部分と符合した。また、もう
一方の末端からのDNA配列は、プライマーPmeI-IP5から
3’側の及びそれに対応するPmeIエンドヌクレアーゼ配
列の部分と符合した。残基4（Asn）および残基5（Ser）
のコドン配列は、5’ AAC 3’および5’ TCC 3’である
ことが判明した。第3節で得たN末端タンパク質の配列デ
ータと符合するN末端アミノ酸を有する693bpのオープン
リーディングフレームがPmeI制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子であると確認した。エンドヌクレアーゼ遺伝子に対
し直ぐ3’側の700bpのDNA配列から翻訳された6フレーム
のアミノ酸配列を、種々の型の公知メチラーゼの保存ア
ミノ酸モチーフと比較したが、これらのモチーフと相同
なアミノ酸配列を同定することはできなかった。同様
に、該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し直ぐ5’側に隣
接した200bpのDNA配列から翻訳された6フレームのアミ
ノ酸配列からは、明らかなメチラーゼモチーフを見出す
ことができなかった。可能なPmeIメチラーゼ遺伝子を位
置づけるために、該エンドヌクレアーゼ遺伝子の両側か
ら更に離れて位置するDNA領域を、後続の工程において
増幅し、クローニングし、配列決定した。
【００６４】9．PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子に対し
5’側のDNAのクローニング：制限エンドヌクレアーゼAp
oI、EagI、BssHII、BsrF、HaeIIおよびBstYIで消化され
環化された第5節からのシュードモナス・メンドシナ（P
seudomonas mendocina）DNAを、逆PCR増幅のための鋳型
として使用した。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の内部
およびその5’末端に対してアニーリングするように、
以下に示すプライマーPmeI-IP6およびPmeI-IP7を設計し
た。クローニングを容易にするために、両プライマーは
PstI部位を含有する。 プライマーPmeI-IP6 5’-ホスホ-GTTCTGCAGCTCGTTGTCTTCTTCTGC-3’（配列番
号16） プライマーPmeI-IP7 5’-ホスホ-ATCCTGCAGGCGACGTTCGGACGATG-3’（配列番
号17） 該産物の増幅を成功させた反応においては、 10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液（最終濃度2mM
のMg++を含有） 6μlの4mM dNTP溶液 5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP6 5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP7 12μlの環化DNA鋳型（約25ng） 58μlのdH2O 2μl（4単位）のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼNE
B#257 を合わせることにより、反応混合物を調製した。
5’側のDNAのクローニング：制限エンドヌクレアーゼAp
oI、EagI、BssHII、BsrF、HaeIIおよびBstYIで消化され
環化された第5節からのシュードモナス・メンドシナ（P
seudomonas mendocina）DNAを、逆PCR増幅のための鋳型
として使用した。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の内部
およびその5’末端に対してアニーリングするように、
以下に示すプライマーPmeI-IP6およびPmeI-IP7を設計し
た。クローニングを容易にするために、両プライマーは
PstI部位を含有する。 プライマーPmeI-IP6 5’-ホスホ-GTTCTGCAGCTCGTTGTCTTCTTCTGC-3’（配列番
号16） プライマーPmeI-IP7 5’-ホスホ-ATCCTGCAGGCGACGTTCGGACGATG-3’（配列番
号17） 該産物の増幅を成功させた反応においては、 10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液（最終濃度2mM
のMg++を含有） 6μlの4mM dNTP溶液 5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP6 5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP7 12μlの環化DNA鋳型（約25ng） 58μlのdH2O 2μl（4単位）のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼNE
B#257 を合わせることにより、反応混合物を調製した。
【００６５】PCR増幅条件は、95℃で2分間の1サイク
ル、ついで95℃で20秒間、50℃で1分間および72℃で2.5
分間の5サイクル、ついで95℃で30秒間、65℃で1分間お
よび72℃で2.5分間の20サイクルであった。15μlの該PC
R反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分析
した。
ル、ついで95℃で20秒間、50℃で1分間および72℃で2.5
分間の5サイクル、ついで95℃で30秒間、65℃で1分間お
よび72℃で2.5分間の20サイクルであった。15μlの該PC
R反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分析
した。
【００６６】いくつかの非特異的増幅バックグラウンド
DNAのうち、1.8kbの産物がApoI環状鋳型PCR反応におい
て認められ、1.6kbの産物がBssHII環状鋳型PCR反応にお
いて認められ、3.3kbの産物がBstYI環状鋳型PCR反応に
おいて認められ、1.6kbの産物がEagl環状鋳型PCR反応に
おいて認められ、0.9kbの産物がHaeII環状鋳型PCR反応
において認められた。これらの5つの産物をゲル精製
し、60μlの1×TEに再懸濁した（BstYI産物は20μlの1
×TEに再懸濁した）。ゲル精製されたApoI産物5μlを、
予めSmaIで切断されCIPで脱リン酸化されアガロースゲ
ルで精製された100ngのベクターpUC19に、1×T4 DNAリ
ガーゼ緩衝液の最終容量20μl中、400UのT4 DNAリガー
ゼを使用して16℃で2時間連結した。ゲル精製されたBss
HII、EagI、HaeIIおよびBstYI産物を、前記のとおり、
同様にしてpUC19中に連結した。10μlの各連結混合物を
大腸菌（E. coli）ER2267株中に形質転換し、100μg/ml
アンピシリン、40μg/ml Xgalおよび50μg/ml IPTGを含
有するL-ブロスプレート上で個々のコロニーについてプ
レーティングした。白色コロニーを個々に拾い、100μg
/mlアンピシリンを含有する10mlのL-ブロスに接種し、3
7℃で一晩増殖させた。ミニプレップを行ない、該精製D
NAを消化し、それをアガロースゲル電気泳動により分析
することにより、所望の構築物のクローンを同定した。
DNAのうち、1.8kbの産物がApoI環状鋳型PCR反応におい
て認められ、1.6kbの産物がBssHII環状鋳型PCR反応にお
いて認められ、3.3kbの産物がBstYI環状鋳型PCR反応に
おいて認められ、1.6kbの産物がEagl環状鋳型PCR反応に
おいて認められ、0.9kbの産物がHaeII環状鋳型PCR反応
において認められた。これらの5つの産物をゲル精製
し、60μlの1×TEに再懸濁した（BstYI産物は20μlの1
×TEに再懸濁した）。ゲル精製されたApoI産物5μlを、
予めSmaIで切断されCIPで脱リン酸化されアガロースゲ
ルで精製された100ngのベクターpUC19に、1×T4 DNAリ
ガーゼ緩衝液の最終容量20μl中、400UのT4 DNAリガー
ゼを使用して16℃で2時間連結した。ゲル精製されたBss
HII、EagI、HaeIIおよびBstYI産物を、前記のとおり、
同様にしてpUC19中に連結した。10μlの各連結混合物を
大腸菌（E. coli）ER2267株中に形質転換し、100μg/ml
アンピシリン、40μg/ml Xgalおよび50μg/ml IPTGを含
有するL-ブロスプレート上で個々のコロニーについてプ
レーティングした。白色コロニーを個々に拾い、100μg
/mlアンピシリンを含有する10mlのL-ブロスに接種し、3
7℃で一晩増殖させた。ミニプレップを行ない、該精製D
NAを消化し、それをアガロースゲル電気泳動により分析
することにより、所望の構築物のクローンを同定した。
【００６７】10．該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し
5’側のDNAの配列決定：ABI 373自動配列決定システム
を製造業者の指示に従い使用し、M13/pUCプライマー#12
33および#1224（NEB）を使用して、第9節からの所望の
挿入断片を有する構築物を配列決定した。該構築物のミ
ニプレップDNA調製物を、鋳型として使用した。BstYIで
環化された鋳型からの3.3kbの増幅産物とHaeIIで環化さ
れた鋳型からの0.9kbの増幅産物との末端は、両方の逆P
CRプライマーPmeI-IP6およびPmeI-IP7に対し3’側の公
知DNA領域と符合した。プライマーウォーキングおよび
配列決定により、完全な配列を得た。その3.3kbの産物
は2.9kbの新たなDNA配列を含有し、その0.9kbの産物は2
00bpの新たなDNA配列を含有していた。その新たなDNA配
列内には、明らかなメチラーゼモチーフは認められなか
った。
5’側のDNAの配列決定：ABI 373自動配列決定システム
を製造業者の指示に従い使用し、M13/pUCプライマー#12
33および#1224（NEB）を使用して、第9節からの所望の
挿入断片を有する構築物を配列決定した。該構築物のミ
ニプレップDNA調製物を、鋳型として使用した。BstYIで
環化された鋳型からの3.3kbの増幅産物とHaeIIで環化さ
れた鋳型からの0.9kbの増幅産物との末端は、両方の逆P
CRプライマーPmeI-IP6およびPmeI-IP7に対し3’側の公
知DNA領域と符合した。プライマーウォーキングおよび
配列決定により、完全な配列を得た。その3.3kbの産物
は2.9kbの新たなDNA配列を含有し、その0.9kbの産物は2
00bpの新たなDNA配列を含有していた。その新たなDNA配
列内には、明らかなメチラーゼモチーフは認められなか
った。
【００６８】11．該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し
3’側のDNAの増幅およびクローニング：該エンドヌクレ
アーゼ遺伝子に対し3’側のDNA情報を得るために、2つ
の連続した逆PCR増幅実験を行なった。
3’側のDNAの増幅およびクローニング：該エンドヌクレ
アーゼ遺伝子に対し3’側のDNA情報を得るために、2つ
の連続した逆PCR増幅実験を行なった。
【００６９】A．逆PCR増幅#1：逆PCR増幅のための鋳型
の調製：3μgのゲノムシュードモナス・メンドシナ（Ps
eudomonas mendocina）DNAを、100μlの反応容量の1×N
E緩衝液#4（20mM Tris-酢酸, 10mM酢酸マグネシウム, 5
0mM酢酸カリウム, 1mM DTT,pH 7.9）中の100UのAatII制
限エンドヌクレアーゼで37℃で1時間消化した。該制限
消化混合物を1容量の平衡化フェノール：クロロホルム
（50：50, v/v）で抽出し、該水相を回収し、1容量のク
ロロホルムで2回抽出した。1/10容量の5M NaClおよび1
容量の2-プロパノールを加えることにより該DNAを沈殿
させ、ついで70％氷冷エタノールで洗浄した。該DNAを5
0μlの1×TEに再懸濁した。2000UのT4 DNAリガーゼを使
用して、この消化されたシュードモナス・メンドシナ
（Pseudomonas mendocina）DNA 10μl（約0.5μg）を50
0μlの1×リガーゼ緩衝液中で16℃で一晩環化した。環
化されHinp1I、MscI、MseI、SacI、StuIおよびTsp509I
で消化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomona
s mendocina）DNAを、同様にして調製した。これらの環
化DNAと、BsaHIで消化され環化された第5節からのDNAと
を、後続の逆PCR反応の鋳型として使用した。
の調製：3μgのゲノムシュードモナス・メンドシナ（Ps
eudomonas mendocina）DNAを、100μlの反応容量の1×N
E緩衝液#4（20mM Tris-酢酸, 10mM酢酸マグネシウム, 5
0mM酢酸カリウム, 1mM DTT,pH 7.9）中の100UのAatII制
限エンドヌクレアーゼで37℃で1時間消化した。該制限
消化混合物を1容量の平衡化フェノール：クロロホルム
（50：50, v/v）で抽出し、該水相を回収し、1容量のク
ロロホルムで2回抽出した。1/10容量の5M NaClおよび1
容量の2-プロパノールを加えることにより該DNAを沈殿
させ、ついで70％氷冷エタノールで洗浄した。該DNAを5
0μlの1×TEに再懸濁した。2000UのT4 DNAリガーゼを使
用して、この消化されたシュードモナス・メンドシナ
（Pseudomonas mendocina）DNA 10μl（約0.5μg）を50
0μlの1×リガーゼ緩衝液中で16℃で一晩環化した。環
化されHinp1I、MscI、MseI、SacI、StuIおよびTsp509I
で消化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomona
s mendocina）DNAを、同様にして調製した。これらの環
化DNAと、BsaHIで消化され環化された第5節からのDNAと
を、後続の逆PCR反応の鋳型として使用した。
【００７０】以下に示す配列のプライマーPmeI-IP8およ
びPmeI-IP9を使用して、該エンドヌクレアーゼ遺伝子に
対し3’側のDNAを増幅した。クローニングを容易にする
ために、両プライマーはPstI部位を含有している。 プライマーPmeI-IP8 5’-pGGTCTGCAGTCGGGCAGAACGTGATATTCGA-3’（配列番号
18） プライマーPmeI-IP9 5’-pGTTCTGCAGGCCATTTGGCACCCTG-3’（配列番号19） 該産物の増幅を成功させた反応においては、 10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液（最終濃度2mM
のMg++を含有） 6μlの4mM dNTP溶液 5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP8 5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP9 12μlの環化DNA鋳型（約25ng） 58μlのdH2O 2μl（4単位）のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼNE
B#257 を合わせることにより、反応混合物を調製した。
びPmeI-IP9を使用して、該エンドヌクレアーゼ遺伝子に
対し3’側のDNAを増幅した。クローニングを容易にする
ために、両プライマーはPstI部位を含有している。 プライマーPmeI-IP8 5’-pGGTCTGCAGTCGGGCAGAACGTGATATTCGA-3’（配列番号
18） プライマーPmeI-IP9 5’-pGTTCTGCAGGCCATTTGGCACCCTG-3’（配列番号19） 該産物の増幅を成功させた反応においては、 10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液（最終濃度2mM
のMg++を含有） 6μlの4mM dNTP溶液 5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP8 5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP9 12μlの環化DNA鋳型（約25ng） 58μlのdH2O 2μl（4単位）のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼNE
B#257 を合わせることにより、反応混合物を調製した。
【００７１】PCR増幅条件は、95℃で2分間の1サイク
ル、ついで95℃で20秒間、52℃で30秒間および72℃で2.
5分間の5サイクル、ついで95℃で30秒間、65℃で30秒間
および72℃で2.5分間の20サイクルであった。15μlの該
PCR反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分
析した。
ル、ついで95℃で20秒間、52℃で30秒間および72℃で2.
5分間の5サイクル、ついで95℃で30秒間、65℃で30秒間
および72℃で2.5分間の20サイクルであった。15μlの該
PCR反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分
析した。
【００７２】いくつかの非特異的増幅バックグラウンド
DNAのうち、1.1kbの産物がAatII環状鋳型PCR反応におい
て認められ、1.4kbの産物がMscI環状鋳型PCR反応におい
て認められ、0.7kbの産物がBsaHI環状鋳型PCR反応にお
いて認められた。これらの産物をゲル精製し、20μlの1
×TEに再懸濁した。ゲル精製されたAatII産物2μlを、
予めSmaIで切断されCIPで脱リン酸化されアガロースゲ
ルで精製された100ngのベクターpUC19に、1×T4 DNAリ
ガーゼ緩衝液の最終容量20μl中、400UのT4 DNAリガー
ゼを使用して16℃で2時間連結した。ゲル精製されたMsc
IおよびBsaHI産物を、前記のとおり、同様にしてpUC19
中に連結した。10μlの各連結混合物を大腸菌（E. col
i）ER2267株中に形質転換し、100μg/mlアンピシリン、
40μg/ml Xgalおよび50μg/ml IPTGを含有するL-ブロス
プレート上で個々のコロニーについてプレーティングし
た。白色コロニーを個々に拾い、100μg/mlアンピシリ
ンを含有する10mlのL-ブロスに接種し、攪拌・通気しな
がら37℃で一晩増殖させた。ミニプレップを行ない、該
精製DNAを消化し、それをアガロースゲル電気泳動によ
り分析することにより、所望の構築物のクローンを同定
した。M13/pUCプライマー#1233および#1224（NEB）を使
用して、これらのクローン中の増幅産物を配列決定し
た。この領域に対し3’側の更なるDNA配列情報を得るた
めの後続の逆PCR増幅で使用する以下に示すプライマーP
meI-IP10およびプライマーPmeI-IP11を設計するため
に、これらの新たに得られたDNA配列を使用した。 PmeI-IP10 5’-ホスホ-GTTCTGCAGCCGTTTCGATGGGCCTTCTC-3’（配列
番号20） PmeI-IP11 5’-ホスホ-GTTCTGCAGAATGAGCTGCGCCAGTTG-3’（配列番
号21） B．逆PCR増幅#2：HaeIIで消化され環化されたシュード
モナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNA（第
5節）を、プライマーPmeI-IP10およびプライマーPmeI-I
P11を用いる逆PCR増幅において鋳型として使用した。該
産物の増幅を成功させた反応においては、 10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液（最終濃度2mM
のMg++を含有） 6μlの4mM dNTP溶液 5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP10 5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP11 12μlの環化DNA鋳型（約25ng） 58μlのdH2O 2μl（4単位）のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼNE
B#257 を合わせることにより、反応混合物を調製した。
DNAのうち、1.1kbの産物がAatII環状鋳型PCR反応におい
て認められ、1.4kbの産物がMscI環状鋳型PCR反応におい
て認められ、0.7kbの産物がBsaHI環状鋳型PCR反応にお
いて認められた。これらの産物をゲル精製し、20μlの1
×TEに再懸濁した。ゲル精製されたAatII産物2μlを、
予めSmaIで切断されCIPで脱リン酸化されアガロースゲ
ルで精製された100ngのベクターpUC19に、1×T4 DNAリ
ガーゼ緩衝液の最終容量20μl中、400UのT4 DNAリガー
ゼを使用して16℃で2時間連結した。ゲル精製されたMsc
IおよびBsaHI産物を、前記のとおり、同様にしてpUC19
中に連結した。10μlの各連結混合物を大腸菌（E. col
i）ER2267株中に形質転換し、100μg/mlアンピシリン、
40μg/ml Xgalおよび50μg/ml IPTGを含有するL-ブロス
プレート上で個々のコロニーについてプレーティングし
た。白色コロニーを個々に拾い、100μg/mlアンピシリ
ンを含有する10mlのL-ブロスに接種し、攪拌・通気しな
がら37℃で一晩増殖させた。ミニプレップを行ない、該
精製DNAを消化し、それをアガロースゲル電気泳動によ
り分析することにより、所望の構築物のクローンを同定
した。M13/pUCプライマー#1233および#1224（NEB）を使
用して、これらのクローン中の増幅産物を配列決定し
た。この領域に対し3’側の更なるDNA配列情報を得るた
めの後続の逆PCR増幅で使用する以下に示すプライマーP
meI-IP10およびプライマーPmeI-IP11を設計するため
に、これらの新たに得られたDNA配列を使用した。 PmeI-IP10 5’-ホスホ-GTTCTGCAGCCGTTTCGATGGGCCTTCTC-3’（配列
番号20） PmeI-IP11 5’-ホスホ-GTTCTGCAGAATGAGCTGCGCCAGTTG-3’（配列番
号21） B．逆PCR増幅#2：HaeIIで消化され環化されたシュード
モナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNA（第
5節）を、プライマーPmeI-IP10およびプライマーPmeI-I
P11を用いる逆PCR増幅において鋳型として使用した。該
産物の増幅を成功させた反応においては、 10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液（最終濃度2mM
のMg++を含有） 6μlの4mM dNTP溶液 5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP10 5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP11 12μlの環化DNA鋳型（約25ng） 58μlのdH2O 2μl（4単位）のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼNE
B#257 を合わせることにより、反応混合物を調製した。
【００７３】PCR増幅条件は、95℃で2分間の1サイク
ル、ついで95℃で20秒間、60℃で30秒間および72℃で2.
5分間の5サイクル、ついで95℃で30秒間、65℃で30秒間
および72℃で2.5分間の20サイクルであった。15μlの該
PCR反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分
析した。0.7kbの増幅産物を得、これを、予めSmaIで切
断されCIPで脱リン酸化されアガロースゲルで精製され
たpUC19ベクター中にクローニングした。所望の挿入断
片を保持するプラスミドクローンを同定するために、ミ
ニプレップを行なった。M13/pUCプライマー#1233および
#1224（NEB）を使用して、その0.7kbの産物を配列決定
した。該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し3’側に、約
1.57kbのDNA配列が得られ、このDNAの6フレームアミノ
酸翻訳物からは、明らかなメチラーゼモチーフを見出す
ことはできなかった。
ル、ついで95℃で20秒間、60℃で30秒間および72℃で2.
5分間の5サイクル、ついで95℃で30秒間、65℃で30秒間
および72℃で2.5分間の20サイクルであった。15μlの該
PCR反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分
析した。0.7kbの増幅産物を得、これを、予めSmaIで切
断されCIPで脱リン酸化されアガロースゲルで精製され
たpUC19ベクター中にクローニングした。所望の挿入断
片を保持するプラスミドクローンを同定するために、ミ
ニプレップを行なった。M13/pUCプライマー#1233および
#1224（NEB）を使用して、その0.7kbの産物を配列決定
した。該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し3’側に、約
1.57kbのDNA配列が得られ、このDNAの6フレームアミノ
酸翻訳物からは、明らかなメチラーゼモチーフを見出す
ことはできなかった。
【００７４】12．DraIメチラーゼで修飾されたDNAがPme
I制限消化から保護されうるか否かを確認するための、
ベクターpNEB193中でのDraIメチラーゼの発現：ベクタ
ーpBR322（Jack Benner, New England Biolabs, Inc）
中の5.5kbの挿入断片上にDraIメチラーゼ遺伝子を含有
するDraIメチラーゼ産生クローン（pDraIRM9.7-G2）
を、以下のとおりにSau3AIで部分消化した。7μgのpDra
IRM9.7-G2 DNAを、350μlの1×Sau3AI緩衝液（100mM Na
Cl, 10mMビスTrisプロパン-HCl, 10mM MgCl2, 1mMDTT,
pH 7.0）中に希釈した。この混合物を使用して、Sau3AI
制限エンドヌクレアーゼの系列希釈（50μlの最終容量
中、それぞれ2倍希釈で1単位/μgDNAから1/64単位/μgD
NAまで）を調製した。これらの反応を37℃で15分間イン
キュベートし、ついでSau3AI制限エンドヌクレアーゼを
68℃で20分間熱不活性化した。DNA1μg当たり1/8単位の
Sau3AIの消化から得た消化DNA 0.5μgを使用して、予め
BamHIで切断されCIPで脱リン酸化された200μgのpNEB19
3ベクターに、800UのT4 DNAリガーゼを含有する40μlの
1×T4 DNAリガーゼ緩衝液中、16℃で16時間連結した。
該連結混合物を200μlの大腸菌（E. coli）ER2426株コ
ンピテント細胞中に形質転換し、100μg/mlアンピシリ
ンを含有するL-ブロスプレート上でプレーティングし
た。約10,000個のコロニーを得、これらを6mlの10mM Tr
is、10mM MgCl2（pH7.5）中に掻き取った。このプール2
mlを、100μg/mlアンピシリンを含有する100mlのL-ブロ
ス中に接種し、振とうしながら37℃で8時間増殖させ
た。前記第5節に記載のミニプレップ法を10倍スケール
アップすることにより、プラスミドを単離した。該ミニ
プレップDNAを500μlの1×TEに再懸濁し、2μlを、50μ
lの1×NE緩衝液4中、40単位のDraIで37℃で2時間消化し
た。10μlの該消化混合物を、50μlの大腸菌（E. col
i）ER2426株コンピテント細胞中に形質転換し、100μg/
mlアンピシリンを含有するL-ブロスプレート上でプレー
ティングした。9個の形質転換体からのプラスミドを、
ミニプレップ法により単離し、DraI制限エンドヌクレア
ーゼで消化した。8個のクローンは、DraI消化から完全
に保護された。ついで、これらをPmeI制限エンドヌクレ
アーゼで消化したところ、それらはPmeI制限消化からも
完全に保護されていた。
I制限消化から保護されうるか否かを確認するための、
ベクターpNEB193中でのDraIメチラーゼの発現：ベクタ
ーpBR322（Jack Benner, New England Biolabs, Inc）
中の5.5kbの挿入断片上にDraIメチラーゼ遺伝子を含有
するDraIメチラーゼ産生クローン（pDraIRM9.7-G2）
を、以下のとおりにSau3AIで部分消化した。7μgのpDra
IRM9.7-G2 DNAを、350μlの1×Sau3AI緩衝液（100mM Na
Cl, 10mMビスTrisプロパン-HCl, 10mM MgCl2, 1mMDTT,
pH 7.0）中に希釈した。この混合物を使用して、Sau3AI
制限エンドヌクレアーゼの系列希釈（50μlの最終容量
中、それぞれ2倍希釈で1単位/μgDNAから1/64単位/μgD
NAまで）を調製した。これらの反応を37℃で15分間イン
キュベートし、ついでSau3AI制限エンドヌクレアーゼを
68℃で20分間熱不活性化した。DNA1μg当たり1/8単位の
Sau3AIの消化から得た消化DNA 0.5μgを使用して、予め
BamHIで切断されCIPで脱リン酸化された200μgのpNEB19
3ベクターに、800UのT4 DNAリガーゼを含有する40μlの
1×T4 DNAリガーゼ緩衝液中、16℃で16時間連結した。
該連結混合物を200μlの大腸菌（E. coli）ER2426株コ
ンピテント細胞中に形質転換し、100μg/mlアンピシリ
ンを含有するL-ブロスプレート上でプレーティングし
た。約10,000個のコロニーを得、これらを6mlの10mM Tr
is、10mM MgCl2（pH7.5）中に掻き取った。このプール2
mlを、100μg/mlアンピシリンを含有する100mlのL-ブロ
ス中に接種し、振とうしながら37℃で8時間増殖させ
た。前記第5節に記載のミニプレップ法を10倍スケール
アップすることにより、プラスミドを単離した。該ミニ
プレップDNAを500μlの1×TEに再懸濁し、2μlを、50μ
lの1×NE緩衝液4中、40単位のDraIで37℃で2時間消化し
た。10μlの該消化混合物を、50μlの大腸菌（E. col
i）ER2426株コンピテント細胞中に形質転換し、100μg/
mlアンピシリンを含有するL-ブロスプレート上でプレー
ティングした。9個の形質転換体からのプラスミドを、
ミニプレップ法により単離し、DraI制限エンドヌクレア
ーゼで消化した。8個のクローンは、DraI消化から完全
に保護された。ついで、これらをPmeI制限エンドヌクレ
アーゼで消化したところ、それらはPmeI制限消化からも
完全に保護されていた。
【００７５】13．PmeIエンドヌクレアーゼの過剰発現： A．和合性ベクター上でのDraIメチラーゼのクローニン
グ：pACYC184のBamHI部位中にDraIメチラーゼ遺伝子を
挿入することにより、DraIメチラーゼ遺伝子を発現させ
た。これを行なうために、Sau3AIで部分消化された第12
節で調製したpDraIRM9.7-G2 DNAの0.5μgを、予めBamHI
で切断され脱リン酸化されたベクターpACYAC184中に、8
00UのT4 DNAリガーゼを含有する40μlの1×T4 DNAリガ
ーゼ緩衝液中、16℃で2時間連結した。該連結混合物を2
00μlの大腸菌（E. coli）ER2426株コンピテント細胞中
に形質転換し、25μg/mlクロラムフェニコールを含有す
るL-ブロスプレート上でプレーティングした。約1,600
個のコロニーを得、これらを4mlの10mM Tris、10mM MgC
l2（pH7.5）中に掻き取った。このプール1mlを、25μ/m
lクロラムフェニコールを含有する75mlのL-ブロス中に
接種し、振とうしながら37℃で8時間増殖させた。前記
第5節に記載のミニプレップ法を10倍スケールアップす
ることにより、プラスミドを単離した。該ミニプレップ
DNAを500μlの1×TEに再懸濁し、14,000rpmで5分間遠心
分離した。336μlの該清澄化上清を、64μlの5M NaClお
よび400μlの13％PEG8000と混合し、氷上で1時間インキ
ュベートした。該DNAを14,000rpm、4℃で5分間遠心沈殿
させ、氷冷70％エタノールで洗浄し、風乾した。該DNA
ペレットを500μlの1×TEに再懸濁し、その5μlを、50
μlの1×NE緩衝液4中、60単位のDraIで37℃で1時間消化
した。DraIで消化されたこのDNA 5μlを、50μlのER242
6コンピテント細胞中に形質転換し、25μg/mlクロラム
フェニコールを含有するL-ブロスプレート上でプレーテ
ィングして、個々の形質転換体を得た。14個の形質転換
体からのプラスミドを、ミニプレップ法により単離し、
DraI制限エンドヌクレアーゼで消化した。これらのうち
の12個のクローンは、DraI消化から完全に保護されてい
た。さらなる制限分析は、pACYC184DraIM10およびpACYC
184DraIM13の2つのクローンが同一であり、約3kbの最小
の挿入断片を含有していることを示した。クローンpACY
C184DraIM10を、PmeIエンドヌクレアーゼの発現のため
に使用した。
グ：pACYC184のBamHI部位中にDraIメチラーゼ遺伝子を
挿入することにより、DraIメチラーゼ遺伝子を発現させ
た。これを行なうために、Sau3AIで部分消化された第12
節で調製したpDraIRM9.7-G2 DNAの0.5μgを、予めBamHI
で切断され脱リン酸化されたベクターpACYAC184中に、8
00UのT4 DNAリガーゼを含有する40μlの1×T4 DNAリガ
ーゼ緩衝液中、16℃で2時間連結した。該連結混合物を2
00μlの大腸菌（E. coli）ER2426株コンピテント細胞中
に形質転換し、25μg/mlクロラムフェニコールを含有す
るL-ブロスプレート上でプレーティングした。約1,600
個のコロニーを得、これらを4mlの10mM Tris、10mM MgC
l2（pH7.5）中に掻き取った。このプール1mlを、25μ/m
lクロラムフェニコールを含有する75mlのL-ブロス中に
接種し、振とうしながら37℃で8時間増殖させた。前記
第5節に記載のミニプレップ法を10倍スケールアップす
ることにより、プラスミドを単離した。該ミニプレップ
DNAを500μlの1×TEに再懸濁し、14,000rpmで5分間遠心
分離した。336μlの該清澄化上清を、64μlの5M NaClお
よび400μlの13％PEG8000と混合し、氷上で1時間インキ
ュベートした。該DNAを14,000rpm、4℃で5分間遠心沈殿
させ、氷冷70％エタノールで洗浄し、風乾した。該DNA
ペレットを500μlの1×TEに再懸濁し、その5μlを、50
μlの1×NE緩衝液4中、60単位のDraIで37℃で1時間消化
した。DraIで消化されたこのDNA 5μlを、50μlのER242
6コンピテント細胞中に形質転換し、25μg/mlクロラム
フェニコールを含有するL-ブロスプレート上でプレーテ
ィングして、個々の形質転換体を得た。14個の形質転換
体からのプラスミドを、ミニプレップ法により単離し、
DraI制限エンドヌクレアーゼで消化した。これらのうち
の12個のクローンは、DraI消化から完全に保護されてい
た。さらなる制限分析は、pACYC184DraIM10およびpACYC
184DraIM13の2つのクローンが同一であり、約3kbの最小
の挿入断片を含有していることを示した。クローンpACY
C184DraIM10を、PmeIエンドヌクレアーゼの発現のため
に使用した。
【００７６】B．エンドヌクレアーゼのクローニング：
発現ベクターpRRS中の強力な誘導プロモーター（PlacUV
5）および強力に認識されるリボソーム結合部位の直ぐ
下流に該制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を挿入すること
により、該遺伝子を発現させた。これを行なうために、
DNA配列データを利用して、2つのオリゴヌクレオチドプ
ライマーを作製した。該フォワードオリゴヌクレオチド
プライマーは、クローニングを容易にするためのPstI部
位、lacZタンパク質の翻訳を停止するためのlacZ遺伝子
に対してインフレームである停止コドン、強力に認識さ
れるリボソーム結合部位、rbsとPmeIエンドヌクレアー
ゼ遺伝子のATG開始コドンとの間の7ヌクレオチドのスペ
ーサー、およびハイブリダイゼーションのためのシュー
ドモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAと
相補的な24ヌクレオチドを含有していた。 プライマーPmeIRexp1： 5’-GAGACTGCAGGAGGTAATTCATATGACCACAAACTCCCCCTCAGAC
-3’（配列番号22） 該リバースプライマーは、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝
子の3’末端に対し84bp 3’側のシュードモナス・メン
ドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAとハイブリダイズ
するように設計した。それは、クローニングを容易にす
るためのBglII部位およびSalI制限部位と、ハイブリダ
イゼーションのためのシュードモナス・メンドシナ（Ps
eudomonas mendocina）と相補的な21ヌクレオチドとを
含有していた。 プライマーPmeIRexp2： 5’-CAAGAGATCTAGTCGACCGGTGTTAGCAACCCGATAC-3’（配
列番号23） これらの2つのプライマーを使用して、シュードモナス
・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）ゲノムDNAから
PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅した。これは、 10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液 6μlの4mM dNTP 2μl（400ng）のシュードモナス・メンドシナ（Pseudom
onas mendocina）ゲノム DNA 5μl（10μMストック）のプライマーPmeIRexp1 5μl（10μMストック）のプライマーPmeIRexp2 4μlの100mM MgSO4 66μlのdH2O 0.6μl（1.2単位）のVent（登録商標）ポリメラーゼ（2
単位/μlのストック）を合わせ、95℃で3分間の1サイク
ル、ついで95℃で30秒間、60℃で20秒間、72℃で50秒間
の4サイクル、ついで95℃で30秒間、65℃で20秒間およ
び72℃で50秒間の20サイクルで増幅することにより行な
った。約850bpの増幅産物をゲル精製し、BglIIおよびPs
tIで切断し、フェノール-クロロホルム抽出し、沈殿さ
せ、TEに再懸濁し、予めPstIおよびBamHIで切断されゲ
ル精製されたpRRSベクター中に連結した。該連結反応物
を、DraIメチラーゼ遺伝子構築物pACYC184DraIM10を保
持する大腸菌（E. coli）ER2426株中に形質転換し、個
々の形質転換体について25μg/mlクロラムフェニコール
および100μg/mlアンピシリンを含有するL-ブロスプレ
ート上でプレーティングした。7個の形質転換体を、25
μg/mlクロラムフェニコールおよび100μg/mlアンピシ
リンを含有する10mlのL-ブロス中に接種し、振とうしな
がら37℃で中期対数期まで増殖させ、0.5mM IPTGで16時
間誘導した。該細胞ペレットを5000rpm、4℃で5分間遠
心沈殿させ、1.5mlの20mM Tris、0.1mMEDTA、1mM DTT、
50mM NaCl（pH7.5）に再懸濁し、超音波処理した。該抽
出物を使用して、50μlの1×NE緩衝液#2（10mM Tris, 1
0mM MgCl2, 50mM NaCl, 1mM DTT, pH7.9）中、37℃で30
分間、λDNAを消化した。すべてのクローンがPmeIエン
ドヌクレアーゼ活性を発現した。PmeIエンドヌクレアー
ゼを産生させるためにpRRSPmeIR1/pACYC184DraIM10と称
されるこれらのクローンの1つを選択し、これに、NEB#1
081なる株名を与えた。NEB#1081の粗製抽出物から得ら
れたPmeI制限エンドヌクレアーゼ活性の力価を、図1に
示す。酵素力価は、細胞1g当たり約1×107単位であっ
た。
発現ベクターpRRS中の強力な誘導プロモーター（PlacUV
5）および強力に認識されるリボソーム結合部位の直ぐ
下流に該制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を挿入すること
により、該遺伝子を発現させた。これを行なうために、
DNA配列データを利用して、2つのオリゴヌクレオチドプ
ライマーを作製した。該フォワードオリゴヌクレオチド
プライマーは、クローニングを容易にするためのPstI部
位、lacZタンパク質の翻訳を停止するためのlacZ遺伝子
に対してインフレームである停止コドン、強力に認識さ
れるリボソーム結合部位、rbsとPmeIエンドヌクレアー
ゼ遺伝子のATG開始コドンとの間の7ヌクレオチドのスペ
ーサー、およびハイブリダイゼーションのためのシュー
ドモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAと
相補的な24ヌクレオチドを含有していた。 プライマーPmeIRexp1： 5’-GAGACTGCAGGAGGTAATTCATATGACCACAAACTCCCCCTCAGAC
-3’（配列番号22） 該リバースプライマーは、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝
子の3’末端に対し84bp 3’側のシュードモナス・メン
ドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAとハイブリダイズ
するように設計した。それは、クローニングを容易にす
るためのBglII部位およびSalI制限部位と、ハイブリダ
イゼーションのためのシュードモナス・メンドシナ（Ps
eudomonas mendocina）と相補的な21ヌクレオチドとを
含有していた。 プライマーPmeIRexp2： 5’-CAAGAGATCTAGTCGACCGGTGTTAGCAACCCGATAC-3’（配
列番号23） これらの2つのプライマーを使用して、シュードモナス
・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）ゲノムDNAから
PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅した。これは、 10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液 6μlの4mM dNTP 2μl（400ng）のシュードモナス・メンドシナ（Pseudom
onas mendocina）ゲノム DNA 5μl（10μMストック）のプライマーPmeIRexp1 5μl（10μMストック）のプライマーPmeIRexp2 4μlの100mM MgSO4 66μlのdH2O 0.6μl（1.2単位）のVent（登録商標）ポリメラーゼ（2
単位/μlのストック）を合わせ、95℃で3分間の1サイク
ル、ついで95℃で30秒間、60℃で20秒間、72℃で50秒間
の4サイクル、ついで95℃で30秒間、65℃で20秒間およ
び72℃で50秒間の20サイクルで増幅することにより行な
った。約850bpの増幅産物をゲル精製し、BglIIおよびPs
tIで切断し、フェノール-クロロホルム抽出し、沈殿さ
せ、TEに再懸濁し、予めPstIおよびBamHIで切断されゲ
ル精製されたpRRSベクター中に連結した。該連結反応物
を、DraIメチラーゼ遺伝子構築物pACYC184DraIM10を保
持する大腸菌（E. coli）ER2426株中に形質転換し、個
々の形質転換体について25μg/mlクロラムフェニコール
および100μg/mlアンピシリンを含有するL-ブロスプレ
ート上でプレーティングした。7個の形質転換体を、25
μg/mlクロラムフェニコールおよび100μg/mlアンピシ
リンを含有する10mlのL-ブロス中に接種し、振とうしな
がら37℃で中期対数期まで増殖させ、0.5mM IPTGで16時
間誘導した。該細胞ペレットを5000rpm、4℃で5分間遠
心沈殿させ、1.5mlの20mM Tris、0.1mMEDTA、1mM DTT、
50mM NaCl（pH7.5）に再懸濁し、超音波処理した。該抽
出物を使用して、50μlの1×NE緩衝液#2（10mM Tris, 1
0mM MgCl2, 50mM NaCl, 1mM DTT, pH7.9）中、37℃で30
分間、λDNAを消化した。すべてのクローンがPmeIエン
ドヌクレアーゼ活性を発現した。PmeIエンドヌクレアー
ゼを産生させるためにpRRSPmeIR1/pACYC184DraIM10と称
されるこれらのクローンの1つを選択し、これに、NEB#1
081なる株名を与えた。NEB#1081の粗製抽出物から得ら
れたPmeI制限エンドヌクレアーゼ活性の力価を、図1に
示す。酵素力価は、細胞1g当たり約1×107単位であっ
た。
【００７７】14．PmeI制限エンドヌクレアーゼは、NEB#
1081から製造することができ、これは、アンピシリン
（100μg/ml）およびクロラムフェニコール（25μg/m
l）を含むL-ブロス培地を含有する発酵槽内で中期対数
期まで増殖させることにより行なうことができる。IPTG
を最終濃度0.3mMまで加えることにより該培養を誘導
し、増殖を16時間継続する。該細胞を遠心分離により収
穫し、−70℃で保存するか又は直ちに使用することがで
きる。
1081から製造することができ、これは、アンピシリン
（100μg/ml）およびクロラムフェニコール（25μg/m
l）を含むL-ブロス培地を含有する発酵槽内で中期対数
期まで増殖させることにより行なうことができる。IPTG
を最終濃度0.3mMまで加えることにより該培養を誘導
し、増殖を16時間継続する。該細胞を遠心分離により収
穫し、−70℃で保存するか又は直ちに使用することがで
きる。
【００７８】15．NEB#1081からのPmeI制限エンドヌクレ
アーゼの精製は、前記工程2で大まかに説明したとお
り、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィーなどの標準的なタンパク質精製技術の
組合せにより行なうことができる。この精製から得られ
たPmeI制限エンドヌクレアーゼは、実質的に純粋であ
り、非特異的エンドヌクレアーゼもエキソヌクレアーゼ
混入物も含んでいない。
アーゼの精製は、前記工程2で大まかに説明したとお
り、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィーなどの標準的なタンパク質精製技術の
組合せにより行なうことができる。この精製から得られ
たPmeI制限エンドヌクレアーゼは、実質的に純粋であ
り、非特異的エンドヌクレアーゼもエキソヌクレアーゼ
混入物も含んでいない。
【００７９】pRRSPmeIR1およびpACYC184DraIM10の両方
を含有する大腸菌（NEB#1081）のサンプルは、ブダペス
ト条約の条項および条件に基づきAmerican Type Cultur
e Collectionに1997年11月25日に寄託され、ATCC受託第
98596号で受領されている。配列表 （２）配列番号1の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：6アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号1：
を含有する大腸菌（NEB#1081）のサンプルは、ブダペス
ト条約の条項および条件に基づきAmerican Type Cultur
e Collectionに1997年11月25日に寄託され、ATCC受託第
98596号で受領されている。配列表 （２）配列番号1の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：6アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号1：
【００８０】
【化１】 （２）配列番号2の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：5アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号2：
【００８１】
【化２】 （２）配列番号3の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：6アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号3：
【００８２】
【化３】 （２）配列番号4の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：24アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号4：
【００８３】
【化４】 （２）配列番号5の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：26塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （ix）特徴： （A）特徴を表す記号：Other （B）存在位置：15…15 （D）他の情報：N=G, A, CまたはT(U) （ix）特徴： （A）特徴を表す記号：Other （B）存在位置：18…18 （D）他の情報：N=G, A, CまたはT(U) （ix）特徴： （A）特徴を表す記号：Other （B）存在位置：21…21 （D）他の情報：Y=CまたはT(U) （ix）特徴： （A）特徴を表す記号：Other （B）存在位置：24…24 （D）他の情報：N=G, A, CまたはT(U) （xi）配列：配列番号5：
【００８４】
【化５】 （２）配列番号6の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：26塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （ix）特徴： （A）特徴を表す記号：Other （B）存在位置：15…15 （D）他の情報：N=G, A, CまたはT(U) （ix）特徴： （A）特徴を表す記号：Other （B）存在位置：18…18 （D）他の情報：N=G, A, CまたはT(U) （ix）特徴： （A）特徴を表す記号：Other （B）存在位置：21…21 （D）他の情報：Y=CまたはT(U) （ix）特徴： （A）特徴を表す記号：Other （B）存在位置：24…24 （D）他の情報：Y=CまたはT(U) （xi）配列：配列番号6：
【００８５】
【化６】 （２）配列番号7の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：24塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （ix）特徴： （A）特徴を表す記号：Other （B）存在位置：10…10 （D）他の情報：R=AまたはG （ix）特徴： （A）特徴を表す記号：Other （B）存在位置：13…13 （D）他の情報：Y=CまたはT(U) （ix）特徴： （A）特徴を表す記号：Other （B）存在位置：16…16 （D）他の情報：R=AまたはG （ix）特徴： （A）特徴を表す記号：Other （B）存在位置：19…19 （D）他の情報：D=GまたはAまたはT(U) （xi）配列：配列番号7：
【００８６】
【化７】 （２）配列番号8の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：6アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号8：
【００８７】
【化８】 （２）配列番号9の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：5アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号9：
【００８８】
【化９】 （２）配列番号10の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：28塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （xi）配列：配列番号10：
【００８９】
【化１０】 （２）配列番号11の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：27塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic RNA （xi）配列：配列番号11：
【００９０】
【化１１】 （２）配列番号12の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：27塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （xi）配列：配列番号12：
【００９１】
【化１２】 （２）配列番号13の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：5アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号13：
【００９２】
【化１３】 （２）配列番号14の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：26塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （xi）配列：配列番号14：
【００９３】
【化１４】 （２）配列番号15の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：21塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （xi）配列：配列番号15：
【００９４】
【化１５】 （２）配列番号16の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：27塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （xi）配列：配列番号16：
【００９５】
【化１６】 （２）配列番号17の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：26塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （xi）配列：配列番号17：
【００９６】
【化１７】 （２）配列番号18の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：31塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （xi）配列：配列番号18：
【００９７】
【化１８】 （２）配列番号19の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：25塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （xi）配列：配列番号19：
【００９８】
【化１９】 （２）配列番号20の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：29塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （xi）配列：配列番号20：
【００９９】
【化２０】 （２）配列番号21の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：27塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （xi）配列：配列番号21：
【０１００】
【化２１】 （２）配列番号22の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：46塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （xi）配列：配列番号22：
【０１０１】
【化２２】 （２）配列番号23の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：37塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （xi）配列：配列番号23：
【０１０２】
【化２３】
【図１】pRRS由来プラスミドpRRSPmeIR1上のPmeIエンド
ヌクレアーゼとpACYC184由来プラスミドpACYC184DraIM1
0上のDraIメチラーゼとを保持する大腸菌（E. coli）ER
2426株の細胞抽出物中のPmeI制限エンドヌクレアーゼ活
性を示すアガロースゲルの写真。0.5gの細胞ペースト
を、1.5mlの超音波処理緩衝液（20mM Tris-HCl, 1mMジ
チオトレイトール, 0.1mM EDTA, pH7.5）に懸濁し、超
音波処理により破壊し、遠心分離により清澄化した。該
抽出物を使用して、100μg/ml BSAで補足された1×NE緩
衝液4中の50μlの反応容量当たり1μgのλDNAを消化
し、37℃で1時間インキュベートした。レーン1および1
0：HindIII-λ＋HaeIII-φX174サイズ基準；レーン2：
0.01μlの粗製抽出物；レーン3：5×10−3μlの粗製抽
出物；レーン4：2.5×10−3μlの粗製抽出物；レーン
5：1.25×10−3μlの粗製抽出物；レーン6：6.25×10
−4μlの粗製抽出物；レーン7：3.13×10−4μlの粗製
抽出物；レーン8：1.56×10−4μlの粗製抽出物；レー
ン9：7.81×10−5μlの粗製抽出物。全PmeI活性は、細
胞ペースト1g当たり約1×107単位に相当する。
ヌクレアーゼとpACYC184由来プラスミドpACYC184DraIM1
0上のDraIメチラーゼとを保持する大腸菌（E. coli）ER
2426株の細胞抽出物中のPmeI制限エンドヌクレアーゼ活
性を示すアガロースゲルの写真。0.5gの細胞ペースト
を、1.5mlの超音波処理緩衝液（20mM Tris-HCl, 1mMジ
チオトレイトール, 0.1mM EDTA, pH7.5）に懸濁し、超
音波処理により破壊し、遠心分離により清澄化した。該
抽出物を使用して、100μg/ml BSAで補足された1×NE緩
衝液4中の50μlの反応容量当たり1μgのλDNAを消化
し、37℃で1時間インキュベートした。レーン1および1
0：HindIII-λ＋HaeIII-φX174サイズ基準；レーン2：
0.01μlの粗製抽出物；レーン3：5×10−3μlの粗製抽
出物；レーン4：2.5×10−3μlの粗製抽出物；レーン
5：1.25×10−3μlの粗製抽出物；レーン6：6.25×10
−4μlの粗製抽出物；レーン7：3.13×10−4μlの粗製
抽出物；レーン8：1.56×10−4μlの粗製抽出物；レー
ン9：7.81×10−5μlの粗製抽出物。全PmeI活性は、細
胞ペースト1g当たり約1×107単位に相当する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (7)
- 【請求項１】 PmeI制限エンドヌクレアーゼをコードす
る単離されたDNAであって、シュードモナス・メンドシ
ナ（Pseudomonas mendocina）から入手可能であること
を特徴とする単離されたDNA。 - 【請求項２】 PmeI制限をコードするDNAセグメントが
挿入されているベクターを含んでなる組換えDNAベクタ
ー。 - 【請求項３】 PmeI制限エンドヌクレアーゼとメチラー
ゼとをコードする単離されたDNAであって、ATCC受託第9
8506号から入手可能であることを特徴とする単離された
DNA。 - 【請求項４】 請求項３に記載の単離されたDNAを含ん
でなるクローニングベクター。 - 【請求項５】 pRRSPmeIR1およびpACYC184DraIM10の両
方を含む、請求項４に記載のクローニングベクター。 - 【請求項６】 請求項２、４または５に記載のクローニ
ングベクターにより形質転換された宿主細胞。 - 【請求項７】 PmeI制限エンドヌクレアーゼの製造法で
あって、請求項２、４または５に記載のベクターで形質
転換された宿主細胞を該エンドヌクレアーゼの発現に適
した条件下で培養することを含んでなる製造法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US976703 | 1997-11-24 | ||
| US08/976,703 US5945288A (en) | 1997-11-24 | 1997-11-24 | Method for cloning and producing the PmeI restriction endonuclease |
Publications (2)
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|---|---|
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Family
ID=25524373
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|---|---|
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| EP (1) | EP0931835B1 (ja) |
| JP (1) | JP4394762B2 (ja) |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| JP2002306186A (ja) * | 2000-10-12 | 2002-10-22 | New England Biolabs Inc | ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼをクローニングする方法及び製造する方法 |
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| US5721126A (en) * | 1995-12-08 | 1998-02-24 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the SCaI restriction endonuclease in E. coli |
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1997
- 1997-11-24 US US08/976,703 patent/US5945288A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-11-06 JP JP31580898A patent/JP4394762B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-24 DE DE69826237T patent/DE69826237T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-24 EP EP98309629A patent/EP0931835B1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002306186A (ja) * | 2000-10-12 | 2002-10-22 | New England Biolabs Inc | ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼをクローニングする方法及び製造する方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0931835B1 (en) | 2004-09-15 |
| US5945288A (en) | 1999-08-31 |
| EP0931835A3 (en) | 2000-04-12 |
| DE69826237T2 (de) | 2005-09-29 |
| EP0931835A2 (en) | 1999-07-28 |
| JP4394762B2 (ja) | 2010-01-06 |
| DE69826237D1 (de) | 2004-10-21 |
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