JP4394762B2 - Ｐｍｅｌ制限エンドヌクレアーゼのクローニング方法および製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）（NEB#698）から入手可能なPmeI制限エンドヌクレアーゼの同定、PmeI制限エンドヌクレアーゼをコードする組換えDNA、および該組換えDNAからのPmeI制限エンドヌクレアーゼの製造に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
II型制限エンドヌクレアーゼは、細菌内に天然に存在する酵素のクラスである。それを他の細菌成分から精製する場合には、分子クローニングおよび遺伝子の特徴づけのための厳密な断片にDNA分子を切断するために、制限エンドヌクレアーゼを実験室内で使用することができる。
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼは、DNA分子に沿った特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識しそれに結合することにより作用する。それは、一旦結合すると、認識配列内の分子またはその一方の側の分子を切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは、異なる認識配列に対する親和性を有する。現在までに調べられている数百の細菌種のうち、特有の特異性を有する180個を超える制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
【０００４】
細菌は、1種あたり大目に見ても少数の制限エンドヌクレアーゼしか有さない傾向がある。エンドヌクレアーゼは、典型的には、それが由来する細菌に基づき命名される。例えば、デイノコッカス・ラジオフィルス（Deinococcus radiophilus）なる種は、Dral、DraIIおよびDraIIIと称される3つの異なる制限エンドヌクレアーゼを合成する。これらの酵素は、それぞれ配列TTTAAA、PuGGNCCPyおよびCACNNNGTGを認識し切断する。一方、大腸菌（Escherichia coli）RY13は、配列GAATTCを認識する酵素EcoRIを唯一合成する。
【０００５】
実際には、制限エンドヌクレアーゼは、細菌細胞の繁殖において防御的な役割を果たしていると考えられる。制限エンドヌクレアーゼのおかげで、細菌はウイルス、プラスミドなどの外来DNA分子による感染に抵抗することができ、もしそれが無ければ、細菌は該外来DNA分子に破壊されるか寄生されることとなろう。制限エンドヌクレアーゼは、認識配列が生じるたびに侵入性外来DNA分子を切断することにより抵抗性を付与する。生じる切断は、該感染遺伝子の多数を不能にし、該DNAを非特異的ヌクレアーゼによる更なる分解に感受性にする。
【０００６】
細菌の防御系のもう1つの成分は、修飾メチラーゼである。これらの酵素は、制限エンドヌクレアーゼを補完するものであり、細菌がそれ自身のDNAを保護しそれを外来感染性DNAから識別するのを可能にする手段を、修飾メチラーゼは提供する。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列を認識しそれに結合するが、該DNAを切断することはなく、メチル基の付加により配列内のいずれかのヌクレオチドを化学修飾する。メチル化後にはもはや、該認識配列は制限エンドヌクレアーゼに切断されない。細菌細胞のDNAは、その修飾メチラーゼの活性により常に修飾される。したがって、それは、内因性制限エンドヌクレアーゼの存在には不感受性である。制限エンドヌクレアーゼの認識および切断に対して感受性なのは、未修飾であり従って識別されうる外来DNAのみである。
【０００７】
遺伝子工学技術の出現に伴い、遺伝子をクローニングしたり、それがコードするタンパク質および酵素を、通常の精製技術で得られるより多量に製造することが、現在では可能となっている。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する際に鍵となるのは、複雑な「ライブラリー」（すなわち、「ショットガン」法により誘導されるクローンの集団）内の該クローンを、それが10-3~10-4の頻度でしか存在しない場合に同定するための簡便かつ信頼しうる方法を開発することである。好ましくは、望ましくない大部分のクローンが破壊され、望ましい希少クローンが生存するように、そのような方法は選択的であるべきである。
【０００８】
II型制限−修飾系は、頻度を増加させてクローニングされている。クローニングされた最初の系では、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択するための手段としてバクテリオファージの感染が用いられた（EcoRII: Kosykhら, Molec. Gen. Genet 178:717-719 (1980); HhaII: Mannら, Gene 3:97-112 (1978); PstI: Walderら, Proc. Nat. Acad. Sci. 78:1503-1507 (1981)）。細菌内の制限−修飾系の存在により該細菌はバクテリオファージの感染に抵抗することができるため、クローニングされる制限−修飾遺伝子を保持する細胞は、原則として、ファージにさらされたライブラリーからの生存体として選択的に単離することができる。しかしながら、この方法は、限られた価値しか有していないことが判明している。特に、クローニングされる制限−修飾遺伝子は、選択的な生存性を付与するのに十分なファージ抵抗性を常に現すわけではないことが判明している。
【０００９】
クローニングのためのもう１つのアプローチは、プラスミドを保持することが初めに確認された系を大腸菌（E. coli）クローニングプラスミド中に導入することを含むものである（EcoRV: Bougueleretら, Nucl. Acid. Res. 12:3659-3676 (1984); PaeR7: GingerasおよびBrooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:402-406 (1983); TheriaultおよびRoy, Gene 19:355-359 (1982); PvuII: Blumenthalら, J. Bacteriol. 164:501-509 (1985)）。
【００１０】
ますます多数の系のクローニングに用いられているもう1つのアプローチは、活性メチラーゼ遺伝子に関する選択を含むものである（米国特許第5,200,333号およびBsuRI: Kissら, Nucl. Acid. Res. 13:6403-6421 (1985)）。制限遺伝子と修飾遺伝子とは、しばしば、密接に連鎖しているため、両遺伝子を同時にクローニングできることが多い。しかしながら、この選択は、常に完全な制限系を与えるわけではなく、メチラーゼ遺伝子しか与えないことがある（BspRI: Szomolanyiら, Gene 10:219-225 (1980); Bcn I: Janulaitisら, Gene 20:197-204 (1982); Bsu RI: KissおよびBaldauf, Gene 21:111-119 (1983);およびMsp I: Walderら, J. Biol. Chem. 258:235-1241 (1983)）。
【００１１】
メチラーゼ遺伝子およびエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするためのもう1つの方法は、DNA損傷に関する比色アッセイに基づくものである（米国特許第5,498,535号）。メチラーゼに関するスクリーニングの場合には、該プラスミドライブラリーを、AP1-200などの宿主大腸菌（E. coli）株中に形質転換する。メチラーゼの発現は、McrA+、McrBC+またはMrr+である大腸菌（E. coli）株内でSOS応答反応を誘導するであろう。AP1-200株は、McrおよびMrr系に関して温度感受性であり、損傷で誘導されうる大腸菌（E. coli）dinD遺伝子座と融合したlac-Z遺伝子を含む。メチラーゼ遺伝子またはエンドヌクレアーゼ遺伝子をコードする組換えプラスミドの検出は、lacZ遺伝子の制限温度での誘導に基づく。メチラーゼ遺伝子をコードする形質転換体は、X-galを含有するLB寒天プレート上で青色コロニーとして検出される（Piekarowiczら, Nucleic Acids Res. 19:1831-1835 (1991)およびPiekarowicaら, J. Bacteriology 173:150-155 (1991)）。同様に、大腸菌（E. coli）ER1992株は、dinD1-Lac Z融合体を含有するが、メチル化に依存する制限系であるMcrA、McrBCおよびMrrを欠いている。この系（「エンドブルー（endoblue）」法と称される）では、エンドヌクレアーゼが宿主細胞DNAを損傷してSOS応答を誘導する場合には、該エンドヌクレアーゼ遺伝子を、その対応（cognate）メチラーゼの不存在下で検出することができる。SOS誘導された細胞は、X-galで補足されたLB寒天プレート上に濃青色のコロニーを形成する（Xuら, Nucleic Acids Res. 22:2399-2403 (1994)）。
【００１２】
直接メチラーゼ選択方法は、種々の障害のため、メチラーゼ（および／またはエンドヌクレアーゼ）クローンを産生しないことがある。例えば、Lunnenら, Gene, 74(1):25-32 (1988)を参照されたい。修飾による保護が未だなされていない宿主内にエンドヌクレアーゼ遺伝子の導入を試みるにあたり、制限−修飾遺伝子をクローニングする場合に1つの考えられる障害がある。メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを、単一のクローンとして一緒に導入する場合には、エンドヌクレアーゼが宿主DNAを切断する機会を得る前に、メチラーゼが宿主DNAを保護的に修飾しなければならない。したがって、場合によっては、まずメチラーゼ、ついでエンドヌクレアーゼというように遺伝子を順次クローニングすることだけが可能かもしれない。
【００１３】
制限−修飾系をクローニングする場合のもう1つの障害は、いくつかの大腸菌（E. coli）株が、シトシンまたはアデニンの修飾と不利に反応することが認められることにある。それらは、メチル化シトシン（RaleighおよびWilson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:9070-9074 (1986)）またはメチル化アデニン（HeitmanおよびModel, J. Bact. 196:3243-3250 (1987); Raleigh, TrimarchiおよびRevel, Genetics, 122:279-296 (1989), Waite-Reesら, J. Bacteriology, 173:5207-5219 (1991)）を含有するDNAを破壊する系を有する。シトシン特異的またはアデニン特異的なメチラーゼ遺伝子を、これらの株中に、それら単独で又はそれらの対応エンドヌクレアーゼ遺伝子と共に容易にクローニングすることはできない。この問題を避けるためには、これらの系が欠損している大腸菌（E. coli）の突然変異株（McrA−およびMcrB−またはMrr−）を使用する必要がある。
【００１４】
もう1つの考えられる問題は、起源生物と大腸菌（E. coli）とで転写装置（例えば、プロモーターおよびリボソーム結合部位）が異なるため、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ遺伝子およびメチラーゼ遺伝子が大腸菌（E. coli）内で発現されない可能性があることである。メチラーゼ選択技術においては、該メチラーゼが、該遺伝子を保持するプラスミドの少なくともいくつかを完全に保護するのに十分な程度で大腸菌（E. coli）内で発現されることが必要である。
【００１５】
精製された制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼ（尤も、これはより低度ではあるが）は、実験室内で遺伝子を特徴づけるための有用な手段であるため、これらの酵素を多量に合成する組換えDNA技術により細菌株を入手することが商業的に要請されている。そのような株は、精製作業を単純化し、商業的に有用な量での製造手段を提供するため、有用であろう。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、DNA配列5’ GTTTAAAC 3’を認識し該認識配列の中央（3番目のT残基と最初のA残基との間）で切断して平滑末端を与える酵素であるPmeI制限エンドヌクレアーゼ（NEB#560）の遺伝子をコードする組換えDNA、および該組換えDNAからこの酵素を製造するための関連方法に関する。本発明はまた、制限エンドヌクレアーゼPmeIを発現する形質転換宿主に関する。本発明に従い製造されたPmeI制限エンドヌクレアーゼは、実質的に純粋であり、通常の技術で製造された制限エンドヌクレアーゼ調製物中で通常見出される混入物を含まない。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明は、PmeI制限エンドヌクレアーゼをコードする組換えDNA、および組換えPmeI酵素の製造法に関する。
【００１８】
シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）からPmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングすることは、著しく困難であることが判明した。メチラーゼ選択方法（米国特許第5,200,333号）が精力的に試みられたが、PmeIメチラーゼ産生クローンは得られなかった。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングした後でさえ、保存されたメチラーゼモチーフは、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接して位置していなかった。PmeIメチラーゼ遺伝子がこのように欠けていたため、対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニングは著しく複雑なものとなった。
【００１９】
PmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするために、高度に精製されたPmeI制限エンドヌクレアーゼタンパク質をシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）細胞から入手して、該エンドヌクレアーゼのN末端のアミノ酸配列を決定することにした。ついで、そのアミノ酸配列を使用して、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）ゲノムDNAからこのDNA領域をPCR増幅するための縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。ついで、PCR増幅された小さなDNA配列を使用して、非縮重逆PCRプライマーを設計し、それを使用して、逆PCR技術によりPmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の出発点に隣接するDNAを増幅した。そのような2個の増幅産物［BssHIIで消化され環化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNA鋳型からの1.4kbの産物、およびBsaWIで消化され環化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNA鋳型からの900bpの産物］を、ベクターpUC19中にクローニングし、配列決定した。該増幅産物に由来するシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）ゲノムの約1.6kbの領域の配列データを用いて、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子を同定した。693bpのオープンリーディングフレームは、精製されたPmeIエンドヌクレアーゼタンパク質のN末端の配列決定から確認したものと符合するN末端アミノ酸配列を有することが認められ、したがって、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子であることを確認した。同定したPmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子に対し直ぐ3’側および5’側のそれぞれ700bpおよび190bpの両DNA配列の6フレームアミノ酸翻訳物においては、明らかな公知メチラーゼモチーフは見出されなかった。可能なPmeIメチラーゼを見出すために、この1.6kbの領域の両側から外のDNA配列データを入手する必要があった。この目的のために、追加的な逆PCR実験を行なった。該エンドヌクレアーゼに対し3’側の追加的な1.57kbのDNA配列および該エンドヌクレアーゼに対し5’側の3.1kbの配列を得たが、明らかな公知メチラーゼモチーフは見出されなかった。いくつかの可能性が存在する。該エンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接するORFの1つは、PmeIメチラーゼをコードしているかもしれないが、そのようにそれが同定されるのを可能にする高度に相同なメチラーゼモチーフを含有していないのかもしれない。該メチラーゼは非常に巨大である可能性があるため、該遺伝子を位置づけるためには、より多くの配列（特に、該エンドヌクレアーゼに対し3’側の配列）が必要となるかもしれない。該メチラーゼは、ゲノムシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNA上で該エンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接していない他の位置に存在する可能性がある。もう1つの可能性は、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAが、PmeIエンドヌクレアーゼに対応するメチラーゼ遺伝子を含有していないことである。
【００２０】
対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子から該宿主を保護するために発現されるPmeIメチラーゼ遺伝子が存在しないため、PmeI制限活性を潜在的に阻止しうる他のメチラーゼに関して研究した。PmeI認識配列の内部の4塩基TTAAを認識するMseIメチラーゼは、PmeI切断を阻止しないことが判明した。PmeI部位を含有する一連のオリゴヌクレオチドを構築して、該認識配列内のアデニンまたはシトシンの1つがメチル化されるようにし、メチル化によりPmeIが阻害されうるか否かを確かめるために、これらのオリゴをPmeI切断に付した。第3アデニン残基でのメチル化はPmeI切断を阻止するが、第1または第2アデニンでのメチル化や、該シトシン残基のC5位でのメチル化は阻止しないことが判明した。N4でのシトシンのメチル化は、試験しなかった。DraIメチラーゼは、PmeI部位5’GTTTAAAC3’の内部の6塩基であるDNA配列5’TTTAAA3’を認識する。DraIメチラーゼは、それらの3つのアデニンの任意の1つをメチル化するため、PmeI制限消化を阻止するか阻止しないかのどちらの可能性も生じてしまう。したがって、DraIメチラーゼにより修飾されたDNAがPmeI制限消化に抵抗性であるか否かを判定する必要があった。この目的には、DraIメチラーゼ産生クローンpDraIRM9.7-G2の部分Sau3AIサブクローンを、単一のPmeI部位と4つのDraI部位とを含有するベクターpNEB193中にクローニングし、DraIメチラーゼ産生クローンをメチラーゼ選択方法により選択した。これらのクローンからのプラスミドを単離したところ、それらはPmeIおよびDraI制限から保護されていることが示された。DraIメチラーゼにより修飾されたDNAはPmeI制限消化から保護されていたため、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子は、DraIメチラーゼにより予め保護された宿主中で発現されることが可能であった。ついでDraIメチラーゼを、pRRS、pAII17などの発現ベクターと和合性のベクターpACYC184中にクローニングした。これは、pDraIRM9.7-G2のSau3AI部分サブクローンをpACYC184中にクローニングし、メチラーゼ選択によりメチラーゼ産生クローンに関して選択することにより行なった。
【００２１】
ついで、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAからの完全な遺伝子を増幅し、それを発現ベクターpRRS中にクローニングすることにより、PmeIエンドヌクレアーゼを発現させた。別の和合性プラスミドpACYC184上に保持されたDraIメチラーゼ遺伝子によりPmeI部位で予め修飾された宿主中に、この構築物を導入した。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子とDraIメチラーゼ遺伝子とを含有する宿主を増殖させ、適当な発現条件で誘導し、該細胞を収穫し、PmeIエンドヌクレアーゼを精製することにより、PmeIエンドヌクレアーゼを製造する。
【００２２】
PmeI制限エンドヌクレアーゼを好ましくクローニングし発現させるための本明細書中に記載の方法は、図1に示されており、以下の工程を含む。
【００２３】
1．シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）を、マグネシウムの添加無しの修飾LB培地を含有するフラスコ内で、攪拌・通気しながら37℃で一晩増殖させる。該細胞を収穫し、溶解し、ゲノムDNAを精製する。
【００２４】
2．New England Biolabs, Inc.（実施例1、工程2を参照されたい）で開発されたタンパク質精製技術の組合せにより、PmeI制限エンドヌクレアーゼを、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）細胞からほぼ均一になるまで精製する。このようにして精製したエンドヌクレアーゼは、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動上でほぼ均一であり、約26キロダルトンの見掛け分子量を有する。
【００２５】
3．Applied BioSystems Division, Perkin-Elmer Corporation（Foster City, California）470A Protein Sequencer（Waite-Reesら, J. Bacteriol. 173:5207-5219 (1991)）を用いて該エンドヌクレアーゼのアミノ末端アミノ酸配列を得、これを使用して、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）ゲノムDNAからPmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点のDNAを増幅するための縮重オリゴヌクレオチドプライマーを直接合成し、後続の研究においてPmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子を同定した。
【００２６】
4．工程3で得たアミノ酸配列に基づく縮重DNAプライマー［アミノ酸残基1〜6の(M)TTNSP（配列番号1）に対応するもの、およびDNAの逆鎖に関するアミノ酸残基10〜14のMIDEC（配列番号2）に対応するもの］を使用して、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部を増幅する。増幅されたDNAの個々のクローンを配列決定する。
【００２７】
5．シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）ゲノムDNAをApol、BsaHI、BsrFI、BstYI、EaeI、HaeII、Sau3AI、NlaIII、EagIおよびBssHIIエンドヌクレアーゼにより消化し、得られた断片を、分子内連結を促進するために低いDNA濃度で連結する。アミノ酸残基Asp-Val-Gly-Met-Ile-Asp（配列番号3）に対応する工程4の縮重プライマーと、Gluをコードするコドンの第1ヌクレオチドGとの間の領域内でアニーリングするように、プライマーPmeI-IP1を設計する（その3’末端は未知領域に配向する）。工程4で得たクローンのDNA配列は、第4および第5残基（AsnおよびSer）の配列において異なるため、プライマーPmeI-IP2が1つのクラスの配列にハイブリダイズしプライマーPmeI-IP3が第2のクラスの配列にハイブリダイズするように、別個の2つのプライマーを作製する。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子のN末端に対応するDNAを含有する環化断片を、プライマーPmeI-IP1およびPmeI-IP2とプライマーPmeI-IP1およびPmeI-1P3とを使用して増幅する。種々のサイズの増幅産物を産生させ、pUC19ベクター中にクローニングする。
【００２８】
6．種々のpUC19構築物を配列決定する。BssHIIで消化され環化されたDNAからの1400bpの増幅断片を含有する1つの構築物pUC19BssHII21だけが、プライマーPmeI-IP1に対し3’側のPmeIエンドヌクレアーゼのN末端アミノ酸配列と符合したDNA配列を含有する。しかしながら、プライマーPmeI-IP3は、おそらく該プライマー配列上のミスマッチにより、他の部位とハイブリダイズする。当然のことながら、PmeI-IP2およびPme-IP3の両プライマーは、第4および第5残基（AsnおよびSer）の配列に対するミスマッチを含有する可能性がある。
【００２９】
7．pUCBssHII21クローンから得た配列に基づいて、新たなプライマーセットを設計する。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子のN末端に対応するDNAを含有する環化断片を、それらの新たなプライマーを用いて増幅する。BsaWIで消化され環化されたDNAは、900bpの産物を与え、これをベクターpUC19中にクローニングする。
【００３０】
8．BsaWIで消化された環状DNAからの900bpの増幅断片を含有する構築物pUC19BsaWI5を配列決定する。N末端アミノ酸配列データと符合し、約26kDのタンパク質を産生するのに妥当なサイズを有するオープンリーディングフレームが存在する。BsaWI産物は、該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し5’側に190bpを含有し、該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し3’側に90bpを含有する。BssHII産物は、該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し3’側に700bpを含有する。該エンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接する配列決定された領域内に、明らかなメチラーゼモチーフは認められない。PmeIメチラーゼ遺伝子を探索するために、以下の節に記載のとおりに、該エンドヌクレアーゼ遺伝子の両側に隣接するDNAを増幅し、クローニングし、配列決定する。
【００３１】
9．PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子に対し5’側のシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを、該エンドヌクレアーゼ遺伝子の5’末端付近とハイブリダイズするプライマーを使用する逆PCR反応で増幅する。制限エンドヌクレアーゼで消化され環化された第5節で調製したシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを、鋳型として使用する。増幅産物をpUC19ベクター中にクローニングする。
【００３２】
10．第9節からの増幅断片を保持する種々のpUC19構築物を配列決定する。BstYIで消化され環化されたDNAは3.3kbの産物を与え、HaeIIで消化され環化されたDNAは0.9kbの産物を与える。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子に対し5’側の配列決定DNAの約3.1kbからの6フレームアミノ酸翻訳物においては、明らかなメチラーゼモチーフを認めることができない。
【００３３】
11．PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子に対し3’側のシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを、2つの連続した逆PCR実験において増幅する。シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを、AatII、Hinp1I、MscI、MseI、Sacl、StulおよびTsp509Iエンドヌクレアーゼで消化し、得られた断片を、分子内連結を促進するために低いDNA濃度で連結する。第1逆PCR実験においては、これらの環状鋳型と第5節からのBsaHIで消化された環状鋳型とを使用する。該プライマーの1つは、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の3’末端の直ぐ外側のDNAとハイブリダイズし、その3’末端は未知領域に配向している。もう一方は、エンドヌクレアーゼ遺伝子内またはその3’末端付近でハイブリダイズし、逆方向に配向している。AatIIで消化され環化されたDNAは1.1kbの産物を与え、MscIで消化された環状DNAは1.4kbの産物を与え、BsaHIで消化された環状DNAは0.7kbの産物を与える。これらの増幅されたDNAをpUC19中にクローニングし、配列決定する。新たに導き出されたDNA配列情報に基づいて、もう2つのプライマーを合成し、第2逆PCR実験で使用する。HaeIIで消化され環化されたDNA（第5節）は、0.7kbの産物を与え、それをpUC19中にクローニングし、配列決定する。このようにして配列決定された該エンドヌクレアーゼ遺伝子の3’末端に対し3’側のDNAの約1.57kbは、明らかなメチラーゼモチーフを含有していない。
【００３４】
12．DraIメチラーゼ産生クローンpDraIRM9.7-G2をSau3AIで部分消化し、得られたDNA断片をpNEB193ベクター中に挿入する。形質転換体を一緒にプールし、プラスミド集団を精製し、DraIエンドヌクレアーゼで消化する。制限されたプラスミドを、再び大腸菌（E. coli）中に形質転換して、未切断クローンを回収する。DraIの消化に抗して生存した9個の形質転換体のプラスミドを精製する。それら9個のプラスミドのうちの8個は、DraIエンドヌクレアーゼ消化およびPmeIエンドヌクレアーゼ消化から保護される。
【００３５】
13．PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の過剰発現：
A．一般的な考慮点
多数の方法により、制限遺伝子を過剰発現させることができる。DNA配列および詳細なマッピング情報は、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の過剰発現のための最善のアプローチを決定する助けとなる。
【００３６】
過剰発現のための1つのアプローチは、全エンドヌクレアーゼ遺伝子の増幅にポリメラーゼ連鎖反応を用いるために、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のN末端および該遺伝子の下流（3’側）のいずれかの部位で直接ハイブリダイズするプライマーを設計することを含む。得られたDNA断片を、pRRSなどの発現ベクター中の誘導プロモーター（lacUV5）の直ぐ下流に挿入することができる。
【００３７】
あるいは、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点の直前にpAGR3（New England Biolabs, Inc.; Beverly, Massachusetts）上のPtacなどの大腸菌（E. coli）に強く認識されるプロモーターを挿入することにより、過剰発現を達成することができる。また、これは、該制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点および末端付近の通常の制限部位とpAGR3のプロモーター付近の和合性制限部位とを見つけ、Ptacプロモーターと調和させて該制限遺伝子をpAGR3中に導入することにより行なうことができる。使用しうる他の調節プロモーターとしては、pUC19およびpBR322誘導体上のPlacUV5（Fuller, Gene 19:43-54 (1982)）およびIPL（ShimatakeおよびRosenberg, Nature 254:128 (1981)）が挙げられる。また、発現を増強するために、強力なリボソーム結合部位（Shine & Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:342-1346 (1974)）を遺伝子の直前に配置することができる。
【００３８】
該制限エンドヌクレアーゼを過剰発現する安定なクローンを得るために、一般には、制限エンドヌクレアーゼの消化から宿主を予め保護する。本発明では、これは、別のプラスミド上でDraIメチラーゼをクローニングすることにより行なう。DraIメチラーゼにより修飾されたDNAがPmeIエンドヌクレアーゼの消化に抵抗性であることを、本出願中で示す。使用するプラスミドは、発現ベクターと和合性でなければならない。また、メチラーゼは、過剰発現される制限エンドヌクレアーゼ遺伝子による消化から宿主ゲノムを保護するレベルで産生されなければならない。
【００３９】
大腸菌（E. coli）内でより効率的に利用されるコドンを使用するために、該遺伝子のDNA配列を、部位特異的突然変異誘発により又は該遺伝子自体の再合成により改変することができる（Ikemura, J. Mol. Biol. 151:389-409 (1981)）。
【００４０】
B．和合性ベクター中へのDraIメチラーゼのクローニング
Sau3AIで部分消化されたpDraIRM9.7-G2 DNA断片（第12節からのもの）を、予めBamHIで切断され脱リン酸化されたベクターpACYC184中に連結する。形質転換体を一緒にプールし、プラスミド集団を精製し、DraIエンドヌクレアーゼで消化する。制限されたプラスミドを、再び大腸菌（E. coli）中に形質転換して、未切断クローンを回収する。ミニプレップに付した14個中12個の形質転換体のプラスミドを、DraIエンドヌクレアーゼの消化から保護する。約3kbの挿入断片を含有するpACYC184DraIM10と称されるそのような1つのクローンを、後続のPmeIエンドヌクレアーゼの発現のために使用する。
【００４１】
C．PmeIエンドヌクレアーゼの発現
PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅するために、DNAプライマーを設計し、合成する。フォワードプライマーは、以下の要素を有する：クローニングを容易にするためのPstI部位、lacZ遺伝子に対しインフレームである停止コドン、大腸菌（E. coli）の強力なコンセンサスリボソーム結合部位、該リボソーム結合部位とPmeIエンドヌクレアーゼのATG開始コドンとの間の7ヌクレオチドのスペーサー配列、およびハイブリダイゼーションのためのPmeIエンドヌクレアーゼDNA配列と符合した24ヌクレオチド。リバースプライマーは、BglII部位と、ハイブリダイゼーションのためのPmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の3’末端に対し84bp 3’側のシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAと符合する21ヌクレオチドとを有する。これらのプライマーを使用して、該エンドヌクレアーゼ遺伝子をゲノムDNAから増幅する。増幅されたDNAをBglIIおよびPstIで切断し、予めPstIおよびBamHIエンドヌクレアーゼで切断されゲル精製された発現ベクターpRRS中に連結する。該連結反応物を、pACYC184DraIM10を含有する大腸菌（E. coli）ER2426コンピテント細胞中に形質転換する。所望のサイズの挿入断片を含有するベクターを、ミニプレップ法により同定する。いくつかのクローンを中期対数期まで増殖させ、0.5mM IPTGで16時間誘導する。ついで該細胞を遠心分離により収穫し、超音波処理緩衝液中に再懸濁し、音波処理により溶解し、該抽出物をPmeIエンドヌクレアーゼ活性に関してアッセイする。pRRSPmeIR1/pACYC184DraIM10と称される、PmeIを発現するそのような1つの宿主を増殖させ、PmeI制限エンドヌクレアーゼの製造に使用する。
【００４２】
14．製造：PmeIエンドヌクレアーゼは、過剰発現されるPmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を保持する宿主細胞から、適当な抗生物質での選択および誘導を伴う豊富な培地中で発酵槽内にて増殖させることにより製造することができる。ついで該細胞を遠心分離により収穫し、音波処理により破壊して、PmeI制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗製細胞抽出物を得る。
【００４３】
15．精製：アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのタンパク質精製技術の組合せにより、PmeIエンドヌクレアーゼを含有する粗製細胞抽出物を精製する。
【００４４】
前記で大まかに説明した工程は、本発明を実施するための好ましい態様を代表するものであるが、前記のアプローチが当該技術分野で公知の技術に従い変更可能であることは当業者には明らかである。
【００４５】
以下の実施例は、実施するのに現在好ましい本発明の実施態様を例示するものである。本実施例は例示的であり、本発明は実施例に限定されるものではなく、添付の請求の範囲に示されるとおりに限定されるにすぎないと理解されるであろう。
【００４６】
前記および後記で引用している参照文献は、参考として本明細書に組入れることとする。
【００４７】
実施例 1
PmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
1．DNAの精製：5gのシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）（NEB#698）細胞ペーストを、20mlの25％ショ糖、0.05M Tris-HCl、1mM EDTA（pH8.0）中に、穏やかに振とうすることにより再懸濁した。5mlの0.5M EDTA（pH8.0）および新たに調製した10mg/mlリゾチーム［0.25M Tris-HCl（pH8.0）中］6mlを加え、該溶液を4℃で2時間インキュベートした。24mlの溶解混合物（1％Triton-X100、50mM Tris、62.5mM EDTA, pH8.0）、ついで5mlの10％SDSを加え、該溶液を4℃で一晩インキュベートした。該溶液を50mlの平衡化フェノールで抽出し、該水相を回収し、50mlのクロロホルムで2回抽出した。該水性溶液を、4回交換する2Lの10mM Tris、1mM EDTA（pH8.0）に対して一晩透析した。ついで、透析された溶液をRNアーゼ（100μg/ml）で37℃で1時間消化した。該DNAを、1/10容量の5M NaClおよび0.55容量の2-プロパノールの添加により沈殿させ、ガラス棒に巻き付けた。該DNAを風乾し、ついで10mlの10mM Tris、1mM EDTA（pH8.0）中に溶解した。
【００４８】
2．シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）（NEB#698）からのPmeI制限エンドヌクレアーゼの精製：マグネシウムの添加無しの修飾LB培地を含有するフラスコ内で、攪拌・通気しながら37℃でシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）細胞を一晩増殖させることにより、PmeI制限酵素を製造することができる。該細胞を遠心分離により収穫した。以下のすべての操作は、氷上または4℃で行なった。196g（湿重量）の細胞ペレットを、50mM NaClを含有する（緩衝液A.05）600mlの緩衝液A（20mM Tris-HCl, 1mMジチオトレイトール(DTT), 0.1mM EDTA, 5%グリセロール, pH7.4）に再懸濁し、ついでフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を最終濃度25μg/mlで加えた。ついで該細胞懸濁液を音波処理により破壊した。該抽出物を12Krpmで90分間遠心分離し、上清を集めた。該ペレットを50mlの緩衝液A.05でリンスし、再び15Krpmで90分間遠心分離した。該上清を合わせ（合計700ml）、緩衝液A.05で平衡化された216mlのQ-セファロースカラム（Pharmacia; Piscataway, NJ）上にローディングした。このカラムを200mlの緩衝液A.05で洗浄し、流出および洗浄によりPmeI活性を溶出した。PmeIを含有する画分を一緒にプールし、緩衝液A.05中で平衡化された216mlのヘパリン-セファロースカラム（Pharmacia; Piscataway, NJ）上にローディングし、600mlの緩衝液A.05で洗浄し、ついで2Lの直線勾配（緩衝液A中の50mM〜800mMのNaCl）を得た。21mlの画分を集めた。PmeI制限活性に関してλDNAで画分をアッセイし、溶出された活性の中間点は約480mMのNaCl濃度であることが判明した。合計12個の画分をプールした。酵素活性の量は750,000単位であると推定された。このヘパリン-セファロースプールを、50mM NaCl（緩衝液B.05）を含有する緩衝液B（20mM KPO4, 6mM 2-メルカプトエタノール, 0.1mM EDTA, 5%グリセロール, pH6.8）中で平衡化された12mlのヒドロキシルアパタイト（HPT）カラム（Calbiochem; LaJolla, CA）に適用し、36mlの緩衝液B.05、ついで120mlの直線勾配（緩衝液B中50mM NaCl〜1M NaCl）で洗浄した。1.2mlの画分を集めた。PmeI活性に関してλDNAで画分をアッセイした。制限酵素活性の中間点は、約500mMのNaClで溶出した。合計13個の画分をプールし、50mM NaCl（緩衝液C.05）を含有する緩衝液C（20mM KPO4, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 5%グリセロール, pH6.8）に対して一晩透析した。透析された溶液を、緩衝液C.05中、ついで50mlの直線勾配（緩衝液C中50mM NaCl〜500mM NaCl）中で平衡化された1mlのpolyCat Aカラム（Custom LC, Inc.; Houston, TX）に適用した。1mlの画分を集め、制限酵素活性に関してλDNAで該画分をアッセイした。PmeI活性は、約270mM NaClで溶出した。3つの画分を一緒にプールし、5容量の緩衝液Aで希釈し、緩衝液A.05で平衡化された1mlのMono Q FPLCカラム（Pharmacia; Piscataway, NJ）上にローディングした。該カラムを2mlの緩衝液A.05で洗浄し、流出および洗浄によりPmeI活性を溶出した。PmeIを含有する画分を一緒にプールし、緩衝液A.05で平衡化された3mlのヘパリン-TSK FPLCカラム（TosoHaas; Philadelphia, PA）上に直接ローディングした。該カラムを2mlの緩衝液A.05、ついで60mlの直線勾配（緩衝液A中50mM NaCl〜500mM NaCl）で洗浄した。1mlの画分を集め、PmeI活性をλDNAでアッセイした。制限酵素活性のピークは、300mM NaClで溶出した。精製されたPmeI制限酵素活性の量は、116,000単位であると推定された。該ピーク画分をSDS-PAGEタンパク質ゲル上にローディングし、電気泳動に付した。該ゲルをクーマシーブルーR-250で染色し、PmeI制限エンドヌクレアーゼ活性に対応する約26kDの顕著なバンドが認められた。
【００４９】
3．アミノ末端PmeIタンパク質の配列決定：前記第2節に記載のとおりに調製したPmeI制限エンドヌクレアーゼを電気泳動に付し、文献記載（Looneyら, Gene 80:193-208 (1989)）のとおりに改変したMatsudaira（Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262:10035-10038 (1987)）の方法に従いエレクトロブロットした。該メンブレンをクーマシーブルーR-250で染色し、約26kDのタンパク質のバンドを切り出し、Applied BioSystems Division, Perkin-Elmer Corporation（Foster City, California）Model 407A気相タンパク質シークエンサー（Waite-Reesら, J Bacteriol. 173:5207-5219 (1991)）上の連続的な分解に付した。27kDのタンパク質の最初の24残基は、(Met)-Thr-Thr-Asn-Ser-Pro-Ser-Asp-Val-Gly-Met-IIe-Asp-Glu-Cys-Leu-Ser-IIe-Val-Xaa-Thr-Xaa-Leu-Ala（配列番号4）に相当した。
【００５０】
4．N末端PmeI DNAの増幅：工程3で得たアミノ酸配列に基づく縮重DNAプライマーを使用して、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部を増幅する。アミノ酸残基1〜6の(M)TTNSP（配列番号1）に対応する以下の2つのプライマーを合成する：PmeI-PS1 5’ GTTGGATCCATGACNACNAAYTCNCC 3’（配列番号5）およびPmeI-PS2 5’ GTTGGATCCATGACNACNAAYAGYCC 3’（配列番号6）。DNAの逆鎖にハイブリダイズさせるために、アミノ酸残基10〜14のMIDECに対応するプライマーPmeI-PS3 5’ GTTCTGCAGRCAYTCRTCDATCAT 3’（配列番号7）を合成する。反応混合物は、30μlの10X Vent（登録商標）反応緩衝液
18μlの4mM dNTP溶液
15μlのプライマーPmeI-PS1
15μlのプライマーPmeI-PS2
3μlのシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNA (約600ng)
219μl dH2O
6μl (12単位)のVent（登録商標） Exo−ポリメラーゼ(NEB#257)
を合わせることにより調製した。
【００５１】
該混合物を94μlの3つのアリコートに分割し、最初のアリコートには6μlのdH2Oを加え、2つ目のアリコートには3μlのdH2Oおよび3μlの100mM MgSO4（5mMの最終Mg++濃度）を加え、最後のアリコートには6μlの100mM MgSO4（8mMの最終Mg++濃度）を加えた。PCR増幅条件は、95℃で2分間の1サイクル、ついで95℃で30秒間、40℃で30秒間および72℃で5秒間の20サイクルである。PCRで増幅されたDNAを3.5％NuSieveアガロースゲル上でサイズ選択し、pUC19中にクローニングする。増幅されたDNAの個々のクローンを配列決定する。PmeI-PS1およびPmeI-PS2の両方を含有するクローンが認められ、第5アミノ酸Serに関するコドン使用頻度は未知のままである。
【００５２】
5．PmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のN末端に隣接するDNAのクローニング：逆PCR増幅のための鋳型調製：3μgのシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを、100μlの1×NE緩衝液#3（50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 100mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.9）中の20単位のApoI制限エンドヌクレアーゼで50℃で1時間消化した。該制限消化混合物を1容量の平衡化フェノール：クロロホルム（50：50, v/v）で抽出し、該水相を回収し、1容量のクロロホルムで2回抽出した。1/10容量の5M NaClおよび1容量の2-プロパノールを加えることにより該DNAを沈殿させ、70％氷冷エタノールで洗浄した。該DNAを50μlの1×TEに再懸濁した。16℃で一晩、2000UのT4 DNAリガーゼを使用して、10μlのこの消化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNA（約0.5μg）を500μlの1×リガーゼ緩衝液中で環化させた。この環化反応の一部を、後続の逆PCR反応のためのDNA鋳型として使用した。BsaHI、BsrFI、BstYI、EaeＩ、HaeII、Sau3AI、NlaIII、EagIおよびBssHIIで消化され環化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを、同様にして調製した。
【００５３】
1つのフォワードまたはコード鎖プライマーPmeI-IP1および2つのリバースまたは非コード鎖プライマーPmeI-IP2およびPmeI-IP3（以下に示す配列を有する）を、工程4で得たDNA配列に基づき合成した。アミノ酸残基8〜13のAsp-Val-Gly-Met-IIe-Asp（配列番号8）に対応するヌクレオチドと残基14のGluをコードするコドンの最初のヌクレオチドGとにハイブリダイズするように、プライマーPmeI-IP1を設計した。また、クローニングを容易にするために、このプライマー内にBamHI制限部位を含めた。残基2のThrをコードするコドンの最後の2つのヌクレオチド、アミノ酸残基3〜7のThr-Asn-Ser-Pro-Ser（配列番号9）に対応するヌクレオチドおよび残基8のAspをコードするコドンの最初のヌクレオチドにハイブリダイズするように、プライマーPmeI-IP2を設計した。また、クローニングを容易にするために、このプライマー内にPstI制限部位を含めた。
プライマーPmeI-IP1
5’ GTTGGATCCGACGTCGGCATGATCGACG-3’（配列番号10）
プライマーPmeI-IP2
5’ GTTCTGCAGCTGAGGGGCTGTTCGTTG-3’（配列番号11）
プライマーPmeI-IP3
5’ GTTCTGCAGCTGAGGGCGAATTCGTTG-3’（配列番号12）
SmaIなどの平滑末端を与える制限酵素により予め切断されているベクター中にPCR断片を直接挿入するのが簡便なことが多い。この場合には、挿入するPCR断片が5’末端にリン酸基を有する必要がある。この目的には、100μlの反応容量中の1mM ATPで補足された1×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（70mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 5mMジチオトレイトール, pH7.6）中の20単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼにより、15μlのDNAプライマーPmeI-IP1（200μM）を37℃で1時間リン酸化した。また、プライマーPmeI-IP2およびPmeI-IP3を、前記のとおり5’末端でリン酸化した。65℃で20分間インキュベートすることにより、T4 DNAポリヌクレオチドキナーゼを熱不活性化した。リン酸化されたプライマーを、2容量の1×TEで最終濃度10μMにまで希釈し、以下のPCR反応で使用した。
【００５４】
消化され環化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを鋳型として使用しリン酸化プライマーPmeI-IP1およびPmeI-IP2を使用して、逆PCR反応を行なった。逆PCR反応においては、個々のDNA鋳型に対して3つの異なるMg++濃度を使用した。反応混合物は、
30μlの10X Vent（登録商標）反応緩衝液
18μlの4mM dNTP溶液
15μlのリン酸化プライマーPmeI-IP1
15μlのリン酸化プライマーPmeI-IP2
36μlの環化DNA鋳型（約25ng）
168μlのdH2O
6μl (12単位)のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼ(NEB#257)
を合わせることにより調製した。
【００５５】
該混合物を94μlの3つのアリコートに分割し、最初のアリコートには6μlのdH2Oを加え、2つ目のアリコートには3μlのdH2Oおよび3μlの100mM MgSO4（5mMの最終Mg++濃度）を加え、最後のアリコートには6μlの100mM MgSO4（8mMの最終Mg++濃度）を加えた。PCR増幅条件は、95℃で2分間の1サイクル、ついで95℃で30秒間、50℃で30秒間および72℃で2.5分間の5サイクル、ついで95℃で30秒間、65℃で30秒間および72℃で2.5分間の20サイクルであった。15μlの該PCR反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分析した。いくつかの非特異的な増幅されたDNAバックグラウンドのうち、以下の産物が認められた：1700bpの断片、および接近して位置する2つのApoIで消化された環状鋳型からの約1500bpの断片、BstYIで消化された環状鋳型からの1500bpの断片、BsaHIで消化された環状鋳型からの900bpの断片および750bpの断片、およびEagIで消化された環状鋳型からの2500bpの断片。これらの増幅産物をゲル精製した。ゲル精製：100μlのPCR反応を1％LMPアガロース中に電気泳動し、バンドを該ゲルから切り出し、65℃で5分間溶融し、40℃に5分間冷却し、40℃で1時間インキュベートすると共に5単位のβ-アガロース（New England Biolabs #392）を加えることにより該アガロースを消化した。ついで、それを1容量の平衡化フェノール：クロロホルム（50：50, v/v）で抽出し、該水相を回収し、1容量のクロロホルムで2回抽出した。1/10容量の5M NaClおよび2容量の2-プロパノールを加えることにより該DNAを沈殿させ、70％エタノールで洗浄し、風乾し、50μlの1×TE緩衝液中に再懸濁した。
【００５６】
また、リン酸化プライマーPmeI-IP1およびPmeI-IP3を使用し、前記と同じ鋳型セットを前記と同様に使用して、逆PCR反応を行なった。15μlの該PCR反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分析した。以下の断片をゲル精製した：ApoIで消化された環状鋳型からの2000bp、1800bpおよび870bpの断片、BstYIで消化された環状鋳型からの1350bpの断片、BsrFIで消化された環状鋳型からの1200bpの断片、BssHIIで消化された環状鋳型からの2100bpおよび1400bpの断片、EagIで消化された環状鋳型からの2500bpの断片、ならびにNlaIIIで消化された環状鋳型からの800bpの断片。
【００５７】
ゲル精製された各増幅DNA産物を、それぞれ以下のとおりにベクターpUC19中に連結した。予めSmaIで切断され仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIP）で脱リン酸化された100ngのpUC19ベクターに5μlのゲル精製DNAを、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液（50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM ATP, 25μg/ml BSA, pH7.5）の最終容量20μl中、400UのT4 DNAリガーゼで連結した。ついで10μlの該連結混合物を大腸菌（E. coli）ER2267株中に形質転換し、100μg/mlアンピシリン、40μg/ml Xgalおよび50μg/ml IPTGを含有するL-ブロスプレート上で個々のコロニーについてプレーティングした。白色コロニーを個々に拾い、100μg/mlアンピシリンを含有する10mlのL-ブロスに接種し、37℃で一晩増殖させた。ミニプレップを行ない、該精製DNAを消化し、それをアガロースゲル電気泳動により分析することにより、所望の構築物のクローンを同定した。
【００５８】
ミニプレップ法：各培養を8000rpmで5分間遠心分離し、上清を棄て、細胞ペレットを1.0mlの25mM Tris、10mM EDTA、50mMグルコース（pH8.0）に再懸濁した。室温で10分後、2mlの0.2M NaOH、1%SDSを各管に加え、該管を振とうして該細胞を溶解し、ついで氷上に配置した。溶液が清澄化したら、1.5mlの3M酢酸ナトリウム（pH4.8）をそれぞれに加え、振とうした。生成した沈殿物を15,000rpm、4℃で10分間遠心沈殿させた。各上清を注ぎ、混合した。室温で10分後、該管を15,000rpmで10分間遠心して、沈殿した核酸をペレット化した。上清を棄て、該ペレットを室温で30分間風乾した。乾燥したら、該ペレットを、100μg/ml RNアーゼを含有する850μlの10mM Tris（pH 8.0）、1mM EDTAに溶解し、37℃で1時間インキュベートして、該RNAを消化した。85μlの5M NaCl、ついで600μlのイソプロパノールを加えることにより、該DNAを沈殿させた。室温で10分間後、該DNAを5分間の遠心分離により遠心沈殿させ、上清を棄て、該ペレットを乾燥し、ついで10mM Tris、1mM EDTA（pH 8.0）（1×TE）の150μlの最終溶液に再溶解した。ついで該プラスミドミニプレップを、種々の制限エンドヌクレアーゼでの消化により分析した。
【００５９】
6．DNA配列決定：ABI 373自動配列決定システムを製造業者の指示に従い使用し、M13/pUCプライマー#1233および#1224（NEB）を使用して、DNA配列決定を行なった。第5節に記載の逆PCR反応からのDNA断片を含有する種々のpUC19構築物のミニプレップDNA調製物を、鋳型として使用した。唯一のクローンが、PmeIエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列（プライマーPmeI-IP1およびPmeI-IP3を使用する逆PCR反応において、BssHIIで消化された環状鋳型から増幅した1400bpの断片）と符合する配列を有していた。このクローンをpUC19BssHII21と称することにした。このクローンの一方の末端のDNA配列は、プライマーPmeI-IP1から3’側のPmeIエンドヌクレアーゼ配列の部分と符合した。しかしながら、もう一方の末端からのDNA配列は、プライマーPmeI-IP3から3’側のPmeIエンドヌクレアーゼ配列の部分とは符合しなかった。プライマーPmeI-IP1は、PmeIゲノムDNA上の所望の位置でハイブリダイズし、プライマーPmeI-IP3は、おそらく該プライマー配列上のミスマッチのため、PmeIゲノムDNA上の他の位置でハイブリダイズする、と結論した。第4および第5残基（AsnおよびSer）に関してコドン配列の相違があったため、これらの残基をコードするDNA配列を排除するように逆PCRプライマーの新たなセットを設計した。
【００６０】
7．該エンドヌクレアーゼ遺伝子のN末端に隣接したDNAを増幅しクローニングするための、新たなプライマーセットを使用する逆PCR増幅：工程6で得たDNA配列に従い、プライマーPmeI-IP4およびPmeI-IP5を設計した。プライマーPmeI-IP4は、アミノ酸残基Val-Gly-Met-IIe-Asp（配列番号13）に対応するヌクレオチドと、Gluのコドンの最初の2つのヌクレオチドとを含んでいた。また、クローニングを容易にするために、このプライマーにはBamHI部位を含めた。
プライマーPmeI-IP4
5’ GTTGGATCCGTCGGCATGATCGACGA-3’（配列番号14）
プライマーPmeI-IP5は、Glyのコドンの最初の2つのヌクレオチドとアミノ酸残基Val-Asp-Ser-Proに対応するヌクレオチドとにハイブリダイズするように設計した。また、クローニングを容易にするために、このプライマーにはBamHI部位を含めた。
プライマーPmeI-IP5
5’ CATGGATCCGACGTCTGAGGG-3’（配列番号15）
BsaWIで消化され環化されたPmeI DNAを鋳型として使用して、逆PCR反応を行なった。該産物の増幅を成功させた反応においては、
10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液
6μlの4mM dNTP溶液
3μlの100mM MgSO4（5mMの最終Mg++濃度）
5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP4
5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP5
12μlの環化DNA鋳型（約25ng）
58μlのdH2O
2μl（4単位）のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼNEB#257
を合わせることにより、反応混合物を調製した。
【００６１】
PCR増幅条件は、95℃で2分間の1サイクル、ついで95℃で30秒間、40℃で1分間および72℃で2.5分間の5サイクル、ついで95℃で30秒間、60℃で1分間および72℃で2.5分間の20サイクルであった。15μlの該PCR反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分析した。
【００６２】
900bpの産物が認められ、それをゲル精製し、50μlの1×TEに再懸濁した。5μlのこのDNAを、1×BamHI緩衝液（150mM NaCl, 10mM Tris-HCl,10mM MgCl2, 1mMジチオトレイトール, pH7.9）の最終容量20μl中、20UのBamHI（NEB#136）で37℃で1時間消化した。該反応混合物を78℃で20分間インキュベートすることにより、制限エンドヌクレアーゼBamHIを熱不活性化した。消化されたDNA 5μlを、予めBamHIで切断されCIPで脱リン酸化されアガロースゲルで精製された100ngのベクターpUC19に、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液の最終容量20μl中、400UのT4 DNAリガーゼを使用して16℃で2時間連結した。10μlの該連結混合物を大腸菌（E. coli）ER2267株中に形質転換し、100μg/mlアンピシリン、40μg/ml Xgalおよび50μg/ml IPTGを含有するL-ブロスプレート上で個々のコロニーについてプレーティングした。白色コロニーを個々に拾い、100μg/mlアンピシリンを含有する10mlのL-ブロスに接種し、37℃で一晩増殖させた。ミニプレップを行ない、該精製DNAを消化し、それをアガロースゲル電気泳動により分析することにより、所望の構築物のクローンを同定した。その900bpの断片を含有するpUC19BsaWI5と称される1つのクローンを配列決定した。
【００６３】
8．クローンpUC19BsaWI5のDNA配列決定：ABI 373自動配列決定システムを製造業者の指示に従い使用し、M13/pUCプライマー#1233および#1224（New England Biolabs, Beverly, MA）ならびに鋳型としてpUC19BsaWI5ミニプレップDNA調製物を使用して、DNA配列決定を行なった。このクローンの一方の末端のDNA配列は、プライマーPmeI-IP4から3’側の及びそれに対応するPmeIエンドヌクレアーゼ配列の部分と符合した。また、もう一方の末端からのDNA配列は、プライマーPmeI-IP5から3’側の及びそれに対応するPmeIエンドヌクレアーゼ配列の部分と符合した。残基4（Asn）および残基5（Ser）のコドン配列は、5’ AAC 3’および5’ TCC 3’であることが判明した。第3節で得たN末端タンパク質の配列データと符合するN末端アミノ酸を有する693bpのオープンリーディングフレームがPmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子であると確認した。エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し直ぐ3’側の700bpのDNA配列から翻訳された6フレームのアミノ酸配列を、種々の型の公知メチラーゼの保存アミノ酸モチーフと比較したが、これらのモチーフと相同なアミノ酸配列を同定することはできなかった。同様に、該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し直ぐ5’側に隣接した200bpのDNA配列から翻訳された6フレームのアミノ酸配列からは、明らかなメチラーゼモチーフを見出すことができなかった。可能なPmeIメチラーゼ遺伝子を位置づけるために、該エンドヌクレアーゼ遺伝子の両側から更に離れて位置するDNA領域を、後続の工程において増幅し、クローニングし、配列決定した。
【００６４】
9．PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子に対し5’側のDNAのクローニング：制限エンドヌクレアーゼApoI、EagI、BssHII、BsrF、HaeIIおよびBstYIで消化され環化された第5節からのシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを、逆PCR増幅のための鋳型として使用した。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の内部およびその5’末端に対してアニーリングするように、以下に示すプライマーPmeI-IP6およびPmeI-IP7を設計した。クローニングを容易にするために、両プライマーはPstI部位を含有する。
プライマーPmeI-IP6
5’-ホスホ-GTTCTGCAGCTCGTTGTCTTCTTCTGC-3’（配列番号16）
プライマーPmeI-IP7
5’-ホスホ-ATCCTGCAGGCGACGTTCGGACGATG-3’（配列番号17）
該産物の増幅を成功させた反応においては、
10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液（最終濃度2mMのMg++を含有）
6μlの4mM dNTP溶液
5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP6
5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP7
12μlの環化DNA鋳型（約25ng）
58μlのdH2O
2μl（4単位）のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼNEB#257
を合わせることにより、反応混合物を調製した。
【００６５】
PCR増幅条件は、95℃で2分間の1サイクル、ついで95℃で20秒間、50℃で1分間および72℃で2.5分間の5サイクル、ついで95℃で30秒間、65℃で1分間および72℃で2.5分間の20サイクルであった。15μlの該PCR反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分析した。
【００６６】
いくつかの非特異的増幅バックグラウンドDNAのうち、1.8kbの産物がApoI環状鋳型PCR反応において認められ、1.6kbの産物がBssHII環状鋳型PCR反応において認められ、3.3kbの産物がBstYI環状鋳型PCR反応において認められ、1.6kbの産物がEagl環状鋳型PCR反応において認められ、0.9kbの産物がHaeII環状鋳型PCR反応において認められた。これらの5つの産物をゲル精製し、60μlの1×TEに再懸濁した（BstYI産物は20μlの1×TEに再懸濁した）。ゲル精製されたApoI産物5μlを、予めSmaIで切断されCIPで脱リン酸化されアガロースゲルで精製された100ngのベクターpUC19に、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液の最終容量20μl中、400UのT4 DNAリガーゼを使用して16℃で2時間連結した。ゲル精製されたBssHII、EagI、HaeIIおよびBstYI産物を、前記のとおり、同様にしてpUC19中に連結した。10μlの各連結混合物を大腸菌（E. coli）ER2267株中に形質転換し、100μg/mlアンピシリン、40μg/ml Xgalおよび50μg/ml IPTGを含有するL-ブロスプレート上で個々のコロニーについてプレーティングした。白色コロニーを個々に拾い、100μg/mlアンピシリンを含有する10mlのL-ブロスに接種し、37℃で一晩増殖させた。ミニプレップを行ない、該精製DNAを消化し、それをアガロースゲル電気泳動により分析することにより、所望の構築物のクローンを同定した。
【００６７】
10．該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し5’側のDNAの配列決定：ABI 373自動配列決定システムを製造業者の指示に従い使用し、M13/pUCプライマー#1233および#1224（NEB）を使用して、第9節からの所望の挿入断片を有する構築物を配列決定した。該構築物のミニプレップDNA調製物を、鋳型として使用した。BstYIで環化された鋳型からの3.3kbの増幅産物とHaeIIで環化された鋳型からの0.9kbの増幅産物との末端は、両方の逆PCRプライマーPmeI-IP6およびPmeI-IP7に対し3’側の公知DNA領域と符合した。プライマーウォーキングおよび配列決定により、完全な配列を得た。その3.3kbの産物は2.9kbの新たなDNA配列を含有し、その0.9kbの産物は200bpの新たなDNA配列を含有していた。その新たなDNA配列内には、明らかなメチラーゼモチーフは認められなかった。
【００６８】
11．該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し3’側のDNAの増幅およびクローニング：該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し3’側のDNA情報を得るために、2つの連続した逆PCR増幅実験を行なった。
【００６９】
A．逆PCR増幅#1：逆PCR増幅のための鋳型の調製：3μgのゲノムシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを、100μlの反応容量の1×NE緩衝液#4（20mM Tris-酢酸, 10mM酢酸マグネシウム, 50mM酢酸カリウム, 1mM DTT, pH 7.9）中の100UのAatII制限エンドヌクレアーゼで37℃で1時間消化した。該制限消化混合物を1容量の平衡化フェノール：クロロホルム（50：50, v/v）で抽出し、該水相を回収し、1容量のクロロホルムで2回抽出した。1/10容量の5M NaClおよび1容量の2-プロパノールを加えることにより該DNAを沈殿させ、ついで70％氷冷エタノールで洗浄した。該DNAを50μlの1×TEに再懸濁した。2000UのT4 DNAリガーゼを使用して、この消化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNA 10μl（約0.5μg）を500μlの1×リガーゼ緩衝液中で16℃で一晩環化した。環化されHinp1I、MscI、MseI、SacI、StuIおよびTsp509Iで消化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを、同様にして調製した。これらの環化DNAと、BsaHIで消化され環化された第5節からのDNAとを、後続の逆PCR反応の鋳型として使用した。
【００７０】
以下に示す配列のプライマーPmeI-IP8およびPmeI-IP9を使用して、該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し3’側のDNAを増幅した。クローニングを容易にするために、両プライマーはPstI部位を含有している。
プライマーPmeI-IP8
5’-pGGTCTGCAGTCGGGCAGAACGTGATATTCGA-3’（配列番号18）
プライマーPmeI-IP9
5’-pGTTCTGCAGGCCATTTGGCACCCTG-3’（配列番号19）
該産物の増幅を成功させた反応においては、
10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液（最終濃度2mMのMg++を含有）
6μlの4mM dNTP溶液
5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP8
5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP9
12μlの環化DNA鋳型（約25ng）
58μlのdH2O
2μl（4単位）のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼNEB#257
を合わせることにより、反応混合物を調製した。
【００７１】
PCR増幅条件は、95℃で2分間の1サイクル、ついで95℃で20秒間、52℃で30秒間および72℃で2.5分間の5サイクル、ついで95℃で30秒間、65℃で30秒間および72℃で2.5分間の20サイクルであった。15μlの該PCR反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分析した。
【００７２】
いくつかの非特異的増幅バックグラウンドDNAのうち、1.1kbの産物がAatII環状鋳型PCR反応において認められ、1.4kbの産物がMscI環状鋳型PCR反応において認められ、0.7kbの産物がBsaHI環状鋳型PCR反応において認められた。これらの産物をゲル精製し、20μlの1×TEに再懸濁した。ゲル精製されたAatII産物2μlを、予めSmaIで切断されCIPで脱リン酸化されアガロースゲルで精製された100ngのベクターpUC19に、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液の最終容量20μl中、400UのT4 DNAリガーゼを使用して16℃で2時間連結した。ゲル精製されたMscIおよびBsaHI産物を、前記のとおり、同様にしてpUC19中に連結した。10μlの各連結混合物を大腸菌（E. coli）ER2267株中に形質転換し、100μg/mlアンピシリン、40μg/ml Xgalおよび50μg/ml IPTGを含有するL-ブロスプレート上で個々のコロニーについてプレーティングした。白色コロニーを個々に拾い、100μg/mlアンピシリンを含有する10mlのL-ブロスに接種し、攪拌・通気しながら37℃で一晩増殖させた。ミニプレップを行ない、該精製DNAを消化し、それをアガロースゲル電気泳動により分析することにより、所望の構築物のクローンを同定した。M13/pUCプライマー#1233および#1224（NEB）を使用して、これらのクローン中の増幅産物を配列決定した。この領域に対し3’側の更なるDNA配列情報を得るための後続の逆PCR増幅で使用する以下に示すプライマーPmeI-IP10およびプライマーPmeI-IP11を設計するために、これらの新たに得られたDNA配列を使用した。
PmeI-IP10
5’-ホスホ-GTTCTGCAGCCGTTTCGATGGGCCTTCTC-3’（配列番号20）
PmeI-IP11
5’-ホスホ-GTTCTGCAGAATGAGCTGCGCCAGTTG-3’（配列番号21）
B．逆PCR増幅#2：HaeIIで消化され環化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNA（第5節）を、プライマーPmeI-IP10およびプライマーPmeI-IP11を用いる逆PCR増幅において鋳型として使用した。該産物の増幅を成功させた反応においては、
10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液（最終濃度2mMのMg++を含有）
6μlの4mM dNTP溶液
5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP10
5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP11
12μlの環化DNA鋳型（約25ng）
58μlのdH2O
2μl（4単位）のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼNEB#257
を合わせることにより、反応混合物を調製した。
【００７３】
PCR増幅条件は、95℃で2分間の1サイクル、ついで95℃で20秒間、60℃で30秒間および72℃で2.5分間の5サイクル、ついで95℃で30秒間、65℃で30秒間および72℃で2.5分間の20サイクルであった。15μlの該PCR反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分析した。0.7kbの増幅産物を得、これを、予めSmaIで切断されCIPで脱リン酸化されアガロースゲルで精製されたpUC19ベクター中にクローニングした。所望の挿入断片を保持するプラスミドクローンを同定するために、ミニプレップを行なった。M13/pUCプライマー#1233および#1224（NEB）を使用して、その0.7kbの産物を配列決定した。該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し3’側に、約1.57kbのDNA配列が得られ、このDNAの6フレームアミノ酸翻訳物からは、明らかなメチラーゼモチーフを見出すことはできなかった。
【００７４】
12．DraIメチラーゼで修飾されたDNAがPmeI制限消化から保護されうるか否かを確認するための、ベクターpNEB193中でのDraIメチラーゼの発現：ベクターpBR322（Jack Benner, New England Biolabs, Inc）中の5.5kbの挿入断片上にDraIメチラーゼ遺伝子を含有するDraIメチラーゼ産生クローン（pDraIRM9.7-G2）を、以下のとおりにSau3AIで部分消化した。7μgのpDraIRM9.7-G2 DNAを、350μlの1×Sau3AI緩衝液（100mM NaCl, 10mMビスTrisプロパン-HCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, pH 7.0）中に希釈した。この混合物を使用して、Sau3AI制限エンドヌクレアーゼの系列希釈（50μlの最終容量中、それぞれ2倍希釈で1単位/μgDNAから1/64単位/μgDNAまで）を調製した。これらの反応を37℃で15分間インキュベートし、ついでSau3AI制限エンドヌクレアーゼを68℃で20分間熱不活性化した。DNA 1μg当たり1/8単位のSau3AIの消化から得た消化DNA 0.5μgを使用して、予めBamHIで切断されCIPで脱リン酸化された200μgのpNEB193ベクターに、800UのT4 DNAリガーゼを含有する40μlの1×T4 DNAリガーゼ緩衝液中、16℃で16時間連結した。該連結混合物を200μlの大腸菌（E. coli）ER2426株コンピテント細胞中に形質転換し、100μg/mlアンピシリンを含有するL-ブロスプレート上でプレーティングした。約10,000個のコロニーを得、これらを6mlの10mM Tris、10mM MgCl2（pH7.5）中に掻き取った。このプール2mlを、100μg/mlアンピシリンを含有する100mlのL-ブロス中に接種し、振とうしながら37℃で8時間増殖させた。前記第5節に記載のミニプレップ法を10倍スケールアップすることにより、プラスミドを単離した。該ミニプレップDNAを500μlの1×TEに再懸濁し、2μlを、50μlの1×NE緩衝液4中、40単位のDraIで37℃で2時間消化した。10μlの該消化混合物を、50μlの大腸菌（E. coli）ER2426株コンピテント細胞中に形質転換し、100μg/mlアンピシリンを含有するL-ブロスプレート上でプレーティングした。9個の形質転換体からのプラスミドを、ミニプレップ法により単離し、DraI制限エンドヌクレアーゼで消化した。8個のクローンは、DraI消化から完全に保護された。ついで、これらをPmeI制限エンドヌクレアーゼで消化したところ、それらはPmeI制限消化からも完全に保護されていた。
【００７５】
13．PmeIエンドヌクレアーゼの過剰発現：
A．和合性ベクター上でのDraIメチラーゼのクローニング：pACYC184のBamHI部位中にDraIメチラーゼ遺伝子を挿入することにより、DraIメチラーゼ遺伝子を発現させた。これを行なうために、Sau3AIで部分消化された第12節で調製したpDraIRM9.7-G2 DNAの0.5μgを、予めBamHIで切断され脱リン酸化されたベクターpACYAC184中に、800UのT4 DNAリガーゼを含有する40μlの1×T4 DNAリガーゼ緩衝液中、16℃で2時間連結した。該連結混合物を200μlの大腸菌（E. coli）ER2426株コンピテント細胞中に形質転換し、25μg/mlクロラムフェニコールを含有するL-ブロスプレート上でプレーティングした。約1,600個のコロニーを得、これらを4mlの10mM Tris、10mM MgCl2（pH7.5）中に掻き取った。このプール1mlを、25μ/mlクロラムフェニコールを含有する75mlのL-ブロス中に接種し、振とうしながら37℃で8時間増殖させた。前記第5節に記載のミニプレップ法を10倍スケールアップすることにより、プラスミドを単離した。該ミニプレップDNAを500μlの1×TEに再懸濁し、14,000rpmで5分間遠心分離した。336μlの該清澄化上清を、64μlの5M NaClおよび400μlの13％PEG8000と混合し、氷上で1時間インキュベートした。該DNAを14,000rpm、4℃で5分間遠心沈殿させ、氷冷70％エタノールで洗浄し、風乾した。該DNAペレットを500μlの1×TEに再懸濁し、その5μlを、50μlの1×NE緩衝液4中、60単位のDraIで37℃で1時間消化した。DraIで消化されたこのDNA 5μlを、50μlのER2426コンピテント細胞中に形質転換し、25μg/mlクロラムフェニコールを含有するL-ブロスプレート上でプレーティングして、個々の形質転換体を得た。14個の形質転換体からのプラスミドを、ミニプレップ法により単離し、DraI制限エンドヌクレアーゼで消化した。これらのうちの12個のクローンは、DraI消化から完全に保護されていた。さらなる制限分析は、pACYC184DraIM10およびpACYC184DraIM13の2つのクローンが同一であり、約3kbの最小の挿入断片を含有していることを示した。クローンpACYC184DraIM10を、PmeIエンドヌクレアーゼの発現のために使用した。
【００７６】
B．エンドヌクレアーゼのクローニング：発現ベクターpRRS中の強力な誘導プロモーター（PlacUV5）および強力に認識されるリボソーム結合部位の直ぐ下流に該制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を挿入することにより、該遺伝子を発現させた。これを行なうために、DNA配列データを利用して、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを作製した。該フォワードオリゴヌクレオチドプライマーは、クローニングを容易にするためのPstI部位、lacZタンパク質の翻訳を停止するためのlacZ遺伝子に対してインフレームである停止コドン、強力に認識されるリボソーム結合部位、rbsとPmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子のATG開始コドンとの間の7ヌクレオチドのスペーサー、およびハイブリダイゼーションのためのシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAと相補的な24ヌクレオチドを含有していた。
プライマーPmeIRexp1：
5’-GAGACTGCAGGAGGTAATTCATATGACCACAAACTCCCCCTCAGAC-3’（配列番号22）
該リバースプライマーは、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の3’末端に対し84bp 3’側のシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAとハイブリダイズするように設計した。それは、クローニングを容易にするためのBglII部位およびSalI制限部位と、ハイブリダイゼーションのためのシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）と相補的な21ヌクレオチドとを含有していた。
プライマーPmeIRexp2：
5’-CAAGAGATCTAGTCGACCGGTGTTAGCAACCCGATAC-3’（配列番号23）
これらの2つのプライマーを使用して、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）ゲノムDNAからPmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅した。これは、
10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液
6μlの4mM dNTP
2μl（400ng）のシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）ゲノムDNA
5μl（10μMストック）のプライマーPmeIRexp1
5μl（10μMストック）のプライマーPmeIRexp2
4μlの100mM MgSO4
66μlのdH2O
0.6μl（1.2単位）のVent（登録商標）ポリメラーゼ（2単位/μlのストック）を合わせ、95℃で3分間の1サイクル、ついで95℃で30秒間、60℃で20秒間、72℃で50秒間の4サイクル、ついで95℃で30秒間、65℃で20秒間および72℃で50秒間の20サイクルで増幅することにより行なった。約850bpの増幅産物をゲル精製し、BglIIおよびPstIで切断し、フェノール-クロロホルム抽出し、沈殿させ、TEに再懸濁し、予めPstIおよびBamHIで切断されゲル精製されたpRRSベクター中に連結した。該連結反応物を、DraIメチラーゼ遺伝子構築物pACYC184DraIM10を保持する大腸菌（E. coli）ER2426株中に形質転換し、個々の形質転換体について25μg/mlクロラムフェニコールおよび100μg/mlアンピシリンを含有するL-ブロスプレート上でプレーティングした。7個の形質転換体を、25μg/mlクロラムフェニコールおよび100μg/mlアンピシリンを含有する10mlのL-ブロス中に接種し、振とうしながら37℃で中期対数期まで増殖させ、0.5mM IPTGで16時間誘導した。該細胞ペレットを5000rpm、4℃で5分間遠心沈殿させ、1.5mlの20mM Tris、0.1mM EDTA、1mM DTT、50mM NaCl（pH7.5）に再懸濁し、超音波処理した。該抽出物を使用して、50μlの1×NE緩衝液#2（10mM Tris, 10mM MgCl2, 50mM NaCl, 1mM DTT, pH7.9）中、37℃で30分間、λDNAを消化した。すべてのクローンがPmeIエンドヌクレアーゼ活性を発現した。PmeIエンドヌクレアーゼを産生させるためにpRRSPmeIR1/pACYC184DraIM10と称されるこれらのクローンの1つを選択し、これに、NEB#1081なる株名を与えた。NEB#1081の粗製抽出物から得られたPmeI制限エンドヌクレアーゼ活性の力価を、図1に示す。酵素力価は、細胞1g当たり約1×107単位であった。
【００７７】
14．PmeI制限エンドヌクレアーゼは、NEB#1081から製造することができ、これは、アンピシリン（100μg/ml）およびクロラムフェニコール（25μg/ml）を含むL-ブロス培地を含有する発酵槽内で中期対数期まで増殖させることにより行なうことができる。IPTGを最終濃度0.3mMまで加えることにより該培養を誘導し、増殖を16時間継続する。該細胞を遠心分離により収穫し、−70℃で保存するか又は直ちに使用することができる。
【００７８】
15．NEB#1081からのPmeI制限エンドヌクレアーゼの精製は、前記工程2で大まかに説明したとおり、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの標準的なタンパク質精製技術の組合せにより行なうことができる。この精製から得られたPmeI制限エンドヌクレアーゼは、実質的に純粋であり、非特異的エンドヌクレアーゼもエキソヌクレアーゼ混入物も含んでいない。
【００７９】
pRRSPmeIR1およびpACYC184DraIM10の両方を含有する大腸菌（NEB#1081）のサンプルは、ブダペスト条約の条項および条件に基づきAmerican Type Culture Collectionに1997年11月25日に寄託され、ATCC受託第98596号で受領されている。配列表
【００８０】
【化１】
【００８１】
【化２】
【００８２】
【化３】
【００８３】
【化４】
【００８４】
【化５】
【００８５】
【化６】
【００８６】
【化７】
【００８７】
【化８】
【００８８】
【化９】
【００８９】
【化１０】
【００９０】
【化１１】
【００９１】
【化１２】
【００９２】
【化１３】
【００９３】
【化１４】
【００９４】
【化１５】
【００９５】
【化１６】
【００９６】
【化１７】
【００９７】
【化１８】
【００９８】
【化１９】
【００９９】
【化２０】
【０１００】
【化２１】
【０１０１】
【化２２】
【０１０２】
【化２３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 pRRS由来プラスミドpRRSPmeIR1上のPmeIエンドヌクレアーゼとpACYC184由来プラスミドpACYC184DraIM10上のDraIメチラーゼとを保持する大腸菌（E. coli）ER2426株の細胞抽出物中のPmeI制限エンドヌクレアーゼ活性を示すアガロースゲルの写真。0.5gの細胞ペーストを、1.5mlの超音波処理緩衝液（20mM Tris-HCl, 1mMジチオトレイトール, 0.1mM EDTA, pH7.5）に懸濁し、超音波処理により破壊し、遠心分離により清澄化した。該抽出物を使用して、100μg/ml BSAで補足された1×NE緩衝液4中の50μlの反応容量当たり1μgのλDNAを消化し、37℃で1時間インキュベートした。レーン1および10：HindIII-λ＋HaeIII-φX174サイズ基準；レーン2：0.01μlの粗製抽出物；レーン3：5×10− 3μlの粗製抽出物；レーン4：2.5×10− 3μlの粗製抽出物；レーン5：1.25×10− 3μlの粗製抽出物；レーン6：6.25×10− 4μlの粗製抽出物；レーン7：3.13×10− 4μlの粗製抽出物；レーン8：1.56×10− 4μlの粗製抽出物；レーン9：7.81×10− 5μlの粗製抽出物。全PmeI活性は、細胞ペースト1g当たり約1×107単位に相当する。
【発明の属する技術分野】
本発明は、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）（NEB#698）から入手可能なPmeI制限エンドヌクレアーゼの同定、PmeI制限エンドヌクレアーゼをコードする組換えDNA、および該組換えDNAからのPmeI制限エンドヌクレアーゼの製造に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
II型制限エンドヌクレアーゼは、細菌内に天然に存在する酵素のクラスである。それを他の細菌成分から精製する場合には、分子クローニングおよび遺伝子の特徴づけのための厳密な断片にDNA分子を切断するために、制限エンドヌクレアーゼを実験室内で使用することができる。
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼは、DNA分子に沿った特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識しそれに結合することにより作用する。それは、一旦結合すると、認識配列内の分子またはその一方の側の分子を切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは、異なる認識配列に対する親和性を有する。現在までに調べられている数百の細菌種のうち、特有の特異性を有する180個を超える制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
【０００４】
細菌は、1種あたり大目に見ても少数の制限エンドヌクレアーゼしか有さない傾向がある。エンドヌクレアーゼは、典型的には、それが由来する細菌に基づき命名される。例えば、デイノコッカス・ラジオフィルス（Deinococcus radiophilus）なる種は、Dral、DraIIおよびDraIIIと称される3つの異なる制限エンドヌクレアーゼを合成する。これらの酵素は、それぞれ配列TTTAAA、PuGGNCCPyおよびCACNNNGTGを認識し切断する。一方、大腸菌（Escherichia coli）RY13は、配列GAATTCを認識する酵素EcoRIを唯一合成する。
【０００５】
実際には、制限エンドヌクレアーゼは、細菌細胞の繁殖において防御的な役割を果たしていると考えられる。制限エンドヌクレアーゼのおかげで、細菌はウイルス、プラスミドなどの外来DNA分子による感染に抵抗することができ、もしそれが無ければ、細菌は該外来DNA分子に破壊されるか寄生されることとなろう。制限エンドヌクレアーゼは、認識配列が生じるたびに侵入性外来DNA分子を切断することにより抵抗性を付与する。生じる切断は、該感染遺伝子の多数を不能にし、該DNAを非特異的ヌクレアーゼによる更なる分解に感受性にする。
【０００６】
細菌の防御系のもう1つの成分は、修飾メチラーゼである。これらの酵素は、制限エンドヌクレアーゼを補完するものであり、細菌がそれ自身のDNAを保護しそれを外来感染性DNAから識別するのを可能にする手段を、修飾メチラーゼは提供する。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列を認識しそれに結合するが、該DNAを切断することはなく、メチル基の付加により配列内のいずれかのヌクレオチドを化学修飾する。メチル化後にはもはや、該認識配列は制限エンドヌクレアーゼに切断されない。細菌細胞のDNAは、その修飾メチラーゼの活性により常に修飾される。したがって、それは、内因性制限エンドヌクレアーゼの存在には不感受性である。制限エンドヌクレアーゼの認識および切断に対して感受性なのは、未修飾であり従って識別されうる外来DNAのみである。
【０００７】
遺伝子工学技術の出現に伴い、遺伝子をクローニングしたり、それがコードするタンパク質および酵素を、通常の精製技術で得られるより多量に製造することが、現在では可能となっている。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する際に鍵となるのは、複雑な「ライブラリー」（すなわち、「ショットガン」法により誘導されるクローンの集団）内の該クローンを、それが10-3~10-4の頻度でしか存在しない場合に同定するための簡便かつ信頼しうる方法を開発することである。好ましくは、望ましくない大部分のクローンが破壊され、望ましい希少クローンが生存するように、そのような方法は選択的であるべきである。
【０００８】
II型制限−修飾系は、頻度を増加させてクローニングされている。クローニングされた最初の系では、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択するための手段としてバクテリオファージの感染が用いられた（EcoRII: Kosykhら, Molec. Gen. Genet 178:717-719 (1980); HhaII: Mannら, Gene 3:97-112 (1978); PstI: Walderら, Proc. Nat. Acad. Sci. 78:1503-1507 (1981)）。細菌内の制限−修飾系の存在により該細菌はバクテリオファージの感染に抵抗することができるため、クローニングされる制限−修飾遺伝子を保持する細胞は、原則として、ファージにさらされたライブラリーからの生存体として選択的に単離することができる。しかしながら、この方法は、限られた価値しか有していないことが判明している。特に、クローニングされる制限−修飾遺伝子は、選択的な生存性を付与するのに十分なファージ抵抗性を常に現すわけではないことが判明している。
【０００９】
クローニングのためのもう１つのアプローチは、プラスミドを保持することが初めに確認された系を大腸菌（E. coli）クローニングプラスミド中に導入することを含むものである（EcoRV: Bougueleretら, Nucl. Acid. Res. 12:3659-3676 (1984); PaeR7: GingerasおよびBrooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:402-406 (1983); TheriaultおよびRoy, Gene 19:355-359 (1982); PvuII: Blumenthalら, J. Bacteriol. 164:501-509 (1985)）。
【００１０】
ますます多数の系のクローニングに用いられているもう1つのアプローチは、活性メチラーゼ遺伝子に関する選択を含むものである（米国特許第5,200,333号およびBsuRI: Kissら, Nucl. Acid. Res. 13:6403-6421 (1985)）。制限遺伝子と修飾遺伝子とは、しばしば、密接に連鎖しているため、両遺伝子を同時にクローニングできることが多い。しかしながら、この選択は、常に完全な制限系を与えるわけではなく、メチラーゼ遺伝子しか与えないことがある（BspRI: Szomolanyiら, Gene 10:219-225 (1980); Bcn I: Janulaitisら, Gene 20:197-204 (1982); Bsu RI: KissおよびBaldauf, Gene 21:111-119 (1983);およびMsp I: Walderら, J. Biol. Chem. 258:235-1241 (1983)）。
【００１１】
メチラーゼ遺伝子およびエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするためのもう1つの方法は、DNA損傷に関する比色アッセイに基づくものである（米国特許第5,498,535号）。メチラーゼに関するスクリーニングの場合には、該プラスミドライブラリーを、AP1-200などの宿主大腸菌（E. coli）株中に形質転換する。メチラーゼの発現は、McrA+、McrBC+またはMrr+である大腸菌（E. coli）株内でSOS応答反応を誘導するであろう。AP1-200株は、McrおよびMrr系に関して温度感受性であり、損傷で誘導されうる大腸菌（E. coli）dinD遺伝子座と融合したlac-Z遺伝子を含む。メチラーゼ遺伝子またはエンドヌクレアーゼ遺伝子をコードする組換えプラスミドの検出は、lacZ遺伝子の制限温度での誘導に基づく。メチラーゼ遺伝子をコードする形質転換体は、X-galを含有するLB寒天プレート上で青色コロニーとして検出される（Piekarowiczら, Nucleic Acids Res. 19:1831-1835 (1991)およびPiekarowicaら, J. Bacteriology 173:150-155 (1991)）。同様に、大腸菌（E. coli）ER1992株は、dinD1-Lac Z融合体を含有するが、メチル化に依存する制限系であるMcrA、McrBCおよびMrrを欠いている。この系（「エンドブルー（endoblue）」法と称される）では、エンドヌクレアーゼが宿主細胞DNAを損傷してSOS応答を誘導する場合には、該エンドヌクレアーゼ遺伝子を、その対応（cognate）メチラーゼの不存在下で検出することができる。SOS誘導された細胞は、X-galで補足されたLB寒天プレート上に濃青色のコロニーを形成する（Xuら, Nucleic Acids Res. 22:2399-2403 (1994)）。
【００１２】
直接メチラーゼ選択方法は、種々の障害のため、メチラーゼ（および／またはエンドヌクレアーゼ）クローンを産生しないことがある。例えば、Lunnenら, Gene, 74(1):25-32 (1988)を参照されたい。修飾による保護が未だなされていない宿主内にエンドヌクレアーゼ遺伝子の導入を試みるにあたり、制限−修飾遺伝子をクローニングする場合に1つの考えられる障害がある。メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを、単一のクローンとして一緒に導入する場合には、エンドヌクレアーゼが宿主DNAを切断する機会を得る前に、メチラーゼが宿主DNAを保護的に修飾しなければならない。したがって、場合によっては、まずメチラーゼ、ついでエンドヌクレアーゼというように遺伝子を順次クローニングすることだけが可能かもしれない。
【００１３】
制限−修飾系をクローニングする場合のもう1つの障害は、いくつかの大腸菌（E. coli）株が、シトシンまたはアデニンの修飾と不利に反応することが認められることにある。それらは、メチル化シトシン（RaleighおよびWilson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:9070-9074 (1986)）またはメチル化アデニン（HeitmanおよびModel, J. Bact. 196:3243-3250 (1987); Raleigh, TrimarchiおよびRevel, Genetics, 122:279-296 (1989), Waite-Reesら, J. Bacteriology, 173:5207-5219 (1991)）を含有するDNAを破壊する系を有する。シトシン特異的またはアデニン特異的なメチラーゼ遺伝子を、これらの株中に、それら単独で又はそれらの対応エンドヌクレアーゼ遺伝子と共に容易にクローニングすることはできない。この問題を避けるためには、これらの系が欠損している大腸菌（E. coli）の突然変異株（McrA−およびMcrB−またはMrr−）を使用する必要がある。
【００１４】
もう1つの考えられる問題は、起源生物と大腸菌（E. coli）とで転写装置（例えば、プロモーターおよびリボソーム結合部位）が異なるため、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ遺伝子およびメチラーゼ遺伝子が大腸菌（E. coli）内で発現されない可能性があることである。メチラーゼ選択技術においては、該メチラーゼが、該遺伝子を保持するプラスミドの少なくともいくつかを完全に保護するのに十分な程度で大腸菌（E. coli）内で発現されることが必要である。
【００１５】
精製された制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼ（尤も、これはより低度ではあるが）は、実験室内で遺伝子を特徴づけるための有用な手段であるため、これらの酵素を多量に合成する組換えDNA技術により細菌株を入手することが商業的に要請されている。そのような株は、精製作業を単純化し、商業的に有用な量での製造手段を提供するため、有用であろう。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、DNA配列5’ GTTTAAAC 3’を認識し該認識配列の中央（3番目のT残基と最初のA残基との間）で切断して平滑末端を与える酵素であるPmeI制限エンドヌクレアーゼ（NEB#560）の遺伝子をコードする組換えDNA、および該組換えDNAからこの酵素を製造するための関連方法に関する。本発明はまた、制限エンドヌクレアーゼPmeIを発現する形質転換宿主に関する。本発明に従い製造されたPmeI制限エンドヌクレアーゼは、実質的に純粋であり、通常の技術で製造された制限エンドヌクレアーゼ調製物中で通常見出される混入物を含まない。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明は、PmeI制限エンドヌクレアーゼをコードする組換えDNA、および組換えPmeI酵素の製造法に関する。
【００１８】
シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）からPmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングすることは、著しく困難であることが判明した。メチラーゼ選択方法（米国特許第5,200,333号）が精力的に試みられたが、PmeIメチラーゼ産生クローンは得られなかった。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングした後でさえ、保存されたメチラーゼモチーフは、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接して位置していなかった。PmeIメチラーゼ遺伝子がこのように欠けていたため、対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニングは著しく複雑なものとなった。
【００１９】
PmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするために、高度に精製されたPmeI制限エンドヌクレアーゼタンパク質をシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）細胞から入手して、該エンドヌクレアーゼのN末端のアミノ酸配列を決定することにした。ついで、そのアミノ酸配列を使用して、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）ゲノムDNAからこのDNA領域をPCR増幅するための縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。ついで、PCR増幅された小さなDNA配列を使用して、非縮重逆PCRプライマーを設計し、それを使用して、逆PCR技術によりPmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の出発点に隣接するDNAを増幅した。そのような2個の増幅産物［BssHIIで消化され環化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNA鋳型からの1.4kbの産物、およびBsaWIで消化され環化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNA鋳型からの900bpの産物］を、ベクターpUC19中にクローニングし、配列決定した。該増幅産物に由来するシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）ゲノムの約1.6kbの領域の配列データを用いて、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子を同定した。693bpのオープンリーディングフレームは、精製されたPmeIエンドヌクレアーゼタンパク質のN末端の配列決定から確認したものと符合するN末端アミノ酸配列を有することが認められ、したがって、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子であることを確認した。同定したPmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子に対し直ぐ3’側および5’側のそれぞれ700bpおよび190bpの両DNA配列の6フレームアミノ酸翻訳物においては、明らかな公知メチラーゼモチーフは見出されなかった。可能なPmeIメチラーゼを見出すために、この1.6kbの領域の両側から外のDNA配列データを入手する必要があった。この目的のために、追加的な逆PCR実験を行なった。該エンドヌクレアーゼに対し3’側の追加的な1.57kbのDNA配列および該エンドヌクレアーゼに対し5’側の3.1kbの配列を得たが、明らかな公知メチラーゼモチーフは見出されなかった。いくつかの可能性が存在する。該エンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接するORFの1つは、PmeIメチラーゼをコードしているかもしれないが、そのようにそれが同定されるのを可能にする高度に相同なメチラーゼモチーフを含有していないのかもしれない。該メチラーゼは非常に巨大である可能性があるため、該遺伝子を位置づけるためには、より多くの配列（特に、該エンドヌクレアーゼに対し3’側の配列）が必要となるかもしれない。該メチラーゼは、ゲノムシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNA上で該エンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接していない他の位置に存在する可能性がある。もう1つの可能性は、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAが、PmeIエンドヌクレアーゼに対応するメチラーゼ遺伝子を含有していないことである。
【００２０】
対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子から該宿主を保護するために発現されるPmeIメチラーゼ遺伝子が存在しないため、PmeI制限活性を潜在的に阻止しうる他のメチラーゼに関して研究した。PmeI認識配列の内部の4塩基TTAAを認識するMseIメチラーゼは、PmeI切断を阻止しないことが判明した。PmeI部位を含有する一連のオリゴヌクレオチドを構築して、該認識配列内のアデニンまたはシトシンの1つがメチル化されるようにし、メチル化によりPmeIが阻害されうるか否かを確かめるために、これらのオリゴをPmeI切断に付した。第3アデニン残基でのメチル化はPmeI切断を阻止するが、第1または第2アデニンでのメチル化や、該シトシン残基のC5位でのメチル化は阻止しないことが判明した。N4でのシトシンのメチル化は、試験しなかった。DraIメチラーゼは、PmeI部位5’GTTTAAAC3’の内部の6塩基であるDNA配列5’TTTAAA3’を認識する。DraIメチラーゼは、それらの3つのアデニンの任意の1つをメチル化するため、PmeI制限消化を阻止するか阻止しないかのどちらの可能性も生じてしまう。したがって、DraIメチラーゼにより修飾されたDNAがPmeI制限消化に抵抗性であるか否かを判定する必要があった。この目的には、DraIメチラーゼ産生クローンpDraIRM9.7-G2の部分Sau3AIサブクローンを、単一のPmeI部位と4つのDraI部位とを含有するベクターpNEB193中にクローニングし、DraIメチラーゼ産生クローンをメチラーゼ選択方法により選択した。これらのクローンからのプラスミドを単離したところ、それらはPmeIおよびDraI制限から保護されていることが示された。DraIメチラーゼにより修飾されたDNAはPmeI制限消化から保護されていたため、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子は、DraIメチラーゼにより予め保護された宿主中で発現されることが可能であった。ついでDraIメチラーゼを、pRRS、pAII17などの発現ベクターと和合性のベクターpACYC184中にクローニングした。これは、pDraIRM9.7-G2のSau3AI部分サブクローンをpACYC184中にクローニングし、メチラーゼ選択によりメチラーゼ産生クローンに関して選択することにより行なった。
【００２１】
ついで、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAからの完全な遺伝子を増幅し、それを発現ベクターpRRS中にクローニングすることにより、PmeIエンドヌクレアーゼを発現させた。別の和合性プラスミドpACYC184上に保持されたDraIメチラーゼ遺伝子によりPmeI部位で予め修飾された宿主中に、この構築物を導入した。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子とDraIメチラーゼ遺伝子とを含有する宿主を増殖させ、適当な発現条件で誘導し、該細胞を収穫し、PmeIエンドヌクレアーゼを精製することにより、PmeIエンドヌクレアーゼを製造する。
【００２２】
PmeI制限エンドヌクレアーゼを好ましくクローニングし発現させるための本明細書中に記載の方法は、図1に示されており、以下の工程を含む。
【００２３】
1．シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）を、マグネシウムの添加無しの修飾LB培地を含有するフラスコ内で、攪拌・通気しながら37℃で一晩増殖させる。該細胞を収穫し、溶解し、ゲノムDNAを精製する。
【００２４】
2．New England Biolabs, Inc.（実施例1、工程2を参照されたい）で開発されたタンパク質精製技術の組合せにより、PmeI制限エンドヌクレアーゼを、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）細胞からほぼ均一になるまで精製する。このようにして精製したエンドヌクレアーゼは、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動上でほぼ均一であり、約26キロダルトンの見掛け分子量を有する。
【００２５】
3．Applied BioSystems Division, Perkin-Elmer Corporation（Foster City, California）470A Protein Sequencer（Waite-Reesら, J. Bacteriol. 173:5207-5219 (1991)）を用いて該エンドヌクレアーゼのアミノ末端アミノ酸配列を得、これを使用して、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）ゲノムDNAからPmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点のDNAを増幅するための縮重オリゴヌクレオチドプライマーを直接合成し、後続の研究においてPmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子を同定した。
【００２６】
4．工程3で得たアミノ酸配列に基づく縮重DNAプライマー［アミノ酸残基1〜6の(M)TTNSP（配列番号1）に対応するもの、およびDNAの逆鎖に関するアミノ酸残基10〜14のMIDEC（配列番号2）に対応するもの］を使用して、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部を増幅する。増幅されたDNAの個々のクローンを配列決定する。
【００２７】
5．シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）ゲノムDNAをApol、BsaHI、BsrFI、BstYI、EaeI、HaeII、Sau3AI、NlaIII、EagIおよびBssHIIエンドヌクレアーゼにより消化し、得られた断片を、分子内連結を促進するために低いDNA濃度で連結する。アミノ酸残基Asp-Val-Gly-Met-Ile-Asp（配列番号3）に対応する工程4の縮重プライマーと、Gluをコードするコドンの第1ヌクレオチドGとの間の領域内でアニーリングするように、プライマーPmeI-IP1を設計する（その3’末端は未知領域に配向する）。工程4で得たクローンのDNA配列は、第4および第5残基（AsnおよびSer）の配列において異なるため、プライマーPmeI-IP2が1つのクラスの配列にハイブリダイズしプライマーPmeI-IP3が第2のクラスの配列にハイブリダイズするように、別個の2つのプライマーを作製する。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子のN末端に対応するDNAを含有する環化断片を、プライマーPmeI-IP1およびPmeI-IP2とプライマーPmeI-IP1およびPmeI-1P3とを使用して増幅する。種々のサイズの増幅産物を産生させ、pUC19ベクター中にクローニングする。
【００２８】
6．種々のpUC19構築物を配列決定する。BssHIIで消化され環化されたDNAからの1400bpの増幅断片を含有する1つの構築物pUC19BssHII21だけが、プライマーPmeI-IP1に対し3’側のPmeIエンドヌクレアーゼのN末端アミノ酸配列と符合したDNA配列を含有する。しかしながら、プライマーPmeI-IP3は、おそらく該プライマー配列上のミスマッチにより、他の部位とハイブリダイズする。当然のことながら、PmeI-IP2およびPme-IP3の両プライマーは、第4および第5残基（AsnおよびSer）の配列に対するミスマッチを含有する可能性がある。
【００２９】
7．pUCBssHII21クローンから得た配列に基づいて、新たなプライマーセットを設計する。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子のN末端に対応するDNAを含有する環化断片を、それらの新たなプライマーを用いて増幅する。BsaWIで消化され環化されたDNAは、900bpの産物を与え、これをベクターpUC19中にクローニングする。
【００３０】
8．BsaWIで消化された環状DNAからの900bpの増幅断片を含有する構築物pUC19BsaWI5を配列決定する。N末端アミノ酸配列データと符合し、約26kDのタンパク質を産生するのに妥当なサイズを有するオープンリーディングフレームが存在する。BsaWI産物は、該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し5’側に190bpを含有し、該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し3’側に90bpを含有する。BssHII産物は、該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し3’側に700bpを含有する。該エンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接する配列決定された領域内に、明らかなメチラーゼモチーフは認められない。PmeIメチラーゼ遺伝子を探索するために、以下の節に記載のとおりに、該エンドヌクレアーゼ遺伝子の両側に隣接するDNAを増幅し、クローニングし、配列決定する。
【００３１】
9．PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子に対し5’側のシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを、該エンドヌクレアーゼ遺伝子の5’末端付近とハイブリダイズするプライマーを使用する逆PCR反応で増幅する。制限エンドヌクレアーゼで消化され環化された第5節で調製したシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを、鋳型として使用する。増幅産物をpUC19ベクター中にクローニングする。
【００３２】
10．第9節からの増幅断片を保持する種々のpUC19構築物を配列決定する。BstYIで消化され環化されたDNAは3.3kbの産物を与え、HaeIIで消化され環化されたDNAは0.9kbの産物を与える。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子に対し5’側の配列決定DNAの約3.1kbからの6フレームアミノ酸翻訳物においては、明らかなメチラーゼモチーフを認めることができない。
【００３３】
11．PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子に対し3’側のシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを、2つの連続した逆PCR実験において増幅する。シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを、AatII、Hinp1I、MscI、MseI、Sacl、StulおよびTsp509Iエンドヌクレアーゼで消化し、得られた断片を、分子内連結を促進するために低いDNA濃度で連結する。第1逆PCR実験においては、これらの環状鋳型と第5節からのBsaHIで消化された環状鋳型とを使用する。該プライマーの1つは、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の3’末端の直ぐ外側のDNAとハイブリダイズし、その3’末端は未知領域に配向している。もう一方は、エンドヌクレアーゼ遺伝子内またはその3’末端付近でハイブリダイズし、逆方向に配向している。AatIIで消化され環化されたDNAは1.1kbの産物を与え、MscIで消化された環状DNAは1.4kbの産物を与え、BsaHIで消化された環状DNAは0.7kbの産物を与える。これらの増幅されたDNAをpUC19中にクローニングし、配列決定する。新たに導き出されたDNA配列情報に基づいて、もう2つのプライマーを合成し、第2逆PCR実験で使用する。HaeIIで消化され環化されたDNA（第5節）は、0.7kbの産物を与え、それをpUC19中にクローニングし、配列決定する。このようにして配列決定された該エンドヌクレアーゼ遺伝子の3’末端に対し3’側のDNAの約1.57kbは、明らかなメチラーゼモチーフを含有していない。
【００３４】
12．DraIメチラーゼ産生クローンpDraIRM9.7-G2をSau3AIで部分消化し、得られたDNA断片をpNEB193ベクター中に挿入する。形質転換体を一緒にプールし、プラスミド集団を精製し、DraIエンドヌクレアーゼで消化する。制限されたプラスミドを、再び大腸菌（E. coli）中に形質転換して、未切断クローンを回収する。DraIの消化に抗して生存した9個の形質転換体のプラスミドを精製する。それら9個のプラスミドのうちの8個は、DraIエンドヌクレアーゼ消化およびPmeIエンドヌクレアーゼ消化から保護される。
【００３５】
13．PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の過剰発現：
A．一般的な考慮点
多数の方法により、制限遺伝子を過剰発現させることができる。DNA配列および詳細なマッピング情報は、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の過剰発現のための最善のアプローチを決定する助けとなる。
【００３６】
過剰発現のための1つのアプローチは、全エンドヌクレアーゼ遺伝子の増幅にポリメラーゼ連鎖反応を用いるために、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のN末端および該遺伝子の下流（3’側）のいずれかの部位で直接ハイブリダイズするプライマーを設計することを含む。得られたDNA断片を、pRRSなどの発現ベクター中の誘導プロモーター（lacUV5）の直ぐ下流に挿入することができる。
【００３７】
あるいは、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点の直前にpAGR3（New England Biolabs, Inc.; Beverly, Massachusetts）上のPtacなどの大腸菌（E. coli）に強く認識されるプロモーターを挿入することにより、過剰発現を達成することができる。また、これは、該制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点および末端付近の通常の制限部位とpAGR3のプロモーター付近の和合性制限部位とを見つけ、Ptacプロモーターと調和させて該制限遺伝子をpAGR3中に導入することにより行なうことができる。使用しうる他の調節プロモーターとしては、pUC19およびpBR322誘導体上のPlacUV5（Fuller, Gene 19:43-54 (1982)）およびIPL（ShimatakeおよびRosenberg, Nature 254:128 (1981)）が挙げられる。また、発現を増強するために、強力なリボソーム結合部位（Shine & Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:342-1346 (1974)）を遺伝子の直前に配置することができる。
【００３８】
該制限エンドヌクレアーゼを過剰発現する安定なクローンを得るために、一般には、制限エンドヌクレアーゼの消化から宿主を予め保護する。本発明では、これは、別のプラスミド上でDraIメチラーゼをクローニングすることにより行なう。DraIメチラーゼにより修飾されたDNAがPmeIエンドヌクレアーゼの消化に抵抗性であることを、本出願中で示す。使用するプラスミドは、発現ベクターと和合性でなければならない。また、メチラーゼは、過剰発現される制限エンドヌクレアーゼ遺伝子による消化から宿主ゲノムを保護するレベルで産生されなければならない。
【００３９】
大腸菌（E. coli）内でより効率的に利用されるコドンを使用するために、該遺伝子のDNA配列を、部位特異的突然変異誘発により又は該遺伝子自体の再合成により改変することができる（Ikemura, J. Mol. Biol. 151:389-409 (1981)）。
【００４０】
B．和合性ベクター中へのDraIメチラーゼのクローニング
Sau3AIで部分消化されたpDraIRM9.7-G2 DNA断片（第12節からのもの）を、予めBamHIで切断され脱リン酸化されたベクターpACYC184中に連結する。形質転換体を一緒にプールし、プラスミド集団を精製し、DraIエンドヌクレアーゼで消化する。制限されたプラスミドを、再び大腸菌（E. coli）中に形質転換して、未切断クローンを回収する。ミニプレップに付した14個中12個の形質転換体のプラスミドを、DraIエンドヌクレアーゼの消化から保護する。約3kbの挿入断片を含有するpACYC184DraIM10と称されるそのような1つのクローンを、後続のPmeIエンドヌクレアーゼの発現のために使用する。
【００４１】
C．PmeIエンドヌクレアーゼの発現
PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅するために、DNAプライマーを設計し、合成する。フォワードプライマーは、以下の要素を有する：クローニングを容易にするためのPstI部位、lacZ遺伝子に対しインフレームである停止コドン、大腸菌（E. coli）の強力なコンセンサスリボソーム結合部位、該リボソーム結合部位とPmeIエンドヌクレアーゼのATG開始コドンとの間の7ヌクレオチドのスペーサー配列、およびハイブリダイゼーションのためのPmeIエンドヌクレアーゼDNA配列と符合した24ヌクレオチド。リバースプライマーは、BglII部位と、ハイブリダイゼーションのためのPmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の3’末端に対し84bp 3’側のシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAと符合する21ヌクレオチドとを有する。これらのプライマーを使用して、該エンドヌクレアーゼ遺伝子をゲノムDNAから増幅する。増幅されたDNAをBglIIおよびPstIで切断し、予めPstIおよびBamHIエンドヌクレアーゼで切断されゲル精製された発現ベクターpRRS中に連結する。該連結反応物を、pACYC184DraIM10を含有する大腸菌（E. coli）ER2426コンピテント細胞中に形質転換する。所望のサイズの挿入断片を含有するベクターを、ミニプレップ法により同定する。いくつかのクローンを中期対数期まで増殖させ、0.5mM IPTGで16時間誘導する。ついで該細胞を遠心分離により収穫し、超音波処理緩衝液中に再懸濁し、音波処理により溶解し、該抽出物をPmeIエンドヌクレアーゼ活性に関してアッセイする。pRRSPmeIR1/pACYC184DraIM10と称される、PmeIを発現するそのような1つの宿主を増殖させ、PmeI制限エンドヌクレアーゼの製造に使用する。
【００４２】
14．製造：PmeIエンドヌクレアーゼは、過剰発現されるPmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を保持する宿主細胞から、適当な抗生物質での選択および誘導を伴う豊富な培地中で発酵槽内にて増殖させることにより製造することができる。ついで該細胞を遠心分離により収穫し、音波処理により破壊して、PmeI制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗製細胞抽出物を得る。
【００４３】
15．精製：アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのタンパク質精製技術の組合せにより、PmeIエンドヌクレアーゼを含有する粗製細胞抽出物を精製する。
【００４４】
前記で大まかに説明した工程は、本発明を実施するための好ましい態様を代表するものであるが、前記のアプローチが当該技術分野で公知の技術に従い変更可能であることは当業者には明らかである。
【００４５】
以下の実施例は、実施するのに現在好ましい本発明の実施態様を例示するものである。本実施例は例示的であり、本発明は実施例に限定されるものではなく、添付の請求の範囲に示されるとおりに限定されるにすぎないと理解されるであろう。
【００４６】
前記および後記で引用している参照文献は、参考として本明細書に組入れることとする。
【００４７】
実施例 1
PmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
1．DNAの精製：5gのシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）（NEB#698）細胞ペーストを、20mlの25％ショ糖、0.05M Tris-HCl、1mM EDTA（pH8.0）中に、穏やかに振とうすることにより再懸濁した。5mlの0.5M EDTA（pH8.0）および新たに調製した10mg/mlリゾチーム［0.25M Tris-HCl（pH8.0）中］6mlを加え、該溶液を4℃で2時間インキュベートした。24mlの溶解混合物（1％Triton-X100、50mM Tris、62.5mM EDTA, pH8.0）、ついで5mlの10％SDSを加え、該溶液を4℃で一晩インキュベートした。該溶液を50mlの平衡化フェノールで抽出し、該水相を回収し、50mlのクロロホルムで2回抽出した。該水性溶液を、4回交換する2Lの10mM Tris、1mM EDTA（pH8.0）に対して一晩透析した。ついで、透析された溶液をRNアーゼ（100μg/ml）で37℃で1時間消化した。該DNAを、1/10容量の5M NaClおよび0.55容量の2-プロパノールの添加により沈殿させ、ガラス棒に巻き付けた。該DNAを風乾し、ついで10mlの10mM Tris、1mM EDTA（pH8.0）中に溶解した。
【００４８】
2．シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）（NEB#698）からのPmeI制限エンドヌクレアーゼの精製：マグネシウムの添加無しの修飾LB培地を含有するフラスコ内で、攪拌・通気しながら37℃でシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）細胞を一晩増殖させることにより、PmeI制限酵素を製造することができる。該細胞を遠心分離により収穫した。以下のすべての操作は、氷上または4℃で行なった。196g（湿重量）の細胞ペレットを、50mM NaClを含有する（緩衝液A.05）600mlの緩衝液A（20mM Tris-HCl, 1mMジチオトレイトール(DTT), 0.1mM EDTA, 5%グリセロール, pH7.4）に再懸濁し、ついでフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を最終濃度25μg/mlで加えた。ついで該細胞懸濁液を音波処理により破壊した。該抽出物を12Krpmで90分間遠心分離し、上清を集めた。該ペレットを50mlの緩衝液A.05でリンスし、再び15Krpmで90分間遠心分離した。該上清を合わせ（合計700ml）、緩衝液A.05で平衡化された216mlのQ-セファロースカラム（Pharmacia; Piscataway, NJ）上にローディングした。このカラムを200mlの緩衝液A.05で洗浄し、流出および洗浄によりPmeI活性を溶出した。PmeIを含有する画分を一緒にプールし、緩衝液A.05中で平衡化された216mlのヘパリン-セファロースカラム（Pharmacia; Piscataway, NJ）上にローディングし、600mlの緩衝液A.05で洗浄し、ついで2Lの直線勾配（緩衝液A中の50mM〜800mMのNaCl）を得た。21mlの画分を集めた。PmeI制限活性に関してλDNAで画分をアッセイし、溶出された活性の中間点は約480mMのNaCl濃度であることが判明した。合計12個の画分をプールした。酵素活性の量は750,000単位であると推定された。このヘパリン-セファロースプールを、50mM NaCl（緩衝液B.05）を含有する緩衝液B（20mM KPO4, 6mM 2-メルカプトエタノール, 0.1mM EDTA, 5%グリセロール, pH6.8）中で平衡化された12mlのヒドロキシルアパタイト（HPT）カラム（Calbiochem; LaJolla, CA）に適用し、36mlの緩衝液B.05、ついで120mlの直線勾配（緩衝液B中50mM NaCl〜1M NaCl）で洗浄した。1.2mlの画分を集めた。PmeI活性に関してλDNAで画分をアッセイした。制限酵素活性の中間点は、約500mMのNaClで溶出した。合計13個の画分をプールし、50mM NaCl（緩衝液C.05）を含有する緩衝液C（20mM KPO4, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 5%グリセロール, pH6.8）に対して一晩透析した。透析された溶液を、緩衝液C.05中、ついで50mlの直線勾配（緩衝液C中50mM NaCl〜500mM NaCl）中で平衡化された1mlのpolyCat Aカラム（Custom LC, Inc.; Houston, TX）に適用した。1mlの画分を集め、制限酵素活性に関してλDNAで該画分をアッセイした。PmeI活性は、約270mM NaClで溶出した。3つの画分を一緒にプールし、5容量の緩衝液Aで希釈し、緩衝液A.05で平衡化された1mlのMono Q FPLCカラム（Pharmacia; Piscataway, NJ）上にローディングした。該カラムを2mlの緩衝液A.05で洗浄し、流出および洗浄によりPmeI活性を溶出した。PmeIを含有する画分を一緒にプールし、緩衝液A.05で平衡化された3mlのヘパリン-TSK FPLCカラム（TosoHaas; Philadelphia, PA）上に直接ローディングした。該カラムを2mlの緩衝液A.05、ついで60mlの直線勾配（緩衝液A中50mM NaCl〜500mM NaCl）で洗浄した。1mlの画分を集め、PmeI活性をλDNAでアッセイした。制限酵素活性のピークは、300mM NaClで溶出した。精製されたPmeI制限酵素活性の量は、116,000単位であると推定された。該ピーク画分をSDS-PAGEタンパク質ゲル上にローディングし、電気泳動に付した。該ゲルをクーマシーブルーR-250で染色し、PmeI制限エンドヌクレアーゼ活性に対応する約26kDの顕著なバンドが認められた。
【００４９】
3．アミノ末端PmeIタンパク質の配列決定：前記第2節に記載のとおりに調製したPmeI制限エンドヌクレアーゼを電気泳動に付し、文献記載（Looneyら, Gene 80:193-208 (1989)）のとおりに改変したMatsudaira（Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262:10035-10038 (1987)）の方法に従いエレクトロブロットした。該メンブレンをクーマシーブルーR-250で染色し、約26kDのタンパク質のバンドを切り出し、Applied BioSystems Division, Perkin-Elmer Corporation（Foster City, California）Model 407A気相タンパク質シークエンサー（Waite-Reesら, J Bacteriol. 173:5207-5219 (1991)）上の連続的な分解に付した。27kDのタンパク質の最初の24残基は、(Met)-Thr-Thr-Asn-Ser-Pro-Ser-Asp-Val-Gly-Met-IIe-Asp-Glu-Cys-Leu-Ser-IIe-Val-Xaa-Thr-Xaa-Leu-Ala（配列番号4）に相当した。
【００５０】
4．N末端PmeI DNAの増幅：工程3で得たアミノ酸配列に基づく縮重DNAプライマーを使用して、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部を増幅する。アミノ酸残基1〜6の(M)TTNSP（配列番号1）に対応する以下の2つのプライマーを合成する：PmeI-PS1 5’ GTTGGATCCATGACNACNAAYTCNCC 3’（配列番号5）およびPmeI-PS2 5’ GTTGGATCCATGACNACNAAYAGYCC 3’（配列番号6）。DNAの逆鎖にハイブリダイズさせるために、アミノ酸残基10〜14のMIDECに対応するプライマーPmeI-PS3 5’ GTTCTGCAGRCAYTCRTCDATCAT 3’（配列番号7）を合成する。反応混合物は、30μlの10X Vent（登録商標）反応緩衝液
18μlの4mM dNTP溶液
15μlのプライマーPmeI-PS1
15μlのプライマーPmeI-PS2
3μlのシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNA (約600ng)
219μl dH2O
6μl (12単位)のVent（登録商標） Exo−ポリメラーゼ(NEB#257)
を合わせることにより調製した。
【００５１】
該混合物を94μlの3つのアリコートに分割し、最初のアリコートには6μlのdH2Oを加え、2つ目のアリコートには3μlのdH2Oおよび3μlの100mM MgSO4（5mMの最終Mg++濃度）を加え、最後のアリコートには6μlの100mM MgSO4（8mMの最終Mg++濃度）を加えた。PCR増幅条件は、95℃で2分間の1サイクル、ついで95℃で30秒間、40℃で30秒間および72℃で5秒間の20サイクルである。PCRで増幅されたDNAを3.5％NuSieveアガロースゲル上でサイズ選択し、pUC19中にクローニングする。増幅されたDNAの個々のクローンを配列決定する。PmeI-PS1およびPmeI-PS2の両方を含有するクローンが認められ、第5アミノ酸Serに関するコドン使用頻度は未知のままである。
【００５２】
5．PmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のN末端に隣接するDNAのクローニング：逆PCR増幅のための鋳型調製：3μgのシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを、100μlの1×NE緩衝液#3（50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 100mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.9）中の20単位のApoI制限エンドヌクレアーゼで50℃で1時間消化した。該制限消化混合物を1容量の平衡化フェノール：クロロホルム（50：50, v/v）で抽出し、該水相を回収し、1容量のクロロホルムで2回抽出した。1/10容量の5M NaClおよび1容量の2-プロパノールを加えることにより該DNAを沈殿させ、70％氷冷エタノールで洗浄した。該DNAを50μlの1×TEに再懸濁した。16℃で一晩、2000UのT4 DNAリガーゼを使用して、10μlのこの消化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNA（約0.5μg）を500μlの1×リガーゼ緩衝液中で環化させた。この環化反応の一部を、後続の逆PCR反応のためのDNA鋳型として使用した。BsaHI、BsrFI、BstYI、EaeＩ、HaeII、Sau3AI、NlaIII、EagIおよびBssHIIで消化され環化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを、同様にして調製した。
【００５３】
1つのフォワードまたはコード鎖プライマーPmeI-IP1および2つのリバースまたは非コード鎖プライマーPmeI-IP2およびPmeI-IP3（以下に示す配列を有する）を、工程4で得たDNA配列に基づき合成した。アミノ酸残基8〜13のAsp-Val-Gly-Met-IIe-Asp（配列番号8）に対応するヌクレオチドと残基14のGluをコードするコドンの最初のヌクレオチドGとにハイブリダイズするように、プライマーPmeI-IP1を設計した。また、クローニングを容易にするために、このプライマー内にBamHI制限部位を含めた。残基2のThrをコードするコドンの最後の2つのヌクレオチド、アミノ酸残基3〜7のThr-Asn-Ser-Pro-Ser（配列番号9）に対応するヌクレオチドおよび残基8のAspをコードするコドンの最初のヌクレオチドにハイブリダイズするように、プライマーPmeI-IP2を設計した。また、クローニングを容易にするために、このプライマー内にPstI制限部位を含めた。
プライマーPmeI-IP1
5’ GTTGGATCCGACGTCGGCATGATCGACG-3’（配列番号10）
プライマーPmeI-IP2
5’ GTTCTGCAGCTGAGGGGCTGTTCGTTG-3’（配列番号11）
プライマーPmeI-IP3
5’ GTTCTGCAGCTGAGGGCGAATTCGTTG-3’（配列番号12）
SmaIなどの平滑末端を与える制限酵素により予め切断されているベクター中にPCR断片を直接挿入するのが簡便なことが多い。この場合には、挿入するPCR断片が5’末端にリン酸基を有する必要がある。この目的には、100μlの反応容量中の1mM ATPで補足された1×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（70mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 5mMジチオトレイトール, pH7.6）中の20単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼにより、15μlのDNAプライマーPmeI-IP1（200μM）を37℃で1時間リン酸化した。また、プライマーPmeI-IP2およびPmeI-IP3を、前記のとおり5’末端でリン酸化した。65℃で20分間インキュベートすることにより、T4 DNAポリヌクレオチドキナーゼを熱不活性化した。リン酸化されたプライマーを、2容量の1×TEで最終濃度10μMにまで希釈し、以下のPCR反応で使用した。
【００５４】
消化され環化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを鋳型として使用しリン酸化プライマーPmeI-IP1およびPmeI-IP2を使用して、逆PCR反応を行なった。逆PCR反応においては、個々のDNA鋳型に対して3つの異なるMg++濃度を使用した。反応混合物は、
30μlの10X Vent（登録商標）反応緩衝液
18μlの4mM dNTP溶液
15μlのリン酸化プライマーPmeI-IP1
15μlのリン酸化プライマーPmeI-IP2
36μlの環化DNA鋳型（約25ng）
168μlのdH2O
6μl (12単位)のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼ(NEB#257)
を合わせることにより調製した。
【００５５】
該混合物を94μlの3つのアリコートに分割し、最初のアリコートには6μlのdH2Oを加え、2つ目のアリコートには3μlのdH2Oおよび3μlの100mM MgSO4（5mMの最終Mg++濃度）を加え、最後のアリコートには6μlの100mM MgSO4（8mMの最終Mg++濃度）を加えた。PCR増幅条件は、95℃で2分間の1サイクル、ついで95℃で30秒間、50℃で30秒間および72℃で2.5分間の5サイクル、ついで95℃で30秒間、65℃で30秒間および72℃で2.5分間の20サイクルであった。15μlの該PCR反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分析した。いくつかの非特異的な増幅されたDNAバックグラウンドのうち、以下の産物が認められた：1700bpの断片、および接近して位置する2つのApoIで消化された環状鋳型からの約1500bpの断片、BstYIで消化された環状鋳型からの1500bpの断片、BsaHIで消化された環状鋳型からの900bpの断片および750bpの断片、およびEagIで消化された環状鋳型からの2500bpの断片。これらの増幅産物をゲル精製した。ゲル精製：100μlのPCR反応を1％LMPアガロース中に電気泳動し、バンドを該ゲルから切り出し、65℃で5分間溶融し、40℃に5分間冷却し、40℃で1時間インキュベートすると共に5単位のβ-アガロース（New England Biolabs #392）を加えることにより該アガロースを消化した。ついで、それを1容量の平衡化フェノール：クロロホルム（50：50, v/v）で抽出し、該水相を回収し、1容量のクロロホルムで2回抽出した。1/10容量の5M NaClおよび2容量の2-プロパノールを加えることにより該DNAを沈殿させ、70％エタノールで洗浄し、風乾し、50μlの1×TE緩衝液中に再懸濁した。
【００５６】
また、リン酸化プライマーPmeI-IP1およびPmeI-IP3を使用し、前記と同じ鋳型セットを前記と同様に使用して、逆PCR反応を行なった。15μlの該PCR反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分析した。以下の断片をゲル精製した：ApoIで消化された環状鋳型からの2000bp、1800bpおよび870bpの断片、BstYIで消化された環状鋳型からの1350bpの断片、BsrFIで消化された環状鋳型からの1200bpの断片、BssHIIで消化された環状鋳型からの2100bpおよび1400bpの断片、EagIで消化された環状鋳型からの2500bpの断片、ならびにNlaIIIで消化された環状鋳型からの800bpの断片。
【００５７】
ゲル精製された各増幅DNA産物を、それぞれ以下のとおりにベクターpUC19中に連結した。予めSmaIで切断され仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIP）で脱リン酸化された100ngのpUC19ベクターに5μlのゲル精製DNAを、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液（50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM ATP, 25μg/ml BSA, pH7.5）の最終容量20μl中、400UのT4 DNAリガーゼで連結した。ついで10μlの該連結混合物を大腸菌（E. coli）ER2267株中に形質転換し、100μg/mlアンピシリン、40μg/ml Xgalおよび50μg/ml IPTGを含有するL-ブロスプレート上で個々のコロニーについてプレーティングした。白色コロニーを個々に拾い、100μg/mlアンピシリンを含有する10mlのL-ブロスに接種し、37℃で一晩増殖させた。ミニプレップを行ない、該精製DNAを消化し、それをアガロースゲル電気泳動により分析することにより、所望の構築物のクローンを同定した。
【００５８】
ミニプレップ法：各培養を8000rpmで5分間遠心分離し、上清を棄て、細胞ペレットを1.0mlの25mM Tris、10mM EDTA、50mMグルコース（pH8.0）に再懸濁した。室温で10分後、2mlの0.2M NaOH、1%SDSを各管に加え、該管を振とうして該細胞を溶解し、ついで氷上に配置した。溶液が清澄化したら、1.5mlの3M酢酸ナトリウム（pH4.8）をそれぞれに加え、振とうした。生成した沈殿物を15,000rpm、4℃で10分間遠心沈殿させた。各上清を注ぎ、混合した。室温で10分後、該管を15,000rpmで10分間遠心して、沈殿した核酸をペレット化した。上清を棄て、該ペレットを室温で30分間風乾した。乾燥したら、該ペレットを、100μg/ml RNアーゼを含有する850μlの10mM Tris（pH 8.0）、1mM EDTAに溶解し、37℃で1時間インキュベートして、該RNAを消化した。85μlの5M NaCl、ついで600μlのイソプロパノールを加えることにより、該DNAを沈殿させた。室温で10分間後、該DNAを5分間の遠心分離により遠心沈殿させ、上清を棄て、該ペレットを乾燥し、ついで10mM Tris、1mM EDTA（pH 8.0）（1×TE）の150μlの最終溶液に再溶解した。ついで該プラスミドミニプレップを、種々の制限エンドヌクレアーゼでの消化により分析した。
【００５９】
6．DNA配列決定：ABI 373自動配列決定システムを製造業者の指示に従い使用し、M13/pUCプライマー#1233および#1224（NEB）を使用して、DNA配列決定を行なった。第5節に記載の逆PCR反応からのDNA断片を含有する種々のpUC19構築物のミニプレップDNA調製物を、鋳型として使用した。唯一のクローンが、PmeIエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列（プライマーPmeI-IP1およびPmeI-IP3を使用する逆PCR反応において、BssHIIで消化された環状鋳型から増幅した1400bpの断片）と符合する配列を有していた。このクローンをpUC19BssHII21と称することにした。このクローンの一方の末端のDNA配列は、プライマーPmeI-IP1から3’側のPmeIエンドヌクレアーゼ配列の部分と符合した。しかしながら、もう一方の末端からのDNA配列は、プライマーPmeI-IP3から3’側のPmeIエンドヌクレアーゼ配列の部分とは符合しなかった。プライマーPmeI-IP1は、PmeIゲノムDNA上の所望の位置でハイブリダイズし、プライマーPmeI-IP3は、おそらく該プライマー配列上のミスマッチのため、PmeIゲノムDNA上の他の位置でハイブリダイズする、と結論した。第4および第5残基（AsnおよびSer）に関してコドン配列の相違があったため、これらの残基をコードするDNA配列を排除するように逆PCRプライマーの新たなセットを設計した。
【００６０】
7．該エンドヌクレアーゼ遺伝子のN末端に隣接したDNAを増幅しクローニングするための、新たなプライマーセットを使用する逆PCR増幅：工程6で得たDNA配列に従い、プライマーPmeI-IP4およびPmeI-IP5を設計した。プライマーPmeI-IP4は、アミノ酸残基Val-Gly-Met-IIe-Asp（配列番号13）に対応するヌクレオチドと、Gluのコドンの最初の2つのヌクレオチドとを含んでいた。また、クローニングを容易にするために、このプライマーにはBamHI部位を含めた。
プライマーPmeI-IP4
5’ GTTGGATCCGTCGGCATGATCGACGA-3’（配列番号14）
プライマーPmeI-IP5は、Glyのコドンの最初の2つのヌクレオチドとアミノ酸残基Val-Asp-Ser-Proに対応するヌクレオチドとにハイブリダイズするように設計した。また、クローニングを容易にするために、このプライマーにはBamHI部位を含めた。
プライマーPmeI-IP5
5’ CATGGATCCGACGTCTGAGGG-3’（配列番号15）
BsaWIで消化され環化されたPmeI DNAを鋳型として使用して、逆PCR反応を行なった。該産物の増幅を成功させた反応においては、
10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液
6μlの4mM dNTP溶液
3μlの100mM MgSO4（5mMの最終Mg++濃度）
5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP4
5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP5
12μlの環化DNA鋳型（約25ng）
58μlのdH2O
2μl（4単位）のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼNEB#257
を合わせることにより、反応混合物を調製した。
【００６１】
PCR増幅条件は、95℃で2分間の1サイクル、ついで95℃で30秒間、40℃で1分間および72℃で2.5分間の5サイクル、ついで95℃で30秒間、60℃で1分間および72℃で2.5分間の20サイクルであった。15μlの該PCR反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分析した。
【００６２】
900bpの産物が認められ、それをゲル精製し、50μlの1×TEに再懸濁した。5μlのこのDNAを、1×BamHI緩衝液（150mM NaCl, 10mM Tris-HCl,10mM MgCl2, 1mMジチオトレイトール, pH7.9）の最終容量20μl中、20UのBamHI（NEB#136）で37℃で1時間消化した。該反応混合物を78℃で20分間インキュベートすることにより、制限エンドヌクレアーゼBamHIを熱不活性化した。消化されたDNA 5μlを、予めBamHIで切断されCIPで脱リン酸化されアガロースゲルで精製された100ngのベクターpUC19に、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液の最終容量20μl中、400UのT4 DNAリガーゼを使用して16℃で2時間連結した。10μlの該連結混合物を大腸菌（E. coli）ER2267株中に形質転換し、100μg/mlアンピシリン、40μg/ml Xgalおよび50μg/ml IPTGを含有するL-ブロスプレート上で個々のコロニーについてプレーティングした。白色コロニーを個々に拾い、100μg/mlアンピシリンを含有する10mlのL-ブロスに接種し、37℃で一晩増殖させた。ミニプレップを行ない、該精製DNAを消化し、それをアガロースゲル電気泳動により分析することにより、所望の構築物のクローンを同定した。その900bpの断片を含有するpUC19BsaWI5と称される1つのクローンを配列決定した。
【００６３】
8．クローンpUC19BsaWI5のDNA配列決定：ABI 373自動配列決定システムを製造業者の指示に従い使用し、M13/pUCプライマー#1233および#1224（New England Biolabs, Beverly, MA）ならびに鋳型としてpUC19BsaWI5ミニプレップDNA調製物を使用して、DNA配列決定を行なった。このクローンの一方の末端のDNA配列は、プライマーPmeI-IP4から3’側の及びそれに対応するPmeIエンドヌクレアーゼ配列の部分と符合した。また、もう一方の末端からのDNA配列は、プライマーPmeI-IP5から3’側の及びそれに対応するPmeIエンドヌクレアーゼ配列の部分と符合した。残基4（Asn）および残基5（Ser）のコドン配列は、5’ AAC 3’および5’ TCC 3’であることが判明した。第3節で得たN末端タンパク質の配列データと符合するN末端アミノ酸を有する693bpのオープンリーディングフレームがPmeI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子であると確認した。エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し直ぐ3’側の700bpのDNA配列から翻訳された6フレームのアミノ酸配列を、種々の型の公知メチラーゼの保存アミノ酸モチーフと比較したが、これらのモチーフと相同なアミノ酸配列を同定することはできなかった。同様に、該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し直ぐ5’側に隣接した200bpのDNA配列から翻訳された6フレームのアミノ酸配列からは、明らかなメチラーゼモチーフを見出すことができなかった。可能なPmeIメチラーゼ遺伝子を位置づけるために、該エンドヌクレアーゼ遺伝子の両側から更に離れて位置するDNA領域を、後続の工程において増幅し、クローニングし、配列決定した。
【００６４】
9．PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子に対し5’側のDNAのクローニング：制限エンドヌクレアーゼApoI、EagI、BssHII、BsrF、HaeIIおよびBstYIで消化され環化された第5節からのシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを、逆PCR増幅のための鋳型として使用した。PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の内部およびその5’末端に対してアニーリングするように、以下に示すプライマーPmeI-IP6およびPmeI-IP7を設計した。クローニングを容易にするために、両プライマーはPstI部位を含有する。
プライマーPmeI-IP6
5’-ホスホ-GTTCTGCAGCTCGTTGTCTTCTTCTGC-3’（配列番号16）
プライマーPmeI-IP7
5’-ホスホ-ATCCTGCAGGCGACGTTCGGACGATG-3’（配列番号17）
該産物の増幅を成功させた反応においては、
10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液（最終濃度2mMのMg++を含有）
6μlの4mM dNTP溶液
5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP6
5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP7
12μlの環化DNA鋳型（約25ng）
58μlのdH2O
2μl（4単位）のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼNEB#257
を合わせることにより、反応混合物を調製した。
【００６５】
PCR増幅条件は、95℃で2分間の1サイクル、ついで95℃で20秒間、50℃で1分間および72℃で2.5分間の5サイクル、ついで95℃で30秒間、65℃で1分間および72℃で2.5分間の20サイクルであった。15μlの該PCR反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分析した。
【００６６】
いくつかの非特異的増幅バックグラウンドDNAのうち、1.8kbの産物がApoI環状鋳型PCR反応において認められ、1.6kbの産物がBssHII環状鋳型PCR反応において認められ、3.3kbの産物がBstYI環状鋳型PCR反応において認められ、1.6kbの産物がEagl環状鋳型PCR反応において認められ、0.9kbの産物がHaeII環状鋳型PCR反応において認められた。これらの5つの産物をゲル精製し、60μlの1×TEに再懸濁した（BstYI産物は20μlの1×TEに再懸濁した）。ゲル精製されたApoI産物5μlを、予めSmaIで切断されCIPで脱リン酸化されアガロースゲルで精製された100ngのベクターpUC19に、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液の最終容量20μl中、400UのT4 DNAリガーゼを使用して16℃で2時間連結した。ゲル精製されたBssHII、EagI、HaeIIおよびBstYI産物を、前記のとおり、同様にしてpUC19中に連結した。10μlの各連結混合物を大腸菌（E. coli）ER2267株中に形質転換し、100μg/mlアンピシリン、40μg/ml Xgalおよび50μg/ml IPTGを含有するL-ブロスプレート上で個々のコロニーについてプレーティングした。白色コロニーを個々に拾い、100μg/mlアンピシリンを含有する10mlのL-ブロスに接種し、37℃で一晩増殖させた。ミニプレップを行ない、該精製DNAを消化し、それをアガロースゲル電気泳動により分析することにより、所望の構築物のクローンを同定した。
【００６７】
10．該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し5’側のDNAの配列決定：ABI 373自動配列決定システムを製造業者の指示に従い使用し、M13/pUCプライマー#1233および#1224（NEB）を使用して、第9節からの所望の挿入断片を有する構築物を配列決定した。該構築物のミニプレップDNA調製物を、鋳型として使用した。BstYIで環化された鋳型からの3.3kbの増幅産物とHaeIIで環化された鋳型からの0.9kbの増幅産物との末端は、両方の逆PCRプライマーPmeI-IP6およびPmeI-IP7に対し3’側の公知DNA領域と符合した。プライマーウォーキングおよび配列決定により、完全な配列を得た。その3.3kbの産物は2.9kbの新たなDNA配列を含有し、その0.9kbの産物は200bpの新たなDNA配列を含有していた。その新たなDNA配列内には、明らかなメチラーゼモチーフは認められなかった。
【００６８】
11．該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し3’側のDNAの増幅およびクローニング：該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し3’側のDNA情報を得るために、2つの連続した逆PCR増幅実験を行なった。
【００６９】
A．逆PCR増幅#1：逆PCR増幅のための鋳型の調製：3μgのゲノムシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを、100μlの反応容量の1×NE緩衝液#4（20mM Tris-酢酸, 10mM酢酸マグネシウム, 50mM酢酸カリウム, 1mM DTT, pH 7.9）中の100UのAatII制限エンドヌクレアーゼで37℃で1時間消化した。該制限消化混合物を1容量の平衡化フェノール：クロロホルム（50：50, v/v）で抽出し、該水相を回収し、1容量のクロロホルムで2回抽出した。1/10容量の5M NaClおよび1容量の2-プロパノールを加えることにより該DNAを沈殿させ、ついで70％氷冷エタノールで洗浄した。該DNAを50μlの1×TEに再懸濁した。2000UのT4 DNAリガーゼを使用して、この消化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNA 10μl（約0.5μg）を500μlの1×リガーゼ緩衝液中で16℃で一晩環化した。環化されHinp1I、MscI、MseI、SacI、StuIおよびTsp509Iで消化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAを、同様にして調製した。これらの環化DNAと、BsaHIで消化され環化された第5節からのDNAとを、後続の逆PCR反応の鋳型として使用した。
【００７０】
以下に示す配列のプライマーPmeI-IP8およびPmeI-IP9を使用して、該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し3’側のDNAを増幅した。クローニングを容易にするために、両プライマーはPstI部位を含有している。
プライマーPmeI-IP8
5’-pGGTCTGCAGTCGGGCAGAACGTGATATTCGA-3’（配列番号18）
プライマーPmeI-IP9
5’-pGTTCTGCAGGCCATTTGGCACCCTG-3’（配列番号19）
該産物の増幅を成功させた反応においては、
10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液（最終濃度2mMのMg++を含有）
6μlの4mM dNTP溶液
5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP8
5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP9
12μlの環化DNA鋳型（約25ng）
58μlのdH2O
2μl（4単位）のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼNEB#257
を合わせることにより、反応混合物を調製した。
【００７１】
PCR増幅条件は、95℃で2分間の1サイクル、ついで95℃で20秒間、52℃で30秒間および72℃で2.5分間の5サイクル、ついで95℃で30秒間、65℃で30秒間および72℃で2.5分間の20サイクルであった。15μlの該PCR反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分析した。
【００７２】
いくつかの非特異的増幅バックグラウンドDNAのうち、1.1kbの産物がAatII環状鋳型PCR反応において認められ、1.4kbの産物がMscI環状鋳型PCR反応において認められ、0.7kbの産物がBsaHI環状鋳型PCR反応において認められた。これらの産物をゲル精製し、20μlの1×TEに再懸濁した。ゲル精製されたAatII産物2μlを、予めSmaIで切断されCIPで脱リン酸化されアガロースゲルで精製された100ngのベクターpUC19に、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液の最終容量20μl中、400UのT4 DNAリガーゼを使用して16℃で2時間連結した。ゲル精製されたMscIおよびBsaHI産物を、前記のとおり、同様にしてpUC19中に連結した。10μlの各連結混合物を大腸菌（E. coli）ER2267株中に形質転換し、100μg/mlアンピシリン、40μg/ml Xgalおよび50μg/ml IPTGを含有するL-ブロスプレート上で個々のコロニーについてプレーティングした。白色コロニーを個々に拾い、100μg/mlアンピシリンを含有する10mlのL-ブロスに接種し、攪拌・通気しながら37℃で一晩増殖させた。ミニプレップを行ない、該精製DNAを消化し、それをアガロースゲル電気泳動により分析することにより、所望の構築物のクローンを同定した。M13/pUCプライマー#1233および#1224（NEB）を使用して、これらのクローン中の増幅産物を配列決定した。この領域に対し3’側の更なるDNA配列情報を得るための後続の逆PCR増幅で使用する以下に示すプライマーPmeI-IP10およびプライマーPmeI-IP11を設計するために、これらの新たに得られたDNA配列を使用した。
PmeI-IP10
5’-ホスホ-GTTCTGCAGCCGTTTCGATGGGCCTTCTC-3’（配列番号20）
PmeI-IP11
5’-ホスホ-GTTCTGCAGAATGAGCTGCGCCAGTTG-3’（配列番号21）
B．逆PCR増幅#2：HaeIIで消化され環化されたシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNA（第5節）を、プライマーPmeI-IP10およびプライマーPmeI-IP11を用いる逆PCR増幅において鋳型として使用した。該産物の増幅を成功させた反応においては、
10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液（最終濃度2mMのMg++を含有）
6μlの4mM dNTP溶液
5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP10
5μlのリン酸化プライマーPmeI-IP11
12μlの環化DNA鋳型（約25ng）
58μlのdH2O
2μl（4単位）のVent（登録商標）Exo−ポリメラーゼNEB#257
を合わせることにより、反応混合物を調製した。
【００７３】
PCR増幅条件は、95℃で2分間の1サイクル、ついで95℃で20秒間、60℃で30秒間および72℃で2.5分間の5サイクル、ついで95℃で30秒間、65℃で30秒間および72℃で2.5分間の20サイクルであった。15μlの該PCR反応を、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により分析した。0.7kbの増幅産物を得、これを、予めSmaIで切断されCIPで脱リン酸化されアガロースゲルで精製されたpUC19ベクター中にクローニングした。所望の挿入断片を保持するプラスミドクローンを同定するために、ミニプレップを行なった。M13/pUCプライマー#1233および#1224（NEB）を使用して、その0.7kbの産物を配列決定した。該エンドヌクレアーゼ遺伝子に対し3’側に、約1.57kbのDNA配列が得られ、このDNAの6フレームアミノ酸翻訳物からは、明らかなメチラーゼモチーフを見出すことはできなかった。
【００７４】
12．DraIメチラーゼで修飾されたDNAがPmeI制限消化から保護されうるか否かを確認するための、ベクターpNEB193中でのDraIメチラーゼの発現：ベクターpBR322（Jack Benner, New England Biolabs, Inc）中の5.5kbの挿入断片上にDraIメチラーゼ遺伝子を含有するDraIメチラーゼ産生クローン（pDraIRM9.7-G2）を、以下のとおりにSau3AIで部分消化した。7μgのpDraIRM9.7-G2 DNAを、350μlの1×Sau3AI緩衝液（100mM NaCl, 10mMビスTrisプロパン-HCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, pH 7.0）中に希釈した。この混合物を使用して、Sau3AI制限エンドヌクレアーゼの系列希釈（50μlの最終容量中、それぞれ2倍希釈で1単位/μgDNAから1/64単位/μgDNAまで）を調製した。これらの反応を37℃で15分間インキュベートし、ついでSau3AI制限エンドヌクレアーゼを68℃で20分間熱不活性化した。DNA 1μg当たり1/8単位のSau3AIの消化から得た消化DNA 0.5μgを使用して、予めBamHIで切断されCIPで脱リン酸化された200μgのpNEB193ベクターに、800UのT4 DNAリガーゼを含有する40μlの1×T4 DNAリガーゼ緩衝液中、16℃で16時間連結した。該連結混合物を200μlの大腸菌（E. coli）ER2426株コンピテント細胞中に形質転換し、100μg/mlアンピシリンを含有するL-ブロスプレート上でプレーティングした。約10,000個のコロニーを得、これらを6mlの10mM Tris、10mM MgCl2（pH7.5）中に掻き取った。このプール2mlを、100μg/mlアンピシリンを含有する100mlのL-ブロス中に接種し、振とうしながら37℃で8時間増殖させた。前記第5節に記載のミニプレップ法を10倍スケールアップすることにより、プラスミドを単離した。該ミニプレップDNAを500μlの1×TEに再懸濁し、2μlを、50μlの1×NE緩衝液4中、40単位のDraIで37℃で2時間消化した。10μlの該消化混合物を、50μlの大腸菌（E. coli）ER2426株コンピテント細胞中に形質転換し、100μg/mlアンピシリンを含有するL-ブロスプレート上でプレーティングした。9個の形質転換体からのプラスミドを、ミニプレップ法により単離し、DraI制限エンドヌクレアーゼで消化した。8個のクローンは、DraI消化から完全に保護された。ついで、これらをPmeI制限エンドヌクレアーゼで消化したところ、それらはPmeI制限消化からも完全に保護されていた。
【００７５】
13．PmeIエンドヌクレアーゼの過剰発現：
A．和合性ベクター上でのDraIメチラーゼのクローニング：pACYC184のBamHI部位中にDraIメチラーゼ遺伝子を挿入することにより、DraIメチラーゼ遺伝子を発現させた。これを行なうために、Sau3AIで部分消化された第12節で調製したpDraIRM9.7-G2 DNAの0.5μgを、予めBamHIで切断され脱リン酸化されたベクターpACYAC184中に、800UのT4 DNAリガーゼを含有する40μlの1×T4 DNAリガーゼ緩衝液中、16℃で2時間連結した。該連結混合物を200μlの大腸菌（E. coli）ER2426株コンピテント細胞中に形質転換し、25μg/mlクロラムフェニコールを含有するL-ブロスプレート上でプレーティングした。約1,600個のコロニーを得、これらを4mlの10mM Tris、10mM MgCl2（pH7.5）中に掻き取った。このプール1mlを、25μ/mlクロラムフェニコールを含有する75mlのL-ブロス中に接種し、振とうしながら37℃で8時間増殖させた。前記第5節に記載のミニプレップ法を10倍スケールアップすることにより、プラスミドを単離した。該ミニプレップDNAを500μlの1×TEに再懸濁し、14,000rpmで5分間遠心分離した。336μlの該清澄化上清を、64μlの5M NaClおよび400μlの13％PEG8000と混合し、氷上で1時間インキュベートした。該DNAを14,000rpm、4℃で5分間遠心沈殿させ、氷冷70％エタノールで洗浄し、風乾した。該DNAペレットを500μlの1×TEに再懸濁し、その5μlを、50μlの1×NE緩衝液4中、60単位のDraIで37℃で1時間消化した。DraIで消化されたこのDNA 5μlを、50μlのER2426コンピテント細胞中に形質転換し、25μg/mlクロラムフェニコールを含有するL-ブロスプレート上でプレーティングして、個々の形質転換体を得た。14個の形質転換体からのプラスミドを、ミニプレップ法により単離し、DraI制限エンドヌクレアーゼで消化した。これらのうちの12個のクローンは、DraI消化から完全に保護されていた。さらなる制限分析は、pACYC184DraIM10およびpACYC184DraIM13の2つのクローンが同一であり、約3kbの最小の挿入断片を含有していることを示した。クローンpACYC184DraIM10を、PmeIエンドヌクレアーゼの発現のために使用した。
【００７６】
B．エンドヌクレアーゼのクローニング：発現ベクターpRRS中の強力な誘導プロモーター（PlacUV5）および強力に認識されるリボソーム結合部位の直ぐ下流に該制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を挿入することにより、該遺伝子を発現させた。これを行なうために、DNA配列データを利用して、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを作製した。該フォワードオリゴヌクレオチドプライマーは、クローニングを容易にするためのPstI部位、lacZタンパク質の翻訳を停止するためのlacZ遺伝子に対してインフレームである停止コドン、強力に認識されるリボソーム結合部位、rbsとPmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子のATG開始コドンとの間の7ヌクレオチドのスペーサー、およびハイブリダイゼーションのためのシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAと相補的な24ヌクレオチドを含有していた。
プライマーPmeIRexp1：
5’-GAGACTGCAGGAGGTAATTCATATGACCACAAACTCCCCCTCAGAC-3’（配列番号22）
該リバースプライマーは、PmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子の3’末端に対し84bp 3’側のシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）DNAとハイブリダイズするように設計した。それは、クローニングを容易にするためのBglII部位およびSalI制限部位と、ハイブリダイゼーションのためのシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）と相補的な21ヌクレオチドとを含有していた。
プライマーPmeIRexp2：
5’-CAAGAGATCTAGTCGACCGGTGTTAGCAACCCGATAC-3’（配列番号23）
これらの2つのプライマーを使用して、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）ゲノムDNAからPmeIエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅した。これは、
10μlの10×Vent（登録商標）反応緩衝液
6μlの4mM dNTP
2μl（400ng）のシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）ゲノムDNA
5μl（10μMストック）のプライマーPmeIRexp1
5μl（10μMストック）のプライマーPmeIRexp2
4μlの100mM MgSO4
66μlのdH2O
0.6μl（1.2単位）のVent（登録商標）ポリメラーゼ（2単位/μlのストック）を合わせ、95℃で3分間の1サイクル、ついで95℃で30秒間、60℃で20秒間、72℃で50秒間の4サイクル、ついで95℃で30秒間、65℃で20秒間および72℃で50秒間の20サイクルで増幅することにより行なった。約850bpの増幅産物をゲル精製し、BglIIおよびPstIで切断し、フェノール-クロロホルム抽出し、沈殿させ、TEに再懸濁し、予めPstIおよびBamHIで切断されゲル精製されたpRRSベクター中に連結した。該連結反応物を、DraIメチラーゼ遺伝子構築物pACYC184DraIM10を保持する大腸菌（E. coli）ER2426株中に形質転換し、個々の形質転換体について25μg/mlクロラムフェニコールおよび100μg/mlアンピシリンを含有するL-ブロスプレート上でプレーティングした。7個の形質転換体を、25μg/mlクロラムフェニコールおよび100μg/mlアンピシリンを含有する10mlのL-ブロス中に接種し、振とうしながら37℃で中期対数期まで増殖させ、0.5mM IPTGで16時間誘導した。該細胞ペレットを5000rpm、4℃で5分間遠心沈殿させ、1.5mlの20mM Tris、0.1mM EDTA、1mM DTT、50mM NaCl（pH7.5）に再懸濁し、超音波処理した。該抽出物を使用して、50μlの1×NE緩衝液#2（10mM Tris, 10mM MgCl2, 50mM NaCl, 1mM DTT, pH7.9）中、37℃で30分間、λDNAを消化した。すべてのクローンがPmeIエンドヌクレアーゼ活性を発現した。PmeIエンドヌクレアーゼを産生させるためにpRRSPmeIR1/pACYC184DraIM10と称されるこれらのクローンの1つを選択し、これに、NEB#1081なる株名を与えた。NEB#1081の粗製抽出物から得られたPmeI制限エンドヌクレアーゼ活性の力価を、図1に示す。酵素力価は、細胞1g当たり約1×107単位であった。
【００７７】
14．PmeI制限エンドヌクレアーゼは、NEB#1081から製造することができ、これは、アンピシリン（100μg/ml）およびクロラムフェニコール（25μg/ml）を含むL-ブロス培地を含有する発酵槽内で中期対数期まで増殖させることにより行なうことができる。IPTGを最終濃度0.3mMまで加えることにより該培養を誘導し、増殖を16時間継続する。該細胞を遠心分離により収穫し、−70℃で保存するか又は直ちに使用することができる。
【００７８】
15．NEB#1081からのPmeI制限エンドヌクレアーゼの精製は、前記工程2で大まかに説明したとおり、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの標準的なタンパク質精製技術の組合せにより行なうことができる。この精製から得られたPmeI制限エンドヌクレアーゼは、実質的に純粋であり、非特異的エンドヌクレアーゼもエキソヌクレアーゼ混入物も含んでいない。
【００７９】
pRRSPmeIR1およびpACYC184DraIM10の両方を含有する大腸菌（NEB#1081）のサンプルは、ブダペスト条約の条項および条件に基づきAmerican Type Culture Collectionに1997年11月25日に寄託され、ATCC受託第98596号で受領されている。配列表
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
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【化８】
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【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 pRRS由来プラスミドpRRSPmeIR1上のPmeIエンドヌクレアーゼとpACYC184由来プラスミドpACYC184DraIM10上のDraIメチラーゼとを保持する大腸菌（E. coli）ER2426株の細胞抽出物中のPmeI制限エンドヌクレアーゼ活性を示すアガロースゲルの写真。0.5gの細胞ペーストを、1.5mlの超音波処理緩衝液（20mM Tris-HCl, 1mMジチオトレイトール, 0.1mM EDTA, pH7.5）に懸濁し、超音波処理により破壊し、遠心分離により清澄化した。該抽出物を使用して、100μg/ml BSAで補足された1×NE緩衝液4中の50μlの反応容量当たり1μgのλDNAを消化し、37℃で1時間インキュベートした。レーン1および10：HindIII-λ＋HaeIII-φX174サイズ基準；レーン2：0.01μlの粗製抽出物；レーン3：5×10− 3μlの粗製抽出物；レーン4：2.5×10− 3μlの粗製抽出物；レーン5：1.25×10− 3μlの粗製抽出物；レーン6：6.25×10− 4μlの粗製抽出物；レーン7：3.13×10− 4μlの粗製抽出物；レーン8：1.56×10− 4μlの粗製抽出物；レーン9：7.81×10− 5μlの粗製抽出物。全PmeI活性は、細胞ペースト1g当たり約1×107単位に相当する。
Claims (4)
- PmeI制限エンドヌクレアーゼをコードする単離されたDNAであって、当該DNAはシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）から入手可能であり、当該DNAにコードされたPmeI制限エンドヌクレアーゼはSDS-PAGEで26kDaの見掛け分子量を有し、アミノ末端に配列番号４の配列を有し、DNA配列5'-GTTTAAAC-3'を認識することを特徴とする単離されたDNAであって、ATCC受託第98596号中のpRRSPmeIR1ベクターから入手可能なDNA。
- 請求項１の単離されたDNAが挿入されている組換えDNAベクター。
- 請求項２に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
- PmeI制限エンドヌクレアーゼの製造法であって、請求項２に記載のベクターで形質転換された宿主細胞を該エンドヌクレアーゼの発現に適した条件下で培養することを含んでなる製造法。
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