DE69533434T2

DE69533434T2 - Für die FseI Restriktionsendonuklease kodierende, isolierte DNA und Verfahren zu ihren Herstellung

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Publication number: DE69533434T2
Application number: DE69533434T
Authority: DE
Inventors: Richard D. Middleton Morgan
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1994-10-18
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2015-10-13
Also published as: JP3939375B2; DE69533434D1; EP0712933A2; EP0712933A3; EP0712933B1; US5543308A; JPH08224088A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die FseI Restriktionsendonuclease und Modifikationsmethylase kodiert, sowie die Herstellung dieser Enzyme von der rekombinanten DNA.
Restriktionsendonucleasen sind eine Klasse von Enzymen, die natürlich in Bakterien vorkommen. Wenn sie von anderen kontaminierenden Bakterienkomponenten weggereinigt werden, können Restriktionsendonucleasen im Labor zum Zerschneiden von DNA-Molekülen in präzise Fragmente verwendet werden. Durch diese Eigenschaft können DNA-Moleküle eindeutig identifiziert und in ihre Genbestandteile fraktioniert werden. Restriktionsendonucleasen haben sich als unverzichtbare Werkzeuge in der modernen Genforschung erwiesen. Sie sind die biochemischen "Scheren" zur Umsetzung von Gentechnik und -analyse.
Restriktionsendonucleasen agieren, indem sie spezielle Sequenzen von Nucleotiden (die "Erkennungssequenz") entlang dem DNA-Molekül erkennen und sich an sie binden. Nach dem Anbinden spalten sie das Molekül innerhalb oder an einer Seite der Erkennungssequenz. Unterschiedliche Restriktionsendonucleasen haben Affinität zu unterschiedlichen Erkennungssequenzen. Mehr als einhundert verschiedene Restriktionsendonuclasen wurden unter den vielen Hunderten Bakterienspezies identifiziert, die bisher untersucht wurden.
Bakterien besitzen gewöhnlich nur eine geringe Anzahl von Restriktionsendonucleasen pro Spezies. Die Endonucleasen werden typischerweise entsprechend den Bakterien benannt, von denen sie abstammen. Die Spezies Neisseria lactamica synthetisiert beispielsweise vier verschiedene Restriktionsendonucleasen mit dem Namen NlaI, NlaII, NlaIII und NlaIV. Diese Enzyme erkennen und spalten jeweils die Sequenzen GGCC, GATC, CATG und GGNNCC. Escherichia coli RY13 synthetisiert hingegen nur ein Enzym, nämlich EcoRI, das die Sequenz GAATTC erkennt.
Ohne uns durch die Theorie binden zu wollen, wird davon ausgegangen, dass Restriktionsendonucleasen in der Natur eine schützende Rolle zum Wohle der Bakterienzelle spielen. Sie machen Bakterien widerstandsfähig gegen Infektionen durch Fremd-DNA-Moleküle wie Viren und Plasmide, die sie ansonsten zerstören oder befallen würden. Sie verleihen Widerstandsfähigkeit, indem sie die Länge des infizierenden DNA-Moleküls abtasten und immer dann spalten, wenn die Erkennungssequenz auftritt. Durch die stattfindende Spaltung werden viele der infizierenden Gene deaktiviert, und die DNA wird für einen weiteren Abbau durch unspezifische Nucleasen empfänglich gemacht.
Eine zweite Komponente von bakteriellen Schutzsystemen sind Modifikationsmethylasen. Diese Enzyme sind komplementär zu Restriktionsendonucleasen und liefern das Mittel, das Bakterien dazu befähigt, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen erkennen und binden sich an die gleiche Nucleotiderkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuclease, anstatt aber die DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch das ein oder andere Nucleotid innerhalb der Sequenz durch Hinzufügen einer Methylgruppe. Im Anschluss an die Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht mehr gebunden oder gespalten durch die Restriktionsendonuclease. Die DNA einer Bakterienzelle wird aufgrund der Aktivität ihrer Modifikationsmethylase völlig modifiziert und ist daher gegenüber der Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuclease unempfindlich. Lediglich unmodifizierte und daher identifizierbare Fremd-DNA reagiert auf eine Erkennung und Spaltung durch Restriktionsendonuclease empfindlich.
Seit dem Beginn der Gentechnologie ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Proteine, die sie kodieren, in größeren Mengen zu produzieren, als es mit konventionellen Reinigungstechniken möglich ist. Die Standardmethode zur Isolierung von interessanten Klonen (Restriktionsendonucleasegene) ist die Entwicklung eines einfachen und zuverlässigen Verfahrens zur Identifizierung solcher Klone innerhalb komplexer "Bibliotheken", d. h. Populationen von Klonen, die durch "Shotgun"-Verfahren hergeleitet werden, wenn sie in geringen Frequenzen von 10^–3 bis 10^–4 auftreten. Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so dass die unerwünschte Mehrheit von Klonen zerstört wird, während die erwünschten seltenen Klone überleben.
Restriktionsmodifikationssysteme des Typs II werden immer öfter kloniert. Die ersten klonierten Systeme nutzten eine Bakteriophage-Infektion als Mittel zur Identifizierung oder Selektierung von Restriktionsendonucleaseklonen (EcoRII: Kosykh et al., Molec. Gen. Genet. 178: 717–719, (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3: 97–112, (1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78: 1503–1507, (1981)). Da die Anwesenheit von Restriktionsmodifikationssystemen in Bakterien diese befähigen, Infektionen durch Bakteriophagen standhalten zu können, können Zellen, die klonierte Restriktionsmodifikationsgene beinhalten, prinzipiell als Überlebende von Bibliotheken selektiv isoliert werden, die dem Phage ausgesetzt wurden. Man hat jedoch festgestellt, dass dieses Verfahren nur von begrenztem Nutzen ist. Im Speziellen wurde gefunden, dass klonierte Restriktionsmodifikationsgene nicht immer ausreichend Phagenwiderstand aufweisen, um selektives Überleben zu gewähren.
Ein weiterer Klonierungsansatz schließt das Übertragen von anfänglich als plasmidbürtig gekennzeichneten Systemen in E. coli Klonierungsplasmide ein (EcoRV: Bougueleret et al., Nucl. Acid. Res. 12: 3659–3676 (1984); PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402–406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19: 355–359 (1982); PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164: 501–509 (1985)).
Ein dritter Ansatz, der zum Klonieren einer zunehmenden Zahl von Systemen angewendet wird, schließt die Selektion eines aktiven Methylasegens ein (siehe z. B. US-Patent Nr. 5,200,333 und BsuRI: Kiss et al., Nucl. Acid. Res. 13: 6403–6421 (1985)). Da Restriktions- und Modifikationsgene oft eng miteinander verknüpft sind, können beide Gene oft simultan kloniert werden. Diese Selektion bringt jedoch nicht immer ein komplettes Restriktionssystem hervor, sondern stattdessen nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10: 219–225 (1980); BcnI: Janulaitis et al., Gene 20: 197–204 (1982); BsuRI: Kiss und Baldauf, Gene 21: 111–119 (1983); und MspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258: 1235–1241 (1983)).
Ein weiteres Verfahren zur Klonierung von Methylase- und Endonucleasegenen beruht auf einem kolorimetrischen Assay hinsichtlich DNA-Schäden. Beim Screenen nach einer Methylase wird die Plasmidbibliothek in einen E. coli-Wirtsstamm wie AP1-200 transformiert. Durch die Expression einer Methylase wird die SOS-Reaktion in einem E. coli-Stamm ausgelöst, der McrA+, McrBC+ oder Mrr+ ist. Der AP1-200 Stamm ist temperaturempfindlich im Hinblick auf die Mcr und Mrr Systeme und beinhaltet ein lac-Z Gen, das mit dem schadeninduzierbaren dinD Locus von E. coli fusioniert ist. Der Nachweis rekombinanter Plasmide, die ein Methylase- oder Endonucleasegen kodieren, basiert auf einer Induktion bei der restriktiven Temperatur des lacZ Gens. Methylasegene kodierende Transformanten werden auf X-Gal-haltigen LB-Agarplatten als blaue Kolonien nachgewiesen. (Piekarowicz, et. al., Nucleic Acids Res. 19: 1831–1835, (1991) und Piekarowicz, et al., J. Bacteriology 173: 150–155 (1991)). Der E. coli Stamm ER1992 enthält ebenfalls eine dinDl-LacZ Fusion, ihm fehlen jedoch die methylierungsabhängigen Restriktionssysteme McrA, McrB und Mrr. In diesem System (mit der Bezeichnung „Endo-Blue"-Verfahren) kann das Endonucleasegen in Abwesenheit seiner zugehörigen Methylase nachgewiesen werden, wenn die Endonuclease die Wirtszell-DNA beschädigt und die SOS-Reaktion auslöst. Die SOS-induzierten Zellen bilden tiefblaue Kolonien auf LB-Agarplatten, die mit X-Gal angereichert sind. (Xu et al., Nucleic Acids Res. 22: 2399–2403 (1994)).
Gelegentlich kann mit dem direkten Methylaseselektionsverfahren aufgrund verschiedener Hindernisse kein Methylase-(und/oder Endonuclease)-Klon hervorgebracht werden (siehe z. B. Lunnen, et al., Gene, 74(1): 25–32 (1988)). Ein Hindernis für die Klonierung von Restriktions-Modifikationsgenen besteht möglicherweise darin, dass versucht wird, das Endonucleasegen in einen Wirt einzubringen, der noch nicht durch Modifikation geschützt wurde. Wenn das Methylasegen und das Endonucleasegen zusammen als ein einzelner Klon eingeführt werden, dann muss die Methylase die Wirts-DNA schützend modifizieren, bevor die Endonuclease die Gelegenheit erhält, sie zu spalten. Gelegentlich können die Gene daher nur sequentiell kloniert werden, zuerst die Methylase und dann die Endonuclease.
Ein weiteres Hindernis für das Klonieren von Restriktions-Modifikationssystemen liegt in der Entdeckung, dass einige Stämme von E. coli auf eine Cytosin- oder Adenin-Modifikation ungünstig reagieren; sie besitzen Systeme, die DNA zerstören, die methyliertes Cytosin (Raleigh und Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83: 9070–9074, (1986)) oder methyliertes Adenin enthält (Heitman und Model, J. Bact. 196: 3243–3250, (1987); Raleigh, Trimarchi und Revel, Genetics, 122: 279–296, (1989) Waite-Rees, et al., J. Bacteriology, 173: 5207–5219 (1991)). Cytosin-spezifische oder Adenin-spezifische Methylasegene können nicht ohne weiteres in diese Stämme kloniert werden, weder allein noch zusammen mit ihren entsprechenden Endonucleasegenen. Um dieses Problem zu umgehen, müssen Mutantenstämme von E. coli (McrA^– und McrB^– oder Mrr^–) verwendet werden, in denen diese Systeme defekt sind.
Ein dritte Schwierigkeit besteht möglicherweise darin, dass einige Restriktionsendonuclease- und -methylasegene aufgrund von Differenzen im Transkriptionsmechanismus des Quellorganismus und E. coli nicht in E. coli exprimieren können, wie z. B. Differenzen in Promotor- und Ribosomenbindungsstellen. Die Methylaseselektionstechnik setzt voraus, dass die Methylase in E. coli ausreichend exprimiert, um wenigstens einige der das Gen tragenden Plasmide vollständig zu schützen.
Da gereinigte Restriktionsendonucleasen und, in geringerem Maße, Modifikationsmethylasen nützliche Werkzeuge zum Charakterisieren und Umordnen von DNA im Labor sind, gibt es einen kommerziellen Anreiz, Stämme von Bakterien durch DNA-Rekombinationstechniken zu gewinnen, die diese Enzyme im Überfluss synthetisieren. Solche Stämme wären von Nutzen, da sie die Aufgabe der Reinigung vereinfachen und außerdem das Mittel zur Herstellung kommerziell nützlicher Mengen bereitstellen würden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die Gene für die FseI Restriktionsendonuclease und Modifikationsmethylase kodiert, erhältlich von Frankia species (NRRL 18528), sowie verwandte Verfahren zur Herstellung dieser Enzyme von der rekombinanten DNA. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem einen transformierten Wirt, der die Restriktionsendonuclease FseI exprimiert, ein Enzym, das die DNA-Sequenz 5'-GGCCGGCC-3' erkennt und in der Erkennungssequenz zwischen dem zweiten -GC-Paar spaltet und einen 4 Basen 3' Überhang hinterlässt (FseI: Nelson et al., Nucl. Acid. Res. 18: 2061–2064 (1990)). FseI Restriktionsendonuclease, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, ist im Wesentlichen rein und frei von den Kontaminanten, die gewöhnlich in mit konventionellen Techniken hergestellten Restriktionsendonuclasepräparaten zu finden sind.
Da mit der Methylaseselektionsmethode kein Methylaseklon hervorgebracht werden konnte, wurde eine neuartige Methode zur Klonierung des FseI Restriktions-Modifikationssystems entwickelt. Das Verfahren zum Klonieren des FseI Restriktions-Modifikationssystems umfasst die folgenden Schritte: Reinigen der FseI Endonuclease von Frankia species auf nahezu Homogenität, Bestimmen der Aminosäuresequenz am N-Terminus des Proteins, Synthetisieren degenerierter DNA-Primer auf der Basis von (1) der N-terminalen Aminosäuresequenz der FseI Endonuclease und (2) konservierten Aminosäuresequenzen von Cytosinmethylasen und Amplifizieren eines Teils der Endonuclease und Methylase von genomischer Frankia species DNA mit diesen Primern. Die FseI Endonuclease kann dann dadurch exprimiert werden, dass das komplette Gen von Frankia species DNA amplifiziert und in einen Expressionsvektor wie pAII17 oder pRRS kloniert wird. Dieses Konstrukt wird dann in einen Wirt eingeführt, der zuvor an FseI Orten mit einer heterologen Methylase, wie NlaI, oder der FseI Methylase, die auf einem separaten kompatiblen Plasmid getragen wird, modifiziert wird.
Zum Klonieren der FseI Methylase und, alternativ, zum Exprimieren der FseI Endonuclease, wird eine Bibliothek gebildet, die DNA von Frankia species enthält. Klone, die die Methylase- und Endonucleasegene enthalten, werden durch Hybridisierung mit der oben erhaltenen amplifizierten DNA ermittelt. Die klonierte DNA wird sequenziert, um die DNA-Sequenz der Endonuclease und der Methylase zu bestimmen, und die Methylase und Endonuclease werden getrennt von der Frankia species Genom-DNA amplifiziert und in geeignete Expressionsvektoren kloniert. Zur Produktion von FseI wird der Wirt, der die FseI Endonuclease und entweder FseI oder NlaI Methylasegene enthält, wachsen gelassen, eine Induktion mit geeigneten Expressionsbedingungen durchgeführt, werden Zellen geerntet und die FseI Endonuclease gereinigt.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 stellt das Verfahren zur Klonierung und Erzeugung der FseI Restriktionsendonuclease dar. Zu Beginn des Klonierungsprojekts war nicht bekannt, welche Strategien oder Bedingungen bei der Klonierung des FseI Restriktions-Modifikationssystems erfolgreich wären. In der Tat brachte der Methylaseselektionsansatz keine FseI Methylase-(oder Endonuclease)-Klone hervor. Proteinsequenzierung, Methylasevergleich, Primer-Design, DNA-Amplifikation und Klonierungsergebnisse, sowie die anschließende DNA-Sequenzierung, Kartierung und Charakterisierung der Klone, die in 1 und Beispiel 1 beschrieben sind, decken den zuvor unbekannten direkten Weg zur Klonierung und Expression des FseI Restriktions-Modifikationssystems auf.
2 ist eine Restriktionskarte der DNA, die in den Vektor pAII17 eingesetzt wurde, um den Überexpressionsklon pRMFseR1 zu erzeugen.
3 ist eine Restriktionskarte der DNA, die in den Vektor pRRS eingesetzt wurde, um den Überexpressionsklon pRMFseR2 zu erzeugen.
4 ist ein Photo eines Agarosegels, das die FseI Restriktionsendonucleaseaktivität in Zellextrakten von E. coli ER2417 demonstriert, wobei die Endonuclease auf dem von pAII17 stammenden Plasmid pRMFseR1 getragen wird.
5 ist ein Photo eines Agarosegels, das die FseI Restriktionsendonucleaseaktivität in Zellextrakten von E. coli ER2427 demonstriert, wobei die Endonuclease auf dem von pRRS stammenden Plasmid pRMFseR2 getragen wird.
6 ist eine Erläuterung des Einbuchstabencodes für die Aminosäuresequenz.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die FseI Restriktionsendonuclease und Methylase kodiert, sowie die Enzyme, die von einer solchen rekombinanten DNA produziert werden.
Das Klonieren des FseI Restriktionsendonucleasegens von Frankia species erwies sich als ungewöhnlich schwierig. Mit dem üblichen Methylaseselektionsverfahren wurden keine Methylaseklone erhalten, obwohl viele verschiedene Bibliotheken in E. coli und Streptomyces Wirtssystemen konstruiert und gescreent wurden. Dies scheint daran zu liegen, dass die FseI Methylase in E. coli oder Streptomyces nicht auf einem Niveau exprimiert, das einen Schutz bieten würde.
Die FseI Endonuclease wurde daher mit einer neuartigen Methode kloniert. Das Endonucleaseprotein wurde auf nahezu Homogenität gereinigt und zum Bestimmen der Aminosäuresequenz am aminoterminalen Ende des Proteins verwendet. Es wurden degenerierte DNA-Primer auf der Basis der Aminosäuresequenz der N-terminalen Region synthetisiert. Darüber hinaus wurden die Aminosäuresequenzen von Cytosinmethylasen im Hinblick auf konservierte Aminosäuremotive verglichen und es wurden degenerierte DNA-Primer auf der Basis dieser konservierten Aminosäuresequenzen synthetisiert. Da der FseI Erkennungsort nur G und C Basenpaaren enthält, muss die FseI Methylase eine Cytosinmethylase sein und sollte das ein oder andere konservierte Aminosäuremotiv von Cytosinmethylasen enthalten. (Bei einer Endonuclease und Methylase, die sowohl Adenin- als auch Cytosinbasen erkennen und bei denen der Methylierungsort unbekannt ist, müsste das gleiche Verfahren zum Klonieren der Gene wirksam sein, obschon mehr Primer-Kombinationen ausprobiert werden müssten, um auch die Adeninmethylase-konservierten Motive zu berücksichtigen.) Ein Teil der FseI Methylase- und FseI Endonucleasegene wurde mit bestimmten degenerierten Cytosinmethylaseprimern in Kombination mit den degenerierten Primern amplifiziert, die komplementär zum N-Terminus der FseI Endonuclease sind. Ein amplifiziertes DNA-Fragment von etwa 1650 bp wurde in pUC19 subkloniert und sequenziert. Die von der DNA-Sequenz dieses PCR-Fragments abgeleitete Aminosäuresequenz stimmte mit der Aminosäuresequenz der FseI Endonuclease in einer Region und mit konservierten Motiven von Cytosinmethylasen in einer anderen Region überein, was eine Bestätigung dafür war, dass dieses DNA-Fragment einen Teil des FseI Endonucleasegens und eines angrenzenden Cytosinmethylasegens (das sich anschließend als FseI Methylasegen erwies) repräsentierte.
Da gemäß der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal entdeckt wurde, dass die gesamte FseI Endonucleasegen- Kodierungssequenz, mit Ausnahme der ersten fünf Aminosäure-Codone, auf dem 1650 bp PCR-Produkt vorlag, wurde eine Schnellklonierungsstrategie ausprobiert. Es wurde ein synthetischer DNA-Primer synthetisiert, der einen Restriktionsort am ATG Startcodon aufwies, um die Klonierung zu erleichtern, und außerdem Codone für die zweite bis fünfte Aminosäure aufwies, wie anhand der FseI Endonuclease-Aminosäuresequenzierung bestimmt (Codon-Nutzung ausgerichtet auf hochexprimierte E. coli Gencodon-Nutzung), gefolgt von zur DNA-Sequenz komplementären Sequenzen, wie anhand des 1650 bp PCR-Produkts bestimmt. Dieser Primer wurde zusammen mit einem Primer, der zur Sequenz des 1650 bp PCR-Produkts komplementär war, die bekanntlich in 3'-Richtung zum FseI Endonucleasegen lag (auf der Basis der Proteingröße), zum Amplifizieren des FseI Endonucleasegens verwendet. Das amplifizierte Produkt wurde in den pAII17 Expressionsvektor ligiert und in einen Wirt eingeführt, der zuvor vor einer FseI Spaltung mit dem NlaI Methylasegen geschützt wurde, das auf einem separaten, kompatiblen Plasmid kloniert wurde. Es wurden individuelle Klone untersucht, wobei einer, der die FseI Endonuclease exprimierte, zum Produzieren von FseI verwendet wurde.
Zur Bestimmung und/oder Bestätigung der Kodierungssequenz für den Anfang und das Ende des FseI Endonucleasegens wurden Klone, die die gesamten FseI Endonuclease- und Methylasegene enthielten, von Frankia species DNA ohne Amplifikation erhalten, um die Bestimmung der DNA-Sequenz beider Gene zu ermöglichen. Dies würde die Expression der FseI Methylase zum Schutz anstelle der Verwendung einer Methylase, die FseI und andere Orte modifiziert (NlaI Methylase methyliert E. coli DNA an mehr als 10.000 Orten, wohingegen FseI Methylase zwischen 10 und 20 Orte methyliert), und eine Bestätigung der Aminosäuresequenz am Anfang der FsesI Endonuclease ermöglichen. Zu diesem Zweck wurde eine Bibliothek von Frankia species DNA in einem Lambda-Dash Vector^TM System konstruiert, um Klone zu erzeugen, die 9 bis 23 kb Inserts von Frankia species DNA enthielten. Das 1650 bp Amplifikationsprodukt wurde als Sonde zur Ermittlung von Lambda-Dash-Klonen verwendet, die die Endonuclease- und Methylasegene enthielten. Diese Lambda-Klone wurden gereinigt, ihre DNA wurde extrahiert und mit Restriktionsenzymen verdaut, um Fragmente von den Klonen mit der gleichen Größe wie Fragmente zu identifizieren, die durch Southern-Hybridisierung mit Frankia species DNA identifiziert wurden. Zwei KpnI Fragmente, eines mit 1,8 kb und eines mit 7,0 kb, die zusammen die gesamten FseI Methylase- und Endonucleasegene enthielten, und ein 3,6 kb SacI Fragment wurden von einem Lambda-Dash-Klon in pUC19 für eine leichtere Manipulation subkloniert. Die die FseI Endonuclease- und Methylasegene kodierende DNA wurde sequenziert und es wurde die exakte Nucleotidsequenz am N-Terminus des Endonucleasegens bestimmt. Man fand, dass die DNA-Sequenz anzeigte, der zweite Aminosäurerest der FseI Endonuclease sei Threonin, nicht Histidin, wie ursprünglich anhand der Proteinsequenzdaten angenommen wurde. Die ursprüngliche Aminosäuresequenzannahme von Histidin wurde von dem Sequenzer als fragwürdig befunden. In Anbetracht der Mehrdeutigkeit der Daten zeigte eine anschließende Untersuchung, dass ein Threoninrest mit den Aminosäuresequenzierungsdaten für diese Position übereinstimmte. Der erste Klon pRMFseR1, der FseI Endonucleaseaktivität exprimierte, hatte somit eine versehentliche Aminosäureänderung an der zweiten Position, ohne irgendeinen nennenswerten Effekt auf die Enzymfunktion. Wir haben somit gezeigt, dass wir selbst mit einer nichtkonservativen Aminosäureänderung eine funktionell aktive FseI Endonuclease produzieren können.
Die DNA-Sequenz der gesamten FseI Endonuclease- und Methylasegene wurde anhand der 1,8 kb und 7,0 kb KpnI und 3,6 kb SacI Klone bestimmt. Die FseI Methylase wurde in den Vektor pSYX20 kloniert. Oligonucleotidprimer, die dafür vorgesehen waren, das FseI Methylasegen zu amplifizieren und seine Expression im pSYX20 Vektor zu erleichtern, wurden synthetisiert, das Methylasegen wurde von Frankia species DNA amplifiziert, das amplifizierte Produkt wurde mit den geeigneten Restriktionsenzymen gespalten und in den pSYX20 Vektor ligiert, der zuvor mit den gleichen Restriktionsendonucleasen gespalten wurde, und in ER2427 Wirtszellen transformiert. Individuelle Transformanten wurden aufgenommen und im Hinblick auf die Anwesenheit des gewünschten Konstrukts analysiert.
DNA-Primer wurden so gestaltet, dass sie das gesamte FseI Endonucleasegen amplifizierten. Der Vorwärtsprimer hatte die folgenden Elemente: einen BamHI Klonierungsort, ein Stoppcodon „in-frame" mit dem lacZ Gen, eine starke Ribosomenbindungsstelle von E. coli Consensus, 7 Nucleotid-Spacer-Sequenz zwischen der Ribosomenbindungsstelle und dem ATG-Startcodon der FseI Endonuclease, ein korrektes Threonin-Codon an der zweiten Position, eine Änderung des Codons für Aminosäurenummer 5 in ein E. coli-bevorzugtes Codon und 24 Nucleotide, die mit der FseI DNA-Sequenz zur Hybridisierung übereinstimmten. Der 3' (Rückwärts) Primer war so gestaltet, dass er nur am 3'-Ende des Endonucleasegens hybridisierte, um eine Überlappung mit dem Methylaseklon zu minimieren. Ein BamHI Ort wurde in diesen Primer eingeführt, um die Klonierung zu erleichtern. Das Endonucleasegen wurde von der genomischen Frankia species DNA amplifiziert. Die amplifizierte DNA wurde durch BamHI gespalten und in den Expressionsvektor pRRS ligiert, der zuvor durch BamHI gespalten und dephosporyliert wurde, und die Ligationsreaktion wurde in kompetente E. coli ER2427 Zellen transformiert, die das NlaI Methylasegen trugen. Vektoren mit Inserts der gewünschten Größe wurden durch Miniprep-Verfahren ermittelt. Diese Klone wurden bis zur mid-log-Phase wachsen gelassen und mit IPTG induziert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet, in Beschallungspuffer resuspendiert und durch Beschallung lysiert. Der Extrakt wurde geklärt und bezüglich FseI Endonucleaseaktivität getestet. Ein FseI-exprimierender Wirt wurde vermehrt und zur Herstellung von FseI Restriktionsendonuclease verwendet. Die FseI Endonuclease wurde durch standardmäßige Proteinreinigungstechniken gereinigt, die nachfolgend beschrieben werden.
Das hierin beschriebene Verfahren, mit dem die FseI Restriktionsendonuclease- und Methylasegene vorzugsweise kloniert und exprimiert werden, ist in 1 dargestellt und umfasst die folgenden Schritte:

1. Frankia species wird in Flaschen mit reichhaltigem Medium wachsen gelassen, die Zellen werden lysiert und die genomische Frankia species DNA wird gereinigt.
2. Das FseI Restriktionsendonucleaseprotein wird von Frankia species Zellen auf nahezu Homogenität durch eine Kombination von Proteinreinigungstechniken gereinigt, die bei New England Biolabs entwickelt wurden (siehe Beispiel 1). Die so gereinigte Endonuclease ist gemäß SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese fast homogen und hat eine scheinbare relative Molekülmasse von 28.000 Dalton.
3. Die aminoterminale Sequenz der Endonuclease wird mit einem 470A Proteinsequenzer von Applied Biosystems erhalten (Brooks, et al., Nucleic Acids Research, 17: 979–997, (1989)) und es werden verschiedene degenerierte DNA-Oligonucleotidprimer auf der Basis der Proteinsequenz hergestellt. Die Aminosäuresequenz und die davon stammenden Oligonucleotidprimer sind in dem Beispiel aufgeführt.
4. Die Aminosäuresequenzen von Cytosinmethylasegenen werden verglichen und Homologiebereiche werden identifiziert (Wilson, Methods in Enzymology, 216: 259–279, (1992)). Degenerierte DNA-Primer werden auf der Basis der Aminosäuresequenzmotive jedes Cytosinmethylasetyps synthetisiert: 5-Methylcytosin-, α-N4-Cytosin- und β-N4-Cytosinmethylasen. Die synthetisierten Primer sind in dem Beispiel aufgeführt.
5. Die Cytosinmethylase-Primer werden in Kombination mit den N-terminalen FseI Endonucleaseprimern verwendet, um einen Teil der FseI Endonuclease- und Methylasegene von Frankia species DNA durch PCR-Techniken zu amplifizieren. Es werden verschiedene Kombinationen von Cytosinmethylase-Primern und N-terminalen FseI Endonucleaseprimern in PCR-Reaktionen zum Amplifizieren eines Teils der Endonuclease- und Methylasegene ausprobiert. Ein verknüpftes Endonuclease- und Methylasegen kann in vier möglichen Kombinationen relativer Positionen vorkommen: konvergent, divergent, angeglichene Endo zuerst und angeglichene Methylase zuerst (Wilson, Nucleic Acids Research, 19: 2539–2566, (1991)). In Kombination mit den drei möglichen Typen von Cytosinmethylasen ergibt dies zwölf mögliche Genkombinationen. Es werden Primerkombinationen ausprobiert, die alle diese berücksichtigen. Ein auffälliges Amplifikationsprodukt von etwa 1,5 kb wird in der konvergenten Genposition mit einem 5-Methylcytosin-Motiv-4-Vorwärtsprimer plus einem FseI Endonuclease-N-Terminus-Vorwärtsprimer beobachtet, und ein schwächeres Produkt von 1,65 kb wird in einem 5-Methylcytosin-Motiv-1-Vorwärtsprimer und dem gleichen N-Terminus-Endonucleaseprimer beobachtet. Unter Verwendung des 1,65 kb Produkts als Matrize kann das 1,5 kb Produkt mit dem Motiv-4-Primer und dem gleichen N-terminalen FseI-Primer amplifiziert werden. Sowohl das 1,65 kb als auch das 1,5 kb Produkt wird in den Vektor pUC19 kloniert.
6. Es wird die DNA-Sequenz an den Enden der PCR-Produkte aus Schritt 5 bestimmt. Die von der DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz stimmt mit der Aminosäuresequenz der im Schritt 3 oben bestimmten FseI Endonuclease überein. Außerdem enthält die von dem anderen Ende der amplifizierten DNA abgeleitete Aminosäuresequenz Aminosäuremotive von 5-Methylcytosinmethylasen, und es wird gefunden, dass das 1,5 kb Produkt eine interne Teilmenge des 1,65 kb Produkts ist.
7. Überexpression des FseI Endonucleasegens:
A. Allgemeine Überlegungen: Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten zur Überexpression des Restriktionsgens. DNA-Sequenz und ausführliche Kartierungsinformationen sind bei der Bestimmung der besten Methode zur Überexpression des Restriktionsendonucleasegens behilflich. Eine Methode zur Überexpression umfasst den Entwurf von Primern, die direkt am N-Terminus des Restriktionsendonucleasegens und irgendwo stromabwärts (3') des Gens hybridisieren, um die Polymerasekettenreaktion zum Amplifizieren des gesamten Endonucleasegens anzuwenden. Das resultierende DNA-Fragment kann in einen Expressionsvektor wie pAII17 direkt stromabwärts eines induzierbaren Promotors (T7) eingesetzt werden. Alternativ kann eine Überexpression durch Einsetzen eines Promotors, der von E. coli allgemein erkannt wird, wie P_tac auf pAGR3 (von W. Jack, New England Biolabs), direkt vor den Anfang des Restriktionsendonucleasegens erreicht werden. Dies kann dadurch erreicht werden, dass geeignete Restriktionsorte in der Nähe vom Anfang und Ende des Restriktionsendonucleasegens und kompatible Restriktionsorte in der Nähe des Promotors von pAGR3 gefunden und das Restriktionsgen in Übereinstimmung mit dem P_tac Promotor in pAGR3 übertragen wird. Zu anderen regulierten Promotoren, die verwendet werden können, gehören PlacUV5 (Fuller, Gene 19: 43–54, (1982)) und IPL (Shimatake und Rosenberg, Nature 254: 128, (1981)) auf pUC19 und pBR322 Derivaten. Darüber hinaus kann eine starke Ribosomenbindungsstelle (Shine & Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 1342–1346, (1974)) vor das Gen gesetzt werden, um die Expression zu erhöhen. Für den Erhalt eines stabilen Klons, der die Restriktionsendonuclease überexprimiert, wird der Wirt im Allgemeinen zuvor vor einem Restriktionsendonucleaseverdau geschützt. In der vorliegenden Erfindung wird dies durch Klonieren von FseI Methylase oder einer heterologen Methylase wie NlaI erreicht, die vor FseI Verdau schützt, indem alle FseI Orte (sowie viele andere Orte) modifiziert werden, auf einem separaten Plasmid. Das verwendete Plasmid muss mit dem Expressionsvektor kompatibel sein. Die Methylase muss außerdem auf einem Niveau produziert werden, das das Genom des Wirts vor dem Verdau durch das überexprimierte Restriktionsendonucleasegen schützt. Die DNA-Sequenz des Gens kann durch ortsgerichtete Mutagenese oder durch Resynthetisieren des Gens selbst verändert werden, um Codone zu verwenden, die in E. coli effizienter genutzt werden (Ikemura, J. Mol. Biol. 151: 389–409, (1981)).
B. Anfängliche schnelle Expression von FseI: es werden synthetische Oligonucleotidprimer entworfen, die zum Amplifizieren des FseI Endonucleasegens von genomischer Frankia species DNA zum Klonieren in pAII17, ein T7 Expressionsvektor, verwendet werden. Unter Verwendung von DNA-Sequenzinformationen von dem obigen 1650 bp PCR-Produkt und der Aminosäuresequenz der FseI Endonuclease wird ein synthetischer Oligonucleotidprimer konstruiert, wobei ein NdeI Ort (-CATATG-) am ATG-Start des FseI Endonucleasegens positioniert ist, um die Klonierung in den NdeI Ort des T7 Expressionsvektor pAII17 zu erleichtern, gefolgt von DNA-Sequenzen, die die ersten 5 Aminosäuren von FseI, wie anhand der Aminosäuresequenz angegeben, kodieren. Aufgrund von Überlegungen bezüglich Codondegenerationen begann der zum Amplifizieren des obigen 1650 bp Produkts verwendete Primer am Codon für die Aminosäure 6 der FseI Endonucleaseproteinsequenz, so dass keine DNA-Sequenzinformationen für die Aminosäuren 2 bis 5 vorhanden waren, auf die der Expressionsprimer gestützt werden konnte. Folglich wird die Primersequenz gewählt, um die Aminosäuren, die für die ersten fünf Positionen in Schritt 3 oben angegeben sind, unter Verwendung der in hochexprimierten E. coli Genen am häufigsten verwendeten Codone einzubauen. Der Expressionsprimer fährt dann mit 21 Basenpaaren einer Sequenz fort, die mit der des 1650 bp PCR-Produkts übereinstimmt. Der rückwärts gerichtete Primer wird gewählt, um der DNA-Sequenz in der Region des Cytosinmethylase-Motivs 4 zu entsprechen, da dadurch gewährleistet wird, dass das gesamte Endonucleasegen präsent ist, und da ein geeigneter SalI Restriktionsort in diesem Primer mit nur einer Basenpaaränderung von der Frankia species DNA-Sequenz erzeugt werden kann. Die amplifizierte DNA wird mit NdeI und SalI gespalten und in den Vektor pAII17 ligiert, der zuvor mit NdeI und SalI gespalten wurde. Der ligierte Vektor wird in einen geeigneten Wirt, E. coli ER2417, eingeführt, der das induzierbare T7 Polymerasegen trägt und der zuvor an FseI Orten aufgrund der Expression des auf dem kompatiblen Vektor pSYX20 getragenen NlaI Methylasegens modifiziert wurde. Individuelle Transformanten werden analysiert und einer, der FseI Endonuclease exprimiert, wird zur Herstellung des Enzyms verwendet.
8. Produktion: Die FseI Endonuclease kann von Klonen, die das NlaI Methylasegen (oder das FseI Methylasegen) und das überexprimierte FseI Restriktionsendonuclasegen tragen, durch Vermehrung in einem Fermenter in einem reichhaltigen Medium mit der angemessenen Antibiotikaselektion und Induktion produziert werden. Die Zellen werden anschließend durch Zentrifugation geerntet und durch Beschallung aufgebrochen, um einen Rohzellextrakt herzustellen, der FseI Restriktionsendonucleaseaktivität enthält.
9. Reinigung: Der Rohzellextrakt mit der FseI-Endonuclease wird durch eine Kombination von standardmäßigen Proteinreinigungstechniken wie Affinitätschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Weitere Charakterisierung der FseI Endonuclease und Methylase und alternative Expression der Enzyme:
10. Die Frankia species DNA wird vollständig und/oder teilweise mit einer Restriktionsendonuclease wie Sau3AI oder einem beliebigen ihrer Isoschizomere verdaut, die spaltet, um (ein) Fragment(e) zu produzieren, das/die in Lambda-Dash II oder einem beliebigen ähnlichen Vektor klonierbar ist/sind, der die gesamten FseI Endonuclease- und/oder Methylasegene enthält.
11. Die verdauten DNAs werden mit dem Lambda-Phage-Klonierungsvektor ligiert. Die resultierenden Gemische werden in vitro verpackt und zum Infizieren eines geeigneten Wirts, z. B. E. coli Stamm ER1458 (NEB Nr. 401-C), verwendet. Der Titer von infektiösem Phage wird durch Plattieren eines Teils des verpackten Phagen und Zählen der resultierenden Plaques bestimmt.
12. Der in vitro verpackte Phage wird vorzugsweise in verschiedenen Dichten in einen weichen Agarrasen eines geeigneten E. coli Wirts, wie ER1458 (NEB Nr. 401-C), auf reichhaltigem Medium ausplattiert. Nach dem Inkubieren werden Phagen, die die FseI Endonuclease- und Methylasegene enthalten, durch Benton-Davis-Southern-Hybridisierung unter Verwendung des durch PCR gewonnenen 1650 bp Teils der Gene als Sonde gegen Nitrocellulosefilterlifts der Plaques identifiziert. Positive Plaques werden von den Platten entfernt und durch mehrere aufeinander folgende Plattierungs- und Hybridisierungsrunden gereinigt. Positive Klone werden wachsen gelassen und ihre DNA wird gereinigt.
13. Eine Karte von Restriktionsfragmenten von Frankia species DNA in der Region der FseI Endonuclease und Methylase wird durch Southern-Hybridisierung der 1650 bp PCR-Produktsonde gegen genomische Frankia species DNA produziert, die mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut wird. Ein 1800 bp und 7000 bp KpnI Fragment und ein 3600 bp SacI Fragment, das verschiedene Lambda-Dash-Klone und die Frankia species Genomkarte gemeinsam haben, wird vom Lambda-Dash-Vektor in pUC19 für eine leichtere Manipulation in nachfolgenden Schritten subkloniert.
14. Sequenzierung: Die DNA, einschließlich des und neben dem Ortes) des 1650 bp Amplifikationsprodukts, wird sequenziert, um die exakte DNA-Sequenz am N-Terminus des Endonucleasegens, einschließlich der vier „fehlenden" Aminosäurecodone und des ATG-Beginns, und die Sequenz am Beginn der Methylase zu bestimmen, die im ursprünglichen Amplifikationsprodukt fehlt. Es wurde gefunden, dass sich die zweite Aminosäure der Endonuclease von der ursprünglichen Sequenzannahme (Schritt 3) unterschied. Diese Aminosäure wird in der nachfolgenden Expression der Endonuclease in das korrekte Threonin geändert. Es werden der angebliche Beginn und das Ende des Methylasegens sowie das Ende der Endonuclease ermittelt. Es wird beobachtet, dass die Endonuclease- und Methylasegene um 12 Nucleotide überlappen.
15. Expression der FseI Methylase: Die FseI Methylase wird in den Vektor pSYX20 kloniert, der mit den Vektoren pAII17 und pRRS kompatibel ist. Es werden Oligonucleotidprimer synthetisiert, die dafür vorgesehen sind, das FseI Methylasegen zu amplifizieren und seine Expression in den pSYX20 Vektor zu erleichtern, das Methylasegen wird von Frankia species DNA amplifiziert, das amplifizierte Produkt wird mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten und in den pSYX20 Vektor ligiert, der zuvor mit den gleichen Restriktionsendonucleasen gespalten wurde, und in ER2427 Wirtszellen transformiert. Individuelle Transformanten werden aufgenommen und in Bezug auf die Anwesenheit des erwünschten Konstrukts analysiert. Ein Transformant mit dem korrekten Konstrukt heißt pRMFseM1.
16. Expression der FseI Endonuclease: DNA-Primer werden zum Amplifizieren des gesamten FseI Endonucleasegens gestaltet. Der Vorwärtsprimer hat die folgenden Elemente: eine BamHI Klonierungsstelle, ein Stoppcodon „in-frame" mit dem lacZ Gen, eine starke Ribosomenbindungsstelle von E. coli Consensus, 7 Nucleotid-Spacer-Sequenz zwischen der Ribosomenbindungsstelle und dem ATG Startcodon der FseI Endonuclease, ein korrektes Threonincodon an der zweiten Position, eine Änderung des Codons für Leucin an der fünften Position in ein E. coli-bevorzugtes Codon und 24 Nucleotide, die mit der FseI DNA-Sequenz zur Hybridisierung übereinstimmen. Dieser Primer folgt dem Beispiel der HinfI Expression (Skoglund, et al., Gene 88: 1–5 (1990)). Der 3' (Rückwärts) Primer ist so gestaltet, dass er nur am 3'-Ende des Endonucleasegens hybridisiert, um eine Überlappung mit dem Methylaseklon und somit die Möglichkeit einer homologen Rekombination zwischen den beiden Plasmiden im Wirt zu minimieren. Ein BamHI Ort wird in diesen Primer eingeführt, um die Klonierung zu erleichtern. Das Endonucleasegen wird von der genomischen Frankia species DNA amplifiziert. Die amplifizierte DNA wird durch BamHI gespalten und in den Expressionsvektor pRRS ligiert, der zuvor durch BamHI gespalten und dephosporyliert wurde, und die Ligationsreaktion wird in eine geeignete Wirtszelle wie E. coli ER2427 transformiert, die zuvor mit der auf pSYX20 getragenen NlaI Methylase modifiziert wurde. Vektoren mit den Inserts der gewünschten Größe werden durch Miniprep-Verfahren identifiziert. Diese Klone werden bis zur mid-log-Phase wachsen gelassen und mit 0,5 mM IPTG induziert. Die Zellen werden dann durch Zentrifugation geerntet, in Beschallungspuffer resuspendiert und durch Beschallung lysiert. Der Extrakt wird geklärt und im Hinblick auf FseI Endonucleaseaktivität getestet. Das pRRS FseI Endonucleasekonstrukt erhält die Bezeichnung pRMFseR2. Ein FseI exprimierender Wirt, der das Plasmid pRMFseR2 enthält, wird vermehrt und zur Herstellung von FseI Restriktionsendonuclease verwendet.
17. Produktion: Die FseI Endonuclease kann von Wirtszellen, die das überexprimierte FseI Restriktionsendonuclasegen und entweder das NlaI Methylasegen oder das FseI Methylasegen tragen, durch Vermehrung in einem Fermenter in einem reichhaltigen Medium mit der angemessenen Antibiotikaselektion und Induktion produziert werden. Die Zellen werden anschließend durch Zentrifugation geerntet und durch Beschallung aufgebrochen, um einen Rohzellextrakt herzustellen, der FseI Restriktionsendonucleaseaktivität enthält.
18. Reinigung: Der Rohzellextrakt mit der FseI-Endonuclease wird durch eine Kombination von standardmäßigen Proteinreinigungstechniken wie Affinitätschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie gereinigt.

Die oben beschriebenen Schritte stellen zwar die bevorzugte Art und Weise der Umsetzung der vorliegenden Erfindung dar, es wird für die fachkundige Person jedoch offensichtlich sein, dass der oben beschriebene Ansatz gemäß in der Technik bekannten Techniken variieren kann.
Anhand des folgenden Beispiels werden derzeit bevorzugte Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. Es ist zu verstehen, dass dieses Beispiel illustrativ ist und dass die Erfindung mit Ausnahme der Angaben in den beiliegenden Ansprüchen nicht als darauf beschränkt anzusehen ist.
1. BEISPIEL
Klonierung von FseI Modifikationsmethylase- und Restriktionsendonucleasegenen
1. DNA-Reinigung: Zum Präparieren der DNA von Frankia species wurden 5 g Zellpaste durch sanftes 10-minütiges Schütteln in 20 ml 25% Saccharose, 0,05 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0, 10 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0, resuspendiert, 6 ml frisch präpariertes 10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris-HCl, pH 8,0, wurden zugegeben, und die Lösung wurde 16 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Die Lösung wurde mit 50 ml äquilibriertem Phenol extrahiert, die wässrige Phase wurde wiedergewonnen und zweimal mit 50 ml Chloroform extrahiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen 5 M NaCl und 1 Volumen 2-Propanol präzipitiert und durch Zentrifugation aufgefangen. Das DNA-Pellet wurde 1 Stunde lang an der Luft getrocknet, anschließend in 11 ml DNA-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert. 10 g CsCl wurden in der DNA-Lösung gelöst und es wurden 0,5 ml von 5 mg/ml Ethidiumbromidlösung zugegeben. Die CsCl-DNA-Lösung wurde bei 44.000 rpm 36 Stunden lang in einem Beckman Ti70 Rotor zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde die DNA-Bande mit einer 17-Gauge-Kanüle abgezogen, 4 Mal mit CsCl-Wasser-gesättigtem 2-Propanol extrahiert, mit 4 Volumen DNA-Puffer verdünnt und mit einem gleichen Volumen von 2-Propanol präzipitiert. Die DNA wurde durch Zentrifugation aufgefangen, zweimal mit 70%igem Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in 2 ml DNA-Puffer resuspendiert.
2. Reinigung der FseI Restriktionsendonuclease von Frankia species (NRRL 18528): FseI Restriktionsenzym kann von NRRL 18528 durch Vermehren von Frankia species Zellen bis zur mid-log-Phase in Flaschen mit reichhaltiger Nährlösung hergestellt werden. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet. Alle folgenden Verfahren fanden auf Eis oder bei 4°C statt. 25 g der Zellen wurden in 50 ml Puffer A (20 mM Tris-HCl, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,1 mM EDTA, pH 7,6) resuspendiert und durch Beschallung aufgebrochen. Der Extrakt wurde durch Zugabe von 3 ml 5 M NaCl auf 0,2 M NaCl gebracht und bei 15.000 rpm 30 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine 15 ml Heparin-Sepharose-Säule geladen, die mit Puffer A äquilibriert wurde, der 0,2 M NaCl enthielt (Puffer A.2). Die Säule wurde mit 45 ml Puffer A.2 gewaschen, gefolgt von einem linearen Gradienten von NaCl, der mit 60 ml Puffer A.2 und 60 ml Puffer A mit 1,0 M NaCl gebildet wurde. Es wurden 3 ml Fraktionen aufgefangen. Der Peak der Restriktionsenzymaktivität eluierte von der Säule zwischen 0,8 und 0,9 M NaCl und wurde gepoolt. Dieser Heparin-Sepharose-Pool wurde mit 3 Volumen Puffer A verdünnt und auf eine 1 ml Phosphocellulosesäule aufgetragen, die in Puffer A.2 äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit 5 ml Puffer A.2 gewaschen, anschließend wurde ein linearer Gradient (40 ml) von 0,2 M NaCl bis 1,0 M NaCl in Puffer A angewendet. Der Peak der Restriktionsenzymaktivität eluierte bei 0,5 M NaCl und wurde gepoolt. Der Phosphocellulosepool wurde mit einer Amicon Centricon-10 Mikrofiltrationsvorrichtung auf 0,56 ml konzentriert und mit 5 ml Puffer A verdünnt und anschließend auf eine 1 ml Mono-Q^®-Säule (Pharmacia) aufgetragen, die mit Puffer A äquilibriert war, der auf 0,05 M NaCl angereichert war. Es wurde ein linearer Gradient in Puffer A von 0,05 bis 0,6 M NaCl angewendet und die FseI Aktivität eluierte bei 0,2 M NaCl. Die Mono-Q-Fraktion mit dem reinsten FseI wurde mit einer Amicon Centricon-10-Vorrichtung konzentriert; dies führte jedoch zu einem Verlust von mehr als 90% der löslichen FseI Aktivität. Die Filtermembran der Centricon-10-Vorrichtung wurde daher in 0,05 ml SDS-Protein-Gel-Ladepuffer gekocht, der Überstand wurde gewonnen und der Elektrophorese unterworfen und gemäß dem Verfahren von Matsudaira (Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262: 10035–10038, 1987) mit den zuvor beschriebenen Modifikationen (Looney, et al., Gene 80: 193–208, (1989)) elektrogeblottet. Die Membran wurde mit Coomassie-Blau R-250 gefärbt, die Proteinbande von etwa 28 kD wurde exzidiert und einem sequentiellen Abbau unterzogen (Waite-Rees et al., J. Bacteriol. 173: 5207–5219, (1991)).
3. Aminoterminale FseI-Proteinsequenz: Die erhaltene Proteinbande von etwa 28 kD wurde einer aminoterminalen Proteinsequenzierung auf einem Gasphasenproteinsequenzer Modell 470A von Applied Biosystems (Brooks, et al., Nucleic Acids Research, 17: 979–997, (1989)) unterzogen. Die Sequenz der erhaltenen ersten 23 Reste war wie folgt: H D E L F P I P E P L V X P V I A L P P L L K (SEQ ID Nr. 1). Diese Peptidsequenzdaten vom Aminoterminus der FseI Endonuclease wurden zum Konstruieren einer Serie von PCR-Primern verwendet:
wobei
Y = T, C
R = A, G
H = A, T, C
S = G, C
N = A, C, G, T
Die Primer 1, 2 und 3 sind Vorwärts- oder Kodierungsstrangprimer, wohingegen 4 und 5 Rückwärts- oder Nichtkodierungsstrangprimer sind.
4. Primer, die Cytosinmethylase-konservierten Sequenzen entsprechen: Die Aminosäuresequenz einer Reihe von Cytosinmethylasegenen wurden bestimmt und verglichen (Wilson, Methods in Enzymology, 216: 259–279, (1992)). Es gibt zwei verschiedene Arten der Cytosinmethylierung: eine an der C5-Position des Cytosinrings und eine an der N4-Position. Der N4-Typ kommt in zwei Klassen, Alpha und Beta, vor, die ähnliche Motive haben, die in unterschiedlicher Reihenfolge vorkommen. Degenerierte DNA-Primer wurden so gestaltet, dass sie mit mehreren der konservierten Sequenzmotive jedes Typs Cytosinmethylase hybridisieren, mit einem gewissen Maß an Priming in Vorwärts-(Kodierungs)-Richtung und einem gewissen Maß in Rückwärtsrichtung, und zwar wie folgt:
A. 5-Methylcytosin
B. N-4-Cytosinmethylase, Alpha-Typ
C. N-4-Cytosinmethylase, Beta-Typ
5. Verschiedene Kombinationen der Cytosinmethylase-Primer aus Abschnitt 4 und der zur N-Terminus-Region des FseI Endonucleasegens aus Abschnitt 3 komplementären Primer wurden in Polymerasekettenreaktionstechniken verwendet, um einen Teil der Endonuclease- und Methylasegene zu amplifizieren. In einer typischen Reaktion wurde ein Hauptreaktionsgemisch hergestellt, das einen getesteten Primer enthielt, und in aliquote Teile aufgeteilt, denen der zweite Primer zugesetzt wurde. In der Reaktion, die erfolgreich einen Teil der FseI Methylase und Endonuclease amplifizierte, wurde ein Hauptreaktionsgemisch durch Kombinieren der folgenden Bestandteile hergestellt:
40 μl 10X Vent^TM Reaktionspuffer
30 μl 4 mM dNTP-Lösung
4 μl (800 ng) Frankia species DNA
20 μl (10 μM Stamm) Primer SEQ ID: 2 oben (FseI-Endonuclease-N-Terminus-Primer)
286 μl dH₂O
4 μl KlenTaq^TM Polymerase (25 Einheiten/μl Stamm)
4 μl Deep Vent^TM Polymerase (0,02 Einheiten/μl Stamm)
Das Gemisch wurde dann in acht aliquote Teile von 47,5 μl aufgeteilt; zum ersten wurden 2,5 μl Primer SEQ ID Nr. 8 (10 μM Stamm) gegeben, zum zweiten wurden 2,5 μl Primer SEQ ID Nr. 10 (10 μM Stamm) gegeben, und so weiter unter Verwendung der Primer SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 15 und SEQ ID Nr. 16. Zum achten aliquoten Teil wurden 2,5 μl dH₂O als Kontrollreaktion gegeben. Die PCR-Amplifikationsbedingungen umfassten 1 Zyklus bei 94°C (3 min) und dann 25 Zyklen bei 95°C (30 sec), 46°C (30 sec) und 72°C (2 min). 15 μl des PCR-Reaktionsprodukts wurden durch Elektrophorese auf einem 1% Agarosegel analysiert. Es wurden mehrere Banden in den Reaktionen mit den Primern SEQ ID Nr. 8 und SEQ ID Nr. 16 mit verschiedenen zweiten Primern beobachtet. Eine auffällige Bande von etwa 1,5 kb wurde in der Reaktion mit den Primern SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 11 beobachtet. Ein schwaches Produkt der gleichen Größe wurde mit den Primern SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 10 beobachtet, und eine Bande mittlerer Intensität von etwa 1,65 kb wurde mit den Primern SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 8 beobachtet. Die Produkte dieser Größe stimmen mit den Erwartungen für eine konvergente Genorientierung überein.
Für einen Test, ob diese Produkte von der FseI Methylase und Endonuclease abstammten, wurde das 1,65 kb Produkt der Primer SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 8 gelgereinigt und als PCR-Matrize verwendet. Gelreinigung: 30 μl der SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID NR. 8 PCR-Reaktion wurden in 1% LMP-Agarose der Elektrophorese unterworfen, die 1,65 kb Bande wurde von dem Gel exzidiert, bei 65°C 5 Minuten lang geschmolzen, 5 Minuten lang auf 40°C gekühlt, und die Agarose wurde durch Zugabe von 1 μl (1 u) β-Agarase (New England Biolabs Nr. 392) verdaut, mit einer 1-stündigen Inkubation bei 40°C. Die DNA wurde durch Präzipitation gewonnen, mit 70%igem Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in DNA-Puffer resuspendiert. PCR-Reaktionen wurden mit den oben genannten Bedingungen und den folgenden Primer-Kombinationen durchgeführt: SEQ ID Nr. 8 alleine brachte 6 schwache Banden mit anderen Größen als 1,65 kb hervor, Primer SEQ ID Nr. 2 alleine brachte kein Produkt hervor, Primer SEQ ID Nr. 2 plus SEQ ID Nr. 8 produzierte eine auffällige 1,65 kb Bande, Primer SEQ ID Nr. 2 plus SEQ ID Nr. 11 (ein interner 5-Methyl-Cytosinmethylase-Primer) produzierte eine auffällige 1,5 kb Bande, da diese von Frankia species DNA hatten, und Primer SEQ ID Nr. 4 (ein interner FseI Endonuclease-N-Terminus-Primer) plus SEQ ID Nr. 11 produzierte eine auffällige Bande von etwa 1,45 kb. Diese Ergebnisse zeigten, dass das 1,65 kb Produkt und das 1,5 kb Produkt, das ursprünglich erhalten wurde, sehr wahrscheinlich von den FseI Endonuclease- und Methylasegenen abstammten. Sowohl das 1,65 kb als auch das 1,5 kb Produkt wurde wie oben beschrieben gelgereinigt, mit T4 Polynucleotid-Kinase kinasebehandelt und in pUC19 Vektor ligiert, der zuvor mit SmaI gespalten und mit Calf Intestinal Alkaline Phosphatase dephosphoryliert wurde. Das Ligationsgemisch wurde dann in den E. coli Stamm ER2420 transformiert und auf L-Nährlösungsplatten mit 100 μg/ml Ampicillin für individuelle Kolonien plattiert. Klone des erwünschten Konstrukts wurden dadurch identifiziert, dass Miniprep-Verfahren durchgeführt wurden und die gereinigte DNA verdaut und durch Agarosegelelektrophorese analysiert wurde.
Analyse von Plasmidklonen: individuelle Transformanten wurden in 10 ml Kulturen von L-Nährlösung mit Ampicillin inokuliert und die von ihnen getragenen Plasmide wurden durch das folgende Miniprep-Plasmidreinigungsverfahren präpariert, das von dem Verfahren von Birnboin and Doly (Nucleic Acids Res. 7: 1513, (1979)) angepasst wurde.
Miniprep-Verfahren: Jede Kultur wurde bei 8000 rpm 5 Minuten lang zentrifugiert; der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in 1,0 ml 25 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM Glucose, pH 8,0, mit 1 mg/ml Lysozym resuspendiert. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden 2,0 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS in jedes Röhrchen gegeben, und die Röhrchen wurden zum Auflösen der Zellen geschüttelt und dann auf Eis gelegt. Nach dem Klären der Lösungen wurden zu jeder 1,5 ml 3 M Natriumacetat, pH 4,8, gegeben und geschüttelt. Die sich ausbildenden Präzipitate wurden bei 15.000 rpm und 4°C 10 Minuten lang geschleudert. Die jeweiligen Überstände wurden in ein Zentrifugenröhrchen gegossen, das 3 ml Isopropanol enthielt, und vermischt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Röhrchen bei 15.000 rpm 10 Minuten lang geschleudert, um die präzipitierten Nucleinsäuren zu pelletieren. Die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten lang an der Luft getrocknet. Nach dem Trocknen wurden die Pellets in 500 μl 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA mit 50 μg/ml RNase gelöst und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert, um die RNA zu verdauen. Die DNA wurde durch Zugabe von 50 μl 5 M NaCl präzipitiert, gefolgt von 350 μl Isopropanol. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde die DNA durch 5-minütige Zentrifugation geschleudert, die Überstände wurden verworfen, die Pellets wurden getrocknet und dann in einer letzten Lösung aus 150 μl 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, wieder aufgelöst. Die Plasmid-Minipreps wurden anschließend durch einen Verdau mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen analysiert.
6. DNA-Sequenzierung: Eine DNA-Sequenzierung erfolgte mit dem Circumvent^TM DNA-Sequenzierungskit (New England Biolabs) gemäß Herstelleranweisungen. Miniprep-DNA-Präparationen wurden als Matrize verwendet. Die DNA-Sequenz lieferte Daten, die als Basis für anschließende Manipulationen verwendet wurden, um das gesamte Restriktionsendonucleasegen zu klonieren und die Expression des geklonten Gens in E. coli zu induzieren. Die von der DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz an einem Ende der 1,65 kb und 1,5 kb PCR-Produkte stimmte eng mit der Proteinsequenz des N-Terminus des FseI-Endonucleasegens überein. Diese DNA-Sequenz lautete wie folgt: 5' TTT CCT ATT CCG GAG CCA TTG GTC AGA CCA GTC ATC GCA CTC CCC CCT CAT CTG AAG GAA TTG ATC 3' (SEQ ID Nr. 27), die in die folgende Aminosäuresequenz translatiert: F P I P K P L V R P V I A L P P H L R E L I (SEQ ID Nr. 28), wobei die fettgedruckten Aminosäuren der N-Terminus-Aminosäuresequenzierungsdaten-Interpretation der FseI-Endonuclease entsprechen. Die von der DNA-Sequenz am anderen Ende des 1,65 kb Amplifikationsprodukt abgeleitete Aminosäuresequenz enthielt die konservierten Motive 1 und 4 von 5-Methylcytosinmethylasen: DNA-Sequenz 5' TTC TGT GGC GCC GGA GGG ATG ACG TTG GGA TTC ATG CAG GCA GGA TTC CAG CCG ATT CTG TCC ATC GAC CAT GAC CTT CCA TCT ATCGAG ACG CAT CGC GCA AAC TTC CCT GGA ATG TCG ATC TGC ACG GAC ATT CGC GAC TTT GTT GAT TTT CCT TCC GCA GAT GTT GTC GTC GGA GGT CCC CCA TGC CAG GGA TTC AGT CGT CTG GGT 3' (SEQ ID Nr. 29), die in die folgende Aminosäuresequenz translatiert: F C G A G G M T L G F M Q A G F Q P I L S I D H D L F S I E T H R A N F P G M S I C T D I R D F V D F P S A D V V V G G P C Q G F S R L G (SEQ ID Nr. 30).
7. Überexpression der FseI-Endonuclease: Das FseI-Endonucleasegen wurde überexprimiert, indem das Gen in den Expressionsvektor pAII17 direkt stromabwärts von einem induzierbaren Promotor (T7) und einer allgemein erkannten Ribosomenbindungstelle eingesetzt wurde. Um dies zu erreichen, wurden zwei Oligonucleotidprimer unter Verwendung der DNA- und Proteinsequenzdaten hergestellt. Der Oligonucleotid-Vorwärtsprimer enthielt eine Sequenz zum Erzeugen einer NdeI-Klonierungsstelle an einem ATG-Startcodon für die Endonuclease, gefolgt von einer DNA-Sequenz zum Kodieren der durch Proteinsequenzierung angegebenen zweiten, dritten, vierten und fünften Aminosäure, wobei die Wahl der Codone so getroffen war, dass sie der gängigsten E. coli Codon-Nutzung von hochexprimierten Genen entsprach, gefolgt von 21 Basen komplementär zur DNA-Sequenz, die von dem 1,65 kb Amplifikationsprodukt erhalten wurde: 5' GGA GGT TAA CAT ATG CAC GAC GAA CTG TTT CCT ATT CCG GAG CCA TTG 3' (SEQ ID Nr. 31), wobei die NdeI Klonierungsstelle fettgedruckt und die ersten fünf Aminosäurecodone unterstrichen sind. Der zweite Oligonucleotidprimer enthielt eine Sequenz von etwa 800 Nucleotiden in 3'-Richtung zum Ende des FseI-Endonucleasegens, mit einem geänderten Nucleotid, um einen SalI Ort zu erzeugen, um die Klonierung des Fragments nach der Amplifikation zu unterstützen: 5' GAT GTT GTC GAC GGA GGT CCC CCA TGC 3' (SEQ ID Nr. 32), (SalI Ort ist fettgedruckt). Diese beiden Primer wurden mit der genomischen Frankia species DNA als Matrize in PCR-Reaktionen unter Verwendung von Vent^TM DNA-Polymerase verwendet, um ein 1,5 kb DNA-Fragment zu amplifizieren, das das FseI-Endonucleasegen enthielt. Die Bande wurde wie oben gelgereinigt. Die gereinigte DNA wurde mit 20 U NdeI und 20 U SalI in 1X NEBuffer 3 1 Stunde lang verdaut. Nach dem Inkubieren wurde der Verdau einmal mit einem 1 : 1-Gemisch aus Phenol : Chloroform und zweimal mit Chloroform extrahiert und mit 2 Volumen Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde durch Zentrifugation pelletiert, einmal in 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 20 μl TE resuspendiert. 3 μl des gereinigten Fragments (~ 0,05 μg) wurden in den T7 Expressionsvektor pAII17 (von S. Xu, New England Biolabs) ligiert, der mit NdeI und SalI (~ 0,05 μg) in einem Gesamtvolumen von 20 μl mit 400 U T4 DNA-Ligase bei 17°C 4 Stunden lang verdaut worden war. pAII17 ist ein T7 Expressionsvektor von pBR322, der einen lac-Operator 4 bp stromabwärts von dem T7 Promotor (genannt T7lac), das lacI^q Gen, Ampicillin-Resistenz und zwei Restriktionsorte zum Klonieren, NdeI und SalI (SalI anstelle von BamHI), enthält. pAII17 enthält außerdem vier Kopien vom rrnB Transkriptionsterminator stromaufwärts vom T7 Promotor, um das Grundniveau der Expression des Targetgens (paII17, konstruiert bei New England Biolabs von W. Jack) von pET-11a (Dubendorff, J. W. und Studier, F. W., J. Mol. Biol. 219: 45–59 (1991)) weiter zu verringern. 10 μl der Ligation wurden zum Transformieren kompetenter E. coli ER2417 verwendet, die zuvor mit dem auf dem kompatiblen Plasmid pNlaIH14 getragenen NlaI Methylasegen modifiziert wurden. [Der NlaI Methylierungserkennungsort GGCC kommt an jedem FseI Restriktionsendonuclease-Erkennungsort zweimal vor und somit wird durch die Methylierung durch NlaI die Wirts-DNA vor FseI-Verdau geschützt. pNlaIH14 stammt von pSYX20, einem Plasmid mit mittlerer Kopiezahl, das kan^r und Tc^r Gene und einen pSC101 Replikationsstartpunkt trägt. Ein in das Tc^r Gen eingesetzte Methylasegen kann konstitutiv vom Tc-Promotor exprimiert werden.] Die transformierten Zellen wurden auf L-Agar mit Ampicillin (100 μg/ml) und Kanamycin (50 μg/ml) plattiert. Plasmide wurden von individuellen Kolonien mit dem Mini-Plasmid-Prep-Verfahren wie im 5. Schritt beschrieben isoliert. NdeI und SalI Doppelverdaus von 5 μl jedes Minipreps wurden mit NdeI und SalI Doppelverdaus von pAII17 verglichen. Klone mit einem Insert von etwa 1,5 kb wurden für eine weitere Charakterisierung ausgewählt. Die Klone wurden in 200 ml L-Nährlösung mit Ampicillin und Kanamycin auf Klett 80 (mid-log-Phase) wachsen gelassen und mit 0,5 mM IPTG induziert. Zwei Stunden nach der Induktion wurden die Zellen (etwa 0,8 g) durch Zentrifugation geerntet, in 3 ml Beschallungspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA) resuspendiert und auf Eis beschallt. Der beschallte Zellextrakt wurde bei 16.000 rpm 20 Minuten lang zentrifugiert. 4,5 μl von jedem Extrakt wurden mit 75 μl eines DNA-Assay-Gemischs (mit 1 μg Adeno2 DNA je 50 μl in NEBuffer 1) vermischt. 25 μl aus diesem Röhrchen wurden mit 50 μl des DNA-Gemischs in einem zweiten Röhrchen (1 : 2-Verdünnung) vermischt. Es folgten drei weitere aufeinander folgende 1 : 2-Verdünnungen. Die Reaktionen wurden 1 Stunde lang bei 30°C inkubiert. 20 μl jeder Reaktion wurden auf einem 1% Agarosegel laufen gelassen. Alle getesteten Klone brachten FseI Restriktionsendonucleaseaktivität hervor. Es wurde geschätzt, dass der Enzymtiter über 1 × 10⁴ Einheiten/g Zellen lag. Einer dieser Klone wurde für eine weitere Charakterisierung ausgewählt und erhielt die Stammbezeichnung NEB NR. 918, wobei das Plasmid pRMFseR1 genannt wurde. Eine Titration der von Rohextrakten von NEB Nr. 918 produzierten FseI Restriktionsendonucleaseaktivität ist in 4 dargestellt.
8. Produktion: Die FseI Restriktionsendonuclease kann von NEB Nr. 918 durch Vermehrung bis zur späten log-Phase in einem Fermenter erzeugt werden, der reichhaltiges Medium mit Ampicillin (100 μg/ml) und Kanamycin (50 μg/ml) enthält. Die Kultur wird dann durch Zugabe von IPTG bis auf eine Endkonzentration von 0,5 mM induziert und 2 bis 4 Stunden lang weiter wachsen gelassen. Die Zellen werden anschließend durch Zentrifugation geerntet.
9. Reinigung der FseI Restriktionsendonuclease von NEB Nr. 918: Der Rohzellextrakt mit der FseI Endonuclease wurde durch eine Kombination von standardmäßigen Proteinreinigungstechniken wie Affinitätschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie wie im 2. Schritt oben gereinigt. Die aus dieser Reinigung hervorgehende FseI Restriktionsendonuclease war im Wesentlichen rein und frei von unspezifischer Endonuclease und Exonuclease.
Weitere Charakterisierung der FseI Endonuclease und Klonierung der FseI Methylase:
10. Restriktionssendonucleasespaltung von genomischer Frankia species DNA: Frankia species DNA wurde wie folgt mit Sau3AI gespalten, um einen Teilverdau zu erreichen: 450 μl Frankia species DNA zu 50 μg/ml in NEBuffer Sau3AI (100 mM NaCl, 10 mM Bis-Tris-Propan-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, pH 7,0 bei 25°) wurden in eine 100 μl Aliquote und sieben 50 μl Aliquoten aufgeteilt. Zu dem 100 μl Röhrchen wurden 5 Einheiten Sau3AI gegeben, um 1 Einheit Enzym je μg DNA zu erhalten. 50 μl wurden aus dem ersten Röhrchen genommen und in das zweite Röhrchen übertragen, um 0,5 Einheiten Sau3AI/μg zu erhalten, usw., wobei jedes folgende Röhrchen die Hälfte der vorherigen Menge von Sau3AI erhielt. Die Röhrchen wurden eine Stunde lang bei 37°C inkubiert, anschließend mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit 2 Volumen Ethanol präzipitiert, getrocknet und in 30 μl TE resuspendiert (TE = 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0), und es wurden jeweils 3 μl durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Röhrchen, die Verdauprodukte im Bereich von 9 bis 23 kb aufwiesen, wurden als Fragmentquelle zur Klonierung ausgewählt. Die separaten Reaktionen wurden miteinander vermischt und Fragmente des gewünschten Bereichs von 9 bis 23 kb wurden von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt wie oben beschrieben gelgereinigt und zur Bildung einer Bibliothek von Klonen verwendet.
11. Sau3AI-Bibliothek: Eine Sau3AI Genombibliothek wurde mit dem Vektor Lambda Dash^TM II (Stratagene) konstruiert. Lambda Dash^TM II ist ein Lambda-Substitutionsvektor, der zum Klonieren von DNA-Fragmenten von 9–23 kb verwendet werden kann. 250 ng (2 μl) von mit Sau3AI teilweise verdauter Frankia species DNA, wie oben beschrieben, wurden mit 500 ng BamHI-gespaltenen Lambda Dash^TM II Armen (0,5 μl) vermischt. 2,5 μl 2X Ligationsgemisch (100 mM Tris, pH 7,8, 20 mM MgCl₂, 20 mM DTT, 2 mM ATP) mit 1000 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und das Gemisch wurde 16 Stunden lang bei 17°C inkubiert. 2,5 μl der Ligationsreaktion wurden in vitro unter Verwendung von Gigapack^® II Plus (Stratagene) in infektiösen Phagenpartikeln gemäß Herstelleranweisungen verpackt. Nach einer 2-stündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die verpackten Phagen in 500 μl SM (SM = 100 mM NaCl, 8 mM MgSO₄, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,01 % Gelatine) plus drei Tropfen Chloroform verdünnt. Der Titer infektiöser Phagenpartikel wurde wie folgt bestimmt. 2 μl der verpackten Phagenlösung wurden in 198 μl SM verdünnt. 1 μl, 10 μl und 100 μl Aliquoten des verdünnten Phagen wurden zu 100 μl einer frischen Suspension von ER1458 Zellen (in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, OD₆₀₀ = 2,0) gegeben, 15 Minuten lang bei RT inkubiert, anschließend mit 3 ml Deckagar bei 40°C vermischt und auf reichhaltigen Platten verteilt. Nach dem Härten des Deckagars wurden die Platten über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Plaques wurden am nächsten Tag gezählt und der Titer des in nachfolgenden Experimenten verwendeten Phagenvorrats wurde mit 5 × 10⁴ pfu/ml errechnet.
12. Die in vitro verpackten Phagen wurden wie oben ausplattiert, um gut getrennte Plaques in Rasen von E. coli ER1458 zu bilden. Es wurden Platten von etwa 250, 500 und 1500 Phagen hergestellt. Nitrocellulosefilter-Plaquelifts dieser Klone von der Lambda Dash^TM II Sau3AI Bibliothek wurden mit einem radioaktiv markierten (Random Priming System I, Nr. 1550, New England Biolabs), gelgereinigten 1,65 kb PCR-Produkt (Benton-Davis-Verfahren, in: Molecular Cloning, a Laboratory Manual von T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982, S. 320 ff.) sondiert. Es wurden sechs positive Plaques identifiziert und alle wurden plaquegereinigt. DNA wurde von konfluenten Plattenlysaten (in Deckagarose) von 4 Phagen präpariert und mit SacI, KpnI und SalI verdaut. Alle vier enthielten ein gemeinsames 1,8 kb KpnI Fragment, mit dem die 1,65 kb Sonde hybridisierte.
13. Southern-Hybridisierung: Ein Southern-Blot wurde wie folgt präpariert: 1 μg Frankia species Genom-DNA wurde mit ApaI, AscI, BamHI, EagI, HindIII, KpnI, MscI, NotI, PstI, SacI, SalI, SmaI, SphI, StuI, XbaI oder XhoI verdaut. Die Verdaus wurden auf einem 0,7% Agarosegel der Elektrophorese unterworfen. Das Gel wurde 15 Minuten lang mit 0,25 M HCl (zwei Wechsel), anschließend mit 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl (zwei Wechsel) jeweils 15 Minuten lang und schließlich mit 1 M NH₄OAc, 0,02 M NaOH (zwei Wechsel) 30 Minuten lang gewaschen. Zum Übertragen der DNA auf Nitrocellulose wurde eine Nitrocelluloseschicht mit einer Porengröße von 0,45 μm in 1 M NH₄OAc, 0,02 M NaOH befeuchtet und ein Stück mit der gleichen Größe wie das Gel wurde auf beide Seiten des Gel gelegt. Dies wurde auf die Oberseite eines zwei Zoll hohen Stapels Papiertücher gelegt und ein weiterer zwei Zoll hoher Stapel Papiertücher wurde darauf gelegt. Eine Glasplatte wurde auf die Oberseite des Stapels gelegt und ein kleines Gewicht wurde auf die Platte gesetzt. Man ließ den DNA-Transfer über Nacht ablaufen. Die Nitrocellulose wurde getrocknet und eine Stunde lang bei 80°C gebacken.
Der Nitrocellulose-Blot wurde in 15 ml 50X Denhardt's (5 g Ficoll, 5 g Polyvinylpyrrolidon, 5 g BSA in 500 ml H₂O), 20 × SSC (175,3 g NaCl, 88,2 g Natriumcitrat in 1 l H₂O), 10% SDS und 10% Dextransulfat vorhybridisiert. Nach einer 1-stündigen Vorhybridisierung bei Raumtemperatur wurde die markierte Sonde (1,65 kb Amplifikationsprodukt, wie oben markiert) zugegeben und der Hybridisierungsschritt wurde über Nacht bei 68°C durchgeführt. Der Blot wurde mit 2 × SSC (drei Wechsel) und 2 × SSC mit 0,1% SDS (drei Wechsel) über einen Zeitraum von 1 Stunde bei 65°C gewaschen. Der Blot wurde 24 Stunden lang einem Röntgenfilm ausgesetzt.
Anhand dieses Blots und des Verdaumusters der Lambda-Klone wurde ein 3,6 kb SacI Fragment identifiziert, das die gesamte FseI Endonuclease und einen Teil des carboxylterminalen Endes des FseI Methylasegens enthielt, und von einem der Lambda-Phagen in pUC19 subkloniert. Ein 7,0 kb KpnI Fragment mit dem gesamten FseI Methylasegen und dem carboxylterminalen Ende des FseI-Endonucleasegens wurde ebenfalls in pUC19 subkloniert, wie auch ein 1,8 kb KpnI Fragment, das den restlichen aminoterminalen Teil des FseI-Endonucleasegens enthielt.
14. DNA-Sequenzierung: Eine DNA-Sequenzierung der FseI Endonuclease- und Methylasegene wurde mit dem Circumvent^TM DNA-Sequenzierungskit (New England Biolabs) und Sequenase^TM 2.0 Sequenzierungskit (United States Biochemicals) gemäß Herstelleranweisungen durchgeführt. Es wurden verschiedene Subklone hergestellt und synthetische Oligonucleotidprimer wurden synthetisiert, um die Sequenzierung zu erzielen. Miniprep-DNA-Präparationen wurden als Matrize verwendet. Die DNA-Sequenz lieferte Daten, die als Basis für anschließende Manipulationen verwendet wurden, um das FseI Methylasegen zu klonieren und das FseI Endonucleasegen zu reklonieren und die Expression dieser Gene in E. coli zu induzieren. Die DNA-Sequenz am Endonuclease-Beginn lautete 5' ATG ACC GAC GAG TTG TTT CCT ATC CCG GAG CCA TTG GTC 3" (SEQ ID Nr. 33). Diese translatierte in die Aminosäuresequenz M T D E L F P I P E P L V (SEQ ID Nr. 34). Die zweite Aminosäure der Endonuclease erwies sich somit als Threonin und nicht Histidin, wie ursprünglich anhand der Aminosäuresequenzierungsdaten aus Schritt 3 angenommen wurde. Es wurden der angebliche Beginn und das Ende des Methylasegens identifiziert, sowie ein Stoppcodon, das vermutlich das Ende der Endonuclease war. Es wurde beobachtet, dass die offenen Leseraster der Endonuclease- und Methylasegene um 12 Nucleotide überlappten. Die FseI Methylase wurde in einem kompatiblen Vektor exprimiert, um FseI Methylase zum Schutz des Wirtsgenoms vor FseI-Spaltung zu verwenden, und es erfolgte eine zweite Expression der Endonuclease, um das kanonische Threonin an der zweiten Position einzubauen und die FseI Methylase zum Schutz zu verwenden.
15. Methylaseklonierung: Zwei Primer wurden so gestaltet, dass sie das FseI-Methylasegen zum Klonieren in pSYX20 amplifizieren. Das FseI-Methylasegen wurde von genomischer Frankia species DNA mit VentTM DNA Polymerase amplifiziert. Das Amplifikationsprodukt von etwa 1100 bp wurde wie oben gelgereinigt, mit BamHI und SalI gespalten, mit Phenol-Chloroform extrahiert, präzipitiert und in pSYX20 Vektor ligiert, der zuvor mit BamHI und SalI gespalten wurde. Die Ligationsreaktion wurde in den E. coli Stamm ER2427 transformiert und individuelle Transformanten wurden mit dem Miniprep-Verfahren behandelt und mit BamHI und SalI verdaut. Transformanten mit dem korrekten Insert wurden isoliert.
16. Endonucleaseklonierung: Das Restriktionsendonucleasegen wurde durch Einsetzen des Gens in den Expressionsvektor pRRS direkt stromabwärts von einem starken induzierbaren Promotor (PlacUV5) und einer allgemein erkannten Ribosomenbindungsstelle exprimiert. Um dies zu erreichen, wurden zwei Oligonucleotidprimer unter Verwendung der DNA- und Protein-Sequenzdaten hergestellt. Der erste Oligonucleotidprimer enthielt einen BamHI-Ort, gefolgt von einem Stoppcodon „in-frame" mit dem lacZ Gen, um die Translation des lacZ-Proteins zu beenden, anschließend eine starke Ribosomenbindungsstelle, sieben Nucleotid-Spacer, den Beginn des FseI Endonucleasegens, ein Threonin-Codon anstelle von Histidin an Position 2, eine Änderung der Codon-Nutzung für Leucin an Aminosäure 5 und eine Sequenz komplementär zu Frankia species DNA zur Hybridisierung: 5' TAG GAT CCG GAG GTT TAA AAT ATG ACC GAC GAG CTG TTT CCT ATC C 3' (SEQ ID Nr. 35). Der Rückwärtsprimer befand sich am 3' Ende des Endonucleasegens und hatte einen hinzugefügten BamHI-Ort zur Klonierung: 5' TAA GGA TCC TCT AGA GCA GGT CGG 3' (SEQ ID Nr. 36). Diese beiden Primer wurden zum Amplifizieren des FseI-Endonucleasegens von genomischer Frankia species DNA durch Kombinieren der folgenden Bestandteile:
10 μl 10X Vent^TM Reaktionspuffer
8 μl 4 mM dNTP-Lösung
1 μl (200 ng) Frankia species DNA
5 μl (10 uM Stamm) Primer (SEQ ID Nr. 35)
5 μl (10 uM Stamm) Primer (SEQ ID Nr. 36)
71 μl dH₂O 0,5 μl Vent^TM Polymerase (2 Einheiten/μl Stamm)
und Amplifizieren bei 95°C (1 min), 56°C (1 min) und 72°C (1 min) über 25 Zyklen verwendet. Das Amplifikationsprodukt von etwa 700 bp wurde wie oben gelgereinigt, mit BamHI gespalten, mit Phenol-Chloroform extrahiert, präzipitiert und in pRRS Vektor ligiert, der zuvor mit BamHI gespalten und dephosphoryliert wurde. Die Ligationsreaktion wurde in den E. coli Stamm ER2427 transformiert, der zuvor mit dem auf dem kompatiblen Plasmid pSYX20 getragenen NlaI-Methylasegen modifiziert wurde. Es wurden individuelle Transformanten analysiert und mehrere FseI-Endonuclease Exprimierende gefunden. Es wurde geschätzt, dass der Enzymtiter größer als 1 × 10⁴ Einheiten/g Zellen war. Einer dieser Klone wurde für eine weitere Charakterisierung selektiert und erhielt die Stammbezeichnung NEB Nr. 943, wobei das Plasmid pRMFseR2 genannt wurde. Eine Probe von NEB Nr. 943 wurde am 18. Oktober 1994 bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung in Rockville, Maryland, mit der Beitritts-Nr. 69707 hinterlegt. Eine Titration der von Rohextrakten von NEB Nr. 943 produzierten FseI-Restriktionsendonucleaseaktivität ist in 5 dargestellt.
17. Die FseI-Restriktionsendonuclease kann von NEB Nr. 943 durch Vermehrung bis zur späten log-Phase in einem Fermenter mit reichhaltigem Medium mit Ampicillin (100 μg/ml), Kanamycin (50 μg/ml) und Chloramphenicol (15 μg/ml) produziert werden. Die Kultur wird dann durch Zugabe von IPTG bis auf eine Endkonzentration von 0,5 mM induziert und 2 bis 4 Stunden lang weiter wachsen gelassen. Die Zellen werden dann durch Zentrifugation geerntet.
18. Die Reinigung der FseI-Restriktionsendonuclease von NEB Nr. 943 fand wie für NEB Nr. 918 im Abschnitt 9 oben statt. Die aus dieser Reinigung hervorgehende FseI Restriktionsendonuclease war im Wesentlichen rein und frei von unspezifischer Endonuclease und Exonuclease.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isoliertes DNA-Segment, das die FseI Restriktionsendonuclease kodiert, wobei die isolierte DNA von dem Plasmid pRMFseR2 (ATCC Nr. 69707) erhältlich ist.
Rekombinanter Vektor, umfassend die isolierte DNA aus Anspruch 1.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 2, der das Plasmid pRMFseR2 umfasst.
Wirtszelle, die mit dem rekombinanten Vektor aus Anspruch 2 oder 3 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung von FseI Restriktionsendonuclease, umfassend das Kultivieren einer mit dem Vektor aus, Anspruch 2 oder 3 transformierten Wirtszelle unter Bedingungen zur Expression der genannten Endonuclease.
Isolierte DNA aus Anspruch 1, wobei die isolierte DNA SEQ ID Nr. 27 umfasst.