DE69930803T2

DE69930803T2 - Verfahren zur Klonierung und Herstellung der Restriktionsendonuklease SnaBI und ihre Isolierung

Info

Publication number: DE69930803T2
Application number: DE69930803T
Authority: DE
Inventors: Keith D. Essex Lunnen; Hiumin Wenham Kong; Geoffrey G. Beverly Wilson
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1998-08-31
Filing date: 1999-08-24
Publication date: 2006-11-30
Anticipated expiration: 2019-08-25
Also published as: US6025179A; EP0985730A1; JP2000083686A; JP4498496B2; EP0985730B1; DE69930803D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die SnaBI Restriktionsendonuclease und die SnaBI Methylase kodiert, sowie die Herstellung von SnaBI Restriktionsendonuclease von der rekombinanten DNA.
Restriktionsendonucleasen des Typs II sind eine Klasse von Enzymen, die in Bakterien natürlich vorkommen. Wenn sie von anderen Bakterienkomponenten weggereinigt werden, können diese Restriktionsendonucleasen im Labor zum Spalten von DNA-Molekülen in kleine Fragmente zur molekularen Klonierung und Gencharakterisierung verwendet werden.
Restriktionsendonucleasen agieren, indem sie spezielle Sequenzen von Nucleotiden (die "Erkennungssequenz") entlang dem DNA-Molekül erkennen und sich an sie binden. Nach dem Anbinden spalten sie das Molekül innerhalb, an einer Seite oder an beiden Seiten der Erkennungssequenz. Unterschiedliche Restriktionsendonucleasen haben Affinität zu unterschiedlichen Erkennungssequenzen. Mehr als zweihundert Restriktionsendonuclasen mit einzigartigen Spezifitäten wurden unter den Tausenden von Bakterienspezies identifiziert, die bisher untersucht wurden (Roberts und Macelis, Nucl. Acids Res. 24: 223–235 (1996)).
Restriktionsendonucleasen werden nach den Bakterien, von denen sie abstammen, benannt. Die durch Deinococcus radiophilus synthetisierten drei verschiedenen Restriktionsendonucleasen haben zum Beispiel den Namen DraI, DraII und DraIII. Diese Enzyme erkennen und spalten jeweils die Sequenzen 5'TTTAAA3', 5'PuGGNCCPy3' und 5'CACNNNGTG3'. Ebenso hat die durch Escherichia coli RY13 synthetisierte einzelne Restriktionsendonuclease die Bezeichnung EcoRI. Sie erkennt die Sequenz 5'GAATTC3'.
Restriktionsendonucleasen treten gewöhnlich zusammen mit einem zweiten Enzym, der Modifikationsmethylase, auf. Zusammen bilden die beiden Enzyme ein bakterielles Restriktionsmodifikations-(R-M)-System. Methylasen sind komplementär zu Restriktionsendonucleasen und liefern ein Mittel, das Bakterien dazu befähigt, ihre eigene DNA vor einem Selbstverdau zu schützen. Modifikationsmethylasen erkennen und binden sich an die gleiche Erkennungssequenz wie die Restriktionsendonuclease, die sie begleiten, anstatt aber die DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch eines der Nucleotide innerhalb der Sequenz durch Hinzufügen einer Methylgruppe, um 5-Methylcytosin, N⁴-Methylcytosin oder N⁶-Methyladenin zu bilden. Im Anschluss an diese Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht mehr durch die zugehörige Restriktionsendonuclease gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle wird durch die Aktivität ihrer Modifikationsmethylase(n) stets vollständig modifiziert und ist daher gegenüber der Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuclease(n) völlig unempfindlich. Lediglich unmodifizierte, d.h. fremde, DNA reagiert auf eine Erkennung und Spaltung durch Restriktionsendonuclease empfindlich.
Anhand der DNA-Rekombinationstechnik ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Enzyme, die sie kodieren, in großen Mengen überzuproduzieren. Der Schlüssel zur Isolierung von Klonen von Restriktionsendonucleasegenen ist die Entwicklung eines einfachen und zuverlässigen Verfahrens zur Identifizierung solcher Klone innerhalb komplexer „Bibliotheken", d.h. Populationen von Klonen, die durch "Shotgun"-Verfahren hergeleitet werden, wenn sie in geringen Frequenzen von 10^–3 bis 10^–4 auftreten. Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so dass die unerwünschte Mehrheit von Klonen zerstört wird, während die erwünschten seltenen Klone überleben.
Restriktionsmodifikationssysteme werden immer öfter kloniert. Die ersten klonierten Systeme nutzten eine Bakteriophage-Infektion als ein Mittel zur Identifizierung oder Selektierung von Restriktionsendonucleaseklonen (EcoRII: Kosykh et al., Mol. Gen. Genet. 178: 717–719, (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3: 97–112, (1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78: 1503–1507 (1981)). Da die Anwesenheit von Restriktionsmodifikationssystemen in Bakterien diese dazu befähigt, Infektionen durch Bakteriophagen standhalten zu können, können Zellen, die klonierte Restriktionsmodifikationsgene beinhalten, prinzipiell als Überlebende von Bibliotheken selektiv isoliert werden, die Phagen ausgesetzt wurden. Man hat jedoch festgestellt, dass dieses Verfahren nur von begrenztem Nutzen ist. Im Speziellen wurde gefunden, dass klonierte Restriktionsmodifikationsgene nicht immer ausreichend Phagenwiderstand aufweisen, um selektives Überleben zu gewähren.
Ein weiterer Klonierungsansatz schließt das Übertragen von anfänglich als plasmidbürtig gekennzeichneten Systemen in E. coli Klonierungsplasmide ein (EcoRV: Bougueleret et al., Nucl. Acids. Res. 12: 3659–3676 (1984); PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402–406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19: 355–359 (1982); PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164: 501–509, (1985)).
Ein dritter Ansatz zum Klonieren von R-M-Systemen schließt die Selektion im Hinblick auf ein aktives Methylasegen ein (US-Patent Nr. 5,200,333 und BsuRI: Kiss et al., Nucl. Acids. Res. 13: 6403–6421 (1985)). Da R- und M-Gene gewöhnlich eng miteinander verknüpft sind, können beide Gene oft simultan kloniert werden. Diese Selektion bringt jedoch nicht immer ein komplettes Restriktionssystem hervor, sondern stattdessen nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10: 219–225 (1980); BcnI: Janulaitis et al., Gene 20: 197–204 (1982); BsuRI: Kiss und Baldauf, Gene 21: 111–119 (1983); und MspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258: 1235–1241 (1983)).
Ein weiteres Verfahren zum Klonieren von R-M-Systemen in E. coli macht sich die Tatsache zunutze, dass bestimmte Modifikationsgene, wenn sie in einen neuen Wirt kloniert und angemessen exprimiert werden, den Wirt dazu befähigen, die Anwesenheit eines anderen Restriktionsgens zu tolerieren (Wilson et al; USA Patentnummer: 5,246,845 (1993)).
Ein neueres Verfahren, das "Endo-Blue-Verfahren", wurde zum direkten Klonieren von Restriktionsendonucleasegenen in E. coli auf der Basis des Indikatorstammes von E. coli beschrieben, der die dinD::lacZ Fusion enthält (Fomenkov et al., US-Patent Nr. 5,498,535 (1996); Fomenkov et al., Nucl. Acids Res. 22: 2399–2403 (1994)). Im Rahmen dieses Verfahrens wird die E. coli SOS-Reaktion im Anschluss an DNA-Schäden genutzt, die durch Restriktionsendonucleasen oder unspezifische Nucleasen verursacht werden. Mit diesem Verfahren wurde eine Reihe thermostabiler Nucleasegene (Tth111I, BsoBI, Tf Nuclease) kloniert (US-Patent Nr. 5,498,535).
Da gereinigte Restriktionsendonucleasen und, in geringerem Maße, Modifikationsmethylasen nützliche Werkzeuge zur Analyse und Umordnung von DNA-Molekülen im Labor sind, gibt es einen starken kommerziellen Anreiz, Bakterienstämme zu konstruieren, die diese Enzyme in großen Mengen produzieren. Solche Überexpressionsstämme erhöhen die Enzymausbeute und vereinfachen die Aufgabe der Enzymreinigung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Das Methylaseselektionsverfahren wurde zum Klonieren des SnaBI Methylasegens (snaBIM) von Sphaerotilus natans (RTCC 15291) angewendet. Mit einem ApoI Teilverdau wurde eine aktive SnaBI Methylase in E. coli unter Verwendung des Plasmidvektors pSnaBI-2 (ein pUC19 Derivat, das zwei SnaBI Orte enthält; einen am SspI Ort und einen anderen am DraI Ort zwischen dem Amp Gen und dem ori von pUC19) kloniert. Anhand einer DNA-Sequenzierung wurde der Standort des eingesetzten snaBIM Gens verifiziert und ein unvollständiges, konvergierendes offenes Leseraster (ORF1) identifiziert.
Da Methylase- und Endonucleasegene in Restriktions-Modifikationssystemen gewöhnlich nebeneinander vorkommen, wurde der Versuch unternommen, die das snaBIM Gen flankierende DNA zu klonieren. Southern-Blots wurden zum Identifizieren angrenzender DNA-Fragmente zur de novo Klonierung und eine inverse PCR zum Isolieren flankierender DNA verwendet. Ein Blotting ergab, dass AatII-, BamHI-, PstI-, SalI- und SphI-Fragmente snaBIM und genügend angrenzende DNA enthalten müssten, um auch das SnaBI Restriktionsgen (snaBIR) zu enthalten. Blots identifizierten auch ein HincII-Fragment, das später zur inversen PCR verwendet wurde. Eine Methylaseselektion bei de novo Bibliotheken, präpariert mit AatII, BamHI, PstI, SalI und SphI, brachte keine SnaBI Methylaseklone hervor. Versuche, Klone durch Transformieren von Selektionen in E. coli, der zuvor durch ein Plasmid modifiziert wurde, das das SnaBI Methylasegen (snaBIM) enthielt, scheiterten ebenfalls. Nach einer Runde der inversen PCR, gefolgt von einer gerichteten PCR, wurden angrenzende Chromosomendaten in pUC19 kloniert. Zwei offene Leseraster (ORF) wurden stromabwärts des SnaBI Methylasegens gefunden. Das erste ORF (ORF1) stimmte nicht mit bekannten Proteinen in der Genbank-Datenbank überein, was auf eine potentielle Restriktionsendonuclease schließen ließ. Das zweite konvergierende ORF (ORF2) war homolog zu zuvor beschriebenen Kontroll-(oder C)-Proteinen (Brooks et al., NAR 19: 841–850 (1991), Tao, et al., J. Bacteriol 173: 1367–1375 (1991)).
Versuche, ein aktives SnaBI Restriktionsgen (ORF1) durch Transformieren in einen zuvor modifizierten E. coli Wirt, der das SnaBI Methylasegen enthielt, in pRRS zu klonieren (Skoglund et al, Gene, 88: 1–5 (1990)), scheiterten. Lediglich ein pRRS snaBIR Klon mit reduzierter SnaBI Endonucleaseaktivität wurde jemals von einem mit SnaBI Methylase zuvor modifizierten E. coli Wirt isoliert.
Unter Verwendung von Vent^® DNA-Polymerase wurde das snaBIR PCR-Fragment dann kloniert und sequenziert nach einer Ligation in pCAB16 an einem BsaAI Ort (bereitgestellt von Bill Jack und Lucia Greenough, New England Biolabs). pCAB16 ist ein pUC18 Derivat, das das aktive mspIR Gen enthält, das in den Polylinker von pUC18 kloniert wurde, wobei mspIR vom Plac Promotor transkribiert wurde. Durch eine Unterbrechung von pCAB16 am BsaAI Ort wird die mspIR Expression unterbrochen, die ansonsten letal wäre. Dadurch wird im Hinblick auf Inserts am BsaAI Ort selektiert ( 6). Das snaBIR PCR-Fragment wurde in pCAB16 ligiert und in einen mit SnaBI zuvor modifizierten E. coli Wirt transformiert. Plasmid-DNA wurde von fünfzehn Isolaten gereinigt und mit PstI und BamHI verdaut. Sechs Isolate enthielten das PCR snaBIR-Fragment. Vier davon, Nr. 1, Nr. 2, Nr. 4 und Nr. 9, wurden sequenziert. Die Sequenzierung zeigte, dass die Klone Nr. 2 und Nr. 4 Mutationen enthielten und dass nur die Klone Nr. 1 und Nr. 9 die korrekte DNA-Sequenz für snaBIR aufwiesen. Alle vier Klone hatten eine entgegengesetzte Orientierung zu Plac und mspIR und beim Assay wies keiner von ihnen eine nachweisbare SnaBI Restriktionsendonucleaseaktivität auf.
Die SnaBI Endonucleasegen-(snaBIR)-Fragmente von Nr. 1 und Nr. 9 wurden nach einem Verdau mit PstI und BamHI gelgereinigt und separat in pRRS ligiert. Zum Ermitteln eines Überexpressors von R.SnaBI war dann die Verwendung eines E. coli Wirts notwendig, der zuvor gegen SnaBI Verdau modifiziert wurde. Durch eine Transformation dieser Ligationen in einen Wirt, der zuvor mit der SnaBI Methylase modifiziert wurde, konnte jedoch außer einem pRRS Klon mit reduzierter SnaBI Endonucleaseaktivität kein aktiver SnaBI Restriktionsklon ermittelt werden. Von sechzehn isolierten Klonen schien nur einer, Nr. 12, das korrekte Fragment zu haben, beim Assay wies er jedoch eine reduzierte SnaBI Endonucleaseaktivität auf.
Die SnaBI Endonuclease erkennt die DNA-Sequenz 5'TAC/GTA 3' und spaltet zwischen der dritten und der vierten Base, wobei stumpfe Enden zurückbleiben. Unter Verwendung der BsaAI Methylase, einer heterospezifischen Methylase, die die DNA-Sequenz 5'PyAC/GTPu 3' erkennt, wurde ein hoch exprimierender SnaBI Endonucleaseklon in E. coli ermittelt. Zunächst wurde das BsaAI Methylasegen (bereitgestellt von Huimin Kong, New England Biolabs) auf pIH919, einem Derivat von pACYC184, das den Plac Promotor und Polylinker von pUC18 enthält, kloniert und anschließend in E. coli transformiert. Dieser mit M.BsaAI zuvor modifizierte E. coli Stamm schützte vor SnaBI Verdau und vielleicht vor beobachteter SnaBI Endonuclease-Sternaktivität (Unveröffentlichte Ergebnisse, Paul Walsh, New England Biolabs). Die pRRS Ligationen der gelgereinigten Fragmente von Nr. 1 und Nr. 9 wurden in den mit M.BsaAI zuvor modifizierten E. coli Wirt transformiert und zwölf Kolonien von jeder Transformation wurden isoliert. Alle 24 Klone schienen das korrekte Insert zu enthalten. Sechs Klone von jeder Platte wurden sequenziert und im Hinblick auf SnaBI Endonuclease geprüft. Alle geprüften Klone exprimierten R.SnaBI zu mehr als 8 × 10⁶ Einheiten von SnaBI Endonuclease, produziert je Gramm nasser E. coli Zellen. Alle Klone enthielten die korrekte snaBIR DNA-Sequenz. Die SnaBI Endonuclease wird von diesen Klonen durch Chromatographie auf nahezu Homogenität gereinigt.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Genorganisation des SnaBI Restriktions-Modifikationssystems.
2 zeigt das SnaBI Methylasegen (SEQ ID Nr. 1) und seine kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2).
3 zeigt das SnaBI Endonucleasegen (SEQ ID Nr. 3) und seine kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 4).
4 zeigt das SnaBI Kontrollgen (SEQ ID Nr. 5) und seine kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 6).
5 zeigt eine Plasmidkarte des pIH919-BsaAI Methylaseklons.
6 zeigt eine Plasmidkarte von pCAB16. 7 zeigt eine Plasmidkarte des pRRS-SnaBIR Endonucleaseklons.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Zur Überproduktion der SnaBI Endonuclease von einem Klon sind zusätzliche Schritte über das übliche Methylaseselektionsverfahren hinaus erforderlich, einschließlich der Verwendung der heterospezifischen Methylase M.BsaAI für den Schutz der E. coli DNA vor SnaBI Verdau. Ein Plasmid, das bsaAIM enthält, wird zunächst zum Modifizieren eines E. coli Wirts verwendet. Dieser Wirt wird dann mit einem kompatiblen Plasmid, das das snaBIR Gen enthält, pRRS + snaBIR, transformiert, und anschließend erfolgt eine Selektion im Hinblick auf Kolonien, die beide Plasmide enthalten, auf Antibiotikaplatten. Das die M.BsaAI kodierende Gen wurde beschrieben.
Das hierin beschriebene Verfahren, mit dem das SnaBI Methylasegen und die SnaBI Restriktionsendonucleasegene vorzugsweise kloniert und in E. coli exprimiert werden, beinhaltet die folgenden Schritte:
1. Konstruktion einer ApoI-partiellen genomischen DNA-Bibliothek
Genomische Sphaerotilus natans DNA wurde mit ApoI inkubiert, um einen teilweisen Verdau zu erreichen. Die mit ApoI teilweise verdaute genomische DNA im Bereich von 0,5–20 kb wurde in den EcoRI-zerschnittenen und CIP-behandelten Vektor pSnaBI-2 bei 17°C über Nacht ligiert. Die ligierte DNA wurde in kompetente E. coli RR1 Zellen transformiert. Die Transformanten wurden plattiert, gepoolt und amplifiziert. Plasmid-DNA wurde von Übernachtzellkulturen der Pools präpariert.
2. Aussetzen der ApoI-partiellen Bibliothek-DNA einem SnaBI Verdau und Isolieren des SnaBI Methylasegens
Die ApoI-partielle Bibliothek-DNA wurde über Nacht mit SnaBI bei 37°C verdaut. Die verdaute DNA wurde präzipitiert und durch eine Behandlung mit CIP dephosphoryliert und anschließend in kompetente RR1 Zellen transformiert. Plasmid-DNA wurde von achtundzwanzig Transformanten isoliert. Individuelle Plasmid-DNAs wurden mit SnaBI verdaut, um jegliche Verdauresistenz nachzuweisen. Ein Plasmidisolat, Nr. 18, wies Resistenz gegen SnaBI-Verdau auf. Es lag eine vollständige Resistenz gegen SnaBI Verdau vor.
3. Sequenzierung des Inserts, das das SnaBI Methylasegen trägt
Es wurde das gesamte ApoI Fragmentinsert im Plasmid Nr. 18 sequenziert. Man stellte fest, dass das Insert eine Länge von 1264 bp hatte und ein vollständiges offenes Leseraster (ORF) und ein unvollständiges konvergierendes offenes Leseraster (ORF1) kodierte. Als das vollständige ORF mit den bekannten Genprodukten in der GenBank unter Verwendung von BLAST verglichen wurde, wies es eine beträchtliche Homologie zu N⁶-Methyladeninmethylasen auf. Das vollständige ORF (687 bp) kodiert somit die SnaBI Methylase (228 aa. Molekülmasse (MW) = 26,1 kDa).
4. Inverse PCR zum Klonieren des fehlenden Teils von snaBIR und Identifizierung von snaBIC
Genomische Sphaerotilus natans DNA wurde durch inverse PCR amplifiziert. Das inverse PCR-Produkt wurde von selbstligierter, HincII-gespaltener DNA gelgereinigt. Das inverse PCR-Produkt wurde mit ApoI und XbaI verdaut, in mit ApoI und XbaI zerschnittenem pUC19 kloniert und sequenziert. Es wurden 371 bp einer neuen Sequenz erhalten. Ein neuer ApoI Ort wurde außerhalb der ursprünglichen klonierten DNA auf dem Chromosom von Sphaerotilus natans DNA entdeckt. Das HincII inverse PCR-Fragment wurde auf diesen ApoI Ort gekürzt und enthielt DNA von diesem ApoI Ort bis zum HincII Ort. Das klonierte ApoI-XbaI Fragment enthielt ein ATG Startcodon und vierundfünfzig Codone eines neuen unvollständigen ORF (ORF2), das in Richtung auf das ursprüngliche klonierte ApoI Fragment konvergierte. Der Rest der neuen DNA von dem HincII inversen PCR-Fragment ging aufgrund dieses neu entdeckten ApoI Ortes in der angrenzenden chromosomalen DNA verloren. Als ORF2 mit bekannten Proteinen in der GenBank unter Verwendung von BLAST verglichen wurde, wies es eine enge Homologie zu zuvor beschriebenen Kontroll-(oder C)-Proteinen auf (Brooks et al., NAR 19: 841–850, (1991), Tao, et al., J. Bacterial 173: 1367–1375, (1991)).
Es wurde davon ausgegangen, dass ORF2 ein neues Kontrollgen (snaBIC) für das SnaBI R-M-System war. Da C-Gene gewöhnlich Restriktionsgenen vorausgehen, kamen wir zu dem korrekten Schluss, dass das SnaBI Endonucleasegen stromabwärts vom snaBIC gelegen war, das in Richtung auf das ursprüngliche ApoI Fragment konvergierte, das snaBIM enthielt. PCR-Primer wurden dann für eine PCR über diese fehlende Sequenz zurück in Richtung auf das ursprüngliche ApoI Fragment entworfen, das snaBIM und das unvollständige ORF1 enthielt. Das PCR-Produkt wurde mit BamHI verdaut, in mit SmaI und BamHI zerschnittenen pUC19 kloniert und dann sequenziert. Die neu abgeleitete Sequenz verlängerte die gesamte sequenzierte DNA auf 1805 bp und beinhaltete eine Sequenz vom ursprünglichen Methylaseisolat Nr. 18 und die inverse PCR des chromosomalen HincII Fragments. Die Translation dieser DNA-Sequenz in sechs Leseraster zeigte, dass es zwei vollständige offene Leseraster stromabwärts gab, die in Richtung auf das SnaBI Methylasegen konvergierten. Die beiden ORF überlappen um 20 Basen (Genorganisation siehe in 1). Das erste ORF (ORF1) stimmte nicht mit bekannten Proteinen in der Genbank-Datenbank überein, was auf eine potentielle Restriktionsendonuclease schließen lässt. Das zweite konvergierende ORF (ORF2) war homolog zu zuvor beschriebenen Kontrollgenen, oder C, Proteinen.
5. Expression des SnaBI Methylasegens in E. coli
Das gesamte SnaBI Methylasegen (687 bp) wurde von genomischer DNA unter Verwendung von Vent^®-Polymerase und zwei Primern zu snaBIR PCR-amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit PstI und XmaI verdaut und in mit PstI und XmaI verdauten pIH919 ligiert und anschließend in den E. coli Stamm ER2267 transformiert. Eine Kolonie-PCR fand an acht Kolonien statt; zwei Isolate, Nr. 3 und Nr. 8, enthielten das snaBIM PCR-Fragment und waren beide vollständig gegen SnaBI Verdau modifiziert. Nr. 8 wurde dann in den E. coli Stamm ER2683 transformiert und mit dem CaCl₂-Standardverfahren kompetent gemacht.
6. Expression des BsaAI Methylasegens in E. coli
Ein 1,4 kb SspI Fragment, das das bsaAIM Methylasegen enthielt, wurde gelgereinigt, in den SmaI Ort des CIP-behandelten Vektors pIH919 ligiert und dann in E. coli ER2502 transformiert. Plasmid-DNA wurde von sechzehn Kolonien gereinigt; ein Klon, Nr. 8, enthielt das 1,4 kb SspI Fragment. Durch Cotransformieren mit pSnaBI-2 (ein pUC19 Derivat mit zwei SnaBI Orten) wurde gezeigt, dass das pIH919-bsaAIM Isolat Nr. 8 pSnaBI-2 vollständig vor einem SnaBI-Verdau schützte. Der BsaAI Methylaseklon Nr. 8 wurde dann in den E. coli Stamm ER2683 transformiert und mit dem CsCl₂-Standardverfahren kompetent gemacht.
7. Klonieren des vollständigen SnaBI Restriktionsendonucleasegens
Zwei Primer wurden zur PCR-Amplifikation von snaBIR (ORF1) synthetisiert. Das PCR-Produkt wurde mit PstI und BamHI verdaut und dann in mit PstI und BamHI verdauten pRRS ligiert. ER2683 [pIH919-snaBIM] und ER2683 [pIH919-bsaAIM] Zellen wurden dann transformiert.
Beide E. coli Stämme schützten vor SnaBI-Verdau, allerdings brachten nur ER2683-[pIH919-bsaAIM]-Zellen einen Klon mit SnaBI Endonucleaseaktivität aus einer direkten Spaerotilus natans Chromosomen-PCR hervor. Ein Klon von zwölf Isolaten, Nr. 33, von ER2683-[pIH919-bsaAIM]-Zellen wies reduzierte Endonucleaseaktivität auf. ER2683 [pIH919-snaBIM] brachte keine SnaBI Endonucleaseklone durch direkte SnaBI Chromosomen-PCR des snaBIR-Gens hervor.
Die obige unverdaute PCR von snaBIR (ORF1) wurde dann in pCAB16 am BsaAI Ort ligiert und anschließend in kompetente ER2502 [pIH919-snaBIM] E. coli Zellen transformiert. Plasmid-DNA von fünfzehn Isolaten wurde gereinigt und mit PstI und BamHI verdaut. Sechs Isolate enthielten das PCR-generierte snaBIR-Fragment. Vier Isolate, Nr. 1, Nr. 2, Nr. 4 und Nr. 9, wurden sequenziert. Die Sequenzierung ergab, dass die Klone Nr. 2 und Nr. 4 Mutationen enthielten und dass nur die Klone Nr. 1 und Nr. 9 die korrekte DNA-Sequenz für snaBIR aufwiesen. Alle isolierten Klone hatten eine entgegengesetzte Orientierung zu Plac und mspIR und alle geprüften Klone von snaBIR PCR, einschließlich Nr. 1 und Nr. 9, wiesen keine nachweisbare SnaBI Restriktionsendonucleaseaktivität auf.
B. Expression des SnaBI Endonucleasegens im E. coli Stamm ER2683 [pIH919-snaBIM]
Da die pCAB16-snaBIR Klone Nr. 1 und Nr. 9 flankierende PstI und BamHI Orte enthielten, die innerhalb der PCR-Primer konstruiert waren, wurden beide Plasmide mit PstI und BamHI verdaut, das snaBIR Insert wurde gelgereinigt und in PstI- und BamHI-verdauten pRRS in einer Linie mit Plac-Promotor ligiert. Diese Ligationsreaktion wurde wieder in ER2683 [pIH919-snaBIM] E. coli Zellen wie im Abschnitt 7 für den direkten chromosomalen PCR-Klonierungsversuch von snaBIR beschrieben transformiert.
Nach der Transformation in E. coli ER2683 [pIH919-snaBIM] wurde Plasmid-DNA von sechzehn Kolonien gereinigt, jeweils acht der obigen Nr. 1 und Nr. 9 Ligationen. Parallel dazu wurde Plasmid-DNA von zwölf Kolonien aus einer direkten chromosomalen PCR von snaBIR + pRRS Transformation von ER2683 [pIH919-snaBIM] ebenfalls gereinigt. Plasmid-DNA wurde mit PstI und BamHI verdaut, um das snaBIR Insert zu identifizieren; potentielle Klone von jeder Ligation wurden dann im Hinblick auf SnaBI Endonucleaseaktivität geprüft. Lediglich ein Isolat, Nr. 12, [von Nr. 9-pCRB16, gelreine PstI/BamHI snaBIR + pRRS Ligation] wies eine reduzierte Aktivität von weniger als 5 × 10⁵ Einheiten je Gramm auf. Es gab keine Klone mit SnaBI Endonucleaseaktivität aus der direkten chromosomalen snaBIR + pRRS ER2683 [pIH919-snaBIM] Transformation.
9. Überexpression des SnaBI Endonucleasegens im E. coli Stamm ER2683 [pIH919-bsaAIM]
Unser Misserfolg bei der Isolierung von Klonen, die SnaBI Endonuclease überexprimieren, wurde als eine Folge des unzureichenden Schutzes durch die M.SnaBI Methylase angesehen. Dieses Problem wurde gelöst, indem stattdessen die M.BsaAI Methylase verwendet wurde. Wir fanden, dass für eine erfolgreiche Überproduktion von SnaBI Endonuclease von einem Klon die Verwendung einer heterospezifischen M.BsaI Methylase mit E. coli Stamm notwendig war (5). Wie im Abschnitt 8 beschrieben wurde, wurde genau diese Ligation [snaBIR + pRRS] von Nr. 1 und Nr. 9 pCAB16 snaBIR Klonen in den kompetenten E. coli Stamm ER2683 [pIH919-bsaAIM] transformiert. Es wurden zwölf Kolonien von jeder Transformation isoliert. Alle 24 Klone enthielten das Insert korrekter Größe. Sechs Klone, Nr. 1, Nr. 2, Nr. 6, Nr. 13, Nr. 15, Nr. 18, wiesen eine hohe SnaBI Endonucleaseaktivität in Übernachtkulturen auf.
Zellextrakte wurden auf T7 DNA im Hinblick auf SnaBI Endonucleaseaktivität bei 37°C 15 Minuten und 1 Stunde lang geprüft. Das Enzymaktivitätsergebnis liegt bei etwa 8 × 10⁶ Einheiten/Gramm nasser E. coli Zellen.
10. Reinigung der SnaBI Restriktionsendonuclease
Die rekombinante SnaBI Endonuclease wurde durch standardmäßige Proteinreinigungstechniken, einschließlich Ionenaustauschchromatographie, gereinigt.
Die vorliegende Erfindung wird weiter anhand der folgenden Beispiele erläutert. Diese Beispiele sollen dem Verständnis der Erfindung dienen und sind nicht als eine Begrenzung davon anzusehen.
BEISPIEL 1
KLONIERUNG DES SnaBI RESTRIKTIONS-MODIFIKATIONSSYSTEMS IN E. coli
Genomische DNA wurde von Sphaerotilus natans (ATCC 15291), NEB Culture Collection Nr. 308, (Borsetti et al, New England Biolabs, unveröffentlichte Beobachtungen) präpariert.
1. Konstruktion einer ApoI-partiellen genomischen DNA-Bibliothek
2,5 μg von genomischer Sphaerotilus natans DNA wurden mit 8, 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 und 0,05 Einheiten ApoI 60 min lang bei 50°C verdaut. 0,125 und 0,05 Einheiten des Verdaus brachten den erwünschten Grad an teilweisem Verdau hervor. Diese mit ApoI teilweise verdaute genomische DNA im Bereich von 0,5 bis 20 kb wurde 20 Minuten lang bei 80°C inkubiert. Die genomische DNA wurde über Nacht bei 17°C in EcoRI-zerschnittenen und CIP-behandelten Vektor pSnaBI-2 ligiert. pSnaBI-2 enthält einen SnaBI Linker, (5'GTACGTAC) 3' 8mer), an zwei verschiedenen Orten in pUC19 (Yanisch-Perron et al Gene 33: 103–119 (1985)): einen am SspI Ort und einen anderen am DraI Ort zwischen dem Amp Gen und ori. Die Transformation erfolgte durch Vermischen von kompetenten RR1 (TonA^–, Dnasel^–) Zellen mit der ligierten DNA durch Standardverfahren. Transformanten wurden auf LB Agar plus Amp (100 μg/ml) plattiert. Etwa 5000 Kolonien wurden aus dieser Transformation erhalten. Zum Erhöhen der Anzahl von Kolonien fand nochmals eine 4X Transformation mit RR1 (TonA Dnasel^–) Zellen und ligierter DNA statt, wobei etwa 25.000 Transformanten erhalten wurden. Die Transformanten wurden gepoolt, in 500 ml LB-Nährlösung plus Amp inokuliert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Plasmid-DNA wurde von dieser Übernachtkultur durch CsCl-Zentrifugation präpariert.
2. SnaBI-Verdau der ApoI-partiellen Bibliothek-DNA und Klonierung des SnaBI Methylasegens
1 μg der ApoI-partiellen Bibliothek-DNA wurde mit 12 Einheiten SnaBI bei 37°C über Nacht verdaut. Die verdaute DNA wurde präzipitiert und dephosphoryliert durch eine Behandlung mit Calf Intestine Phosphatase (CIP), woraufhin eine Transformation von kompetenten RR1 Zellen folgte. Es wurden einhundertundzwanzig Transformanten erhalten. Plasmid-DNA wurde von 10 ml Zellkulturen von 28 Transformanten isoliert und mit 8 Einheiten SnaBI 2 Stunden lang bei 37°C verdaut, um die Verdauresistenz zu prüfen. Ein Plasmidisolat, Nr. 18, wies eine vollständige Resistenz gegen SnaBI-Verdau auf. Ein Restriktionsverdau von Nr. 18 Plasmid-DNA mit ApoI zeigte, dass sie ein Insert von etwa 1,2 kb DNA enthielt.
3. Sequenzierung des Inserts, das das SnaBI-Methylasegen trägt
Das Insert von Nr. 18 Plasmid-DNA wurde durch Primer-Walking mit dem Didesoxy-Terminationsverfahren unter Verwendung eines Ampli Taq DNA-Polymerase Dye Deoxy Terminator Sequencing Kits und eines ABI373A DNA-Sequenzierungsautomaten sequenziert. Das gesamte Insert mit einer Länge von 1264 bp kodiert ein vollständiges offenes Leseraster (ORF) und ein unvollständiges konvergierendes offenes Leseraster (ORF1). Die Nucleotidsequenzanalyse zeigte, dass das vollständige ORF das snaBIM-Gen ist. Es hat eine Länge von 687 bp und kodiert ein 228 aa Protein mit einer vorausgesagten MW von 26,1 kD. Die M.SnaBI Methylase-aa-Sequenz enthält konservierte Motive, die in Alphatyp-N⁶-Methyladeninmethylasen zu finden sind (2).
4. Inverse PCR zum Klonieren des fehlenden Teils von snaBIR und Identifizierung von snaBIC
Zum Klonieren des fehlenden Teils der SnaBI Endonuclease (ORF1) wurde der entsprechende Abschnitt der genomischen Sphaerotilus natans DNA durch inverse PCR amplifiziert. Genomische Sphaerotilus natans DNA wurde mit HincII gespalten. Die gespaltene DNA wurde bei einer geringen Konzentration (2 μg/ml) selbstligiert und das ligierte Gemisch wurde als Matrize in einer inversen PCR unter Verwendung eines Primersatzes verwendet:
Mit Vent^® (Exo-)polymerase und Zyklisierungsbedingungen von 95°C 1', 60°C 1', 72°C 3,5', 30 Zyklen wurde ein inverses PCR-Produkt von etwa 600 bp erzeugt. 1 μg dieses 600 bp PCR-Produkts wurde dann als DNA-Matrize in einer zweiten Runde der PCR-Amplifikation (100 μl Reaktionen, 95°C 1', 55°C 1', 72°C 3,5', 30 Zyklen, Vent^® (Exo+)polymerase) verwendet, um von dem gleichen 600 bp PCR-Fragment mehr zu erzeugen. Gelgereinigtes 600 bp PCR-Fragment wurde mit ApoI und XbaI verdaut, mit ApoI- und XbaI-verdautem pUC19 ligiert, in E. coli ER2502 transformiert und auf LB-Agar plus Amp (100 μg/ml) plattiert. Durch eine direkte PCR von zwölf Kolonien unter Verwendung von pUC19 Universalprimern Nr. 1233 und Nr. 1224 (New England Biolabs) wurden potentielle inverse PCR-Klone wie folgt identifiziert: individuelle Kolonien wurden von den LB-Agarplatten genommen, in 100 μl dH₂O gegeben, 5 Minuten lang gekocht und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Unter Kolonie-PCR-Bedingungen von 95°C 10 sec, 62°C 1', 72°C 1', 30 Zyklen wurden 2,5 μl gekochte DNA in einer 50 μl Reaktion mit Vent^® (Exo-)polymerase verwendet. Kolonien mit Inserts wurden CsCl-gereinigt und mit den gleichen Primern sequenziert.
371 bp einer neuen Sequenz wurden von diesen inversen PCR-Klonen erhalten. Die zusätzlichen 371 bp enthielten ein ATG Startcodon und 55 folgende Codone eines neuen unvollständigen (ORF2), das in Richtung auf das ursprüngliche klonierte ApoI Fragment konvergierte. Der Anfang des snaBIR Gens war nicht vorhanden. Der Rest der neuen DNA von dem HincII inversen PCR-Fragment ging aufgrund eines neu entdeckten ApoI Ortes in der angrenzenden chromosomalen DNA verloren. Man stellte fest, dass die 54 Codone von ORF2 das verkürzte SnaBI Kontrollgen (snaBIC) an diesem neu entdeckten ApoI Ort waren. Da Kontrollgene gewöhnlich Endonucleasegenen vorausgehen, kamen wir zu dem Schluss, dass snaBIR stromabwärts von snaBIC liegen müsste, das in Richtung auf das ursprüngliche ApoI Fragment konvergierte, das das snaBI Methylasegen (snaBIM) enthielt. Ein PCR-Primer (SninvAP) wurde dann für eine PCR über dieses fehlende ApoI Fragment zurück in Richtung auf das ursprüngliche ApoI-Fragment konstruiert, das snaBIM und das teilweise snaBIR (ORF1) enthielt. Die PCR fand auf genomischer Sphaerotilus natans DNA unter Verwendung eines neu konstruierten Primers (SninvAP) mit (SnaBI2) Primer statt:
Unter Verwendung von Vent^® (Exo-)polymerase wurden die folgenden PCR-Bedingungen verwendet: 95°C 1', 54°C 1', 72°C 1', 30 Zyklen. Es wurde ein PCR-Fragment von etwa vierhundertunddreißig (430) bp erhalten. Dieses wurde mit BamHI verdaut und in SmaI- und BamHI-verdauten pUC19 ligiert, anschließend in den E. coli Stamm ER2502 transformiert und auf LB Agar plus Amp (100 μg/ml) wachsen gelassen. Eine Kolonie-PCR von zehn Kolonien unter Verwendung von pUC19 Universalprimern Nr. 1223 und Nr. 1224 (New England Biolabs) fand dann unter Verwendung von Vent^® (Exo-)polymerase unter den folgenden PCR-Bedingungen statt: 94°C 10 sec, 62°C 1', 72°C 1', 30 Zyklen. Plasmid-DNA von Nr. 8 enthielt das klonierte PCR-(430 bp)-Fragment und wurde CsCl-gereinigt und unter Verwendung der pUC19 Universalprimer sequenziert. Die Sequenzierung brachte die restlichen 24 aa von snaBIC und das ATG-Codon und 40 aa von snaBIR hervor. Man fand, dass das vollständige snaBIR Gen (ORF1) eine Länge von 672 bp hatte und ein 223 aa Protein mit vorausgesagter MW von 24,5 kD kodierte (3).
5. Subklonierung des SnaBI Methylasegens
Zum Klonieren des vollständigen SnaBI Endonucleasegens (snaBIR) wurde ein gegen SnaBI Endonucleaseverdau modifizierter E. coli Stamm hergestellt, indem snaBIM in ein kompatibles pACYC184 Derivat, pIH919, kloniert wurde. Das gesamte Methylasegen (687 bp) wurde von genomischer DNA unter Verwendung von Vent^® Polymerase unter PCR-Bedingungen von 95°C 1', 54°C 1', 72°C 1', 30 Zyklen und zwei Primern (SnaBI 5M) und (SnaBI 3M) amplifiziert:
Das PCR-Fragment wurde dann 2 Stunden lang bei 37°C mit PstI und XmaI verdaut und anschließend 2 Stunden lang bei 17°C in mit PstI und XmaI verdauten pIH919 ligiert. Die Ligation wurde in E. coli ER2267 transformiert und die transformierten Zellen wurden auf LB-Agar plus Chloramphenicol (25 μg/ml) plattiert. Eine Kolonie-PCR von acht Kolonien unter Verwendung des pUC19 Universalprimers (Nr. 1223) und des Primers (SnaBI 5M) fand dann unter Verwendung von Vent^® (Exo-)polymerase unter den folgenden PCR-Bedingungen statt: 94°C 10 sec, 62°C 1', 72°C 1', 30 Zyklen. Zwei Isolate, Nr. 3 und Nr. 8, enthielten das snaBIM PCR Fragment. E. coli ER2502 mit Nr. 3 oder Nr. 8 [snaBIM-pIH919] wurde mit dem CaCl₂-Verfahren kompetent gemacht und mit pSnaBI-2, ein pUC19 Derivat mit zwei SnaBI Orten, transformiert. Plasmid-DNA von jeweils vier Kolonien wurde gereinigt und mit SnaBI Endonuclease inkubiert. In allen Fällen wurde pSnaBI-2 vollständig vor SnaBI Endonucleaseverdau geschützt. Nr. 8 wurde dann in den E. coli Stamm ER2683 transformiert und mit dem CaCl₂-Standardverfahren kompetent gemacht.
6. Subklonierung des BsaAI Methylasegens
10 μg bsaAIM-pUC19 Plasmid, das ein 1,9 kb EcoRI Fragment enthielt, wurde mit 10 Einheiten SspI 60 Minuten lang bei 37°C verdaut und gelgereinigt. Das bsaAIM-haltige SspI Fragment wurde in den SmaI Ort des CIP-behandelten Vektors pIH919 ligiert und dann in E. coli ER2502 transformiert und auf LB-Agar plus Chloramphenicol (25 μg/ml) plattiert. Plasmid-DNA wurde von sechzehn Kolonien gereinigt. Ein Isolat, Nr. 8, erbrachte einen vollständigen Schutz vor SnaBI Endonucleaseverdau, was ein Hinweis auf eine In-vivo-Modifikation von SnaBI Orten über die Expression des BsaAI Methylasegens war. Nr. 8 wurde dann in ER2683 transformiert und mit dem CaCl₂-Verfahren kompetent gemacht.
7. Klonierung des vollständigen SnaBI Restriktionsendonucleasegens
Zwei Primer wurden zur PCR-Amplifikation des vollständigen snaBIR (ORF1) synthetisiert. Das Gen wurde von genomischer DNA unter Verwendung von Vent^® Polymerase und zwei Primern (SnaBI 5R) und (SNaBI 3R) unter PCR-Bedingungen von 95°C 1', 54°C 1', 72°C 1', 30 Zyklen amplifiziert.
Das PCR-Produkt wurde mit PstI und BamHI verdaut und dann gelgereinigt, woraufhin eine Ligation in PstI- und BamHI-verdauten pRRS über Nacht bei 17°C folgte. Die Ligation wurde in ER2683 [pIH919-snaBIM] und ER2683 [pIH919-bsaAIM] transformiert und auf LB-Agarplatten plus Amp (100 μg/ml) und Chloramphenicol (25 μg/ml) plattiert. Plasmid-DNA wurde durch Mini-Präparation von 10 ml Zellkulturen von zwölf Kolonien für jede Transformation gereinigt. Obwohl beide E. coli Stämme vor SnaBI Verdau schützten, brachten nur ER2683-[pIH919-bsaAIM]-Zellen einen Klon hervor, der das snaBIR PCR-Fragment mit SnaBI Endonucleaseaktivität enthielt. Ein Klon von zwölf Isolaten, Nr. 33, aus der ER2683 [pIH919-bsaAIM] Transformation wies reduzierte Endonucleaseaktivität auf. ER2683 [pIH919-snaBIM] brachte keine aktiven SnaBI Endonucleaseklone durch direkte SnaBI Chromosomen-PCR des snaBIR-Gens in pRRS hervor.
Das gleiche PCR-Fragment wurde unter Verwendung der Primer (SnaBI 5R) und (SnaBI 3R) von snaBIR (ORF1) ebenfalls bei 17°C über Nacht in gelgereinigten, mit BsaAI verdauten pCAB16 ligiert und anschließend in kompetente ER2502 [pIH919-snaBIM] E. coli Zellen transformiert und auf LB-Agarplatten plus Amp (100 μg/ml) und Chloramphenicol (25 μg/ml) plattiert. Plasmid-DNA wurde durch Mini-Präparation von fünfzehn Kolonien gereinigt und mit PstI und BamHI verdaut. Sechs Isolate enthielten das PCR-generierte snaBIR-Fragment. Vier Klone, Nr. 1, Nr. 2, Nr. 4 und Nr. 9, wurden sequenziert. Wie zuvor in der Zusammenfassung und ausführlichen Beschreibung beschrieben wurde, enthielten Nr. 1 und Nr. 9 die korrekte DNA-Sequenz für snaBIR, allerdings keine nachweisbare SnaBI Endonucleaseaktivität. Alle sequenzierten Klone hatten eine entgegengesetzte Orientierung zu Plac und mspIR, was möglicherweise das Fehlen von SnaBI Endonucleaseaktivität erklärt.
8. Expression von SnaBI Endonuclease im E. coli Stamm ER2683 [pIH919-snaBIM]
Da die pCAB16-snaBIR Klone Nr. 1 und Nr. 9 PstI und BamHI Orte enthielten, die innerhalb der PCR-Primer für snaBIR konstruiert waren, wurden beide Plasmide mit PstI und BamHI verdaut. Das snaBIR Insert wurde gelgereinigt und in PstI- und BamHI-verdauten pRRS in einer Linie mit Plac ligiert. Diese Ligationsreaktion wurde wieder in ER2683 [pIH919-snaBIM] E. coli Zellen transformiert. Plasmid-DNA von insgesamt 16 Isolaten wurde durch Mini-Präparation gereinigt, jeweils acht individuelle Isolate der Nr. 1 und Nr. 9 Ligation. Plasmid-DNA wurde mit PstI und BamHI verdaut, um das snaBIR-Insert zu identifizieren. Potentielle Klone von jeder Ligation wurden dann im Hinblick auf SnaBI Endonucleaseaktivität geprüft. Nur ein Isolat, Nr. 12, [von pCAB16-9, gelreine PstI/BamHI snaBIR + pRRS Ligation] wies eine reduzierte Aktivität von weniger als 5 × 10⁵ Einheiten je Gramm auf. Dies war der einzige Klon mit SnaBI Endonucleaseaktivität, der in E. coli ER2683 [pIH919-snaBIM] ermittelt wurde.
9. Expression von SnaBI Endonuclease im E. coli Stamm ER2683 [pIH919-bsaAIM]
Zur Überproduktion von SnaBI Endonuclease von einem Klon war die Verwendung der heterospezifischen Methylase M.BsaAI erforderlich. Wie im Abschnitt 7 beschrieben wurde, wurde das gesamte SnaBI Restriktionsendonucleasegen (672 bp) von genomischer DNA amplifiziert, bei 17°C über Nacht in gelgereinigten, mit BsaAI linearisierten pCAB16 ligiert und anschließend in kompetente ER2502 [pIH919-snaBIM] E. coli Zellen transformiert und auf LB-Agarplatten plus Amp (100 μg/ml) und Chloramphenicol (25 μg/ml) plattiert. Isolierte pCAB16-snaBIR Klone Nr. 1 und Nr. 9 enthielten die korrekte DNA-Sequenz für snaBIR, wurden anschließend mit PstI und BamHI verdaut und gelgereinigt, in mit PstI und BamHI verdauten pRRS ligiert und anschließend in den kompetenten E. coli Stamm ER2683 [pIH919-bsaAIM] tranformiert, plattiert auf LB-Agarplatten plus Amp (100 μg/ml) und Chloramphenicol (25 μg/ml). Plasmid-DNA von zwölf Kolonien von jeder Transformation wurde durch Mini-Präparation für insgesamt vierundzwanzig Klone isoliert. Alle 24 Klone schienen das Insert korrekter Größe zu enthalten; sechs Klone von jeder Platte wurden mit PstI und BamHI verdaut und enthielten das snaBIR Fragment korrekter Größe. Sechs Klone, Nr. 1, Nr. 2, Nr. 6, Nr. 13, Nr. 15, Nr. 18, wiesen eine hohe SnaBI-Endonucleaseaktivität in folgender Übernachtkultur auf, die bei 37°C wachsen gelassen wurde: 50 ml Luria Broth plus Amp (100 μg/ml) und Chloramphenicol (25 μg/ml) mit ER2683 [pIH919-bsaRIM, pRRS-snaBIR] Kultur wurde über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. Zellen wurden geerntet und in 4 ml Beschallungspuffer (100 mM KCl, 10 mM Tris pH 7, 0,1 mM EDTA, 10 mM β-Mercaptoethanol) resuspendiert. Zellen wurden durch Beschallung lysiert. Nach einer Zentrifugation zum Entfernen von Debris wurde der Rohzellextrakt auf T7 DNA im Hinblick auf SnaBI Endonucleaseaktivität bei 37°C wie folgt geprüft: 1 μl Rohextrakt wurde hundertfach (100fach) in Reaktionspuffer, der T7 DNA enthielt, verdünnt und vermischt. 1 μl wurde zu 50 μl übertragen und vermischt, 25 μl wurden durch eine Reihe von sechs Röhrchen übertragen, 15 Minuten und 1 Stunde lang inkubiert. Die SnaBI Endonucleaseaktivität lag bei etwa 8 × 10⁶ Einheiten/Gramm nasser E. coli Zellen.
Eine Probe von E. coli mit ER2683 [pIH919-bsaAIM, pRRS-snaBIR] (NEB Nr. 1166) wurde am 26. August 1998 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags mit der ATCC Akzessionsnummer 202166 bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung hinterlegt.
10. Reinigung der SnaBI Restriktionsendonuclease
Die rekombinante SnaBI Restriktionsendonuclease wird durch standardmäßige Proteinreinigungstechniken wie Affinitätschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie gereinigt. SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isoliertes DNA-Segment, das die SnaBI Restriktionsendonuclease kodiert, wobei das isolierte DNA-Segment vom Plasmid pRRS-snaBIR von ATCC 202166 erhältlich ist.
Rekombinanter DNA-Vektor, der das DNA-Segment aus Anspruch 1 umfasst.
Wirtszelle, transformiert durch den rekombinanten DNA-Vektor aus Anspruch 2 und durch DNA, die eine heterospezifische Methylase kodiert, die DNA vor SnaBI Verdau schützen kann.
Wirtszelle nach Anspruch 3, wobei die heterospezifische Methylase BsaAI Methylase ist und die DNA, die die Methylase kodiert, vom Plasmid pIH919-bsaAIM von ATCC 202166 erhältlich ist.
Verfahren zur Herstellung von SnaBI Restriktionsendonuclease, das das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 3 oder 4 unter Bedingungen zur Expression der SnaBI Endonuclease beinhaltet.