JPH0965884A - ＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼのクローニング及び製造法 - Google Patents
ＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼのクローニング及び製造法Info
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- JPH0965884A JPH0965884A JP8066393A JP6639396A JPH0965884A JP H0965884 A JPH0965884 A JP H0965884A JP 8066393 A JP8066393 A JP 8066393A JP 6639396 A JP6639396 A JP 6639396A JP H0965884 A JPH0965884 A JP H0965884A
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- saci
- gene
- sequence
- methylase
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メ
チラーゼをコードするＤＮＡ及び組換えＤＮＡ、及び該
ＤＮＡからＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼを製造する
方法を提供すること。 【解決手段】 ＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ又はＳ
ａｃＩ制限修飾系をコードするＤＮＡセグメントを挿入
した単離ＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換された
宿主細胞を、該エンドヌクレアーゼの発現に好適な条件
下に培養する。
チラーゼをコードするＤＮＡ及び組換えＤＮＡ、及び該
ＤＮＡからＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼを製造する
方法を提供すること。 【解決手段】 ＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ又はＳ
ａｃＩ制限修飾系をコードするＤＮＡセグメントを挿入
した単離ＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換された
宿主細胞を、該エンドヌクレアーゼの発現に好適な条件
下に培養する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＳａｃＩ制限エン
ドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換え
ＤＮＡ、並びに該組換えＤＮＡからＳａｃＩ制限エンド
ヌクレアーゼを製造する方法に関する。
ドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換え
ＤＮＡ、並びに該組換えＤＮＡからＳａｃＩ制限エンド
ヌクレアーゼを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】タイプ
II制限エンドヌクレアーゼは、細菌中に天然に産生する
酵素類であり、細菌の他の成分を取り除いて精製すれ
ば、実験室でＤＮＡ分子のクローニング及び遺伝子のキ
ャラクタリゼーション用に該分子を正確な断片に切断す
るのに用いることができる。
II制限エンドヌクレアーゼは、細菌中に天然に産生する
酵素類であり、細菌の他の成分を取り除いて精製すれ
ば、実験室でＤＮＡ分子のクローニング及び遺伝子のキ
ャラクタリゼーション用に該分子を正確な断片に切断す
るのに用いることができる。
【０００３】制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に
沿った特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識
し、該配列に結合することによって作用する。該酵素
は、一旦結合すると、分子を認識配列内又は該配列の一
方の端部で切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは
異なる認識配列に対して親和性を有する。現在までに検
査された数百もの細菌種の中から単一の特異性を有する
制限エンドヌクレアーゼが１８０個以上も同定された。
沿った特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識
し、該配列に結合することによって作用する。該酵素
は、一旦結合すると、分子を認識配列内又は該配列の一
方の端部で切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは
異なる認識配列に対して親和性を有する。現在までに検
査された数百もの細菌種の中から単一の特異性を有する
制限エンドヌクレアーゼが１８０個以上も同定された。
【０００４】細菌は、種毎にせいぜい極く少数の制限エ
ンドヌクレアーゼしか有していない傾向がある。一般に
エンドヌクレアーゼは、それらが由来する細菌に従って
命名されている。従って、例えばＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ種は、ＤｒａＩ、ＤｒａII
及びＤｒａIIIと称される３種の異なる制限エンドヌク
レアーゼを合成する。これらの酵素はそれぞれ、ＴＴＴ
ＡＡＡ，ＰｕＧＧＮＣＣＰｙ及びＣＡＣＮＮＮＧＴＧ配
列を認識して切断する。一方、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＲＹ１３は、ただ１つの酵素ＥｃｏＲＩを合
成し、配列ＧＡＡＴＴＣを認識する。
ンドヌクレアーゼしか有していない傾向がある。一般に
エンドヌクレアーゼは、それらが由来する細菌に従って
命名されている。従って、例えばＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ種は、ＤｒａＩ、ＤｒａII
及びＤｒａIIIと称される３種の異なる制限エンドヌク
レアーゼを合成する。これらの酵素はそれぞれ、ＴＴＴ
ＡＡＡ，ＰｕＧＧＮＣＣＰｙ及びＣＡＣＮＮＮＧＴＧ配
列を認識して切断する。一方、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＲＹ１３は、ただ１つの酵素ＥｃｏＲＩを合
成し、配列ＧＡＡＴＴＣを認識する。
【０００５】制限エンドヌクレアーゼは、実際に細菌細
胞を保護する防御的役割を果たすものと考えられる。制
限エンドヌクレアーゼは、細菌を破壊若しくはそれに寄
生するウイルス及びプラスミドのような外来ＤＮＡ分子
による感染に対する耐性を細菌に与える。制限エンドヌ
クレアーゼは、侵入する外来ＤＮＡ分子をその認識配列
が発生するたびに切断して耐性を付与する。感染性遺伝
子の多くは切断されると失活し、そのＤＮＡが非特異的
ヌクレアーゼによりさらに分解され易くなる。
胞を保護する防御的役割を果たすものと考えられる。制
限エンドヌクレアーゼは、細菌を破壊若しくはそれに寄
生するウイルス及びプラスミドのような外来ＤＮＡ分子
による感染に対する耐性を細菌に与える。制限エンドヌ
クレアーゼは、侵入する外来ＤＮＡ分子をその認識配列
が発生するたびに切断して耐性を付与する。感染性遺伝
子の多くは切断されると失活し、そのＤＮＡが非特異的
ヌクレアーゼによりさらに分解され易くなる。
【０００６】細菌の第２の保護系成分は修飾メチラーゼ
である。該酵素は、制限エンドヌクレアーゼと相補的で
あり、細菌が自身のＤＮＡを保護し、該ＤＮＡと外来の
感染性ＤＮＡとを区別し得る手段を提供する。修飾メチ
ラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識
配列を認識し、該配列に結合するが、ＤＮＡを切断する
代わりに、メチル基の付加により配列内のいずれかのヌ
クレオチドを化学修飾する。認識配列は、メチル化され
た後ではもはや制限ヌクレアーゼによって切断されな
い。細菌細胞のＤＮＡは、常にその修飾メチラーゼの作
用により完全に修飾され、従って、内在制限エンドヌク
レアーゼの存在に対しては完全に不感受性である。制限
エンドヌクレアーゼの認識及び切断に対して感受性を有
するのは、修飾されていない、従って外来であると同定
され得るＤＮＡのみである。
である。該酵素は、制限エンドヌクレアーゼと相補的で
あり、細菌が自身のＤＮＡを保護し、該ＤＮＡと外来の
感染性ＤＮＡとを区別し得る手段を提供する。修飾メチ
ラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識
配列を認識し、該配列に結合するが、ＤＮＡを切断する
代わりに、メチル基の付加により配列内のいずれかのヌ
クレオチドを化学修飾する。認識配列は、メチル化され
た後ではもはや制限ヌクレアーゼによって切断されな
い。細菌細胞のＤＮＡは、常にその修飾メチラーゼの作
用により完全に修飾され、従って、内在制限エンドヌク
レアーゼの存在に対しては完全に不感受性である。制限
エンドヌクレアーゼの認識及び切断に対して感受性を有
するのは、修飾されていない、従って外来であると同定
され得るＤＮＡのみである。
【０００７】遺伝子工学技術の到来により、現在では、
遺伝子をクローン化し、遺伝子がコードするタンパク質
及び酵素を慣用の精製技術により得られるよりも大量に
製造することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子のクローン単離の手掛かりは、クローンが１０-3〜
１０-4の程度の低い頻度で発生する場合に、そのような
クローンを、複合体「ライブラリー」、即ち「ショット
ガン」手順により誘導されたクローン集団内で同定する
簡単且つ信頼し得る方法を開発することである。該方法
は、不要な多数のクローンを破壊し、所望の少数のクロ
ーンを生存させるように選択的であるのが好ましい。
遺伝子をクローン化し、遺伝子がコードするタンパク質
及び酵素を慣用の精製技術により得られるよりも大量に
製造することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子のクローン単離の手掛かりは、クローンが１０-3〜
１０-4の程度の低い頻度で発生する場合に、そのような
クローンを、複合体「ライブラリー」、即ち「ショット
ガン」手順により誘導されたクローン集団内で同定する
簡単且つ信頼し得る方法を開発することである。該方法
は、不要な多数のクローンを破壊し、所望の少数のクロ
ーンを生存させるように選択的であるのが好ましい。
【０００８】タイプII制限修飾系は高頻度でクローン化
される。最初にクローン化された系は、制限エンドヌク
レアーゼクローンの同定又は選択手段としてバクテリオ
ファージ感染を用いた〔ＥｃｏＲII：Ｋｏｓｙｋｈら．
Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１７８：７１７−７
１９，（１９８０）；ＨｈａII：Ｍａｎｎら，Ｇｅｎ
ｅ，３：９７−１１２，（１９７８）；ＰｓｔＩ：Ｗａ
ｌｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
７８：１５０３−１５０７，（１９８１）〕。細菌中に
制限修飾系が存在すると、細菌がバクテリオファージ感
染に対して耐性を有し得るので、クローン化制限修飾遺
伝子を有する細胞は、原則として、ファージに暴露され
たライブラリーから生存細胞として選択的に単離され得
る。しかし該方法は、有用性が限定されていることが知
見された。具体的に言えば、クローン化制限修飾遺伝子
は必ずしも選択的生存を付与するに十分なファージ耐性
を示さないことがわかった。
される。最初にクローン化された系は、制限エンドヌク
レアーゼクローンの同定又は選択手段としてバクテリオ
ファージ感染を用いた〔ＥｃｏＲII：Ｋｏｓｙｋｈら．
Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１７８：７１７−７
１９，（１９８０）；ＨｈａII：Ｍａｎｎら，Ｇｅｎ
ｅ，３：９７−１１２，（１９７８）；ＰｓｔＩ：Ｗａ
ｌｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
７８：１５０３−１５０７，（１９８１）〕。細菌中に
制限修飾系が存在すると、細菌がバクテリオファージ感
染に対して耐性を有し得るので、クローン化制限修飾遺
伝子を有する細胞は、原則として、ファージに暴露され
たライブラリーから生存細胞として選択的に単離され得
る。しかし該方法は、有用性が限定されていることが知
見された。具体的に言えば、クローン化制限修飾遺伝子
は必ずしも選択的生存を付与するに十分なファージ耐性
を示さないことがわかった。
【０００９】別のクローン化法は、プラスミドによって
運搬されるものとして特徴付けられた系を最初にＥ．ｃ
ｏｌｉクローニングプラスミドに転移させることを含む
〔ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔら，Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３６５９−３６７６，（１
９８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ及びＢｒｏｏ
ｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８０：４０２−４０６，（１９８３）；Ｔｈｅｒｉ
ａｕｌｔ及びＲｏｙ，Ｇｅｎｅ，１９：３５５−３５９
（１９８２）；ＰｖｕII：Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら，
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６４：５０１−５０
９，（１９８５）〕。
運搬されるものとして特徴付けられた系を最初にＥ．ｃ
ｏｌｉクローニングプラスミドに転移させることを含む
〔ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔら，Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３６５９−３６７６，（１
９８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ及びＢｒｏｏ
ｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８０：４０２−４０６，（１９８３）；Ｔｈｅｒｉ
ａｕｌｔ及びＲｏｙ，Ｇｅｎｅ，１９：３５５−３５９
（１９８２）；ＰｖｕII：Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら，
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６４：５０１−５０
９，（１９８５）〕。
【００１０】第３の、より多くの系のクローン化に用い
られている方法は、活性メチラーゼ遺伝子の選択による
クローン化である〔１９８６年９月３日に公開されたＥ
ＰＯ特許出願公開第０１９３４１３号明細書及びＢｓｕ
ＲＩ：Ｋｉｓｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１
３：６４０３−６４２１，（１９８５）を参照された
い〕。制限遺伝子及び修飾遺伝子はしばしば近接して結
合するので、両遺伝子を同時にクローン化し得る場合が
多い。しかし、この選択により必ずしも完全な制限系が
得られるとは限らず、その代わりに、メチラーゼ遺伝子
のみが得られる〔ＢｓｐＲＩ：Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉ
ら，Ｇｅｎｅ，１０：２１９−２２５，（１９８０）；
ＢｃｎＩ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓら，Ｇｅｎｅ，２０：
１９７−２０４（１９８２）；ＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓ及
びＢａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ，２１：１１１−１１９，
（１９８３）；並びにＭｓｐＩ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８：１２３５−１２４１，
（１９８３）〕。
られている方法は、活性メチラーゼ遺伝子の選択による
クローン化である〔１９８６年９月３日に公開されたＥ
ＰＯ特許出願公開第０１９３４１３号明細書及びＢｓｕ
ＲＩ：Ｋｉｓｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１
３：６４０３−６４２１，（１９８５）を参照された
い〕。制限遺伝子及び修飾遺伝子はしばしば近接して結
合するので、両遺伝子を同時にクローン化し得る場合が
多い。しかし、この選択により必ずしも完全な制限系が
得られるとは限らず、その代わりに、メチラーゼ遺伝子
のみが得られる〔ＢｓｐＲＩ：Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉ
ら，Ｇｅｎｅ，１０：２１９−２２５，（１９８０）；
ＢｃｎＩ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓら，Ｇｅｎｅ，２０：
１９７−２０４（１９８２）；ＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓ及
びＢａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ，２１：１１１−１１９，
（１９８３）；並びにＭｓｐＩ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８：１２３５−１２４１，
（１９８３）〕。
【００１１】より最近になって、ｄｉｎＤ：：ｌａｃＺ
融合を含むＥ．ｃｏｌｉのインジケーター株をベースと
するＥ．ｃｏｌｉ中の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
直接クローニング法〔「エンド−ブルー法」（ｅｎｄｏ
−ｂｌｕｅ ｍｅｔｈｏｄ）〕が記載された〔Ｆｏｍｅ
ｎｋｏｖら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：
２３９９−２４０３（１９９４）〕。該方法は、エンド
ヌクレアーゼ又は非特異的ヌクレアーゼによるＤＮＡ損
傷後のＥ．ｃｏｌｉのＳＯＳ応答を利用する。多くの熱
安定性ヌクレアーゼ遺伝子（Ｔｔｈ１１１Ｉ，ＢｓｏＢ
Ｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓヌクレアーゼ）が該方法（係属特許
出願）によりクローン化された。
融合を含むＥ．ｃｏｌｉのインジケーター株をベースと
するＥ．ｃｏｌｉ中の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
直接クローニング法〔「エンド−ブルー法」（ｅｎｄｏ
−ｂｌｕｅ ｍｅｔｈｏｄ）〕が記載された〔Ｆｏｍｅ
ｎｋｏｖら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：
２３９９−２４０３（１９９４）〕。該方法は、エンド
ヌクレアーゼ又は非特異的ヌクレアーゼによるＤＮＡ損
傷後のＥ．ｃｏｌｉのＳＯＳ応答を利用する。多くの熱
安定性ヌクレアーゼ遺伝子（Ｔｔｈ１１１Ｉ，ＢｓｏＢ
Ｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓヌクレアーゼ）が該方法（係属特許
出願）によりクローン化された。
【００１２】Ｅ．ｃｏｌｉのこれらの系のクローニング
を妨げる他の障害が種々のメチラーゼのクローニングプ
ロセス中に発見された。多くのＥ．ｃｏｌｉ株（クロー
ニングに通常用いられているものを含む）は、シトシン
のメチル化を含むＤＮＡの導入に抵抗する系を有する。
〔Ｒａｌｅｉｇｈ及びＷｉｌｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８３：９０７０−９
０７４，（１９８６）〕。従って、クローニングに、ど
のＥ．ｃｏｌｉ株を用いるかを慎重に検討することも必
要である。
を妨げる他の障害が種々のメチラーゼのクローニングプ
ロセス中に発見された。多くのＥ．ｃｏｌｉ株（クロー
ニングに通常用いられているものを含む）は、シトシン
のメチル化を含むＤＮＡの導入に抵抗する系を有する。
〔Ｒａｌｅｉｇｈ及びＷｉｌｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８３：９０７０−９
０７４，（１９８６）〕。従って、クローニングに、ど
のＥ．ｃｏｌｉ株を用いるかを慎重に検討することも必
要である。
【００１３】精製された制限エンドヌクレアーゼ及びと
きに修飾メチラーゼも、実験室における遺伝子のキャラ
クタリゼーションに有用なツールなので、該酵素を大量
に合成する組換えＤＮＡ技術による細菌株製造の工業化
が求められている。そのような株は、精製プロセスを簡
易化すると共に、商品化に有用な量を製造する手段を提
供するので有用である。
きに修飾メチラーゼも、実験室における遺伝子のキャラ
クタリゼーションに有用なツールなので、該酵素を大量
に合成する組換えＤＮＡ技術による細菌株製造の工業化
が求められている。そのような株は、精製プロセスを簡
易化すると共に、商品化に有用な量を製造する手段を提
供するので有用である。
【００１４】外来制限修飾系をクローン化してＥ．ｃｏ
ｌｉに導入したときに、恐らくＥ．ｃｏｌｉにおける遺
伝子の不十分な転写又は翻訳により、メチラーゼ及びエ
ンドヌクレアーゼの収率が天然のエンドヌクレアーゼ産
生株に比べて極めて低い場合がある。これは、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ中でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ遺伝子をクローニン
グする場合、２種の微生物が異なるＧＣ含量を有するた
めに、特によく認められる。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
遺伝子がＥ．ｃｏｌｉ中で十分に発現し、効率的な遺伝
子発現に基づいて選択され得るクローニング系をもつこ
とが望ましい。
ｌｉに導入したときに、恐らくＥ．ｃｏｌｉにおける遺
伝子の不十分な転写又は翻訳により、メチラーゼ及びエ
ンドヌクレアーゼの収率が天然のエンドヌクレアーゼ産
生株に比べて極めて低い場合がある。これは、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ中でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ遺伝子をクローニン
グする場合、２種の微生物が異なるＧＣ含量を有するた
めに、特によく認められる。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
遺伝子がＥ．ｃｏｌｉ中で十分に発現し、効率的な遺伝
子発現に基づいて選択され得るクローニング系をもつこ
とが望ましい。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、メチラーゼ選
択法により、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来のＳａｃＩ
制限エンドヌクレアーゼをＥ．ｃｏｌｉにクローニング
する方法に関する。先ず、ライブラリー構築中にｐＢＲ
３２２及びｐＵＣ１９のような標準的なクローニングベ
クターを用いて、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子をクローン
化する標準メチラーゼ遺伝子選択法を試みた。ＳａｃＩ
メチラーゼ遺伝子のクローニングは、恐らくはＥ．ｃｏ
ｌｉ中のＳａｃＩメチラーゼ遺伝子の発現度が低いため
に、慣用のクローニングベクターを用いてもうまくいか
なかった。ＳａｃＩメチラーゼがＥ．ｃｏｌｉ中で効率
的に発現しなければ、プラスミド上のＳａｃＩ部位はメ
チラーゼによって効率的に修飾されない。その結果、プ
ラスミドは切断され、ＳａｃＩエンドヌクレアーゼによ
るチャンレンジの後、プラスミドライブラリー中に失わ
れる。標準メチラーゼ選択が機能しなかったので、「エ
ンド−ブルー法」を用いてＳａｃＩエンドヌクレアーゼ
遺伝子をクローン化した。２０個以上のクローンを同定
したが、いずれも検出し得る程のＳａｃＩエンドヌクレ
アーゼ活性を有していなかった。ＰＣＲ ＤＮＡ増幅を
用いる第２の方法により、ＳａｃＩエンドヌクレアーゼ
遺伝子の開始部をクローン化した。ＳａｃＩタンパク質
Ｎ末端配列に基づいて変性プライマーを形成し、該プラ
イマーを８７ｂｐ（２９コドン）コーディング配列の増
幅に用いた。短鎖のＰＣＲ産物を得、ｐＵＣ１９にクロ
ーン化し、ＤＮＡ配列を決定した。該ＰＣＲ産物はプラ
イマー多量体であることが判明した。
択法により、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来のＳａｃＩ
制限エンドヌクレアーゼをＥ．ｃｏｌｉにクローニング
する方法に関する。先ず、ライブラリー構築中にｐＢＲ
３２２及びｐＵＣ１９のような標準的なクローニングベ
クターを用いて、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子をクローン
化する標準メチラーゼ遺伝子選択法を試みた。ＳａｃＩ
メチラーゼ遺伝子のクローニングは、恐らくはＥ．ｃｏ
ｌｉ中のＳａｃＩメチラーゼ遺伝子の発現度が低いため
に、慣用のクローニングベクターを用いてもうまくいか
なかった。ＳａｃＩメチラーゼがＥ．ｃｏｌｉ中で効率
的に発現しなければ、プラスミド上のＳａｃＩ部位はメ
チラーゼによって効率的に修飾されない。その結果、プ
ラスミドは切断され、ＳａｃＩエンドヌクレアーゼによ
るチャンレンジの後、プラスミドライブラリー中に失わ
れる。標準メチラーゼ選択が機能しなかったので、「エ
ンド−ブルー法」を用いてＳａｃＩエンドヌクレアーゼ
遺伝子をクローン化した。２０個以上のクローンを同定
したが、いずれも検出し得る程のＳａｃＩエンドヌクレ
アーゼ活性を有していなかった。ＰＣＲ ＤＮＡ増幅を
用いる第２の方法により、ＳａｃＩエンドヌクレアーゼ
遺伝子の開始部をクローン化した。ＳａｃＩタンパク質
Ｎ末端配列に基づいて変性プライマーを形成し、該プラ
イマーを８７ｂｐ（２９コドン）コーディング配列の増
幅に用いた。短鎖のＰＣＲ産物を得、ｐＵＣ１９にクロ
ーン化し、ＤＮＡ配列を決定した。該ＰＣＲ産物はプラ
イマー多量体であることが判明した。
【００１６】Ｅ．ｃｏｌｉ中のＳａｃＩメチラーゼ遺伝
子の発現を増大させるために、ｐＲＲＳと称されるｌａ
ｃＵＶ５プロモーターを含む高コピー数のプラスミド
（Ｓｋｏｇｌｕｎｄら，Ｇｅｎｅ，８８：１−５，１９
９０）を用いて、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子をクローン
化し、メチラーゼ選択に用いた。ＳａｃＩメチラーゼ遺
伝子を、ｐＲＲＳ中、以下の４段階で連続的にクローン
化した：（１）Ｓａｕ３ＡＩ部分消化ゲノムＤＮＡとＢ
ａｍＨＩ切断／ＣＩＰ処理ｐＲＲＳの結合、及び結合さ
れたＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉ ＲＲ１コンピテント細胞へ
の形質転換；（２）混合プラスミドライブラリーの形
成；（３）プラスミドＤＮＡライブラリーのＳａｃＩ消
化及びチャレンジされたＤＮＡのＲＲ１細胞への再形質
転換；（４）生存細胞中のＳａｃＩ耐性プラスミドのス
クリーニング。ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子をクローン化
した後、メチラーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡ断片のクロ
ーン化を試みた。通常、特定の制限修飾系中のメチラー
ゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子は互いに隣り合
って位置している。コロニーハイブリダイゼーションを
用い、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子及び隣接ＤＮＡを含む
大型挿入物についてプラスミドライブラリーをスクリー
ニングした。大型挿入物を同定しようとする試みは失敗
に帰した。ＳａｃＩエンドヌクレアーゼ遺伝子をクロー
ン化するためには、適合し得るプラスミド中のＳａｃＩ
エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現を増大させる必要があ
ることがわかった。ＡＴＧ開始コドン〔ＧＧＡＧＧＴＡ
ＡＡＴＡＡ（配列番号１）〕の前に６ｂｐのスペーシン
グ（ｓｐａｃｉｎｇ）を含む良好なリボソーム結合部を
合成した。ｓａｃＩＭ遺伝子がＴｅｔプロモーターによ
り作動するように、良好なリボソーム結合部位を含むＳ
ａｃＩメチラーゼ遺伝子をｐＬＧ３３９（中コピー数ベ
クター）のＴｅｔR遺伝子のＳａｌＩ部位にクローン化
した。Ｅ．ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡはＳａｃＩメチラーゼ
により完全に修飾される。予備保護した宿主を作製した
後、２段階の逆ＰＣＲによりＳａｃＩエンドヌクレアー
ゼ遺伝子をクローン化した。第１の逆ＰＣＲはＳａｃＩ
エンドヌクレアーゼ遺伝子の７０％を含み、第２の逆Ｐ
ＣＲは残りの遺伝子を含んでいた。ポリメラーゼ連鎖反
応によりゲノムＤＮＡ由来の遺伝子を増幅し、ＳａｃＩ
エンドヌクレアーゼ遺伝子全体をクローン化して、ｐＲ
ＲＳベクターに挿入した。
子の発現を増大させるために、ｐＲＲＳと称されるｌａ
ｃＵＶ５プロモーターを含む高コピー数のプラスミド
（Ｓｋｏｇｌｕｎｄら，Ｇｅｎｅ，８８：１−５，１９
９０）を用いて、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子をクローン
化し、メチラーゼ選択に用いた。ＳａｃＩメチラーゼ遺
伝子を、ｐＲＲＳ中、以下の４段階で連続的にクローン
化した：（１）Ｓａｕ３ＡＩ部分消化ゲノムＤＮＡとＢ
ａｍＨＩ切断／ＣＩＰ処理ｐＲＲＳの結合、及び結合さ
れたＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉ ＲＲ１コンピテント細胞へ
の形質転換；（２）混合プラスミドライブラリーの形
成；（３）プラスミドＤＮＡライブラリーのＳａｃＩ消
化及びチャレンジされたＤＮＡのＲＲ１細胞への再形質
転換；（４）生存細胞中のＳａｃＩ耐性プラスミドのス
クリーニング。ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子をクローン化
した後、メチラーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡ断片のクロ
ーン化を試みた。通常、特定の制限修飾系中のメチラー
ゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子は互いに隣り合
って位置している。コロニーハイブリダイゼーションを
用い、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子及び隣接ＤＮＡを含む
大型挿入物についてプラスミドライブラリーをスクリー
ニングした。大型挿入物を同定しようとする試みは失敗
に帰した。ＳａｃＩエンドヌクレアーゼ遺伝子をクロー
ン化するためには、適合し得るプラスミド中のＳａｃＩ
エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現を増大させる必要があ
ることがわかった。ＡＴＧ開始コドン〔ＧＧＡＧＧＴＡ
ＡＡＴＡＡ（配列番号１）〕の前に６ｂｐのスペーシン
グ（ｓｐａｃｉｎｇ）を含む良好なリボソーム結合部を
合成した。ｓａｃＩＭ遺伝子がＴｅｔプロモーターによ
り作動するように、良好なリボソーム結合部位を含むＳ
ａｃＩメチラーゼ遺伝子をｐＬＧ３３９（中コピー数ベ
クター）のＴｅｔR遺伝子のＳａｌＩ部位にクローン化
した。Ｅ．ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡはＳａｃＩメチラーゼ
により完全に修飾される。予備保護した宿主を作製した
後、２段階の逆ＰＣＲによりＳａｃＩエンドヌクレアー
ゼ遺伝子をクローン化した。第１の逆ＰＣＲはＳａｃＩ
エンドヌクレアーゼ遺伝子の７０％を含み、第２の逆Ｐ
ＣＲは残りの遺伝子を含んでいた。ポリメラーゼ連鎖反
応によりゲノムＤＮＡ由来の遺伝子を増幅し、ＳａｃＩ
エンドヌクレアーゼ遺伝子全体をクローン化して、ｐＲ
ＲＳベクターに挿入した。
【００１７】
【発明の実施の形態】ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子及びエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子をクローン化して発現させる本
明細書に記載の方法は、図１に示され、以下の段階を含
む： １．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎ
ｅｓのゲノムＤＮＡを精製する。
ンドヌクレアーゼ遺伝子をクローン化して発現させる本
明細書に記載の方法は、図１に示され、以下の段階を含
む： １．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎ
ｅｓのゲノムＤＮＡを精製する。
【００１８】２．該ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩのような制限
エンドヌクレアーゼ又はその任意のアイソシゾマーで部
分的に消化し、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子全体を含むＤ
ＮＡ断片を形成する。あるいは、ＡｐａＬＩ、ＳａｃII
又はＳａｌＩゲノムライブラリーのような制限修飾系全
体を含むライブラリーを形成してもよい。さらに断片
は、クローン化し得るサイズ、即ち、２〜２０ｋｂの範
囲のものでなければならない。３．Ｓａｕ３ＡＩ消化ゲ
ノムＤＮＡをＢａｍＨＩ切断／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９ク
ローニングベクターに共有結合させるのが好ましい。得
られた混合物を用いて、適切な宿主、即ち、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ株ＲＲ１のようなｈｓｄＲ-、ｍｃｒＢＣ-、mrr-株を
形質転換する。ＤＮＡ／細胞混合物を形質転換細胞用の
アンピシリン選択培地上に置く。インキュベーション
後、形質転換細胞のコロニーを一緒に収穫して、一次細
胞ライブラリーを形成する。
エンドヌクレアーゼ又はその任意のアイソシゾマーで部
分的に消化し、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子全体を含むＤ
ＮＡ断片を形成する。あるいは、ＡｐａＬＩ、ＳａｃII
又はＳａｌＩゲノムライブラリーのような制限修飾系全
体を含むライブラリーを形成してもよい。さらに断片
は、クローン化し得るサイズ、即ち、２〜２０ｋｂの範
囲のものでなければならない。３．Ｓａｕ３ＡＩ消化ゲ
ノムＤＮＡをＢａｍＨＩ切断／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９ク
ローニングベクターに共有結合させるのが好ましい。得
られた混合物を用いて、適切な宿主、即ち、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ株ＲＲ１のようなｈｓｄＲ-、ｍｃｒＢＣ-、mrr-株を
形質転換する。ＤＮＡ／細胞混合物を形質転換細胞用の
アンピシリン選択培地上に置く。インキュベーション
後、形質転換細胞のコロニーを一緒に収穫して、一次細
胞ライブラリーを形成する。
【００１９】４．組換え体プラスミドを一次細胞ライブ
ラリーから完全に精製して一次プラスミドライブラリー
を形成する。次いで、精製されたプラスミドライブラリ
ーをＳａｃＩエンドヌクレアーゼ又は任意のＳａｃＩア
イソシゾマーでｉｎ ｖｉｔｒｏで完全に消化する。Ｓ
ａｃＩエンドヌクレアーゼ消化により、非修飾、無メチ
ラーゼクローンの選択的破壊が発生し、ＳａｃＩメチラ
ーゼ含有クローンの相対頻度が増大する。
ラリーから完全に精製して一次プラスミドライブラリー
を形成する。次いで、精製されたプラスミドライブラリ
ーをＳａｃＩエンドヌクレアーゼ又は任意のＳａｃＩア
イソシゾマーでｉｎ ｖｉｔｒｏで完全に消化する。Ｓ
ａｃＩエンドヌクレアーゼ消化により、非修飾、無メチ
ラーゼクローンの選択的破壊が発生し、ＳａｃＩメチラ
ーゼ含有クローンの相対頻度が増大する。
【００２０】５．ＳａｃＩメチラーゼクローンの同定：
消化されたプラスミドライブラリーＤＮＡをＥ．ｃｏ
ｌｉ株ＲＲ１のような宿主に再形質転換し、アンピシリ
ンプレート上で平板培養して再形質転換コロニーを得
る。該コロニーを取り出し、そのプラスミドＤＮＡを形
成し、精製されたプラスミドＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ
でＳａｃＩエンドヌクレアーゼと共にインキュベートし
て、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子の存在について分析し、
該遺伝子がＳａｃＩ消化に対して耐性を有するかどうか
を決定する。
消化されたプラスミドライブラリーＤＮＡをＥ．ｃｏ
ｌｉ株ＲＲ１のような宿主に再形質転換し、アンピシリ
ンプレート上で平板培養して再形質転換コロニーを得
る。該コロニーを取り出し、そのプラスミドＤＮＡを形
成し、精製されたプラスミドＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ
でＳａｃＩエンドヌクレアーゼと共にインキュベートし
て、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子の存在について分析し、
該遺伝子がＳａｃＩ消化に対して耐性を有するかどうか
を決定する。
【００２１】６．メチラーゼ遺伝子がクローン化された
ら、該クローンを制限マッピング及び欠失マッピングに
より分析する。挿入体全体を配列決定して、ＳａｃＩメ
チラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を決定する。
ら、該クローンを制限マッピング及び欠失マッピングに
より分析する。挿入体全体を配列決定して、ＳａｃＩメ
チラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を決定する。
【００２２】７．メチラーゼ遺伝子配列を決定したら、
メチラーゼ遺伝子の開始部及び末端部にアニーリングす
る２セットのプライマーを設計する。逆ＰＣＲを用い
て、メチラーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡを増幅する。
メチラーゼ遺伝子の開始部及び末端部にアニーリングす
る２セットのプライマーを設計する。逆ＰＣＲを用い
て、メチラーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡを増幅する。
【００２３】８．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒ
ｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡは、ＡｐａＬＩ、Ｂｓｒ
ＦＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、ＨａｅII、ＮｇｏＭＩ、Ｐ
ｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＳａｃII若しくはＴａｑＩ制限酵素
又は、逆ＰＣＲ反応用の妥当なサイズの鋳型ＤＮＡ（３
ｋｂ未満）を産生させる任意の他の制限酵素で消化する
のが好ましい。消化したＤＮＡを低ＤＮＡ濃度（１ｍｌ
当たり２μｇ未満）で自己連結させる。連結した環状Ｄ
ＮＡを、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子の末端にアニーリン
グするプライマーセットを用いる逆ＰＣＲ反応用の鋳型
として用いる。
ｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡは、ＡｐａＬＩ、Ｂｓｒ
ＦＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、ＨａｅII、ＮｇｏＭＩ、Ｐ
ｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＳａｃII若しくはＴａｑＩ制限酵素
又は、逆ＰＣＲ反応用の妥当なサイズの鋳型ＤＮＡ（３
ｋｂ未満）を産生させる任意の他の制限酵素で消化する
のが好ましい。消化したＤＮＡを低ＤＮＡ濃度（１ｍｌ
当たり２μｇ未満）で自己連結させる。連結した環状Ｄ
ＮＡを、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子の末端にアニーリン
グするプライマーセットを用いる逆ＰＣＲ反応用の鋳型
として用いる。
【００２４】９．逆ＰＣＲ産物を得た後、ＤＮＡをＴ４
ＤＮＡキナーゼ及びＤＮＡポリメラーゼで処理し、Ｈ
ｉｎｃII切断／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９ベクターにクロー
ン化する。挿入体全体を配列決定し、そのＤＮＡ配列を
全６個の読み取り枠でアミノ酸配列に翻訳し、次いでＳ
ａｃＩＮ末端タンパク質配列に対するアミノ酸配列と比
較する。２７個のアミノ酸がＳａｃＩタンパク質配列と
同一である８０４ｂｐの読み取り枠１個を同定する。８
０４ｂｐ配列の末端には終結コドンが見あたらず、これ
は、ＳａｃＩエンドヌクレアーゼ遺伝子がまだ終結して
いないことを示している。
ＤＮＡキナーゼ及びＤＮＡポリメラーゼで処理し、Ｈ
ｉｎｃII切断／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９ベクターにクロー
ン化する。挿入体全体を配列決定し、そのＤＮＡ配列を
全６個の読み取り枠でアミノ酸配列に翻訳し、次いでＳ
ａｃＩＮ末端タンパク質配列に対するアミノ酸配列と比
較する。２７個のアミノ酸がＳａｃＩタンパク質配列と
同一である８０４ｂｐの読み取り枠１個を同定する。８
０４ｂｐ配列の末端には終結コドンが見あたらず、これ
は、ＳａｃＩエンドヌクレアーゼ遺伝子がまだ終結して
いないことを示している。
【００２５】１０．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈ
ｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡを、ＡａｔII、Ａｐａ
Ｉ、ＢｓａＷＩ、ＢｓｓＨＩ、ＥａｅＩ、ＨａｅII、Ｍ
ｓｅＩ、ＮｃｏＩ、ＮｌａIII、ＰｖｕＩ若しくはＴａ
ｑＩ制限酵素又は、 逆ＰＣＲ反応用の妥当なサイズの鋳
型ＤＮＡ（３ｋｂ未満）を産生させる任意の他の制限酵
素で消化する。消化されたＤＮＡを低ＤＮＡ濃度（１ｍ
ｌ当たり２μｇ未満）で自己連結させる。連結した環状
ＤＮＡを、８０４ｂｐの読み取り枠の末端にアニーリン
グするプライマーセットを用いる逆ＰＣＲ反応用の鋳型
として用いる。逆ＰＣＲ産物を得た後、ＤＮＡをＴ４
ＤＮＡキナーゼ及びＤＮＡポリメラーゼで処理し、Ｈｉ
ｎｃII切断／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９ベクターにクローン
化する。挿入体を終結コドンが見つかるまで配列決定す
る。完全なＳａｃＩエンドヌクレアーゼ遺伝子は１０７
７ｂｐであることが判明した。該遺伝子を２段階の逆Ｐ
ＣＲによりクローン化した。
ｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡを、ＡａｔII、Ａｐａ
Ｉ、ＢｓａＷＩ、ＢｓｓＨＩ、ＥａｅＩ、ＨａｅII、Ｍ
ｓｅＩ、ＮｃｏＩ、ＮｌａIII、ＰｖｕＩ若しくはＴａ
ｑＩ制限酵素又は、 逆ＰＣＲ反応用の妥当なサイズの鋳
型ＤＮＡ（３ｋｂ未満）を産生させる任意の他の制限酵
素で消化する。消化されたＤＮＡを低ＤＮＡ濃度（１ｍ
ｌ当たり２μｇ未満）で自己連結させる。連結した環状
ＤＮＡを、８０４ｂｐの読み取り枠の末端にアニーリン
グするプライマーセットを用いる逆ＰＣＲ反応用の鋳型
として用いる。逆ＰＣＲ産物を得た後、ＤＮＡをＴ４
ＤＮＡキナーゼ及びＤＮＡポリメラーゼで処理し、Ｈｉ
ｎｃII切断／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９ベクターにクローン
化する。挿入体を終結コドンが見つかるまで配列決定す
る。完全なＳａｃＩエンドヌクレアーゼ遺伝子は１０７
７ｂｐであることが判明した。該遺伝子を２段階の逆Ｐ
ＣＲによりクローン化した。
【００２６】１１．次いで、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子
をｐＳＣ１０１誘導体にクローン化して、Ｅ．ｃｏｌｉ
宿主を予備修飾する。２つのプライマーを用いてＰＣＲ
によりＳａｃＩエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅す
る。前進プライマーは、ＡＴＧ開始コドンの前に、リボ
ソーム結合部位及び７ｂｐのスペーシングを含んでい
る。次いでＳａｃＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を発現ベ
クターｐＲＲＳにクローン化し、ＳａｃＩメチラーゼ予
備修飾細胞に形質転換する。
をｐＳＣ１０１誘導体にクローン化して、Ｅ．ｃｏｌｉ
宿主を予備修飾する。２つのプライマーを用いてＰＣＲ
によりＳａｃＩエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅す
る。前進プライマーは、ＡＴＧ開始コドンの前に、リボ
ソーム結合部位及び７ｂｐのスペーシングを含んでい
る。次いでＳａｃＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を発現ベ
クターｐＲＲＳにクローン化し、ＳａｃＩメチラーゼ予
備修飾細胞に形質転換する。
【００２７】
【実施例】以下の実施例は、現在実施するのに好ましい
本発明の実施態様を例示するために記載されている。該
実施例は本発明を例示するものであって限定するもので
はなく、本発明は、添付特許請求の範囲によってのみ限
定されるものとする。
本発明の実施態様を例示するために記載されている。該
実施例は本発明を例示するものであって限定するもので
はなく、本発明は、添付特許請求の範囲によってのみ限
定されるものとする。
【００２８】実施例１ ＳａｃＩ制限修飾系のクローニング １．「エンド−ブルー法」を用いたＳａｃＩエンドヌク
レアーゼ遺伝子のクローン化。
レアーゼ遺伝子のクローン化。
【００２９】Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中でのＳａｃＩエンドヌ
クレアーゼ遺伝子の発現度が低い場合、「エンド−ブル
ー法」を用い、ＳａｃＩメチラーゼを保護することな
く、エンドヌクレアーゼ遺伝子を直接Ｅ．ｃｏｌｉにク
ローン化し得る。Ｓａｕ３ＡＩ部分消化ＳａｃＩゲノム
ＤＮＡをＢａｍＨＩ消化／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９に結合
し、ｄｉｎ１：：ｌａｃＺ融合体を有するＥ．ｃｏｌｉ
インジケーター株に形質転換し、Ｘ−ｇａｌインジケー
タープレート上で平板培養した。１０，０００ＡｐR形
質転換細胞中に２６個のブルーコロニーを見いだした。
これらのブルー単離体全てからプラスミドＤＮＡを調製
し、ＳａｃＩＮ末端タンパク質配列から設計した変性プ
ローブとのハイブリダイゼーションに用いた。１個のプ
ラスミドがプローブにハイブリダイズしたことが認めら
れた。該プラスミド中の挿入体についてＤＮＡ配列を決
定した。翻訳されたアミノ酸配列とＳａｃＩタンパク質
配列との間には、４個のアミノ酸からなる配列（ｓｔｒ
ｅｔｃｈ）が同一であること以外には何ら有意な同一性
は認められなかった。これら４個のアミノ酸残基を含む
アミノ酸配列から変性プローブを設計した。ブルー単離
体全ての細胞抽出物にはＳａｃＩ活性は全く見られなか
った。
クレアーゼ遺伝子の発現度が低い場合、「エンド−ブル
ー法」を用い、ＳａｃＩメチラーゼを保護することな
く、エンドヌクレアーゼ遺伝子を直接Ｅ．ｃｏｌｉにク
ローン化し得る。Ｓａｕ３ＡＩ部分消化ＳａｃＩゲノム
ＤＮＡをＢａｍＨＩ消化／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９に結合
し、ｄｉｎ１：：ｌａｃＺ融合体を有するＥ．ｃｏｌｉ
インジケーター株に形質転換し、Ｘ−ｇａｌインジケー
タープレート上で平板培養した。１０，０００ＡｐR形
質転換細胞中に２６個のブルーコロニーを見いだした。
これらのブルー単離体全てからプラスミドＤＮＡを調製
し、ＳａｃＩＮ末端タンパク質配列から設計した変性プ
ローブとのハイブリダイゼーションに用いた。１個のプ
ラスミドがプローブにハイブリダイズしたことが認めら
れた。該プラスミド中の挿入体についてＤＮＡ配列を決
定した。翻訳されたアミノ酸配列とＳａｃＩタンパク質
配列との間には、４個のアミノ酸からなる配列（ｓｔｒ
ｅｔｃｈ）が同一であること以外には何ら有意な同一性
は認められなかった。これら４個のアミノ酸残基を含む
アミノ酸配列から変性プローブを設計した。ブルー単離
体全ての細胞抽出物にはＳａｃＩ活性は全く見られなか
った。
【００３０】２．ＰＣＲを用いたＳａｃＩエンドヌクレ
アーゼ遺伝子の開始部の増幅。
アーゼ遺伝子の開始部の増幅。
【００３１】ＳａｃＩタンパク質のＮ末端配列は、
（Ｍ）ＧＩＴＩＫＫＳＥ（又はＴ）ＡＥＱＶＬＲＫＡＹ
ＥＡＡＡＳＤＤＶＦＬＥＦ（又はＤ）（配列番号：６）
と決定された。変性プライマーをアミノ酸残基ＩＴＩＫ
Ｋ（配列番号：７）及びＤＤＶＦＬＥＦ（配列番号：
８）から設計し、ＰＣＲ反応（９５℃で１分、３０℃で
１分の４０サイクル）において、ＳａｃＩエンドヌクレ
アーゼ遺伝子の開始部の８４ｂｐの増幅に用いた。ＰＣ
Ｒ産物をＴ４ ＤＮＡキナーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ
で処理し、ＨｉｎｃII切断／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９にク
ローン化した。挿入体ＤＮＡを配列決定した。挿入体は
全てプライマーのコンカテマー（プライマー二量体）で
あることが判明した。
（Ｍ）ＧＩＴＩＫＫＳＥ（又はＴ）ＡＥＱＶＬＲＫＡＹ
ＥＡＡＡＳＤＤＶＦＬＥＦ（又はＤ）（配列番号：６）
と決定された。変性プライマーをアミノ酸残基ＩＴＩＫ
Ｋ（配列番号：７）及びＤＤＶＦＬＥＦ（配列番号：
８）から設計し、ＰＣＲ反応（９５℃で１分、３０℃で
１分の４０サイクル）において、ＳａｃＩエンドヌクレ
アーゼ遺伝子の開始部の８４ｂｐの増幅に用いた。ＰＣ
Ｒ産物をＴ４ ＤＮＡキナーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ
で処理し、ＨｉｎｃII切断／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９にク
ローン化した。挿入体ＤＮＡを配列決定した。挿入体は
全てプライマーのコンカテマー（プライマー二量体）で
あることが判明した。
【００３２】３．クローニングベクターとしてｐＵＣ１
９を用いたＳａｃＩメチラーゼ選択。
９を用いたＳａｃＩメチラーゼ選択。
【００３３】以下のように、クローニングベクターとし
てｐＵＣ１９を用い、ＡａｔII、ＢａｍＨＩ、Ｎａｒ
Ｉ、Ｓａｕ３ＡＩ及びＳｐｈＩゲノムＤＮＡライブラリ
ーを構築した：ＡａｔII、ＢａｍＨＩ、ＮａｒＩ及びＳ
ｐｈＩ消化Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡ
を、ＡａｔII、ＢａｍＨＩ、ＮａｒＩ及びＳｐｈｌ切断
／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９ベクターに結合した；Ｓａｕ３
ＡＩ部分消化Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮ
ＡをＢａｍＨＩ切断／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９に結合させ
た。結合したＤＮＡをＲＲ１コンピテント細胞に形質転
換し、アンピシリンプレート上で平板培養した。各形質
転換において、全部で１−５×１０4個の細胞が見つか
った。各一次細胞ライブラリーからプラスミドＤＮＡを
形成し、ＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼで切断した。
ＳａｃＩ消化ＤＮＡをＲＲ１コンピテント細胞に形質転
換した。生存する形質転換細胞からプラスミドＤＮＡを
再単離し、ＳａｃＩ制限酵素で消化して、プラスミドＤ
ＮＡがＳａｃＩ消化に対して耐性を有しているかどうか
を調べた。各ライブラリー由来の１０８個のプラスミド
をＳａｃＩ消化に対する耐性について調べた。ベクター
のＳａｃＩ部位が欠失した１４個の耐性クローンを検出
した。真の耐性クローンは５つのライブラリーのいずれ
にも見られなかった。
てｐＵＣ１９を用い、ＡａｔII、ＢａｍＨＩ、Ｎａｒ
Ｉ、Ｓａｕ３ＡＩ及びＳｐｈＩゲノムＤＮＡライブラリ
ーを構築した：ＡａｔII、ＢａｍＨＩ、ＮａｒＩ及びＳ
ｐｈＩ消化Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡ
を、ＡａｔII、ＢａｍＨＩ、ＮａｒＩ及びＳｐｈｌ切断
／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９ベクターに結合した；Ｓａｕ３
ＡＩ部分消化Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮ
ＡをＢａｍＨＩ切断／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９に結合させ
た。結合したＤＮＡをＲＲ１コンピテント細胞に形質転
換し、アンピシリンプレート上で平板培養した。各形質
転換において、全部で１−５×１０4個の細胞が見つか
った。各一次細胞ライブラリーからプラスミドＤＮＡを
形成し、ＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼで切断した。
ＳａｃＩ消化ＤＮＡをＲＲ１コンピテント細胞に形質転
換した。生存する形質転換細胞からプラスミドＤＮＡを
再単離し、ＳａｃＩ制限酵素で消化して、プラスミドＤ
ＮＡがＳａｃＩ消化に対して耐性を有しているかどうか
を調べた。各ライブラリー由来の１０８個のプラスミド
をＳａｃＩ消化に対する耐性について調べた。ベクター
のＳａｃＩ部位が欠失した１４個の耐性クローンを検出
した。真の耐性クローンは５つのライブラリーのいずれ
にも見られなかった。
【００３４】４．クローニングベクターとしてｐＲＲＳ
を用いたＳａｃＩメチラーゼ選択。
を用いたＳａｃＩメチラーゼ選択。
【００３５】メチラーゼ選択法では、ＳａｃＩメチラー
ゼ遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで妥当なレベルまで発現さ
せ、それによってメチラーゼが該遺伝子を有するベクタ
ー上のＳａｃＩ部位を修飾する必要がある。Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中では２種の微
生物のＧＣ含量が異なるために発現度が低いことは公知
である。ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子を高レベルに発現さ
せるために、クローニングベヒクルとして別の高コピー
数ベクターｐＲＲＳを用いた。プラスミドｐＲＲＳは、
ｐＵＣ１９上に標準ｌａｃプロモーターより強力なｌａ
ｃＵＶ５プロモーターを有している。多重クローニング
部位にクローン化された遺伝子はｌａｃＵＶ５プロモー
ターにより作動される。Ｓａｕ３ＡＩ部分消化Ｓ．ａｃ
ｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ消化／
ＣＩＰ処理ｐＲＲＳベクターに結合させ、結合したＤＮ
ＡをＲＲ１コンピテント細胞に形質転換した。一次細胞
ライブラリーとして合計１００００個のＡｐR形質転換
細胞を得た。一次細胞ライブラリーからプラスミドＤＮ
Ａを形成し、ＳａｃＩ制限酵素で切断し、ＲＲ１コンピ
テント細胞に再形質転換した。生存する形質転換細胞を
取り出し、培養した。これらの細胞からプラスミドＤＮ
Ａを単離した。これらのプラスミドのいずれがＳａｃＩ
メチラーゼ遺伝子を含んでいるかを調べるために、個々
のプラスミドをＳａｃＩエンドヌクレアーゼで消化し
た。１個のプラスミドが真にＳａｃＩ消化に対する耐性
を有していることが見いだされた。該プラスミドは約１
５００ｂｐの挿入体を有している。該挿入体中のＰｓｔ
Ｉ断片（約３２０ｂｐ）又はＨｉｎｃII断片（約１２０
０ｂｐ）が欠失すると、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子が不
活性化し、欠失クローンがＳａｃＩエンドヌクレアーゼ
切断に対して感受性になる。
ゼ遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで妥当なレベルまで発現さ
せ、それによってメチラーゼが該遺伝子を有するベクタ
ー上のＳａｃＩ部位を修飾する必要がある。Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中では２種の微
生物のＧＣ含量が異なるために発現度が低いことは公知
である。ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子を高レベルに発現さ
せるために、クローニングベヒクルとして別の高コピー
数ベクターｐＲＲＳを用いた。プラスミドｐＲＲＳは、
ｐＵＣ１９上に標準ｌａｃプロモーターより強力なｌａ
ｃＵＶ５プロモーターを有している。多重クローニング
部位にクローン化された遺伝子はｌａｃＵＶ５プロモー
ターにより作動される。Ｓａｕ３ＡＩ部分消化Ｓ．ａｃ
ｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ消化／
ＣＩＰ処理ｐＲＲＳベクターに結合させ、結合したＤＮ
ＡをＲＲ１コンピテント細胞に形質転換した。一次細胞
ライブラリーとして合計１００００個のＡｐR形質転換
細胞を得た。一次細胞ライブラリーからプラスミドＤＮ
Ａを形成し、ＳａｃＩ制限酵素で切断し、ＲＲ１コンピ
テント細胞に再形質転換した。生存する形質転換細胞を
取り出し、培養した。これらの細胞からプラスミドＤＮ
Ａを単離した。これらのプラスミドのいずれがＳａｃＩ
メチラーゼ遺伝子を含んでいるかを調べるために、個々
のプラスミドをＳａｃＩエンドヌクレアーゼで消化し
た。１個のプラスミドが真にＳａｃＩ消化に対する耐性
を有していることが見いだされた。該プラスミドは約１
５００ｂｐの挿入体を有している。該挿入体中のＰｓｔ
Ｉ断片（約３２０ｂｐ）又はＨｉｎｃII断片（約１２０
０ｂｐ）が欠失すると、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子が不
活性化し、欠失クローンがＳａｃＩエンドヌクレアーゼ
切断に対して感受性になる。
【００３６】欠失クローン〔ＰｓｔＩフラグメントの欠
失、ＨｉｎｃｌＩフラグメントの欠失、ＥａｇＩ／Ｂａ
ｍＨＩフラグメントの欠失、ＥａｇＩ／ＥｃｏＲＩの欠
失、ＸｂａＩ／ＡｆｌIIフラグメントの欠失及びエキソ
ヌクレアーゼIII／ヤエナリ（Ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌク
レアーゼの欠失〕を用いて、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子
全体を配列決定した。ＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列
を図２に示す。
失、ＨｉｎｃｌＩフラグメントの欠失、ＥａｇＩ／Ｂａ
ｍＨＩフラグメントの欠失、ＥａｇＩ／ＥｃｏＲＩの欠
失、ＸｂａＩ／ＡｆｌIIフラグメントの欠失及びエキソ
ヌクレアーゼIII／ヤエナリ（Ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌク
レアーゼの欠失〕を用いて、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子
全体を配列決定した。ＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列
を図２に示す。
【００３７】５．ＳａｃＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の
クローニング。
クローニング。
【００３８】ＰｖｕIIゲノムＤＮＡライブラリーの構
築： ゲノムＤＮＡのサザン法分析により、１０ｋｂの
ＰｖｕII制限フラグメントは、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝
子とエンドヌクレアーゼ遺伝子の両方を含むことが示さ
れた。８〜１２ｋｂ以内のＰｖｕIIフラグメントをゲル
精製し、ＨｉｎｃII切断／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９に結合
させ、結合したＤＮＡをＲＲ１コンピテント細胞に形質
転換した。プローブとしてＳａｃＩメチラーゼ遺伝子を
用いてコロニーハイブリダイゼーションを行ったが、真
の陽性クローンは同定されなかった。
築： ゲノムＤＮＡのサザン法分析により、１０ｋｂの
ＰｖｕII制限フラグメントは、ＳａｃＩメチラーゼ遺伝
子とエンドヌクレアーゼ遺伝子の両方を含むことが示さ
れた。８〜１２ｋｂ以内のＰｖｕIIフラグメントをゲル
精製し、ＨｉｎｃII切断／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９に結合
させ、結合したＤＮＡをＲＲ１コンピテント細胞に形質
転換した。プローブとしてＳａｃＩメチラーゼ遺伝子を
用いてコロニーハイブリダイゼーションを行ったが、真
の陽性クローンは同定されなかった。
【００３９】逆ＰＣＲによるＳａｃＩエンドヌクレアー
ゼ遺伝子のクローニング： 逆ＰＣＲは、既知のＤＮＡ
配列に隣接するＤＮＡをクローン化するのに効率的な方
法である。Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡ
を、ＡａｔII、ＡｖｒII、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、Ｅｃ
ｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄIII、ＫｐｎＩ、Ｍｌｕ
Ｉ、ＮｃｏＩ、ＮａｒＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕII、Ｓｍａ
Ｉ、ＳｐｈＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ又はＸｈｏＩで消化
した。消化されたＤＮＡをそれぞれ自己連結させて、低
ＤＮＡ濃度（全容量５００μｌ中２μｇ／ｍｌ）で環化
した。連結したＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ3で一
度、ＣＨＣｌ3で一度抽出し、９５％エタノールで沈殿
させた。該ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応（９５℃で１分、６０
℃で１分、７２℃で５分の３０サイクル）用の鋳型とし
て用いた。メチラーゼ遺伝子の末端にアニーリングする
プライマーセットを以下のように設計した：前進プライ
マー、５’−ＧＡＧＴＧＡＡＧＣＧＣＧＡＧＧＴＧＣＡ
ＧＣＧＧＣＡＧＡ−３’（配列番号９）、逆進プライマ
ー、５’−ＡＡＡＣＧＡＡＣＴＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＧ
ＴＣＡＴＧＡ−３’（配列番号１０）。自己連結Ｐｓｔ
ＩゲノムＤＮＡ及びＳｐｈＩゲノムＤＮＡ中に、それぞ
れ９００ｂｐ及び４０００ｂｐの逆ＰＣＲ産物が見いだ
された。
ゼ遺伝子のクローニング： 逆ＰＣＲは、既知のＤＮＡ
配列に隣接するＤＮＡをクローン化するのに効率的な方
法である。Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡ
を、ＡａｔII、ＡｖｒII、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、Ｅｃ
ｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄIII、ＫｐｎＩ、Ｍｌｕ
Ｉ、ＮｃｏＩ、ＮａｒＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕII、Ｓｍａ
Ｉ、ＳｐｈＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ又はＸｈｏＩで消化
した。消化されたＤＮＡをそれぞれ自己連結させて、低
ＤＮＡ濃度（全容量５００μｌ中２μｇ／ｍｌ）で環化
した。連結したＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ3で一
度、ＣＨＣｌ3で一度抽出し、９５％エタノールで沈殿
させた。該ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応（９５℃で１分、６０
℃で１分、７２℃で５分の３０サイクル）用の鋳型とし
て用いた。メチラーゼ遺伝子の末端にアニーリングする
プライマーセットを以下のように設計した：前進プライ
マー、５’−ＧＡＧＴＧＡＡＧＣＧＣＧＡＧＧＴＧＣＡ
ＧＣＧＧＣＡＧＡ−３’（配列番号９）、逆進プライマ
ー、５’−ＡＡＡＣＧＡＡＣＴＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＧ
ＴＣＡＴＧＡ−３’（配列番号１０）。自己連結Ｐｓｔ
ＩゲノムＤＮＡ及びＳｐｈＩゲノムＤＮＡ中に、それぞ
れ９００ｂｐ及び４０００ｂｐの逆ＰＣＲ産物が見いだ
された。
【００４０】逆ＰＣＲ反応の効率をさらに高めるため
に、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡを、そ
の認識配列が全てＧＣ塩基対であるＢｓｒＦＩ、Ｅａｅ
Ｉ、ＨａｅII、ＴａｑＩ及びＮｇｏＭＩ制限酵素のよう
な切断頻度の高い制限酵素で消化した。効率的な逆ＰＣ
Ｒ反応を得るためには妥当なサイズの鋳型ＤＮＡ（３ｋ
ｂ未満）を生じさせる制限酵素を用いることが望まし
い。逆ＰＣＲ反応において、ＢｓｒＦＩ、ＥａｅＩ、Ｈ
ａｅII、ＰｓｔＩ、ＴａｑＩ及びＮｇｏＭＩで消化し、
自己連結させたＤＮＡ中に増幅産物が見つかった。Ｎｇ
ｏＭＩ及びＨａｅII逆ＰＣＲ産物をＴ４ ＤＮＡキナー
ゼ、ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ｐＵＣ１９にクロー
ン化した。挿入体を配列決定し、新しい配列を全６個の
枠内で翻訳した。翻訳されたアミノ酸配列をＳａｃＩＮ
末端タンパク質配列と比較した。ＳａｃＩエンドヌクレ
アーゼ遺伝子がＳａｃＩメチラーゼ遺伝子の２２ｂｐ下
流にあることがわかった。２７個のアミノ酸がＳａｃＩ
タンパク質配列と同一である８０４ｂｐからなる読み取
り枠１個を同定する。８０４ｂｐ配列の末端には終結コ
ドンが見られず、これは、ＳａｃＩエンドヌクレアーゼ
遺伝子がまだ終結していないことを示している。Ｓａｃ
Ｉエンドヌクレアーゼ遺伝子の残りをクローン化するた
めに、別のプライマーセットを設計して、以下のように
既知のＤＮＡ配列の末端にアニーリングした：前進プラ
イマー、５’−ＧＡＡＧＴＧＣＧＴＧＧＡＡＡＧＡＧＣ
ＧＴＧＴＣＧ−３’（配列番号：１１）；逆進プライマ
ー、５’−ＧＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＣＣＧＴＣＣＡＡＡ
ＡＴＣＡ−３’（配列番号：１２）。Ｓ．ａｃｈｒｏｍ
ｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡを、ＡａｔII、ＡｐａＩ、Ｂ
ｓａＷＩ、ＢｓｓＨII、ＥａｅＩ、ＨａｅII，Ｍｓｅ
Ｉ、ＮｃｏＩ、ＮｌａIII、 ＰｖｕＩ又はＴａｑＩ制限
酵素で消化した。消化されたＤＮＡを低ＤＮＡ濃度（１
ｍｌ当たり２μｇ未満）で自己連結させた。連結した環
状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応（９５℃で１分、６０℃で１
分、７２℃で１分の３０サイクル）用の鋳型として用い
た。ＡａｔII、ＢｓａＷＩ、ＢｓｓＨII、ＮｌａIII、
ＰｖｕＩ及びＨａｅII消化／自己連結ＤＮＡの連結ＤＮ
Ａ中に逆ＰＣＲ産物が見つかった。ＨａｅII及びＰｖｕ
Ｉからの逆ＰＣＲ産物をＴ４ ＤＮＡキナーゼ及びＤＮ
Ａポリメラーゼで処理し、ＨｉｎｃII切断／ＣＩＰ処理
ｐＵＣ１９ベクターにクローン化した。挿入体を終結コ
ドンが見つかるまで配列決定した。ＳａｃＩエンドヌク
レアーゼ遺伝子は全部で１０７７ｂｐであり、４１ｋＤ
ａのタンパク質をコードすることが判明した。
に、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡを、そ
の認識配列が全てＧＣ塩基対であるＢｓｒＦＩ、Ｅａｅ
Ｉ、ＨａｅII、ＴａｑＩ及びＮｇｏＭＩ制限酵素のよう
な切断頻度の高い制限酵素で消化した。効率的な逆ＰＣ
Ｒ反応を得るためには妥当なサイズの鋳型ＤＮＡ（３ｋ
ｂ未満）を生じさせる制限酵素を用いることが望まし
い。逆ＰＣＲ反応において、ＢｓｒＦＩ、ＥａｅＩ、Ｈ
ａｅII、ＰｓｔＩ、ＴａｑＩ及びＮｇｏＭＩで消化し、
自己連結させたＤＮＡ中に増幅産物が見つかった。Ｎｇ
ｏＭＩ及びＨａｅII逆ＰＣＲ産物をＴ４ ＤＮＡキナー
ゼ、ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ｐＵＣ１９にクロー
ン化した。挿入体を配列決定し、新しい配列を全６個の
枠内で翻訳した。翻訳されたアミノ酸配列をＳａｃＩＮ
末端タンパク質配列と比較した。ＳａｃＩエンドヌクレ
アーゼ遺伝子がＳａｃＩメチラーゼ遺伝子の２２ｂｐ下
流にあることがわかった。２７個のアミノ酸がＳａｃＩ
タンパク質配列と同一である８０４ｂｐからなる読み取
り枠１個を同定する。８０４ｂｐ配列の末端には終結コ
ドンが見られず、これは、ＳａｃＩエンドヌクレアーゼ
遺伝子がまだ終結していないことを示している。Ｓａｃ
Ｉエンドヌクレアーゼ遺伝子の残りをクローン化するた
めに、別のプライマーセットを設計して、以下のように
既知のＤＮＡ配列の末端にアニーリングした：前進プラ
イマー、５’−ＧＡＡＧＴＧＣＧＴＧＧＡＡＡＧＡＧＣ
ＧＴＧＴＣＧ−３’（配列番号：１１）；逆進プライマ
ー、５’−ＧＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＣＣＧＴＣＣＡＡＡ
ＡＴＣＡ−３’（配列番号：１２）。Ｓ．ａｃｈｒｏｍ
ｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡを、ＡａｔII、ＡｐａＩ、Ｂ
ｓａＷＩ、ＢｓｓＨII、ＥａｅＩ、ＨａｅII，Ｍｓｅ
Ｉ、ＮｃｏＩ、ＮｌａIII、 ＰｖｕＩ又はＴａｑＩ制限
酵素で消化した。消化されたＤＮＡを低ＤＮＡ濃度（１
ｍｌ当たり２μｇ未満）で自己連結させた。連結した環
状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応（９５℃で１分、６０℃で１
分、７２℃で１分の３０サイクル）用の鋳型として用い
た。ＡａｔII、ＢｓａＷＩ、ＢｓｓＨII、ＮｌａIII、
ＰｖｕＩ及びＨａｅII消化／自己連結ＤＮＡの連結ＤＮ
Ａ中に逆ＰＣＲ産物が見つかった。ＨａｅII及びＰｖｕ
Ｉからの逆ＰＣＲ産物をＴ４ ＤＮＡキナーゼ及びＤＮ
Ａポリメラーゼで処理し、ＨｉｎｃII切断／ＣＩＰ処理
ｐＵＣ１９ベクターにクローン化した。挿入体を終結コ
ドンが見つかるまで配列決定した。ＳａｃＩエンドヌク
レアーゼ遺伝子は全部で１０７７ｂｐであり、４１ｋＤ
ａのタンパク質をコードすることが判明した。
【００４１】６．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＳａｃＩエンド
ヌクレアーゼの発現。
ヌクレアーゼの発現。
【００４２】ＳａｃＩメチラーゼ遺伝子をｐＳＣ１０１
誘導体ｐＬＧ３３９にサブクローン化してＥ．ｃｏｌｉ
宿主を予備修飾した。２個のプライマーを用い、ＰＣＲ
により、ＳａｃＩエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅
した。前進プライマーは、ＡＴＧ開始コドンの前にリボ
ソーム結合部位及び７ｂｐのスペーシングを含んでいる
〔前進プライマー、５’−ＣＡＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧ
ＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡＡＡＴＧＧＧＡＡＴＡＡＣＡＡＴ
ＴＡＡＡＡＡＧＡＧＣＡＣＧ−３’（配列番号：１
３）；逆進プライマー、５’−ＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＧ
ＧＣＧＡＴＡＣＡＴＴＧＣＣＴＣＡＧＧＡＡＡＧ−３’
（配列番号：１４〕。ＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩ部位
が隣接（フランキング）したＳａｃＩエンドヌクレアー
ゼ遺伝子を発現ベクターｐＲＲＳにクローン化し、Ｓａ
ｃＩメチラーゼ予備修飾細胞に形質転換した。ｐＲＲＳ
−ＳａｃＩＲ+及びｐＬＧ−ＳａｃＩＭ+を有する細胞
（ＮＥＢ＃９６３）５００ｍｌをＬＢプラスＡｐ（１０
０μｇ／ｍｌ）及びＫｍ（５０μｇ／ｍｌ）中、３０℃
で１２０ｋｌｅｔｔ単位に増殖させ、０．５ｍＭまでＩ
ＰＴＧを添加して４時間ＳａｃＩ産生を誘導した。細胞
を収穫し、音波処理緩衝液３０ｍｌに再懸濁した。１０
０μｇ／ｍｌまでリゾチームを添加し、音波処理して細
胞の溶解を完結させた。細胞の破片を遠心して除去し
た。細胞抽出物をＴＥ緩衝液に１０、１００、１０００
及び１０００倍希釈した。５μｌの希釈抽出物を用い
て、１μｇのＨｉｎｄIII切断λＤＮＡを３７℃で１時
間消化した。消化したＤＮＡを０．８％アガロースゲル
で分離した。該クローンが、湿潤Ｅ．ｃｏｌｉ細胞１グ
ラム当たり１．５×１０6単位のＳａｃＩエンドヌクレ
アーゼを形成することが判明した。１９９５年３月２２
日に、ＳａｃＩ制限修飾系（ＮＥＢ＃９６３）を含む
Ｅ．ｃｏｌｉＲＲ１の試料を、ブタペスト条約下に、Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ受託番号 を
受けた。
誘導体ｐＬＧ３３９にサブクローン化してＥ．ｃｏｌｉ
宿主を予備修飾した。２個のプライマーを用い、ＰＣＲ
により、ＳａｃＩエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅
した。前進プライマーは、ＡＴＧ開始コドンの前にリボ
ソーム結合部位及び７ｂｐのスペーシングを含んでいる
〔前進プライマー、５’−ＣＡＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧ
ＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡＡＡＴＧＧＧＡＡＴＡＡＣＡＡＴ
ＴＡＡＡＡＡＧＡＧＣＡＣＧ−３’（配列番号：１
３）；逆進プライマー、５’−ＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＧ
ＧＣＧＡＴＡＣＡＴＴＧＣＣＴＣＡＧＧＡＡＡＧ−３’
（配列番号：１４〕。ＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩ部位
が隣接（フランキング）したＳａｃＩエンドヌクレアー
ゼ遺伝子を発現ベクターｐＲＲＳにクローン化し、Ｓａ
ｃＩメチラーゼ予備修飾細胞に形質転換した。ｐＲＲＳ
−ＳａｃＩＲ+及びｐＬＧ−ＳａｃＩＭ+を有する細胞
（ＮＥＢ＃９６３）５００ｍｌをＬＢプラスＡｐ（１０
０μｇ／ｍｌ）及びＫｍ（５０μｇ／ｍｌ）中、３０℃
で１２０ｋｌｅｔｔ単位に増殖させ、０．５ｍＭまでＩ
ＰＴＧを添加して４時間ＳａｃＩ産生を誘導した。細胞
を収穫し、音波処理緩衝液３０ｍｌに再懸濁した。１０
０μｇ／ｍｌまでリゾチームを添加し、音波処理して細
胞の溶解を完結させた。細胞の破片を遠心して除去し
た。細胞抽出物をＴＥ緩衝液に１０、１００、１０００
及び１０００倍希釈した。５μｌの希釈抽出物を用い
て、１μｇのＨｉｎｄIII切断λＤＮＡを３７℃で１時
間消化した。消化したＤＮＡを０．８％アガロースゲル
で分離した。該クローンが、湿潤Ｅ．ｃｏｌｉ細胞１グ
ラム当たり１．５×１０6単位のＳａｃＩエンドヌクレ
アーゼを形成することが判明した。１９９５年３月２２
日に、ＳａｃＩ制限修飾系（ＮＥＢ＃９６３）を含む
Ｅ．ｃｏｌｉＲＲ１の試料を、ブタペスト条約下に、Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ受託番号 を
受けた。
【００４３】
配列番号：１ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列
【００４４】
【表１】
【００４５】配列番号：２ 配列の長さ：１１６８ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１..１１６７ 配列
【００４６】
【表２】
【００４７】
【表３】
【００４８】
【表４】
【００４９】配列番号：３ 配列の長さ：３８９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００５０】
【表５】
【００５１】
【表６】
【００５２】
【表７】
【００５３】配列番号：４ 配列の長さ：１０７７ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１..１０７４ 配列
【００５４】
【表８】
【００５５】
【表９】
【００５６】
【表１０】
【００５７】配列番号：５ 配列の長さ：３５８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００５８】
【表１１】
【００５９】
【表１２】
【００６０】
【表１３】
【００６１】配列番号：６ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列
【００６２】
【表１４】
【００６３】配列番号：７ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列
【００６４】
【表１５】
【００６５】配列番号：８ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列
【００６６】
【表１６】
【００６７】配列番号：９ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列
【００６８】
【表１７】
【００６９】配列番号：１０ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列
【００７０】
【表１８】
【００７１】配列番号：１１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列
【００７２】
【表１９】
【００７３】配列番号：１２ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列
【００７４】
【表２０】
【００７５】配列番号：１３ 配列の長さ：５１ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列
【００７６】
【表２１】
【００７７】配列番号：１４ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列
【００７８】
【表２２】
【図１】ＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼのクローニン
グ及び製造スキームである。
グ及び製造スキームである。
【図２】ｓａｃＩＭ遺伝子のＤＮＡ配列及びそれによっ
てコードされるタンパク質配列（配列番号：２及び対応
アミノ酸配列、配列番号：３）である。
てコードされるタンパク質配列（配列番号：２及び対応
アミノ酸配列、配列番号：３）である。
【図３】ｓａｃＩＲ遺伝子のＤＮＡ配列及びそれによっ
てコードされるタンパク質配列（配列番号：４及び対応
アミノ酸配列、配列番号：５）である。
てコードされるタンパク質配列（配列番号：４及び対応
アミノ酸配列、配列番号：５）である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (6)
- 【請求項１】 宿主Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈ
ｒｏｍｏｇｅｎｅｓから得ることができる、ＳａｃＩ制
限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ。 - 【請求項２】 ＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼをコー
ドするＤＮＡセグメントを挿入したベクターからなる組
換え体ＤＮＡベクター。 - 【請求項３】 ＡＴＣＣ番号 から得ることがで
きる、ＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ
をコードする単離ＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項３に記載の単離ＤＮＡを含むクロ
ーニングベクター。 - 【請求項５】 請求項２又は４に記載のクローニングベ
クターにより形質転換された宿主細胞。 - 【請求項６】 ＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼの発現
に適した条件下に、請求項２又は４に記載のベクターで
形質転換した宿主細胞を培養することを含むＳａｃＩ制
限エンドヌクレアーゼの製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/409,199 US5532153A (en) | 1995-03-23 | 1995-03-23 | Method for cloning and producing the SacI restriction endonuclease |
| US409199 | 1995-03-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0965884A true JPH0965884A (ja) | 1997-03-11 |
Family
ID=23619456
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8066393A Pending JPH0965884A (ja) | 1995-03-23 | 1996-03-22 | ＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼのクローニング及び製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5532153A (ja) |
| EP (1) | EP0733711A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0965884A (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5534428A (en) * | 1994-09-06 | 1996-07-09 | Life Technologies, Inc. | Cloned Ssti/SacI restriction-modification system |
| US5663067A (en) * | 1996-07-11 | 1997-09-02 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the SapI restriction endonuclease in E. coli |
| US5945326A (en) * | 1997-03-20 | 1999-08-31 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the Spel restriction endonuclease |
| US6586220B1 (en) * | 2002-02-26 | 2003-07-01 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and expression of BsaWI restriction endonuclease and BsaWI methylase in E. coli |
| WO2007097778A2 (en) | 2005-08-04 | 2007-08-30 | New England Biolabs, Inc. | Novel restriction endonucleases, dna encoding these endonucleases and methods for identifying new endonucleases with the same or varied specificity |
| CN105483097B (zh) * | 2007-07-12 | 2021-07-13 | 新英格兰生物实验室公司 | 高保真度限制性内切核酸酶 |
| TWI541020B (zh) | 2008-04-17 | 2016-07-11 | 巴克斯歐塔公司 | 生物活性胜肽 |
| CN107557372A (zh) * | 2017-08-30 | 2018-01-09 | 江苏愚公生命科技有限公司 | 用于表达限制性内切酶SacI的甲基化保护菌株的筛选方法 |
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